KR20250022285A - 액체-액체 상분리를 통한 scotin 프롤린-풍부 도메인 생체분자 응축물 및 그의 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액체-액체 상분리를 통해 형성되는 SCOTIN 프롤린-풍부 도메인(proline-rich domain; PRD)의 생체분자 응축물 및 이와 관련된 물질, 방법 및 용도 등에 관한 것으로, 구체적으로 생체분자 응축물을 세포소기관 막에 타겟팅하기 위한 재조합 단백질, 핵산 또는 벡터를 제공하고; PRD 또는 이를 포함하는 단백질의 생체분자 응축물 형성 방법 및 이를 활용한 세포소기관 또는 소포체 기능 조절 방법 및 응축물 조절 물질 선별 방법 등을 제공한다.

Description

액체-액체 상분리를 통한 SCOTIN 프롤린-풍부 도메인 생체분자 응축물 및 그의 응용{SCOTIN Proline-Rich Domain Biomolecular Condensates via Liquid-liquid Phase Separation and Applications Thereof}

본 발명은 액체-액체 상분리를 통해 형성되는 SCOTIN 프롤린-풍부 도메인의 생체분자 응축물 및 이와 관련된 물질, 방법 및 용도 등에 관한 것이다.

진핵세포는 세포소기관(organelle)을 통해 세포 공간을 구획화하고 그 안에서 특수화된 생물학적 기능을 수행한다. 세포소기관 중에서 막 없는 구획(membrane-less compartments) 또는 생체분자 응축물(biomolecular condensate)은 외부가 지질막으로 경계화되지 않고도 물리화학적으로 분리된 내부 환경을 조성하고 그 안에 생체분자를 응축하여 고유의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 영역으로, 대표적으로 핵소체(nucleolus), 파라스펙클(paraspeckle), 카할체(Cajal body), P 과립, 스트레스 과립 등의 응축물 구조가 여기에 해당한다(문헌[Banani, Salman F., et al.(2017)] 등).

생체분자 응축물이 액체-액체 상분리(liquid-liquid phase separation) 특성을 가질 경우, 응축물은 액체 또는 젤 유사 상태로 구획화되어 액체 방울(liquid droplet)의 재료적 특성을 나타내고, 응축물 안팎으로 생체분자를 자유롭게 교환할 수 있다. 생체분자 응축물의 액체-액체 상분리 특성이 세포 신호 전달, 신경 시냅스, 유전자 발현, 단백질 분해 등 광범위한 세포 기능 조절에 관여할 뿐 아니라, 암과 퇴행성 질환 등의 발병 과정에 밀접하게 관련되어 있다는 점이 알려짐에 따라 생체분자 응축물 분야는 학계와 산업계의 광범위한 주목을 받고 있다(문헌[Hyman, Anthony A., Christoph A. Weber, and Frank Julicher. (2014)] 등). 생체분자 응축물에 대한 의학적 또는 생명공학적 응용에 대한 연구는, 응축물 특성분석 방법(미국 특허 US10,533,167 B2 및 US10,538,756 B2 및 문헌[Bracha, Dan, Mackenzie T. Walls, and Clifford P. Brangwynne (2019)]) 및 응축물 조절 물질 선별 방법(미국 특허 US11,340,231 B2 및 US11,493,519 B2; 문헌[Boija, Ann, Isaac A. Klein, and Richard A. Young. (2021)]) 등으로 공지되어 있다.

한편, SCOTIN 단백질은 주로 세포핵 또는 ER(Endoplasmic reticulum) 막에 위치한 단백질로, 감마선 조사 또는 인터페론 자극 등 스트레스성 환경에서 발현이 유도되어 p53에 의한 아폽토시스 유도 등의 세포 반응을 유도하는 것으로 알려져있다(문헌[Bourdon, J-C., et al.(2002)]). 본 발명자는 선행 연구를 통해 SCOTIN 단백질 중 세포질 노출 영역인 프롤린 풍부 도메인(proline-rich domain; PRD)이 HCV(hepatitis C virus) 단백질(nonstuructural 5A; NS5A)의 오토리소좀 분해 유도, ERES(ER exit site)와 파고포어(phagophore) 접촉 억제를 통한 오토파지(autophagy) 유도 억제 기능이 있음을 보고한 바 있다(문헌[Kim, Nari, et al.(2016)], 문헌[Lee, Jee-Eun, et al.(2021)] 등). 그러나, SCOTIN 단백질 또는 그 하위 도메인인 PRD가 액체-액체 상분리를 통해 생체분자 응축물을 형성할 수 있다는 점은 알려진 바가 없다.

미국 특허 US10,533,167 B2 미국 특허 US10,538,756 B2 미국 특허 US11,340,231 B2 미국 특허 US11,493,519 B2 국제특허공개 WO2021/094746 A1 국제특허공개 WO2021/150937 A1

Hyman, Anthony A., Christoph A. Weber, and Frank Julicher. "Liquid-liquid phase separation in biology." Annual review of cell and developmental biology 30 (2014): 39-58. Bracha, Dan, Mackenzie T. Walls, and Clifford P. Brangwynne. "Probing and engineering liquid-phase organelles." Nature biotechnology 37.12 (2019): 1435-1445. Banani, Salman F., et al. "Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry." Nature reviews Molecular cell biology 18.5 (2017): 285-298. Boija, Ann, Isaac A. Klein, and Richard A. Young. "Biomolecular condensates and cancer." Cancer cell 39.2 (2021): 174-192. Bourdon, J-C., et al. "Scotin, a novel p53-inducible proapoptotic protein located in the ER and the nuclear membrane." The Journal of cell biology 158.2 (2002): 235-246. Kim, Nari, et al. "Interferon-inducible protein SCOTIN interferes with HCV replication through the autolysosomal degradation of NS5A." Nature communications 7.1 (2016): 1-12. Lee, Jee-Eun, et al. "SHISA5/SCOTIN restrains spontaneous autophagy induction by blocking contact between the ERES and phagophores." Autophagy (2021): 1-16.

본 발명의 목적은, 액체-액체 상분리를 통해 형성되는 SCOTIN 단백질의 프롤린-풍부 도메인(proline-rich domain; PRD) 생체분자 응축물과 관련된 물질, 용도 및 방법을 제공하는 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 생체분자 응축물을 세포소기관 막에 타겟팅하기 위한 재조합 단백질, 핵산 또는 벡터를 제공하고; PRD 또는 이를 포함하는 단백질의 생체분자 응축물 형성 방법 및 이를 활용한 세포소기관 또는 소포체 기능 조절 방법 및 응축물 조절 물질 선별 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명에서 서술되는 모든 용어는 달리 정의되지 않는 한 생명과학 분야에 널리 공지된 것과 동등한 의미로 이용되며, 인용된 문헌은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함될 뿐만 아니라 해당 문헌이 언급된 명세서 내 서술적 맥락에 따라 본 발명의 명세서에 직접 기재된 내용과 마찬가지로 취급된다.

SCOTIN 단백질 및 프롤린-풍부 도메인(PRD)

본 발명에서, SCOTIN 단백질은 SCOTIN/SHISA5 유전자에 의해 발현되는 단백질이다. 인간 SCOTIN 유전자는 3p21.3 염색체에 위치하며 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다(NCBI Accession No. NP_057563.3, UniProt Accession Number Q8N114 등 참고).

본 발명에서, SCOTIN 단백질은 종간 서열 상동성 및 세포 내 발현 맥락, 보존적 아미노산 치환 가능성 등을 고려하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 아미노산 서열과 상동성을 갖는 단백질을 포함하며, 이하에서는 편의상 인간 SCOTIN 단백질 중 서열번호 1의 서열정보를 기준으로 서술한다.

SCOTIN 단백질은 총 240개의 아미노산으로 구성되며, 아민기 말단에서부터 1-24번 아미노산 서열은 신호 펩티드(signal peptide; SS), 25-103번 아미노산 서열은 시스테인 풍부 도메인(cysteine-rich domain; CRD), 104-128번 아미노산 서열은 막관통 도메인(transmembrane domain; TM), 그리고 129-240번 아미노산 서열은 프롤린 풍부 도메인(proline-rich domain; PRD)으로 정의된다. 본 발명에서, 프롤린 풍부 도메인(PRD)은 특별한 언급이 없는 이상 상기 SCOTIN 단백질의 PRD를 의미하며, 본 발명에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시된다.

PRD의 액체-액체 상분리 특성

본 발명에서, PRD는 in vitro에서 또는 세포 내에서 자발적으로 액체-액체 상분리를 유도함으로써 생체분자 응축물을 형성할 수 있다. 생체분자 응축물(biomolecular condensate)은 진핵세포 내에서 단백질 등의 생체 분자에 의해 형성되는 막으로 둘러싸이지 않은 구획을 지칭하며, 응축물을 형성하는 핵심 분자의 상 분리(phase separation) 특성에 의해 외부 환경과 분자적 조성과 농도가 구분되는 막으로 경계화되지 않는 구획을 형성할 수 있다. 액체-액체 상분리가 in vitro에서 일어날 경우 응축물은 구형의 액체 방울(liquid droplet) 형태로 관측될 수 있다.

생체분자 응축물은 상분리 특성에 따라 다양한 위상(phase)을 가질 수 있으며, 액체-액체 상분리에 의해 형성되는 응축물은 액체 방울의 재료적 특성을 나타내고, 액체 또는 젤-유사 상태로 외부와 구분된 생화학적 환경을 유지하며, 응축물의 외부 환경과 물질 교환이 역동적으로 일어나는 특징을 가진다. 따라서, 액체-액체 상분리된 생체분자 응축물은, 고체 상의 결정체, 응집물(aggregate) 또는 화학양론적 단백질 복합체와 물리화학적으로, 그리고 생화학적으로 구별된다.

액체-액체 상분리에 의해 형성되는 생체분자 응축물은 in vitro에서 또는 세포 내에서 다양한 관측 수단에 의해 관측 및 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, in vitro에서 형성되는 생체분자 응축물은 구형의 액체 방울이 자발적으로 형성되는 현상을 관찰함으로써 측정될 수 있고, 세포 내에서 형성되는 생체분자 응축물은 나노미터 내지 마이크로미터 규모의 응축물 구조를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 생체분자 응축물의 액체-액체 상분리 특성은 응축물에 대한 형광 라이브 이미징을 통해 응축물의 융합과 분열 거동을 관측함으로써 식별될 수 있고, 형광 블리칭, 예컨대, FRAP(fluorescence recovery after photobleaching), FLIP(Fluorescence loss in photobleaching) 또는 FCS(fluorescence correlation spectroscopy) 등의 형광 기법을 통해 관측될 수 있으며, 이때 산출된 응축물의 분자 이동성 또는 유동성은 화학양론적 단백질 결합체와 비교하여 수 초 내지 수 분 단위까지 연장될 수 있다(문헌[Banani, Salman F., et al. (2017)] 등). 이외에도, 응축물의 액체-액체 상분리 특성을 분석하기 위해 확립된 광유전학 도구를 사용할 수 있다(문헌[Bracha, Dan, Mackenzie T. Walls, and Clifford P. Brangwynne (2019)] 등).

본 발명의 실시예에서, 세포소기관 타겟팅 PRD 재조합 단백질 또는 SCOTIN 단백질에 대한 형광 라이브 이미징을 통해 응축물의 융합과 분열이 역동적으로 일어난다는 점과 FRAP 관측을 통해 응축물의 분자 재배열이 활발히 일어난다는 점을 확인하였다(실시예 2; 도 2c 내지 도 2f). 이는, 본 발명의 PRD 응축물이 액체-액체 상분리 특성을 가진 액체 또는 젤-유사 상 특성을 가진다는 점을 보여주는 것이다.

본 발명에서, IDR(intrinsically disordered region)은 단백질 영역 중 삼차 구조로 폴딩되지 못하고 에너지가 유사한 다양한 풀린 형태들 사이를 자발적으로 오고가는 무정형 영역을 지칭한다. IDR의 약하고 일시적인 다가성(multivalent) 상호작용은 액체-액체 상분리를 유도함으로써 액체 또는 젤-유사 상의 생체분자 응축물을 형성할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, PRD는 내부에 28개의 아미노산 서열(SCOTIN 단백질 기준 150 내지 177번 아미노산 서열; 서열번호 3)로 구성된 IDR을 포함하며, 서열번호 3으로 표시되는 IDR이 결실된 PRD 또는 SCOTIN 단백질은 액체-액체 상분리를 통한 in vitro 액체 방울 형성 및 세포 내 액체-액체 상분리된 생체분자 응축물 형성 기능이 상실됨을 확인하였다(실시예 2; 도 2a 및 도 2e). 이는, 본 발명의 PRD 또는 이를 포함하는 단백질(예컨대, 세포소기관 막 타겟팅 PRD 재조합 단백질 또는 SCOTIN 단백질 등)은 IDR을 매개로 액체-액체 상분리를 유도함으로써 생체분자 응축물 또는 액체 방울을 형성할 수 있음을 보여주는 것이다. 이를 통해, IDR에 의존적인 PRD의 세포 기능 조절 현상을 관측함으로써 액체-액체 상분리를 통해 형성된 응축물의 세포 내 기능을 확인할 수 있다.

PRD를 액체-액체 상분리 도메인으로 포함하는 단백질

본 발명의 실시예에서, PRD를 기본 도메인으로 하는 다양한 형태의 단백질은 공통적으로 PRD의 액체-액체 상분리 기능을 통해 응축물(구체적으로, in vitro에서 액체 방울 및/또는 세포 내에서 생체분자 응축물)을 형성할 수 있음을 확인하였다(실시예 1; 도 1a 내지 도 1c 및 도 1f). 따라서, PRD를 기본 도메인으로 하는 적절한 형태의 단백질이 in vitro 또는 세포 내에서 PRD의 생체분자 응축물 특성을 발휘하기 위해 이용될 수 있다.

일 실시양태에서, PRD를 포함하는 단백질은 막 단백질 형태이며, 예컨대 내재성(integral) 또는 표재성(peripheral) 막 단백질일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, PRD가 지질막에 결합되는 막 단백질 형태로 구현되는 경우 지질막 상에 PRD 응축물을 형성함을 확인하였다(실시예 1, 3 및 6; 도 1a 내지 도 1c, 도 1f, 도 3a 내지 도 3c, 도 6a 내지 도 6d). 막 단백질 형태로 발현된 PRD의 경우, 세포질 또는 in vitro 상의 3차원 공간에서 자유롭게 거동할 수 있는 PRD 응축물과 달리 지질 이중층이 형성된 2차원 공간에 그 이동 양상이 한정된다(문헌[Su, Xiaolei, et al. "Phase separation of signaling molecules promotes T cell receptor signal transduction." Science 352.6285 (2016): 595-599.] 및 문헌[Beutel, O., and R. MARASPINI. POMBO-GARCIA K., MARTIN-LEMAITRE C., HONIGMANN A. 2019." Phase separation of zonula occludens proteins drives formation of tight junctions" Cell (2019) 179: 923-936.] 등)

또다른 일 실시양태에서, PRD를 포함하는 단백질은 세포질 또는 in vitro 상에서 자유롭게 이동할 수 있는 비막성(non-membrane) 단백질 형태일 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 막 단백질 도메인이 연결되지 않은 PRD만으로도 세포 내에서 또는 in vitro에서 액체-액체 상분리를 통한 응축물이 형성됨을 확인하였다(실시예 1 및 2; 도 1c 및 도 2a).

일 실시양태에서, PRD에는 응축물의 특성분석 또는 기능 조절 등의 목적을 달성하기 위해 1종 이상의 외래 물질(예컨대, 저분자 화합물, 지질, 탄수화물, 핵산, 폴리펩티드, 나노입자, 소포체, 바이러스 또는 세포 등)이 컨쥬게이션될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 외래 물질은 외래 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있으며, 이 경우 유전적 발현 시스템을 이용하여 PRD의 말단에 외래 단백질 또는 폴리펩티드를 융합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 에피토프 태그(Myc) 또는 형광 단백질(mDsRed, GFP, YFP, mEmerald 등)가 융합된 PRD를 세포 내에서 발현시킴으로써 응축물의 형성 위치, 크기 및 형태 등의 특성분석을 수행하였으며(실시예 1 내지 3; 도 1b, 도 1c, 도 1e 내지 도 1f, 도 2c 내지 도 2f, 도 3a 내지 도 3c), 친화성 태그(12-His)가 융합된 PRD를 in vitro에 처리함으로써 응축물을 소포체 막에 부착시켜 막 접촉을 유도하는 응축물 기능 조절을 수행하였다(실시예 6; 도 6a 내지 도6d). PRD에 외래 단백질(예컨대, 수 내지 수십 kDa 크기의 단백질) 융합 여부는 PRD의 본질적인 응축물 형성 기능에 영향을 미치지 않으므로, 의학적 또는 생명공학적 목적에 따른 적절한 외래 단백질(예컨대, 효소, 태그 단백질, 형광 단백질, 구조 단백질, 신호전달 단백질 등)을 PRD에 융합하여 생체분자 응축물 기능을 발휘할 수 있다.

PRD에 융합되는 외래 단백질은 그 이용 목적에 따라 적절한 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있고, 효소적 변형 또는 화학적 변형이 가해질 수 있으며 이를 통해 1종 이상의 외래 물질을 추가로 결합할 수 있다. 또한, 전체 단백질의 발현 또는 정제 후 특정 조건에서 단백질 분해효소 등에 의해 외래 단백질은 제거될 수 있다.

이하에서, PRD를 액체-액체 상분리 도메인으로 하는 단백질을 크게 3 가지 형태로 구분하여 서술한다.

1. 세포소기관 타겟팅 PRD 재조합 단백질 및 이의 응축물 활용

PRD 재조합 단백질

일 측면에서, 본 발명은 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD(proline-rich domain); 및 (ii) 상기 PRD에 융합된 세포소기관 타겟팅 막 단백질(여기서, 상기 막 단백질은 SCOTIN 단백질에서 유래하지 않음)을 포함하는, 세포소기관의 막 상에 PRD 생체분자 응축물을 타겟팅하기 위한 재조합 단백질을 제공한다.

상기 재조합 단백질에서, 세포소기관 타겟팅 막 단백질은 진핵세포에서 발현된 후 단백질 분류 시스템에 의해 특정 세포소기관의 막으로 수송되는 단백질로서, 전체 재조합 단백질이 세포소기관의 막 상에 타겟팅될 수 있도록 하는 기능을 수행한다. 상기 재조합 단백질이 타겟팅되는 세포소기관은 진핵세포의 세포 내막계에 속하는 막성 세포소기관일 수 있으며, 세포 내부에 위치하는 막성 세포소기관(예컨대, 세포핵, ER, 골지체, 엔도솜, 오토파고좀, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포, 퍼옥시좀, 분비성 과립 등) 뿐만 아니라, 세포 원형질막(plasma membrane) 및 엑소좀을 포함한다.

일 실시양태에서, 재조합 단백질이 타겟팅되는 세포소기관은 ER, 엔도솜, 또는 미토콘드리아이다. 본 발명의 실시예에서, ER, 엔도솜 및 미토콘드리아에 타겟팅되는 재조합 단백질을 제작한 후 세포에 과발현시킨 결과, 목적하는 세포소기관의 막 상에서 PRD 응축물이 형성되었음을 관찰하였다(실시예 1 및 3; 도 1f, 도 3b 및 도 3c).

보다 구체적으로, 상기 세포소기관 타겟팅 막 단백질은 (a) 세포소기관 마커 단백질 또는 (b) 신호 펩티드가 융합된 막관통 도메인일 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 (a) 세포소기관 마커 단백질은, 특정 세포소기관의 막에 위치하는 것으로 알려진 막 마커 단백질로서, 타겟팅하고자 하는 세포소기관에 따라 적절한 종류를 선택하여 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 막 마커 단백질은 (1) 타겟팅하고자 하는 세포소기관의 막에 특이적으로 위치하고 (2) 특정 효소 활성이나 번역 후 변형이 상대적으로 적거나 실질적으로 없어 타겟팅하는 단백질의 기능에 실질적인 영향을 주지 않으며 (3) 막 마커 단백질의 과발현만으로는 자체적인 응축 능력이 없어서 재조합 단백질의 응축에 영향을 주지 않는 단백질인 것을 특징으로 한다. 상기 기준에 따라, 예컨대, ER(Sec61β, VAPA, RTN4, CLIMP63), 골지체(Giantin, GM130), 초기 엔도솜(EEA1, Rab5), 후기 엔도솜(CD63, Rab7), 리사이클링 엔도솜(transferrin receptor; TfR), 오토파고좀(LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAP L1, GABARAP L2), 리소좀(LAMP1, LAMP2), 세포막(E-cadherin, GPI, VSVG), 핵막(Lamin B1, NUP98, Merin) 또는 엑소좀(CD9)의 마커 단백질을 공지된 서열 정보 등을 참고하여 본 발명의 세포소기관 마커 단백질로 이용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 세포소기관 마커 단백질로 ER 막 마커 단백질인 Sec61β 또는 후기 엔도솜 막 마커 단백질인 CD63로 이용하여 PRD를 융합한 재조합 단백질(mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β 및 CD63-SCOTIN PRD-Myc)을 세포 내에 각각 발현시키자, 해당 세포소기관의 막 상에 재조합 단백질이 타겟팅되어 PRD 응축물을 형성함을 확인하였다(실시예 1 및 3; 도 1f 및 도 3b).

일 실시양태에서, 상기 (b) 신호 펩티드가 융합된 막관통 도메인은, 그 자체로는 단백질 타겟팅 기능을 갖지 않는 막관통 도메인 영역의 말단에 수십개의 아미노산 서열로 구성된 신호 펩티드가 융합된 막 단백질이다. 여기서, 상기 신호 펩티드는 진핵 세포의 단백질 분류 시스템에 의해 막 단백질을 특정 세포소기관으로 이동하도록 하는 기능을 수행한다. 전형적인 신호 펩티드는 약 13 내지 36개 아미노산으로 구성된 단백질 타겟팅 신호로 작용하며, 예컨대 막 단백질의 N'-말단 근처에 양으로 하전된 친수성 펩티드, 신호 펩티드 내에 존재하는 소수성 아미노산, C-말단 부근에 다소 극성인 영역으로 구성될 수 있다. 다만, 퍼옥시좀 등 특정 세포소기관에 대한 신호 펩티드는 막 단백질의 C'-말단에 융합될 수도 있다. 신호 펩티드는 목적하는 세포소기관으로 이동되면 시그널 펩티데이즈(signal peptidase)에 의해 절단될 수 있다. 상기 신호 펩티드는 타겟팅하고자 하는 세포소기관에 따라 적절한 종류를 선택하여 이용할 수 있으며, 예컨대 ER(KDEL, MHRRRSRSCREDQKPV), 골지체(SXYQRL), 미토콘드리아 타겟팅 서열(MTS), 퍼옥시좀 타겟팅 서열(peroxisome targeting signal; PTS) 및 공지된 서열정보 등을 적절히 활용할 수 있다(문헌[Nielsen, Henrik, et al. "A brief history of protein sorting prediction." The protein journal 38 (2019): 200-216.] 등).

일 실시양태에서, 미토콘드리아 외막을 타겟팅하기 위해 TOM20의 N'말단 신호 펩티드를 융합한 막 단백질을 활용할 수 있다(문헌[Kanaji, Sachiko, et al. "Characterization of the signal that directs Tom20 to the mitochondrial outer membrane." The Journal of cell biology 151.2 (2000): 277-288.]). 본 발명의 실시예에서, 신호 펩티드가 융합된 막관통 도메인로 미토콘드리아의 외막을 타겟팅할 수 있는 TOM20의 N'말단 33개의 신호 펩티드를 이용하여 PRD를 융합한 재조합 단백질(TOM20(N33)-PRD-YFP)을 세포 내에 발현시키자, 해당 세포소기관의 막 상에 재조합 단백질이 타겟팅되어 PRD 응축물을 형성함을 확인하였다(실시예 3; 도 3c).

상기 재조합 단백질에서, 막 단백질은 SCOTIN 단백질에서 유래하지 않으며, 구체적으로 SCOTIN 단백질의 TM과 상이한 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 PRD를 제외한 어떤 영역도 SCOTIN 단백질을 구성하는 기능적 도메인(예컨대, SCOTIN 단백질의 SS, CRD, TM)과 상이한 것을 특징으로 한다.

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 단백질이 세포내막계에 속하는 세포소기관을 타겟팅할 경우, PRD는 막 단백질의 N' 말단(mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β) 또는 C' 말단(CD63-SCOTIN PRD-Myc; MTS-PRD-YFP)에 융합되어 세포질 영역으로 노출될 수 있다.

일 실시양태에서, 응축물의 특성분석 또는 응축물 기능 조절을 위해 재조합 단백 질 중 PRD 말단에 1종 이상의 외래단백질이 융합될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, PRD에 융합되는 외래 단백질의 일례로 짧은 에피토프 태그(Myc) 또는 약 27kDa의 분자량을 갖는 형광 단백질(mEmerald, YFP)을 이용하여 세포소기관의 막에 타겟팅되는 응축물의 위치와 크기 및 형태 관측을 수행하였다(실시예 1 및 3; 도 1f 및 도 3c).

일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다. 구체적으로, 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 로서, 진핵세포 내에 도입될 수 있는 적절한 전달체에 물리적 또는 화학적으로 결합될 수 있다. 일 실시양태에서, 이러한 전달체는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터(예컨대 플라스미드 또는 바이러스성 벡터)이며, 시약 또는 키트 형태로 제품화될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 세포는 진핵세포일 수 있으며, 타겟팅하고자 하는 세포소기관에 따라, 상기 진핵세포는 동물세포(예컨대, 인간을 포함한 포유류 세포), 식물세포 또는 균류 세포(예컨대, 효모 등)일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 단백질을 분리된 진핵세포에서 발현시키는 단계; 상기 진핵세포의 단백질 분류 시스템에 의해 재조합 단백질이 세포소기관으로 수송되도록 하는 단계; 및 상기 세포소기관의 막 상에서 PRD의 액체-액체 상분리가 유도되도록 하는 단계를 포함하는, 세포소기관의 막 상에 생체분자 응축물을 타겟팅하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 분리된 세포는 생물체에서 물리적으로 분리되어 체외에서 배양 가능한 모든 세포, 조직, 기관을 포함할 뿐 아니라, 한 번 분리된 세포에서 유래된 세포 또는 세포주를 포함한다. 즉, 배지 내에서 배양 가능하다면 생체로부터 물리적인 분리 유무를 불문하고 본 발명의 분리된 세포에 포함된다.

진핵세포에서 재조합 단백질의 발현은 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 재조합 벡터를 통해 세포 내로 도입하는 등의 유전적 수단에 의해 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질은 이를 코딩하는 핵산을 이에 작동가능하도록 연결된 프로모터 및 복제 원점을 보유한 재조합 벡터(예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 인공 염색체 등)에 삽입하여 유전자 전달용 비히클과 함께 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, ER(mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β), 후기 엔도솜(CD63-SCOTIN PRD-Myc) 및 미토콘드리아(TOM20(N33)-PRD-YFP) 막 상에 PRD 응축물을 타겟팅하기 위한 재조합 단백질을 인간 유래 세포주(HeLa 또는 HEK293)에 발현시키자 상기 재조합 단백질이 해당 세포소기관의 막 상으로 이동하여 막 상에 PRD의 액체-액체 상분리에 의한 생체분자 응축물을 형성함을 확인하였다(실시예 1 내지 3; 도 1f, 도 3b 및 도 3c).

세포소기관 간 막 접촉 조절

일 측면에서, 본 발명은 상술한 제1 및 제2 재조합 단백질을 분리된 진핵세포에서 발현시키는 단계; 상기 진핵세포의 단백질 분류 시스템에 의해 제1 및 제2 재조합 단백질이 각각 제1 및 제2 세포소기관으로 이동되도록 하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 세포소기관의 막 상에서 PRD의 액체-액체 상분리가 유도되도록 하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 재조합 단백질은 각각 제1 및 제2 세포소기관 타겟팅 막 단백질을 포함하고, PRD는 모두 세포질 영역으로 노출되는 것인, 세포 내에서 제1 및 제2 세포소기관의 막 접촉을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 세포소기관의 막 접촉은 서로 다른 두 세포소기관의 막이 물리적으로 근접한 위치에 놓이는 것을 의미한다. 세포소기관은 막 접촉 사이트(membrane contact site; MCS)를 통해 서로 접촉을 형성하며, 이를 통해 신호전달, 생체분자 이동 등의 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 예컨대, 진핵세포의 ER은 막 접촉을 통해 엔도리소좀 등 세포내막계의 시공간적 배치를 조절할 수 있다. 이러한 막 접촉은, 양쪽 세포소기관의 막 단백질 간의 상호작용 또는 테더링(tethering)에 의해 매개될 수 있다.

세포소기관 간의 막 접촉 수준은 두 세포소기관 간의 물리적 배치를 형광현미경 또는 전자현미경으로 관찰함으로써 관측될 수 있고, PLA(proximity ligation assay)와 같이 두 세포소기관의 마커 단백질 간의 거리를 측정하는 기법에 의해 관측될 수 있다.

일 실시양태에서, 상술한 재조합 단백질에 의한 막 접촉 대상이 되는 세포소기관 중, 제1 세포소기관은 ER이고, 제2 세포소기관은 엔도솜, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아 또는 원형질의 막일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, SCOTIN 단백질의 PRD는 다른 두 세포소기관(ER 및 후기 엔도솜)의 막에 위치하여 동종 상호작용(homotypic interaction) 또는 테더링을 통해 양 세포소기관의 막 접촉을 유도할 수 있고, 이 과정은 PRD 응축물의 형성을 통해 매개된다는 점을 확인하였다(실시예 5; 도 5a, 도 5c 및 도 5d). 나아가, ER 및 후기 엔도솜 간의 막 접촉 유도는 세포 내에서 엔도솜의 공간적 배치를 조절할 수 있음을 확인하였다(실시예 7; 도 7).

세포소기관 형태 조절

생체분자 응축물은 막 상에서 구조 단백질을 모집하거나, 표면장력과 부착력을 발휘하는 재료적 특성을 통해 세포소기관 형태 변화를 유도할 수 있다(문헌[Agudo-Canalejo, Jaime, et al. "Wetting regulates autophagy of phase-separated compartments and the cytosol." Nature 591.7848 (2021): 142-146.] 등).

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 목적하는 세포소기관의 막 상에 PRD 응축물을 타겟팅함으로써 세포소기관의 구조 또는 형태를 조절할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, ER 막 상에 형성된 PRD 응축물은 ER의 하위 구조의 응축을 유도하였고, 후기 엔도솜 막 상에 형성된 PRD 응축물은 엔도솜의 클러스터화된 구조를 유도하였으며, 미토콘드리아 외막에 형성된 PRD 응축물은 일부 미토콘드리아의 분절화(fragmentation) 형태를 유도함을 확인하였다(실시예 3; 도 1f, 도 3b 및 도 3c).

2. SCOTIN 단백질 및 이의 응축물 활용

일 측면에서, 본 발명은 분리된 세포에서 SCOTIN 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 상기 SCOTIN 단백질 중 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계를 포함하는, 세포소기관의 막 상에 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물을 형성하는 방법을 제공한다.

SCOTIN 단백질은 세포 내 발현 후 ER 및 핵막 뿐만 아니라 엔도솜 등 세포 내 다양한 소포체성 구획에도 위치한다. 본 발명의 실시예에서, SCOTIN 단백질을 세포 내에 과발현시킨 경우 세포소기관의 막 상에서 SCOTIN 단백질 응축물이 자발적으로 형성되었으며, 이러한 응축물은 SCOTIN 단백질의 PRD 내 IDR에 의해 매개되는 액체-액체 상분리에 의해 유도되는 액체 또는 젤-유사 특성을 가진다는 점을 확인하였다(실시예 1 및 2; 도 1e 및 도 2e).

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질의 발현 유도는 서열번호 1로 표시되는 SCOTIN 단백질을 코딩하는 핵산이 삽입된 재조합 벡터를 세포 내에 트랜스펙션하는 방법과 같이 SCOTIN 단백질을 코딩하는 핵산을 세포 내에 도입하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 또다른 일 실시양태에서, SCOTIN 단백질의 발현 유도는 인터페론 처리 및 DNA 손상 신호 중 어느 하나 이상인 SCOTIN 발현 유도 환경을 조성하는 것에 의해 수행될 수 있다. 상기 DNA 손상 신호는 세포 내 DNA를 직간접적으로 손상하는 것으로 알려진 물리적 또는 화학적 환경을 의미하며, 예컨대 방사선 (예컨대, 감마선, X선, 자외선, 기타 이온화 방사선) 조사 또는 DNA 손상 유발 물질(예컨대, 알킬화제, 토포아이소머라제 억제제 등 유전독성 화학물질[genotoxic chemical]) 처리 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

SCOTIN 단백질 발현을 유도할 수 있는 세포 스트레스성 환경은 본 발명의 기술 분야에 일부 공지되어 있다(문헌[Bourdon, J-C., et al. (2002)] 및 문헌[Kim, Nari, et al.(2016)] 등).

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질이 응축물을 형성하는 세포소기관은 ER이다. 이 경우, SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물은 ER 막 구조의 응축 및/또는 ER에서 골지체로의 소포체 수송 억제 기능을 수행할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, SCOTIN 단백질 유도 환경에서 SCOTIN 단백질 응축물은 세포소기관(ER) 막 상에 형성되어 ER tubule을 한 군데로 얽히게 하는 구조를 형성하고(실시예 3; 도 3a), SCOTIN 단백질 응축물에 의해 매개되는 소포체 수송 기능 억제가 일어난다는 점을 확인하였다(실시예 8; 도 8a 및 도 8b).

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질이 응축물을 형성하는 세포소기관은 ER 및 엔도솜(예컨대, 후기 엔도솜)이다.

이 경우, SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물은 ER 및 엔도솜 간 접촉을 유도함으로써 세포 내 엔도솜의 공간적 배치를 조절할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, SCOTIN KO 세포에서 SCOTIN 단백질을 과발현하는 경우 SCOTIN 단백질 응축물은 ER 및 엔도솜을 근접한 위치로 유도하였고(실시예 5; 도 5a 내지 도 5d), 세포핵 근처 영역으로 엔도솜의 공간적 배치를 유도한다는 점을 확인하였다(실시예 7; 도 7).

ER에서 골지체로의 소포체 수송 억제

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질 발현 유도 환경(예컨대, DNA 손상 또는 염증성 환경과 같은 세포 스트레스 환경)을 조성함으로써 ER 막 상에 형성된 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물은 ER에서 골지체로의 소포체 수송을 일시적으로 억제할 수 있다.

진핵세포에서 분비성 경로(secretory pathway)를 따르는 단백질은 신규 합성 후 ER(endoplasmic reticulum)에서 농축되고 ERES(ER exit site)에서 COPII(coat protein complex type II) 복합체에 의해 분류되어 골지체를 거쳐 목적지로 수송된다. COPII 복합체가 운반 단백질을 수송하는 과정은, ERES에서 GTPase Sar1을 Sec16으로 모집하고, 내부 코트 단백질 Sec23-Sec24 이량체 및 외부 코트 Sec13-31 사량체 결합을 형성한 후, Sec23-Sec24 이량체가 막 운반 단백질에 결합하고, Sec31-Sec13 사량체가 ERES에 모집되어 케이지 형태의 외부 코트를 형성하여, 이를 통해 안정한 COPII 복합체에 둘러싸인 소포체가 형성하는 일련의 과정으로 구성된다. 진핵세포 내에서 COPII 소포체에 의해 ER에서 골지체로 단백질 운반이 일어나는 과정은 정교하게 조절되며, 스트레스성 환경과 같은 외부 자극에 반응하여 소포체 수송 기능은 적절히 통제된다.

본 발명의 실시예에서, RUSH 시스템을 이용한 단백질 이동 추적 실험을 통해, SCOTIN 단백질을 과발현하거나 또는 SCOTIN 발현 유도 환경(예컨대, 인터페론-감마 처리)을 조성하였을 경우 SCOTIN PRD의 IDR에 의해 매개되는 생체분자 응축물을 통해 ER에서 골지체로의 COPII 매개성 단백질 수송이 억제된다는 점을 확인하였다(실시예 8; 도 8a 및 도 8b).

이에, 본 발명은 분리된 진핵세포에서 SCOTIN 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 상기 SCOTIN 단백질 중 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD의 액체-액체 상분리를 유도함으로써 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물을 형성하는 단계를 포함하는, ER에서 골지체로의 소포체 수송 억제 방법을 제공한다. 상기 ER에서 골지체로의 소포체 수송 억제는 분비성 경로를 따르는 단백질의 수송 억제를 포함한다.

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질 응축물은 ER 막 상에 형성되어 COPII 복합체 구성요소, 구체적으로 Sec31 또는 Sec13을 SCOTIN 단백질 응축물 구획 내에 격리할 수 있다.

응축물 구획에 단백질의 선택적 격리

일 측면에서, 본 발명은 분리된 진핵세포에서 SCOTIN 단백질의 발현을 유도하는 단계; 상기 SCOTIN 단백질 중 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD의 액체-액체 상분리를 유도함으로써 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물을 형성하는 단계; 및 상기 응축물 구획에 격리된 단백질을 식별하는 단계를 포함하는, SCOTIN 단백질 응축물에 격리되는 단백질의 선별 방법을 제공한다.

생체분자 응축물은 단백질의 선택적 격리를 통해 응축물 구획 내에 해당 단백질을 농축시켜 특수한 생화학적 반응을 매개하거나 또는 해당 단백질이 응축물 구획 바깥에서 활동하는 것을 억제함으로써 특정한 세포 반응을 매개할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세포소기관의 막 상에 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물을 형성하는 방법은 생체분자 응축물 구획에 선택적으로 격리되는 단백질의 식별을 위해 활용될 수 있다.

일 실시양태에서, 생체분자 응축물에 의해 격리되는 단백질의 식별은 BioID를 이용한 근접도 라벨링(proximity labeling) 기법 등을 통해 수행될 수 있다. 예컨대, SCOTIN 단백질의 PRD 말단에 바이오틴 라이게이즈(biotin ligase) 효소를 태깅한 후 효소 기질인 바이오틴을 처리하여 SCOTIN 단백질의 응축물 구획에 격리될 수 있는 단백질에 대해 바이오틴화 반응을 수행한 후, 스트렙타비딘 비드를 이용해 바이오틴화된 단백질을 풀-다운한 뒤 질량분석을 통해 격리 단백질을 식별할 수 있다.

SCOTIN 단백질 응축물 구획에 격리될 수 있는 세포 내 단백질의 예로는, 세포-세포 접촉(adhesion), 소포체에 의해 매개되는 단백질 수송(예컨대, COPII 소포체의 형성, ER에서 골지체로의 단백질 수송, 또는 골지체 이후 단계의 소포체 수송 등), 세포 또는 세포소기관의 막 융합, 액틴 필라멘트 중합, 숙주 세포로의 바이러스 침투, ER 스트레스에 대항하는 번역 조절 등에 관여하는 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, SCOTIN 단백질 응축물 구획에 선택적으로 격리되는 단백질은 COPII 복합체의 구성요소인 Sec31 및/또는 Sec13이며, 응축물 구획으로의 상기 단백질의 선택적 격리를 통해 ER에서 골지체로의 단백질 수송이 억제될 수 있음을 확인하였다(실시예 8; 도 8c).

SCOTIN 응축물 돌연변이

SCOTIN 단백질은 DNA 손상 또는 염증성 환경과 같은 세포 스트레스성 환경에서 그 발현이 유도되어, 아폽토시스 또는 바이러스성 단백질의 격리 및 분해 등 스트레스에 대항하는 세포 기능을 매개하는 것으로 알려져있다.

본 발명의 실시예에서, 암 환자의 SCOTIN 단백질 돌연변이 중 PRD의 IDR 내 점돌연변이(S151P, A157D, 161Stop)를 선별한 후, 상기 돌연변이 SCOTIN 단백질이 과발현된 세포에서 SCOTIN 단백질의 응축물 형성과 이로 인한 세포 기능에 이상이 발생하였음을 확인하였다(실시예 9; 도 9a 및 도 9b).

이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 SCOTIN 단백질 기준으로 (i) 151번째 세린이 프롤린으로 치환됨(S151P); (ii) 157번째 알라닌이 아스파르트산으로 치환됨(A157D); 및 (iii) 161번째 아미노산이 번역 종결 신호로 치환(161Stop) 중 어느 하나 이상의 돌연변이 부위를 코딩하는 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는, SCOTIN 발현 유도 환경에서 SCOTIN 단백질 응축물 형성 이상 또는 ER에서 골지체로의 수송 억제 기능 이상 검출용 조성물을 제공한다.

ER 및 엔도솜 간 접촉 조절

상술한 세포소기관 막 타겟팅 재조합 단백질 단락에서 서술한 바와 같이, 세포소기관은 막 접촉 사이트를 통해 서로 접촉을 형성하며, SCOTIN 단백질의 발현 유도는 ER 및 엔도솜(예컨대, 후기 엔도솜)의 막에 각각 SCOTIN 단백질이 위치되도록 하여 각 세포소기관의 막 상에 위치한 SCOTIN 단백질의 응축물 형성을 통해 막 접촉을 유도할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, SCOTIN 단백질이 두 세포소기관(ER 및 엔도솜)의 막 상에 위치하여, SCOTIN 단백질의 PRD 내 IDR에 의해 매개되는 응축물 형성을 통해 세포소기관 간의 막 접촉을 유도할 수 있고, 이를 통해 세포 내 엔도솜의 공간적 배치를 세포핵 근처로 유도함으로써 세포소기관의 세포 내 동적 거동을 조절할 수 있음을 확인하였다(실시예 5 및 실시예 7; 도 5a 내지 도 5d 및 도 7).

3. 프롤린-풍부 도메인(PRD) 및 이의 응축물 활용

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 in vitro 또는 세포 내에 처리하는 단계; 및 PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계를 포함하는, PRD 응축물을 형성하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, PRD는 액체-액체 상분리를 유도하는 기본 도메인으로 작용하여, 다른 도메인의 도움 없이도 in vitro에서 액체 방울을 형성하거나 또는 세포 내에서 생체분자 응축물을 형성할 수 있다.

in vitro에서 PRD의 액체-액체 상분리는 PRD 단백질의 농도, PRD에 융합되는 외래 단백질, 반응계의 환경(예컨대, pH 및 완충액 조성, 크라우딩 제제의 첨가 여부 등)에 의존적으로 나타나며 고유의 상 다이어그램을 형성한다(실시예 2; 도 2b). 본 발명의 실시예에서, 정제된 PRD는 in vitro에서 처리되어 외부 에너지 공급 없이 자발적으로 합쳐져 액체 방울을 형성하였다(실시예 2; 도 2a).

세포 내에서 PRD는 생체막에 억류되지 않고 세포질 공간에 분산된 생체분자 응축물 구조를 형성할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, PRD 발현 벡터를 세포 내에 트랜스펙션시킴으로써 세포질 공간에 구형의 PRD 생체분자 응축물을 형성함을 관찰하였다(실시예 1; 도 1c). 대안적인 실시양태에서, 정제된 PRD는 적절한 세포내 전달 수단에 탑재되어 세포 외부에 처리되어 세포 내부로 도입할 수 있다. 예컨대, PRD를 리포좀, 에멀젼, 지질 나노입자 등 지질 기반 전달체에 삽입하거나, PRD에 세포막 수용체 결합 단백질(예컨대, 항체 또는 이의 단편) 또는 세포-침투성 펩티드(cell-penetrating peptide; CPP)를 융합함으로써, 세포 외부에 처리된 PRD를 세포 내부로 도입할 수 있다(문헌[Cerrato, Carmine Pasquale, and Ulo Langel. "An update on cell-penetrating peptides with intracellular organelle targeting." Expert Opinion on Drug Delivery 19.2 (2022): 133-146.] 등).

in vitro 또는 세포 내에 형성된 PRD 응축물은 3차원 반응 공간 내에서 자유롭게 이동 및 확산할 수 있으며, 특정 생체 분자를 응축물 구획 내에 격리시킴으로써 생체 분자의 생화학적 활성을 조절하는 데에 활용될 수 있다. 예컨대, PRD 응축물 구획 내에 효소와 기질 농도를 농축시킴으로써 전체 반응 속도를 증가시킬 수 있고, 거대분자 크라우딩 효과를 통해 응축물 구획에 포획된 효소 활성을 조절할 수 있다. 그 외에도, PRD 응축물은 세포 내 특정 환경의 감지, 단백질 농도 완충, 특정 생물학적 반응의 활성화 또는 비활성화, 단백질 국소화, 세포소기관의 형태 조절을 위한 응력 제공 등 생체분자 응축물을 통해 의학적 또는 생명공학적으로 적용될 수 있는 실시양태를 따를 수 있다(문헌[Banani, Salman F., et al. (2017)] 등).

PRD에 융합되는 외래 단백질

본 발명에서, PRD에는 상술한 1종 이상의 외래 물질이 컨쥬게이션될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 외래 물질은 PRD 말단에 융합되는 외래 단백질 또는 폴리펩티드이며, 이를 코딩하는 핵산 서열이 PRD를 코딩하는 핵산 서열에 연결된 재조합 벡터 형태로 발현될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 에피토프 태그(Myc)를 PRD에 융합함으로써 세포 내 PRD 응축물의 형성 위치, 구조 및 크기를 관측하였고, 친화성 태그(12-His)를 PRD에 융합함으로써 in vitro에서 PRD 응축물을 소포체 막에 부착시켜 소포체 막 접촉을 유도하였다(실시예 6; 도 6a 및 도 6b).

일 실시양태에서, PRD의 액체-액체 상분리 특성 조절을 위해 1종 이상의 IDR 서열을 PRD 말단에 융합할 수 있다. 이를 통해 PRD 내부의 IDR에 의한 다원자가 상호작용을 증가시킴으로써 액체-액체 상분리가 유도되는 포화농도(C_sat), 응축물의 크기 및 위상 특성 등을 조절할 수 있다(문헌[Alberti, Simon, Amy Gladfelter, and Tanja Mittag. "Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates." Cell 176.3 (2019): 419-434.]).

일 실시양태에서, PRD에 세포 내 특정 구획으로 타겟팅하기 위한 신호 서열, 예컨대, NLS(nuclear localization signal)을 융합함으로써 PRD 응축물을 특정 구획에 국소화하고 PRD 응축물과 상호작용하는 생체분자를 농축할 수 있다.

일 실시양태에서, PRD에 효소 단백질을 융합함으로써 효소 단백질의 생물학적 또는 생화학적 기능을 개선할 수 있다. 예컨대, 핵산 중합효소(예컨대, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 역전사효소 또는 RNA 레플리케이즈 등), 제한효소(예컨대, Type I 내지 V 효소), 라이게이즈 등 분자생물학적 도구로 활용되는 효소를 PRD에 융합함으로써 상기 효소에 거대분자 크라우딩(macromolecular crowding) 효과를 조성함으로써 효소 활성을 증진시킬 수 있다(국제특허 WO2021/094746 등).

일 실시양태에서, PRD에 항체 또는 이의 단편을 융합함으로써 상기 항체에 대한 항원 영역에 PRD 응축물 구획을 형성할 수 있다. 예컨대, 세포막 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 PRD에 융합함으로써 상기 수용체에 PRD 응축물을 형성할 수 있다. PRD 응축물을 엔도사이토시스 등 세포 내부화(internalization) 과정을 거치는 수용체에 결합함으로써, PRD 응축물을 세포 내에 도입하는 데에 사용할 수 있다.

일 실시양태에서, 2종 이상의 외래 물질을 각각 서로 다른 PRD에 컨쥬게이션함으로써, 외래 물질들을 동일한 PRD 응축물 구획에 전달할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 2종의 외래 태그 단백질(Myc 및 GST)을 PRD에 융합한 2종의 SCOTIN 단백질을 세포 내에 과발현시킨 후, GST 풀-다운을 통해 두 태그 단백질이 동일한 PRD 응축물 구획에 전달되어 상호작용한다는 점을 확인하였다(실시예 4; 도 4). PRD에 서로 다른 2종의 외래 물질을 컨쥬게이션하여 동일한 응축물 구획으로 전달하는 방법은 의학적 또는 생명공학적 도구로 유용하게 활용될 수 있다. 예컨대, 세포 수용체에 대한 항체 또는 이의 단편을 PRD에 융합한 제1 PRD와 약물 분자를 컨쥬게이션한 제2 PRD를 세포 외부에 함께 처리함으로써, 제1 PRD는 항체-매개 엔도사이토시스를 유도하고, 제2 PRD는 제1 PRD와 함께 응축물 구획을 형성함으로써 이에 융합된 약물 분자를 제1 PRD와 함께 세포 내부로 전달할 수 있다(문헌[Bai, Xun, et al. "Phase separation enhanced drug delivery system for anti-cancer therapy." (2022).] 등).

PRD 막 부착에 의한 소포체간 막 접촉 유도

일 실시양태에서, PRD에 막 부착 기능을 갖는 막 부착 펩티드를 융합함으로써, 상술한 세포소기관 타겟팅 PRD 또는 SCOTIN 단백질과 같은 내재성 막 단백질이 발휘하는 막 접촉 기능을 구현할 수 있다.

상기 막 부착 펩티드는 소포체 또는 세포소기관의 막에 결합 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드로서, 막 부착 펩티드가 융합된 PRD는 표재성(peripheral) 막 단백질 형태로 소포체 또는 세포소기관의 막에 부착되어 막 상에 PRD 응축물을 형성할 수 있다. 이를 통해, PRD를 포함하는 내재성(integral) 막 단백질과 유사한 기능을 구현할 수 있다.

일 실시양태에서, 막 부착 펩티드로서 친화성 태그 단백질, 예컨대 폴리히스티딘(poly-His), GST, MBP, CBP, Strep-tag, FLAG-tag 등을 사용하고, PRD를 부착하고자 하는 생체막에 상기 친화성 태그 단백질에 대한 리간드를 첨가함으로써 해당 생체막 상에 특이적으로 PRD를 부착할 수 있다. 예컨대, Ni⁺ 친화성 태그 단백질인 폴리히스티딘의 경우, 킬레이터 지질인 DOGS-Ni-NTA를 소포체 성분으로 포함시킴으로써 in vitro에서 PRD를 타겟 소포체 표면에 부착시키는 시스템을 제작할 수 있다(실시예 6; 도 6a 및 도 6b). 소포체 표면에 PRD 응축물을 형성시킴으로써, 내재성 막 단백질(세포소기관 타겟팅 재조합 단백질 또는 SCOTIN 단백질)과 유사하게 소포체 막 접촉을 유도할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 리간드가 컨쥬게이션된 지질을 포함하는 소포체를 시험관 내에 처리하는 단계; 상기 소포체 처리 전후로 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 처리하는 단계(여기서, 상기 PRD에 상기 리간드에 대한 친화성 펩티드가 융합됨); 상기 PRD를 상기 소포체의 막에 부착하는 단계; 및 상기 PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계를 포함하는, 소포체 간 막 접촉을 유도하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 친화성 태그 단백질로 폴리히스티딘 태그 단백질을 이용하고, 이에 대한 리간드인 Ni⁺ 킬레이팅 그룹(NI-NTA)이 컨쥬게이션된 지질을 소포체에 첨가함으로써 소포체 막 상에 PRD를 부착할 수 있고, PRD의 액체-액체 상분리를 통해 소포체 간 막 접촉을 유도할 수 있다(실시예 6; 도 6c 및 도 6d).

상기 소포체는 단일한 1종의 소포체일 수 있고, 크기 또는 형태가 상이한 2종 이상의 소포체를 포함할 수 있다.

PRD를 이용한 응축물 조절물질 선별 방법

일 측면에서, 본 발명은 시험 물질을 처리하는 단계; 상기 시험 물질 처리 전후로 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 처리하는 단계; PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계; 및 상기 PRD의 응축물 형성 수준이, 시험물질이 비처리된 대조군 환경과 비교하여 변화하는 경우 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, PRD의 액체-액체 상분리 조절 물질 선별 방법을 제공한다.

상기 시험 물질은 세포 외부에서 처리되는 저분자 화합물, 펩티드, 항체 또는 이의 단편, 앱타머, 올리고핵산, 고분자 화합물, 다기능성 화합물, 천연물 또는 이들의 조합일 수 있고, 세포 내에서 발현될 수 있는 유전자 컨스트럭트일 수 있다.

상기 PRD 응축물 형성 수준은 액체 방울(liquid droplet) 형성 여부; 응축물의 형성 위치 및/또는 수준; 응축물이 형성된 생체막의 형태; 응축물이 형성된 생체막 간 접촉 수준; 응축물에 의한 소포체 수송 억제 수준; 및 응축물에 의한 생체분자의 격리 수준 또는 이들의 조합을 통해 관측 및 측정될 수 있다. 예컨대, in vitro에서 PRD를 처리한 후 액체 방울을 형성하는 대조군 환경과 비교하여, 시험 물질을 처리 후 액체 방울 형성이 결여되는 경우 시험 물질을 PRD의 액체-액체 상분리 억제 물질로 선별할 수 있으며, 이를 통해 1,6-헥산디올(1,6-hexanediol)을 선별할 수 있다(실시예 2; 도 2a). 상기 상분리 조절 물질은 생체분자 응축물 조절 물질일 수 있으며, 구체적으로 응축물 형성 유도 물질 또는 억제 물질일 수 있다.

상기 액체-액체 상분리 조절 물질의 선별을 위해, PRD에 응축물 특성 분석을 위한 1종 이상의 외래 단백질 또는 폴리펩티드를 융합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 생체분자 응축물 타겟팅 재조합 단백질은 목적 세포소기관의 막 상에 응축물을 타겟팅함으로써 세포소기관의 구조 및 기능을 조절할 수 있고, PRD 또는 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물 형성을 통해 세포소기관 간 접촉 유도 및 ER의 소포체 수송 기능 억제 등 응축물 매개 세포기능을 조절하고 응축물 조절 물질의 선별에 활용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 PRD 생체분자 응축물은 다양한 형태로 의학적 또는 생명공학적 유용성을 발휘할 수 있다.

도 1a는 SCOTIN 단백질의 도메인별 컨스트럭트를 나타내는 모식도이고;
도 1b 및 도 1c는 SCOTIN 단백질 도메인별 컨스트럭트가 과발현된 세포의 면역형광 관찰 결과를 나타내고;
도 1d는 SCOTIN 단백질 영역의 IDR 특성을 예측한 결과를 나타내고;
도 1e는 IDR 결실 SCOTIN 단백질 과발현 세포의 형광 이미지를 나타내고;
도 1f는 ER 막 단백질과 융합된 키메라 PRD가 과발현된 세포의 형광 이미지를 나타내고;
도 2a는 in vitro에서 정제된 PRD의 액체 방울 형성 결과를 나타내고;
도 2b는 PRD 액체 방울 형성 조건에 대한 상 다이어그램을 나타내고;
도 2c는 세포 내 SCOTIN 단백질 응축물에 대한 라이브 이미지 결과를 나타내고;
도 2d 및 도 2e는 세포 내 SCOTIN 단백질에 대한 FRAP 결과를 나타내고;
도 2f는 ER 타겟팅 PRD 응축물에 대한 FRAP 결과를 나타내고;
도 3a는 ER 막 상에 형성된 SCOTIN 응축물에 대한 컨포칼 현미경 관찰 결과를 나타내고;
도 3b는 후기 엔도솜 막에 타겟팅된 SCOTIN 응축물에 대한 형광 이미징 결과를 나타내고;
도 3c는 미토콘드리아 외막에 타겟팅된 SCOTIN 응축물에 대한 형광 이미징 결과를 나타내고;
도 4는 GST 및 Myc이 각각 태깅된 SCOTIN 단백질의 상호작용을 보여주는 GST 풀-다운 결과를 나타내고;
도 5a 및 도 5b는 다양한 SCOTIN 도메인별 과발현 세포에서 ER 및 엔도솜 간 PLA 측정 결과를 나타내고;
도 5c 및 도 5d는 ER 및 엔도솜 타겟팅 PRD가 공동발현된 세포에서 PLA 측정 결과를 나타내고;
도 6a는 in vitro 리포좀 테더링 실험의 모식도를 나타내고;
도 6b는 정제된 PRD의 소포체 막 부착 결과를 나타내고;
도 6c는 PRD가 부착된 소포체(SUV)간 막 접촉 결과를 나타내고;
도 6d는 PRD가 부착된 소포체(SUV 및 GUV)간 막 접촉 결과를 나타내고;
도 7은 ER 및 엔도솜 간 막 접촉 조절에 의한 세포 내 엔도솜 배치 결과를 나타내고;
도 8a는 RUSH 시스템을 통해 SCOTIN 과발현 세포에서 ER에서 골지체로의 막 수송 억제 결과를 나타내고;
도 8b는 RUSH 시스템을 통해 인터페론 감마 처리 세포에서 ER에서 골지체로의 단백질 수송 억제 결과를 나타내고;
도 8c는 SCOTIN 응축물 구획에 COPII 구성요소인 Sec31의 격리를 나타내는 형광 이미징 결과를 나타내고;
도 9a는 SCOTIN 단백질의 IDR 돌연변이 과발현 세포에서 응축물 구조를 관찰한 결과를 나타내고;
도 9b는 SCOTIN 단백질의 IDR 돌연변이 과발현 세포에서 RUSH 시스템을 통해 ER에서 골지체로의 단백질 수송 기능을 측정한 결과를 나타낸다.

<재료 및 실험방법>

플라스미드

SCOTIN-Myc, SCOTIN-mDsRed 컨스트럭트는 SCOTIN 단백질 코딩 서열(UniProt accession number Q8N114)을 pcDNA3.1-Myc(Invitrogen, V80020) 벡터에 클로닝하거나 또는 pEF-DEST51 벡터(Invitrogen, 12285011)에 C-말단에 mDsRed 모노머(pDsRed-monomer-N1; Clontech, 632465)와 함께 클로닝하여 제작하였다.

SCOTIN PRD-Myc, SCOTIN(TMPRD)-Myc, SCOTIN(Δ150-177)-mDsRed 컨스트럭트 등은 QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene, 200519)를 이용해 SCOTIN 서열을 SCOTIN PRD, SCOTIN(TMPRD) 또는 SCOTIN(Δ150-177)로 교체하여 제작하였다.

Str-Ii-SCOTIN-SBP-EGFP 또는 Str-Ii-SCOTIN(Δ150-177)-SBP-EGFP 컨스트럭트는 Str-Ii-VSVG-SBP-EGFP(Addgene, 65300)에서 VSVG를 SCOTIN 또는 SCOTIN(Δ150-177)로 교체하여 제작하였다. Str-Ii-SCOTIN-SBP-mDsRed 및 Str-Ii-SCOTIN(Δ150-177)-SBP-mDsRed는 EGFP를 DsRed 모노머로 교체하여 제작하였다.

모든 컨스트럭트는 DNA 서열분석으로 확인하였다.

세포소기관 막 타겟팅 PRD 키메라

ER 막, 후기 엔도솜 막 및 미토콘드리아 외막에 각각 타겟팅되는 PRD 재조합 단백질 mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β(서열번호 5), CD63-SCOTIN PRD-Myc(서열번호 6), MTS-SCOTIN PRD-YFP(서열번호 7), PTS-SCOTIN PRD-Myc(서열번호 8)을 코딩하는 핵산이 삽입된 플라스미드 벡터(유전자 컨스트럭)를 다음과 같이 제작하였다(MTS: mitochondria targeting sequence, PTS: peroxisome targeting sequence).

mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β 컨스트럭트는 인간 SCOTIN PRD를 Gibson assembly를 이용해 mEmerald-Sec61β-C1(Addgene, 90992)의 BglII 사이트에 추가하여 제작하였다.

CD63-SCOTIN PRD-Myc 컨스트럭트는 인간 SCOTIN PRD 및 인간 CD63 코딩 서열을 pcDNA3.1-Myc 벡터에 클로닝하여 제작하였고, CD63-SCOTIN PRD-YFP는 pcDNA3.1-CD63-SCOTIN PRD-Myc 재조합 벡터에서 Myc을 YFP로 교체하여 제작하였다.

MTS-SCOTIN PRD-YFP 컨스트럭트는 pcDNA3.1-CD63-SCOTIN PRD-YFP에서 CD63을 인간 TOM20(N-말단 33개 아미노산) 코딩 서열로 교체하여 제작하였다(문헌[Kanaji, Sachiko, et al. "Characterization of the signal that directs Tom20 to the mitochondrial outer membrane." The Journal of cell biology 151.2 (2000): 277-288.] 등).

PTS-SCOTIN PRD-Myc 컨스트럭트는 인간 PEX13의 퍼옥시좀 타게팅 시퀀스(135번 내지 354번 아미노산)를 pcDNA3.1-CD63 SCOTIN PRD-Myc에서 CD63을 대체하여 제작하였다(문헌[Fransen, Marc, et al. "Human pex19p binds peroxisomal integral membrane proteins at regions distinct from their sorting sequences." Molecular and cellular biology 21.13 (2001): 4413-4424.]).

세포 배양 및 트랜스펙션

HeLa 및 HEK293 세포는 10% FBS(Welgene, S001-01) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122)으로 보충된 DMEM(Lonza, BE12-604F)에서 배양하였다. 플라스미드를 제조사 설명서에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen, 1668019)으로 세포에 트랜스펙션하였다. 배지를 4 시간 후 교체하고, 48 시간 후 수확하거나 고정하여 후속 실험에 이용하였다.

면역형광법 및 형광 현미경 관찰

세포를 상온에서 4% 파라포름알데히드(Thermo Fisher Scientific, A11313)로 10 분 동안 고정한 후, PBS(Thermo Fisher Scientific, 21600010) 내 0.2% Triton X-100(Thermo Fisher Scientific, BP-151-500)으로 10 분 동안 투과화하였다. 단, RTN4 및 Sec61β 항체 염색에는 PBS 내 0.2% 사포닌(Sigma, 47036-50 g-f)을 이용하였다. 블로킹을 위해 PBST 내 5% BSA 또는 0.2% 사포닌-PBS 내 5% BSA를 상온에서 1 시간 첨가한 후 세포를 1차 항체로 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 면역염색용 1차 항체로 토끼 항-Sec61β(Atlas Antibodies, HPA049407), 토끼 항-RTN4(Bio-Rad, AHP1799), 마우스 항-giantin(Abcam, ab37266), 토끼 항- EEA1(Cell Signaling, C45B10), 마우스 항-CD63(BD Pharmingen, 556019), 마우스 항-LAMP1(Abcam, ab25630), 토끼 항-TfR(Abcam, ab84036) 및 FITC 항-Myc(Abcam, ab1263)을 이용하였다. 그 다음, PBST 내 Alexa Fluor 405(Abcam, ab175651) 또는 Alexa Fluor 488, 568, 647(Invitrogen, A21206, A21202, A10042, A10037, A31573, A31571)에 컨쥬게이션된 2차 항체를 세포와 함께 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포핵을 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 시약(Invitrogen, R37606)으로 가시화하였다. 제조사 설명서에 따라 MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen, M22426)를 이용하여 미토콘드리아를 염색하였다. 커버슬립을 형광 마운팅 배지(Dako, s3023)로 마운팅하고 LSM800 컨포칼 현미경을 이용해 63X 대물렌즈로 이미지를 획득하였다.

SCOTIN PRD 단백질 정제

12-His가 태깅된 SCOTIN PRD 단백질(서열번호 4)을 제조하기 위해, 단백질 정제에 이용되는 SCOTIN PRD 및 PRD(Δ150-177) 발현용 플라스미드는 Gibson assembly를 이용해 pET28a 벡터에 SCOTIN cDNA로부터 증폭된 해당 DNA 절편을 TEV 절단 사이트와 함께 삽입하여 제작하였다.

pET28a 벡터에 삽입된 12His-SCOTIN PRD 또는 12His-SCOTIN(PRDΔ150-177)를 E.coli BL21(DE3)에서 과발현시켰다. 박테리아를 TB(Terrific Broth) 배지에서 37 ℃에서 8 시간 동안 진탕 배양 후 17 ℃에서 36 시간 동안 후속 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 박테리아 펠렛을 라이시스 버퍼(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일; pH 7.9)로 재현탁 및 초음파 처리를 통해 용해시켰다. 그 후, 원심분리(12000×g, 4 ℃)를 통해 용해물 펠렛을 수득한 후, 상온에서 2 시간 동안 교반하여 바인딩 버퍼(8 M 우레아, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 25 mM 이미다졸; pH 7.9) 내에 용해시켰다. 원심분리(12,000×g, 4 ℃)를 통해 바인딩 버퍼 내 펠렛 형태의 세포 파쇄물을 제거하고, 상층액을 HisTrap™ HP 컬럼(Cytiva)을 이용해 정제하였다. 용출된 단백질을 FPLC(AKTA go, Cytiva)를 이용한 젤 필트레이션(HiLoad® 16/600 Superdex® 200 pg)으로 추가 정제하였다. 단백질을 탈염 컬럼(PD-10, Cytiva)을 이용해 스토리지 버퍼(20 mM sodium acetate, 150 mM NaCl; pH 5)로 투석하였다. 그 다음, Vivaspin® concentrators (Sartorius)로 단백질을 실험에 필요한 농도로 농축한 후 -80 ℃에 보관하였다.

In vitro 상 분리 어세이

액체-액체 상분리(LLPS) 분석을 위해 정제된 단백질(10 μM)을 LLPS 버퍼(pH 7.5에서 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 10% PEG8000)에 혼합하였다. 단백질 2 uL을 LLPS 버퍼와 혼합하고 3% BSA 코팅 글래스 슬라이드에 로딩하고 커버 슬립으로 덮은 후 LLPS 액체 방울을 관찰하였다. 액체 방울 이미지는 단백질과 LLPS 버퍼가 혼합된 후 Axiovert 200 M 현미경(Zeiss) 또는 FV3000 컨포칼 현미경(Olympus)으로 즉시 촬영하였다.

라이브 이미징 및 FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching) 어세이

라이브 이미징을 위해 35-mm 디쉬 내 배양액과 함께 배양한 SCOTIN-mDsRed 발현 HeLa 세포를 LSM800 컨포칼 현미경으로 촬영하였다. FRAP 분석을 위해 전체 응축물을 커버하는 구형 영역을 최고 레이저 출력으로 블리칭하였다. 형광 세기를 최소 인터벌로 측정하였다. FRAP 결과는 동일한 세포 내에서 블리칭되지 않은 동일 면적의 대조군 영역을 기준으로 정규화하여 산출하였다. 상대 세기는 측정 세기를 블리칭 전 최초 세기로 나누어 계산하였다. Plateau 및 t_1/2 수치는 GraphPad Prism 8 program 비선형 회귀분석으로 산출하였다.

GST 풀-다운(pulldown)

HEK-293 세포를 NP-40 라이시스 버퍼(pH 7.4에서 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 1% Nonidet P-40)로 용해시켰다. 세포 용해물(2.5 mg)을 40 μL의 글루타치온-세파로오스 비드(GE Healthcare)와 함께 4 ℃에서 배양하였다. 그 다음, 비드를 NP-40 라이시스 버퍼로 5 회 세척하고, 95 ℃에서 5% β-머캡토에탄올로 보충된 램나이(Laemmli) 샘플 버퍼로 10 분 동안 배양하여 단백질을 비드로부터 용출시켰다. 그 다음, 웨스턴 블롯팅을 통해 태그 단백질의 검출 여부를 확인하였다.

웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅 분석을 위해, 세포를 라이시스 버퍼(25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 데옥시콜린, 0.1% SDS, 1 mM DTT, 2 μg/ml 펩스타틴, 0.1 mg/ml PMSF, 5 μg/ml 아프로티닌, 5 μg/ml 류펩틴 및 1 mM 벤즈아미딘)에 얼음에서 30 분 동안 용해시켰다. 13,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리 후, 상층액 내 단백질을 브래드포드 방법으로 정량화하였다(Bio-Rad, BR 5000006). 세포 용해물을 5X 단백질 로딩 버퍼(15% SDS, 0.825 M 수크로오스, 0.325 M Tris-Cl (pH 6.8), 0.002% 브로모페놀 블루, 5% β-머캡토에탄올)로 혼합하고, 95 ℃에서 15 분 동안 처리하였다. 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에 분리하고, 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad, BR 162-0115)으로 옮긴 뒤, 항체를 처리하였다. 니트로셀룰로스 막을 HRP(horseradish)-컨쥬게이션된 2차 항체(Thermo Fisher Scientific, 31430 및 31460)로 인큐베이션하고, LAS4000 luminescent 이미지 분석기(Fujifilm Life Science)를 이용해 면역반응 신호를 시각화하였다. 신호는 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Scientific, 34096)을 이용해 획득하였다.

PLA(proximity ligation assay)

실험은 제조사 설명서(Sigma-Aldrich, DUO92101)에 따라 수행하였으며, 구체적으로, 샘플을 마우스 항-VAPA(Santa Cruz, sc-293278), 항-RTN4(Santa Cruz, sc-271878), 항-Rab7(Cell Signaling Technology, 9367S) 또는 항-MLN64(Abcam, ab3478) 항체 등으로 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 음성 대조군 샘플은 단일 항체만으로 인큐베이션하였다. 세척 후 세포를 항-토끼 PLA PLUS 및 항-마우스 PLA MINUS 프로브(Duolink; Sigma-Aldrich, DUO92002 및 DUO92004)로 37 ℃에서 1 시간 동안 습식챔버에서 인큐베이션하였다. 혼성화된 상보적 프로브의 라이게이션 후(30 분, 37 ℃),적색 또는 녹색 형광 라벨링된 뉴클레오티드로 회전 환 증폭(rolling circle amplification)을 37 ℃에서 100 분간 진행되게 하였다. 그 후, 형광 스팟을 컨포칼 현미경으로 수집 및 정량화하였다.

인공 리포좀의 제조

SUV(small unilamellar vesicle)를 제조하기 위해, 먼저 클로로포름 내에서 73%(mol/mol) POPC(Avanti Polar Lipids, 850457P), 20% DOPS(Avanti Polar Lipids, 840035C), 5% DOGS-NTA(Avanti Polar Lipids, 790404P) 및 2% Rh-PE(Avanti Polar Lipids, 810146C)를 혼합하였다. 클로로포름을 증발시킨 후, 1 mL의 재현탁 버퍼(20mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150mM NaCl 및 10%[v/v] 글리세롤)에서 30 분 동안 격렬한 볼텍싱 및 음파처리를 통해 얇은 지질 필름을 완전히 재현탁시켰다. SUV 제조를 위해 혼합물이 혼탁한 상태에서 투명한 상태가 될 때까지 초음파 처리를 하였다. 그 다음, 40 ℃에서 폴리카보네이트 막(Avanti Polar Lipids, 610003, pore diameter 50 nm)을 갖춘 미니-압출기(mini-extruder)를 통해 수득된 리포좀 현탁액을 25회 압출하였다. 4 mM 지질 농도의 리포좀 현탁액을 이용 전까지 4 ℃에서 보관하였다. 리포좀의 크기 분포는 동적 광산란 장치(DLS; Malvern Instruments, Nano S90)로 측정하였다.

GUV(giant unilamellar vesicle)을 제조하기 위해, 먼저 100 mg/mL의 농도로 폴리비닐 알콜(PVA; Alfa Aesar, 41240, average MW 88,000-97,000) 용액을 탈이온수(DW) 내에 제조하고, 20-30 μL의 PVA 용액을 슬라이드 글래스에 고르게 펴바른 다음, 50 ℃에서 30 분 동안 건조시켜 얇은 PVA 필름을 만들었다. 93%(mol/mol) POPC(Avanti Polar Lipids, 850457P), 5% DOGS-NTA(Avanti Polar Lipids, 790404P) 및 2% Cy5-PE(Avanti Polar Lipids, 810335C)를 함유한 지질 혼합물을 클로로포름 내에 1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 총 20-30μL의 지질 혼합물을 PVA-코팅된 글래스 슬라이드에 적가한 후 부드럽게 퍼져나가게 하였다. 그 다음, 진공 하에서 최소 1 시간 동안 클로로포름을 완전히 제거하였다. GUV 형성을 위한 챔버 제조를 위해, 지질-코팅된 슬라이드 글래스에 O-링을 부착하고, 200 mM 수크로오스, 50 mM NaCl 및 20 mM Tris(pH 8.2)를 함유한 200μL의 GUV 형성 버퍼를 챔버에 충전하였다. 1 시간 동안 암실에서 인큐베이션한 후, 챔버 내 GUV 현탁액을 회수하였다. 수득된 GUV 현탁액을 이용 전까지 4 ℃에서 보관하였다. 크기는 컨포칼 현미경으로 모니터링하였다.

리포좀 테더링 어세이

SUV 및 GUV의 막 지질 성분인 DOGS-NTA에 SCOTIN PRD가 결합할 수 있도록 SCOTIN PRD에 막부착 펩티드인 폴리(His) 태그(12-His)를 융합하였다. 정제된 12His-SCOTIN PRD는 10 μM, SUV은 2 mM, GUV은 1 mg/mL의 농도로 실험에 이용하였고, 리포좀 공동-침강 어세이(liposome co-sedimentation assay)를 통해 SCOTIN PRD가 소포체의 막 상에 부착되었는지 확인하였다(문헌[Segawa, Kazuya, Naoki Tamura, and Joji Mima. "Homotypic and heterotypic trans-assembly of human Rab-family small GTPases in reconstituted membrane tethering." Journal of Biological Chemistry 294.19 (2019): 7722-7739.] 및 문헌[Wu, Xiandeng, et al. "Vesicle tethering on the surface of phase-separated active zone condensates." Molecular Cell 81.1 (2021): 13-24.] 등).

SCOTIN-KO 세포의 제작

SCOTIN 녹아웃(KO) 세포주는 SCOTIN-KO 및 HDR 플라스미드(Santa Cruz Biotechnology, sc-408226, sc-408226-HDR)를 이용해 제작하였다. gRNA/Cas9 발현 플라스미드 및 도너 플라스미드를 푸로마이신이 함유된 배지에서 HeLa 세포로 트랜스펙션하였다. 각 콜로니에 대해 웨스턴 블롯팅을 통해 SCOTIN 단백질의 발현이 결실되었음을 확인하였다.

통계적 분석

모든 통계 분석 및 그래프 생성은 GraphPad Prism을 이용하였으며, 통계적 차이는 두 그룹간 비교를 위해 two-tailed unpaired t-test로 평가하였다. 세 개 이상의 언매칭 그룹 평균을 비교하기 위해, Turkey's multiple comparison으로 one-way ANOVA를 이용하였다. 모든 데이터를 평균±표준오차(또는 편차)로 표시하였고, 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, n.s.(유의하지 않음)으로 표시하였다.

<실시예>

실시예 1. 프롤린 풍부 도메인(PRD)의 응축물 형성 기능

SCOTIN 단백질의 다양한 도메인별 컨스트럭트 SCOTIN, SCOTIN(ΔPRD), SCOTIN(TMPRD), SCOTIN PRD, SCOTIN(Δ150-177)를 세포에 트랜스펙션시킨 후 형광 현미경 관찰을 통해 응축물 형성 여부를 조사하였다(도 1a).

그 결과, HeLa 세포에 SCOTIN-Myc 단백질 또는 SCOTIN(TMPRD)-Myc 단백질을 과발현시킨 후 면역형광 관찰시 응축물이 관찰되었으나, SCOTIN(ΔPRD)-Myc 단백질을 과발현시킨 경우 응축물은 관찰되지 않았다(도 1b; 스케일바 10 μm). 반면, 막관통 도메인이 없는 PRD-Myc를 과발현시킨 후 컨포칼 현미경 관찰시 SCOTIN(TMPRD)-Myc 과발현 세포에와 마찬가지로 응축물이 관찰되었다(도 1c; 스케일바 10 μm).

알파폴드 프로그램 분석 결과, PRD 도메인은 구조적 시그니처가 약한 본질적으로 무질서한 영역으로 예측되었으며, 특히 IDR 예측 프로그램 분석 결과 PRD 중 28개 아미노산으로 구성된 영역(SCOTIN 단백질 기준 150-177번 아미노산 서열)은 강한 IDR(intrinsically disordered region) 특성을 갖는 영역으로 예측되었다(도 1d). SCOTIN 단백질 중 상기 IDR이 결실된 SCOTIN(Δ150-177) 컨스트럭트를 제작하여 HeLa 세포에 트랜스펙션시킨 후 컨포칼 현미경으로 관찰한 결과, SCOTIN 과발현 세포에서 관찰되었던 응축물 구조는 더 이상 관찰되지 않았다(도 1e; 스케일바 10 μm).

PRD를 제외한 SCOTIN 막 단백질 영역을 내재성(integral) ER 막 단백질 Sec61β로 교체한 키메라 PRD(Sec61β-PRD-mEmerald) 컨스트럭트를 제작하여 HeLa 세포에 트랜스펙션시킨 후 현미경 관찰을 수행하였다. 그 결과, 키메라 PRD 과발현 세포에서 뚜렷한 구형의 응축물 구조가 관찰된 반면, PRD가 융합되지 않은 Sec61β-mEmerald 과발현 세포나, IDR이 결실된 Sec61β-PRD(Δ150-177)-mEmrald 과발현 세포에서는 응축물 구조가 관찰되지 않았다(도 1f; 스케일바 10 μm).

상기 실험 결과들은, 세포 내에서 PRD가 IDR에 의해 매개된 응축물을 형성할 수 있으며, PRD 단독으로 세포질 내에 응축물을 형성하거나 또는 외래 막 단백질 도메인을 통해 세포소기관 막 상에 응축물을 형성할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 2. PRD 응축물의 액체-액체 상분리 기능

IDR에 의해 매개된 PRD 응축물의 상 분리 특성을 조사하기 위해, 정제된 PRD를 in vitro에서 처리한 후 현미경 관찰을 수행하였다. 그 결과, 생리학적 염 농도(150mM) 및 중성 pH(7.0)에서 처리된 PRD(10 μm)는 응축하여 액체 방울(liquid droplet)을 형성하였다(도 2a; 스케일바 10 μm). 액체 방울을 형성할 수 있는 단백질 농도 및 pH 상 다이어그램은 도 2b에 나타내었다. 반면, 액체 방울이 형성된 환경에서 액체-액체 상분리 억제제 1,6-헥산디올(5% w/v)을 더 처리하거나, PRD 대신 PRD(Δ150-177)를 처리한 경우 액체 방울이 형성되지 않았다(도 2a).

상기 결과들은, in vitro에서 PRD가 IDR에 의해 매개된 응축물을 형성할 수 있으며, 이 응축물은 액체-액체 상분리를 통해 형성된 액체 또는 젤 기반의 응축물임을 보여주는 것이다.

세포 내에서 PRD 응축물의 액체-액체 상분리 특성을 관찰하기 위해 SCOTIN-mDsRed 발현 HeLa 세포에서 컨포칼 라이브 이미징을 수행하였다. 그 결과, 수 내지 수십 초의 관찰 기간 동안 응축물에서 융합(fusion) 및 분열(fission)이 역동적으로 전개되고 있음을 확인하였다(도 2c; 스케일바 10 μm).

다음으로, 응축물 경계로 분자 재배열이 일어나는지 조사하기 위해, SCOTIN-mDsRed 발현 세포에서 응축물 부위를 형광 블리칭한 후 형광 신호의 회복 양상을 측정하는 FRAP 실험을 수행하였다. 그 결과, SCOTIN-mDsRed 발현 세포에서는 응축물 영역의 블리칭 후 형광 신호 회복이 느리게 일어나는 반면(도 2d; t_1/2 = 122.6s; Plateau = 62.53), SCOTIN(Δ150-177)-mDsRed 발현 세포에서는 액체-액체 상분리가 일어나지 않는 ER 막 단백질과 유사한 수준으로 형광 신호 회복이 매우 빠르게 일어났다(도 2e; t_1/2 = 10.72s; Plateau = 83.16).

더욱이, 실시예 1의 ER 타겟팅 키메라 PRD 응축물에서의 분자 재배열 속도를 FRAP 측정한 결과, ER 마커 단백질(Emerald-Sec61β)에서는 빠른 형광 신호 회복이 나타났으나(도 2f; t_1/2 = 6.737s; Plateau = 93.61), 키메라 PRD(mEmerald-PRD-Sec61β)의 형광 회복 속도는 훨씬 느리게 나타났다(도 2f; t_1/2 = 162.1s; Plateau = 66.21).

상기 결과들은, 세포 내에서 세포소기관의 막 상에 형성된 PRD 응축물이 액체-액체 상분리를 통해 형성된 액체 또는 젤 기반의 응축물임을 보여주는 것이다.

실시예 3. 세포소기관 막 상에 타겟팅되는 PRD 응축물 관찰

SCOTIN-Myc 발현 세포를 RTN4와 공염색한 후 ER 영역을 컨포컬 현미경으로 관찰한 결과, SCOTIN은 ER tubule 마커(RTN4)와 동일 영역에 위치하였고(이미지 I), 작은 구형 응축물 구조를 형성하거나(이미지 II) 또는 ER tubule을 한 군데로 얽히게 하는 크고 불규칙한 응축물 구획을 형성하고 있음(이미지 III)을 관찰하였다(도 3a). 키메라 PRD(mEmerald-SCOTIN PRD-Sec61β) 과발현을 통해 ER 막 상에 PRD를 타겟팅 경우에도 PRD 응축물은 ER 막 상에서 뚜렷한 구형의 PRD 응축물을 형성하였다 (도 1e).

후기 엔도솜에 타겟팅되는 CD63을 막 단백질로 연결한 CD63-SCOTIN PRD-Myc을 세포 내에 과발현한 경우, PRD 응축물이 엔도솜 막 상에 타겟팅되어 응축물을 형성하고, 엔도솜들이 클러스터화된 구획을 형성함을 관찰하였다(도 3b).

미토콘드리아 외막을 타겟팅하는 미토콘드리아 신호서열(MTS) TOM20의 N-말단 33개 아미노산 서열을 막 단백질로 연결한 TOM20(N33)-PRD-YFP을 세포 내에 과발현한 경우, PRD 응축물이 미토콘드리아 외막에 타겟팅되어 응축물을 형성하였고, 응축하고, 미토콘드리아의 분절화(fragmentation)된 형태가 관찰되었다(도 3c).

상기 실험 결과들은, 세포소기관의 막에 타겟팅되는 막 단백질을 이용하여 PRD 응축물을 해당 세포소기관의 막 상에 타겟팅할 수 있고, 이를 통해 세포소기관의 응축 등 형태 변화를 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 4. PRD 응축물 구획으로 외래 단백질의 전달

HEK293 세포에 SCOTIN-GST 플라스미드와 함께, SCOTIN-Myc 또는 SCOTIN(Δ150-177)-Myc 플라스미드를 48 시간 동안 트랜스펙션시켰다. 전체 세포 용해물에 대해 글루타치온-세파로오스 비드(glutathione-Sepharose bead)를 이용해 SCOTIN-GST에 대해 풀-다운(pulldown)을 수행하고, 면역블롯팅을 통해 SCOTIN-GST와 상호작용하는 단백질을 분석하였다.

그 결과, SCOTIN-Myc이 트랜스펙션된 경우 풀-다운된 침전물에서 Myc 태그 단백질이 검출된 반면, SCOTIN(Δ150-177)-Myc이 트랜스펙션된 경우에는 Myc 태그 백질이 검출되지 않았다 검출되지 않았다(도 4).

상기 실험 결과는, PRD에 외래 단백질을 융합시킴으로써 PRD 응축물 구획에 외래 단백질을 전달할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 5. PRD 응축물에 의한 세포소기관 막 접촉 조절

PLA(proximity ligation assay)는 2종의 단백질이 근접한 거리(예컨대, 약 40nm 이하)에 놓여 있을 때 증폭 신호를 검출할 수 있으며, 세포소기관의 막 단백질에 대해 PLA를 수행함으로써 두 세포소기관의 막 접촉 수준을 측정할 수 있다.

먼저, SCOTIN-mDsRed가 과발현된 SCOTIN-KO HeLa 세포에서 ER-엔도솜 테더링 단백질인 VAPA(ER 단백질) 및 Rab7(후기 엔도솜 단백질)에 대해 PLA를 수행하여 ER 및 후기 엔도솜 간의 막 접촉 수준을 측정하였다. 그 결과, SCOTIN-KO HeLa 세포에서 PLA 신호는 야생형 HeLa 세포에 비해 현저히 감소하였으나, full-length SCOTIN이 과발현된 경우 막 접촉 수준이 야생형 수준으로 회복되었다. 그러나, SCOTIN(ΔPRD) 또는 SCOTIN(Δ150-177)를 과발현시킨 경우에는 막 접촉 수준이 회복되지 않았다(도 5a). SCOTIN-KO 세포에 SCOTIN, TMPRD 또는 PRD를 각각 발현시킨 경우, SCOTIN 및 TMPRD는 ER 및 엔도솜의 막 접촉 수준을 회복시킨 반면, PRD는 회복시키지 못하였다(도 5b).

ER 및 후기 엔도솜을 각각 타겟팅하는 키메라 PRD (Sec61β-PRD-mEmerald 및 CD63-PRD-Myc) 컨스트럭트를 세포에 공동 발현시킨 후, 두 세포소기관의 막에 타겟팅된 PRD 응축물에 의해 막 접촉이 유도될 수 있는지 면역형광 관찰을 통해 조사하였다. 그 결과, ER 및 후기 엔도솜의 막 상에 각각 타겟팅된 두 키메라 PRD는 동일한 위치에서 관찰되었다(도 5c). 추가적으로, VAPA 및 Rab7에 대해 PLA를 수행한 결과, 2종의 키메라 PRD가 공동 발현된 경우 ER 및 엔도솜 간 근접도가 증가하였다(도 5d).

상기 실험 결과들은, PRD가 두 세포소기관(ER 및 엔도솜)의 막 상에 위치하여, PRD 응축물을 형성함으로써 세포소기관 간의 막 접촉을 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 6. 소포체 막 상에 부착된 PRD 응축물에 의한 막 접촉 조절

PRD를 소포체 막 상에 부착할 경우 소포체 간 막 접촉을 유도할 수 있는지 조사하기 위해 in vitro 리포좀 테더링 분석을 수행하였다(도 6a). 실험을 위해 크기가 서로 상이한 2종의 리포좀(GUV, SUV)을 제작하하였으며, GUV는 직경 약 10 μm의 거대 리포좀으로서 막 곡률이 무시할만큼 작기 때문에 막 정렬(membrane alignment)을 모니터링하기에 용이하고, SUV는 직경 약 30 nm의 리포좀으로서 세포 내 구형 소포체와 유사한 형태이다. 리포좀 관찰을 위해, SUV 및 GUV는 각각 로다민 B 및 Cy5가 컨쥬게이션된 지질로 라벨링하였다. 12-His로 태깅된 PRD를 소포체 막 상에 부착하기 위해, 리포좀을 5% DOGS-Ni²⁺-NTA로 도핑하였다. 12His-PRD의 리포좀 부착은 리포좀 공동침강 분석을 통해 확인하였다(도 6b).

형광 염색된 리포좀에 대해 컨포칼 현미경 관찰 결과, SUV만 처리된 환경과 달리 SUV에 PRD를 부착시킨 경우 SUV끼리 서로 리포좀 클러스터를 형성하였으며, PRD 대신 PRD(Δ150-177)을 SUV에 부착한 경우 리포좀 클러스터가 형성되지 않았다(도 6c; 스케일바 10 μm).

SUV와 GUV를 함께 처리한 경우, PRD가 부착된 PRD-GUV의 표면 상에 정렬된 PRD-SUV 응축물(도 6d, Type I) 또는 PRD-GUV 표면 상에서 클러스터화된 PRD-SUV 응축물이 관찰되었으나(도 6d, Type II), IDR 결실 PRD가 부착된 PRDΔ150-177-SUV를 처리한 경우에는 PRD-GUV와 막 접촉을 형성하지 못하였다(도 6d).

상기 실험 결과들은, PRD를 소포체 막 표면에 부착시킴으로써 PRD 응축물에 의한 소포체 간 막 접촉을 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 7. PRD 응축물에 의한 세포 내 세포소기관의 배치 조절

후기 엔도솜은 세포 내에서 주로 세포핵 근처(perinuclear; PN) 영역에 배치되어 PN 클라우드를 형성하는 것으로 알려져있다. 세포 내에서 PRD 응축물에 의한 두 세포소기관(ER 및 엔도솜) 간 접촉 조절이 엔도솜의 공간적 배치에 미치는 영향을 조사하였다. SCOTIN KO 세포에 Rab7-EGFP를 트랜스펙션하고 후기 엔도솜의 세포 내 분포를 형광 현미경으로 관찰한 결과, 야생형 세포에서 후기 엔도솜은 PN 클라우드에 주로 배치되었으나, SCOTIN KO 세포에서 후기 엔도솜은 더 분산된 형태로 세포 주변부에서 종종 관찰되었다. SCOTIN KO 세포에 SCOTIN-mDsRed를 과발시킨 경우, 후기 엔도솜이 PN 클라우드에 다시 억류되지만, 응축물 돌연변이 SCOTINΔ150-177이 발현된 경우에는 이와 같은 엔도솜 배치의 회복이 관찰되지 않았다(도 7).

상기 실험 결과는, PRD 응축물에 의한 세포소기관 접촉 조절을 통해, 세포소기관의 공간적 배치를 조절할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 8. PRD 응축물에 의한 ER에서 골지체로의 수송 조절

RUSH(retention using selective hook) 시스템은 ER 후크 단백질과 리포터 단백질을 공동으로 발현시킬 수 있는 바이시스트론 발현 플라스미드(bicistronic expression plasmid)로 구성되며, 여기서 후크 단백질은 ER 체류 서열(예컨대, MHRRRSRSCREDQKPV, KDEL 등)이 태깅된 Str(streptavidin)이고, 리포터 단백질에는 Str에 결합되는 SBP(streptavidin-binding protein)과 추적용 형광 단백질(예컨대, EGFP 등)이 융합된다. 후크 및 리포터 단백질이 세포 내에 공동 발현되면 Str과 SBP간 결합에 의해 리포터 단백질이 ER에 인위적으로 억류되지만, 바이오틴을 외부에서 처리하게 되면 Str과 SBP간 결합이 붕괴되고 리포터 단백질이 후크 단백질에서 해방된다. 이때, 형광 현미경으로 SBP에 융합된 형광 단백질 신호를 관찰하면 리포터 단백질의 세포 내 수송 경로를 모니터링할 수 있다(문헌[Boncompain et al.] 등 참조).

분비성 경로를 따라 ER에서 골지체를 거쳐 세포막으로 이동하는 E-카드헤린을 리포터 단백질로 이용한 RUSH 시스템을 ER 후크 단백질과 함께 발현시킨 후 형광 관찰을 수행한 결과, 야생형 세포에서는 바이오틴 처리 전 ER에 억류된 SBP-EGFP-E-카드헤린이 바이오틴 처리 15분 후 골지체(G130: 골지체 마커 단백질)로 이동하였다. 반면, SCOTIN 과발현 세포에서는 바이오틴 처리 후 E-카드헤린의 골지체 이동 수준이 야생형 세포에 비해 현저히 감소하였고, SCOTIN(Δ150-177) 발현 세포에서는 대조군인 Sec61β 과발현 세포 수준으로 회복되었다(도 8a; 스케일바 10 μm).

한편, RUSH 시스템이 도입된 야생형 세포에서 SCOTIN 발현 유도 물질인 인터페론γ(IFN-γ)을 외부에서 처리한 경우 바이오틴 처리 15 분 후 나타나는 E-카드헤린의 골지체 이동은 억제되었으나, 야생형 세포 대신 SCOTIN KO 세포에서 인터페론γ을 처리한 경우에는 E-카드헤린의 골지체 이동 억제는 나타나지 않았다(도 8b).

ER에서 골지체로의 소포체 수송은 Sec16, Sec23/24, Sec31/13 등 COPII 구성요소의 결합을 통해 수행된다. SCOTIN 과발현 세포에서 Sec31은 Sec16 대신 SCOTIN 응축물 영역에서 관찰되었으나, SCOTIN 대신 SCOTIN(Δ150-177)이 과발현된 세포에서는 SCOTIN 응축물에 Sec31의 격리는 나타나지 않았다(도 8c).

상기 결과들은, ER의 막 상에 형성되는 SCOTIN 응축물이 COPII 구성요소(Sec31)를 격리함으로써 SCOTIN 단백질 발현 환경에서 ER에서 골지체로의 소포체 수송을 억제할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 9. IDR 돌연변이에 의한 PRD 응축물 형성 기능 상실

OncoMX(문헌[Dingerdissen et al., 2020])에 보고된 암 돌연변이 데이터를 분석하여 SCOTIN 단백질 기능에 영향을 미칠 가능성이 높은 점 돌연변이 영역을 조사하였다. 이중, SCOTIN 단백질의 IDR 영역인 150 내지 177번째 영역에 발생한 점 돌연변이를 SCOTIN-mDsRed 컨스트럭트에 도입한 후 HeLa 세포에 트랜스펙션시켜 응축물 형성 여부를 조사하였다. 그 결과, S151P, A157 및 161stop 돌연변이에서 응축물 형성 기능이 상실되는 것을 확인하였다(도 9a).

IDR 점 돌연변이가 SCOTIN 단백질의 ER에서 골지체로의 수송 억제 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 돌연변이 SCOTIN 단백질 발현 세포에서 E-카드헤린 RUSH 리포터로 소포체 수송 기능을 추적하였다. 그 결과, S151P, A157D 및 161stop 돌연변이는 ER에서 골지체로의 RUSH 리포터(E-카드헤린) 수송을 억제하지 못하였다(도 9b).

상기 실험 결과들은, PRD의 IDR에 발생하는 돌연변이로 인해 응축물 형성 기능 및 이를 매개로 하는 소포체 수송 조절 기능이 상실될 수 있음을 보여주는 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

1. (i) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD(proline-rich domain); 및
   (ii) 상기 PRD에 융합된 세포소기관 타겟팅 막 단백질(여기서, 상기 막 단백질은 SCOTIN 단백질에서 유래하지 않음)을 포함하는,
   세포소기관의 막 상에 생체분자 응축물을 타겟팅하기 위한 재조합 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 세포소기관 타겟팅 막 단백질은
   (a) 세포소기관 마커 단백질; 또는
   (b) 신호 펩티드가 융합된 막관통 도메인인,
   재조합 단백질.
3. 제 1 항에 있어서, PRD에 외래 단백질이 융합된 것인, 재조합 단백질.
4. 제 1 항에 있어서, 세포소기관은 ER, 엔도솜 또는 미토콘드리아인 재조합 단백질.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 핵산.
6. 제 5 항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
7. 제 6 항의 재조합 벡터가 도입된 세포.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 분리된 진핵세포에서 발현시키는 단계;
   상기 진핵세포의 단백질 분류 시스템에 의해 재조합 단백질이 세포소기관으로 타겟팅되도록 하는 단계; 및
   상기 세포소기관의 막 상에서 PRD의 액체-액체 상분리가 유도되도록 하는 단계를 포함하는,
   세포소기관의 막 상에 생체분자 응축물을 타겟팅하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 제1 및 제2 재조합 단백질을 분리된 진핵세포에서 발현시키는 단계;
   상기 진핵세포의 단백질 분류 시스템에 의해 제1 및 제2 재조합 단백질이 각각 제1 및 제2 세포소기관으로 타겟팅되도록 하는 단계; 및
   상기 제1 및 제2 세포소기관의 막 상에서 PRD의 액체-액체 상분리가 유도되도록 하는 단계를 포함하고,
   여기서, 상기 제1 및 제2 재조합 단백질은 각각 제1 및 제2 세포소기관 타겟팅 막 단백질을 포함하고, PRD는 모두 세포질 영역으로 노출되는 것인,
   세포 내에서 제1 및 제2 세포소기관의 막 접촉을 유도하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 제1 세포소기관은 ER이고, 제2 세포소기관은 엔도솜인 방법.
11. 분리된 진핵세포에서 SCOTIN 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및
    상기 SCOTIN 단백질 중 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계
    를 포함하는, 세포소기관의 막 상에 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물을 형성하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, SCOTIN 단백질의 발현 유도는
    (i) SCOTIN 단백질을 코딩하는 핵산을 세포 내에 도입하거나; 또는
    (ii) 인터페론 처리 및 DNA 손상 신호 중 어느 하나 이상의 SCOTIN 발현 유도 환경을 조성하는 것에 의해 수행되는 것인, 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 세포소기관은 ER을 포함하는 것인 방법.
14. 제 13 항에 있어서, ER 막 상에 형성된 SCOTIN 단백질의 생체분자 응축물은 하기 중 어느 하나 이상을 유도하는 것인, 방법.
    (i) ER 막 구조의 응축;
    (ii) ER에서 골지체로의 소포체 수송 억제; 및
    (iii) ER 및 엔도솜 간 접촉.
15. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 처리하는 단계; 및
    PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계
    를 포함하는, 생체분자 응축물을 형성하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, PRD 응축물은 in vitro에서 액체 방울(liquid droplet)을 형성하는 것인 방법.
17. 제 16 항에 있어서, PRD에 외래 펩티드가 태깅된 것인, 방법.
18. 리간드가 컨쥬게이션된 지질을 포함하는 소포체를 시험관 내에 처리하는 단계;
    상기 소포체 처리 전후로 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 처리하는 단계(여기서, 상기 PRD에 상기 리간드에 대한 친화성 펩티드가 융합됨);
    상기 PRD를 상기 소포체의 막에 부착하는 단계; 및
    상기 PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계
    를 포함하는, 소포체 간 막 접촉을 유도하는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 리간드는 Ni-NTA(Nitrilotriacetic acid)이고, 친화성 펩티드는 폴리히스티딘(polyhistidine)인, 방법.
20. 제 18 항에 있어서, 소포체는 2종 이상의 소포체를 포함하는 것인, 방법.
21. 시험 물질을 처리하는 단계;
    상기 시험 물질 처리 전후로 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PRD를 처리하는 단계;
    PRD의 액체-액체 상분리를 유도하는 단계; 및
    상기 PRD의 응축물 형성 수준이, 시험물질이 비처리된 대조군 환경과 비교하여 변화하는 경우 시험 물질을 선별하는 단계
    를 포함하는, PRD의 액체-액체 상분리 조절 물질 선별 방법.
22. 제 21 항에 있어서, PRD의 액체-액체 상분리 조절 물질은 하기 중 어느 하나 이상의 조절 물질인 선별 방법:
    (i) ER 및 엔도솜 간 접촉 조절 물질; 또는
    (ii) ER에서 골지체로의 소포체 수송 조절 물질.