KR20250019640A

KR20250019640A - 면역 향상 방법

Info

Publication number: KR20250019640A
Application number: KR1020247039722A
Authority: KR
Inventors: 아키코 이와사키; 더블유. 마크 솔츠만; 벤자민 골만-이즈리얼로우; 티안양 마오; 브루스 터너; 토드 와이더
Original assignee: 제너두 바이오, 인코포레이티드; 예일 유니버시티
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2025-02-10
Also published as: WO2023212668A2; WO2023212668A3; AU2023259401A1; EP4514387A2; TW202400793A; MX2024013366A

Abstract

본 발명은 면역을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

면역 향상 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2022년 4월 29일에 출원된 "면역 향상 방법"이라는 명칭의 미국 가출원 제 63/336,499호 및 2022년 6월 2일에 출원된 "면역 향상 방법"이라는 명칭의 미국 가출원 제 63/648,451호의 우선권 이익을 주장하고, 상기 문헌은 각각 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 면역을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

서열목록

본 출원은 XML 파일 형식으로 전자적으로 제출된 서열목록을 포함하고 있으며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 출원의 서열목록은 "130481-5002-WO.XML"로 표시되어 있으며, 2023년 4월 25일에 생성되었고 크기는 8,500바이트이다.

사스-CoV-2에 대한 mRNA-기반 백신은 일반 인구에서 안전하고 효과적인 사용을 위한 mRNA 치료제의 엄청난 가능성을 보여주었다. 그러나 최근 연구에서는 무증상 감염과 mRNA-지질 나노입자(lipid nanoparticle)(LNP) 기반 요법으로 2차 투여 후 약 4개월에 시작되는 증상 및 중증 감염 양상에서 백신 효과가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 베타(B.1.351), 델타(B.1.617.2), 및 현재 오미크론(B.1.529) 해당 변이체(variant of concern)(VOC)에 의해 면역 회피성이 증가하는 지속적인 바이러스 진화 또한 코비드-19에 대한 백신 효과가 감소하는데 기여했다. 현재 백신은 사스-CoV-2 감염을 예방하는데 효과가 작을뿐만 아니라 바이러스 전파를 예방하는 효과도 떨어진다.

따라서 코비드-19에 대한 면역을 향상시켜야 할 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족한다.

본 발명은 이를 필요로 하는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 본 방법은 점막 부위(mucosal site)에 항원 또는 항원을 인코딩(encoding)하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 이전에 바이러스에 대해 백신접종(vaccinating)했거나 이에 감염된 적이 있는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간은 항체, 기억 B 세포 및 효과기(effector) CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 증가된 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발된다.

일부 실시형태에서, 증가된 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된다.

일부 실시형태에서, 점막 부위는 직장, 질(vaginal), 방광, 눈(ocular), 구강(oral), 설하, 식도, 비강(nasal), 위장관(gastrointestinal), 폐 및 귀 점막 부위(aural mucosal site)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항원은 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원은 다가 항원(multivalent antigen)이다.

일부 실시형태에서, 항원은 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.

일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다.

일부 실시형태에서, 항원은 미생물 병원체로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 미생물 병원체는 마이코박테리아(mycobacterium), 박테리아, 진균, 바이러스, 기생충 또는 프리온(prion)이다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 로타바이러스(rotavirus), 노로바이러스(norovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아스트로바이러스(astrovirus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza viruses), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 아데노바이러스, 보카바이러스(bocavirus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 단순포진 바이러스 1형(herpes simplex virus type 1)(HSV-1), 단순포진 바이러스 2형(HSV-2), 인간 유두종바이러스(human papillomavirus)(HPV), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 아데노바이러스, 소아마비(poliomyelitis), 일본뇌염(Japanese encephalitis), 천연두(smallpox), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 플라비바이러스(flaviviruses), 에코바이러스(echovirus), 라이노바이러스, 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 이하선염 바이러스(mumps virus), 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스(parvovirus), 우두 바이러스(vaccinia virus), 인간 T-림프구 바이러스(HTLV), 뎅기 바이러스(dengue virus), 인간 유두종 바이러스(HPV), 연속종 바이러스(molluscum virus), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 아르보바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus), 사스-CoV-2(SARS-CoV-2), 헤노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura)(HSP), RNA 바이러스, DNA 바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, RNA 바이러스는 일반 감기, 독감, 사스(SARS), 메르스(MERS), 코비드-19(Covid-19), 뎅기 바이러스, C형 간염, E형 간염, 서나일열(West Nile fever), 에볼라 바이러스 질병(Ebola virus disease), 광견병, 소아마비(polio), 이하선염, 홍역, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, DNA 바이러스는 단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalo virus), 수두대상포진 바이러스(varicella zoster virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 로제올로 바이러스(roseolo virus), 인간 헤르페스바이러스-7(human herpesvirus-7), 카포시 육종-연관 바이러스(Kaposi's sarcoma-associated virus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 점막 전달에 의해 투여된다.

일부 실시형태에서, 점막 전달은 직장 전달, 협측(buccal) 전달, 폐 전달, 안구 전달, 비강 전달, 비강내(intranasal) 전달, 질 전달 및 경구 전달로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인간 대상체의 점막 조직에 투여된다.

일부 실시형태에서, 점막 조직은 전비공(anterior nostril), 비강동굴(nasal sinus), 직장, 질, 식도, 요도, 설하 및 협측으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내(intravenously), 근육내(intramuscularly), 피내(intradermally), 피하(subcutaneously), 비강내 또는 흡입(inhalation)으로 투여된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비강내 분무로 투여된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 애주번트(adjuvant)를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 애주번트를 포함한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원은 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 인간에서 사스-CoV-2에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법에 관한 것으로; 본 방법은 점막 부위에 적어도 하나의 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 이전에 사스-CoV-2에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있다. 일부 실시형태에서, mRNA는 사스-CoV-2의 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 인코딩한다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 애주번트를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, mRNA는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된다.

일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 양이온성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA) 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 인지질을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 적어도 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 콜레스테롤(Chol), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 50 nm 내지 약 1000 nm 범위의 평균 직경을 갖는다.

일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 600 nm의 범위의 평균 직경을 갖는다.

일부 실시형태에서, 면역 반응은 점막 면역 반응이다.

일부 실시형태에서, 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgA 항체 생성이다.

일부 실시형태에서, 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgG 항체 생성이다.

일부 실시형태에서, 인간은 IgA 항체가 증가한다.

일부 실시형태에서, 인간은 IgG 항체가 증가한다.

도 1a는 K18-hACE2 마우스에 전장 사스-CoV-2(SCV2) 스파이크 단백질(spike protein)을 인코딩(encoding)하는 1 μg의 mRNA-지질 나노입자(LNP)로 근육내(IM) 면역화를 실시한 다음, mRNA-LNP 면역화 후 14일에 융합 전 안정화된 3량체 재조합 사스-CoV-2(SCV2) 스파이크 단백질 1 μg으로 비강내(IN) 면역화를 실시하는 실험을 보여준다. IN 부스트(boosting) 후 14일, 혈청, 기관지폐포 세척액(BALF), 비강 세척액을 수집하여 결합 및 중화 항체 반응을 평가했다. 폐 조직을 수집하여 혈관외 B 세포 분석을 실시했다.
도 1b는 나이브 마우스(naive mouse), mRNA-LNP IM으로 면역화(IM 프라임)된 마우스, 스파이크 단백질 IN으로 면역화(IN 스파이크)된 마우스 또는 IM 프라임 및 스파이크로의 IN 부스트로 면역화(프라임 및 스파이크)된 마우스에서 SCV2 스파이크 S1 하위단위 특이적 비강 세척액 IgA(B), 비강 세척액 IgG(C), BALF IgA(D), BALF IgG(E), 혈청 IgA(F), 혈청 Ig(G) 측정치를 보여준다.
도 1c는 BALF(H, I) 및 혈청(J, K)에서 SCV2 스파이크-위형 수포구내염 바이러스(VSV)에 대한 중화 역가 측정치를 보여준다.
도 1d는 IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직에서 RBD 4량체 결합 B 세포, IgA⁺ 상주 메모리 B 세포(B_RM), IgG⁺ B_RM, IgA⁺ 항체 분비 세포(ASC) 및 IgG⁺ ASC를 포함하는 다양한 혈관외(정맥 표지(labeling) 항체 음성) B 세포 하위집합의 측정치를 보여준다.
도 2a는 K18-hACE2 마우스를 1 μg mRNA-LNP로 IM 프라임하고 14일 후에 1μg SCV2 스파이크로 IN 부스트한 실험을 보여준다. 폐 조직, BALF 및 비강 비갑개(nasal turbinate)를 혈관외 T 세포 분석을 위해 수집하였다. 폐 조직을 부스트 후 14일, BALF 및 비강 비갑개를 부스트 후 7일에 수집하였다.
도 2b는 혈관외 CD8 T 세포 반응을 보여준다: 폐 조직(B-D), BALF(E-G)에서 SCV2 스파이크-특이적 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포의 정량화.
도 2c는 혈관외 CD8 T 세포 반응을 보여준다: 비강 비갑개(H-J)에서 SCV2 스파이크-특이적 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포의 정량화, (K-P) 혈관외 CD4 T 세포 반응: 나이브, IM 프라임, IN 스파이크 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직(K-M) 또는 BALF(N-P)에서 활성화된 다클론 CD4 T 세포, CD69⁺CD103^- CD4 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺ CD4 T 세포의 정량화.
도 3a는 K18-hACE2 마우스를 1 μg의 mRNA-LNP로 IM 프라임한 다음, IM 프라임 후 14일에 1 μg의 네이키드 mRNA(IN 네이키드 mRNA) 또는 PACE로 캡슐화(encapsulating)된 1 μg의 mRNA로 IN 부스트(IN PACE-스파이크)한 실험을 보여준다. IN 부스트 후 십사(14)일에 BALF 및 혈액을 수집하여 항체를 측정했다. 폐 조직을 수집하여 CD8 T 세포 분석을 실시했다.
도 3b는 나이브, IM 프라임, IN PACE-스파이크, IM 프라임+IN 네이키드 mRNA 또는 프라임 및 PACE-스파이크 마우스의 폐 조직에서 총 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포 정량화를 보여준다.
도 3c는 나이브, IM 프라임, IN PACE-스파이크, IM 프라임+IN 네이키드 mRNA, 또는 프라임 및 PACE-스파이크 마우스에서 사스-CoV-2 스파이크 S1 하위단위 특이적 BALF IgA(E), BALF IgG(F), 혈청 IgA(G) 및 혈청 IgG(H) 측정치를 보여준다.
도 4a는 K18-hACE2 마우스를 0.05 μg의 mRNALNP로 IM 프라임하고 IM 프라임 후 14일에 스파이크 IN 1 μg으로 IN 부스트한 실험을 보여준다. 부스트 후 6주에, 마우스에 6 x 10⁴개의 PFU 사스-CoV-2(2019n-CoV/USA_WA1/2020)로 유발시험(challenging)하였다. 제1 코호트는 감염 후 최대 14일(DPI)의 중량 감소 및 생존을 평가하는데 사용되었다. 제2 코호트는 바이러스 역가 측정을 위해 2 DPI에 폐 및 비강 비갑개 조직을 수집하는데 사용되었다. 제3 코호트는 조직학적 평가를 위해 5 DPI에 폐 조직을 수집하는데 사용되었다.
도 4b는 1 내지 14 DPI에 나이브, IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 중량 감소 및 생존을 보여준다. (E-F) 플라크 분석을 통해 2 DPI에 폐 및 비강 비갑개 조직에서 감염성 바이러스 역가 측정치. (G) 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin)(H&E) 염색을 통해 5 DPI에 폐 절편의 병리학 점수.
도 4c는 감염되지 않은 IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 대표적인 H&E 염색 결과를 보여준다.
도 4d는 K18-hACE2 마우스에 0.05 μg의 mRNA-LNP를 IM으로 프라임하고, IM 프라임 후 14일에 PACE로 캡슐화된 mRNA 10 μg으로 IN 부스트(IN PACE-스파이크)한 실험을 보여준다. 부스트 6주 후, 마우스에 6 x 10⁴개의 PFU 사스-CoV-2(2019n-CoV/USA_WA1/2020)로 유발시험하였다.
도 4e는 1 내지 14 DPI에 나이브, IM 프라임, 또는 프라임 및 PACE-스파이크 K18-hACE2 마우스의 중량 감소 및 생존을 보여준다.
도 5a는 K18-hACE2 마우스를 1 μg의 mRNA-LNP로 IM 프라임한 다음, IM 프라임 후 14일에 1μg의 mRNALNP IM 또는 5 μg의 융합 전 안정화된 3량체 재조합 사스-CoV-1(SCV1) 스파이크 IN으로 부스트(IN 스파이크X)한 실험을 보여준다. 부스트 후 31일에 폐 조직을 수집하여 유세포 분석법으로 T 세포를 분석하고, BALF 및 혈액을 수집하여 항체를 측정했다.
도 5b는 나이브, mRNA-LNP 프라임/부스트, 또는 프라임 및 스파이크X 마우스의 폐 조직에서 총 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포 정량화를 보여준다.
도 5c는 나이브, mRNA-LNP 프라임/부스트, 또는 프라임 및 스파이크X 마우스에서 SCV1 스파이크 S1 하위단위-특이적 BALF IgA (E), BALF IgG (F), 혈청 IgA (G), 및 혈청 IgG (H) 측정치를 보여준다. (I-L) 나이브, mRNA-LNP 프라임/부스트 또는 프라임 및 스파이크X 마우스에서 SCV2 스파이크 S1 하위단위-특이적 BALF IgA (I), BALF IgG (J), 혈청 IgA (K), 및 혈청 IgG (L) 측정치. (M,N) SCV1 스파이크 위형 VSV에 대한 중화 역가 측정치. (O,P) SCV2 스파이크 위형 VSV에 대한 중화 역가 측정치.
도 6a는 K18-hACE2 마우스를 1 μg의 mRNA-LNP로 IM 프라임하고 IM 프라임 후 12주에 1 μg SCV2 스파이크로 IN 부스트한 실험을 보여준다. 부스트 후 7일 및 56일에, 폐 조직을 수집하여 유세포 분석법으로 T 세포를 분석하고, BALF 및 혈액을 수집하여 항체를 측정했다.
도 6b는 부스트 후 7일 및 56일에 IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직에서 총 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^- 4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포의 정량화(B-D)를 보여준다. (E-G) 부스트 후 7일 및 56일에 IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직에서 활성화된 총 다클론 CD4 T 세포, CD69⁺CD103^- CD4 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺ CD4 T 세포의 정량화.
도 6c는 부스트 후 7일 및 56일에 IM 프라임 또는 프라임 및 스파이크 마우스에서 SCV2 스파이크 S1 하위단위-특이적 BALF IgA (H), BALF IgG (I), 혈청 IgA (J), 및 혈청 IgG (K)의 측정치를 보여준다.
도 7a는 K18-hACE2 마우스를 0.05 μg의 mRNA-LNP로 IM 프라임하고 IM 프라임 후 14일에 1 μg의 스파이크 IN으로 IN 부스트한 실험을 보여준다. 부스트후 6주에 폐 조직을 수집하여 유세포 분석법을 통해 CD8 T 세포 분석을 실시하였고, BALF 및 혈액을 수집하여 항체를 측정했다.
도 7b는 나이브, IM 프라임, 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직에서 총 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포의 정량화를 보여준다.
도 7c는 나이브, IM 프라임, 또는 프라임 및 스파이크 마우스에서 SCV2 스파이크 S1 하위단위-특이적 BALF IgA (E), BALF IgG (F), 혈청 IgA (G), 및 혈청 IgG (H)의 측정치를 보여준다.
도 8a는 K18-hACE2 마우스를 1 μg의 mRNA-LNP로 IM 프라임한 다음, IM 프라임 후 14일에 1μg의 mRNA-LNP IM 또는 1 μg의 SCV2 스파이크 IN으로 부스트(IN 스파이크)한 실험을 보여준다. 부스트 후 45일에, 폐 조직을 수집하여 유세포 분석법을 통해 T 세포를 분석하고, BALF 및 혈액을 수집하여 항체를 측정했다.
도 8b는 나이브, mRNA-LNP 프라임/부스트, 또는 프라임 및 스파이크 마우스의 폐 조직에서 총 4량체⁺ CD8 T 세포, CD69⁺CD103^-4량체⁺ CD8 T 세포, 또는 CD69⁺CD103⁺4량체⁺ CD8 T 세포의 정량화를 나타낸다.
도 8c는 나이브, mRNA-LNP 프라임/부스트, 또는 프라임 및 스파이크 마우스에서 사스-CoV-2 스파이크 S1 하위단위 특이적 BALF IgA (E), BALF IgG (F), 혈청 IgA (G), 및 혈청 IgG (H)의 측정치를 보여준다. (I,J) SCV2 스파이크-위형 VSV에 대한 중화 역가 측정치.
도 9는 추출된 mRNA의 길이 및 완전성을 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석한 것을 보여준다. 추출된 mRNA를 1% 아가로스 겔에 로딩하기 전에 SYBR 안전 염색과 혼합하고, TAE 완충액에서 유동시킨 다음 겔 이미징 시스템(gel imaging system)으로 이미징했다.
도 10a 내지 도 10b는 (도 10a) 혈관외 항원-특이적 CD8 T 세포와 다클론 활성화 CD4 T 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략을 보여준다. (도 10b) 혈관외 항원-특이적 및 다클론 B 세포 하위집합을 확인하기 위한 게이팅 전략.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사 ("a" 및 "an")은 문맥상 명확히 달리 표시되지 않는 한 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

용어 "변이체"는 하나 이상(예를 들어, 다수)의 위치에서 변이, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 용어 "변이체"는 사스-CoV-2 바이러스 변이체를 지칭한다.

용어 "스파이크", "부스트" 또는 "부스터"는 상호 혼용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성 제제(immunogenic agent)"는 세포 또는 세포 성분의 현탁액과 같은 임의의 물질, 물질의 조성물 또는 유기 재료의 조성물을 포함하고, 면역원성 제제는 적절한 물질과 혼합하여 적절한 양으로 투여될 때 인간 대상체에 코로나바이러스에 대한 실질적인 면역 반응을 부여할 수 있다.

용어 "면역학적으로 균등하다"는 폴리펩타이드가 면역 반응을 유발하는 능력과 관련하여 임의의 S 단백질의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 기능적으로 균등하다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 2 내지 10개 아미노산 잔기 길이의 짧은 펩타이드, 올리고펩타이드(11 내지 100개 아미노산 잔기), 및 더 긴 펩타이드(폴리펩타이드의 일반적인 해석, 즉 100개 초과의 아미노산 잔기 길이)와 단백질(글리코실화에 의해 화학적으로 변형되거나 다른 화학 기에 접합될 수 있는 적어도 하나의 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 기능적 물질)을 모두 포함한다. 폴리펩타이드의 정의에는 사스-CoV-2의 폴리펩타이드 또는 단백질의 기본 형태와 임의의 종류의 숙주를 형질 전환하는 임의의 종류의 발현 벡터의 재조합 단백질 또는 펩타이드, 또한 화학적으로 합성된 펩타이드도 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 적어도 두 개의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 중합체를 지칭하고 DNA, RNA 및 이의 혼성체를 포함한다. DNA는 안티센스 분자(antisense molecule), 플라스미드 DNA(plasmid DNA), cDNA, PCR 산물 또는 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 헤어핀 RNA(small hairpin RNA)(shRNA), 메신저 RNA(messenger RNA)(mRNA), 안티센스 RNA, miRNA, micRNA, 다가 RNA, 다이서 기질 RNA(dicer substrate RNA) 또는 바이러스 RNA(vRNA) 및 이의 조합 형태일 수 있다. 핵산은 확인된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함하고, 이는 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이며 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는다.

본 발명은 인간 대상체를 바이러스에 대해 백신접종하는 방법에 관한 것으로, 인간 대상체는 이전에 바이러스에 대해 체계적으로 백신접종했거나 바이러스에 감염된 적이 있다. 본 방법은 점막 부위에 항원을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법은 "프라임 및 스파이크" 또는 "프라임 및 부스트"로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 프라임 및 스파이크 방법은 호흡기내 점막 면역 기억을 유도하기 위해 기본 체계적 백신접종으로 생성된 기존 면역을 활용하는 무애주번트(unadjuvanted) 비강내 스파이크 부스트를 활용한다. 또한, 다양한 스파이크 단백질을 사용하여 프라임 및 스파이크는 사르베코바이러스에 대한 교차-반응 면역을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라임 및 스파이크는 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체와 같은 사르베코바이러스에 대한 다가 반응을 가능하게 한다.

일 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 본 방법은 점막 부위에 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 이전에 바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간은 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포가 증가했다. 일부 실시형태에서, 증가된 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 이전 백신접종은 비경구 투여에 의해 실시된다.

일부 실시형태에서, 증가된 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 증가된 항체는 면역글로불린 G(IgG), IgM 및 IgA이다.

일부 실시형태에서, 점막 부위는 직장, 질, 방광, 눈, 구강, 설하, 식도, 비강, 위장관, 폐 및 귀 점막 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항원은 단백질 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.

일부 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시형태에서, mRNA는 N1-메틸-슈도우리딘(pseudouridine)-변형된 mRNA이다. 일부 실시형태에서, mRNA는 슈도우리딘-변형된 mRNA이다. 일부 실시형태에서, 항원은 두 개 이상의 다른 mRNA를 포함한다. 두 개 이상의 mRNA는 다가 반응을 유도하기 위해 두 개 이상의 다른 단백질을 인코딩한다.

일부 실시형태에서, 항원은 미생물 병원체로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 미생물 병원체는 마이코박테리아, 박테리아, 진균, 바이러스, 기생충 또는 프리온이다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, 아스트로바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스, 라이노바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 단순포진 바이러스 1형(HSV-1), 단순포진 바이러스 2형(HSV-2), 인간유두종바이러스(HPV), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 소아마비, 일본뇌염, 천연두, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, 인간 T-림프구 바이러스(HTLV), 뎅기 바이러스, 인간 유두종 바이러스(HPV), 연속종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 아르보바이러스 뇌염 바이러스, 사스-CoV-2, 헤노흐-쉔라인 자반증(HSP), RNA 바이러스, DNA 바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, RNA 바이러스는 일반 감기, 독감, 사스, 메르스, 코비드-19, 뎅기 바이러스, C형 간염, E형 간염, 서나일열, 에볼라 바이러스 질병, 광견병, 소아마비, 이하선염, 홍역, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, DNA 바이러스는 단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두대상포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 로제올로 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스-7, 카포시 육종-연관 바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 점막 전달은 직장 전달, 협측 전달, 폐 전달, 안구 전달, 비강 전달, 비강내 전달, 질 전달 및 경구 전달로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 점막 조직은 전비공, 비강동굴, 직장, 질, 식도, 요도, 설하 및 협측으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 비강내 또는 흡입으로 투여된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 폴리(아민-코-에스테르)(PACE) 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, PACE 중합체는 미국 특허 제 10,682,422호; 제 10,465,042호; 제 9,272,043호; 제 9,895,451호; 제 PCT/US2012/067447; 및 미국 특허 공개 US20200399424에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시형태에서, 인간은 약 1주 전, 2주 전, 3주 전, 1개월 전, 2개월 전, 3개월 전, 4개월 전, 5개월 전, 6개월 전, 7개월 전, 8개월 전, 9개월 전, 10개월 전, 11개월 전 또는 12개월 전에 바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있다.

일부 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 일부 실시형태에서, RNA는 소형 RNA, 리보자임, 소형 간섭 RNA(siRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 다이서 기질 RNA(dsRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 전달 RNA(tRNA), 메신저 RNA(mRNA), 자가 증폭 mRNA(SAM)로부터 선택되는 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 인간 대상체에 투여되면 결과적으로 단백질로 번역되고, 단백질은 치료 기능 또는 백신접종에 영향을 미친다.

일부 실시형태에서, 나노입자는 미국 특허 제 10,106,490; 10,723,692; 9,737,619; 9,738,593; 및 WO2015199952A1에 기재된 하나 이상의 화합물을 포함하고, 상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시형태에서, 나노입자는 미국 특허 제10,682,422호; 제 10,465,042호; 제 9,272,043호; 제 9,895,451호; PCT/US2012/067447; 및 미국 특허 공개 US20200399424에 기재된 하나 이상의 화합물을 포함하고, 상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

일부 실시형태에서, 입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm, 바람직하게는 약 150 nm 내지 약 275 nm의 평균 입자 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 중합체:폴리펩타이드의 중량:중량 비율은 약 25:1 내지 250:1이다.

현재 승인된 사스-CoV-2 mRNA-LNP 기반 및 벡터 기반 백신은 근육내 투여에 의존하고, 이는 동물 모델 및 인간에서 순환 항체, 기억 B 세포 및 순환 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 높은 수준을 유도한다. 그러나 비경구 백신은 조직 상주 기억 T 세포(T_RM) 및 B 세포(B_RM)와 점막 IgG 및 이량체 IgA와 같은 감염 부위에서 높은 수준의 강력한 항바이러스 면역 기억을 유도하지 않는다. 이는 CD8⁺ T_RM이 강력하게 유도되는 인간 및 마우스의 사스-CoV-2 감염과 다르다. 호흡기 점막을 표적화하는 백신은 비경구 백신접종의 단점을 해결할 수 있는데, 최근 비강으로 전달되는 사스-CoV-2 스파이크 인코딩 아데노바이러스 벡터에 대한 전임상 평가에서 마우스, 햄스터 및 비인간 영장류에서 인상적인 점막 면역원성과 보호 및 감소된 바이러스 배출이 나타났기 때문이다. 전임상 점막 인플루엔자 백신 연구에서도 점막 면역이 CD8⁺ T_RM 또는 이량체 IgA를 통해 이종 하위유형 유발시험에 대한 보호를 향상할 수 있으며 면역의 지속성을 개선할 수 있음을 보여주었다.

백신의 일차 호흡기 투여는 강력한 점막 면역 반응을 유도하며, 전신적으로 프라임한 후 비강내로 부스트하면 유사한 전신 면역이 나타나지만 점막 면역이 향상된다는 추가 이점이 있다.

최근 연구에서는 무증상 감염과 2차 투여 후 약 4개월에 시작되는 증상 및 중증 감염 양상에서 VOVID-19에 대한 FDA 승인 mNRA 백신의 효과가 감소하는 것으로 나타났다. 비경구 백신접종 요법에서 면역이 감소하는 상황에서, 본 개시내용은 mRNA-LNP 기반 백신의 강력한 전신 프라임 후, 무애주번트 스파이크 단백질 또는 무면역반응성 폴리플렉스 캡슐화 mRNA(immunosilent polyplex encapsulating mRNA)로 비강내 부스트(IN) 부스트를 이용하는 코비드-19에 대한 면역을 향상시키는 방법을 기재한다.

호흡기 점막 면역 발생을 위한 IN 무애주번트 하위단위 백신 부스트의 가능성을 평가하기 위해, K18-hACE2 마우스에 IM 주사로 mRNA-LNP(Comirnaty) 1 μg을 접종(프라임)한 다음, 14일 후에 IN 투여로 재조합 무애주번트 스파이크 단백질 1μg을 접종(프라임 및 스파이크)했다. 추가 대조군에는 IM 프라임만 실시한 K18-hACE2 마우스와 부스트 시 IN 스파이크만 실시한 마우스가 포함된다. 마우스를 21일 또는 28일(부스트 후 7일 또는 14일)에 안락사시키고 점막 체액성 면역의 발생을 평가했다(도 1a). 비강 세척액, 기관지폐포 세척액(BALF), 혈청의 항-사스-CoV-2 스파이크 S1 IgG 및 IgA를 평가했다. 프라임 및 스파이크를 실시한 마우스만 비강 세척액과 BALF에서 높은 수준의 항-사스-CoV-2 IgA 및 IgG를 발생시켰다(도 1b(B-E)). IM 프라임 단독 또는 IN 스파이크 단독은 점막 항체 발생에 충분하지 않았다. 혈청에서 IM 프라임 단독은 낮은 수준의 IgA 및 IgG를 유도하기에 충분했지만, 프라임 및 스파이크는 항-스파이크 S1 IgA 및 IgG 둘 모두의 상당한 전신적 부스트로 이어졌다(도 1b(F,G)). 항체 수준의 이러한 증가는 BALF와 혈청 둘 모두에서 중화 역가의 증가와 상관관계가 있었다(도 1b(H-K)). 이러한 결과는 단일 투여량의 무애주번트 비강내 스파이크 단독으로는 면역원성이 없으며 무애주번트 스파이크에 의한 강력한 점막 및 전신 항체 반응의 유도에는 이 경우 mRNA-LNP에 의한 사전 전신 프라임이 필요하다는 것을 나타낸다.

스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 특이적 B 세포 4량체와 조합된 정맥내(IV) CD45 표지를 사용하여 프라임 및 스파이크가 폐 조직 내에서 항원-특이적 B 세포(IV^-CD19⁺B220⁺4량체⁺)를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 1d(L)). 4량체는 RBD 결합에 대해서만 평가되었기 때문에 폐 조직 내에서 전체 스파이크에 반응하는 보다 완전한 B 세포 세트를 나타낼 가능성이 있는 다클론 조직 반응도 살펴보았다. IgA 또는 IgG를 발현하는 폐 조직에서 클래스 전환 항체 분비 세포(ASC)(IV^-CD19^+/-CD138⁺)가 증가하는 것으로 발견되었고(도 1d(M,N)), IgA 또는 IgG를 발현하는 클래스 전환 B_RM (IV^-CD19⁺B220⁺IgD^-IgM^-CD38⁺)이 증가하는 것으로 발견되었다(도 1d(O,P)). 이러한 결과는 점막 항체 생성 증가와 일치하고 프라임 및 스파이크가 폐에서 국소 B 세포 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.

위와 유사하게, 폐 조직 내 순환 세포와 면역 세포를 구별하기 위한 CD45 IV 표지를 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 4량체와 보존된 사르베코바이러스 스파이크 에피토프(VNFNFNGL)로 조합하였다. 폐 조직(도 2b(B-D)), 하부 기도 BALF(도 2b(E-G)) 및 상부 기도 비강 비갑개(도 2c(H-J))에서 CD69⁺ 및 CD103⁺를 포함하는 T_RM의 표준 마커를 발현하는 스파이크 IV^- 4량체⁺ CD8⁺ T 세포의 상당한 유도가 발견되었다. 또한 항원을 경험한 CD4⁺ T 세포(IVCD44⁺CD4⁺)에서 상당한 증가가 발견되었으며, 이 중 다수는 BALF(도 2c(N-P))에서 회수한 폐 조직(도 2c(K-M))과 하부 기도에서 T_RM CD69⁺및 CD103⁺ 마커를 발현했다. 이러한 결과는 프라임 및 스파이크가 체액성 점막 반응을 유도할 뿐만 아니라 폐 실질과 기도 CD8⁺ T_RM및 CD4⁺ T_RM을 강력하게 유발한다는 것을 나타낸다.

1 μg IM 프라임을 실시한 K18-hACE2 마우스를 84일 후에 IN 스파이크로 부스트했다. 본 발명자들은 91일(부스트 후 7일)과 140일(부스트 후 56일)에 체액성 및 세포성 점막 면역 반응을 샘플링했다. 본 발명자들은 지연된 IN 스파이크가 CD8⁺ T_RM을 유도하기에 충분했으며 이는 적어도 56일 동안 지속되었음을 발견했다. CD4⁺ T_RM은 부스트 후 7일에 조기에 유도되었지만, 이의 수명은 적어도 다클론적으로 56일까지 감소하는 것으로 보였다. CD8⁺ T_RM 반응과 유사하게 지연된 부스트에 대한 적절한 체액성 반응뿐만 아니라 BALF에서 강하고 증가하는 점막 IgA 및 IgG, 부스트 후 56일에 강하고 증가하는 혈청 IgA 및 IgG가 발견되었다. 이러한 결과는 투여 간격을 3개월로 하여 프라임 및 스파이크를 제공하면 장기간 지속되는 점막 및 전신 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발하기에 충분함을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 인간은 BNT162b2 (Pfizer/BioNTech), mRNA-1273 (Moderna), AZD1222/ChAdOxl (AstraZeneca/Oxford Univ), Ad5 -벡터 코비드-19 백신 (CanSino Biologies), CoronaVac (Sinovac), NVX-CoV2373 (Novavax), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 코비드-19 백신으로 이전에 백신접종했다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체에 대한 이전 백신접종에 의해 증가된 IgG 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체에 대한 이전 백신접종에 의해 증가된 IgM 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체에 대한 이전 백신접종에 의해 증가된 IgA 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체의 이전 감염에 의해 증가된 IgG 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체의 이전 감염에 의해 증가된 IgM 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 또는 이의 변이체의 이전 감염에 의해 증가된 IgA 항체가 유발되었다.

일부 실시형태에서, 증가된 IgG는 약 100 내지 150, 약 100 내지 200, 약 100 내지 300, 약 100 내지 400, 약 150 내지 200, 약 150 내지 250, 약 150 내지 300, 약 150 내지 400, 약 200 내지 250, 약 200 내지 300, 약 200 내지 350, 또는 약 200 내지 400 BAU/ml의 범위이다.

일부 실시형태에서, 증가된 IgG는 약 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 280, 290, 295, 또는 300 BAU/ml.

일부 실시형태에서, 증가된 IgM은 약 25 내지 100, 약 25 내지 150, 약 25 내지 200, 약 25 내지 300, 약 50 내지 100, 약 50 내지 150, 약 50 내지 200, 약 50 내지 300, 약 75 내지 100, 약 75 내지 150, 약 75 내지 200, 약 75 내지 300, 약 100 내지 150, 약 100 내지 200, 약 100 내지 300, 약 125 내지 200, 약 125 내지 300, 약 150 내지 200, 약 150 내지 300, 약 200 내지 300, 약 250 내지 300 AU/ml의 범위이다.

일부 실시형태에서, 증가된 IgM은 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 180, 190, 195, 또는 200 AU/ml이다.

일부 실시형태에서, 증가된 IgA는 약 10 내지 100, 약 10 내지 150, 약 10 내지 200, 약 25 내지 100, 약 25 내지 150, 약 25 내지 200, 약 50 내지 100, 약 50 내지 150, 약 50 내지 200, 약 75 내지 100, 약 75 내지 150, 약 75 내지 200, 약 100 내지 150, 약 100 내지 200, 약 125 내지 150, 약 125 내지 200, 약 150 내지 200 AU/ml의 범위이다.

일부 실시형태에서, 증가된 IgA는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 AU/ml이다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 mRNA는 사스-CoV-2의 스파이크 단백질 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 mRNA는 다가 항원이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 두 개 이상의 다른 mRNA를 포함한다. 두 개 이상의 mRNA는 두 개 이상의 다른 단백질을 인코딩하여 사스-CoV-2에 대한 다가 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 N1-메틸-슈도우리딘-변형된 mRNA이다. 일부 실시형태에서, mRNA는 슈도우리딘-변형된 mRNA이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 폴리(아민-코-에스테르)(PACE) 중합체를 포함한다.

일부 실시형태에서, 적어도 하나의 mRNA는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화된다.

일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 또한 적어도 하나의 인지질을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 면역 반응은 점막 면역 반응이다.

일부 실시형태에서, 인간은 약 1주 전, 2주 전, 3주 전, 1개월 전, 2개월 전, 3개월 전, 4개월 전, 5개월 전, 6개월 전, 7개월 전, 8개월 전, 9개월 전, 10개월 전, 11개월 전 또는 12개월 전에 바이러스에 대해 백신접종하거나 이에 감염된 적이 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 인간 대상체에 사스-CoV-2에 대한 백신접종하기 위한 항원으로서 폴리펩타이드 및 이의 면역원성 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질, 이의 면역원성 변이체 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 임의의 확인된 S 단백질 또는 이의 하위단위 또는 단편과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 임의의 확인된 S 단백질 또는 이의 하위단위 또는 단편과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체는 사스-CoV-2의 다른 균주에서 발견되는 사스-CoV-2 스파이크 단백질 변이체이다. 변이체에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 사스-CoV-2, B.1.1.7 균주, B.1.351 균주, P.1 균주, CAL 20 균주 또는 이의 임의의 조합의 알파(Alpha), 베타(Beta) 또는 델타(Delta) 변이체의 스파이크 단백질이 포함된다.

일부 실시형태에서, 사스-CoV-2 변이체는 다음에 제한되는 것은 아니나, 알파(B.1.1.7 및 Q 계통), 베타(B.1.351 및 후세대 계통), 감마(Gamma)(P.1 및 후세대 계통), 델타(B.1.617.2 및 AY 계통), 엡실론(Epsilon)(B.1.427 및 B.1.429), 에타(Eta)(B.1.525), 이오타(Iota)(B.1.526), 카파(Kappa)(B.1.617.1), 1.617.3, 뮤(Mu)(B.1.621, B.1.621.1), 제타(Zeta)(P.2), 뮤(B.1.621, B.1.621.1), 오미크론(Omicron)(Pango 계통 B.1.1.529, BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3) 및 이의 조합을 포함한다.

우한에서 단리된 사스-CoV-2의 스파이크 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 1로 나열되어 있다.

다양한 균주의 스파이크 단백질의 예시적 변이체는 표 1에 제시되어 있다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사스-CoV-2 S 단백질 균주에 대한 다른 아미노산 서열을 포함하고, 여기에는 문헌[Deng(2020) Science, 8:eabb9263 and Taboada(2020) J. Virol. 94:e01056]에 공개된 것 중 임의의 것이 포함된다. 그러나 다른 사스-CoV-2 균주가 이러한 균주의 알파 변이체 S 단백질, 단편 및 하위 단위와 실질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타낼 가능성이 높다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 사스-CoV-2 또는 이의 변이체의 M 단백질, E 단백질, N 단백질 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 S 단백질 변이체는 알파 변이체의 위치 501N에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 501N에 상응하는 아미노산은 Y로 치환된다. 일부 실시형태에서, 위치 501N에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 본 명세서에서 기재된 S 단백질 변이체는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 추가 돌연변이는 알파 변이체에 대한 위치에서 다음 아미노산에 상응하는 위치에서의 돌연변이 중에서 하나 이상 선택될 수 있다: 18L, 69H, 70V, 80D, 144Y, 215D, 246R, 242L, 243A, 및 244L, 417K, 484E, 570A, 614D, 681P, 701A, 716T, 982S, 및 1118D. 일부 실시형태에서, 알파 변이체의 위치 69H에 상응하는 아미노산은 결실된다. 일부 실시형태에서, 위치 70V에 상응하는 아미노산은 결실된다. 일부 실시형태에서, 위치 144Y에 상응하는 아미노산은 결실된다. 일부 실시형태에서, 위치 570A에 상응하는 아미노산은 D이다. 일부 실시형태에서, 위치 614D에 상응하는 아미노산은 G이다. 일부 실시형태에서, 위치 681P에 상응하는 아미노산은 H이다. 일부 실시형태에서, 위치 716T에 상응하는 아미노산은 I이다. 일부 실시형태에서, 위치 982S에 상응하는 아미노산은 A이다. 일부 실시형태에서, 위치 1118D에 상응하는 아미노산은 H이다. 일부 실시형태에서, 위치 80D에 상응하는 아미노산은 A이다. 일부 실시형태에서, 위치 215D에 상응하는 아미노산은 G이다. 일부 실시형태에서, 위치 484E에 상응하는 아미노산은 K이다. 일부 실시형태에서, 위치 701A에 상응하는 아미노산은 V이다. 일부 실시형태에서, 위치 18L에 상응하는 아미노산은 F이다. 일부 실시형태에서, 위치 246R에 상응하는 아미노산은 I이다. 일부 실시형태에서, 위치 417K에 상응하는 아미노산은 N이다. 일부 실시형태에서, 위치 242L에 상응하는 아미노산은 결실된다. 일부 실시형태에서, 위치 243A에 상응하는 아미노산은 결실된다. 일부 실시형태에서, 위치 244L에 상응하는 아미노산은 결실된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에서 기재된 S 단백질 변이체는 사스-CoV-2 델타의 S 단백질이다. 일부 실시형태에서, 사스-CoV-2 델타의 S 단백질은 알파 변이체에 비해 다음과 같은 스파이크 단백질 치환을 갖는다: T19R, V70F, T95I, G142D, 156E 결실, 157F 결실, R158G, A222V, W258L, K417N, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N.

일부 실시형태에서, 본 명세서에서 기재된 S 단백질 변이체는 사스-CoV-2 오미크론의 S 단백질이다. 일부 실시형태에서, 사스-CoV-2 오미크론의 S 단백질은 알파 변이체에 비해 다음과 같은 스파이크 단백질 치환을 갖는다: A67V, 아미노산 69 내지 70의 결실, T95I, 아미노산 142 내지 144의 결실, Y145D, 아미노산 211의 결실, L212I, 214에서 아미노산 EPE의 삽입, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, 및 L981F.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 투여는 단일 투여로 실시되거나 다회 투여로 부스트될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 전신 투여에는 위장관을 통한 흡수를 포함하는 장 투여 또는 비경구 투여가 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비경구 투여"는 정맥내 주사와 같이 위장관을 통한 투여가 아닌 임의의 다른 방식으로 투여하는 것을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 비강내로 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 양은 0.1 μg 내지 300 μg, 0.5 μg 내지 200 μg, 또는 1 μg 내지 100 μg, 예를 들어 약 1 μg, 약 3 μg, 약 10 μg, 약 30 μg, 약 50 μg 또는 약 100 μg이 투여량당 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 단일 투여량의 투여를 예상한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 프라임 투여량의 투여에 이어서 하나 이상의 부스터 투여량을 투여하는 것을 예상한다. 부스터 투여량 또는 첫 번째 부스터 투여량은 프라임 투여량 투여 후 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주 또는 약 5주 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부스터 투여량 또는 첫 번째 부스터 투여량은 프라임 투여량 투여 후 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 또는 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 12개월 후에 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에서 기재된 폴리펩타이드의 양은 60 μg 이하, 50 μg 이하, 40 μg 이하, 30 μg 이하, 20 μg 이하, 10 μg 이하, 5 μg 이하, 2.5 μg 이하, 또는 1 μg 이하가 투여량당 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 양은 적어도 0.25 μg, 적어도 0.5 μg, 적어도 1 μg, 적어도 2 μg, 적어도 3 μg, 적어도 4 μg, 적어도 5 μg, 적어도 10 μg, 적어도 20 μg, 적어도 30 μg, 또는 적어도 40 μg이 투여량당 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 양은 0.25 μg 내지 60 μg, 0.5 μg 내지 55 μg, 1 μg 내지 50 μg, 5 μg 내지 40 μg 또는 10 μg 내지 30 μg 이 투여량당 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 산물은, 예를 들어 0.50 mg/mL 농도의 주사용 용액을 위한 동결 농축액으로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주사용 용액을 제조하기 위해, 약제 산물을 해동하고, 예를 들어, 1단계 희석 과정에 의해 등장성 염화나트륨 용액(예를 들어, 0.9% NaCl, 식염수)으로 희석한다. 일부 실시형태에서, 정균성 염화나트륨 용액(예를 들어, 0.9% NaCl, 식염수)은 희석제로 사용할 수 없다. 일부 실시형태에서, 희석된 약제 산물은 회백색 현탁액이다. 최종 주사용 용액의 농도는 투여할 각각의 투여량 수준에 따라 다르다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물과 투여 수단을 포함하는 키트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 비강 투여를 위한 비강 분무 장치를 포함한다. 비강 분무 장치는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 문헌[Djupesland, Drug Deliv. Transl. Res. (2013) 3(1): 42-62]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 키트는 사스-CoV-2 또는 이의 변이체에 대한 백신접종을 위한 자가 투여에 편리할 수 있다.

본 발명에 따른 키트에서 약제학적 조성물은 0.5 내지 75 μg의 폴리펩타이드, 예를 들어 0.5 내지 50 μg의 폴리펩타이드 또는 5 내지 50 μg의 폴리펩타이드를 포함한다.

실시예

일반적으로 기재된 본 교시는 본 개시내용의 특정 양상 및 실시형태를 기재된 목적으로 포함된 다음 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해할 수 있다.

방법 및 재료:

모든 절차는 예일 대학교 동물 관리 및 사용 위원회 및 예일 환경 건강 및 안전성의 승인을 받아 BSL-3 시설(사스-CoV-2 감염 마우스)에서 실시되었다.

세포 및 바이러스

hACE2 및 TMPRSS2를 과발현하는 Vero E6 세포(Barney Graham NIH-VRC에서 무상 제공)를 1% 피루브산 나트륨 및 5% 소태아 혈청(FBS)을 보충한 Dulbecco 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)에서 37℃, 5% CO2로 배양했다. 사스-CoV-2 단리체 hCOV-19/USA-WA1/2020 (NR-52281)을 BEI Resources에서 구입하여 hACE2 및 TMPRSS2를 과발현하는 VeroE6 세포에서 증폭했다. 세포를 2 내지 3일 동안 MOI 0.01로 감염시켜 작업 스톡을 생성한 다음, 인큐베이션 후 상청액을 원심분리(500g x 5분)하여 정제하고 0.45마이크론 필터로 여과하여 -80℃에서 보관했다. 바이러스 역가를 hACE2와 TMPRSS2를 과발현하는 Vero E6 세포를 사용한 표준 플라크 분석을 통해 측정하였다.

마우스

B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (K18-hACE2) 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하여 이후 예일 대학교에서 사육하고 수용하였다. 8 내지 12주 된 암컷을 면역 실험에 사용했다. 이 연구에서 사용한 모든 절차(성별 매칭, 연령 매칭)는 미국 연방 지침과 예일 의대 동물 관리 및 사용 위원회의 기관 정책을 준수했다.

실시예 1: 사스-CoV-2 감염

마우스를 프로필렌 글리콜에 희석한 30% v/v 이소플루란(Isoflurane)을 사용하여 마취했다. 피펫(pipette)을 사용하여 6x10⁵개 PFU 사스-CoV-2가 포함된 50 μL를 비강내로 투여했다.

실시예 2: Comirnaty mRNA-LNP에서 mRNA 추출

mRNA를 본 명세서에 기재된 TRIzol/클로로포름 분리 방법을 사용하여 백신 제형에서 추출했다. 간단히 말해서, 백신의 분취량을 TRIzol LS(Thermo Fisher Scientific)에 1:6.6의 백신 대 TRIzol 부피 비율로 녹였다. 15분간 인큐베이션(37℃, 교반)한 후 TRIzol 1 mL당 0.2 mL의 클로로포름을 첨가했다. 용액을 1분간 격렬하게 교반한 다음 실온에서 3분간 인큐베이션했다. 용액을 4℃에서 8분간 12,000 x g로 원심분리했다. 단리된 mRNA가 포함된 수용액을 제조업체 프로토콜에 따라 Qiagen(Germantown, MD, USA)에서 구입한 RNeasy Maxi 키트로 추가로 정제했다. RNA를 마지막 단계에서 37℃로 가온시킨 아세트산나트륨 완충액(25 mM, pH 5.8)으로 컬럼에서 용출했다. 추출된 mRNA를 260, 280 및 230 nm에서 흡광도의 NanoDrop 측정을 통해 농도와 순도를 분석했으며, 순도는 A260/A280 > 2 및 A260/A230 > 2로 평가했다. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 길이를 결정하고 mRNA가 손상되지 않았는지 확인했다. 1:100 SYBR Safe 염색(Thermo Fisher Scientific)이 포함된 추출된 mRNA를 1% 아가로스 겔에 로딩하고 1:5000 SYBR Safe 염색이 포함된 TAE 완충액으로 75V에서 구동시켰다.

실시예 3: PACE 폴리플렉스 제형 및 특성화

PACE 중합체를 이전에 기재한 대로 합성하고 특성화했다. 모든 폴리플렉스를 50:1의 중합체 대 mRNA의 중량 비율로 제형화하였다. PACE 중합체를 DMSO(37℃, 교반)에 100 mg/mL로 하룻밤 동안 용해했다. 폴리플렉스 제조 전에, 말단 기 변형 및 폴리에틸렌 글리콜 꼬리를 포함하는 PACE 중합체 용액을 혼합하여 최적의 PACE 중합체 블렌드를 생성했다. mRNA와 중합체를 동일한 부피의 아세트산 나트륨 완충액(25 mM, pH 5.8)에 희석했다. 그런 다음 중합체 희석액을 15초 동안 교반하고 mRNA 희석액과 혼합한 다음 추가로 25초 동안 교반했다. 폴리플렉스를 사용하기 전에 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다.

실시예 4: 백신접종

Comirnaty 백신의 사용된 바이알을 개봉 후 24시간 이내에 예일 건강 약국에서 구입하여 4℃에서 보관했다. 바이알에는 잔여 백신(제조업체의 지침에 따라 100 μg/mL로 희석)이 포함되고 척추 주사기로 분리하여 모았다. 모은 잔여 백신을 분취하여 -80℃에서 보관했다. 케타민(ketamine)(50 mg/kg) 및 크실라진(xylazine)(5 mg/kg)의 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 백신을 멸균 PBS에 희석하고 표시된 바와 같이 최종 투여량을 1 μg 또는 0.05 μg로 하여 10 μL 또는 20 μL를 31 g 주사기로 좌측 대퇴사두근에 주사했다. 사스-CoV-2 안정화 스파이크(ACRO biosystems, SPN-C52H9) 또는 사스-CoV-1 스파이크(ACRO biosystems, SPN-S52H6)로 비강내 백신접종을 위해 제조업체 프로토콜에 따라 멸균 무내독소 물에 재구성한 다음 멸균 PBS에 희석하여 -80℃에 보관했다. 마우스를 프로필렌 글리콜에 희석한 30% v/v 이소플루란을 사용하여 마취시키고 IN 경로를 통해 50 μL에 1 μg 또는 5 μg(표시된 바와 같음)을 투여했다. IN mRNA-PACE의 경우, 용액에 폴리플렉스 50 μL를 표시된 투여량으로 투여했다.

실시예 5: 바이러스 역가 분석

표시된 시점에서 마우스를 100% 이소플루란으로 안락사시켰다. 전체 폐의 약 50%를 2% FBS와 2% 항생제/항진균제(Gibco)가 포함된 1 mL PBS가 있는 비드 균질화 튜브에 넣고 -80℃에서 보관했다. 폐 균질물을 원심분리(3900 rpm에서 10분)로 잔해물을 제거했다. 사스-CoV-2의 감염 역가를 NaHCO3, 2% FBS, 0.6% Avicel RC-581이 보충된 DMEM에서 hACE2 및 TMPRSS2를 과발현하는 VeroE6 세포에서 플라크 분석을 통해 결정했다. 플라크를 감염 후 40 내지 42시간에 10% 중성 완충 포르말린에 1시간 용해시킨 다음 20% 에탄올에 0.5% 크리스탈 바이올렛을 넣고 30분간 염색했다. 플레이트를 물로 세정하여 플라크를 시각화했다.

실시예 6: 사스-CoV-2 특이적-항체 측정

ELISA를 편의상 본 명세서에 기록하고 재현한 수정 사항을 포함하여 이전에 기재한 대로 실시했다. 96웰 MaxiSorp 플레이트(Thermo Scientific #442404)를 PBS에서 2 μg/mL 농도로 재조합 사스-CoV-2 S1 단백질(ACRO Biosystems S1NC52H3) 또는 사스-CoV-1 S1 단백질(ACRO Biosystems S1N-S52H5) 50μL/웰로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션했다. 코팅 완충액을 제거하고 플레이트를 블로킹 용액(0.1% Tween-20, 5% 분유가 포함된 PBS) 250μL와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 혈청 또는 기관지폐포 세척액(BALF)을 희석 용액(0.1% Tween-20 및 2% 분유가 포함된 PBS)에 희석하고 희석된 혈청 또는 BALF 100 μL를 첨가하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 PBS-T(0.05% Tween-20이 포함된 PBS)로 자동 플레이트 세척기로 5회 세척하고(사이클당 250 μL) 희석 용액에 희석된 HRP 항마우스 IgG(Cell Signaling Technology #7076, 1:3,000) 또는 HRP 항마우스 IgA(Southern Biotech #1040 내지 05, 1:1,000) 50 μL를 각 웰에 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 자동 플레이트 세척기에서 PBS-T로 3회 세척했다. 플레이트를 50 μL의 TMB 기질 시약 세트(BD Biosciences #555214)로 발색시키고, 15분 후에 50 μL의 2 N 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그런 다음 플레이트를 450 nm 및 570 nm의 파장에서 확인하고 차이를 기록했다.

실시예 7: 면역조직화학 및 병리학적 분석

예일 병리학을 폐 조직의 포매, 절편화 및 H&E 염색에 의해 실시했다. 폐 병리학자는 슬라이드를 맹검으로 검토하여 면역 세포 침윤 및 기타 관련 병리를 확인했다. 다음과 같이 1 내지 4점으로 채점했다: (1) 가변적 반응성 폐포세포 및 기질 반응의 경미한 반점성 단핵구 침윤, 실질 및 혈관 주위; (2) 다양한 반응성 폐포세포 및 기질 반응의 중간 정도의 반점성 단핵구 침윤, 실질 및 혈관 주위; (3) 단핵구 및 과립구/호중구를 포함하는 경미하고 농후한 혼합 침윤; (4) 단핵구 및 과립구/호중구를 포함하는 중간 정도의 농후한 혼합 침윤.

실시예 8: 혈관내 표지, 세포 단리 및 유세포 분석법

혈관내 세포와 혈관외 세포를 구별하기 위해 마우스를 30% 이소플루란으로 마취하고 APC/Fire 750 CD45 Ab(30 내지 F11, AB_2572116, BioLegend, #103154)를 정맥내 주사한 후 3분간 표지한 후 마우스를 안락사시켰다. 폐를 가위로 잘게 다진 후 RPMI에서 1 mg/mL 콜라겐 분해효소 A(Roche)와 30 μg/mL DNase I(Sigma-Aldrich)를 포함한 분해 칵테일에서 37℃에서 45분간 인큐베이션했다. 그런 다음 조직을 70 μm 필터로 여과했다. 세포를 염화암모늄-칼륨 완충액으로 처리하고 1% BSA가 포함된 PBS에 재현탁했다. 단일 세포 현탁액을 Fc 블록과 Aqua 세포 생존 염료와 함께 4℃에서 20분간 인큐베이션했다. 표면 염색 전에 세포를 PBS로 한 번 세척했다. T 세포 분석을 위해 세포를 항-CD103 (BV421, 2E7, AB_2562901, BioLegend #121422), 항-CD3 (BV605, 17A2, AB_2562039, BioLegend #100237), 항-CD44 (BV711, IM7, AB_2564214, BioLegend #103057), 항-CD62L (FITC, MEL-14, AB_313093, BioLegend #104406), 항-CD8a (PerCP/Cy5.5, 16-10A1, AB_2566491, BioLegend #305232), 항-CD69 (PE/Cy7, H1.2F3, AB_493564, BioLegend #104512), 항-CD183 (CXCR3) (APC, CXCR3-173, AB_1088993, BioLegend #126512), 항-CD4 (AF700, GK 1.5, AB_493699, BioLegend #100430), 및 PE사스- CoV-2 S 539-546 MHC 클래스 I 4량체 (H-2K(b))로 4℃에서 30분 동안 염색했다. B 세포 분석을 위해 세포를 항-GL7 (Pacific Blue, GL7, AB_2563292, BioLegend #144614), 항-IgM (BV605, RMM-1, AB_2563358, BioLegend #406523), 항-CD138 (BV711, 281-2, AB_2562571, BioLegend #142519), 항-CD19 (BV785, 6D5, AB_11218994, BioLegend #115543), 항-IgA (FITC, 다클론, AB_2794370, SouthernBiotech #1040 내지 02), 항-B220 (PerCP/Cy5.5, RA3- 6B2, AB_893354, BioLegend #103236), PE-사스-CoV-2 RBD 4량체, 항-CD38 (PE/Cy7, 90, AB_2275531, BioLegend #102718), APC-사스-CoV-2 RBD 4량체, 및 항-IgD (AF700, 11-26c.2a, AB_2563341, BioLegend #405730)로 4℃에서 30분간 처리했다. PBS로 세척한 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 세포 집단 데이터를 Attune NxT Flow Cytometer에서 수집하여 FlowJo Software(10.5.3; Tree Star)를 사용하여 분석했다.

실시예 9: 사스-CoV-2 수용체 결합 도메인 B 세포 4량체 생성

재조합 사스-CoV-2 스파이크 RBD His 바이오틴 단백질, CF(R&D/BT10500 내지 050)를 스트렙타비딘-PE(Prozyme PJRS25) 또는 스트렙타비딘-APC(Prozyme PJ27S)와 4:1의 몰 비율로 4℃에서 30분간 인큐베이션했다. 그런 다음 혼합물을 정제하고 Amicon Ultra(50 kDA MWCO) 스핀 컬럼에서 농축한 다음 멸균된 저온 PBS로 1회 세척했다. 농도를 나노드롭(nanodrop)에서 결정하고 형광체 특이적 흡광도를 사용했으며 4량체를 PBS에서 1.0 μM로 희석하여 4℃에서 보관했다.

실시예 10: 위형바이러스 생성

VSV 기반 위형 바이러스를 이전에 기재한 대로 생성했다. 사스-CoV-2 Wuhan-Hu-1 스파이크 당단백질 유전자를 포함하는 벡터 pCAGGS는 HHSN272201400008C에서 생성되었으며 이를 BEI Resources(NR-52310)를 통해 입수했다. Wuhan-Hu-1 단리체 스파이크 당단백질의 서열은 USA-WA1/2020 단리체와 동일하다. 사스-CoV-1 스파이크 인코딩 플라스미드는 Vincent Munster 박사가 무상 제공했고 이전에 기재했다. 293T 세포를 스파이크 플라스미드로 형질전환한 다음 복제 결핍 VSV 발현 Renilla 루시퍼라제를 37℃에서 1시간 동안 접종했다. 그런 다음 바이러스 접종물을 제거하고 세포를 가온된 PBS로 3회 세척했다. 접종 후 24시간과 48시간에 위형바이러스를 포함한 상청액을 수집하여 원심분리로 정제하고, Amicon Ultra 원심분리 필터 단위(100 kDa)로 농축한 다음 -80℃에서 분취량으로 보관했다. 위형바이러스를 Huh7.5 세포에서 적정하여 세포 단독 대조군 배경의 약 600배에 달하는 상대적 광 단위 신호를 얻었다.

실시예 11: 위형바이러스 중화 분석

hACE2 및 TMPRSS2를 과발현하는 VeroE6(도 1a 내지 도 1d) 또는 Huh7.5 세포(도 5a 내지 도 5c)를 감염 전날 96웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅했다(3x10⁴). 감염 당일 혈청 및 BALF를 56℃에서 30분간 열 불활성화했다. 도 1a 내지 도 1d 혈청을 1:50의 시작 희석도에서 시험하였고 BALF 샘플을 1:4의 시작 희석도에서 시험하였으며, 둘 모두 8개의 2배 연속 희석도를 사용하였다. 도 5a 내지 도 5c 혈청을 8개의 3배 연속 희석도를 사용하여 1:40의 시작 희석도에서 시험하였다. 연속 희석도는 위형바이러스와 1:1로 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포에서 성장 배지를 흡인하여 혈청/바이러스 혼합물 100 μL로 교체하였다. 24시간 후 감염 배지를 제거하고 플레이트를 -80℃에서 급속 동결하였다. 각 웰에 30 μg 수동 용해 완충액(Promega)을 첨가하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에 30 μg의 Renilla-Glo 루시퍼라제 분석 시스템 기질(Promega)을 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 발광도를 마이크로플레이트 리더(SpectraMax i3, Molecular Devices)에서 측정했다. IC50을 Prism 9(GraphPad Software) 비선형 회귀를 사용하여 계산했다.

실시예 12: 무애주번트 사스-CoV-2 스파이크로 IN 부스트하면 점막 체액성 면역이 유도된다.

호흡기 점막 면역 발생을 위한 IN 무애주번트 하위단위 백신 부스트의 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 mRNA-LNP의 강력한 전신 면역원성을 활용하기로 했다. 또한, 본 발명자들은 광범위한 사스-CoV-2 스파이크 조작의 이점을 얻었는데, 이는 퓨린 절단 부위에 C-말단 T4 피브리틴 3량체화 모티프(C-terminal T4 fibritin trimerization motif), 6개의 프로린 치환(F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, V987P), 및 알라닌 치환(R683A 및 R685A)을 추가하여 융합 전 확인에서 단백질을 안정화하는데 도움이 된다. 이러한 돌연변이 세트는 면역원성을 크게 향상시키고 단백질 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이 중 일부는 현재 백신에 사용된다.

본 발명자들은 IM 주사(프라임)로 1 μg의 mRNA-LNP(Comirnaty)로 K18-hACE2 마우스에 백신접종한 다음, 14일 후에 IN 투여(프라임 및 스파이크)로 1 μg의 재조합 무애주번트 스파이크 단백질을 백신접종했다. 추가 대조군에는 IM 프라임을 단독 투여한 K18-hACE2 마우스 및 부스트 시 IN 스파이크를 단독 투여한 마우스가 포함된다. 마우스를 21일 또는 28일(부스트 후 7일 또는 14일)에 안락사시키고 점막 체액성 면역의 발생을 평가했다(도 1a).

먼저, 본 발명자들은 비강 세척액, 기관지폐포 세척액(BALF) 및 혈청에서 항-사스-CoV-2 스파이크 S1 IgG 및 IgA를 평가했다. 본 발명자들은 프라임 및 스파이크를 투여한 마우스만 비강 세척액과 BALF에서 높은 수준의 항-사스-CoV-2 IgA 및 IgG를 발생시켰다(도 1b(B-E)). IM 프라임 단독 또는 IN 스파이크 단독은 점막 항체의 발생에 충분하지 않았다. 혈청에서 IM 프라임 단독은 낮은 수준의 IgA 및 IgG를 유도하기에 충분했으나; 프라임 및 스파이크는 항-스파이크 S1 IgA와 IgG의 상당한 전신적 부스트를 유발했다(도 1b(F,G)). 항체 수준의 이러한 증가는 BALF 및 혈청 모두에서 중화 역가의 증가와 상관관계가 있었다(도 1c(H-K)). 이러한 결과는 단일 투여량의 무애주번트 비강내 스파이크 단독으로는 면역원성이 없으며 무애주번트 스파이크에 의한 강력한 점막 및 전신 항체 반응의 유도에는 이 경우 mRNA-LNP에 의한 사전 전신적 프라임이 필요하다는 것을 나타낸다.

폐의 조직 상주 기억 B 세포(B_RM)는 마우스 인플루엔자 모델에서 2차 이종 유발시험 시 항체 분비 B 세포의 빠른 복귀 반응을 돕는 것으로 나타났으며 사스CoV-2에 대한 보호에서 중요한 국소 면역 효과기일 수 있다. 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 B 세포 4량체와 조합한 정맥내 주사(IV) CD45 표지를 사용하여 본 발명자들은 프라임 및 스파이크가 폐 조직 내에서 항원 특이적 B 세포를 증가시킨다는 것을 발견했다(IV^-CD19⁺B220⁺4량체⁺)(도 1d(L)). 4량체가 RBD 결합에 대해서만 평가되었다는 점을 감안할 때, 본 발명자들은 또한 폐 조직 내에서 전체 스파이크에 반응하는 더 완전한 B 세포 세트를 나타낼 가능성이 있는 다클론 조직 반응을 살펴보았다. 본 발명자들은 IgA 또는 IgG를 발현하는 폐 조직에서 클래스 전환 항체 분비 세포(ASC)(IVCD19^+/- CD138⁺)가 증가하는 것을 발견했고(도 1d(M, N)), 본 발명자들은 IgA 또는 IgG를 발현하는 클래스 전환 B_RM(IV^-CD19⁺B220⁺IgD^-IgM^-CD38⁺)이 증가하는 것을 발견했다(도 1d(O, P)). 이러한 결과는 점막 항체 생성 증가와 일치하고 프라임 및 스파이크가 폐에서 국소 B 세포 반응을 유발한다는 것을 나타낸다.

실시예 13: 프라임 및 스파이크가 점막 T 세포 면역을 유도한다.

본 발명자들은 프라임 및 스파이크가 호흡기에서 점막 체액성 기억 반응을 유도한다는 것을 발견했기 때문에 다음으로 폐 조직 상주 기억 T 세포(T_RM)의 유도를 평가하고자 했다. 본 발명자들은 통상적으로 하위단위 백신은 항원 특이적 T 세포 반응의 강력한 유도제가 아니었지만, 동물 모델과 인간 모두에서 T 세포 기억 반응 유도에 충분한 것으로 나타난 mRNA-LNP 프라임에 의해 생성된 면역 기억이 하위단위 매개 T 세포 부스트 반응을 가능하게 할 것이라는 가설을 세웠다. 위와 유사하게, 본 발명자들은 CD45 IV 표지를 조합하여 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 4량체를 보존된 사르베코바이러스 스파이크 에피토프(VNFNFNGL)로 하여 폐 조직 내에서 순환 세포와 면역 세포를 구별했다. 본 발명자들은 폐 조직(도 2b(B-D)), 하부 기도 BALF(도 2b(E-G)) 및 상부 기도 비강 비갑개(도 2c(H-J))에서 CD69⁺ 및 CD103⁺를 포함하는 T_RM의 표준 마커를 발현하는 스파이크 IV^- 4량체⁺ CD8⁺ T 세포의 상당한 유도를 발견했다. 또한, 본 발명자들은 항원 경험 CD4⁺ T 세포 (IVCD44⁺ CD4⁺)에서 상당한 증가를 발견했으며, 이 중 다수는 BALF(도 2c(N-P))에서 회수한 폐 조직(도 2c(K-M))과 하부 기도에서 T_RM CD69⁺및 CD103⁺ 마커를 발현했다. 이러한 결과는 프라임 및 스파이크가 체액성 점막 반응을 유도할 뿐만 아니라 폐 실질 및 기도 CD8⁺ T_RM및 CD4⁺ T_RM을 강력하게 유발한다는 것을 나타낸다.

실시예 14: 지연 간격 프라임 및 스파이크는 점막 면역을 유도하기에 충분하다.

본 발명자들은 프라임과 부스트 사이에 14일 간격의 프라임 및 스파이크에 의해 점막 체액성 및 세포성 면역 기억 반응이 유의하게 유도된다는 것을 보여주었지만, 본 발명자들은 지연된 부스트가 상당한 점막 체액성 및 세포성 반응을 유도할 수도 있는지 궁금했다. 이 질문을 시험하기 위해 1 μg IM 프라임을 투여한 K18-hACE2 마우스에 84일 후에 IN 스파이크로 부스트했다. 본 발명자들은 91일(부스트 후 7일)과 140일(부스트 후 56일)에 체액성 및 세포성 점막 면역 반응을 샘플링했다(도 6a). 본 발명자들은 지연된 IN 스파이크가 CD8⁺ T_RM을 유도하기에 충분했고, 이는 적어도 56일 동안 지속됨을 발견하였다(도 6b(B-D)). CD4⁺ T_RM은 부스트 후 7일에 조기에 유도되었지만; 이의 지속성은 적어도 다클론적으로 56일까지 감소하는 것으로 보였다(도 6b(E-G)). CD8⁺ T_RM 반응과 유사하게, 본 발명자들은 부스트 후 56일에 지연된 부스트에 대한 적절한 체액성 반응뿐만 아니라 BALF에서 강하고 증가하는 점막 IgA와 IgG(도 6c(H,I))와 강하고 증가하는 혈청 IgA와 IgG(도 6c(J,K))를 발견했다. 이러한 결과는 투여 간격을 3개월로 하여 프라임 및 스파이크를 투여하면 오래 지속되는 점막 및 전신 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발하기에 충분하다는 것을 나타낸다.

실시예 15: mRNA 폴리플렉스의 IN 전달도 점막 부스트를 매개한다.

본 발명자들은 다음으로 IN 스파이크 부스트를 위한 대체 플랫폼의 능력을 평가했다. 폴리(아민-코에스터)(PACE)는 생분해성 3원중합체로, 중합체의 특성에 따라 생체내 특정 조직에 mRNA 또는 DNA와 같은 핵산을 캡슐화하여 전달하기 위해 개발되었다. 최근 연구에 따르면 호흡기에 전달된 mRNA-LNP는 마우스에서 투여량 의존적 방식으로 치명적인 것으로 나타났다. 반면, PACE 재료는 비교적 면역학적으로 무반응이어서 호흡기와 같이 면역병리에 더 취약한 위치에 투여할 수 있도록 개발되었다. 스파이크 단백질을 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 PACE의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 mRNA를 Comirnaty에서 추출하여 PACE 폴리플렉스에 캡슐화했다. 백신접종을 위해 K18-hACE2 마우스에 1 μg IM 프라임(mRNA-LNP)을 주사하고 14일 후에 PACE에 캡슐화된 mRNA 1 μg을 투여하여 IN(PACE-스파이크)을 투여했다. 추가 대조군에는 PACE-스파이크 단독 및 IM 프라임 + PACE 캡슐화 부재 하의 추출한 mRNA(네이키드 mRNA)가 포함되었다(도 3a). 본 발명자들은 프라임 및 스파이크에서 발견한 것과 유사하게, 프라임 및 PACE-스파이크는 표준 조직 상주 마커(CD69⁺ 및 CD103⁺)를 발현하는 항원 특이적 CD8⁺ T_RM(IV^-4량체⁺)을 유도했다(도 3b). 또한, PACE-스파이크를 부스트한 마우스는 더 높은 수준의 BALF 항-사스-CoV-2 IgA를 발생시켰고; BALF IgG 및 혈청 IgA 및 IgG의 수준은 IM 프라임 단독 마우스와 유사했다(도 3c). IM 프라임에 이어 IN 네이키드 mRNA는 IM 프라임 단독의 경우 이상의 점막 또는 전신 면역 반응을 유도할 수 없었는데, 이는 점막 부스트에 PACE에 의한 mRNA 캡슐화가 필요함을 나타낸다. 또한 IN PACE-스파이크 단독의 단일 투여는 이 투여량에서 임의의 검출 가능한 점막 또는 전신 항체 반응을 유발하기에 충분하지 않았다.

실시예 16: mRNA-LNP 면역이 감소하는 상황에서 프라임 및 스파이크 또는 프라임 및 PACE-스파이크는 치명적인 사스-CoV-2 유발시험으로부터 보호한다.

현재 백신은 처음에는 보호 면역을 유발하는데 매우 효과적이었지만, 항체 수준이 감소하고 면역 회피가 발생하면 가까운 미래에 사스-CoV-2에 대한 부스터가 필요할 것이나; 가장 좋은 부스트 방법은 여전히 의문이다. IN 투여가 대체 보호 부스트를 제공하는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 감소하는 면역을 모방하기 위해 저 투여량 mRNALNP 백신접종 모델을 활용했고; 0.05 μg mRNA-LNP로의 단일 투여량 면역화를 실시했다. 이러한 저 투여량 mRNA-LNP 백신접종 마우스는 균일하게 전신 항체 반응을 발생시키지만, 본 발명자들은 이전에 이 투여량이 사스-CoV-2 유발시험으로부터 보호하기에 충분하지 않다는 것을 발견하였다. 프라임 후 14일의 마우스에 IN 스파이크(1 μg 무애주번트 스파이크 단백질)를 투여했다. 이전에 기재한 1 μg IM 프라임 마우스와 유사하게, IN 스파이크로 부스트한 0.05 μg IM 프라임 마우스는 부스트 후 42일에 폐에서 항원-특이적 CD8⁺ T_RM 및 BALF에서 IgA 및 IgG가 유의하게 증가했다(도 7a). 이러한 데이터는 또한 저 투여량 mRNA-LNP 프라임으로 생성된 매우 낮은 수준의 면역 기억도 IN 무애주번트 스파이크로 점막 및 전신 체액성 및 세포성 기억을 유도하도록 효과적으로 부스트할 수 있음을 나타낸다.

나이브, 저 투여량 프라임 단독, 저 투여량 프라임 및 스파이크 마우스에 6x10⁴ PFU 상동/전세대 WA1 균주 사스-CoV-2로 유발시험하였다. 마우스를 2 DPI에서 안락사시키고 비강 비갑개와 폐의 플라크 검사로 바이러스 부담을 평가하거나, 5 DPI에서 안락사시키고 폐의 병리학을 평가하거나, 14일 동안 중량 감소 및 치사율을 모니터링했다(도 4a). 프라임 및 스파이크를 투여한 모든 마우스는 중량 감소 또는 치사로부터 완전히 보호되었지만 나이브 마우스 또는 저 투여량 프라임 단독 마우스는 바이러스 유발시험으로부터 보호되지 않았다(도 4b(B-D)). 또한 프라임 및 스파이크를 투여한 마우스의 이환율 및 치사율의 이러한 상당한 개선은 상부 호흡기(비강 비갑개)과 하부 호흡기(폐) 모두에서 바이러스 부담 감소와 함께 나타났다(도 4b(E,F)). 또한 프라임 및 스파이크는 폐 병리로부터 상당한 보호를 제공했으며, 6마리 중 1마리만 5 DPI에서 제한된 단핵구 침윤이 발생했고, 나머지 마우스는 감염되지 않은 마우스에서 나타나는 것과 유사한 폐 구조로 완전히 보호되었다(도 4b(G), 도 4c). mRNA-PACE IN 부스트의 보호 능력을 평가하기 위해, 다시 저 투여량 프라임 mRNA-LNP 마우스를 사용하여 10 μg의 IN mRNA-PACE로 부스트했다. 본 발명자들은 프라임 및 PACE-스파이크가 이환율 및 치사율로부터 상당한 보호를 제공함을 발견했다(도 4d, 도 4e). 이 데이터는 IN 무애주번트 스파이크 또는 스파이크를 인코딩하는 mRNA-PACE가 전임상 마우스 모델에서 코비드-19와 유사한 폐 질병 및 치사율로부터 보호하기에 충분히 점막 면역을 부스트한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 또한 이 백신 전략의 견고성, 다능성 및 안전성을 강조하는데, 이는 두 가지 방식으로 전신 mRNA-LNP 프라임을 비강내로 부스트하는 것이 점막 면역을 유도하고 치명적인 사스-CoV-2 유발시험에 대한 보호를 제공하기에 충분하기 때문이다.

실시예 17: 프라임 및 스파이크는 비경구 mRNA-LNP 기반 부스트와 유사한 강력한 전신 면역을 유발한다.

IM 주사 mRNA-LNP 기반 백신은 면역원성 및 백신 효능 연구가 이 부스트 방법에 가장 집중되어 있기 때문에 많은 국가에서 현재 표준으로 권장하는 부스트 전략이다. 프라임 및 스파이크를 IM mRNA-LNP 프라임/부스트와 비교하기 위해, 본 발명자들은 K18-hACE2 마우스를 1 μg의 mRNA-LNP로 프라임한 다음, 14일 후에 1 μg IN 스파이크 또는 1 μg IM mRNA-LNP를 투여했다. 마우스를 부스트 후 31일에 안락사시키고, 항원-특이적 CD8⁺ T_RM을 유세포 분석법으로 평가하고, BALF 및 혈청의 항체를 ELISA로 평가하고, VSV 위형바이러스 중화 분석을 실시하여 혈청 항체 중화 반응을 평가했다(도 8a- 도 8c). 본 발명자들은 IM mRNA-LNP 부스트 및 IN 스파이크 부스트 동물 모두 혈관외(IV^-) 4량체⁺CD8⁺ T 세포 수준이 증가한 것을 발견했으나; IN 스파이크 부스트 동물만 폐에서 CD69⁺ 및 CD103⁺를 발현하는 CD8⁺ T_RM이 발생했다(도 8b). 본 발명자들은 ELISA를 통해 IN 스파이크 부스트 동물만 BALF에서 항-사스-CoV-2 IgA가 발생했다. BALF IgG 수준은 IM mRNA-LNP 및 IN 스파이크 부스트 마우스에서 유사했는데, 이는 IM mRNA-LNP 부스트 마우스에서 전신 항체 수준이 증가하여 세포 간 이동이 일어난 것일 수 있다. 본 발명자들은 유사하게 IM mRNA-LNP 및 IN 스파이크 부스트 마우스에서 항-사스-CoV-2 IgA 및 IgG의 균등한 혈청 수준를 발견했다. 혈청의 중화 분석에서도 IM mRNA-LNP 및 IN 스파이크 부스트 간에 유사한 IC50이 나타났다. 이 데이터는 프라임 및 스파이크가 IM mRNA-LNP 부스트와 유사한 전신 중화 항체 수준(neutralizing antibody level)을 유도한다는 것을 보여주었고, 이는 보호의 상관관계로 나타났으며, 점막 IgA 및 CD8⁺ T_RM을 고유하게 유발한다.

실시예 18: 이종 스파이크는 원래 항원 문제 없이 교차-반응 면역을 강력하게 유발한다.

위의 실험은 무애주번트 하위단위 스파이크 또는 스파이크를 인코딩하는 PACE-스파이크에 의해 별개의 해부학적 위치, 이 경우 호흡 점막에서 부스트하면, 새로 부스트된 부위에서 새로운 점막 면역 기억을 형성하고 해당 항원에 대한 전신 면역을 향상할 수 있음을 명확히 보여준다. 무애주번트 하위단위 스파이크 및 mRNAPACE에서 부스트 항원은 전신 프라임 항원(mRNA-LNP)과 상동이다. 현재 순환 균주 사스-CoV-2, 특히 델타 및 오미크론은 스파이크 단백질 서열과 구조에 상당한 변화가 있다. 델타는 T19R, G142D, Δ56-157, R158G, Δ13-214, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N 돌연변이를 보유하고, 오미크론은 A67V, Δ9-70, T95I, G142D, Δ43-145, N211I, L212V, ins213-214RE, V215P, R216E, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, 및 L981F 돌연변이를 보유한다. 이러한 돌연변이는 델타와 오미크론이 모두 더 빠르게 전파되고 기존의 체액성 면역을 회피하게 했으며, 향후 변이체는 더욱 분화될 가능성이 높으므로 광범위한 반응성 면역을 유발하는 부스트 전략이 향후 변이체를 중화하는데 필요할 것으로 나타난다. 본 발명자들은 IN 부스트를 위한 무애주번트 이종 스파이크 단백질의 능력을 시험하기 위해, 1 μg mRNA-LNP로 K18-hACE2 마우스를 프라임한 다음 14일 후에 3량체 안정화 돌연변이(R667A, K968P, V969P)를 포함하는 5 μg의 사스-CoV-1 스파이크 또는 프라임 및 스파이크X로 부스트했다(도 5a). 사스-CoV-1은 연관된 사르베코바이러스이지만, 이의 스파이크 단백질은 현재 사용되는 mRNA-LNP 백신에 의해 인코딩된 원래의 사스-CoV-2 스파이크 서열과 76%의 상동성을 공유한다. 비교를 위해 본 발명자들은 또한 1 μg IM mRNA-LNP로 mRNA-LNP 프라임된 마우스를 부스트했다. 부스트 후 31일에 CD45 IV 표지를 사용하여, 본 발명자들은 표준 T_RM 마커인 CD69⁺ 및 CD103⁺를 발현하는 IV^- 4량체⁺ CD8⁺ T 세포가 유의하게 증가한 것을 발견했다(도 5b). 앞서 언급했듯이, 이 MHC I 4량체 서열은 사스-CoV-1 및 사스-CoV-2가 모두 속한 사르베코바이러스 패밀리 내에서 매우 보존되어 있다. 다음으로, 본 발명자들은 BALF 및 혈청에서 항-사스-CoV-1 항체의 발생을 평가하였고, 프라임 및 스파이크X에서 IM mRNA-LNP 프라임/부스트에 비해 호흡기 점막 및 순환계에서 항-사스-CoV-1 IgA 및 IgG가 유의하게 증가한 것을 발견했다. 이전 연구와 일치하게, 사스-CoV-2 mRNALNP의 2회의 투여량이 사스-CoV-1 스파이크에 결합하는 검출 가능한 항체를 유도하기에 충분하다는 것을 발견했다. 다음으로, 본 발명자들은 BALF 및 혈청에서 항-사스-CoV-2 항체를 평가했다. 본 발명자들은 프라임 및 스파이크X가 IM 사스-CoV-2 mRNA-LNP 프라임/부스트보다 더 높은 BALF IgA를 유도한다는 것을 발견했다. 본 발명자들은 BALF에서 유사한 수준의 항-사스-CoV-2 IgG를 발견하였는데, 이는 본 발명자들이 발견한 증가된 혈청 IgG를 나타낼 가능성이 높다(도 5c(I-L)). 다음으로, 본 발명자들은 VSV 기반 위형바이러스 중화 분석을 사용하여 프라임 및 스파이크X 마우스의 혈청이 I 사스-CoV-2 mRNA-LNP로 부스트한 마우스보다 사스-CoV-1에 대해 더 높은 중화 역가를 나타냄을 보여준다(도 5c(M,N)). 마찬가지로, 혈청 IgG 수준와 유사하게 일치하는 것으로, IM 사스-CoV-2 mRNA-LNP 프라임/부스트 마우스는 프라임 및 스파이크X 마우스보다 사스-CoV-2에 대해 유의하게 더 높은 중화 역가를 나타낸다(도 5c(O,P)). 이러한 데이터를 종합하면, 무애주번트 이종 스파이크 단백질로 IN을 부스트하면 원래 항원 문제의 부재 하에 유의하게 다른 스파이크 단백질에 대한 강력한 점막 세포성 및 체액성 기억을 유도할 수 있음을 나타낸다.

실시예 19: 프라임 및 스파이크는 사스-CoV-2에 대한 점막 면역을 유도한다

지난 2년간의 사스-CoV-2 팬데믹 동안 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된 변형된 mRNA를 포함하는 백신은 매우 효과적이었다. 3상 임상 시험과 그에 따른 시판 후 백신 효과 연구는 처음에 증상이 있는 질병에 대해 90% 초과의 백신 효능을 보였다. 안타깝게도, 최근 연구에서 mRNA-LNP 기반 요법으로 2차 투여 후 약 4개월이 지나면서 무증상 감염 및 증상 중증 감염 양상에서 백신 효과가 감소하는 것으로 나타났다. 이 연구는 이전에 사스-CoV-2에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자에게 프라임 및 스파이크가 미치는 영향을 분석하는 것이다. 이를 위해, 이전에 사스-CoV-2에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자를 두 그룹으로 균등하게 나눈다. 한 그룹은 대조군으로 위약이 포함된 비강내 제형을 투여하고; 다른 그룹은 FDA에서 승인한 mRNA 백신이 포함된 비강내 제형을 투여한다. 환자의 감염 또는 백신접종 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월에 투여를 실시한다. 프라임 및 스파이크의 효과를 평가하기 위해 백신이 투여되는 점막 부위에서 CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, 기억 T 세포 (T_RM) 및 B 세포 (B_RM) 및 점막 IgG 및 이량체 IgA를 측정한다.

실시예 20: 프라임 및 스파이크는 인간 유두종 바이러스(HPV)에 대한 점막 면역을 유도한다.

이 연구는 이전에 HPV에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자에게 프라임 및 스파이크의 효과를 분석하는 것이다. 이를 위해, 이전에 HPV에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자를 두 그룹으로 균등하게 나눈다. 한 그룹은 대조군으로 위약이 포함된 질 제형을 투여하고; 다른 그룹은 HPV에 대한 백신이 포함된 질 제형을 투여한다. 환자의 감염 또는 백신접종 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월에 투여를 실시한다. 프라임 및 스파이크의 효과를 평가하기 위해 백신이 투여되는 점막 부위에서 CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, 기억 T 세포 (T_RM) 및 B 세포 (B_RM) 및 점막 IgG 및 이량체 IgA를 측정한다.

실시예 21: 프라임 및 스파이크는 로타바이러스에 대한 점막 면역을 유도한다.

이 연구는 이전에 로타바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자에게 프라임 및 스파이크의 효과를 분석하는 것이다. 이를 위해, 이전에 로타바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 환자를 두 그룹으로 균등하게 나눈다. 한 그룹은 대조군으로 위약이 포함된 경구 제형을 투여하고; 다른 그룹은 로타바이러스에 대한 백신이 포함된 경구 제형을 투여한다. 환자의 감염 또는 백신접종 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월에 투여를 실시한다. 프라임 및 스파이크의 효과를 평가하기 위해 백신이 투여되는 점막 부위에서 CD8⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, 기억 T 세포 (T_RM) 및 B 세포 (B_RM) 및 점막 IgG 및 이량체 IgA를 측정한다.

Claims

이를 필요로 하는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 점막 부위(mucosal site)에 항원 또는 항원을 인코딩(encoding)하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 이전에 바이러스에 대해 백신접종(vaccinating)했거나 이에 감염된 적이 있는, 방법.
제1항에 있어서, 인간은 바이러스에 대한 백신을 비경구적으로 백신접종한, 방법.
제1항에 있어서, 항원은 다가 항원(multivalent antigen)인, 방법.
이를 필요로 하는 인간에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 점막 부위에 항원을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 항체, 기억 B 세포, 효과기(effector) CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포가 증가한, 방법.
제4항에 있어서, 증가된 항체, 기억 B 세포, 효과기 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발되는, 방법.
제4항에 있어서, 증가된 항체, 기억 B 세포 및 효과기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발되는, 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 증가된 항체는 면역글로불린 G(IgG), IgM, IgA 또는 이의 조합인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 점막 부위는 비강인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 적어도 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 핵산은 DNA 또는 RNA인, 방법.
제1항에 있어서, 핵산은 mRNA인, 방법.
제11항에 있어서, mRNA는 N1-메틸-슈도우리딘(pseudouridine)-변형된 mRNA인, 방법.
제11항에 있어서, mRNA는 슈도우리딘-변형된 mRNA인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 미생물 병원체로부터 유래되는, 방법.
제14항에 있어서, 미생물 병원체는 마이코박테리아(mycobacterium), 박테리아, 진균, 바이러스, 기생충 또는 프리온(prion)인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 로타바이러스(rotavirus), 노로바이러스(norovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아스트로바이러스(astrovirus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza viruses), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 아데노바이러스, 보카바이러스(bocavirus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 단순포진 바이러스 1형(herpes simplex virus type 1)(HSV-1), 단순포진 바이러스 2형(HSV-2), 인간 유두종바이러스(human papillomavirus)(HPV), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 아데노바이러스, 소아마비(poliomyelitis), 일본뇌염(Japanese encephalitis), 천연두(smallpox), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 플라비바이러스(flaviviruses), 에코바이러스(echovirus), 라이노바이러스, 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 이하선염 바이러스(mumps virus), 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스(parvovirus), 우두 바이러스(vaccinia virus), 인간 T-림프구 바이러스(HTLV), 뎅기 바이러스(dengue virus), 인간 유두종 바이러스(HPV), 연속종 바이러스(molluscum virus), 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스, 아르보바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus), 사스-CoV-2(SARS-CoV-2), 헤노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura)(HSP), RNA 바이러스, DNA 바이러스, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항에 있어서, RNA 바이러스는 일반 감기, 독감, 사스(SARS), 메르스(MERS), 코비드-19(Covid-19), 뎅기 바이러스, C형 간염, E형 간염, 서나일열(West Nile fever), 에볼라 바이러스 질병(Ebola virus disease), 광견병, 소아마비(polio), 이하선염, 홍역, 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항에 있어서, DNA 바이러스는 단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalo virus), 수두대상포진 바이러스(varicella zoster virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 로제올로 바이러스(roseolo virus), 인간 헤르페스바이러스-7(human herpesvirus-7), 카포시 육종-연관 바이러스(Kaposi's sarcoma-associated virus), 이의 변이체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 점막 전달에 의해 투여되는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 인간 대상체의 점막 조직에 투여되는, 방법.
제23항에 있어서, 점막 조직은 전비공(anterior nastril), 비강동굴(nasal sinus), 직장, 질(vaginal), 식도, 요도, 설하 및 협측(buccal)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 비강내(intranasal)로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 애주번트(adjuvant)를 포함하지 않는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 애주번트를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(lipid nanoparticle)(LNP)를 포함하는, 방법.
제28항에 있어서, 항원은 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화(encapsulating)되는, 방법.
제28항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 적어도 하나의 양이온성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA) 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)을 포함하는, 방법.
제28항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 폴리(아민-코-에스테르)(PACE) 중합체를 포함하는, 방법.
제28항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 인지질을 추가로 포함하는, 방법.
제33항에 있어서, 적어도 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 콜레스테롤(Chol), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인간은 약 1주 전, 2주 전, 3주 전, 1개월 전, 2개월 전, 3개월 전, 4개월 전, 5개월 전, 6개월 전, 7개월 전, 8개월 전, 9개월 전, 10개월 전, 11개월 전, 또는 12개월 전에 바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있는, 방법.
이를 필요로 하는 인간에서 사스-CoV-2에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 점막 부위에 적어도 하나의 mRNA를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 인간은 이전에 바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있는, 방법.
제36항에 있어서, 인간은 BNT162b2 (Pfizer/BioNTech), mRNA-1273 (Moderna), AZD1222/ChAdOxl (AstraZeneca/Oxford Univ), Ad5 -벡터 코비드-19 백신 (CanSino Biologies), CoronaVac (Sinovac), NVX-CoV2373 (Novavax), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 코비드-19 백신으로 이전에 백신접종한 적이 있는, 방법.
제36항에 있어서, 적어도 하나의 mRNA는 사스-CoV-2 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 스파이크 단백질(spike protein)을 인코딩하는, 방법.
제36항에 있어서, 약제학적 조성물은 두 개 이상의 다른 항원을 인코딩하는 mRNA를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 두 개 이상의 항원은 사스-CoV-2 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 스파이크 단백질인, 방법.
제40항에 있어서, 두 개 이상의 항원은 표 1에 나열된 돌연변이 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 애주번트를 포함하지 않는, 방법.
제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 애주번트를 포함하는, 방법.
제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는, 방법.
제44항에 있어서, 적어도 하나의 mRNA는 지질 나노입자(LNP) 내에 캡슐화되는, 방법.
제45항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 적어도 하나의 양이온성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA) 및/또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)을 포함하는, 방법.
제45항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 폴리(아민-코-에스테르)(PACE) 중합체를 포함하는, 방법.
제45항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)는 적어도 하나의 인지질을 추가로 포함하는, 방법.
제49항에 있어서, 적어도 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 콜레스테롤(Chol), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및/또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)을 포함하는, 방법.
제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 50 nm 내지 약 1000 nm 범위의 평균 직경을 갖는, 방법.
제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 600 nm의 범위의 평균 직경을 갖는, 방법.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응은 점막 면역 반응인, 방법.
제53항에 있어서, 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgA 항체 생성인, 방법.
제53항에 있어서, 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgG 항체 생성인, 방법.
제53항에 있어서, 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgM 항체 생성인, 방법.
제36항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 증가된 중화 항체 수준(elevated neutralizing antibody level)이 유발된, 방법.
제36항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된 증가된 중화 항체 수준을 갖는, 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 증가된 중화 항체는 IgG, IgM, IgA 또는 이의 조합인, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발된 증가된 IgG 항체 수준을 갖는, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발된 증가된 IgM 항체를 갖는, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 대한 이전 백신접종에 의해 유발된 증가된 IgA 항체를 갖는, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된 증가된 IgG 항체를 갖는, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된 증가된 IgM 항체를 갖는, 방법.
제59항에 있어서, 인간은 메르스-CoV, 사스-CoV-1, 사스-Cov-2 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 이전 감염에 의해 유발된 증가된 IgA 항체를 갖는, 방법.
제36항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 인간은 약 1주 전, 2주 전, 3주 전, 1개월 전, 2개월 전, 3개월 전, 4개월 전, 5개월 전, 6개월 전, 7개월 전, 8개월 전, 9개월 전, 10개월 전, 11개월 전 또는 12개월 전에 바이러스에 대해 백신접종했거나 이에 감염된 적이 있는, 방법.
제35항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 사스-CoV-2 변이체는 알파(Alpha)(B.1.1.7 및 Q 계통), 베타(Beta)(B.1.351 및 후세대 계통), 감마(Gamma)(P.1 및 후세대 계통), 델타(Delta)(B.1.617.2 및 AY 계통), 엡실론(Epsilon)(B.1.427 및 B.1.429), 에타(Eta)(B.1.525), 이오타(Iota)(B.1.526), 카파(Kappa)(B.1.617.1), 1.617.3, 뮤(Mu)(B.1.621, B.1.621.1), 제타(Zeta)(P.2), 뮤(B.1.621, B.1.621.1), 오미크론(Omicron)(Pango 계통 B.1.1.529, BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제36항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 mRNA는 N1-메틸-슈도우리딘-변형된 mRNA인, 방법.
제36항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 mRNA는 슈도우리딘-변형된 mRNA인, 방법.