KR20250008144A

KR20250008144A - 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질 및 허혈성 질환 또는 손상의 치료를 위한 이의 주사 가능한 제형

Info

Publication number: KR20250008144A
Application number: KR1020247043246A
Authority: KR
Inventors: 에릭 슈무크; 아미쉬 라발
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2025-01-14
Also published as: JP7535070B2; EP3302594B1; JP7468983B2; JP2018521018A; US20160354447A1; EP3302594A1; KR20180015187A; JP2022066207A; CN107735113B; US20190111113A1; CN107735113A; WO2016197038A1

Abstract

공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 3-차원 세포외 기질(ECM)을 이용한 조성물 및 방법이 기재된다. ECM은 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고, 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%는 피브로넥틴이다. 심장 질환 또는 허혈성 질환 또는 손상을 치료하는데 이용될 수 있는 조성물은 주사 가능한 조성물이고, 이 때 ECM은 작은 단편으로 잘리거나 분말로 동결건조된다. 기재된 방법은 치료용 세포의 동반 전달없이, ECM으로 제조된 세포 비함유 패치를 손상된 조직과 접촉시킴에 의해 허혈성 질환 또는 손상을 치료하는 방법, 및 패치 그 자체 또는 치료용 세포로 시딩된 패치를 손상된 사지 조직과 접촉시킴에 의해 허혈성 사지 손상을 치료하는 방법을 포함한다.

Description

심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질 및 허혈성 질환 또는 손상의 치료를 위한 이의 주사 가능한 제형{CARDIAC FIBROBLAST-DERIVED EXTRACELLULAR MATRIX AND INJECTABLE FORMULATIONS THEREOF FOR TREATMENT OF ISCHEMIC DISEASE OR INJURY}

관련 출원의 전후 참조

본 출원은 그 전문에 개시된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된, 2015년 6월 3일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/170,324호의 이익을 주장한다.

연방 후원된 연구 또는 개발에 관한 언급

본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 DK080345 및 HHSN268201000010C 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

배경

허혈은 조직, 기관, 또는 팔다리로 가는 동맥혈류의 중단이다. 허혈은 세포 대사에 필요한 산소 및 글루코스의 부족을 초래하여, 조직 손상 또는 사멸(허혈성 손상)로 이어질 수 있다.

심근 경색증을 일으킬 수 있는 심장 허혈은 심근(심장 근육)이 불충분한 혈류를 받을 때 발생한다. 심장에 대한 허혈성 손상은 전세계적으로 입원과 사망의 주요 원인이며, 환자의 결과를 개선시키기 위해서는 심장 허혈성 손상에 대한 새롭고 보다 효과적인 치료가 필요하다.

심장 허혈과 별개의 병인 및 표준 치료 요법을 갖는 사지 허혈은 사지로의 혈류 부족의 결과이다. 미국에서, 매년 약 2백만 명이 사지 허혈로 고통받는다. 발현시, 이러한 환자의 60%는 이용 가능한 유효한 치료 옵션이 없다. 허혈성 사지 손상의 일반적인 형태인 허혈성 궤양은 반복 감염되는 경향이 있는 치유가 안되는 고통스러운 만성 상처이다. 보통, 허혈성 사지 손상을 성공적으로 치료할 수 있는 약물은 존재하지 않는다. 조직의 혈관재형성 및/또는 다양한 피부 대용물의 사용이 흔한 치료이지만, 이러한 치료가 손상된 사지를 구제하기에 항상 충분한 것은 아니어서, 유일하게 실행 가능한 치료 옵션인 절단으로 이어진다.

이전 특허(전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 8,802,144호) 및 간행물(Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131, 본원에 참조로서 포함됨)에서 Schmuck 등은 치료용 세포를 손상되거나 병적인 심장 조직에 전달하기 위한 플랫폼으로서 이용될 수 있는 공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질로 제조된 바이오스캐폴드(bioscaffold)를 기술하고 있다. 바이오스캐폴드는 치료용 세포를 손상되거나 병적인 심장 조직에 전달하는 메커니즘으로서 치료용 세포로 시딩된다. 이 치료 방법은 손상된 심장 표면에 세포-시딩된 패치를 배치하기 위해 침습적이고 잠재적으로 위험도가 높은 수술을 수행해야 한다. 또한, 이 치료 방법은 환자에게 내인성이 아닌 치료용 세포의 사용을 요구하며, 추가적인 복잡성, 잠재적인 위험, 및 추가적인 규제 장애가 추가된다. 마지막으로, 이 치료 방법은 심장 조직의 손상 및 질병에 특이적이며, 허혈성 사지 손상과 같이 비-심장 조직에서 발생한 손상에 작용할 것으로 기대되지 않는다.

이러한 이유들로 인해, 공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질로부터 제조된 종래에 기재된 바이오스캐폴드를 사용하는 새로운 조성물 및 방법이 매우 요망될 것이다.

간단 개요

본 발명자들은 미국 특허 8,802,144호에 기재된 공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질로부터 제조된 주사 가능한 조성물이 제조되고 심장에 전달될 수 있음을 본원에서 입증한다. 또한, 본 발명자들은 공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질이, 치료용 세포로 시딩되든 그렇지 않든 간에, 허혈성 사지 손상을 효과적으로 치료할 수 있음을 본원에서 입증한다. 마지막으로, 본 발명자들은 심지어 치료용 세포의 부재시에도, 공학처리된 심장 섬유모세포-유래된 세포외 기질이 허혈성 심장 및 허혈성 사지 손상 둘 모두를 효과적으로 치료할 수 있음을 본원에서 입증한다.

따라서, 첫 번째 양태에서, 본 개시 내용은 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상을 치료하기 위한 주사 가능한 조성물을 포함한다. 조성물은 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하는 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질의 하나 이상의 단편을 포함하고, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%는 피브로넥틴이다. 하나 이상의 단편은 18 게이지 피하 바늘의 주입구를 통과할 정도로 충분히 작다. 또한, 제형은 주사 가능한 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 세포외 기질의 구조 단백질은 화학적으로 가교되지 않는다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 단편은 20-500 μm의 두께를 갖는다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 단편은 동결건조된 분말의 형태이다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 세포외 기질은 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 또는 비글리칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 제형에는 무손상 심장 섬유모세포 세포가 본질적으로 없다. 일부 그러한 구체예에서, 제형은 전혀 세포를 함유하지 않는다.

일부 구체예에서, 조성물은 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포를 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 세포는 골격 근모세포, 배아 줄기(ES) 세포 또는 이의 유도체, 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포 또는 이의 유도체, 다능성 성체 생식계 줄기(maGCS) 세포, 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포(VSEL 세포), 내피 전구 세포(EPC), 심장형성 세포(CPC), 심장공-유래된 세포(CDC), 다능성 Isl1 ⁺ 심혈관 전구 세포(MICP), 심외막-유래된 전구 세포(EPDC), 지방질-유래된 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 스트로마 세포, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제를 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 성장 인자는 스트로마 세포-유래된 인자 1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 또는 각질세포 성장 인자(KGF)를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 단편은 27 게이지 피하 바늘의 주입구를 통과할 정도로 충분히 작다.

두 번째 양태에서, 본 개시 내용은 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 질환 또는 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 대상체에 유효량의 상기 기재된 제형을 주입하는 단계를 포함하고, 이로써 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 질환 또는 손상의 중증도가 감소한다.

일부 구체예에서, 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 질환 또는 손상은 급성 심근 경색증, 심부전, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 선천 결손, 뇌졸중, 당뇨 족부 궤양, 말초 동맥 질환(PAD), PAD-관련 궤양, 또는 사지 허혈에 의해 초래된다.

세 번째 양태에서, 본 개시 내용은 주사 가능한 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 20-500 μm의 두께를 갖고 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하는 세포제거된(decellularized) 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질을 수득하는 단계로서, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%가 피브로넥틴인, 단계; (b) (i) 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질을 18 게이지 피하 바늘의 주입구를 통과할 수 있는 충분히 작은 단편으로 자르거나, (ii) 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질을 분말로 동결건조시키는 단계; 및 (c) 잘리거나 동결건조된 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질을 주사 가능한 약학적으로 허용되는 담체와 혼합시키는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 생성된 조성물을 0.60 mm² 미만의 최소 유동 면적을 갖는 하나 이상의 통로를 통해 통과시키는 단계를 추가로 포함한다. "최소 유동 면적"이라 함은 통로를 통과하는 흐름 방향에 수직인 단면에서 측정된 통로의 최소 단면적을 의미한다. 예를 들어, 통로가 표준 피하 바늘인 경우, 최소 유동 면적은 피하 바늘의 내부 표면의 단면을 정의하는 원의 면적일 것이다. 내경이 0.838 mm인 표준 게이지 18 피하 바늘은 원의 면적 공식에 기반하여(단면적 = πr²) 0.552 mm²의 최소 유동 면적을 가질 것이다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 통로 중 적어도 하나는 0.040 mm² 미만의 최소 유동 면적을 갖는다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질을 수득하는 단계는 (a) 심장 섬유모세포를 심장 조직으로부터 분리하거나 심장 섬유모세포를 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포로부터 유래시키고; (b) 심장 섬유모세포를 배양액에서 1-15회 계대 동안 증식시키고; (c) 증식된 심장 섬유모세포를 cm² 당 100,000 내지 500,000개 세포의 세포 밀도를 갖는 배양액으로 플레이팅함에 의해 수행된다. 이러한 단계를 수행함에 있어서, 심장 섬유모세포는 20-500 μm의 두께를 갖는 3-차원 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질(CF-ECM)을 분비한다. 일부 그러한 구체예에서, 이 단계는 CF-ECM을 세포제거제와 접촉시켜, 심장 세포외 기질의 세포를 제거하는 것을 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 주사 가능한 조성물에 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 세포는 골격 근모세포, 배아 줄기 (ES) 세포 또는 이의 유도체, 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포 또는 이의 유도체, 다능성 성체 생식계 줄기 세포(maGCS), 골수 중간엽 줄기 세포 (BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포 (VSEL 세포), 내피 전구 세포 (EPC), 심장형성 세포(CPC), 심장공-유래된 세포(CDC), 다능성 Isl1 ⁺ 심혈관 전구 세포 (MICP), 심외막-유래된 전구 세포 (EPDCs), 지방질-유래된 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 스트로마 세포, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 주사 가능한 조성물에 하나 이상의 비-세포 치료제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 비-세포 치료제는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 성장 인자는 스트로마 세포-유래된 인자 1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 또는 각질세포 성장 인자(KGF)를 포함할 수 있다.

네 번째 양태에서, 본 개시 내용은 허혈성 질환 또는 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 허혈성 질환 또는 손상을 나타내는 대상체의 조직을 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고 두께가 20-500 μm인 세포 비함유 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질(CF-ECM)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%는 피브로넥틴이고, 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질에는 어떤 세포도 시딩되지 않는다. 이 방법을 수행한 결과, 허혈성 질환 또는 손상의 중증도가 감소한다.

일부 구체예에서, 세포 비함유 공학처리된 심장 세포외 기질은 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 및 비글리칸 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구체예에서, 세포 비함유 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질은 (a) 심장 섬유모세포를 심장 조직으로부터 분리하거나 심장 섬유모세포를 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포로부터 유래시키고; (b) 심장 섬유모세포를 배양액에서 1-15회 계대 동안 증식시키고; (c) 증식된 심장 섬유모세포를 cm² 당 100,000 내지 500,000개 세포의 세포 밀도를 갖는 배양액으로 플레이팅하고(이 때 심장 섬유모세포는 20-500 μm의 두께를 갖는 3-차원 심장 섬유모세포 기질을 분비함); (d) 심장 세포외 기질을 세포제거제와 접촉시켜, 심장 세포외 기질의 세포를 제거함에 의해 수득된다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 허혈성 질환 또는 손상을 나타내는 대상체의 조직을 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 비-세포 치료제는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 성장 인자는 스트로마 세포-유래된 인자 1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 또는 각질세포 성장 인자(KGF)를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 허혈성 질환 또는 손상은 심근 경색증, 뇌졸중, 당뇨 족부 궤양, 말초 동맥 질환(PAD), PAD-관련 궤양, 또는 사지 허혈에 의해 초래된다. 일부 그러한 구체예에서, 허혈성 질환 또는 손상은 사지 허혈에 의해 초래된다. 일부 그러한 구체예에서, 사지 허혈은 죽상경화증 또는 당뇨병의 결과이다.

다섯 번째 양태에서, 본 개시 내용은 허혈성 사지 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 허혈성 사지 손상을 나타내는 대상체의 조직을 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고 두께가 20-500 μm인 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질(CF-ECM)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%는 피브로넥틴이다. 이 방법을 수행함으로써, 허혈성 사지 손상의 중증도가 감소한다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 세포외 기질은 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 또는 비글리칸 중 하나 이상을 포함한다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 세포외 기질에 허혈성 사지 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포가 시딩된다. 일부 그러한 구체예에서, 허혈성 사지 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포는 골격 근모세포, 배아 줄기(ES) 세포 또는 이의 유도체, 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포 또는 이의 유도체, 다능성 성체 생식계 줄기 세포(maGCS), 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포(VSEL 세포), 내피 전구 세포(EPC), 지방질-유래된 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 스트로마 세포, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질은 (a) 심장 섬유모세포를 심장 조직으로부터 분리하거나 심장 섬유모세포를 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포로부터 유래시키고; (b) 심장 섬유모세포를 배양액에서 1-15회 계대 동안 증식시키고; (c) 증식된 심장 섬유모세포를 cm² 당 100,000 내지 500,000개 세포의 세포 밀도를 갖는 배양액으로 플레이팅함에 의해 수득될 수 있고, 이 때 심장 섬유모세포는 20-500 μm의 두께를 갖는 3-차원 심장 세포외 기질을 분비한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 허혈성 손상을 나타내는 대상체의 조직을 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 비-세포 치료제는 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 그러한 구체예에서, 하나 이상의 성장 인자는 스트로마 세포-유래된 인자 1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 또는 각질세포 성장 인자(KGF)를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 허혈성 사지 손상은 죽상경화증 또는 당뇨병의 결과이다.

기재된 조성물 및 방법은 하기에서 더 상세히 설명된다.

도면의 간단한 설명
하기의 상세한 설명을 고려할 때, 본 발명은 보다 잘 이해될 것이며 전술한 것 이외의 특징, 양태, 및 이점은 명백해질 것이다. 그러한 상세한 설명은 하기 도면을 참조한다.
도 1은 검은색 조직 염료로 염색된 단편화된 CF-ECM을 도시한다. 단편화 프로토콜은 이질성 CF-ECM 단편을 생성한다. 단편은 CF-ECM의 작은 "시트"로 나타난다.
도 2는 검은색 조직 염료로 염색된 단편화된 CF-ECM을 도시한다.
도 3은 검은색 조직 염료로 염색된 단편화된 CF-ECM을 도시한다.
도 4는 검은색 조직 염료로 염색된 단편화된 CF-ECM을 도시한다.
도 5는 검은색 조직 염료로 착색되고 심장 카테터를 통해 돼지 LV로 주입되는 CF-ECM 주사 가능한 제형을 도시한다. CF-ECM이 어떻게 사이질 공간에 위치하는지에 주목하라.
도 6은 심장초음파상에 의해 측정된, MI 후 다양한 시점에 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 박출률의 변화를 도시하는 그래프이다. 패치 단독 처리는 변화를 -10%로 안정화시켰다.
도 7은 심장초음파상에 의해 측정된, MI 후 다양한 시점에 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 수축기말 용적을 도시하는 그래프이다.
도 8은 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 MI 후 28일에 수축기말 용적의 변화를 도시하는 그래프이다.
도 9는 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 단면 병리학 측정을 도시하는 그래프이다. 제시된 측정은 흉터 두께(왼쪽 위 패널), 힌지 포인트 두께(오른쪽 위 패널), 먼 벽 두께(왼쪽 아래 패널) 및 % 좌심실 경색(오른쪽 아래 패널)이다.
도 10A는 뒷다리 허혈 모델에서 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 수술 후 일수의 함수로서 관류 지수를 도시하는 그래프이다. 구체적으로, 마우스는 대퇴 동맥의 이중 라이게이션 후 1.0 x 10⁶ GFP+ MSC가 로딩된 CF-ECM, 세포가 없는 CF-ECM 단독, 근내 주사로 전달된 GFP+ MSC 단독, 또는 플라시보에 의한 치료를 받았다. 관류 지수는 레이저 도플러 영상을 스캐닝함에 의해 영향을 받은 사지의 혈류를 정상 사지와 비교함으로써 계산된다. CF-ECM으로 처리된 동물은 세포 처리된 대조군 및 플라시보 대조군보다 현저하게 큰 혈류를 지녔다(p=0.003).
도 10B는 뒷다리 허혈 모델에서 4개의 상이한 처리 그룹에 대한 레이저 도플러 스캔 및 해당 사진의 대표적인 이미지를 도시한다.
도 10C는 뒷다리 허혈 모델에서 4개의 처리 그룹에 대한 수술 후 일수의 함수로서 자가절단으로부터 자유(freedom)를 도시하는 그래프이다. CF-ECM 처리된 동물은 세포 및 플라시보 처리된 동물보다 더 큰 발 잔류능을 지녔다.
도 10D는 뒷다리 허혈 모델에서 4개의 처리 그룹에 대한 수술 후 일수의 함수로서 변형된 허혈 지수의 그래프이다. 변형된 허혈 지수는 사지 건강의 전반적인 평가이다. 변형된 허혈 지수는 세포 처리된 대조군 및 플라시보 대조군보다 CF-ECM 처리된 동물에서 강한 개선 경향을 보여주었다.
도 11은 각 처리 그룹에 대한 영향을 받은 종아리 및 대퇴 근육의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 영향을 받은 조직의 정량적인 조직학 채점은 표 1에 제시된다.
도 12는 마우스 뒷다리 허혈 모델에서 CF-ECM으로 옮겨진 GFP+ 중간엽 줄기 세포(MSC)에 대한 데이터를 제시한다.
도 13은 CF-ECM으로 옮겨진 GFP+ MSC가 심근 경색증(MI) 후 리모델링을 감소시켰음을 입증한다.
도 14는 CF-ECM으로 옮겨진 GFP+ MSC가 MI 후 리모델링을 감소시켰음을 입증한다.
도 15는 CF-ECM으로 옮겨진 GFP+ MSC가 MI 후 리모델링을 감소시켰음을 입증한다.
도 16은 위약 치료(sham treatment)에 비해 CF-ECM 단독 투여의 효능을 입증한다.
도 17은 위약 치료에 비해 CF-ECM 단독 투여의 효능을 입증한다.
도 18은 주사 가능한 CF-ECM으로의 MSC의 1시간 시딩의 결과를 도시한다.
도 19는 주사 가능한 CF-ECM으로의 MSC의 18시간 시딩을 도시한다.
도 20은 MSC 단독 주입에 비해 주사 가능한 ECM와 함께 MSC를 주입한지 네(4) 시간 후에 증가된 세포 체류를 도시한다. 청색 = MSC 주입. 황색 = 주사 가능한 CF-ECM + MSC 주입.
도 21은 주사 가능한 ECM과 함께 MSC를 주입한지 24 및 48시간 후에 증가된 세포 체류를 도시한다.

본 발명은 다양한 수정 및 대안적인 형태가 가능하지만, 이의 특정 구체예는 도면의 예로서 도시되었고 본원에 상세하게 기재된다. 그러나, 본원에서 특정 구체예의 설명은 본 발명을 개시된 특정 형태로 제한하려는 것이 아니라, 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 정신 및 범위 내에 있는 모든 수정, 등가물, 및 대안을 포함하려는 의도임이 이해되어야 한다.

상세한 설명

본 출원은 이전에 기재된 공학처리된 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질(CF-ECM)의 주사 가능한 제형 및 이를 제조하고 이용하는 방법을 개시하고 있다. 그러한 제형을 이용하여 심장 질환 또는 손상, 및 다른 허혈성 손상, 예컨대, 허혈성 사지 손상을 치료할 수 있다. 유리하게는, 이 제형은 침습 수술의 필요없이, 주입에 의해 표적 조직에 직접 전달될 수 있다.

본 출원은 심장 질환 또는 손상을 치료하기 위한 치료용 세포가 시딩되지 않은 세포 비함유 공학처리된 CF-ECM의 용도, 및 허혈성 사지 손상을 치료하기 위한 치료용 세포가 시딩되거나 시딩되지 않은 CF-ECM의 용도를 추가로 기술한다. CF-ECM은 접착제 또는 봉합을 필요로 하지 않으며 표적 조직에 잘 붙고, 유연하게 움직이며, 표적 조직으로의 시딩된 세포의 전달을 성공적으로 촉진하는 패치를 형성한다.

공학처리된 CF-ECM은 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고, 다른 구조 단백질도 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공학처리된 CF-ECM은 구조 단백질 콜라겐 타입 V를 포함한다.

바람직하게는, 피브로넥틴 분자는 공학처리된 CF-ECM에 존재하는 구조 단백질 분자의 60% 내지 90%를 구성한다. 일부 구체예에서, 피브로넥틴 분자는 ECM에 존재하는 구조 단백질 분자의 70% 내지 90%를 구성한다. 일부 구체예에서, 피브로넥틴 분자는 공학처리된 CF-ECM에 존재하는 구조 단백질 분자의 80% 내지 90%를 구성한다.

공학처리된 CF-ECM은 단편화되거나 동결건조되기 전에, 20-500 μm의 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 단편화되지 않은 CF-ECM은 30-200 μm 또는 50-150 μm 범위의 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 존재하는 구조 단백질 분자의 80% 초과는 피브로넥틴 분자이다.

바람직하게는, 공학처리된 CF-ECM의 구조 단백질은 화학적으로 가교되지 않는다.

구조 단백질 외에, 심장 ECM은 하나 이상의 모세포 단백질, 예컨대, 성장 인자 및 사이토카인, 뿐만 아니라 다른 물질을 포함할 수 있다. 심장 ECM에서 발견될 수 있는 다른 단백질의 비제한적인 예는 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 단백질-리신 6-옥시다제, 및 비글리칸을 포함한다. 일부 구체예에서, ECM은 임의로 형질전환 성장 인자 베타 1(TGFB-1), 형질전환 성장 인자 베타 3(TGFB-3), 상피 성장 인자-유사 단백질 8, 성장/분화 인자 6, 과립소, 갈랙틴 3 결합 단백질, 니도겐 1, 니도겐 2, 데코린, 프로라르긴, 혈관 내피 성장 인자 D (VEGF-D), 폰 빌레브란트 인자 A1, 폰 빌레브란트 인자 A5 A, 기질 금속단백질분해효소 14, 기질 금속단백질분해효소 23, 혈소판 인자 4, 프로트롬빈, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 구성원 11, 및 아교세포 유래 넥신 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

임의로, 공학처리된 CF-ECM은 세포제거되므로, 무손상 심장 섬유모세포 세포가 본질적으로 결여되어 있다. 일부 구체예에서, CF-ECM은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 심장 질환 또는 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포로 시딩될 수 있다. 바이오스캐폴드를 시딩하는데 이용될 수 있었던 치료용 세포 유형의 예는 비제한적으로 골격 근모세포, 배아 줄기 세포(ES), 유도된 만능성 줄기 세포(iPS), 다능성 성체 생식계 줄기 세포(maGCS), 골수 중간엽 줄기 세포 (BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포(VSEL 세포), 내피 전구 세포(EPC), 심장형성 세포(CPC), 심장공-유래된 세포(CDC), 다능성 Isl1 ⁺ 심혈관 전구 세포(MICP), 심외막-유래된 전구 세포(EPDC), 지방질-유래된 줄기 세포, 인간 중간엽 줄기 세포(iPS 또는 ES 세포로부터 유래됨), 인간 중간엽 스트로마 세포(iPS 또는 ES 세포로부터 유래됨), 또는 이의 조합을 포함한다. 이러한 세포 유형 모두는 당 분야에 잘 알려져 있다.

공학처리된 CF-ECM을 제조하는 방법 및 이의 구조 및 조성에 대한 더 많은 정보는 본원에 참조로서 포함되는, 예컨대, 미국 특허 8,802,144호에 기재되어 있다.

기재된 주사 가능한 조성물은 주사 가능한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 공학처리된 CF-ECM의 하나 이상의 단편을 포함하고, 이 때 단편은 피하 바늘의 입구를 자유롭게 통과할 수 있을 정도로 충분히 작다. 일부 구체예에서, 단편은 공칭 내경이 0.838 mm인 게이지 18 피하 바늘의 입구를 통과하기에 충분히 작다. 다른 구체예에서, 단편은 게이지 19(공칭 내경 .686 mm), 게이지 20(공칭 내경 .603 mm), 게이지 21(공칭 내경 .514 mm), 게이지 22(공칭 내경 .413 mm), 게이지 23(공칭 내경 .337 mm), 게이지 24(공칭 내경 .311 mm), 게이지 25(공칭 내경 .260 mm), 게이지 26(공칭 내경 .260 mm), 및/또는 게이지 27(공칭 내경 .210 mm) 피하 바늘의 입구를 통과하기에 충분히 작다.

비제한적인 예에서, 단편은 공학처리된 CF-ECM을, 예컨대, 면도날, 메스, 또는 가위로 자름에 의해 형성될 수 있다. 임의로, 일단 생성되면, 단편을 현탁시켜 피하 바늘을 통해 1회 이상 통과시킬 수 있다.

또 다른 비제한적인 예에서, 단편은 공학처리된 CF-ECM을 동결건조(냉동-건조 및 분말화)시킴에 의해 형성될 수 있다. 동결건조는 약학적 조성물을 제조하는데 이용되는 널리 공지된 기술이다. 일부 경우에, 동결건조는 단편 사이즈를 조절하는데 이용된다.

본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 적합한 희석제, 보존제, 용해제, 에멀젼화제, 또는 애쥬번트, 총괄적으로 "약학적으로 허용되는 담체"와 함께 치료적 유효량의 CF-ECM 단편을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"은 심각한 독성, 심각한 자극, 또는 심각한 알레르기 반응과 같은 과도한 부작용 없이 요망되는 치료 반응을 생성하기에 충분한 활성 치료제의 양을 나타낸다. 특정 "유효량"은, 명백하게, 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태, 치료되는 동물의 유형, 치료 기간, 병용 치료의 특성(존재하는 경우), 및 사용된 특정 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 요소에 따라 달라질 것이다. 최적 유효량은 통상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

추가로, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 비제한적으로 0.01-0.1M 및 바람직하게는 0.05M 포스페이트 완충제 또는 0.9% 염수를 포함한다. 추가로, 그러한 약학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 비제한적으로 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 염수 및 완충된 매질을 포함한다.

비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링거 및 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 링거 덱스트로스에 기반한 것과 같은 전해질 보충제 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 콜레이팅제(collating agent), 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.

주사 가능한 조성물은 심장 질환 또는 손상, 허혈성 사지 손상, 또는 조직으로의 혈액 공급 중단으로 인한 다른 손상을 치료하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 주사 가능한 조성물은 관통-심내막 전달에 적절한 임의의 수단을 이용하여 심실의 심내막 벽에 전달된다. 예를 들어, 전달 카테터를 이용하여 주사 가능한 조성물을 심장 질환 또는 질병의 치료를 위해 전달할 수 있다. 본원에 기재된 주사 가능한 조성물의 치료용 또는 진단용 전달을 달성하기 위해 다른 전달 장치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 조성물은 Myostar(Biosense Webster), Helix(Biocardia), Bullfrog(Mercator MedSystems) 또는 C-Cath(Cardio3Biosciences)와 같은 심장 바늘 팁 주입 카테터를 이용하여 전달될 수 있다. 유리하게는, 본원에 기재된 주입 방법에 의한 주사 가능한 조성물의 전달은 최소로 침습적이며 전신 마취, 체외 순환(예를 들어, 인공 심폐기를 통한 순환), 순환 보조기, 또는 개흉 없이 달성될 수 있다. 따라서, 환자에 대한 합병증 가능성 및 위험이 실질적으로 낮다.

일부 경우에, 주사 가능한 조성물은 심외막 전달을 위해, 임의의 적절한 수단을 이용하여, 외부 심장 벽(심외막)에 전달된다. 예를 들어, 본원에 기재된 주사 가능한 조성물의 심외막 전달은 바늘 및/또는 주사기를 포함하는 전달 장치를 이용하여 달성될 수 있다.

본 출원은 심장 질환 또는 손상, 허혈성 사지 손상, 또는 조직으로의 혈액 공급 중단으로 인한 다른 손상을 치료하는 것을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌, 세포-비함유 공학처리된 CF-ECM에 대한 치료적 용도를 추가로 기재한다.

본 출원은 허혈성 사지 손상 및 치유가 어려운 관련 허혈성 궤양을 치료하기 위한, 치료용 세포가 시딩되거나 시딩되지 않은 공학처리된 CF-ECM에 대한 치료적 용도를 추가로 기재한다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본원에 제시되고 기술된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 하기 실시예로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구범위의 범주 내에 속할 것이다.

실시예

실시예 1: 공학처리된 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질의 주사 가능한 제형

본 실시예에서, 본 발명자들은 공학처리된 CF-ECM의 주사 가능한 제형을 제조하기 위해 심장 섬유모세포로부터 공학처리된 ECM, 세포제거되고 공학처리된 ECM, 및 단편화된 공학처리된 ECM을 생성하였다. 생성된 제형은 카테터 주입을 통해 돼지 심장에 성공적으로 전달되었다. 따라서, 본 실시예는 최소로 침습적인 비수술 방법을 이용하여 심장에 전달될 수 있는 공학처리된 CF-ECM의 대안적인 조성물을 설명한다. 또한, 단편화된 제형은 전달된 공학처리된 CF-ECM의 표면적을 크게 증가시켜, 이전에 기재된 심장 질환 또는 손상 적용 및 본 출원에서 처음 기재된 허혈성 상처 적용 둘 모두에 대해 개선된 이익을 발생시킨다.

방법 및 결과

공학처리된 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질(CF-ECM). 공학처리된 섬유모세포 유래된 세포외 기질은 종래 기재된 방법을 이용하여 제조되었다(미국 특허 8,802,144호 및 문헌[Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131]을 참조하라, 둘 모두는 본원에 참조로서 포함됨). 간단히 말해, 수컷 Lewis 래트(260-400g)를 CO₂ 질식으로 희생시키고, 심장을 빠르게 절제하고, 심방을 제거하고, 심실을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 빙냉 PBS에 두었다. 심장을 잘게 분쇄하여 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 73 U/mL 콜라게나제 2, 2 μg/mL 판크레아틴(4x)에서 분해시키고, 65분 동안 교반하면서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해된 조직을 70 μm 셀 스트레이너에서 체질하고 4℃에서 20분 동안 1000xg에서 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 재현탁하고 2개의 T75 배양 플라스크로 플레이팅하였다. 세포를 표준 배양 조건(37℃, 5% CO₂, 100% 습도) 하에서 2시간 동안 부착시킨 다음, 비-부착 세포를 PBS로 세척하여 제거하고, 배양 배지(DMEM, 10% 우태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 교체하여 컨플루언트(confluent)될 때까지 배양하였다.

1 cm² 당 약 1.1x10⁵ 내지 2.2x10⁵의 밀도로 플레이팅된 심장 섬유모세포(계대 2-3회)를 고 글루코스 DMEM + 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 배양시킴에 의해 CF-ECM 스캐폴드 형성을 유도하였고 이를 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 7 내지 15일 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 섬유모세포를 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 세정함에 의해 섬유모세포를 배양 디쉬로부터 시트로서 제거하였다. 그 후 세포 시트가 플레이트 표면에서 들릴 때까지(약 5분) 이들을 37℃에서 PBS 용액에서 2 mM EDTA와 함께 인큐베이션시켰다.

최적화된 공학처리된 CF-ECM 세포제거 프로토콜. 그 후 생성된 심장 섬유모세포 세포 시트에서 세포를 벗겨냈다. 시트는 실온(RT)에서 로테이터 상에서 두 번의 교대적인 저장성/고장성 트리스 완충된 염수(TBS)(저, 고, 저, 고)의 15분 세척을 받았다. 고장성 TBS는 500mM NaCl/50mM 트리스를 포함하였고, 7.6-8.0의 염기성 pH를 지녔다. 저장성 TBS는 이것이 오로지 10mM 트리스만을 포함한 것을 제외하고(7.6-8.0의 염기성 pH), 유사하게 제조되었다.

다음에, 시트를 로테이터 상에서 실온으로 등장성 TBS 중 1% 트리-n-부틸 포스페이트(TnBP)를 이용하여 72 hr 동안 세척하였다. 등장성 트리스는 150mM NaCl/50 mM 트리스를 포함하였다(염기성 pH 7.6-8.0). 이어서, 시트를 PBS에서 2분 동안 세정한 다음, 로테이터 상에서 37℃에서 저장성 TBS 중 90U/mL DNase(Qiagen)에서 3시간 동안 세척하였다. 그 다음에 저장성 TBS에서 2x2분 세정한 후, 패치를 다른 디쉬로 이동시켰다. 그 후 에탄올에서 2x2분 세척하고, 로테이터 상에서 실온으로 Molecular Grade H₂O에서 2 hr 세척하였다. 생성된 세포제거된 공학처리된 CF-ECM을 사용 준비가 될 때까지 4℃에서 PBS에 저장하였다.

주사 가능한 CF-ECM 단편화 프로토콜. 상기 기술된 대로 제조된 CF-ECM을 작은(약 2 mm x 2 mm) 단편이 생성될 때까지 면도날, 메스 또는 가위로 잘랐다. 작은 CF-ECM 단편을 1-5 mL 등장성 완충제(염수, PBS, TBS, Plasmalyte A)에 현탁시키고, 적절한 크기의 튜브로 옮겼다. 그 후 CF-ECM 단편을 함유하는 이 현탁액을 3-5 ml 주사기에 부착된 18 게이지 바늘을 통해 15-20회 통과시켰다. 이어서 생성된 CF-ECM 현탁액을 3-5 ml 주사기에 부착된 21 게이지 바늘을 통해 15-20회 통과시켰다. 생성된 CF-ECM 현탁액을 3-5 ml 주사기에 부착된 24 게이지 바늘을 통해 15-20회 통과시켰다. 생성된 CF-ECM 현탁액을 3-5 ml 주사기에 부착된 27 게이지 바늘을 통해 15-20회 통과시켰다. 그 후 생성된 CF-ECM 현탁액을 5000-10,000 x g에서 10-15분 동안 원심분리시켰다.

최종 주사 가능한 조성물을 형성하기 위해, 단편화된 CF-ECM을 등장성 주사 가능한 용액(생리식염수, Plasmalyte A)에 주입에 적절한 부피(0.5-5 mL)로 현탁시켰다. 단편화된 CF-ECM은 작고 이질적인 시트-유사 단편이다(도 1-4를 참조하라).

주사 가능한 단편화된 CF-ECM 조성물의 시험.

단편화된 CF-ECM의 주사 가능한 조성물을 심장 주입 카테터(27 게이지 바늘 팁 카테터)에서 시험하였다. 시험으로부터 CF-ECM 단편이 1시간의 체류 시간(카테터에 머무르는 시간)에도 불구하고 막히지 않고 카테터를 통과할 수 있음이 확인된다. 추가 시험 결과, CF-ECM 단편은 세포에 쉽게 결합하고, 여전히 시딩된 물질로서 기능할 수 있는 것으로 나타났다. 한 시험에서, 세포는 무손상 CF-ECM 스캐폴드에 결합된 다음 주입을 위해 단편화되었다. 또 다른 시험에서, CF-ECM 스캐폴드가 단편화된 다음 세포가 단편 혼합물에 결합되었다.

CF-ECM 단편을 함유하는 주사 가능한 조성물은 주입 카테터를 통해 돼지 심실에 주입되었다. 추가 시험을 통해 CF-ECM 단편은 돼지 심장에 성공적으로 전달된 것으로 나타났다. CF-ECM의 주사 가능한 조성물은 주입 전에 CF-ECM을 검정색으로 염색함에 의해 심실에서 검출되었다. 주사 가능한 CF-ECM은 좌심실의 사이질 공간에서 주로 관찰되었다(도 5를 참조하라).

결론

본 실시예는 단편화된 공학처리된 CF-ECM을 함유하는 본 발명자들의 주사 가능한 제형이 Helix 또는 Myostar와 같은 주입 심장 카테터를 통해 최소 침습적으로 심장에 투여될 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 종래에 개시된 CF-ECM "패치"는 침습적 수술 절차를 수행하여 표적 조직에 이식되어야 한다. 또한, CF-ECM을 단편화함으로써, 사용된 CF-ECM의 총 표면적이 40배 이상 증가하여, 잠재적으로 치료 효능을 증가시킨다.

다음 실시예에 제시된 대로, 무손상 CF-ECM 스캐폴드는, 심지어 치료용 세포의 부재시에도, 손상된 심장 조직 또는 허혈성 사지 손상을 치료할 때 치료제로서 이용될 수 있다. 따라서, 주사 가능한 CF-ECM 단편 제형은 단독 요법(stand-alone therapy)으로 이용될 수 있거나, 이식을 위한 치료용 세포로 시딩될 수 있다. 치료용 세포 전달 플랫폼으로 사용시, CF-ECM 단편은 임의의 부착 세포 유형과 쌍을 이룰 수 있다. 부착 세포는 CF-ECM에 신속히 부착되고, 바늘과 주사기 또는 바늘 팁 카테터를 통해 질병이 있는 심근(또는 임의의 기관/조직)에 전달되어, 표적화된 조직의 세포 체류를 증가시킬 수 있다.

실시예 2: 공학처리된 CF-ECM "패치"는 심지어 치료용 세포의 부재시에도 래트 심근 경색증 모델에서 치료 효과를 나타낸다

공학처리된 CF-ECM은 치료용 세포를 손상되거나 병적인 심장 조직에 전달하기 위한 플랫폼으로서 종래에 기재되었다(미국 특허 8,802,144호 및 문헌[Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131]을 참조하라, 둘 모두는 본원에 참조로서 포함됨). 본 실시예에서, 본 발명자들은 공학처리된 CF-ECM "패치"가 심지어 치료용 세포의 부재시에도 심근 경색증(MI)의 래트 모델에서 입증된 바와 같은 치료 효과를 지닌다는 놀라운 발견을 보고한다.

방법 및 결과

공학처리된 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질(CF-ECM). 공학처리된 섬유모세포 유래된 세포외 기질은 종래 기재된 방법을 이용하여 제조되었다(미국 특허 8,802,144호 및 문헌[Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131]을 참조하라, 둘 모두는 본원에 참조로서 포함됨). 간단히 말해, 수컷 Lewis 래트(260-400g)를 CO₂ 질식으로 희생시키고, 심장을 빠르게 절제하고, 심방을 제거하고, 심실을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 빙냉 PBS에 두었다. 심장을 잘게 분쇄하여 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 73 U/mL 콜라게나제 2, 2 μg/mL 판크레아틴(4x)에서 분해시키고, 65분 동안 교반하면서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해된 조직을 70 μm 셀 스트레이너에서 체질하고 4℃에서 20분 동안 1000xg에서 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 재현탁하고 2개의 T75 배양 플라스크로 플레이팅하였다. 세포를 표준 배양 조건(37℃, 5% CO₂, 100% 습도) 하에서 2시간 동안 부착시킨 다음, 비-부착 세포를 PBS로 세척하여 제거하고, 배양 배지(DMEM, 10% 우태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 교체하여 컨플루언트될 때까지 배양하였다.

래트 LAD 영구 라이게이션 모델. 12주령 수컷 Lewis 래트에서 좌전 하행 동맥 라이게이션에 의해 심근 경색증이 유도되었다(LAD 영구 라이게이션 모델; 문헌[Kumar D. et al., Coron Artery Dis. 2005 Feb;16(1):41-44]을 참조하라). LAD를 라이게이션하고 흉부를 닫아, 심근 경색증(MI)을 모델링하였다. MI 후 48시간 뒤에, 흉부를 열고, 4가지 상이한 치료법 중 하나를 수행하였다: (1) 세포가 없는 CF-ECM 패치를 경색 부위에 배치하였다(패치 단독); (2) 2시간 동안 래트 중간엽 줄기 세포(MSC)로 시딩된 CF-ECM 패치를 경색 부위에 배치하였다(시딩된 패치); (3) 래트 중간엽 줄기 세포(MSC)를 CF-ECM 패치 없이 경색 부위에 배치하였다(세포 단독); 및 (4) 세포 또는 CF-ECM 패치를 경색 부위에 배치하지 않았다(위약).

심장초음파상. MI 후 0, 7, 14, 21, 및 28일에 각 래트에 대해 연속 심장초음파상을 수행하였다. MI는 유해한 진행성 좌심실 확장을 초래한다. 박출률(도 6) 및 수축기말 용적(도 7 및 8)의 변화에 의해 측정된 대로, 시딩된 패치 및 패치 둘 모두는 위약 절차에 비해 측정 가능한 치료 효과를 생성하였다.

단면 병리학. 래트를 희생시키고, 경색 심장에 대한 단면 병리학을 수행하였다. 구체적으로, 흉터 두께, 힌지 포인트 두께, 먼 벽 두께, 및 % 좌심실 조직 경색을 측정하였다. 시딩된 패치 및 패치 단독에 의한 치료는 둘 모두 위약 치료에 비해 증가된 힌지 포인트 두께, 흉터 두께, 및 먼 벽 두께를 발생시켰다(도 9).

결론

더불어, 이러한 결과는 놀랍게도 세포 비함유 CF-ECM 패치가 시딩된 세포의 부재 하에서 심장 질환 또는 손상의 치료를 위한 치료제로서 이용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 3: 공학처리된 CF-ECM "패치"는 시딩된 세포의 존재 또는 부재의 두 경우 모두에 마우스 사지 허혈 모델에서 치료 효과를 나타낸다

공학처리된 CF-ECM은 치료용 세포를 손상되거나 질병이 있는 심장 조직에 전달하기 위한 플랫폼으로서 종래에 기재되었다(미국 특허 8,802,144호 및 문헌[Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131]을 참조하라, 둘 모두는 본원에 참조로서 포함됨). 본 실시예에서, 본 발명자들은 공학처리된 CF-ECM "패치"가, 치료용 세포가 패치에 시딩되거나 시딩되지 않은 두 경우 모두에, 허혈성 사지 손상의 모델에서 치료 효과를 지님을 보고한다.

방법

섬유모세포 유래된 세포외 기질. 공학처리된 심장 섬유모세포 유래된 세포외 기질(CF-ECM)은 종래 기재된 방법을 이용하여 제조되었다(미국 특허 8,802,144호 및 문헌[Schmuck, E.G., et al., Cardiovasc Eng Technol 5(1) (2014): 119-131]을 참조하라, 둘 모두는 본원에 참조로서 포함됨). 간단히 말해, 수컷 Lewis 래트(260-400g)를 CO₂ 질식으로 희생시키고, 심장을 빠르게 절제하고, 심방을 제거하고, 심실을 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 빙냉 PBS에 두었다. 심장을 잘게 분쇄하여 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 73 U/mL 콜라게나제 2, 2 μg/mL 판크레아틴(4x)에서 분해시키고, 65분 동안 교반하면서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해된 조직을 70 μm 셀 스트레이너에서 체질하고 4℃에서 20분 동안 1000xg에서 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 재현탁하고 2개의 T75 배양 플라스크로 플레이팅하였다. 세포를 표준 배양 조건(37℃, 5% CO₂, 100% 습도) 하에서 2시간 동안 부착시킨 다음, 비-부착 세포를 PBS로 세척하여 제거하고, 배양 배지(DMEM, 10% 우태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 교체하여 컨플루언트될 때까지 배양하였다.

1 cm² 당 약 1.1x10⁵ 내지 2.2x10⁵의 밀도로 플레이팅된 심장 섬유모세포(계대 2-3회)를 고 글루코스 DMEM + 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 배양시킴에 의해 CF-ECM 스캐폴드 형성을 유도하였고 이를 37℃, 5% CO₂ 및 100% 습도에서 10 내지 14일 동안 배양하였다. 2 mM EDTA 용액과 37℃에서 인큐베이션시킴에 의해 섬유모세포를 배양 디쉬로부터 시트로서 제거하였다. 그 후 분자 등급의 물과 인큐베이션시킴에 의해 생성된 섬유모세포 세포 시트에서 세포를 벗겨낸 다음 일정하게 교반하면서 0.15% 과산화아세트산과 함께 4℃에서 24-48시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 생성된 기질을 멸균수에 이어 PBS로 반복하여 세정하였다.

생성된 CF-ECM 스캐폴드는 취급이 용이하고 봉합이나 접착제를 요구하지 않으며 자연적으로 조직에 부착되는 약 16mm 직경, 200 μm 두께의 반투명 스캐폴드이다.

GFP+ 배아 줄기 세포 유래된 중간엽 줄기 세포. 인간 ESC 주 H9 Cre-LoxP(항시적 EGFP 발현)를 22회 계대에서 WiCell(Madison, WI)로부터 입수하였다. 세포를 분화된 영역을 제거하지 않고 3-4회 계대 동안 Matrigel®(BD Biosciences) 코팅된 플라스크 상에서 mTeSR™1 배지(StemCell Technologies)에서 배양하였다. 분화된 세포를 분리하고, 모든 세포가 섬유모세포-유사 형태를 가질 때까지 조직 배양 플라스틱 상에서 MSC 성장 배지(10% MSC 특성화된 FBS, MEM 비필수 아미노산, 알파-MEM)에서 배양하였다. 세포는 다음 유동세포계수법 프로파일을 나타내었다: CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD73+, CD90+ 및 CD105+. 이식 또는 주입을 위해 500 μl의 PBS에 현탁시키기 전에 7.5 x 10⁵ GFP⁺ MSC를 이용하여 섬유모세포 세포외 기질 스캐폴드에 2시간 동안 시딩하였다.

MSC 표현형을 확인하기 위해 이들 세포에 대해 시험관내 시험을 수행하였다. 지방형성 및 골형성 분화를 위해, MSC를 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 컨플루언시(confluency)로 성장시켰다. 지방형성 및 골형성 분화 배지(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 첨가하고 총 21일 동안 3-4일마다 교체하였다. 지방세포 지질 점적은 오일 레드 O 염색(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 의해 검출되었다. 골모세포 석회화는 알리자린 레드 S 염색(Sigma-Aldrich)에 의해 검출되었다. 연골형성 분화를 위해, 2.5x10⁵개 세포를 딥웰 96-웰 플레이트에 놓고 펠릿을 만들기 위해 원심분리하였다. 배지는 총 24일 동안 3-4일마다 교체되었다. 연골세포는 글루코사미노글리칸을 염색하는, 알시안 블루로 염색된 연골세포 펠릿의 파라핀-임베디드 섹션을 이용하여 검출되었다.

마우스 뒷다리 허혈 모델 및 치료적 전달. 모든 절차는 UW-Madison 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 정책 및 지침에 따라 수행되었다. 뒷다리 허혈 모델은 종래에 기재된 대로 생성되었다(Westvik TS, Fitzgerald TN, Muto A, Maloney SP, Pimiento JM, Fancher TT, et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of vascular surgery. 2009;49:464-473). 간단히 말해, 체중이 18.1+/-1.4 g인 면역-적격 암컷 Balb/C 마우스를 2-5% 흡입된 이소플루오란으로 마취시켰다. 검상돌기(xyphoid)의 수준으로부터 미측(caudal)으로 무릎까지 동물의 털을 벗긴 다음, 바로누운 자세로 가열된 물 블랭킷 위에 두고 흡입된 1-3% 이소플루오란에 유지시켰다. 일반적인 장골 동맥은 정중선 절개로 접근하였다. 무딘 박리를 이용하여, 좌측 총 장골 동맥을 노출시키고, 정맥 및 주변 조직으로부터 분리한 다음 약 3 mm 간격으로 6-0 실크로 이중 라이게이션시켰다. 라이게이션 후 복벽과 피부를 닫았다. 좌측 대퇴 동맥은 서혜부 절개로 접근하였다. 대퇴 동맥을 상기 기재된 대로 분리하고 서혜부 인대의 원위에서 슬와 동맥의 근위까지 노출시켰다. 마지막으로, 대퇴 동맥을 6-0 실크로 이중 라이게이션하고 라이게이션 사이에서 양분시켰다. 그 후 연구 작용제를 피하 또는 근내 적용하고(하기 참조), 피부를 닫고, 동물을 회복시켰다.

마우스를 4개의 처리 그룹으로 나누었다: 그룹 A: 1.0 x 10⁶ GFP+ MSC가 로딩된 CF-ECM이 모음근 근육에 피하 전달되었다. 그룹 B: 세포가 없는 CF-ECM 단독이 모음근 근육에 피하 전달되었다. 그룹 C: GFP+ MSC 단독이 모음근 근육에 근내 주입에 의해 전달되었다. 그룹 D: 염수로 구성된 대조군이 모음근 근육에 근내 주입에 의해 전달되었다. 근내 주입은 27G 바늘 및 1 mL 주사기를 이용하여 수행되었고, 대퇴 라이게이션 주위에 분포된 약 4개 부위에서 외향근에 주입되었다. CF-ECM을 세포-면 아래에 배향시키고 대퇴부 라이게이션을 덮기 위해 고르게 폈다.

종말점. 4 그룹 모두의 동물은 처리 후 35일까지 생존하였고 그 후 희생되었다. 조직 괴사 및 뒷다리 관류는 디지털 사진, 세로방향 레이저 도플러 검정, 및 반정량적 조직병리학을 사용하여 측정되었다. 또한, 종래에 정의된 대로(문헌[Westvik TS, Fitzgerald TN, Muto A, Maloney SP, Pimiento JM, Fancher TT, et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of vascular surgery. 2009;49:464-473]을 참조하라) 변형된 허혈(MII) 지수 점수를 계산하였다.

스캐닝 레이저 도플러 관류. 레이저 도플러 스캐닝은 Moor Instruments Ltd, Millwey Axminster, Devon, England에 의한 moorLDI Laser Doppler Imager를 이용하여 수술 후 2, 7, 14, 21, 28, 35일에 수행되었다. 간단히 말해, 마우스를 2-5% 흡입된 이소플루오란으로 마취시키고, 스캔 기간 동안 1.5% 이소플루란에 유지시켰다. 마우스를 도플러 스캐너 필드(6.0 cm x 3.2 cm) 내에 함유된 하지의 배쪽면을 갖도록 바로누운 자세로 고정시켰다. 마우스를 10 ms/픽셀의 해상도로 스캔하였다. 실온은 24.4±1℃였다. 시점 당 동물에 대해 3회 스캔을 완료하였고 최종 측정을 위해 평균을 구하였다. 분석은 moorLDI 이미지 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 분석은 2 mm의 관심 원형 영역을 사용하여 첫 번째 발가락에서 정확히 원위에 있는 발의 배쪽면의 중심에서 수행되었다.

조직병리학. 척주로부터 골반의 관절이단술에 의해 뒷다리를 분리하였다. 꼬리 사지의 피부를 내측면의 아래로 절개하여 적절한 고정을 허용하였다. Surgipath Decalcifier I(Leica)에서 24시간 동안 조직의 석회질을 제거한 다음 10% 포르말린에 고정시켰다. 종아리 및 대퇴에서 조직을 단면으로 절단하고, 파라핀에 임베딩하고, 10 μm 섹션을 절단하고, 헤모톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 핵 집중화, 지방 침윤, 골수 괴사, 섬유증 및 근섬유 이질성을 평가하기 위해 수의학 병리학자에 의해 정량적인 채점 시스템을 개발하였다.

결과

CF-ECM 상에서 전달된 GFP+ ESC 유래된 MSC는 중증 사지 허혈의 마우스 모델에서 관류를 현저히 개선시킨다. 중증 뒷다리 허혈은 26 Balb/C 마우스에서 장골(illeo)-대퇴 라이게이션에 의해 성공적으로 유도되었다. 모델 생성시 마우스를 4개 그룹 중 하나로 무작위화하였다; 플라시보 주입, hMSC 주입, CF-ECM 스캐폴드 단독 및 hMSC 시딩된 CF-ECM 스캐폴드. 모든 마우스는 수술 및 치료에서 생존하였고, 세포 단독 주입 그룹의 2마리 마우스는 불충분한 세포 생존력으로 인해 분석에서 제외되었다.

중증 허혈은 수술 2일 후에 레이저 도플러 스캐닝에 의해 확인되었다(도 10A). 35일의 실험 과정 동안 플라시보 주입 및 hMSC 주입에 비해 CF-ECM 단독 및 hMSC 시딩된 CF-ECM에서 관류에 상당한 치료 시간 상호작용(p=0.03)이 있었다(도 10A-10B). hMSC 시딩된 CF-ECM으로 처리된 동물은 가장 낮은 자가절단율을 보였다(도 10C). 변형된 허혈 지수 점수는 플라시보 주입 및 hMSC 주입에 비해 CF-ECM 단독 및 hMSC 시딩된 CF-ECM 그룹에서 가장 컸다(도 10D).

정량적인 조직학 분석. 허혈성 종아리(IC) 및 대퇴(IT)의 정량적인 조직학 채점을 인증된 수의학 병리학자(DS)에 의해 수행하였다(표 1). 중증 허혈의 지표인 골수 괴사는 모든 그룹에서 심한 것으로 나타났다. 재생 마커인 근섬유 이질성은 플라시보 주입(IC = 2. +/-0.3, IT =2.1 +/-0.2) 및 hMSC 주입(IC = 3.0 +/-0.4, IT =2.6 +/-0.2) 그룹 단독에 비해 CF-ECM(IC = 3.7 +/-0.3; IT =3.0 +/-0.2) 및 hMSC 시딩된 CF-ECM(IC = 3.8 +/-0.3, IT =3.2 +/-0.2) 그룹에서 현저하게 증가하였다(p=0.04). 핵 집중화(IC p=0.35, IT p=0.59) 지방 침윤(IC p=0.37, IT p=0.63), 골수 괴사(IC p=0.32, IT p=0.64) 및 섬유증(IC p=0.62, IT p=0.64)에서 전체적인 차이는 없었다. IC(p=0.60) 또는 IT(p=0.97)에서 고-강도 필드(high-powered field)에 대한 근세포(도 11)는 치료에 의한 영향을 받지 않았지만 근세포 면적은 IC(p=0.0001) 및 IT (0.0004)의 모든 치료에서 현저하게 감소하였다.

표 1은 영향을 받은 조직의 정량적인 조직학 채점을 보여준다. 대퇴(p=0.0035) 및 종아리(p=0.05) 둘 모두에서 세포 처리된 대조군 및 위약 대조군에 비해 CF-ECM 처리된 동물에서 근세포 이질성의 유의한 증가에 주목하라. 근세포 이질성은 근육 재생의 마커이다.

결론

본 실시예는 공학처리된 CF-ECM "패치"가 사지 허혈을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 패치는 세포-비함유 요법으로서 사용되거나, 잠재적으로 치료용 세포로 시딩될 수 있다.

표 1: 영향을 받은 조직의 정량적인 조직학 채점

실시예 4: 공학처리된 CF-ECM 시트는 시딩된 세포의 부재시에도 치료 효과를 나타낸다

래트 심근 경색증 모델을 이용하여 세포가 시딩되고 시딩되지 않은 CF-ECM 효능을 검정하였다. 래트 MSC(rMSC)가 CF-ECM으로 옮겨졌을 때, MI 후 델타 박출률이 보존되었고(도 12), 수축기말 용적이 증가하였으며(도 13), MI 후 리모델링이 감소하였다(도 14 및 15). CF-ECM + MSC의 조합은 수축기말 용적, 박출률, 힌지 포인트 두께, 및 흉터 두께를 개선시켰다. 시딩된 세포의 부재시에도, CF-ECM 단독은 박출률, 힌지 포인트 두께, 및 흉터 두께를 개선시켰다.

도 16 및 17에 도시된 대로, CF-ECM 단독의 투여는 위약 치료에 비해 수축기말 용적(ESV)을 감소시키고 박출률을 증가시키는데 효과적이었다.

아울러, 이러한 검정은 CF-ECM 단독의 투여가 박출률, 수축기말 용적, 수축기말 압력, 확장기말 용적, 및 수축기말 압력 용적 상관관계(ESPVR)를 개선시키는데 충분하였음을 입증하였다. 따라서, CF-ECM 단독의 투여는 유리하였다.

실시예 5: 중간엽 줄기 세포(MSC) 주입 및 체류 검정

주사 가능한 CF-ECM은 임상 용도로 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, CF-ECM의 주입은 최소로 침습적이며, 개심술을 필요로 하지 않으며 심장 재생 요법을 위해 전달될 수 있다. 이것은 심장 세포 요법이 유리할 많은 사람들이 개심술을 받기에 지나치게 아프기 때문에 중요하다. 최소로 침습적인 주사 가능한 CF-ECM의 주입은 심장 세포 요법을 받을 수 있는 환자 풀을 증가시킬 것이다. 이식된 세포의 유리한 배치를 위해 세포 이동을 요구하지 않는 심장 벽으로의 직접 전달을 포함하여, 주사 가능한 CF-ECM은 더 많은 심장 부위에 제공될 수 있다.

CF-ECM에 GFP+ MSC를 1시간 및 18시간 동안 시딩하였다. 도 18 및 19에 각각 도시된 대로, MSC는 CF-ECM 물질의 응집체로 이동하였다.

세포 체류 검정을 건강한 래트(심근 경색증 없음; n = 5마리)를 이용하여 수행하였다. 심장에 (1) QTRACKER™ 525 프로브로 표지된 1 x 10⁶ rMSC; (2) QTRACKER™ 655 프로브로 표지되고 주사 가능한 CF-ECM에 시딩된 1 x 10⁶ rMSC를 주입하였다. 데이터를 다음 시점에 수집하였다: 4시간, 24시간, 48시간, 6일, 및 7일. 세포 체류를 3D cryo-영상을 사용하여 평가하였다.

도 20에 도시된 대로, 주사 가능한 CF-ECM은 주입 네(4) 시간 후에 세포 체류를 증가시켰다. 도 21에 도시된 대로, 주사 가능한 CF-ECM은 주입 24시간 및 48시간 후에 세포 체류를 증가시켰다. 4시간 시점에 관찰된 CF-ECM에 결합된 rMSC와 유사한 분포가 주어지는 경우, QTRACKER ™ 655 프로브가 손실되었고 과잉 GFP 신호가 "네이키드(naked)" rMSC로 잘못 해석될 가능성이 있다.

이러한 데이터는 CF-ECM의 주사 가능한 제형이 바늘 팁 심장 카테터를 이용하여 전달될 수 있고, CF-ECM이 MSC의 "네이키드" 주입(즉, 주사 가능한 CF-ECM이 없이 주입됨)에 비해 4시간 시점에 심장 벽에서 세포 체류를 급격하게 증가시켰음을 나타낸다. eGFP를 발현시키는 세포주의 활용은 4시간 시점 후에 데이터 해석을 어렵게 만들었다. 예를 들어, QTRACKER™ 655 프로브 리포터 발현은 24시간 후에 검출되기 어려웠다.

요약하면, CF-ECM은 시트 또는 주사 가능한 제형으로 제조될 수 있다. 두 제형 모두는 세포의 표적화된 전달을 허용한다. 치료용 세포 체류는 시트 및 주사 가능한 제형 둘 모두를 이용하여 크게 개선되었다. 또한, 본 발명자들은 CF-ECM이 스스로 고유한 생체활성을 지님을 입증하였다.

본 출원에 열거된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다. 개시된 주제의 특정 구체예 및 실시예가 본원에서 논의되었지만, 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 본 명세서 및 하기 청구범위 검토시 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다.

Claims

(a) 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하는 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질의 하나 이상의 단편으로서, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%가 피브로넥틴이고, 하나 이상의 단편이 18 게이지 피하 바늘의 주입구를 통과할 정도로 충분히 작은, 단편; 및
(b) 주사 가능한 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상을 치료하기 위한 주사 가능한 조성물.
제 1항에 있어서, 공학처리된 심장 세포외 기질의 구조 단백질이 화학적으로 가교되지 않는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 단편이 20-500 μm의 두께를 갖는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 단편이 동결건조된 분말의 형태인 조성물.
제 1항에 있어서, 공학처리된 심장 세포외 기질이 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 및 비글리칸 중 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물에 무손상 심장 섬유모세포 세포가 본질적으로 결여된 조성물.
제 6항에 있어서, 조성물에 세포가 없는 조성물.
제 1항에 있어서, 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포를 추가로 포함하는 조성물.
제 8항에 있어서, 심장 질환, 심장 손상, 또는 허혈성 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포가 골격 근모세포, 배아 줄기(ES) 세포 또는 이의 유도체, 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포 또는 이의 유도체, 다능성 성체 생식계 줄기 세포(maGCS), 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포(VSEL 세포), 내피 전구 세포(EPC), 심장형성 세포(CPC), 심장공-유래된 세포(CDC), 다능성 Isl1+ 심혈관 전구 세포(MICP), 심외막-유래된 전구 세포(EPDC), 지방질-유래된 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 스트로마 세포, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
제 10항에 있어서, 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 조성물.
제 11항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 스트로마 유래된 인자-1(SDF-1), 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 단편이 27 게이지 피하 바늘의 주입구를 통과할 정도로 충분히 작은 조성물.
대상체에 유효량의 제 1항의 조성물을 주입하여, 심장 질환, 심장 손상, 허혈성 질환 또는 허혈성 손상의 중증도를 감소시키는 것을 포함하는, 심장 질환, 심장 손상, 허혈성 질환 또는 허혈성 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
제 14항에 있어서, 심장 질환, 심장 손상, 허혈성 질환 또는 허혈성 손상이 급성 심근 경색증, 심부전, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 선천 결손, 뇌졸중, 당뇨 족부 궤양, 말초 동맥 질환(PAD), PAD-관련 궤양, 또는 사지 허혈에 의해 초래되는 방법.
허혈성 손상을 나타내는 대상체의 조직을 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고 두께가 20-500 μm인 세포 비함유 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질과 접촉시켜, 허혈성 질환 또는 손상의 중증도를 감소시키는 것을 포함하는, 허혈성 질환 또는 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%가 피브로넥틴이고, 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질에 어떤 세포도 시딩되지 않는, 방법.
제 16항에 있어서, 세포 비함유 공학처리된 심장 세포외 기질이 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 및 비글리칸 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제 16항에 있어서, 허혈성 질환 또는 손상을 나타내는 대상체의 조직을 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 18항에 있어서, 하나 이상의 비-세포 치료제가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 방법.
제 19항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 스트로마 유래된 인자-1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 16항에 있어서, 허혈성 질환 또는 손상이 심근 경색증, 뇌졸중, 당뇨 족부 궤양, 말초 동맥 질환(PAD), PAD-관련 궤양, 또는 사지 허혈에 의해 초래되는 방법.
제 21항에 있어서, 사지 허혈이 죽상경화증 또는 당뇨병의 결과인 방법.
허혈성 사지 손상을 나타내는 대상체의 조직을 구조 단백질 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 및 엘라스틴을 포함하고 두께가 20-500 μm인 공학처리된 심장 섬유모세포 세포-유래된 세포외 기질과 접촉시켜, 허혈성 사지 손상의 중증도를 감소시키는 것을 포함하는, 허혈성 사지 손상을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 이 때 공학처리된 세포외 기질에 존재하는 구조 단백질의 60% 내지 90%가 피브로넥틴인, 방법.
제 23항에 있어서, 공학처리된 심장 세포외 기질이 모세포 단백질 내재성 형질전환 성장 인자 베타 1(LTGFB-1), 내재성 형질전환 성장 인자 베타 2(LTGFB-2), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 산성이며 시스테인이 풍부한 분비 단백질(SPARC), 베르시칸 핵심 단백질(VCAN), 갈랙틴 1, 갈랙틴 3, 기질 gla 단백질(MGP), 설페이트화 당단백질 1, 및 비글리칸 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
제 23항에 있어서, 공학처리된 심장 세포외 기질이 허혈성 사지 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포로 시딩되는 방법.
제 25항에 있어서, 허혈성 사지 손상에 대한 치료제인 하나 이상의 세포가 골격 근모세포, 배아 줄기(ES) 세포 또는 이의 유도체, 유도된 만능성 줄기(iPS) 세포 또는 이의 유도체, 다능성 성체 생식계 줄기 세포(maGCS), 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC), 극소 배아-유사 줄기 세포(VSEL 세포), 내피 전구 세포(EPC), 지방질-유래된 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포, iPS 또는 ES 세포로부터 유래된 인간 중간엽 스트로마 세포, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 23항에 있어서, 허혈성 손상을 나타내는 대상체의 조직을 하나 이상의 외인성 비-세포 치료제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 27항에 있어서, 하나 이상의 비-세포 치료제가 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 방법.
제 28항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 스트로마 유래된 인자-1(SDF-1), 상피 성장 인자(EDF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 섬유모세포 성장 인자 1(FGF-1), 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 및 각질세포 성장 인자(KGF)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 23항에 있어서, 허혈성 사지 손상이 죽상경화증의 결과인 방법.