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KR20250006170A - 인간 뇌실막-특이적 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

인간 뇌실막-특이적 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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KR20250006170A
KR20250006170A KR1020247038496A KR20247038496A KR20250006170A KR 20250006170 A KR20250006170 A KR 20250006170A KR 1020247038496 A KR1020247038496 A KR 1020247038496A KR 20247038496 A KR20247038496 A KR 20247038496A KR 20250006170 A KR20250006170 A KR 20250006170A
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KR
South Korea
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sequence
article
aav
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targeting peptide
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Pending
Application number
KR1020247038496A
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English (en)
Inventor
비벌리 데이비드슨
메간 에스. 카이저
용홍 첸
엘리 카렐
브래들리 하이만
로즈마리 조안 잭슨
Original Assignee
더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
더 제너럴 하스피톨 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아, 더 제너럴 하스피톨 코포레이션 filed Critical 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
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Abstract

본원은 대상체의 뇌실막에 분자 치료제를 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이 방법은 대상체에게 아데노-관련 바이러스(AAV)를 투여하는 단계를 포함한다. AAV는 뇌실막-특이적 프로모터의 조절 하에서 치료학적 트랜스유전자를 암호화한다.

Description

인간 뇌실막-특이적 프로모터 및 이의 용도
우선권 주장
본 출원은 2023년 1월 30일, 2022년 10월 31일, 2022년 4월 22일 및 2023년 1월 30일에 각각 출원된 미국 가특허 출원 제63/482/155호, 제63/381,689호 및 제63/333,979호에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 각 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 의학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는 분자 치료제를 환자, 특히 뇌 또는 중추 신경계에 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
아데노-관련 바이러스(modified adeno-associated virus; AAV)는 신경 질환 치료를 위한 강력한 치료학적 후보이다. AAV는 분열 및 비-분열 세포를 모두 감염시킬 수 있는 비-외막, 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 감염 후, 바이러스는 숙주 게놈 내에서 강력한 통합을 나타내지 않지만 세포 핵에서 에피솜으로서 지속된다. AAV 화물(cargo)의 발현은 패키징 캡시드 수준에서 트랜스유전자 프로모터(promoter)에 의해 공간적으로 조절된다. 또, 질병 치료를 위한 AAV의 용도는 병든 조직에 대한 개입이 필요할 수 있으므로, 건강한 조직과 다른 유전자 발현 프로파일을 함유하는 표적 조직에서 문제가 발생할 수 있다.
치료학적 트랜스유전자(therapeutic transgene) 발현을 구동하는 올바른 프로모터 서열을 찾는 것이 중요한 목표이다.
본원은 대상체(subject)의 뇌실막 조직(ependymal tissue)에서 치료학적 트랜스유전자를 발현시키는 방법을 제공하며, 방법은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로모터, 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 프로모터의 조절 하에서 치료학적 트랜스유전자를 암호화(encoding)하는 변형된 아데노-관련 바이러스(AAV)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 프로모터는 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 프로모터는 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 프로모터는 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
변형된 AAV는 변형된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다, 예를 들어 변형된 캡시드 단백질이 표적화 펩티드(targeting peptide)를 포함하는 경우, 여기서 상기 표적화 펩티드는 3개 내지 10개 아미노산 길이(amino acid in length), 예를 들어 7개 아미노산 길이이다. 변형된 AAV 캡시드 단백질은 변형된 AAV1 캡시드 단백질, 변형된 AAV2 캡시드 단백질 또는 변형된 AAV9 캡시드 단백질일 수 있다. 변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV1 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 AAV1 캡시드 단백질의 잔기 590 뒤에 삽입된다.
표적화 펩티드는 링커 서열(linker sequence) 측면에 인접(flanking)할 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은, 예를 들어 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 SSA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인 경우, 2개 또는 3개 아미노산 길이이다.
변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 AAV2 캡시드 단백질의 잔기 587 뒤에 삽입된다. 표적화 펩티드는 링커 서열 측면에 인접할 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은, 예를 들어 링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AA인 경우, 2개 또는 3개 아미노산 길이이다.
변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 상기 AAV9 캡시드 단백질의 잔기 588 뒤에 삽입된다. 표적화 펩티드는 링커 서열 측면에 인접할 수 있으며, 여기서 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은, 예를 들어 링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인 경우, 2개 또는 3개 아미노산 길이이다.
치료학적 트랜스유전자는 siRNA, shRNA, miRNA, 비-암호화(non-coding) RNA, lncRNA, 치료학적 단백질 또는 CRISPR 시스템일 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 ApoE2일 수 있으며, 대상체는 집단 평균(populational average)에 비해 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)을 앓고 있거나 이의 발병 위험이 높다. 투여는 직접적인 뇌실내(intracerebroventricular) 또는 실질내(intraparenchymal) 주사일 수 있다. 변형된 AAV는 1회를 초과하여, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여될 수 있다. 변형된 AAV는 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다 또는 매년 투여될 수 있다. 이 방법은 또한 대상체에게 비-AAV 요법(therapy)을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
이 방법은 다수의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함할 수 있다, 예를 들어 바이러스를 약 1Х106 내지 약 1Х1018 벡터 게놈/킬로그램(vg/㎏)의 용량(dose)으로 투여하거나, 또는 바이러스를 약 1x107-1x1017, 약 1x108-1x1016, 약 1x109-1x1015, 약 1x1010-1x1014, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1011, 약 1x1011-1x1012, 약 1x1012-1x1013, 또는 약 1x1013-1x1014 vg/㎏ 대상체의 용량으로 투여한다. 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류일 수 있다. 인간 대상체는 50세 이상일 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 폴리-아데닐화 신호(poly-adenylation signal)에 연결될 수 있다.
또한, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로모터, 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) 치료학적 트랜스유전자를 암호화하는 변형된 아데노-관련 바이러스(AAV)를 제공한다. 프로모터는 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 프로모터는 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 프로모터는 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
변형된 AAV는 변형된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다, 예를 들어 변형된 캡시드 단백질은 표적화 펩티드를 포함하고, 표적화 펩티드는 3개 내지 10개 아미노산 길이, 예를 들어 7개 아미노산 길이이다. 변형된 AAV 캡시드 단백질은 변형된 AAV1 캡시드 단백질, 변형된 AAV2 캡시드 단백질, 또는 변형된 AAV9 캡시드 단백질일 수 있다.
변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV1 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 AAV1 캡시드 단백질의 잔기 590 뒤에 삽입된다, 예를 들어 표적화 펩티드는 링커 서열 측면에 인접할 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은 2개 또는 3개 아미노산 길이이다. 링커 서열은 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 SSA 및 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS일 수 있다.
변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 상기 AAV2 캡시드 단백질의 잔기 587 뒤에 삽입된다, 예를 들어 표적화 펩티드는 링커 서열 측면에 인접할 수 있으며, 여기서 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은 2개 또는 3개 아미노산 길이이다. 링커 서열은 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA 및 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AA일 수 있다.
변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질에서 유래될 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드는 AAV9 캡시드 단백질의 잔기 588 뒤에 삽입된다, 예를 들어 표적화 펩티드는 링커 서열 측면에 인접할 수 있으며, 여기서 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열은 2개 또는 3개 아미노산 길이이다. 링커 서열은 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA 및 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS일 수 있다.
치료학적 트랜스유전자는 siRNA, shRNA, miRNA, 비-암호화 RNA, lncRNA, 치료학적 단백질 또는 CRISPR 시스템일 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 폴리-아데닐화 신호에 연결될 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 검출 가능한 리포터, 예를 들어 형광 단백질, 펩티드 태그 또는 루시퍼라제를 암호화하는 서열에 전사적으로 연결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 변형된 AAV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 단리 및 정제된 핵산을 제공한다. 서열은 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 서열은 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 서열은 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
서열은 이종 암호화 영역(heterologous coding region)에 작동적으로 연결될 수 있다. 핵산은 (a) 다목적 클로닝 부위(multipurpose cloning site), (b) 전사 종료 신호, (c) 폴리-아데닐화 서열, 및/또는 (d) 복제 기원(origin of replication) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 (a) 검출 가능한 마커(detectable marker)를 암호화하는 서열, (b) 친화성 태그(affinity tag)를 암호화하는 서열, 및/또는 (c) 하나 또는 2개의 아데노-관련 바이러스 역전 말단 반복부(adeno-associated virus inverted terminal repeat) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 복제 가능한 벡터에 함유될 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 2A "자기-절단(self-cleaving)" 펩티드를 암호화하는 서열에 의해 리포터에 전사적으로 연결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 미세아교세포 염증(microglial inflammation)을 감소 또는 손상시키는 방법을 제공하며, 방법은 상기 염증의 감소 또는 손상이 필요한 대상체에서 미세아교세포에 ApoE2를 전달하는 단계를 포함한다. 미세아교세포에 ApoE2를 전달하는 것은 상기 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 변형된 AAV 또는 이를 포함하는 약제학적 제형을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 치료학적 트랜스유전자는 ApoE2이다. 미세아교세포 염증은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease), 예를 들어 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 운동 뉴런 질환(motor neuron disease), 척추소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척추성 근위축증(spinal muscular atrophy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 바텐병(Batten disease), 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)에 의해 발생하거나 이와 관련될 수 있다. 미세아교세포 염증은 알츠하이머병에 의해 발생하거나 이와 관련될 수 있다.
투여는 ApoE2 또는 변형된 AAV의 직접적인 뇌실내 또는 실질내 주사를 통해 이루어질 수 있으며, 1회 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 및/또는 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다 또는 매년의 투여를 수반할 수 있다. 이 방법은 또한 상기 대상체에게 비-AAV ApoE2 요법을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
AAV 요법의 경우, 다수의 바이러스 입자를 투여할 수 있으며, 예를 들어 약 1Х106 내지 약 1Х1018 벡터 게놈/킬로그램(vg/㎏)의 용량, 예를 들어 약 1x107-1x1017, 약 1x108-1x1016, 약 1x109-1x1015, 약 1x1010-1x1014, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1011, 약 1x1011-1x1012, 약 1x1012-1x1013, 또는 약 1x1013-1x1014 vg/㎏ 환자의 용량으로 투여할 수 있다. 대상체는 인간 또는 비-인간 포유류, 또는 50세 이상의 인간일 수 있다. 치료학적 트랜스유전자는 폴리-아데닐화 신호에 연결될 수 있다.
본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명에서 분명해질 것이다. 그러나 상세한 설명 및 구체적인 예는 개시내용의 바람직한 구현예를 나타내지만 단지 예시로서 제공되며, 따라서 개시내용의 진의 및 범위 내의 다양한 변화 및 수정은 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
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하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 개시내용의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 본원에 제공된 특정 구현예에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. 뇌실막-특이적 프로모터 식별. 뇌실의 뇌실막 내벽이 얇기 때문에 발명자들은 조직-특이적 유전자를 식별하기 위해 감산적 접근 방식을 사용하였다. 샘플을 뇌실-인접 백질과 회백질, 및 뇌실막와 함께 백질과 회백질을 포함하는 뇌실 가장자리의 영역으로부터 수득하였다. 백질 + 뇌실막 및 회백질 + 뇌실막 샘플에 고유한 유전자는 풍부한(enriched) 것으로서 분류되었다. 여러 관련 질병 상태에서 활성 프로모터 사용을 보장하기 위해, 샘플을 건강한 대조군뿐만 아니라, 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병(HD), 전두측두형 치매(Frontotemporal Dementia), 루이소체 치매(Lewy body dementia), 경계성 치매(sematic dementia), 및 치매 환자로부터 얻었다.
도 2. 뇌실막에서의 발현 검증. 상위 유전자 적중을 Allen Brain Institute의 공개된 제자리 하이브리드화(in situ hybridization) 데이터와 비교 검증하였다. -는 뇌실막-특이적/풍부하지 않음; + od는 뇌실막 특이적/풍부함; NA는 입수할 수 있는 데이터 없음이다.
도 3. 뇌실막에서의 발현 검증. 뇌실막-특이적 프로모터 트랜스유전자의 만화 도해. 대략 1100-2500 bp의 뇌실막-풍부 유전자의 잠재적 프로모터 서열이 eGFP 리포터 상류에 클로닝되었다. 개별 트랜스유전자는 RNA 전사물의 3'UTR에 있는 3-bp 바코드를 사용하여 식별되었다.
도 4. 마우스 뇌실막에서 h뇌실막 프로모터 라이브러리 사용. 저용량(5E10 vg), 중간용량(1E11 vg), 및 고용량(5E11 vg)의 벡터 용량 주입 후 마우스 뇌실막 RNA 및 AAV4 바이러스 라이브러리 입력에서 각 트랜스유전자-관련 바코드의 분획 기여도.
도 5. 마우스 뇌실막에서 h뇌실막 프로모터 라이브러리 사용. 바이러스 라이브러리 입력에 대한 RNA 출력의 판독 풍부성의 정량분석. 현저한 풍부성이 양성 대조군, 편재성 iCAG 프로모터 및 hVWA3a 프로모터에 의해 나타났다.
도 6. 레서스(Rhesus) 뇌실막-함유 샘플에서 h뇌실막 프로모터의 분획 기여도 - eGFP. 도 4에서 사용된 동일한 라이브러리를 AAV2로서 제조하여 총 2E13 vg로 2 마리의 성체 레서스 원숭이의 측뇌실에 주입하였다. 주입 후 3주차에 척수를 아래로 통과하는 뇌실 가장자리의 영역을 미세-절제하였다. RNA를 단리하고, cDNA로 전환시키고, 3글자 바코드가 포함된 PCR 산물을 앰플리콘 서열분석하였다. 컬러 막대는 각 트랜스유전자의 상대적 기여도를 가리킨다.
도 7. h뇌실막 라이브러리 라운드 2 - 발현을 증가시키기 위해 프로모터 인트론을 도입한다. 원래의 트랜스유전자는 인간 아포지단백질 2(ApoE2) cDNA를 발현하도록 변형되었으며, 인트론-매개된 증대를 통해 발현이 증가하도록 프로모터 영역 내에 짧은(133 bp) 및 긴(951 bp) 인트론을 포함한다. 효율적인 스플라이싱을 촉진하는 것으로 알려진 짧은 측면인접 서열이 또한 포함되었다(청색 및 녹색 막대).
도 8. h뇌실막 프로모터 라이브러리-유래된 mRNA는 ApoE 단백질을 올바르게 스플라이싱하고 암호화한다. 인트론-함유 변이체에서 스플라이싱 효율을 시험하기 위해, 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 올바른 스플라이싱은 cDNA(C) 대 플라스미드 DNA(D)에서 인트론-함유 영역 전체를 증폭시켜 검증하였다.
도 9. h뇌실막 프로모터 라이브러리-유래된 mRNA는 ApoE 단백질을 올바르게 스플라이싱하고 암호화한다. HEK293 세포 용해물 및 배양 배지에서 인트론이 없는(N) 변이체 및 인트론-함유(짧은 S, 긴 L) 변이체로부터 ApoE 단백질 출력을 측정하는 웨스턴 블롯.
도 10. Rh뇌실막에 사용된 인트론-함유 프로모터. 인트론이 없거나, 짧거나 또는 긴 인트론을 함유하는 6개의 상이한 프로모터의 라이브러리를 단일 AAV2에서 제조하고 2 마리의 성체 레서스 원숭이의 측뇌실에 총 2.8e13 vg의 용량으로 주입하였다. 4주 후에, 뇌실 가장자리를 미세-절제하였다. 이전과 마찬가지로 3' UTR에 고유한 3글자 바코드가 포함된 생성물의 앰플리콘 서열분석을 사용하여 생체내에서 상대적 프로모터 사용을 평가하였다. 모든 hVWA3a 변이체는 입력 라이브러리에 비해 생체내에서 상대적 풍부함을 보였다.
도 11. h뇌실막 프로모터는 마우스에서 발현을 구동한다. 성체 APOE-/-(null) 마우스에 hVWA3a 프로모터 하에서 APOE2를 전달하는 혈청형 AAV4를 우측 측뇌실로 전달하였다. 뇌실막 조직을 미세-절제하고 자동 웨스턴 블롯 기술(WES)을 통해, 주입되지 않은 뇌 조직과 비교된 APOE2 정량분석을 위해 단백질을 추출하였다.
도 12. h뇌실막 프로모터는 마우스에서 편재성 CAG 프로모터보다 더 높은 발현을 구동한다. APOE-/-(null) 마우스에게 편재성 CAG 프로모터 또는 hVWA3a 프로모터 중 어느 하나 하에서 APOE2를 전달하는 혈청형 AAV4를 동일한 용량으로 우측 측뇌실에 주입하였다. 모든 동물로부터 미세-절제된 뇌실막 조직으로부터 단백질을 추출하고 자동 웨스턴 블롯 기술(WES)을 수행하였다. 밴드의 강도로 보아, hVWA3a에 의해 구동된 APOE2는 CAG 프로모터보다 더 많은 양의 APOE2 단백질을 발현하였다.
도 13. 인간 뇌실막 특이적 프로모터를 갖는 펩티드 변형된 AAV1 캡시드: ERDRpAAV1.hVWA3a.eGFP. 양성 eGFP 형광 신호는 뇌실 내벽의 뇌실막 세포로 제한된다.
도 14. hVWA3a 프로모터 분절(서열번호 1).
도 15. 짧은 인트론(밑줄)이 있는 hVWA3a 프로모터 분절(133 bp)(서열번호 2).
도 16. 긴 인트론(밑줄)이 있는 hVWA3a 프로모터 분절(951 bp)(서열번호 3).
도 17. 인간 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand Factor ) A 도메인 3A(VWA3a) 유전자의 상류 조절 서열을 사용하여 인간 APOE2의 뇌실막-특이적 발현을 구동하는 AAV 트랜스유전자의 개략도. 짧은 β-글로빈/IgG 키메라 인트론(133 bp)을 전사 개시 부위 하류에 삽입하여 인트론-매개된 증대를 통해 전사를 증대시키고 강력한 코작 서열을 포함시켜 APOE2 번역을 개시하였다. 전체 트랜스유전자는 AAV2 역전 말단 반복부(ITR)에 측면 인접하고 있다.
도 18. AAV에 대한 hVWA3a 프로모터 짧은 인트론 hApoE2 발현 작제물(서열번호 4).
도 19. pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2 @ 7E10 vg는 비히클-처리 대조군과 비교하여 피질의 ThioS 양성 신호를 유의미하게 감소시킨다. 인간 APOE4에 대해 동형접합성인 알츠하이머병 마우스 모델에 전달된 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2. 고용량의 7E10 vg로 처리된 마우스에서 ThioS 양성 세포의 %가 비히클 처리된 대조용 마우스에 비해 유의미하게 감소한다(p < 0.05). 저용량: 7E9 vg; 중간용량: 2E10 vg; 고용량: 7E10 vg. ThioS는 마우스의 아밀로이드 플라크에서 발견되는 B-주름 시트를 염색한다(미만성 플라크와 상반되는 치밀한 코어 플라크의 마커로 사용됨). ThioS의 차이는 있지만 올리고머성 항체 염색(IBL)은 그렇지 않은데, 이는 AAV가 일반적으로 플라크 형성보다는 치밀한 코어 플라크 형성을 방지한다는 것을 가리킨다.
도 20. pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2 @ 7E10 vg는 비히클-처리된 대조군과 비교하여 피질에서 아밀로이드-베타 양성 신호를 유의미하게 감소시킨다. 인간 APOE4에 대해 동형접합성인 알츠하이머병 마우스 모델에 전달된 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2. 비히클 처리된 마우스에 비해 7E10 vg로 처리된 마우스에서 아밀로이드-베타 염색된 세포가 유의미하게 감소된다(p < 0.05). 저용량: 7E9 vg; 중간용량: 2E10 vg; 고용량: 7E10 vg.
도 21. hVWA3a 프로모터 서열에 대한 DNA에서 QPCR에 의해 분석된 바이러스 게놈 사본. 인간 APOE4에 대해 동형접합성인 알츠하이머병 마우스 모델에 전달된 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2. 벡터의 3개 용량 모두로 처리된 마우스 뇌의 DNA 용해물은 인간 VWA3a 프로모터 서열의 비-전사 영역에서 분석 시 양성이다. 대조군(비히클) 처리된 AD 마우스뿐만 아니라 대조군 처리된 WT 마우스는 표준 곡선에 의해 검출 가능한 범위 이하의 hVWA3a 배경 수준만을 나타내었다. 저용량: 7E9 vg; 중간용량: 2E10 vg; 고용량: 7E10 vg.
도 22. hVWA3a 프로모터 서열에 대한 DNA에서 QPCR에 의해 분석된 바이러스 게놈 사본. pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2의 바이러스 게놈 사본은 3개의 상이한 용량의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2로 처리된 비인간 영장류의 뇌의 뇌실막 조직, 피질 조직 및 해마 조직에서 검출가능하다. 뇌 조직 DNA 용해물이 인간 VWA3a 프로모터 서열의 비-전사 영역에서 분석된 전체 게놈 사본에 대해 분석되었다. 미경험 샘플은 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.APOE2를 수용하지 않은 NHP로부터 유래한다. 그래프에서 위에서 아래로의 입력은 왼쪽에서 오른쪽으로의 입력과 동일하다.
도 23. 알츠하이머병의 삼중 트랜스제닉 마우스 모델에서 APOE2의 발현. APOE4X APP/PS1은 키메라 마우스/인간 아밀로이드 전구체 단백질, 돌연변이 인간 프레세닐린 1 및 인간 APOE4를 발현하는 삼중 트랜스제닉 마우스로, 인간 상태의 여러 측면을 가진 모델을 생성시킨다. 이미지는 처리되지 않고 방치된 경우 3개월, 4개월, 5개월 및 6개월차의 신경 염색(DAPI; 청색)된 피질 아밀로이드-베타(Aβ; 적색)를 나타낸다. 연구 패러다임은 플라크 축적이 시작되는 4개월차에 마우스에게 주사하고 6개월차에 부검하였다. 마우스 뇌실 내에 7E9, 2E10 및 7E10 vg의 상승하는 용량의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2를 주입하였다. 게놈 사본 발현의 판독값을 도 21에 나타낸다.
도 24. APOE2 발현은 APOE4XAPP/PS1 마우스에서 플라크 침착에 이롭다. 좌측의 ThioS 염색은 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2 전달 후 2개월차의 플라크를 나타낸다. 정량적 그래프는 7E10 vg의 용량을 수령한 마우스에서 ThioS 수준 및 가용성 AB42 수준이 유의미하게 감소한 것을 나타낸다.
도 25. APOE2 발현은 AD 마우스 모델에서 플라크 밀도 및 플라크 크기를 감소시킨다. 7E10 vg의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2는 처리되지 않은 동일 연령의 AD 마우스에 비해 플라크 매개변수를 유의미하게 감소시켰다.
도 26. 신경교세포의 매개변수 등급화를 위한 트레이닝(training) 이미지. 뇌 섹션을 Iba1(미세아교세포 마커; 청색), GFAP(성상세포 마커; 녹색) 및 아밀로이드-베타(플라크 마커; 적색)로 염색하고 플라크 근처의 신경교세포의 상대적인 염색 수준을 채점하였다.
도 27. 바이러스에 의해 발현된 APOE2는 플라크 근처의 미세아교세포증( microgliosis )을 예방한다. 도 26의 이미지로 트레이닝한 2명의 맹검 과학자는 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2를 투여한 마우스의 뇌에서 플라크(Aβ; 적색) 근처의 미세아교세포(Iba1; 청색)를 채점하였다.
도 28. 3개월, 4개월, 5개월 및 6개월령의 AD 마우스 뇌 염색. 상단 패널은 GFAP(녹색) 및 Aβ(적색)로 염색된 피질 이미지를 도시한다. 하단 패널은 Iba1(청색) Aβ(적색)로 염색된 피질 이미지를 도시한다.
도 29. AD 마우스의 예비 평가는 미세아교세포증의 높은 가변성을 갖는다. pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2가 투여된 AD 마우스에서는 미세아교세포증의 가변성이 훨씬 더 높게 나타난다.
도 30. 플라크 근처의 GFAP 채점의 그래픽 표현. AD 마우스에 APOE2의 전달은 맹검 병리학적 채점에 의해 평가된 플라크 근처의 성상세포 반응성에 유의미한 영향을 미치지 않는다.
도 31. 바이러스에 의해 발현된 APOE2는 플라크 근처의 시냅스 손실을 방지한다. 7E10 vg의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2 또는 비히클 대조군을 주입한 AD 마우스의 뇌 이미지. 시냅스 말단의 PSD95(시냅스-후 밀도 -95) 염색은 투여된 동물에서 더 뚜렷하다.
도 32. APOE2가 투여된 AD 마우스의 시냅스 무결성 정량분석. 플라크의 근위부(근처; 적색) 및 원위부(먼; 청색)의 시냅스를 조직학적 이미지로부터 정량분석하였다. 7E10 vg의 치료제를 투여한 마우스만이 플라크 근처 및 먼 곳 모두에서 유사한 양의 시냅스 밀도를 나타내었다. 다른 모든 AD 처리 그룹에서는 플라크 근처의 시냅스 밀도가 플라크에서 멀리 떨어진 곳에 비해 유의미하게 낮았다(좌측 그래프). 우측 그래프는 그룹 간의 "근처" 및 "먼" 시냅스 밀도를 비교하는데, 이는 고용량(7E10 vg) 그룹에서 다른 모든 그룹에 비해 "근처" 플라크의 시냅스 밀도가 유의미하게 더 높다는 것을 밝힌다.
도 33A-E. 신규의 AAV 캡시드 및 프로모터에 의해 구동된 APOE2의 뇌실막 세포 발현. (도 33A) APOE KO 마우스 뇌실의 뇌실막 세포에서 인간 APOE 발현을 나타내는 제자리 하이브리드화. (도 33B) APOE KO 마우스의 피질에서 뇌실막 생성된 AAV 유래 APOE2가 내인성 수준의 약 10%(도 33C)임을 보여주는 APOE에 대한 웨스턴 블롯. (도 33D) 각 마우스에서 추출한 조직의 바이러스 게놈 사본[(F(4,35)=5.546 p=0.0014) 사후 Tukey 다중 비교 검정]. (도 33E) 비히클 처리된 동물에 정규화된 인간 APOE에 대한 qRTPCR(F(4, 26) = 2.890 p=0.0419 비히클에 대한 사후 Dunnett 검정). (E) APOE에 대한 mRNA와 바이러스 게놈 사본 간의 유의미한 상관관계(p=0.0445)를 나타내는 선 그래프. N은 각 마우스가 개별 점임을 표시한다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 34A-E. POE2는 용량-의존적 방식으로 플라크 침착, 수 및 크기를 감소시킨다. (도 34A) 투여된 APP/PS1/APOE4 동물의 피질에서 thioS에 대한 IHC. (도 34B) ThioS 염색에 의한 피질 피복률이 고용량 동물에서 유의미하게 낮다(F(3, 27) = 4.310 p=0.0329). (도 34C) ThioS에 의한 피질 피복률 백분율은 각 마우스의 뇌 샘플에서 바이러스 게놈 사본 수와 유의미한 상관관계가 있다(p=0.0112). (도 34D) 플라크 수(F(3, 27) = 3.597 p=0.0263) 및 (도 34E) 플라크 크기(F(3, 27) = 4.113 p=0.0159)는 모두 고용량 그룹에서 유의미한 효과를 나타낸다. n은 각 마우스가 개별 점임을 표시하고, 빈 원은 암컷이고, 색칠 된 원은 수컷임을 표시한다. 사후 검정은 비히클과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 검정으로서 도시된다. p *p<0.05, **p<0.01.
도 35A-D. APOE2는 플라크 근처의 미세아교세포증을 감소시킨다. (도 35A) 투여된 APP/PS1/APOE4 동물의 피질에서 IBA1 및 o Aβ에 대한 IHC. (도 35B) 평균 미세아교세포 반응 점수(F(3, 26) = 4.529 p=0.0110)는 고용량 및 중간용량 그룹에서 미세아교세포 활성화의 감소를 나타내고 (도 35C) 해당 마우스의 바이러스 게놈 사본 수와 유의미하게 상관된다(p = 0.0081). (도 35D) 이러한 감소는 4점으로 평가된 플라크 수의 감소 및 1점으로 평가된 플라크 수의 증가에 기인한다. n은 각 마우스가 개별 점임을 표시하고, 빈 원은 암컷이고, 색칠 된 원은 수컷임을 표시한다. 사후 검정은 비히클과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 검정으로 도시된다. p *p<0.05
도 36A-D. APOE2는 근처의 시냅스 손실을 감소시킨다. (도 36A) 투여된 APP/PS1/APOE4 동물의 피질에서 PSD95 및 oAβ에 대한 IHC. (도 36B) 시냅스 밀도는 플라크에서 멀리 떨어진 곳에서는 변하지 않지만 (도 36C) 플라크 근처에서는 유의미하게 증가한다(F(3, 27) = 5.153 p=0.0060). (도 36D) 이는 비히클과 비교하여 고용량 동물에서 시냅스 손실률의 유의미한 감소로 이어진다(F(3, 27) = 3.693 p =0.0239). n은 각 마우스가 개별 점임을 표시하고, 빈 원은 암컷이고, 색칠 된 원은 수컷임을 표시한다. 사후 검정은 비히클과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 검정으로 도시된다. p *p<0.05.
도 37A-D. 올리고머성 Aβ에 대한 APOE2의 영향. (도 37A) Aβ 염색에 의한 피질 피복률은 고용량 동물에서 유의미하게 더 낮다(F(3, 27) = 6.336, p=0.0022). (도 37B) ThioS에 의한 피질 피복률은 해당 마우스의 바이러스 게놈 사본 수와 유의미하게 상관된다(p=0.0173). (도 37C) ELISA는 SDS 가용성(F(3, 28) = 3.497 p=0.0285) 및 (도 37D) 포름산 가용성(F(3, 30) = 3.741 p=0.0214) Aβ가 모두 고용량 그룹에서 유의미한 효과를 보임을 나타낸다. n은 각 마우스가 개별 점임을 표시하고, 빈 원은 암컷이고, 색칠 된 원은 수컷임을 표시한다. 사후 검정은 비히클과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 검정으로 도시된다. p *p<0.05, **p<0.01.
도 38A-E. APOE2는 플라크 근처의 성상세포 반응성에 영향을 미치지 않는다. (도 38A) 플라크에 대한 미세 및 성상세포 반응성을 평가하는 데 사용된 4점 척도의 전형적인 이미지. (도 38B) 투여된 APP/PS1/APOE4 동물의 피질에서 GFAP 및 oAβ에 대한 IHC. (도 38C) 평균 성상세포 반응 점수(F(3,26)=1.634 p=0.2057)는 그룹 간에 변화가 없고 (도 38D) 바이러스 게놈 수와 유의미하게 상관되지 않는다(p=0.1904). (도 38E) 각 범주로 채점된 플라크 수에서 그룹 간에 차이가 없다. n은 각 마우스가 개별 점임을 표시하고, 빈 원은 암컷이고, 색칠 된 원은 수컷임을 표시한다. 사후 검정은 비히클과 비교하는 Dunnett의 다중 비교 검정으로 도시된다. p *p<0.05
도 39A-C. APOE2는 신경돌기 이영양증(neuritic dystrophy)에 영향을 미치지 않는다. (도 39A) 투여된 APP/PS1/APOE4 동물의 피질에서 Smi-312 및 oAβ에 대한 IHC. (도 39B) 분석 결과, (도 39C) 플라크 크기를 고려하더라도(F(3, 25) = 1.127 p=0.3569), 플라크 당 카운팅된 이영양증 수에 차이가 없음을 보여준다(F(3, 25) = 0.4710; p=0.7052).
도 40. h뇌실막 프로모터는 ICV 전달 후 NHP에서 뇌실막-국소화된 APOE 전사를 구동한다. 총 1E13 vg의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2 벡터를 성체 아프리카 녹색 원숭이의 측뇌실에 단측으로 주입하였다. 주입 후 60일차에 절편화(sectioning)를 위해 조직을 채취하고, 트랜스유전자 발현을 RNA 형광 제자리 하이브리드화(RNA-FISH)에 의해 모니터링하였다. 인간 APOE를 표적화하도록 설계된 탐침은 높은 서열 상동성으로 인해 내인성 아프리카 녹색 APOE와 강한 중복을 나타낸다. 전사물 기원을 지정하기 위해, 우리는 위치에 의존하였다. 내인성 APOE 전사는 성상세포와 미세아교세포에서만 발생하므로, 우리는 뇌실막-특이적 유전자 FoxJ1(백색 점선으로 표시됨)과의 중복에 의해 정의되는 뇌실막-국소화된 신호를 트랜스유전자-유래된 APOE2로서 볼 수 있다. Hoechst H33258은 조직 DNA를 식별한다.
도 41. h뇌실막 프로모터는 ICV 전달 후 NHP에서 CSF APOE를 증가시킨다. 총 1E13 vg의 pmAAV1.ERDR.hVWA3a.ApoE2 벡터를 성체 아프리카 녹색 원숭이의 측뇌실에 단측으로 주입하였다. CSF를 기준선, 주입 후 30-, 45- 및 60-일차에 수집하고, APOE 단백질을 자동 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 모든 값은 기준선에 정규화되었다.
본원에서, 발명자들은 마우스와 인간의 뇌에서 뇌실막-특이적 발현을 구동할 수 있는 프로모터 서열을 식별하고자 하였으며, 이는 차례로 신경 질환을 치료하기 위해 분비된 단백질의 발현을 구동하는 유전자 치료 양식에 사용될 수 있다. 발명자들은 먼저 신경 질환 상태와 연령에 민감하지 않은 유전자를 식별한 다음, 관련 프로모터를 대리로 식별하기로 하였다. 이러한 프로모터는 뇌실 내벽의 상피 세포층인 뇌실막에서 트랜스유전자 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 이러한 세포를 AAV로 감염시킨 후에, 분비된 단백질은 뇌실로 들어가 뇌척수액을 통해 뇌 전체에 분포될 수 있다. 또, 질병 조직에서 유전자 발현 패턴이 변경되어 부정적인 영향을 받을 수 있는 프로모터를 제거함으로써 트랜스유전자 발현을 더 강하게 달성할 수 있을 것이다.
이를 달성하기 위해 발명자들은 정상 및 병든 뇌(알츠하이머병, 헌팅턴병, 전두측두형 치매 등)에서 뇌실막 및 인접한 뇌실막-부재 샘플을 수득하였다. RNA 서열분석을 사용하여, 발명자들은 뇌실막-함유 샘플에서 발현이 풍부하고 질병 상태와 관계없이 유지되는 유전자를 식별하였다. 이들의 특이성에 대한 추가 증거를, Allen Brain Institute 제자리 하이브리드화 라이브러리를 포함한 공개된 데이터 세트를 사용하여 검증하였다. 프로모터는 느슨하게 정의된 구조이므로, 상위 유전자 후보(11개 프로모터)로부터 전사 개시 부위 상류의 게놈 서열(~1100-2500 bp)을 단리하고 이를 AAV-양립성 트랜스유전자(ITR에 측면 인접됨) 내의 GFP 리포터 및 독특한 3글자 RNA 바코드 상류에 배치하였다. 상이한 프로모터를 함유하는 플라스미드를 모아, AAV4 또는 AAV2로서 제조하고, 각각 마우스 또는 레서스 원숭이의 뇌실에 직접 주입하였다. 뇌실막-함유 조직을 미세-절제하고 3글자 바코드 주변 영역에서 앰플리콘 서열분석을 수행하였다. 출력을 라이브러리 입력과 비교하여 풍부성을 확인하였다. 상류 인트론을 포함시키면 조직 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 첫 번째 스크린에서 식별된 상위 적중(6개 프로모터)을 짧은(133 bp) 또는 긴(951 bp) 인트론을 포함하도록 추가로 변형시켰다. 개별 버전은 다시 3'UTR의 독특한 3글자 바코드에 의해 식별되었다. 3a(hVWA3a)를 함유하는 인간 폰 빌레브란트 인자 A 도메인의 변이체를 포함하는 트랜스유전자는 최종 스크린에서 가장 고도로 풍부하며 추가 연구를 위해 선택되었다.
본 개시내용의 이들 및 다른 양태를 하기에서 더 상세히 논의한다.
I. 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 파보바이러스 과의 작은 비-병원성 바이러스이다. 지금까지 수많은 혈청학적으로 구별되는 AAV가 동정되었으며, 12개가 넘게 인간이나 영장류에서 단리되었다. AAV는 복제를 위해 헬퍼 바이러스에 의존한다는 점에서 이 과의 다른 구성원과 다르다.
AAV 게놈은 숙주 세포 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 존재할 수 있으며; 광범위한 숙주 범위를 갖고; 분열 세포 및 비-분열 세포 모두를 시험관내 및 생체내에서 형질도입하고, 형질도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 유지한다. AAV 바이러스 입자는 열에 안정적이며, 용매, 세제, pH 및 온도 변화에 강하고; 컬럼 정제 및/또는 CsCl 구배 또는 다른 수단에 의해 농축될 수 있다. AAV 게놈은 양성- 또는 음성-감지되는 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)을 포함한다. 대략 4.7 kb 게놈의 AAV는 플러스 또는 마이너스 극성의 단일 가닥 DNA의 한 분절로 이루어진다. 게놈의 단부는, 헤어핀 구조로 폴딩되고 바이러스 DNA 복제의 기원으로 작용할 수 있는 짧은-역전 말단 반복부(ITR)이다.
AAV "게놈"은 궁극적으로 AAV 입자를 형성하기 위해 패키징되거나 캡슐화되는 재조합 핵산 서열을 지칭한다. AAV 입자는 종종 AAV 캡시드 단백질과 함께 패키징된 AAV 게놈을 포함한다. 재조합 플라스미드를 사용하여 재조합 벡터를 구축하거나 제조하는 경우, AAV 벡터 게놈에는 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 해당하지 않는 "플라스미드" 부분은 포함되지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 게놈 부분을 "플라스미드 주쇄"라 칭하며, 이는 플라스미드 증식 및 생성에 필요한 공정인 플라스미드의 복제 및 증폭에 중요하지만 자체가 바이러스 입자에 패키징되거나 캡슐화되지는 않는다. 따라서 AAV 벡터 "게놈"은 AAV 캡시드 단백질에 의해 패키징되거나 캡슐화된 핵산을 지칭한다.
AAV 비리온(입자)은 AAV 캡시드를 포함하는, 직경이 약 25 ㎚인 비-외막 이십면체 입자이다. AAV 입자는 3개의 관련 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3으로 구성된 이십면체 대칭을 포함하며, 이들은 함께 상호 작용하여 캡시드를 형성한다. 대부분의 고유 AAV의 게놈은 종종 2개의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함하는데, 이를 좌측 ORF 및 우측 ORF라고 지칭한다. 우측 ORF는 종종 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 이러한 단백질은 종종 각각 1:1:10의 비율로 발견되지만 다양한 비율일 수 있으며 모두 우측 ORF로부터 유래된다. VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질은 대안의 스플라이싱 및 독특한 개시 코돈의 사용에 의해 서로 상이하다. 결실 분석은 대안적으로 스플라이싱된 메시지로부터 번역된 VP1의 제거나 변경이 감염성 입자의 수율 감소를 초래한다는 것을 입증하였다. VP3 암호화 영역 내의 돌연변이는 단일-가닥 자손 DNA 또는 감염성 입자를 생성시키지 못한다. 특정 구현예에서, AAV 입자의 게놈은 1, 2 또는 3개 모두의 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 암호화한다.
좌측 ORF는 종종 비-구조적 Rep 단백질인 Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 암호화하는데, 이는 단일-가닥 자손 게놈의 생성 외에도 복제 및 전사 조절에 관여한다. Rep 단백질 중 2개는 인간 염색체 19의 q 아암 영역내로의 AAV 게놈의 우선적 통합과 연관되었다. Rep68/78은 NTP 결합 활성뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 일부 Rep 단백질은 핵 국소화 신호뿐만 아니라 여러 잠재적인 인산화 부위를 가지고 있다. 특정 구현예에서 AAV(예: rAAV)의 게놈은 일부 또는 모든 Rep 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서 AAV(예: rAAV)의 게놈은 Rep 단백질을 암호화하지 않는다. 특정 구현예에서 하나 이상의 Rep 단백질은 트랜스로 전달될 수 있으므로 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 AAV 입자에 포함되지 않는다.
AAV 게놈의 단부는 바이러스 DNA 복제의 기원으로 작용하는 T자 모양의 헤어핀 구조로 폴딩될 잠재력을 가진 짧은-역전 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 따라서, AAV의 게놈은 단일 가닥 바이러스 DNA 게놈의 측면에 인접한 하나 이상(예: 한 쌍)의 ITR 서열을 포함한다. ITR 서열은 종종 각각 약 145개 염기의 길이를 갖는다. ITR 영역 내에서, ITR의 기능에 중심적인 것으로 여겨지는 두 가지 요소, 즉 GAGC 반복 모티프 및 말단 분해 부위(trs)가 기재되었다. 반복 모티프는 ITR이 선형 또는 헤어핀 형태일 때 Rep에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결합은 부위- 및 가닥-특이적 방식으로 발생하는 trs에서 절단을 위해 Rep68/78을 위치시키는 것으로 생각된다. 복제에서의 역할 외에도 이 두 요소는 바이러스 통합에 중심적인 것으로 보인다. 염색체 19 통합 유전자좌 내에, 인접한 trs가 있는 Rep 결합 자리가 함유된다. 이러한 요소는 기능적이며 유전자좌 특이적 통합에 필요한 것으로 나타났다.
"재조합"이라는 용어는 벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 또는 파보바이러스(예: AAV) 벡터의 수식어로서뿐만 아니라, 재조합 핵산 서열 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서, 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조성물이 조작(즉, 가공)되었음을 의미한다. AAV, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 재조합 벡터의 특정 예로는 야생형 바이러스 게놈에 일반적으로 존재하지 않는 핵산 서열이 바이러스 게놈 내에 삽입된 경우가 있을 수 있다. 재조합 핵산 서열의 일례로 핵산(예: 유전자)이, 바이러스 게놈 내에서 유전자와 통상적으로 연관되는 5', 3' 및/또는 인트론 영역이 있거나 없이 벡터에 클로닝된 억제 RNA를 암호화하는 경우가 있을 수 있다. "재조합"이라는 용어는 본원에서 바이러스 벡터와 같은 벡터나 폴리뉴클레오티드와 같은 서열을 언급할 때 항상 사용되는 것은 아니지만, 핵산 서열, 폴리뉴클레오티드, 트랜스유전자 등을 포함한 "재조합" 형태는 이러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터"는, 바이러스로부터 야생형 게놈의 일부를 제거하는 분자적 방법을 사용하고 핵산 서열과 같은 비-고유 핵산으로 대체함으로써 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 전형적으로, 예를 들어 AAV의 경우, AAV 게놈의 하나 또는 2개 모두의 역전 말단 반복부(ITR) 서열이 재조합 AAV 벡터에 유지된다. "재조합" 바이러스 벡터(예: rAAV)는 바이러스(예: AAV) 게놈과 구별되는데, 이는 상기 바이러스 게놈의 일부가 전사 활성제를 암호화하는 핵산 또는 억제 RNA를 암호화하는 핵산 또는 치료 단백질을 암호화하는 핵산과 같은 바이러스 게놈 핵산과 관련하여 비-고유 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서 이러한 비-고유 핵산 서열의 통합은 바이러스 벡터를 "재조합" 벡터로서 정의하며, 이는 AAV의 경우 "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다.
특정 구현예에서, AAV(예: rAAV)는 2개의 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV(예: rAAV)는 한 쌍의 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV(예: rAAV)는 적어도 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 측면에 인접하는(즉, 각각 5' 및 3' 단부에 있는) 한 쌍의 ITR을 포함한다.
AAV 벡터(예: rAAV 벡터)는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위해 패키징될 수 있으며, 본원에서 "AAV 입자"로서 지칭된다. 재조합 AAV 벡터가 AAV 입자에 캡슐화되거나 패키징되는 경우, 상기 입자는 "rAAV 입자"로도 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, AAV 입자는 rAAV 입자이다. rAAV 입자는 종종 rAAV 벡터 또는 그 일부를 포함한다. rAAV 입자는 하나 이상의 rAAV 입자(예: 다수의 AAV 입자)일 수 있다. rAAV 입자는 전형적으로 rAAV 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키징하는 단백질(예: 캡시드 단백질)을 포함한다. rAAV 벡터에 대한 언급은 rAAV 입자를 언급하는 데 사용될 수도 있다는 점에 유의한다.
임의의 적합한 AAV 입자(예: rAAV 입자)는 본원의 방법 또는 용도에 사용될 수 있다. rAAV 입자 및/또는 이에 포함된 게놈은 임의의 적합한 AAV의 혈청형 또는 균주로부터 유래될 수 있다. rAAV 입자 및/또는 이에 포함된 게놈은 2개 이상의 AAV의 혈청형 또는 균주로부터 유래될 수 있다. 따라서 rAAV는 임의의 AAV의 혈청형 또는 균주의 단백질 및/또는 핵산, 또는 그 일부를 포함할 수 있으며, 여기서 AAV 입자는 포유류 세포의 감염 및/또는 전달에 적합하다. AAV 혈청형의 비제한적 예로는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 및 AAV-2i8이 있다.
특정 구현예에서 다수의 rAAV 입자는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 하위 그룹 또는 변이체)의 입자 또는 이로부터 유래된 입자를 포함한다. 특정 구현예에서 다수의 rAAV 입자는 2개 이상의 상이한 rAAV 입자(예: 상이한 혈청형 및/또는 균주)의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "혈청형"이라는 용어는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하는 데 사용되는 구분이다. 혈청학적 독특성은 다른 AAV와 비교하여 한 AAV에 대한 항체들 간의 교차 반응성이 없는 것을 기준으로 결정된다. 이러한 교차 반응성 차이는 대개 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자의 차이(예: AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이)로 인해 발생한다. 캡시드 변이체를 포함한 AAV 변이체는 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 가능성이 있음에도 불구하고, 상기 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 상이하다.
특정 구현예에서, 첫 번째 혈청형 게놈을 기반으로 하는 rAAV 벡터는 벡터를 패키징하는 하나 이상의 캡시드 단백질의 혈청형에 상응한다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈을 포함하는 하나 이상의 AAV 핵산(예: ITR)의 혈청형은 rAAV 입자를 포함하는 캡시드의 혈청형에 상응한다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터 게놈은 상기 벡터를 패키징하는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 별개의 AAV(예: AAV2) 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, rAAV 벡터 게놈은 AAV2 유래 핵산(예: ITR)을 포함할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나 이상은 상이한 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 혈청형 또는 그 변이체로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 참조 혈청형과 관련된 rAAV 입자 또는 이의 벡터 게놈은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 입자의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 하위서열과 적어도 60% 이상(예: 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 하위서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 참조 혈청형과 관련된 rAAV 입자 또는 벡터 게놈은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 혈청형의 캡시드 또는 ITR 서열과 적어도 60% 이상(예: 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 캡시드 또는 ITR 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본원의 방법은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 입자의 용도, 투여 또는 전달을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원의 방법은 rAAV2 입자의 용도, 투여 또는 전달을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV2 입자는 AAV2 캡시드를 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 하나 이상의 캡시드 단백질(예: VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 변이체이다. 일부 양태에서, AAV2 변이체의 하나 이상의 캡시드 단백질은 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 캡시드 단백질(들)과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
특정 구현예에서 rAAV9 입자는 AAV9 캡시드를 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV9 입자는 고유 또는 야생형 AAV9 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 하나 이상의 캡시드 단백질(예: VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV9 입자는 고유 또는 야생형 AAV9 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV9 입자는 고유 또는 야생형 AAV9 입자의 변이체이다. 일부 양태에서, AAV9 변이체의 하나 이상의 캡시드 단백질은 고유 또는 야생형 AAV9 입자의 캡시드 단백질(들)과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
특정 구현예에서, rAAV 입자는 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 허용하는 헤어핀 형성 능력; AAV DNA를 숙주 세포 게놈에 통합시키는 능력; 및/또는 필요한 경우 패키징하는 능력)을 유지하는 한, 고유 또는 야생형 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 상응하는 ITR과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 하나 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
특정 구현예에서, rAAV2 입자는 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 허용하는 헤어핀 형성 능력; AAV DNA를 숙주 세포 게놈에 통합시키는 능력; 및/또는 필요한 경우 패키징하는 능력)을 유지하는 한, 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 ITR과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 하나 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
특정 구현예에서 rAAV9입자는 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 허용하는 헤어핀 형성 능력; AAV DNA를 숙주 세포 게놈에 통합시키는 능력; 및/또는 필요한 경우 패키징하는 능력)을 유지하는 한, 고유 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 ITR과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들어 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등 내지 최대 100% 동일한 하나 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
rAAV 입자는 임의의 적합한 수의 "GAGC" 반복부를 갖는 ITR을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 AAV2 입자의 ITR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 "GAGC" 반복부를 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 3개의 "GAGC" 반복부를 포함하는 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 4개 미만의 "GAGC" 반복부를 갖는 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자는 4개 초과의 "GAGC" 반복부를 갖는 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서 rAAV2 입자의 ITR은 처음 2개의 "GAGC" 반복부의 네 번째 뉴클레오티드가 T가 아닌 C인 Rep 결합 부위를 포함한다.
예시적으로 적합한 길이의 DNA를 rAAV 입자내로의 패키징/캡슐화를 위해 rAAV 벡터에 통합시킬 수 있으며, 길이는 약 5 킬로염기(kb) 이하일 수 있다. 특히, 구현예에서, DNA의 길이는 약 5 kb 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만 또는 약 2.5 kb 미만이다.
RNAi 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 당업계에 공지된 적합한 재조합 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다(예: 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조). 재조합 AAV 벡터를 전형적으로 AAV 바이러스 패키징 시스템을 사용하여 형질도입이 가능한 AAV 입자에 패키징하고 전파시킨다. 형질도입이 가능한 AAV 입자는 포유류 세포에 결합하여 세포 내로 진입한 후 핵산 화물(예: 이종 유전자)을 세포 핵으로 전달할 수 있다. 따라서 형질도입이 가능한 온전한 rAAV 입자는 포유류 세포를 형질도입하도록 구성된다. 포유류 세포를 형질도입하도록 구성된 rAAV 입자는 종종 복제가 가능하지 않으며 자기-복제를 위해 추가적인 단백질 기구가 필요하다. 따라서 포유류 세포를 형질도입하도록 구성된 rAAV 입자는 포유류 세포에 결합하여 진입하고 세포로 핵산을 전달하도록 설계되며, 여기서 전달을 위한 핵산은 종종 rAAV 게놈 내 한 쌍의 AAV ITR 사이에 위치한다.
형질도입이 가능한 AAV 입자를 생성시키기에 적합한 숙주 세포에는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포가 포함되지만 이에 제한되지 않으며, 이들은 이종 rAAV 벡터의 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되었던 세포이다. 안정한 인간 세포주인 HEK293(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 수탁 번호 ATCC CRL1573으로 쉽게 입수할 수 있음)의 세포를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 5형 DNA 단편으로 형질전환되고 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현하는 변형된 인간 배아 신장 세포주(예: HEK293)를 사용하여 재조합 AAV 입자를 생성시킨다. 변형된 HEK293 세포주는 쉽게 형질감염되며, rAAV 입자를 생성시키기에 특히 편리한 플랫폼을 제공한다. 포유류 세포를 형질도입할 수 있는 고역가 AAV 입자의 생성 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, AAV 입자를 문헌[Wright, 2008] 및 문헌[Wright, 2009]에 제시된 대로 제조할 수 있다.
특정 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 전 또는 이와 동시에 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 형질감염시켜 숙주 세포에 도입된다. 따라서 AAV 헬퍼 작제물은 때때로 생산적인 AAV 형질도입에 필요한 누락 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공하는 데 사용된다. AAV 헬퍼 작제물은 종종 AAV ITR이 없고 스스로 복제하거나 패키징할 수 없다. 이러한 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. Rep 및 Cap 발현 생성물을 모두 암호화하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기재되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 암호화하는 다수의 다른 벡터가 공지되어 있다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 필수 조절 영역이 있는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 특수 벡터이다. 발현 벡터는 적어도 세포에서 전파를 위한 복제 기원 및 임의로 이종 핵산 서열, 발현 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들), 및 폴리아데닐화 신호와 같은 추가 요소를 포함할 수 있다.
II. 치료제
일부 구현예에서, 바이러스 유전자 전달 방법은 포유류 세포 또는 표적 조직에 핵산을 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 배양된 세포 또는 숙주 생물에 억제 RNA, 비-암호화 RNA 및/또는 치료 단백질을 암호화하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다.
A. 억제 RNA
"RNA 간섭(RNAi)"은 siRNA에 의해 개시되는 서열-특이적, 전사-후 유전자 침묵 과정이다. RNAi 동안 siRNA는 표적 mRNA의 분해를 유도하여 결과적으로 서열 특이적 유전자 발현 억제를 초래한다.
"억제 RNA", "RNAi", "작은 간섭 RNA" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA" 분자, "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA" 분자 또는 "miRNA"는 관심 핵산 서열을 표적화하는 뉴클레오티드의 RNA 듀플렉스이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "siRNA"라는 용어는 shRNA와 miRNA의 하위 집합을 포괄하는 일반 용어이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 두 영역 사이의 상보적 짝짓기에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오티드 서열이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열과 상보적이라는 점에서 유전자를 "표적화한다". 특정 구현예에서, siRNA는 헌팅틴(huntingtin)을 암호화하는 서열에 표적화된다. 일부 구현예에서, siRNA의 듀플렉스의 길이는 30개 염기쌍 미만이다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 길이는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 염기쌍일 수 있다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 길이는 19 내지 25개 염기쌍이다. 특정 구현예에서, 듀플렉스의 길이는 19 또는 21개 염기쌍이다. siRNA의 RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 듀플렉스 부분 외에, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 두 서열 사이에 위치한 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프는 길이가 다양할 수 있다. 일부 구현예에서 루프의 길이는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서 루프의 길이는 18개 뉴클레오티드이다. 헤어핀 구조는 또한 3' 및/또는 5' 오버행 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 오버행의 길이는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 오버행이다.
shRNA는 5' 측면인접 영역, siRNA 영역 분절, 루프 영역, 3' siRNA 영역 및 3' 측면인접 영역을 함유하도록 설계된 스템-루프 구조로 구성된다. 대부분의 RNAi 발현 전략은 강력한 polIII-기반 프로모터에 의해 구동되는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 활용하였다. 많은 shRNA가 시험관내 및 생체내에서 표적 서열의 효과적인 녹다운을 나타냈지만, 표적 유전자의 효과적인 녹다운을 나타낸 일부 shRNA는 생체내에서 독성이 있는 것으로도 밝혀졌다.
miRNA는 전구체 스템 루프 전사물로부터 가공된 작은 세포 RNA(~22 nt)이다. 공지된 miRNA 스템 루프는 관심 유전자에 특이적인 RNAi 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. miRNA 분자는 miRNA가 내인성으로 발현되기 때문에 shRNA 분자보다 선호될 수 있다. 따라서 miRNA 분자는 dsRNA 반응성 인터페론 경로를 유도할 가능성이 낮고 shRNA보다 더 효율적으로 가공되며 80% 더 효과적으로 침묵시키는 것으로 나타났다.
최근에 발견된 대안의 접근법은 RNAi 벡터로서 인공 miRNA(siRNA 서열을 운반하는 pri-miRNA 스캐폴드)를 사용하는 것이다. 인공 miRNA는 내인성 RNAi 기질과 더 자연스럽게 유사하며 Pol-II 전사(예: RNAi의 조직 특이적 발현 허용) 및 폴리시스트론 전략(예: 여러 siRNA 서열 전달 허용)에 더 적합한다. 참고로 포함된 미국특허 제10,093,927호를 참조하시오.
"shRNA"의 전사 단위는 독립 뉴클레오티드의 루프에 의해 연결된 센스 및 안티센스 서열로 구성된다. shRNA는 Exportin-5에 의해 핵에서 수출되고, 세포질에 도달하면 Dicer에 의해 처리되어 기능적 siRNA를 생성시킨다. "miRNA" 스템 루프는 독립 뉴클레오티드의 루프에 의해 연결된 센스 및 안티센스 서열로 구성되며, 전형적으로 더 큰 1차 전사물(pri-miRNA)의 일부로 발현되고, 이는 Drosha-DGCR8 복합체에 의해 절단되어 pre-miRNA로서 알려진 중간체를 생성시키며, 이는 후속적으로 Exportin-5에 의해 핵에서 수출되고, 세포질에 도달하면 Dicer에 의해 처리되어 기능적 siRNA를 생성시킨다. "인공 miRNA" 또는 "인공 miRNA 셔틀 벡터"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 듀플렉스 스템 루프(적어도 약 9-20개 뉴클레오티드)의 영역이 Drosha 및 Dicer 처리를 통해 절제되어 표적 유전자의 siRNA 서열로 대체되는 반면 스템 루프 내의 효과적인 Drosha 처리에 필요한 구조적 요소는 유지되는 1차 miRNA 전사물을 지칭한다. "인공"이라는 용어는 측면인접 서열(상류 ~35개 뉴클레오티드 및 하류 ~40개 뉴클레오티드)이 siRNA의 다중 클로닝 부위 내의 제한 효소 부위에서 발생한다는 사실에서 유래한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "miRNA"라는 용어는 자연적으로 발생하는 miRNA 서열과 인공적으로 생성된 miRNA 셔틀 벡터를 모두 포함한다.
siRNA는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 합성적 최소 폴리아데닐화 신호 또는 6개의 T의 서열이다.
RNAi의 설계에 siRNA의 특성, 침묵 효과의 내구성, 및 전달 시스템 선택 등 고려해야 할 인자가 다수 존재한다. RNAi 효과를 내기 위해 유기체에 도입되는 siRNA는 전형적으로 엑손 서열을 함유한다. 더욱이 RNAi 과정은 상동성에 따라 달라지므로, 유전자 특이성을 극대화하는 동시에 상동성이지만 유전자 특이성이 아닌 서열 간의 교차 간섭 가능성을 최소화하도록 서열을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게 siRNA는 siRNA 서열과 억제시키고자 하는 유전자 간에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 심지어 100% 이상의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와 약 80% 미만으로 동일한 서열은 상당히 덜 효과적이다. 따라서 siRNA와 억제시키고자 하는 유전자 간의 상동성이 클수록 관련 없는 유전자의 발현에 영향을 미칠 가능성이 줄어들 것이다.
또한, siRNA의 크기는 중요한 고려 사항이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 적어도 약 19-25개의 뉴클레오티드를 포함하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 siRNA 분자에 관한 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, siRNA는 바람직하게는 길이가 500, 200, 100, 50 또는 25개 뉴클레오티드 미만이다. 더욱 바람직하게, siRNA는 길이가 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드이다.
siRNA 표적은 일반적으로 폴리펩티드를 암호화하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드의 발현에 중요한 복제, 전사 또는 번역 또는 기타 과정을 조절하는 폴리뉴클레오티드 영역, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 영역과 발현을 조절하는 작동적으로 연결된 영역을 모두 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 세포에서 발현되는 모든 유전자가 표적이 될 수 있다. 바람직하게 표적 유전자는, 질병에 중요하거나 연구 대상으로서 특별한 관심사인 세포 활성의 진행에 관여하거나 연관된 것이다.
B. 비-암호화 RNA
cDNA 클로닝 프로젝트와 게놈 타일링 어레이(genomic tiling array)에서 입증된 바와 같이, 인간 게놈의 90% 초과가 전사를 거치지만 단백질을 암호화하지는 않는다. 이러한 전사 산물을 비-단백질 암호화 RNA(ncRNA)라고 지칭한다. 리보솜 RNA, 전이 RNA, 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 및 작은 인 RNA(snoRNA)와 같은 다양한 ncRNA 전사물은 세포 기능에 필수적이다. 마찬가지로, 마이크로 RNA(miRNA), 내인성 짧은 간섭 RNA(siRNA), PIWI 상호작용 RNA(piRNA), 및 작은 인 RNA(snoRNA)와 같은 많은 수의 짧은 ncRNA도 진핵 세포에서 중요한 조절 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 최근 연구에서는 세포 유형별 발현을 나타내고 특정 세포 내 구획에 국한되는 긴 ncRNA(lncRNA) 전사물 그룹이 입증되었다. lncRNA는 세포 발생 및 분화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로도 공지되어 있는데, 이는 상기가 진화 과정에서 선택되었다는 관점을 뒷받침한다.
lncRNA는 다양한 기능을 가지고 있는 것으로 보인다. 많은 경우, 단백질의 활성이나 국소화를 조절하는 역할을 하거나 세포 내 구조의 조직적 틀 역할을 하는 것으로 보인다. 다른 경우, lncRNA는 여러 개의 작은 RNA를 생성하도록 가공되거나 다른 RNA가 가공되는 방식을 조절할 수 있다. 공공 연구 컨소시엄인 GenCode(버전 #27)에서 생산한 최신 버전의 데이터는 인간 게놈에서 약 16,000개의 lncRNA를 카탈로그화하여 약 28,000개의 전사물을 생성시켰으며; 다른 데이터베이스를 포함하면, 40,000개가 넘는 lncRNA가 공지되어 있다.
흥미롭게도, lncRNA는 특정 게놈 위치에서 특정 표적 단백질의 발현에 영향을 미치고, 단백질 결합 상대의 활성을 조절하고, 크로마틴-변형 복합체를 그의 작용 부위로 유도하고, 전사-후 가공되어 수많은 5'-캡이 있는 작은 RNA를 생성시킬 수 있다. 후생유전적 경로도 lncRNA의 차등 발현을 조절할 수 있다.
증가하는 증거가 또한, 비정상적으로 발현된 lncRNA가 정상적인 생리학적 과정과 다양한 질병 상태에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. lncRNA는 허혈(ischaemia), 심장병(heart disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 건선(psoriasis), 및 8형 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia type 8)을 포함한 다양한 질병에서 잘못 조절된다. 이러한 잘못된 조절은 유방암, 대장암, 전립선암, 간세포암 및 백혈병과 같은 다양한 유형의 암에서도 나타났다. gadd74 및 lncRNA-RoR5와 같은 여러 lncRNA는 사이클린, 사이클린 의존성 키나제(CDK), CDK 억제제 및 p53과 같은 세포 주기 조절자를 조절하여 세포 주기 진행에 유연성과 견고성을 추가로 제공한다. 또한, 일부 lncRNA는, 동원체(kinetochore) 형성에 필수적이며 따라서 인간과 파리의 유사 분열 중 염색체 분리에 중요한 중심체 위성(centromeric satellite) RNA와 같은 유사 분열 과정과 연계되어 있다. 또 다른 핵 lncRNA인 MA-lincl은 세포 증식의 조절자인 이웃 유전자 Pura의 발현을 억제하기 위해 시스(cis)로 기능하여 M 단계 종료를 조절한다.
lncRNA는, 연장된 개방 판독 프레임(ORF)이 없는 200개 초과의 뉴클레오티드(예: 약 200 내지 약 1200 nt, 약 2500 nt 이상)의 전사물로서 통상 정의되는 그룹이다. "비-암호화 RNA"(ncRNA)라는 용어에는 lncRNA뿐만 아니라 약 200nt 미만, 예를 들어 약 30 내지 200 nt의 짧은 전사물도 포함된다.
따라서, 일부 구현예에서, 예를 들어 관심의 특정 뇌 구조로의 ncRNA의 전달은 비정상적인 RNA 발현 수준을 교정하거나 질병을 유발하는 lncRNA의 수준을 조절한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 바이러스 게놈이 치료학적 비-암호화 RNA(ncRNA)를 암호화하도록 가공된 rAAV를 제공한다. 일부 구현예에서, ncRNA는 길이가 약 200개 뉴클레오티드(nt) 이상인 긴 비-암호화 RNA(lncRNA)이다. 일부 구현예에서, 치료제는 길이가 약 25 nt 또는 약 30 nt 내지 약 200 nt인 ncRNA이다. 일부 구현예에서, lncRNA는 길이가 약 200 nt 내지 약 1,200 nt이다. 일부 구현예에서, lncRNA는 길이가 약 200 nt 내지 약 1,100, 약 1,000, 약 900, 약 800, 약 700, 약 600, 약 500, 약 400 또는 약 300 nt이다.
C. CRISPR 시스템
유전자 편집은 살아있는 세포 내에서 표적 유전자를 수정할 수 있는 기술이다. 최근, CRISPR의 박테리아 면역 체계를 활용하여 주문형 유전자 편집을 수행함으로써 과학자들이 게놈 편집에 접근하는 방식에 혁명을 일으켰다. RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제인 CRISPR 시스템의 Cas9 단백질은 안내 RNA 서열을 변경하여 비교적 쉽게 새로운 부위를 표적화하도록 조작될 수 있다. 이 발견으로 서열 특이적 유전자 편집이 기능적으로 유효하게 되었다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현 또는 활성 지시에 관여하는 전사물 및 기타 요소를 통틀어 지칭하며, 여기에는 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(전사 활성화 CRISPR) 서열(예: tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-짝 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복" 및 tracrRNA-처리된 부분 직접 반복 포함), 안내 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"라고도 함) 및/또는 CRISPR 유전자좌의 기타 서열 및 전사물이 포함된다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비-암호화 RNA 분자(안내) RNA, 및 뉴클레아제 기능(예: 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예: Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 유형 I, 유형 II 또는 유형 III CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다, 예를 들어 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같이, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래할 수 있다.
CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 유도한 후, 본원에서 논의된 바와 같이 파괴를 일으킬 수 있다. 다른 구현예에서, "닉카제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nicking)하는 데 사용된다. 예를 들어, 특이성을 개선시키기 위해 쌍을 이룬 닉카제를 사용할 수 있으며, 각각은 닉이 동시에 도입될 때 5' 오버행이 도입되도록 서열을 표적화하는 한 쌍의 상이한 gRNA에 의해 지시된다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제제(예: KRAB) 또는 활성제와 같은 이종 효과기 도메인에 융합된다. 대안적으로, 촉매적으로 불활성화된 Cas9를 갖는 CRISPR 시스템은 리보솜 결합 단백질에 융합된 전사 억제제 또는 활성제를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물 포함)를 세포에 도입시킨다. 일반적으로, gRNA의 5' 단부에 있는 표적 부위는 상보적 염기 짝짓기를 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위(예: 유전자)에 표적화한다. 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 5' 바로 옆의 위치를 기준으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 안내 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개의 뉴클레오티드를 표적 DNA 서열에 상응하도록 수정함으로써 원하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소에 의해 특성화된다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 안내 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 이때 표적 서열과 안내 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 일으키고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진할 만큼 충분한 상보성이 있는 경우, 완전한 상보성이 반드시 필요하지는 않다.
표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 모든 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 세포소기관 내부와 같은 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적 위치로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"이라고 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형이라고 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 안내 서열 포함)의 형성은 표적 서열 내부 또는 근처(예: 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 이내)의 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부(예: 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한, 안내 서열에 작동적으로 연결된 tracr 짝 서열의 전부 또는 일부에 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 하이브리드화하는 것과 같이, CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 tracr 짝 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한 상보성, 예를 들어 최적으로 정렬될 때 tracr 짝 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터를 세포에 도입시켜 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 구성 요소는 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-짝 서열에 연결된 안내 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터에 있는 별도의 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있다. Cas 효소는 본원에 개시된 바와 같이, 조절된 대안의 스플라이싱 사건의 조절 하에서 키메라 표적 유전자 미니유전자로서 또는 키메라 미니유전자 전사촉진자에 대한 표적 유전자로서의 표적 유전자일 수 있다. gRNA는 구성적 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소를 단일 벡터에, 첫 번째 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성 요소를 제공하는 하나 이상의 추가 벡터와 함께 병용할 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(또한 "클로닝 부위"라고도 함)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 여러 개의 상이한 안내 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여, CRISPR 활성을 여러 개의 상이한, 세포 내 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다.
벡터는 CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열(예: Cas 단백질)에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(또한 Csn1 및 Csx12로서 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체 또는 이들의 변형된 버전이 있다. 이들 효소는 공지되어 있다; 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 SwissProt 데이터베이스 수탁 번호 Q99ZW2에서 찾을 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9(예: 에스. 피오게네스 또는 에스. 뉴모니아(S. pneumonia)로부터 유래)일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예를 들어 표적 서열 내부 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 하나 또는 두 가닥 모두를 절단하도록 지시할 수 있다. 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥 모두를 절단하는 능력이 없도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스로부터 유래된 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인 중의 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를, 두 가닥을 모두 절단하는 뉴클레아제에서 닉카제(단일 가닥 절단)로 전환시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 안내 서열(들)(예: DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 2개의 안내 서열)과 조합하여 사용될 수 있다. 이 조합은 두 가닥을 모두 닉킹되게 하여 NHEJ 또는 HDR을 유도하는 데 사용되게 할 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 비-인간 영장류를 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유류와 같은 특정 유기체의 세포이거나 이로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을, 고유 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번히 또는 가장 빈번히 사용되는 코돈으로 대체하여 관심 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 보인다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율성과 상관관계가 있으며, 이는 차례로 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전사 RNA(tRNA) 분자의 가용성을 포함한 여러 가지 사항에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번히 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
일반적으로, 안내 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열에의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때 안내 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다.
최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이에 대한 비제한적인 예로는 the Smith-Waterman 알고리즘, the Needleman-Wunsch 알고리즘, the Burrows-Wheeler Transform 기반 알고리즘(예: the Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, San Diego, Calif.), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 입수할 수 있음), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 입수할 수 있음) 등이 있다.
CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열 및 임의로 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 비제한적으로, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인이 포함된다. 에피토프 태그의 비제한적인 예로는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그가 있다. 리포터 유전자의 예로는 글루타치온-5-트랜스퍼라제(GST), 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP)을 포함한 자가 형광 단백질이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는, DNA 분자와 결합하거나 다른 세포 분자와 결합하는 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있으며, 여기에는 비제한적으로 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 도메인 융합, 및 헤르페스 단순 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합이 포함된다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가 도메인은 본원에 참고로 포함된 US 20110059502에 기재되어 있다.
D. 치료 단백질
일부 구현예는 하기에 나열된 것과 같은 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 발현에 관한 것이다.
아포지단백질 E2. 아포지단백질 E(APOE)는 포유류의 체내 지방 대사에 관여하는 단백질이다. 하위유형은 알츠하이머병과 심혈관 질환에 연루되어 있다. APOE는 아포지단백질이라고 하는 지방-결합 단백질 계열에 속한다. 순환계에서, 상기는 킬로미크론 잔여물, VLDL, IDL 및 일부 HDL을 포함한 여러 부류의 지단백질 입자의 일부로서 존재한다. APOE는 트리글리세라이드-풍부 지단백질의 통상적인 가공(분해)에 필수적인 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)와 유의미하게 상호작용한다. 말초 조직에서 APOE는 주로 간과 대식세포에 의해 생성되며 콜레스테롤 대사를 매개한다. 중추 신경계에서 APOE는 주로 성상세포에 의해 생성되며 저밀도 지단백질 수용체 유전자 계열의 구성원인 APOE 수용체를 통해 콜레스테롤을 뉴런으로 운반한다. APOE는 뇌의 주요 콜레스테롤 담체이다. APOE는 성상세포에서 뉴런으로 콜레스테롤을 운반하는 데 필요하다. APOE는 활성화된 C1q와 복합체를 형성하여 고전적 보체 경로의 체크포인트 억제제로서 적격이다. APOE는 포유류 신체의 지방 대사에 관여하는 단백질이다. 하위유형은 알츠하이머병과 심혈관 질환에 연루되어 있다.
APOE는 299개 아미노산 길이이고 여러 개의 양친매성 α-나선을 함유한다. 결정학 연구에 따르면 힌지 영역이 단백질의 N- 및 C-말단 영역을 연결한다. N-말단 영역(잔기 1-167)은 비-극성 면이 단백질 내부를 향하도록 역평행 4-나선 다발을 형성한다. 한편, C-말단 도메인(잔기 206-299)은 큰 노출된 소수성 표면을 형성하고 수소 결합과 염-가교를 통해 N-말단 나선 다발 도메인의 표면과 상호작용하는 3개의 α-나선을 포함한다. C-말단 영역에는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 결합 부위도 포함된다.
APOE는 다형성이며, 3개의 주요 대립유전자(엡실론 2, 엡실론 3, 엡실론 4): APOE-ε2(cys112, cys158), APOE-ε3(cys112, arg158), 및 APOE-ε4(arg112, arg158)를 갖는다. 이러한 대립유전자 형태는 112번 및 158번 위치에서 단지 아미노산 하나 또는 2개만 상이하지만, 이러한 차이가 APOE의 구조와 기능을 변경시킨다.
2012년 현재, E4 변이체가 다양한 인종 집단에서 늦은-발병 산발성 알츠하이머병(AD)에 대한 가장 큰 유전적 위험 요인으로 공지되었다. 그러나 E4 변이체는 모든 인구에서 위험과 상관관계가 있는 것은 아니다. 나이지리아인은 세계 인구에서 APOE4 대립유전자의 관찰 빈도가 가장 높지만, 그들 사이에 AD는 드물다. 이는 콜레스테롤 수치가 낮기 때문일 수 있다. 2개의 E4 대립유전자를 보유한 백인과 일본인은 E4 대립유전자를 전혀 보유하지 않은 사람에 비해 75세까지 AD를 발병할 위험이 10 내지 30배 더 높다. 이는 아밀로이드와의 상호 작용으로 인해 발생할 수 있다. 알츠하이머병은 펩티드 베타-아밀로이드 응집체가 축적되는 것이 특징이다. 아포지단백질 E는 세포 내부와 세포 사이에서 이 펩티드의 단백질 분해를 증가시킨다. 동형(isoform) APOE-ε4는 이러한 반응을 촉진하는 데 다른 것만큼 효과적이지 않아, 해당 유전자 변이가 있는 개인에서 AD에 대한 취약성이 증가한다.
AD 환자의 40 내지 65%가 ε4 대립유전자를 하나 이상 가지고 있지만 APOE4는 이 질병의 결정인자가 아니다. AD 환자의 적어도 1/3은 APOE4 음성이며 일부 APOE4 동형접합체는 결코 이 질병을 나타내지 않는다. 그러나 2개의 ε4 대립유전자를 갖는 사람은 AD를 발병할 위험이 최대 20배 더 높다. 또한 APOE2 대립유전자가 AD에서 보호 역할을 할 수 있다는 증거가 존재한다. 따라서 알츠하이머병에 가장 취약하고 어린 나이에 발병할 위험이 가장 높은 유전자형은 APOE4,4이다. 유전자형 APOE3,3을 벤치마크로 하고(이 유전자형을 가진 사람은 위험 수준이 1.0인 것으로 간주됨) 오직 백인의 경우에, 유전자형 APOE4,4를 가진 개인은 알츠하이머병을 발병할 오즈비(odds ratio)가 14.9이다. APOE3,4 유전자형을 가진 개인은 3.2의 오즈비를 가지고 있으며, 2 대립유전자와 4 대립유전자 사본을 가진 사람(APOE2,4)은 2.6의 오즈비를 갖는다. 2 대립유전자와 3 대립유전자 사본을 각각 한 개씩 가진 사람(APOE2,3)은 오즈비가 0.6이다. 2 대립유전자 사본을 2개 가진 사람(APOE2,2)도 오즈비가 0.6이다.
추가의 예시적인 치료 단백질로는 분비 항체, 나노바디, 트리펩티딜 펩티다제 1(TPP1), 설파미다제(SGSH), 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(PPT1), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 알파-L-이두로니다제(IDUA), 갈락토세레브로시다제(GALC), CLN6 막관통 ER 단백질(CLN6), 베타-갈락토시다제(GLB1), 베타-헥소스아미니다제 A 알파 서브유닛(HEXA), 설파타제 변형 인자 1(SUMF1), 알파-d-만노시다제(MAN2B1), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 헤파란-알파-글루코스아미니드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT), 및 알파-N-아세틸글루코스아미니다제(NAGLU)가 있다.
본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"의 기능 또는 활성을 언급할 때, 당해 분야의 통상의 기술자는 이것이 예를 들어, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 추가적인 이점을 가진 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. "변형된 단백질"에 관한 구현예가 "변형된 폴리펩티드"에 관하여 구현될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다는 것이 구체적으로 고려된다.
재조합 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있다; 따라서 결실이 있는 단백질, 치환이 있는 단백질, 결실 및 치환이 있는 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이러한 단백질은 예를 들어 융합 단백질 또는 링커가 있는 단백질과 같이 삽입 또는 추가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 고유 단백질 중 하나 이상의 잔기가 없지만 상기 고유 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 단백질이 투여되는 유기체와 같은 특정 유기체에서 항원성으로 결정된 단백질의 영역으로부터 아미노산 잔기가 결실된 것이다.
치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질 내 하나 이상의 부위에서 한 아미노산을 또 다른 아미노산으로 교환하는 것을 함유하며, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수도 있고 아닐 수도 있다. 즉, 한 아미노산이 유사한 모양 및 전하를 가진 아미노산으로 대체된다. 보존적 치환은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어 하기의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라진에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르트산에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라진으로; 글루타메이트에서 아스파테이트로; 글리신에서 프로린으로; 히스티딘에서 아스파라진 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로.
결실 또는 치환 외에, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 가질 수 있으며, 이는 전형적으로 폴리펩티드에 적어도 하나의 잔기를 추가하는 것을 수반한다. 여기에는 표적 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입이 포함될 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 추가는 하기에서 설명한다.
문헌[Gonzalez et al., BMC Neurosci 10.1186/1471-2202-12-4 (2011)]은 맥락막 신경총 외식편(explant)과 파지를 배양하고 표적화 능력이 있는 입자를 회수함으로써 CP 상피 세포로 내재화(internalization)할 수 있는 리간드에 대한 M13 박테리오파지 상의 펩티드 라이브러리를 스크리닝하였다. 4차례의 스크리닝 후 식별된 3개의 펩티드를, 특이적이고 용량 의존적인 결합 및 내재화에 대해 분석하였다. 내재화는 동족 합성 펩티드와의 공-배양에 의해 방지되었기 때문에, 결합은 특이적인 것으로 간주되었다. 또한, 래트 뇌에 i.v.c. 주입 후, 각 펩티드는 CP의 상피 세포와 뇌실 내벽의 뇌실막에 파지를 표적화하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 펩티드는 본원에 기재된 AAV 벡터에 사용될 수 있다.
"생물학적으로 기능상 동등한"이라는 용어는 당업계에서 잘 이해되고 있으며, 본원에서 더 상세히 정의된다. 따라서, 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한, 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%의 대조용 폴리펩티드의 아미노산과 동일하거나 기능상 동등한 아미노산을 갖는 서열이 포함된다. 재조합 단백질은 특정 양태에서 그의 고유 대응물과 생물학적으로 기능상 동등할 수 있다.
또한 아미노산 및 핵산 서열은 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가적인 잔기를 포함할 수 있지만, 단백질 발현과 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여 서열이 상기에 제시된 기준을 충족하는 한, 여전히 본질적으로 본원에 개시된 서열 중 하나에 제시된 바와 같을 수 있다는 점도 이해될 것이다. 말단 서열의 추가를 특히, 예를 들어 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 하나에 측면인접한 다양한 비-암호화 서열을 포함하거나 유전자 내에 존재하는 것으로 공지된 다양한 내부 서열, 즉 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로, 약 200개 초과 내지 최대 유전자로부터 번역된 전장 서열까지의 단백질; 약 100개 초과 아미노산의 폴리펩티드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개 아미노산의 펩티드를 지칭하지만 이에 제한되지 않는다. 편의상, "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본 원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "아미노산 잔기"는 자연적으로 발생하는 임의의 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 당업계에 공지된 임의의 아미노산 모방물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 순차적이며, 아미노산 잔기의 서열을 중단시키는 어떠한 비-아미노산도 없다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, "단백질 또는 펩티드"라는 용어는 자연적으로 발생하는 단백질에서 발견되는 20개의 일반적인 아미노산 중 적어도 하나 또는 적어도 하나의 변형되거나 특이한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 치료 단백질을 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 리더 서열을 사용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기와 같은 단백질 친화성 태그, 또는 항체 에피토프와 같은 면역학적으로 활성인 도메인(바람직하게는 절단성인)을 추가하여 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 것을 포함한다. 비제한적인 친화성 태그에는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)가 포함된다.
융합 단백질의 생성 방법은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 완전한 융합 단백질의 드노보(de novo) 합성 또는 이종 도메인을 암호화하는 DNA 서열의 부착에 이어서, 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.
모 단백질의 기능적 활성을 회복시키는 융합 단백질의 생성은 탠덤으로 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱되는 펩티드 링커를 암호화하는 가교 DNA 분절로 유전자들을 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이를 가질 것이다.
III. 치료 및 투여 방법
바이러스 벡터는 일부 양태에서 환자에게 직접 투여되거나(생체내) 또는 시험관내 또는 생체외에서 세포를 치료하는 데 사용되며, 이어서 환자에게 투여될 수 있다. 특히, 본원은 뇌실막에서 트랜스유전자의 발현을 유도하는 방법을 제공한다. 이러한 구현예 중 일부에서, 대상체는 뇌 또는 신경 장애를 가지고 있으며, 트랜스유전자가 치료 유효량으로 전달된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 표적 조직 세포의 적어도 약 70%를 형질도입하고;. AVV는 내부 털세포 및 외부 털세포를 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 효율, 심지어 100% 정도로 높은 효율로 표적화한다. 일부 구현예에서, 세포는 뇌실의 세포, 예를 들어 뇌실막 세포이다.
뇌실막은 뇌의 뇌실계와 척수 중심관 내벽의 신경상피(단순 원주형 섬모 상피)이다. 뇌실막은 중추신경계(CNS)의 4가지 유형의 신경아교세포 중 하나이다. 이는 뇌척수액(CSF)의 생성에 관여하며 신경 재생을 위한 저장소 역할을 하는 것으로 나타났다. 뇌실막은 신경교 세포의 한 유형인 뇌실막세포라고 칭하는 뇌실막의 세포로 구성된다. 이 세포는 뇌의 뇌실과 척수 중심관의 내벽을 형성하며, 뇌척수액으로 충전되게 된다. 이들은 일부 점막 상피 세포와 매우 유사한 단순 원주 모양의 신경 조직 세포이다. 초기 단섬모 뇌실막은 순환하는 뇌척수액에서 기능하기 위해 다중섬모 뇌실막으로 분화된다. 이 세포의 기저막은 성상세포에 부착하는 촉수와 같은 확장을 특징으로 한다. 정점부는 섬모 및 미세융모로 덮여 있다.
"벡터"라는 용어는 작은 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예: AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터), 또는 핵산의 삽입 또는 통합에 의해 조작될 수 있는 다른 비히클을 지칭한다. 바이러스 벡터와 같은 벡터는 핵산 서열을 세포로 도입/전달하는 데 사용될 수 있으며, 그 안의 핵산 서열이 전사되고, 단백질을 암호화하는 경우, 세포에 의해 번역된다.
이러한 조성물을 사용하여 뇌 또는 중추 신경계의 상태를 치료할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 표 A에 있는 해당 서열 목록을 사용하여, 상태 치료가 필요한 대상체에서 표 A에 나열된 상태를 치료하는 데 사용된다.
임의의 적합한 세포 또는 포유류는 본원에 기재된 방법 또는 용도에 의해 투여되거나 치료될 수 있다. 전형적으로, 본원에 기재된 방법이 필요한 포유류는 질병 상태와 관련된 비정상적 또는 이상 단백질을 갖거나 발현하는 것으로 의심된다. 대안적으로, 포유류 수용자는 유전자 대체 요법이 잘 듣는(amenable) 상태를 가질 수 있다. 본원에 사용된 "유전자 대체 요법"은 치료제를 암호화하는 외인성 유전 물질을 수용자에게 투여하고 투여된 유전 물질을 제자리에서 후속적으로 발현시키는 것을 지칭한다. 따라서 "유전자 대체 요법이 잘 듣는 상태"라는 문구는 유전 질환(즉, 하나 이상의 유전자 결함에 기인하는 질병 상태) 및 후천적 병리(즉, 선천적 결함에 기인하지 않는 병리적 상태)와 같은 상태를 포괄한다. 따라서 본원에 사용된 바와 같이, "치료제"라는 용어는 포유류 수용자에게 유익한 효과가 있는 임의의 작용제 또는 물질을 지칭한다. 따라서 "치료제"는 핵산 또는 단백질 성분을 갖는 치료 및 예방 분자를 모두 포괄한다.
포유류의 비제한적 예로는 인간, 비-인간 영장류(예: 원숭이, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이, 마카크 원숭이 등), 가축(예: 개와 고양이), 농장 동물(예: 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(예: 마우스, 래트, 토끼, 기니피그)이 있다. 특정 구현예에서, 포유류는 인간이다. 특정 구현예에서, 포유류는 비-설치류 포유류(예: 인간, 돼지, 염소, 양, 말, 개 등)이다. 특정 구현예에서, 비-설치류 포유류는 인간이다. 포유류는 임의의 연령 또는 임의의 발달 단계(예: 성인, 청소년, 아동, 유아 또는 자궁 내 포유류)일 수 있다. 포유류는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 특정 구현예에서 포유류는 동물 질병 모델, 예를 들어 질병 상태와 관련된 비정상적 또는 이상 단백질을 갖거나 발현하는 동물 모델 또는 질병 상태를 유발하는, 단백질의 불충분 발현을 갖는 동물 모델일 수 있다.
본원에 기재된 방법 또는 조성물에 의해 치료되는 포유류(대상체)에는 성인(18세 이상) 및 아동(18세 미만)이 포함된다. 성인에는 노인이 포함된다. 전형적인 성인은 50세 이상이다. 아동의 연령은 1-2세 또는 2-4세, 4-6세, 6-18세, 8-10세, 10-12세, 12-15세 및 15-18세이다. 아동은 또한 유아를 포함한다. 유아는 전형적으로 생후 1-12개월이다.
특정 구현예에서, 방법은 본원에 제시된 바와 같이 포유류에 다수의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 신경퇴행성 질환과 같은 질병 상태의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도, 진행 또는 발병 시간이 감소되거나, 줄어들거나, 예방되거나, 억제되거나, 지연된다. 특정 구현예에서, 방법은 신경퇴행성 질환과 같은 질병 상태의 부작용을 치료하기 위해 포유류에 다수의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 신경퇴행성 질환과 같은 질병 상태의 증상의 악화 또는 진행을 안정화, 지연 또는 예방하거나, 또는 역전 및 거스르기 위해 포유류에 다수의 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 한 가지 방법은 본원에 제시된 바와 같은 다수의 바이러스 입자를 포유류의 중추 신경계 또는 그 일부에 투여하는 단계를 포함하고, 신경 퇴행성 질환과 같은 질병 상태의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도, 진행 또는 발병 시간이 적어도 약 5일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 25일, 약 25일 내지 약 50일, 또는 약 50일 내지 약 100일까지 감소되거나, 줄어들거나, 예방되거나, 억제되거나 지연된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 치료학적으로 유효한 수의, 트랜스유전자를 함유하거나 또는 하나 이상의 상이한 바이러스 입자 세트를 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 조성물(여기서 한 세트의 각 입자는 동일한 유형의 트랜스유전자를 함유할 수 있지만, 각 입자 세트는 다른 세트와 상이한 유형의 트랜스유전자를 함유한다)을 전달할 수 있다.
본 개시내용에 따른 제형을 다양한 기법 및 경로, 예를 들어 비제한적으로 실질내, 뇌내, 뇌실내(ICV), 척추강내(예: IT-요추, IT-흉부, IT-대조(cisterna magna)) 투여 및 CNS 및/또는 CSF에 직접 또는 간접적으로 주입하는 임의의 다른 기법 및 경로를 통해 CNS에 전달하는 데 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 제형을 치료가 필요한 대상체의 뇌척수액(CSF)에 투여함으로써 CNS에 전달한다. 일부 구현예에서, 경막내 투여를 사용하여 바이러스 입자를 CSF에 전달한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 경막내 투여(경막내 주사라고도 함)는 척추관(척수를 둘러싼 경막내 공간)에의 주사를 지칭한다. 다양한 기법을 사용할 수 있으며, 여기에는 굴 또는 낭 또는 요추 천자 등을 통한 측뇌실 주사 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 방법은 문헌[Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 18:143-192 (1991)] 및 문헌[Ommaya et al., Cancer Drug Delivery, 1:169-179 (1984)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따르면, 바이러스 입자는 척추관 주변의 모든 영역에 주입될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 요추 영역 또는 대조에 주입되거나 뇌실내로 뇌실 공간에 주입된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "요추 영역" 또는 "요추 부위"라는 용어는 3번째와 4번째 요추(허리) 척추 사이의 부위, 및 보다 포괄적으로, 척추의 L2-S1 영역을 지칭한다. 전형적으로, 요추 영역 또는 요추 부위를 통한 척추강 내 주입은 "요추 IT 전달" 또는 "요추 IT 투여"라고도 한다. "대조"라는 용어는 두개골과 척추 상단 사이의 개구부를 경유한 소뇌 주변 및 아래의 공간을 지칭한다. 전형적으로, 대조를 통한 척추강 내 주입을 또한 "대조 전달"이라고도 지칭한다. "뇌실"이라는 용어는 척수의 중심관과 연속되는 뇌의 공동을 지칭한다. 따라서 척추강 내 투여에는 중심관으로의 모든 주입이 포함된다. 전형적으로 뇌실 공동을 통한 주입을 뇌실 내(ICV) 전달이라고 지칭한다.
다양한 장치가 본 개시내용에 따라 척추강 내 투여에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 척추강 내 투여를 위한 장치는 유체 접근 포트(예: 주입 포트); 유체 접근 포트와 유체 연통하는 제1 유동 오리피스, 및 척수에 삽입하도록 배열된 제2 유동 오리피스를 갖는 중공 본체(예: 카테터); 및 척수에 중공 본체의 삽입을 고정하기 위한 고정 기구를 포함한다. 다양한 구현예에서, 유체 접근 포트는 저장소를 포함한다. 일부 구현예에서, 유체 접근 포트는 기계적 펌프(예: 주입 펌프)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이식된 카테터는 저장소(예: 볼루스 전달용) 또는 주입 펌프에 연결된다. 유체 접근 포트는 이식되거나 외부에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 척추강 내 투여를 요추 천자(즉, 느린 볼루스) 또는 포트 카테터 전달 시스템(즉, 주입 또는 볼루스)을 통해 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 카테터를 요추 척추의 층 사이에 삽입하고 팁을 척추강 공간을 통해 원하는 수준(일반적으로 L3-L4)까지 나사로 고정한다.
척추강 내 투여에 적합한 단일 용량 부피는 전형적으로 적다. 전형적으로, 본 개시내용에 따른 척추강 내 전달은 대상체의 CSF의 조성뿐만 아니라 두개내 압력의 균형을 유지한다. 일부 구현예에서, 척추강 내 전달은 대상체로부터 상응하는 CSF의 제거 없이 수행된다. 일부 구현예에서, 적합한 단일 용량 부피는 예를 들어 약 10 ㎖, 8 ㎖, 6 ㎖, 5 ㎖, 4 ㎖, 3 ㎖, 2 ㎖, 1.5 ㎖, 1 ㎖ 또는 0.5 ㎖ 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 단일 용량 부피는 약 0.5-5 ㎖, 0.5-4 ㎖, 0.5-3 ㎖, 0.5-2 ㎖, 0.5-1 ㎖, 1-3 ㎖, 1-5 ㎖, 1.5-3 ㎖, 1-4 ㎖ 또는 0.5-1.5 ㎖일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 척추강 내 전달은 먼저 원하는 양의 CSF를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 약 10 ㎖ 미만(예: 약 9 ㎖, 8 ㎖, 7 ㎖, 6 ㎖, 5 ㎖, 4 ㎖, 3 ㎖, 2 ㎖, 1 ㎖ 미만)의 CSF가 IT 투여 전에 먼저 제거된다. 이러한 경우, 적합한 단일 용량 부피는 예를 들어 약 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖, 15 ㎖ 또는 20 ㎖ 초과일 수 있다.
다양한 다른 장치를 사용하여 치료 조성물의 척추강 내 투여를 수행할 수 있다. 예를 들어, 원하는 효소를 함유하는 제형을 수막암종증(meningeal carcinomatosis)에 대한 약물을 척추강 내 투여하는 데 통상적으로 사용되는 Ommaya 저장소를 사용하여 제공할 수 있다(Ommaya, Lancet 2: 983-84, 1963). 보다 구체적으로, 이 방법에서 뇌실 튜브를 전각에 형성된 구멍을 통해 삽입하고, 두피 아래에 설치된 Ommaya 저장소에 연결하고, 저장소를 피하로 천공하여 대체되는 특정 효소를 척추강 내로 전달하며, 이는 저장소에 주입된다. 개인에게 치료 조성물 또는 제형을 척추강 내 투여하기 위한 다른 장치는 본원에 참조로 포함된 미국특허 제6,217,552호에 기재되어 있다. 대안적으로, 바이러스 입자를 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입을 통해 척추강 내로 제공할 수 있다. 투여량 치료는 단일 투여 또는 다중 투여의 형태일 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시내용의 한 구현예에서, 바이러스 입자를 대상체의 뇌에서 측뇌실 주입을 통해 투여한다. 주입은 예를 들어 대상체의 두개골에 만든 천공을 통해 이루어질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 입자 및/또는 다른 약제학적 제형을 대상체의 뇌실에 수술적으로 삽입된 션트를 통해 투여한다. 예를 들어, 주입이 측뇌실(더 크다) 내로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 세 번째 및 네 번째 더 작은 뇌실에 주입할 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용에서 사용된 약제학적 조성물은 대상체의 대조 또는 요추 부위에의 주입에 의해 투여된다.
IV. 약제학적 조성물
본원에 사용되는 바와 같이 "약제학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"이라는 용어는 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용되는 조성물, 제형, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약제학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 물질이 아니다, 예를 들어 물질은 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물, "약제학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는" 제형 및 조성물은 멸균될 수 있다. 이러한 약제학적 제형 및 조성물을 예를 들어 대상체에게 바이러스 입자를 투여하는 데 사용할 수 있다.
이러한 제형 및 조성물은 약제 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달에 적합한 용매(수성 또는 비-수성), 용액(수성 또는 비-수성), 유화액(예: 수중유적형 또는 유중수적형), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비-수성 용매, 용액 및 현탁액에는 현탁제 및 증점제가 포함될 수 있다. 보충 활성 화합물(예: 보존제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)도 제형 및 조성물에 통합될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제에는 조성물을 수용하는 개인에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제학적 작용제가 포함된다. 약제학적으로 허용되는 부형제에는 소르비톨, 트윈 80, 및 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 상기 중에 포함될 수 있다. 또한, 계면활성제, 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 본원에 제시되거나 당업계의 숙련가에게 공지된 바와 같이 특정한 투여 또는 전달 경로와 호환되도록 제형화될 수 있다. 따라서 약제학적 조성물에는 다양한 경로에 의한 투여 또는 전달에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제가 포함된다.
바이러스 입자의 주사 또는 주입에 적합한 약제학적 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액이 포함될 수 있으며, 이들은 임의로 리포솜에 캡슐화된, 멸균 주사성 또는 주입성 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적합하다. 모든 경우에, 최종 형태는 멸균 유체이고 제조, 사용 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성을, 예를 들어 리포좀 형성, 분산액의 경우 필요한 입자 크기 유지 또는 계면활성제 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 등장제, 예를 들어 당, 완충액 또는 염(예: 염화나트륨)이 포함될 수 있다. 주사성 조성물의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 사용함으로써 일어날 수 있다.
바이러스 입자의 용액 또는 현탁액은 하기 성분 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다: 주사용수와 같은 멸균 희석제, 포스페이트 완충 식염수(PBS)와 같은 식염수 용액, 인공 CSF, 계면활성제, 고정유, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 글리세린 또는 기타 합성 용매; 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등과 같은 항균 및 항진균제; 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절제.
본 개시내용의 조성물, 방법 및 용도에 적합한 약제학적 제형, 조성물 및 전달 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 하기 문헌을 참조하시오: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315).
바이러스 입자 및 그 조성물을 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 단위 투여형으로 제형화할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 단위 투여형은 치료할 개인에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 단위 투여형은 원하는 효과를 생성시키는 데 필요하다고 생각되는 바이러스 입자의 수에 따라 달라진다. 필요한 양은 단일 용량으로 제형화되거나 다중 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 용량은 적절한 바이러스 입자 농도로 조정될 수 있으며, 임의로 소염제와 결합되고, 사용을 위해 패키징될 수 있다.
한 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료 유효량, 즉 문제의 질병 상태의 증상이나 부작용을 감소시키거나 개선하기에 충분한 양 또는 원하는 이득을 부여하기에 충분한 양을 제공하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단위 투여형"은 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 임의로 약제학적 담체(보조제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 함께, 하나 이상의 용량으로 투여될 때 원하는 효과(예: 예방 또는 치료 효과)를 생성하도록 계산된 소정량을 함유한다. 단위 투여형은, 예를 들어 앰플 및 바이알 내에 있을 수 있으며, 이들은 액체 조성물 또는 동결-건조되거나 또는 동결건조된 상태의 조성물을 포함할 수 있고; 멸균 액체 담체는, 예를 들어 생체내에서 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별적인 단위 투여형은 다중 투여 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 따라서 예를 들어, 바이러스 입자 및 그 약제학적 조성물은 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여형으로 패키징될 수 있다.
바이러스 입자를 함유하는 제형은 전형적으로 유효량을 함유하며, 상기 유효량은 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 결정된다. 바이러스 입자는 전형적으로 조성물의 약 1% 내지 약 95%(w/w)의 범위, 또는 적합한 경우 훨씬 더 많을 수 있다. 투여되는 양은 치료를 고려하는 포유류 또는 인간 대상체의 나이, 체중 및 신체 상태와 같은 인자에 따라 달라진다. 유효 투여량은 당업계의 숙련가에 의해 용량 반응 곡선을 확립하는 통상적인 시험을 통해 확립될 수 있다.
V. 정의
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "트랜스유전자"라는 용어는 본원에서 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드에는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 및 억제 DNA 또는 RNA(RNAi, 예: 작은 또는 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작은 또는 짧은 간섭(si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA 또는 안티센스 RNA)가 포함된다. 폴리뉴클레오티드에는 자연적으로 발생하거나, 합성되거나, 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예: 변이 핵산)가 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥, 선형 또는 원형일 수 있으며, 임의의 적합한 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규약에 따라 본원에 기재될 수 있다.
폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 종종 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 축퇴성 코돈 치환을 또한 포함한다.
핵산은 개방 판독 프레임에 작동적으로 연결된 하나 이상의 발현 제어 또는 조절 요소를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 조절 요소는 포유류 세포에서 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 지시하도록 구성된다. 발현 제어/조절 요소의 비제한적 예로는 전사 개시 서열(예: 프로모터, 인핸서, TATA 박스 등), 번역 개시 서열, mRNA 안정성 서열, 폴리 A 서열, 분비 서열 등이 있다. 발현 제어/조절 요소는 임의의 적합한 유기체의 게놈으로부터 수득될 수 있다.
"프로모터"는 대개 암호화 서열의 상류(5')에 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이는 RNA 폴리머라제 및 적절한 전사에 필요한 다른 인자에 대한 인식을 제공함으로써 암호화 서열의 발현을 지시 및/또는 조절한다. pol II 프로모터에는 TATA-박스 및 임의로 전사 개시 부위를 지정하는 데 사용되는 다른 서열로 구성된 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터가 포함되며, 여기에 발현 제어를 위한 조절 요소가 추가된다. 1형 pol III 프로모터에는 전사 개시 부위 하류에 3개의 시스-작용 서열 요소가 포함된다: a) 5'서열 요소(A 블록); b) 중간 서열 요소(I 블록); c) 3'서열 요소(C 블록). 2형 pol III 프로모터에는 전사 개시 부위 하류에 2개의 필수적인 시스-작용 서열 요소가 포함된다: a) A 박스(5'서열 요소); 및 b) B 박스(3'서열 요소). 3형 pol III 프로모터에는 전사 개시 부위 상류에 여러 개의 시스-작용 프로모터 요소, 예를 들어 전통적인 TATA 박스, 근위 서열 요소(PSE), 및 원위 서열 요소(DSE)가 포함된다.
"인핸서"는 전사 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며 프로모터의 선천적 요소이거나 또는 발현 수준 또는 조직 특이성을 향상시키는 이종 요소일 수 있다. 이는 어느 방향으로든 작동할 수 있으며(5'->3' 또는 3'->5'), 프로모터의 상류 또는 하류에 위치하더라도 기능할 수 있다.
인핸서는 고유의 유전자로부터 전적으로 유래되거나, 자연에서 발견되는 다양한 요소로부터 유래된 다양한 요소로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 분절로 구성될 수도 있다. 인핸서는 자극적, 생리학적 또는 발달 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 효과를 조절/제어하는 단백질 요소의 결합에 관여하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
"트랜스유전자"는 편의상 세포 또는 유기체에 도입되거나 도입된 핵산 서열/폴리뉴클레오티드를 지칭하는 데 사용된다. 트랜스유전자에는 억제 RNA 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자와 같은 임의의 핵산이 포함되며 일반적으로 자연적으로 발생하는 AAV 게놈 서열과 관련하여 이종성이다.
"형질도입"이라는 용어는 벡터(예: 바이러스 입자)를 통해 핵산 서열을 세포 또는 숙주 유기체에 도입시키는 것을 지칭한다. 따라서 바이러스 입자에 의한 트랜스유전자의 세포로의 도입은 세포의 "형질도입"으로서 지칭될 수 있다. 트랜스유전자는 형질도입된 세포의 게놈 핵산에 통합될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 도입된 트랜스유전자가 수용 세포 또는 유기체의 핵산(게놈 DNA)에 통합하게 되면 이는 그 세포 또는 유기체에서 안정적으로 유지될 수 있으며, 수용 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체에 의해 추가로 전달되거나 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 트랜스유전자는 수용 세포 또는 숙주 유기체에서 염색체 외부에 또는 단지 일시적으로 존재할 수 있다. 따라서 "형질도입된 세포"는 형질도입을 통해 트랜스유전자가 도입된 세포이다. 따라서 "형질도입된" 세포는 트랜스유전자가 도입된 세포 또는 그 자손이다. 형질도입된 세포는 전파될 수 있고, 트랜스유전자는 전사될 수 있으며, 암호화된 억제 RNA 또는 단백질은 발현될 수 있다. 유전자 치료 용도 및 방법의 경우, 형질도입된 세포는 포유류 중에 있을 수 있다.
핵산/트랜스유전자는 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동적으로 연결"되며, 여기서 프로모터는 암호화된 폴리펩티드의 전사를 조절할 수 있다. 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 핵산을 또한 발현 카세트로서 지칭할 수 있다.
특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 CMV 인핸서를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "변형시키다" 또는 "변이체"라는 용어 및 그 문법적 변형은 핵산, 폴리펩티드 또는 그 하위서열이 참조 서열에서 벗어남을 의미한다. 따라서 변형 및 변이 서열은 참조 서열과 실질적으로 동일하거나 더 크거나 작은 발현, 활성 또는 기능을 가질 수 있지만 적어도 참조 서열의 일부 활성 또는 기능을 유지한다. 특정 유형의 변이체는 돌연변이 단백질로, 돌연변이, 예를 들어 미스센스 또는 넌센스 돌연변이가 있는 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 변이체는 야생형과 비교하여 유전적으로 변경된 변형된 서열을 지칭한다. 이 서열은 암호화된 단백질 서열의 변경 없이 유전적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 이 서열은 변이 단백질을 암호화하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한, 야생형 단백질 서열과 같은 참조 서열에 대한 적어도 부분적 서열 동일성을 유지하는 단백질을 암호화하도록 코돈 변형되었고 또한 변형 단백질을 암호화하도록 코돈-변형된 조합 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 그러한 핵산 변이체의 일부 코돈은 그에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 변경없이 변경될 것이며, 핵산 변이체의 일부 코돈이 변화될 것이고 이는 차례로 그에 의해 암호화된 단백질의 아미노산을 변화시킨다.
"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본원에 개시된 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "트랜스유전자"에 의해 암호화된 "폴리펩티드"에는, 자연적으로 발생하는 야생형 및 기능적 다형성 단백질과 마찬가지로, 부분 또는 전장 고유 서열, 폴리펩티드가 어느 정도의 기능 또는 활성을 유지하는 한, 이의 기능적 하위서열(단편) 및 이의 서열 변이체가 포함된다. 따라서 본 개시내용의 방법 및 용도에서, 핵산 서열에 의해 암호화된 이러한 폴리펩티드는, 결함이 있거나 또는 치료된 포유류에서 활성, 기능 또는 발현이 불충분하거나 결핍되거나 존재하지 않는 내인성 단백질과 동일할 필요는 없다.
변형의 비제한적 예로는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환(예: 약 1 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 500, 약 500 내지 약 750, 약 750 내지 약 1000개 이상의 뉴클레오티드 또는 잔기)이 있다.
아미노산 변형의 일례는 보존적 아미노산 치환 또는 결실이다. 특정 구현예에서 변형된 또는 변이 서열은 변형되지 않은 서열(예: 야생형 서열)의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 유지한다.
아미노산 변형의 또 다른 예는 바이러스 입자의 캡시드 단백질에 도입된 표적 펩티드이다. 재조합 바이러스 벡터를 중추 신경계, 예를 들어 특정 뇌 영역에 표적화하는 펩티드가 식별되었다.
이렇게 변형된 재조합 바이러스는 다른 유형의 조직(예: 간 조직)보다 한 유형의 조직(예: CNS 조직)에 우선적으로 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 바이러스는 필적하는 변형되지 않은 캡시드 단백질보다 더 높은 수준에서 결합함으로써 뇌 혈관 상피 조직을 "표적화"할 수 있다. 예를 들어, 변형된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 바이러스는 변형되지 않은 재조합 바이러스보다 50% 내지 100% 더 높은 수준에서 뇌 뇌실막 조직에 결합할 수 있다.
"핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 일부이다. 대부분의 유기체에서 데옥시리보핵산(DNA)은 유전 물질인 반면, 리보핵산(RNA)은 DNA에 포함된 정보를 단백질로 전달하는 데 관여한다. 개시된 뉴클레오티드 서열 및 단백질의 단편 및 변이체 또는 이에 의해 암호화된 부분 길이의 단백질도 본 개시내용에 포함된다. "단편" 또는 "일부"는 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이 또는 전체 길이 미만을 의미한다. 특정 구현예에서, 단편 또는 일부는 생물학적으로 기능적이다(즉, 야생형의 활성 또는 기능의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 유지함).
분자의 "변이체"는 고유 분자의 서열과 실질적으로 유사한 서열이다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 변이체는 유전 암호의 축퇴로 인해 고유 단백질의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 이들과 같은 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체는 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 하이브리드화 기법과 같은 분자 생물학 기법을 사용하여 식별될 수 있다. 변형 뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들어 부위-지향 돌연변이유발을 사용하여 생성된 것, 고유 단백질을 암호화하는 것뿐만 아니라, 아미노산 치환이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것과 같은, 합성적으로 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열 변이체는 고유(내인성) 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 50%, 60%, 내지 70%, 예를 들어 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 내지 79%, 일반적으로 적어도 80%, 예를 들어 81%-84%, 적어도 85%, 예를 들어 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 내지 98%의 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 구현예에서, 변이체는 생물학적으로 기능성이다(즉, 야생형의 활성 또는 기능의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 유지함).
특정 핵산 서열의 "보존적 변형"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 유전 암호의 축퇴로 인해, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 폴리펩티드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 따라서 코돈에 의해 아르기닌이 지정된 모든 위치에서 상기 코돈은 암호화된 단백질을 변경시키지 않고 기재된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, "보존적으로 변형된 변이"의 한 종류이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원에 기재된 모든 핵산 서열은 또한 달리 언급되지 않는 한 모든 가능한 침묵 변이도 기재한다. 당업계의 숙련가는 핵산의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 ATG 제외)을 표준 기법을 사용하여 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형시킬 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 "침묵 변이"는 기재된 각 서열에 내재되어 있다.
폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적인 동일성"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드가, 표준 매개변수를 사용하여 기재된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열과 비교했을 때 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%, 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 당업계의 숙련가는 이러한 값이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치지정 등을 고려하여 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하도록 적절히 조절될 수 있음을 알 것이다. 이러한 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 통상적으로 적어도 70%, 적어도 80%, 90% 또는 심지어 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다.
폴리펩티드의 맥락에서 "실질적인 동일성"이라는 용어는 폴리펩티드가 지정된 비교 창에서 참조 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%, 또는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 가리킨다. 두 폴리펩티드 서열이 동일하다는 표시는 한 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 동일하며, 예를 들어 이때 두 펩티드는 보존적 치환에 의해서만 상이하다.
"질환"은 세포, 조직 또는 장기의 정상적인 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 의미한다.
"치료하다" 및 "치료"라는 용어는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치를 모두 지칭하며, 여기서 목적은 장애의 발병, 진행 또는 악화와 같은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애를 예방, 억제, 감소 또는 줄이는 것이다. 이 개시내용의 목적에 유익하거나 바람직한 임상적 결과에는, 검출 여부에 관계 없이 증상 완화, 질병의 정도 감소, 질병의 증상이나 부작용의 안정화(즉, 악화 또는 진행되지 않음), 질병 진행 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적이든 전면적이든)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우의 예상 생존율에 비해 생존 기간을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료가 필요한 사람으로는 이미 상태나 장애가 있는 사람뿐만 아니라 이러한 소인이 있는 사람(예: 유전자 분석으로 결정)이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "본질적으로 없음"은 특정 성분의 관점에서 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물에 배합되지 않았거나 오염 물질 또는 미량으로만 존재한다는 것을 의미한다. 따라서 조성물의 의도치 않은 오염으로 인해 발생하는 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 표준 분석 방법에 의해 명시된 성분의 양을 전혀 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구항(들)에 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"이라는 단어는 "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은 단지 대안만을 언급하거나 대안이 상호 배타적일 때를 제외하고는 "및/또는"을 의미하는 데 사용되지만, 본 개시내용은 대안만을 언급하는 정의와 "및/또는"을 지지한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "또 다른"은 적어도 두 번째 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전체에서 "약"이라는 용어는 하나의 값에 장치의 내재적 오차 변동, 값을 결정하는 데 사용되는 방법의 내재적 변동, 연구 대상체 간에 존재하는 변화 또는 명시된 값의 10% 이내의 값이 포함된다는 것을 나타내는 데 사용된다.
VI. 키트
개시내용은 패키징 물질 및 그 안에 있는 하나 이상의 구성 요소를 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 구성 요소에 대한 설명이나 또는 함유된 구성 요소의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용에 대한 설명서가 포함된 표지 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 구성 요소, 예를 들어 핵산, 재조합 벡터 및/또는 바이러스 입자의 콜렉션을 함유할 수 있다.
키트는 상기 키트의 하나 이상의 구성 요소를 수용하는 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 물질은 구성 요소를 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 물질(예: 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
표지 또는 삽입물은 그 안에 있는 하나 이상의 구성 요소의 식별 정보, 복용량, 작용 기전을 포함한 활성 성분의 임상 약리학, 약동학 및 약력학을 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 유통기한을 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 키트 구성 요소가 사용될 수 있는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 임상의 또는 대상체가 키트 구성 요소 중 하나 이상을 방법, 용도 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서에는 복용량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 섭생 중 어느 하나를 실행하기 위한 설명서가 포함될 수 있다.
표지 또는 삽입물은 예방학적 또는 치료학적 이점과 같이 구성 요소가 제공할 수 있는 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물에는 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대한 대상체 또는 임상의에의 경고와 같은, 잠재적인 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보가 포함될 수 있다. 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용했거나, 복용할 것이거나, 현재 복용 중이거나, 또는 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 섭생을 받았거나, 받을 것이거나, 현재 받고 있는 경우에도 부작용이나 합병증이 발생할 수 있으며, 따라서 설명서에는 이러한 양립할 수 없음에 대한 정보가 포함될 수 있다.
표지 또는 삽입물에는 구성 요소, 키트 또는 패키징 물질(예: 상자)에 별도로 또는 부착된, 또는 키트 구성 요소를 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄물", 예를 들어 종이 또는 판지가 포함된다. 표지 또는 삽입물에는 바코드가 있는 인쇄 표지, 디스크, CD 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3와 같은 광 디스크 또는 RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체 또는 자기/광 저장 매체, FLASH 메모리, 하이브리드 및 메모리 유형 카드와 같은 이들의 하이브리드와 같은 컴퓨터 판독 매체도 추가로 포함될 수 있다.
VII. 실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 포함되었다. 당업계의 숙련가는, 하기 실시예에 개시된 기법이 발명자에 의해 본 개시내용의 실행에서 잘 기능하도록 발견된 기법을 나타내며, 따라서 이를 실행하기 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 점을 이해해야 한다. 그러나 당업계의 숙련가는 본 개시내용에 비추어 공개된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 개시내용의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 여전히 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점을 이해해야 한다.
실시예 1
뇌실막-풍부 또는 뇌실막-특이적 유전자를 식별하기 위한 감산적 접근 방식. 뇌실막은 뇌실과 척추의 중심관을 덮고 있는 얇은 상피층을 구성한다. 이 세포는 뇌실의 뇌척수액(CSF)과 매우 가까이에 있으며, 상기 유체는 이러한 공동을 충전할 뿐만 아니라 지주막하 공간으로 이동하고 혈관 주위 공간을 따라 실질로 확산되어 뇌 전체에 널리 분포된다. 따라서 뇌실막에서 CSF로 분비된 단백질은 뇌 전체에 광범위하게 전달될 수 있다. 치료학적으로, 분비된 단백질을 암호화하는 아데노-관련 바이러스(AAV)로 뇌실막 세포를 감염시키면 설치류, 개 및 비-인간 영장류의 뇌에서 광범위한 단백질 발현이 촉진됨이 입증되었다. 뇌실막-국소화된 AAV의 강력하고 장기적인 발현을 보장하기 위해, 발명자들은 AAV 트랜스유전자에 통합될 수 있는 내인성 유전자 시그니처와 각각의 조절 영역을 식별하고자 하였다. 이 연구에서 중요한 것은 질병 상태에 민감하지 않은 발현을 갖는 유전자를 식별하여 병적인 뇌에 도입되더라도 강력한 발현을 보장하는 것이었다. 따라서 발명자들은 건강한 환자뿐만 아니라 전두측두엽 치매, 경계성 치매, 루이소체 치매, 알츠하이머병(AD), 및 헌팅턴병(HD)을 앓고 있는 환자로부터 샘플을 공급받았다. 뇌실막 내벽의 깊이가 제한되어 있기 때문에, 이 특정 조직 유형을 깨끗하게 단리하는 것은 매우 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해 발명자들은 뇌실막-풍부 유전자 또는 뇌실막-특이적 유전자를 식별하기 위해 감산적 접근 방식(subtractive approach)을 사용하였다. 조직 샘플을 뇌실에 인접한 백질과 회백질, 및 뇌실막을 함유하는 뇌실 가장자리의 백질과 회백질로부터 수득하였다. 백질 + 뇌실막 및 회백질 + 뇌실막 샘플에 특이적인 유전자는 뇌실막-풍부 또는 -특이적인 것으로 간주되었다(도 1). 상위 적중을 Allen Brain Institute에서 공개한 제자리 하이브리드화 데이터와 비교하였다(도 2).
뇌실막-특이적 유전자에서 예측된 조절 영역의 단리. 기능적 프로모터 분절을 단리하기 위해 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여, 식별된 유전자의 상류 서열에서 프로모터 유사 시그니처를 검색하였다. 특히 H3K4me3, H3K27Ac, CpG 섬 및 전사 인자 결합 부위를 함유하는 분절이 주목되었다. 약 1100-2500개의 염기쌍(bp) 분절을 인간(HT1080) 게놈 DNA(gDNA)에서 PCR 증폭시켜 eGFP 리포터 상류에 배치하였다. 3' UTR에서 3-bp 바코드를 사용하여 고처리량 서열분석을 위한 프로모터를 식별하였다(도 3). 개별 플라스미드를 동일한 몰 비율로 모으고, 트랜스유전자를 각각 마우스와 레서스 원숭이에서 시험하기 위해 AAV4 또는 AAV2 캡시드에 라이브러리로서 패키징하였다.
마우스 및 레서스 뇌실막에서 RNA 발현을 구동하는 단리된 프로모터 분절의 생체내 시험. 뇌실막-풍부 프로모터를 함유하는 13개 트랜스유전자의 라이브러리를 단일 AAV4로서 제조하여 성체 FVBn 마우스의 측뇌실에 고용량(1e11 vg), 중간용량(5e10 vg) 및 저용량(1e10 vg)으로 주사하였다. 3주 후, 뇌실 내벽 및 제한된 주변 조직을 미세-절제하고 Trizol을 사용하여 RNA를 단리하였다. 3-bp 바코드를 둘러싼 영역을, Illumina 서열분석 어댑터를 연결하기 위해 2단계 PCR 프로토콜을 사용하여 cDNA로부터 증폭시켰다. 최종 생성물에 앰플리콘 서열분석을 수행하여 상대적 기여도를 정량화하였다. 도 4의 그래프는 조직 및 입력 바이러스에서 총 판독 수에 대한 각 바코드의 분획 기여도를 입증한다.
생체내에서 프로모터로서 단리된 분절의 기능을 정량분석하기 위해 RNA 출력의 상대적 기여도를 입력 바이러스의 기여도에 정규화하였다. 예상대로, 편재성 iCAG 프로모터는 생체내에서 강한 발현을 보였다(도 5). 인간 폰 빌레브란트 인자 A 도메인 함유 3a(hVWA3a) 유전자의 조절 서열을 함유하는 트랜스유전자가 또한 바이러스 입력보다 풍부하였다.
도 4에서 사용된 동일한 라이브러리를 AAV2로서 제조하여 동물당 총 2e13 vg로 2마리의 성체 레서스 원숭이의 측뇌실에 주사하였다. 3주 후, 척수를 포함한 뇌실 가장자리의 영역을 미세-절제하였다(도 6). RNA를 단리하여 cDNA로 전환시키고, 3-bp 바코드가 포함된 PCR 산물을 앰플리콘 서열분석하였다. 컬러 막대는 조직 RNA 또는 바이러스 DNA에서 각 트랜스유전자의 상대적 기여도를 나타낸다. 일치하는 위치에서 RNA 풍부 패턴은 2마리의 상이한 원숭이 사이에서, 및 동일한 구조의 별도 영역 내에서 유사하였다.
프로모터-국소화된 인트론 및 ApoE2 암호화 서열을 함유하도록 하는 원래 트랜스유전자의 변형. 염색체 19의 아포지단백질 E 유전자(APOE) 내의 유전적 변이는 후기 발병형 알츠하이머병의 차별적인 위험과 관련이 있다. 가장 흔한 대립유전자인 APOE3는 중립적인 것으로 여겨지며, 사람의 발병 위험을 증가시키지도 감소시키지도 않는다. APOE4는 위험을 증가시키고 조기 발병과 관련이 있는 반면, 비교적 드문 변이체인 APOE2는 질병에 대한 보호 기능을 제공한다. 조기-발병형 AD의 마우스 모델에 AAV4-APOE2를 뇌실 내 주사한 결과 뇌실막과 맥락막 신경총의 형질도입 및 피질 실질에서 검출 가능한 단백질 침착이 이루어져 Aβ 침착이 역전되고 CNS로부터의 제거가 개선되었다(PMID: 24259049). 발명자들의 디자인을 치료학적 적용에 맞게 조정하기 위해, 발명자들은 eGFP 리포터를 6개의 상이한 뇌실막-풍부 프로모터를 함유하는 작제물에서 인간 ApoE2 cDNA로 대체하였다(도 7 및 8). 이 6개의 라이브러리를 짧은(133 bp) β-글로빈/IgG 키메라 인트론 또는 긴(951 bp) 치킨 β 액틴/토끼 β-글로빈 인트론의 도입에 의해 추가 확장시켜 인트론-매개된 발현 향상을, 각 유전자에 대해 총 3개의 변이체에 대해 시험하였다.
인트론 스플라이싱을 측정하기 위해, 개별 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시키고 24시간 후에 수확하였다. RNA를 제조업체의 설명서에 따라 Trizol을 사용하여 단리하고, MultiScribe 역전사효소를 사용하여 역전사시켰다. 올바른 스플라이싱을, cDNA(C) 대 플라스미드 DNA(D)에서 인트론-함유 영역 전체를 증폭시킴으로써 검증하였다. hANXA1의 짧은 인트론을 제외한 대부분의 트랜스유전자에서 인트론이 완전히 제거된 것이 관찰되었다(도 8). 인트론-함유 트랜스유전자의 단백질 출력을 또한 HEK293 세포 용해물과 배양 배지에서 측정하였다. 도 9에는 HEK293 세포에서 내인성으로 쉽게 검출되지 않는 단백질인 APOE에 대한 웨스턴 블롯이 포함되어 있다. 인트론-매개된 향상과 일관되게, 모든 변이체는 인트론의 존재 하에서 짧은 인트론 대비 긴 인트론에서 더 큰 정도로 증가된 단백질 출력을 보였다.
생체내 인트론-함유 프로모터 활성의 측정. 모두 18개의 ApoE2 트랜스유전자 변이체(인트론 없는, 짧은, 및 긴)를 별도의 플라스미드로서 제조하고 동일한 몰 비율로 모아 단일 AAV2 라이브러리를 생성시켰다. 바이러스를 동물 당 총 2.8e13 vg의 용량으로 2마리의 성체 레서스 원숭이의 측뇌실에 주입하였다. 4주 후, 뇌실 가장자리를 4 ㎜ 두께의 관상 조각으로부터 미세-절제하고 Trizol을 사용하여 RNA를 단리하였다. 3' UTR에서 독특한 3글자 바코드를 함유하는 생성물의 cDNA 앰플리콘 서열분석을 사용하여 생체내에서 상대적 프로모터 사용을 평가하였다(도 10). 괄호 안의 숫자는 더 큰 표시된 구조에서 필적하는 조각으로부터의 단리를 가리킨다. 모든 hVWA3a 변이체는 입력 라이브러리에 대한 생체내 상대적 풍부성을 보였다.
hVWA3a 프로모터가 마우스 모델에서 트랜스유전자 발현을 구동할 수 있다는 확인. 성체 APOE-/- (null) 마우스에 hVWA3a 프로모터 하에서 APOE2를 상기 마우스의 우측 측뇌실로 전달하는 혈청형 AAV4를 주사하였다. 뇌실막 조직을 미세절제하고 자동 웨스턴 블롯 기술(WES)을 통해, 주사되지 않은 뇌 조직과 비교된 APOE2 정량분석을 위해 단백질을 추출하였다.
hVWA3a 프로모터가 이전 작제물에 비해 APOE2의 더 높은 발현을 나타낸다는 확인. APOE-/- (null) 마우스에 편재성 CAG 프로모터 또는 hVWA3a 프로모터 하에 APOE2를 동일한 용량으로 상기 마우스의 우측 측뇌실로 전달하는 혈청형 AAV4를 주사하였다. 모든 동물로부터 미세절제된 뇌실막 조직으로부터 단백질을 추출하고 자동 웨스턴 블롯 기술(WES)을 수행하였다. 밴드의 강도로 보아, hVWA3a에 의해 구동된 APOE2는 CAG 프로모터보다 더 많은 양의 APOE2 단백질을 발현하였다.
hVWA3a와 조합된 신규 캡시드 ERDRpAAV1의 생체분포는 eGFP 트랜스유전자에 의해 시각화된 바와 같이 마우스 모델에서 뇌실막 세포로의 발현을 제한한다. 인간 뇌실막 특이적 프로모터를 갖는 펩티드 변형된 AAV1 캡시드: ERDRpAAV1.hVWA3a.eGFP. 양성 eGFP 형광 신호는 뇌실 내벽의 뇌실막 세포로 제한된다.
이 APP/PS1/ApoE4 마우스 모델에서 뇌실막 발현을 통한 ApoE2의 도입은 피질 아밀로이드 플라크의 크기 및 밀도를 감소시키고 이 동물의 뇌에서 올리고머성 Aβ의 농도를 감소시켰다. 또한, 발명자들은 이 APP/PS1/ApoE4 마우스 모델에서 ApoE2의 도입이 피질 플라크 근처에서 미세아교세포의 활성화를 극적으로 감소시킨다는 것을 관찰하였다. 이는 ApoEε4가 미세아교세포를 염증 표현형으로 프라이밍할 수도 있고, 외인성 ApoE2가 이 비정상적인 활성화를 방해하거나 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 또한 발명자들은 ApoE2가 이들 마우스에서 아밀로이드 베타 플라크 주변의 후광에서 발생하는 시냅스 손실을 예방하거나 줄일 수 있음을 발견하였다. 합쳐보면, 이는 미세아교세포에 대한 ApoE2의 효과가 아밀로이드 침착의 결과로서 발생하는 듯한 플라크 근처 시냅스의 비정상적인 삼킴으로부터 보호될 수 있음을 가리킨다. 도 23-34 참조.
이러한 결과는 분비된 ApoE2의 뇌실막 ApoE4 담체로의 바이러스 전달이 AD의 전형적인 병변(예: 플라그 침착 및 신경퇴행)과 산발성 AD에서 관찰되는 증가된 신경염증 프로파일 모두에 영향을 미치는 데 유효한 치료 전략이 될 수도 있음을 시사한다.
실시예 2
방법. 연구 설계. 발명자들은 AD 트랜스제닉 마우스 모델의 뇌실 공간 내에서 APOE2 변이체를 발현하는 신규 AAV 벡터의 뇌실 내(ICV) 주입을 수행하였다. 마우스에게 2개월 동안 AAV 또는 비히클 대조군을 주사하였다. 면역조직화학(IHC) 및 효소결합 면역흡착검사(ELISA)를 사용하여, 발명자들은 인간 APOE2가 아밀로이드 침착에 미치는 영향을 평가하였다. 마우스는 무작위로 처리 그룹에 배정되었다. 주입된 벡터의 성질은 통계 분석까지 맹검으로 유지되었다. 이들은 이 연구를 위해 조건당 8마리(각 성별 4마리)의 동물이 필요하다고 추정한다. 이는 이전 데이터(Hudry et al., 2013)를 기반으로 한 것과 비교하여 기준선 표현형의 30%를 교정하는 데 필요한 >0.8의 힘을 제공할 것이다.
동물. APP/SP1(Radde et al., 2006) 마우스는 Thy1 프로모터 하에서 인간 돌연변이 APP KM670/671NL 및 PSEN1 L166P를 발현하는데, 이는 3-4개월령에 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 중증 표현형으로 이어진다. APOE 표적화된 교체는 마우스 모델에서 쥐 APOE 프로모터의 조절 하에 인간 APOE4(Huynh et al., 2019)를 발현한다. 이들 동물은 APP/PS1 트랜스유전자가 마우스 apoe(APPPS1/APOE4) 대신 인간 APOE4의 2개 사본과 함께 발현될 때까지 역교배되었다. 발명자들은 4개월 된 APOE4-TR/APP/PS1 마우스를 고용량(7E10vg, n=14), 중간용량(2E10vg, n=11), 또는 저용량(7E9vg, n=11)의 AAVert-APOE2 또는 비히클 대조군(n=10)에 2개월 동안 노출시켰다. 또한, C57BL/6 배경의 APOE KO(Jackson labs) 마우스의 코호트를 조직 및 CSF 내의 Aβ 수준에 대한 비교 척도로 포함시켰다. 실험은 미국 국립보건원(NIH) 및 기관 지침에 따라 수행되었으며 두 성별이 모두 사용되었다. 마우스 뇌의 작은 크기로 인해 모든 분석에 모든 동물을 사용하지는 않았으며, n은 도시된 점의 수로 표시된다. 빈 원은 암컷을 나타내고 색칠 된 원은 수컷을 나타낸다.
바이러스 벡터 구축 및 제조. AAV-기반 바이러스 벡터의 연구 등급 제조는 인증된 Working Cell Bank(WCB)의 부착 인간 배아 신장 상피 세포(HEK293)의 일시적 삼중 형질감염에 의해 Philadelphia Children's Hospital Research Vector Core(RVC)에서 수행되었다. 세포를 형질감염 전에 조직 배양 플라스크와 롤러 병에서 확대시켰다. 연구 생성물의 시험은 RVC QC에서 사내 수행되었으며 시험 방법, 절차 및 결과는 각 로트에 대한 분석 인증서(CoA)에 보고되었다.
정위적(stereotactic) 뇌실내 주사. AAV 뇌실내 주사를 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(14, 30). 동물을 마취시키고(O2/이소플루란 0.2%) 정위적 프레임(David Kopf Instruments)에 위치시켰다. 10-㎕ Hamilton 주사기(Hamilton Medical)에 부착된 33게이지 바늘을 사용하여 0.20 ㎕/분의 속도로 5.25 ㎕의 바이러스 제제를 각 측뇌실에 주사하였다. 정위 좌표를 브레그마(전후 +0.3 ㎜, 내외측 ±1 ㎜, 및 등복부 -2 ㎜)로부터 계산하였다.
웨스턴 블롯. 마우스 피질 조직을 핸드헬드 전기 균질화기를 사용하여 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 포함된 빙냉 TBS 10 중량 부피로 균질화하였다. 그런 다음 균질물을 10분 동안 10,000 g에서 회전시키고 상등액(TBS 가용성 분획)을 수집하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 단백질 농도를 BCA 분석을 사용하여 결정하였다. 총 단백질(5-10 ㎍)을 로딩하고 MES 완충액 중의 4-12% NuPAGE 겔에 의해 분리시킨 다음, 단백질을 120 V에서 2시간 동안 중량 기준으로 분리시켰다. 단백질을 트리스-글리신 전이 완충액 중의 XCell II™ Blot Module 시스템을 사용하여 30 V에서 1.5시간 동안 니트로셀룰로스 멤브레인상에 전기전이시켰다. 멤브레인을 1:1 TBS로 희석한 차단 완충액(Li-Cor Biosciences)에서 1시간 동안 배양하여 배경 염색을 감소시켰다. 이어서 멤브레인을, 0.1% Tween-20이 첨가된 차단 완충액에 희석된 1차 항체; rb 항-APOE(Novus biologicals, NBP1-31123) 및 ms 항-GAPDH(Millipore MAB374)와 함께 실온에서 밤새 진탕시키면서 배양하였다. 이어서 멤브레인을 세척하고 적절한 680 및 800 IR 염색 2차 항체(Li-Cor Biosciences)와 함께 배양하였다. 멤브레인을 Odyssey 적외선 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하고 Odyssey 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
DNA 및 RNA 추출 및 분석. 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 뇌 조직에서 추출하였다. 샘플을 BioRad CFX Manager 3.1 소프트웨어를 사용하여 BioRad CFX384 실시간 시스템 C1000 Touch에서 실행시켰다. 전체 게놈 사본을, 작제물을 함유하는 선형화된 플라스미드를 사용하여 생성된 6점 표준 곡선에 대해 정량분석하였다. 프라이머/탐침(작제물의 비-암호화 영역에 대해 설계됨)을 TaqMan® Master Mix(Applied Biosystems)와 함께 사용하였다.
제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol(Ambion by Life Technologies)을 사용하여 뇌 조직에서 전체 RNA를 추출하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA(1 ㎍)를 DNase I, RNase-free(ThermoScientific)로 처리하였다. 상보적 DNA를 고용량 cDNA 역전사 키트(Life Technologies)를 사용하여 생성시켰다. 샘플을 BioRad CFX Manager 3.1 소프트웨어를 사용하여 BioRad CFX384 실시간 C1000 Touch에서 실행시켰다. APOE 수준을 TaqMan® Master Mix(Applied Biosystems)와 함께 사용하도록 설계된 프라이머/탐침에 의해 정량분석하였다. 트랜스유전자 발현 인간 APOE(Hs00171168_m1) 상업용 TaqMan® 프라이머/탐침 세트(Applied Biosystems)의 외인성 mRNA 수준. 내인성 마우스 베타-액틴(Mm02619580_g1)을 샘플 전체에서 발현을 정규화하기 위한 참조 유전자로 사용하였다.
ELISA 정량분석. Aβ40 및 Aβ42의 농도를 제조업체의 지침에 따라 BNT-77/BA-27(Aβ40의 경우) 및 BNT-77/BC-05(Aβ42의 경우) 샌드위치 ELISA(Wako)에 의해 결정하였다. Aβ40 및 Aβ42 농도를 각 마우스의 TBS, SDS-가용성 및 SDS-불용성 분획에서 측정하였다. 마우스 뇌 절편을 cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)과 함께 10배 부피(w/v)의 TBS 완충액에서 균질화하고 4℃에서 30분 동안 1000,000 × g에서 원심분리하였다. 상등액을 수집하여 TBS-가용성 분획으로 별도로 보관하였다. 그런 다음 펠릿을 2% SDS가 포함된 TBS 완충액 10배 부피(w/v)에서 균질화하고, 37℃에서 30분간 배양한 다음 20℃에서 30분간 100,000×g에서 원심분리하였다. SDS-불용성 펠릿을 500 ㎕의 70% 포름산에 용해시키고 1분 30초 간격으로 빙상에서 10% 출력으로 초음파 처리하여 완전히 용해시킨 다음 4℃에서 30분간 100,000×g에서 원심분리시켰다. 포름산-가용성 상등액을 Speed-Vac으로 건조시킨 다음 1배 부피(w/v)의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 재현탁시켰다. DMSO-가용성 분획을 SDS-불용성 분획으로 사용하였다(Hashimoto et al 2020에서 수정)(Hashimoto et al., 2020).
RNAscope. APOE KO 마우스의 드롭 고정된 반구를 동결 초미세절편기에서 30 ㎛로 절편화하였다. 실험 조건(모의 주사 대 AAV 주사)당 3마리의 마우스를 RNAscope로 APOE mRNA에 대해 염색하였다. RNAscope 실험을 약간 조정된 제조업체의 권장 사항에 따라 Manual Fluorescent Multiplex 키트 v2(Advanced Cell Diagnostics)를 사용하여 수행하였다. 간단히 말해, 각 마우스에 대해 여러 절편을 APOE mRNA 정량분석에 사용하기 위해 슈퍼프로스트(superfrost) 슬라이드 상에서 베이킹하였다. 표적 검색 및 프로테아제 절단 후, 탐침 하이브리드화를 hs-APOE(433091), 3-부분 양성 대조용 탐침_Mm(320881) 및 음성 대조용 탐침-DapB(310043)로 40℃에서 2시간 동안 수행하였다. RNAscope 신호를 얻기 위한 증폭 단계 후, TSA-cy3(Perkin Elmer FP1170)를 사용하여 신호를 발생시켰다. 절편을 1:1000 dapi로 대조 염색한 다음, 면역마운트를 사용하여 장착하고 Olympus VS120-S6-W 가상 슬라이드 현미경을 사용하여 ×10의 배율로 스캐닝하였다.
면역조직학적 분석. 마우스를 이소플루란 흡입에 의해 안락사시켰다. 한쪽 대뇌 반구를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드와 15% 글리세롤에 고정시키고 48시간 후 PBS 중의 30% 글리세롤로 변경하였다. 나머지 반구를 생화학적 분석을 위해 급속 동결시켰다. 드롭 고정된 반구를 신경과학 동료에 의해 처리하였다. 40개 반구를 젤라틴 블록에 포매하고 30 ㎛로 절편화하였다. 절편을 0.5% Triton-X에서 15분 동안 투과 처리한 후 0.1% Triton-X와 5% 정상 염소 혈청에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 1차 항체와의 배양을 0.05% Triton-X와 2.5% 정상 염소 혈청에서 4℃에서 밤새 수행하였다. 이어서 절편을 TBS로 세척하고 적절한 2차 항체를 실온에서 TBS 중의 0.05% Triton-X 및 2.5% 정상 염소 혈청에서 1:500으로 희석하였다. 절편을 실온에서 10분 동안 TBS 중의 1:1000 dapi와 함께 배양하고, 세척한 후, Immunomount를 사용하여 장착하였다.
플라크 정량분석. 10번째 절편마다 아밀로이드 베타에 대해 토끼 항 Abeta(1:500, IBL, CAT # 18584)를 사용하여 상술한 바와 같이 염색하였다. 아밀로이드가 밀집된 코어 플라크를 장착하기 전에 50% 에탄올 중의 0.05% Thio-S(Sigma-Aldrich)로 표지하였다. 절편을 장착하고 40배의 nanozoomer 현미경을 사용하여 스캐닝하였다. 절편을 qupath(Bankhead et al., 2017)를 사용하여 정량분석하였다. 각 절편에 대해 피질 영역을 선택하고, 물체 분류기를 사용하여 플라크를 식별하고, 플라크 피복 면적을 측정된 피질 면적의 퍼센트로서 평가하였다. 플라크 크기 및 수에 대해서, 각 동물의 피질에서 같은 크기의 면적을 선택하고 물체 분류기를 사용하여 플라크를 식별하였다.
신경교세포 평가. 여러 절편을 상술한 바와 같이 염색하였다. 1차 항체는 1:1000 비오틴화된 Ms 항 Abeta 82E1(IBL 10326), 1:500 GFAP-488(Millipore MAB 3402X), 1:500 토끼 항-IBA1(wako 019-19741)이었다. 2차 항체는 스트렙트아비딘 Alexa Fluor 568(Invitrogen S11226) 및 당나귀 항-토끼 647(A-31573)이었다. 5개의 피질 플라크 함유 영역을 40x로 Olympus FV3000 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 체성감각 피질에서 무작위로 이미지화하였다. Z 스택을 생성시키고 각 플라크를 2명의 맹검 조사자에 의해 신경교 반응성 수준에 대해 4점 척도(도 38A)로 평가하였다. 개별 마우스의 모든 플라크를 함께 평균하여 도 35B-C 및 도 38C-D의 그래프를 생성시켰으며, 주어진 실험 그룹의 모든 플라크를 도 35D 및 도 38E에 대해 평가하였다.
시냅스 정량분석. 여러 절편을 상술한 바와 같이 염색하였다. 1차 항체는 1:500 토끼 항 Abeta 1:500(IBL, CAT # 18584) 및 1:500 염소 항 PSD95(abcam ab12093)를 사용하였다. 2차 항체는 당나귀 항-염소 488(Invitrogen A-11078) 및 당나귀 항-토끼 594(A A-21207)였다. 5개의 피질 플라크 함유 영역을 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 60배로 Olympus FV3000 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 체성 감각피질로부터 무작위로 이미지화하였다. 5 ㎛의 Z 스택을 0.56 ㎛의 슬라이스 크기로 이미지화하였다. 이미지를 문헌[Jackson et al. 2019]과 유사한 사용자 지정 Image J 및 Matlab Macros를 사용하여 처리하였다. 간단히 말해서 10 ㎛ x 10 ㎛의 수확물을 플라크 후광에서 15 ㎛ 이내 또는 플라크 후광에서 40 ㎛ 넘게 떨어진 영역으로부터 채취하였다. 세포 찌꺼기와 dapi는 피하였다. 사용자 정의 이미지 J 매크로를 사용하여 수확물 임계값을 설정하고 시냅스를 사용자 정의 matlab 매크로를 사용하여 정량분석하였다. 모든 수확물을 함께 평균하여 각 마우스의 플라크 근처 및 먼 곳의 밀도를 구하였다.
신경돌기 정량분석. 여러 절편을 상술한 바와 같이 염색하였다. 1차 항체는 1:500 토끼 항 Abeta 1:500(IBL, CAT # 18584) 및 1:500 마우스 항 SMI312(Biolegend 837904)를 사용하였다. 2차 항체는 당나귀 항-토끼 488(Invitrogen A-21206) 및 당나귀 항-마우스 594(A-21203)였다. 5개의 피질 플라크 함유 영역을 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 60배로 Olympus FV3000 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 체성 감각 피질로부터 무작위로 이미지화하였다. 20 ㎛의 Z 스택을 1 ㎛의 슬라이스 크기로 이미지화하였다. 이미지를, 플라크당 이영양증의 수를 세고 또한 플라크 면적을 정량분석하는 맹검 실험을 통해 Image J를 사용하여 정량분석하였다. 하나 초과의 플라크가 존재하는 이미지에서, 가장 큰 플라크를 정량분석하였다.
통계 분석. 통계 분석을 Prism 소프트웨어로 수행하였다. 일원 ANOVA를 사용하여 모든 그룹 간 분석을 분석한 다음 각 그룹과 비히클 대조군 간의 Dunnett 다중 비교 검정을 수행하였다. 단순 선형 회귀 분석을 사용하여 인자와 바이러스 게놈 사본 수 간의 상관 관계를 평가하였으며, 이때 p 값은 기울기가 유의미하게 0이 아닌지 여부를 나타낸다. 각 마우스가 단일 데이터 점인 통계를 수행하였다. 각 분석에 대해 샘플은 블라인드 처리되었다.
결과. AAVert-APOE2의 뇌실 내 주사는 용량 의존적 방식으로 뇌에서 APOE2의 지속적인 생성을 유도한다. APOE는 주로 CNS 내의 성상세포 및 미세아교세포에 의해 생성되며, 일단 생성되면 분비된 후 실질 전체로 확산될 수 있다. 이전에, 발명자들은 뇌실 내벽의 뇌실막에 의해 생성된 APOE2가 피질까지 확산되어 플라크와 플라크 관련 손상에 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다(Hudry et al., 2013).
발명자들은 APOE2를 발현하는 신규의 뇌실막 제한된 AAV 캡시드(AAVert)의 4개월 된 APOE KO 마우스에의 단일 뇌실 내(ICV) 주사를 수행하였으며, 상기 마우스를 2개월 후에 희생시켰다. 고용량(7E10 게놈 단위(vg))의 바이러스를 Apoe KO 마우스에 주사한 결과, 인간 APOE에 대한 RNAscope를 사용하여 검출된 뇌실의 뇌실막 세포 내벽에서 APOE2 mRNA가 확고하게 발현되었다(도 1A). 바이러스 구동된 APOE2 단백질은 또한 웨스턴 블롯을 통해 피질의 TBS 추출에서도 검출되었으며 이는 정상 APOE의 10%인 것으로 나타났다(도 33B-C).
발명자들은 그 후 APOE2를 운반하는 AAV를 4개월 된 APPPS1/APOE4 동물에 주입하고, 상기 동물을 2개월 후에 도태시켰다. 이들은 동물에게 저용량-7E9 vg, 중간용량-2E10 vg, 및 고용량-7E10 vg의 3개의 상이한 용량뿐만 아니라 비히클 대조군을 주사하였다. 후뇌에서 DNA를 추출한 후 qPCR을 실시한 결과, 용량 의존적 흡수 효과가 나타났고, 3마리의 동물은 흡수가 나타나지 않았다(도 33D). 바이러스 게놈 사본의 수는 인간 APOE mRNA의 양의 증가와 상관관계가 있는데, 상기 량은 비히클 처리된 동물에서 관찰된 내인성 수준보다 고용량 동물에서 ~50% 더 높다(도 33E). 이러한 데이터를 종합해 보면 단일 ICV 주사가 용량 의존적 방식으로 뇌실막 세포에서 APOE2 발현을 유도한다는 것을 알 수 있다.
APOE2의 발현은 AB 플라크 침착 수준에 용량 의존적 영향을 미친다. APP/PS1/APOE4 모델은 아밀로이드증의 비교적 공격적인 모델이다. APPPS1/APOE4 동물은 생후 4개월차에 적당한 플라크 침착을 보이며 생후 6개월차에는 피질 전체에 플라크 침착이 잘 확립된다. 따라서 발명자들은 생후 4개월차에 주사하고 생후 6개월차에 희생시켰다. ThioS를 고밀도 코어 아밀로이드 플라크의 마커로 사용하여 플라크 침착에 대한 APOE2의 용량 의존적 효과를 입증한다(도 34A-C). 고용량 동물은 비히클 처리된 동물과 비교하여 ThioS 양성 염색으로 덮인 피질의 피복률이 ~33% 감소함을 보인다(도 34B). 플라크 부담을 후뇌에서 추출한 바이러스 게놈 사본 수와 비교하면 플라크에 대한 APOE2의 용량 의존적 효과가 명확하다(도 34C). 항-올리고머성 Aβ(oAβ) 항체를 사용한 염색은 상기 그룹(보충 도면 도 1A)과 개인 수준(보충 도면 도 1B) 모두에서 유사한 추세를 보였다.
관찰된 피질 피복률의 감소는, 고용량 동물이 비히클 처리된 동물과 비교시 ㎟당 플라크 수의 감소 및 Aβ 플라크 크기의 훨씬 더 유의미한 감소를 보인 경우(도 34E), 플라크 밀도의 유의미한 감소를 동반한다(도 34D).
아밀로이드의 생화학적 측정은 이미지화 측정과 일치한다. 마우스 뇌의 포름산 및 SDS 가용성 추출물로부터 측정된 Aβ42 펩티드의 농도는 조직학적으로 관찰된 변화를 모방하였으며, 따라서 고용량 동물은 SDS(도 36C)와 포름산(보충 도면 도 1D) 가용성 Aβ42의 양의 ~50% 감소를 나타내었다.
APOE4는 제거율을 손상시키고 Aβ의 응집을 촉진하는 반면 APOE2는 반대 효과를 갖는 것으로 나타났다. 본원에 제시된 데이터는 APOE2가 존재할 때 BBB를 통한 Aβ 펩티드의 유출이 증가하여 플라크가 감소하는 것과 일치한다.
APOE2의 발현은 플라크 관련 신경염증에 대해 용량 의존적 효과를 갖는다. APOE4 마우스는 APOE2 또는 APOE3 마우스와 비교시 플라크에 대한 더 공격적인 신경 염증 반응을 보이는 것으로 나타났다. 이는 APOE4 보유자가 더 염증성 표현형을 보인다는 데이터에서 알 수 있듯이 인간의 질병을 반영한다(Serrano-Pozo, Li, et al., 2021). APOE2를 추가하면 국소 성상세포와 미세아교세포에 대한 플라크의 영향을 약화시킬 수 있는지 알아보기 위해, 발명자들은 Aβ, Iba1(미세아교세포)(도 35A) 및 GFAP(도 38B의 성상세포)에 대한 IHC를 수행하였다. 이들은 4-점 척도(여기서 1이 비-반응성이고 4가 매우 반응성이다)로 신경교세포 반응성 수준을 평가하였다(도 38A). 이미지를 0.89의 상관성 R2로 2명의 맹검 조사자에 의해 평가하였다. 발명자들은, 이들 마우스의 미세아교세포 활성화가 플라크와 밀접하게 연관되고, 따라서 플라크가 적은 고용량 동물은 활성 미세아교세포의 전반적인 수준이 낮을 것이기 때문에 전체 피질이 아닌 개별 플라크를 바로 둘러싼 영역을 평가하기로 하였다. 이 방법을 활용함으로써 발명자들은 전체 플라크 밀도로부터 부분적으로 분리된 미세아교세포 반응성을 살펴볼 수 있다.
발명자들은 비히클 처리된 마우스와 비교시 고용량 및 중간용량 그룹에서 미세아교세포 반응성이 명백하고 통계적으로 유의미하게 감소함을 발견하였으며(도 35B), 이러한 약화는 개별 동물의 바이러스 게놈 사본 수와 유의미한 상관관계를 보인다(도 35C). 이러한 감소는 비히클 처리와 비교시 고용량 및 중간용량 동물에서 강한 미세아교세포 반응(점수 1)을 일으키지 않은 플라크 수의 증가와, 점수가 4인 플라크의 감소에 의해 구동되는 것으로 보인다(도 3D). 대조적으로 플라크 주변의 성상세포 반응성은 APOE2 수준이나 발현에 영향을 받지 않으며(도 38A-D) 모든 그룹에서 플라크 주변에서 동등하게 상승한다.
APOE2 노출은 아밀로이드 침착물 주변의 시냅스 손실을 조절한다. 시냅스 손실은 인지 장애와 상관관계가 있는 것으로 공지되어 있으며 인간 환자(Koffie et al., 2012)뿐만 아니라 이 마우스 모델(Hudry et al., 2013)의 플라크 근처에서 발생하는 것으로 나타났다. 발명자들은 앞서 보유자와 마우스 모두에서 APOE4가 APOE3 마우스 또는 보유자와 비교하여 플라크 근처에서 더 많은 양의 시냅스 손실과 관련이 있음을 보여주었다. APOE4가 시냅스 손실을 보호하지 못하는 것으로 나타났으므로, 이들은 이 모델에서 APOE2를 추가하면 시냅스 무결성을 보호할 수 있을 것이라는 가설을 시험하였다.
시냅스-후 밀도(PSD95)를 면역조직화학을 사용하여 확인하고 공초점 현미경검사로 이미지화하였다(도 38A). 이 모델에서 시냅스 손실은 플라크 가장자리 15 um 이내에서 가장 현저하게 발생하는 것으로 나타났으며(Hudry et al., 2013; Koffie et al., 2012), 따라서 이 영역에서 채취된 수확물을 플라크 가장자리에서 40 um 넘게 떨어진 곳에서 채취한 수확물로서 분석하였다. 플라크에서 멀리 떨어진 시냅스 밀도는 그룹 간에 차이가 없었으나(도 38B); 가장 높은 용량을 주사한 동물은 비히클 처리된 동물에 비해 플라크 근처에서 시냅스 수준이 증가한 것으로 나타났으며(도 38C), 이는 거의 정상적인 시냅스 밀도로 회복되었다. 시냅스 손실 퍼센트를, 동일한 동물의 플라크 근처의 시냅스 밀도를 플라크에서 멀리 떨어진 시냅스 밀도와 비교하여 계산하였다(도 38D). 비히클 처리된 동물은 고용량 동물보다 2배나 많은 시냅스 손실을 보였으며, 고용량 동물의 70%가 플라크 근처에서 10% 미만의 손실을 보인 반면, 다른 그룹에서는 한 마리를 제외한 모든 동물이 10%를 초과한 손실을 보였다.
발명자들은 또한 축삭 마커 SMI312와 올리고머성 Aβ 항체를 함께 염색하여 아밀로이드 침착물과 관련된 이영양성 신경돌기의 수를 평가하였다(도 39A). 이들은 그룹 간에 신경돌기 이영양증의 수에 차이가 없음을 발견하였다(도 39B-C).
논의. APOE 유전자형과 AD 사이의 강력한 유전적 및 실험적 연관성은 오랫동안 AD 위험 변경제 또는 치료법을 고려할 때 APOE를 관심 주제로 만들었다(Serrano-Pozo, Das, et al., 2021). 그러나 뇌 전체에 유전자 산물을 분배하는 실질적인 문제는 AD와 같이 대량의 뇌 조직에 영향을 미치는 질병에 유전자 치료를 사용하는 데 있어서 장벽이 된다. 이는 특히 비-인간 영장류나 인간과 같은 더 큰 유기체에서 그렇다. 본 연구에서는 이 장벽을 극복하는 접근 방식을 시험하였다: 즉, 분비 단백질을 뇌실막 및 관련 구조의 형질도입을 통해 발현시켜 분비 단백질이 피질 맨틀 전체로 확산되도록 하는 것이다. 발명자들은 이 접근 방식을 알츠하이머 병리의 APOE4/APP/PS1 모델에서 APOE2를 발현하는 데 적용하였으며, 이는 달성 가능한 용량에서 APOE2의 발현이 처리 후 8주 이내에 플라크 침착, 신경염증 및 신경퇴행에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
중요하게, 이러한 개선은 확립된 질병(즉, 플라크 침착이 이미 시작된)의 환경에서 관찰된다는 점인데, 이는 신경병리학적 관점에서 확립된 초기 알츠하이머병 환자에서 발생하는 변화를 모델링한 것이다. 본원에 제시된 결과는 AD에서 APOE의 영향이 APOE4와 관련된 발달기 또는 중년기 변화의 결과가 아니라 질병 진행 내내 지속되며(Evans et al., 2020) AD가 확립된 후에도 APOE를 조작하면 질병의 진행 과정을 변경시킬 수 있음을 시사한다.
발명자들은 이러한 매우 공격적인 아밀로이드증 모델에서 효과를 알아보는 데 필요한 AAV와 APOE2의 최소 유효량을 결정하기 위해 3회 용량의 바이러스를 시험하였다(도 2). 다른 연구자들의 연구(Castellano et al., 2011; Hashimoto et al., 2012; Serrano-Pozo, Das, et al., 2021) 덕분에, 발명자들은 Aβ 플라크의 특징적인 AD 병리학에 대한 APOE2의 주요 효과가 BBB를 통한 Aβ 제거율 증가와 응집 감소 때문이라는 가설을 세웠다. 이 연구는 APOE2 생성이 고밀도 코어 섬유질 플라크와 Aβ의 생화학적 척도 모두에 영향을 미친다는 것을 보여주며, 이는 상기 결론과 일치한다.
신경염증 및 AD는 오랫동안 AD 환자와 마우스 모델 모두에서 AD의 위험 인자인 미세아교세포 유전자의 수와 뇌의 미세아교세포증 및 성상아교세포증이 현저히 증가하는 것에 기인하여 부분적으로 연계되었다(Leng & Edison, 2021). 최근 몇 년 동안 APOE 유전자형이 신경 염증에 미치는 영향이 연구되었다(Hong et al., 2016). 미세아교세포는 기저 조건에서 APOE를 생성하지만 염증이 생기면 이러한 세포에서 생성이 극적으로 증가한다. 이러한 관찰 결과는 미세아교세포가 생성한 APOE4가 피드 포워드(feed forward) 루프를 유발하거나 영속시키는 데 독성 기능 효과의 증가를 갖는다는 가설로 이어졌으며(Krasemann et al., 2017), 이는 APOE의 효과가 세포 자율적일 가능성을 제기한다. 발명자들은 뇌실막 세포에 의해 생성된 외인성 APOE2가 마우스의 플라크 근처에 있는 미세아교세포의 활성을 억제한다는 것을 보여주었는데(도 3), 이는 상기 가설과 일치하지 않으며 미세아교세포에 대한 APOE의 효과 중 적어도 일부는 다른 세포 유형에서 생성된 APOE 때문이라는 것을 나타낸다.
APOE4는 AD에서 플라크 근처의 더 심각한 시냅스 손실과 관련이 있다(Hudry et al., 2013; Koffie et al., 2012). 가장 높은 용량의 AAV를 투여한 마우스에서 발명자들은 시냅스 손실량이 감소하는 것을 확인하여 APOE2가 이 신경퇴행성 표현형을 예방할 수 있음을 시사한다. 이들은 앞서 APOE와 올리고머성 oAβ가 시냅스에서 공동 국소화되고 APOE4가 oAβ를 시냅스에 전달하는 데 더 효율적임을 보였다(Koffie et al., 2012). APOE2의 이러한 시냅스 보호 효과는 서로를 배제하지 않는 여러 기전 때문일 수 있었다. APOE2는 시냅스에 존재하는 생물활성 oAβ를 감소시키는 데 도움이 될 수 있었고, 미세아교세포에 대한 APOE2의 효과는 반응성 미세아교세포로 인한 시냅스 가지치기(synaptic pruning) 수준을 감소시킬 수 있었으며, oAβ의 제거율 증가는 플라크의 후광에서 oAβ의 양을 감소시킬 수 있었다. 이러한 효과의 조합으로 인해 시냅스에서 독성 oAβ가 결여되어 미세아교세포 가지치기와 oAβ의 시냅스 독성 효과가 감소할 가능성이 있다.
본원에 제공된 데이터는 분비된 단백질의 발현을 위한 뇌실막 제한된 AAV의 유용성을 강조하는데, 이 단백질은 일단 신경막 및 CSF로 분비되면 뇌 실질 전체로 확산될 수 있다. 이러한 접근 방식은 상기 유전자 치료 방법을 사용하여 전체 뇌를 치료할 수 있는 실질적인 가능성을 보여주는데, 이는 리소좀 저장 질환과 프로그라눌린 돌연변이 관련된 전두측두형 치매에서 프로그라눌린 기능 상실과 같은 질병에 큰 의미가 있을 것이다. 발명자들은 궁극적으로 단일 쇄 항체 생산에서부터 다른 생물활성 분자의 발현에 이르기까지 다양한 잠재적 치료법을 뇌에 도입할 수 있는 능력을 구상한다. 현행 연구는 원칙적으로 두 가지의 것; 치료제로서의 APOE2 단백질, 및 혈액 뇌 장벽 문제 또는 말초 발현(제거 포함)의 어려움으로 인해 현재 CNS 장애에 사용할 수 없는 치료제를 위한 AAV 플랫폼을 확립한다.
결론적으로, 본원에 제시된 데이터는 APOE2를 도입한 유전자 치료가 E2 또는 E4 대립유전자를 물려받은 인간 환자의 확립된 표현형과 유사한 보호 기능을 갖는다는 것을 시사한다. 이 모델에서 APOE2 발현의 낮은 수준조차도 Aβ 침착물에 영향을 미치고, 신경염증을 완화하며, 시냅스 시스템을 지원한다. 이는 APOE 조절이 알츠하이머병 환자의 질병을 변경시키는 치료법에 중요한 가능성이 있음을 말해준다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본원에 기재된 방법 및 단계 또는 단계 순서에 변형이 적용될 수 있으며, 이는 개시내용의 개념, 진의 및 범위를 벗어나지 않는다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제가 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있으며, 동일하거나 유사한 결과가 달성된다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 개시내용의 진의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌은 본원에 제시된 내용에 대한 예시적인 절차 또는 기타 세부 사항을 보완하는 정도로, 본원에 구체적으로 참조로 포함된다.
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Claims (75)

  1. 대상체(subject)의 뇌실막 조직(ependymal tissue)에서 치료학적 트랜스유전자(therapeutic transgene)를 발현시키는 방법으로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로모터(promoter), 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 프로모터의 조절 하에서 치료학적 트랜스유전자를 암호화(encoding)하는 변형된 아데노-관련 바이러스(modified adeno-associated virus; AAV)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    변형된 AAV가 변형된 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    변형된 캡시드 단백질이 표적화 펩티드(targeting peptide)를 포함하고, 상기 표적화 펩티드가 3개 내지 10개 아미노산 길이(amino acid in length), 예를 들어 7개 아미노산 길이인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 변형된 AAV1 캡시드 단백질, 변형된 AAV2 캡시드 단백질 또는 변형된 AAV9 캡시드 단백질인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV1 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 상기 AAV1 캡시드 단백질의 잔기 590 뒤에 삽입되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열(linker sequence) 측면에 인접(flanking)하고, 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 SSA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인, 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV2 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 상기 AAV2 캡시드 단백질의 잔기 587 뒤에 삽입되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열 측면에 인접하고, 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AA인, 방법.
  14. 제7항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 상기 AAV9 캡시드 단백질의 잔기 588 뒤에 삽입되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열 측면에 인접하고, 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 siRNA, shRNA, miRNA, 비-암호화(non-coding) RNA, lncRNA, 치료학적 단백질 또는 CRISPR 시스템인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 ApoE2이고, 대상체가 집단 평균(populational average)에 비해 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)을 앓고 있거나 이의 발병 위험이 높은, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여가 직접적인 뇌실내(intracerebroventricular) 또는 실질내(intraparenchymal) 주사인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형된 AAV가 1회를 초과하여 투여되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    변형된 AAV가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여되는, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    변형된 AAV가 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다 또는 매년 투여되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 비-AAV 요법(therapy)을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 바이러스 입자가 투여되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    바이러스가 약 1Х106 내지 약 1Х1018 벡터 게놈/킬로그램(vg/㎏)의 용량(dose)으로 투여되는, 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    바이러스가 약 1x107-1x1017, 약 1x108-1x1016, 약 1x109-1x1015, 약 1x1010-1x1014, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1011, 약 1x1011-1x1012, 약 1x1012-1x1013, 또는 약 1x1013-1x1014 vg/㎏ 환자의 용량으로 투여되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인, 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 비-인간 포유류인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    인간 대상체가 50세 이상인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 폴리-아데닐화 신호(poly-adenylation signal)에 연결되는, 방법.
  31. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 프로모터, 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) 치료학적 트랜스유전자를 암호화하는 변형된 아데노-관련 바이러스(AAV).
  32. 제31항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 변형된 AAV.
  33. 제31항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 변형된 AAV.
  34. 제31항에 있어서,
    프로모터가 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프로모터인, 변형된 AAV.
  35. 제31항에 있어서,
    변형된 캡시드 단백질을 포함하는 변형된 AAV.
  36. 제35항에 있어서,
    변형된 캡시드 단백질이 표적화 펩티드를 포함하고, 상기 표적화 펩티드가 3개 내지 10개 아미노산 길이, 예를 들어 7개 아미노산 길이인, 변형된 AAV.
  37. 제35항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 변형된 AAV1 캡시드 단백질, 변형된 AAV2 캡시드 단백질 또는 변형된 AAV9 캡시드 단백질인, 변형된 AAV.
  38. 제37항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV1 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 상기 AAV1 캡시드 단백질의 잔기 590 뒤에 삽입되는, 변형된 AAV.
  39. 제38항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열 측면에 인접하고, 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 변형된 AAV.
  40. 제39항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 SSA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인, 변형된 AAV.
  41. 제37항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV2 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 상기 AAV2 캡시드 단백질의 잔기 587 뒤에 삽입되는, 변형된 AAV.
  42. 제41항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열 측면에 인접하고, 상기 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 변형된 AAV.
  43. 제42항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AA인, 변형된 AAV.
  44. 제37항에 있어서,
    변형된 AAV 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질에서 유래되고, 표적화 펩티드가 AAV9 캡시드 단백질의 잔기 588 뒤에 삽입되는, 변형된 AAV.
  45. 제44항에 있어서,
    표적화 펩티드가 링커 서열 측면에 인접하고, 표적화 펩티드의 각 측면에 있는 링커 서열이 2개 또는 3개 아미노산 길이인, 변형된 AAV.
  46. 제45항에 있어서,
    링커 서열이 표적화 펩티드의 N-말단 쪽에서 AAA이고 상기 표적화 펩티드의 C-말단 쪽에서 AS인, 변형된 AAV.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 siRNA, shRNA, miRNA, 비-암호화 RNA, lncRNA, 치료학적 단백질 또는 CRISPR 시스템인, 변형된 AAV.
  48. 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 폴리-아데닐화 신호에 연결되는, 변형된 AAV.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 검출 가능한 리포터, 예를 들어 형광 단백질, 펩티드 태그 또는 루시퍼라제를 암호화하는 서열에 전사적으로 연결되는, 변형된 AAV.
  50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항의 변형된 AAV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  51. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열, 또는 이와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 단리 및 정제된 핵산.
  52. 제51항에 있어서,
    서열이 서열번호 1 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열인, 핵산.
  53. 제51항에 있어서,
    서열이 서열번호 2 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열인, 핵산.
  54. 제51항에 있어서,
    서열이 서열번호 3 또는 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열인, 핵산.
  55. 제51항에 있어서,
    서열이 이종 암호화 영역(heterologous coding region)에 작동적으로 연결되는, 핵산.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 다목적 클로닝 부위(multipurpose cloning site), (b) 전사 종료 신호, (c) 폴리-아데닐화 서열, 및/또는 (d) 복제 기원(origin of replication) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 핵산.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 검출 가능한 마커(detectable marker)를 암호화하는 서열, (b) 친화성 태그(affinity tag)를 암호화하는 서열, 및/또는 (c) 하나 또는 2개의 아데노-관련 바이러스 역전 말단 반복부(adeno-associated virus inverted terminal repeat) 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 핵산.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    복제 가능한 벡터에 함유되는 핵산.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 2A "자기-절단(self-cleaving)" 펩티드를 암호화하는 서열에 의해 리포터에 전사적으로 연결되는, 핵산.
  60. 미세아교세포 염증(microglial inflammation)을 감소 또는 손상시키는 방법으로서, 상기 염증의 감소 또는 손상이 필요한 대상체에서 미세아교세포에 ApoE2를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    미세아교세포에 ApoE2를 전달하는 것이 대상체에게 ApoE2 단백질 또는 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 변형된 AAV 또는 제50항의 약제학적 제형을 투여하는 단계를 포함하며, 치료학적 트랜스유전자가 ApoE2인, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서,
    미세아교세포 염증이 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease), 예를 들어 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 운동 뉴런 질환(motor neuron disease), 척추소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척추성 근위축증(spinal muscular atrophy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 바텐병(Batten disease), 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)에 의해 발생하거나 이와 관련되는, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    ApoE2 또는 변형된 AAV의 투여가 직접적인 뇌실내 또는 실질내 주사인, 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    ApoE2 단백질 또는 변형된 AAV가 1회를 초과하여 투여되는, 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    ApoE2 단백질 또는 변형된 AAV가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여되는, 방법.
  66. 제64항에 있어서,
    ApoE2 단백질 또는 변형된 AAV가 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다 또는 매년 투여되는, 방법.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 비-AAV ApoE2 요법을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 바이러스 입자가 투여되는, 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    AAV가 약 1Х106 내지 약 1Х1018 벡터 게놈/킬로그램(vg/㎏)의 용량으로 투여되는, 방법.
  70. 제68항에 있어서,
    바이러스가 약 1x107-1x1017, 약 1x108-1x1016, 약 1x109-1x1015, 약 1x1010-1x1014, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1013, 약 1x1010-1x1011, 약 1x1011-1x1012, 약 1x1012-1x1013, 또는 약 1x1013-1x1014 vg/㎏ 환자의 용량으로 투여되는, 방법.
  71. 제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인, 방법.
  72. 제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 비-인간 포유류인, 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    인간 대상체가 50세 이상인, 방법.
  74. 제60항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 트랜스유전자가 폴리-아데닐화 신호에 연결되는, 방법.
  75. 제60항, 제61항 및 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    미세아교세포 염증이 알츠하이머병에 의해 발생하거나 이와 관련되는, 방법.
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