KR20250001930A - 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산 용도 - Google Patents
쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20250001930A KR20250001930A KR1020240083511A KR20240083511A KR20250001930A KR 20250001930 A KR20250001930 A KR 20250001930A KR 1020240083511 A KR1020240083511 A KR 1020240083511A KR 20240083511 A KR20240083511 A KR 20240083511A KR 20250001930 A KR20250001930 A KR 20250001930A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microorganism
- rhtc
- isoleucine
- protein
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 115
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 title claims abstract description 99
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 title claims abstract description 99
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 title claims abstract description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 47
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 8
- 101710180758 Threonine efflux protein Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 101
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 101
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 101
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 59
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 38
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 102100023162 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Human genes 0.000 claims description 2
- 101710193388 L-serine dehydratase/L-threonine deaminase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710125839 L-threonine dehydratase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710170075 Serine dehydratase-like Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 74
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 101150094644 rhtC gene Proteins 0.000 description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100533902 Arabidopsis thaliana SPL13A gene Proteins 0.000 description 2
- 101100533904 Arabidopsis thaliana SPL13B gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100455080 Bacillus subtilis (strain 168) lmrB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100070556 Oryza sativa subsp. japonica HSFA4D gene Proteins 0.000 description 2
- 101100043227 Oryza sativa subsp. japonica SPL13 gene Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150099282 SPL7 gene Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 101150062776 yccA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150042817 NFS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100126298 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) iscS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150114492 SPL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000014268 sports nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 개시는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산을 위한 용도, L-이소류신 생산 방법, 및 L-이소류신 생산 증가 방법을 제공한다.
Description
본 개시는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산을 위한 용도와 관련된 것으로, 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-이소류신 생산 방법, 상기 미생물의 L-이소류신 생산능 증가방법 및/또는 L-이소류신 생산 조성물에 관한 것이다.
L-이소류신(L-isoleucine, Ile, I)은 필수 아미노산이고, 동물 사료, 식품 첨가물, 의약품 등의 다양한 제품의 제조에 사용된다. L-이소류신은 대사 후 에너지 생성, 헤모글로빈 생성, 혈당 조절, 근육 생성 및 보수 등의 기능을 하기 때문에 수액제, 영양제, 스포츠 영양제뿐만 아니라 동물 사료 분야에서도 사용이 증가되고 있다.
이러한 경향에 기반하여, 코리네박테리움 속 미생물을 비롯하여 다양한 미생물을 이용한 L-이소류신의 제조방법에 있어서 생산능 향상을 위한 다양한 시도가 행해지고 있다.
이와 같은 노력에도, L-이소류신의 생산능을 향상시키는 기술의 개발은 여전히 요구되고 있다.
본 개시는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 L-이소류신 생산 미생물을 제공한다.
본 개시는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 L-이소류신 생산용 조성물을 제공한다.
본 개시는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법을 제공한다.
본 개시는 미생물에 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하는, 미생물의 L-이소류신 생산능 증가 방법을 제공한다.
본 개시는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의, L-이소류신 생산, L-이소류신 생산 미생물 제조, 및/또는 미생물의 L-이소류신 생산능 증가를 위한 용도를 제공한다.
본 개시는 미생물의 L-이소류신 생산능 부여 및/또는 증가 기능을 가지는 단백질을 탐색하고, 이를 적절한 숙주세포에 도입함으로써 L-이소류신 생산능을 가지거나 L-이소류신 생산능이 증가된 미생물을 개발하여, 상기 단백질을 포함하는 미생물, 이의 L-이소류신 생산 용도, 및 관련 기술을 제공한다.
본 개시 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 개시에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
용어의 정의
본 개시에서, 용어 “상응하는 (corresponding to)”은 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 본 개시에서 제공하는 특정 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 정렬(align)하여 확인되는 대응 영역의 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 이러한 서열 정렬은 통상적인 서열 정렬 방법에 의할 수 있고, 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 개시에서, 폴리뉴클레오타이드(“핵산 분자” 또는 “유전자”와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드(“단백질”과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 가진다 또는 포함한다 또는 상기 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 본 개시에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다.
일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 상기 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열(염기서열) 또는 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상(상한값은 100% 또는 100% 미만일 수 있음)의 상동성 또는 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 본래의 기능은 쓰레오닌 배출 기능일 수 있고, 목적하는 기능은 L-이소류신 생산능(예컨대, 숙주세포(미생물)에 도입시 모균주 (도입되지 않은 미생물) 대비 L-이소류신 생산능을 부여 및/또는 증가시키는 기능)을 의미할 수 있다.
본 개시에서 용어, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 쓰레오닌 배출 단백질에 상응하는 기능(상기 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능)을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 개시의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 개시에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 소정의 서열번호로 정의된 서열과 상이하지만, 상기 단백질의 기능 (functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 변이체는 1개 이상(예컨대, 1개, 2개, 3개 등)의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 다양한 서열을 가질 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 상기 변이체의 기능은 본래 단백질(native protein)에 비하여 동등 정도를 유지하거나, 증가되거나, 또는 유의하지 않은 정도로 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein)의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질/폴리뉴클레오타이드, 변이형 폴리펩타이드/폴리뉴클레오타이드 등으로도 표현될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 목적상, 상기 변이체는 야생형 또는 비변형 단백질 대비 활성(예컨대, 본래의 활성 및/또는 목적하는 활성)이 유지 또는 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시에서의 단백질의 변이체는 보존적 치환에 의하여 생성된 것일 수 있다. 상기 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함할 수 있다. 또한, 상기 변이체는 폴리펩타이드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩타이드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 운반(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 개시에서, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 두 개의 폴리펩타이드 분자간의 서열 정보, 예를 들면 점수(score), 동일성(identity), 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오타이드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 확인함으로써 결정할 수 있다.
본 개시에서, ‘상동성 (homology)’ 또는 ‘동일성 (identity)’은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 개시에서, 수치 앞에 기재된 용어 “약(about)”은 뒤에 기재된 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 포괄적으로 의미하기 위하여 사용되는 것일 수 있고, 일 예에서, 상기 동등하거나 유사한 범위는 기재된 수치의 ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, ±3%, ±2%, ±1% 등의 범위를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시에서, 수치만 기재된 경우에도 기재된 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 포괄적으로 의미하기 위하여 사용되는 것으로 해석될 수 있고, 일 예에서, 상기 동등하거나 유사한 범위는 기재된 수치의 ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, ±3%, ±2%, ±1% 등의 범위를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 개시를 보다 상세히 설명한다.
본 개시는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이를 이용한 L-이소류신 생산과 관련된 기술을 제공한다.
본 개시는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물은,
(1) 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC,
(2) 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 (2) 및/또는 (3)의 폴리뉴클레오타이드는,
(a) 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC의 유전자를 포함하거나,
(b) 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC의 유전자 및 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 (예컨대 강화 프로모터)
를 포함하는 것일 수 있다.
쓰레오닌 배출 단백질
상기 쓰레오닌 배출 단백질은 L-쓰레오닌 배출 단백질(L-threonine exporter, L-threonine efflux protein) RhtC일 수 있다. 상기 L-쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 L-쓰레오닌을 세포 밖으로 배출하도록 매개하는 단백질로, 5개의 막전이 도메인(transmembrane domains)을 가지는 내막 단백질로 알려져 있다. 실험적 토폴로지(experimental topology)로 분석된 바로서 상기 단백질의 C-말단이 세포질에 존재할 수 있다. 본 개시에서 상기 쓰레오닌 배출 단백질은 RhtC 단백질 또는 RhtC과 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 야생형 또는 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 변이체일 수 있다. 상기 쓰레오닌 배출 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등과 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래의 쓰레오닌 배출 단백질일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 Rhtc는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상(상한값은 100% 또는 100% 미만일 수 있음)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있거나, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환됨으로써, 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC의 활성이 강화될 수 있다. 일 예에서, 상기 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산은 류신(Leu, L)일 수 있다. 일 예에서, 상기 원래와 다른 아미노산은 세린(Ser, S)일 수 있다. 일 예에서, 상기 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 세린으로 치환된 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표현될 수 있다. 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산(류신; Leu, L)이 세린(Ser, S)으로 치환됨으로써, 쓰레오닌 배출 단백질의 활성이 강화될 수 있다.
일 예에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 상기 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 본래의 기능(쓰레오닌 배출 기능) 및/또는 목적하는 기능(L-이소류신 생산능(L-이소류신 생산능 부여 및/또는 증가 기능))을 유지하는 한, 상기 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상(상한값은 100% 또는 100% 미만일 수 있음)의 상동성 또는 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본 개시에서, 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 앞서 설명한 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
상기 유전자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈(코돈 최적화)을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 서열번호 11의 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC의 코딩 유전자는 서열번호 12의 핵산 서열, 상기 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 세린으로 치환된 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 13)을 포함하는 단백질의 코딩 유전자는 서열번호 14의 핵산 서열을 각각 포함하는 것일 수 있다. 상기 핵산 서열은, 코돈 축퇴성 및/또는 코돈 최적화를 고려하여 코딩하는 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 변이된 핵산 서열을 포함할 수도 있다.
일 예에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 앞서 설명한 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 암호화하는 유전자에 더하여, 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 5’에서 3’ 방향으로, 프로모터 및 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC의 코딩 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
본 개시에서, 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 상기 프로모터가 상기 유전자의 전사 조절을 수행할 수 있도록 상기 유전자와 기능적 연결된 것을 의미할 수 있다. 상기 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현(전사)를 강화하는 강화 프로모터(strong promoter)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 프로모터는 공지된 강력한 프로모터들 중에서 선택될 있고, 예컨대, cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL1 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터, yccA 프로모터, PlysC 프로모터 (예컨대 PlysCP1 프로모터 (US 8426577 B2)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
본 개시에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 앞서 설명한 유전자, 또는 유전자 및 프로모터를 포함하고, 숙주 세포에서 복제/발현(전사) 가능한 DNA 구조체를 의미할 수 있다. 상기 벡터는 재조합 벡터 및 발현 벡터로 표현될 수 있다.
상기 벡터는 숙주 세포 내에서 복제/전사 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 플라스미드 형태로 존재하거나, 숙주 세포의 유전체(염색체) 내에 삽입 가능한 벡터 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 목적 단백질(쓰레오닌 배출 단백질 RhtC)을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 구조물을 의미할 수 있다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 유전체(염색체)와 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 유전체 내에 통합될 수 있다.
통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터인 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용하거나, 플라스미드 벡터인 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 벡터로서 pDC24, pDCM2, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합 또는 CRISPR 시스템에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 벡터는 상기 숙주 세포의 형질전환 여부 (예컨대, 숙주 세포 내 도입 (예컨대, 염색체 내 삽입) 여부)를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 세포 내 도입 또는 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
폴리펩타이드의 강화
일 예에서, 본 개시의 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 강화된 것일 수 있다.
본 개시에서 용어, 폴리펩타이드 활성의 “강화”는, 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성”은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성을 의미한다. 이는 “변형 전 활성”과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비하여 “강화”, “상향조절”, “과발현” 또는 “증가”한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩타이드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩타이드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량) 증가를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩타이드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩타이드 활성에 의한 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩타이드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 개시의 폴리펩타이드의 강화는
1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩타이드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩타이드 활성이 강화도록 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩타이드를 코딩하도록 상기 폴리펩타이드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 9) 단백질(폴리펩티드)의 세포내 위치(cellular localization) 조절; 또는
10) 상기 1) 내지 9) 중 선택된 2 이상의 조합에 의한 것일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 폴리펩타이드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩타이드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩타이드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 6) 폴리펩타이드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩타이드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩타이드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩타이드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
상기 9) 단백질(폴리펩티드)의 세포내 위치 조절은, 단백질(폴리펩티드)을 세포내 특정 세포소기관(organelle)이나 특정 세포 내 공간으로 표적화하는 것일 수 있다. 예를 들어 단백질(폴리펩티드)의 표적화에 기능하는 선도 서열(leader sequence)의 부가 또는 제거를 통해 주변질(periplasm)이나 세포질(cytoplasm)로 표적화하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 폴리펩타이드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩타이드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩타이드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩타이드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 본 개시의 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 강화 프로모터로 교체시킴으로써 강화된 것일 수 있다. 상기 강화 프로모터는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터, PlysC 프로모터 (예컨대 PlysCP1 프로모터 (US 8426577 B2)) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
쓰레오닌 배출 단백질 발현 미생물
앞서 설명한 바와 같이, 본 개시에서는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물을 제공한다.
본 개시에서, “쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물”은 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하지 않던 미생물이 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하게 된 경우 및/또는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하던 미생물이 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 과발현하게된 경우를 의미할 수 있다.
상기 미생물은 L-이소류신 생산능을 가지거나, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하지 않는 동종 미생물 또는 야생형과 비교하여, L-이소류신 생산능이 증가한 것을 특징으로 한다.
일 예에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC 발현 미생물은,
(1) 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC,
(2) 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
다르게 표현하면, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC 발현 미생물은 숙주 세포(미생물 또는 모균주로도 표현됨)에 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 도입(형질전환)한 재조합 미생물일 수 있다.
상기 숙주세포로서의 미생물(야생형 또는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입되지 않은 미생물)이 L-이소류신 생산능을 가지는 것인 경우, 상기 재조합 미생물은, 야생형 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입되지 않은 숙주세포와 비교하여, L-이소류신 생산능이 증가한 것일 수 있다. 상기 숙주세포로서의 미생물(야생형 또는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입되지 않은 미생물)이 L-이소류신 생산능을 가지지 않는 것인 경우, 상기 재조합 미생물은 L-이소류신 생산능이 부여된 것일 수 있다.
일 예에서, 본 개시의 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 L-이소류신 생산 미생물은, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 상기 쓰레오닌 배출 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 미생물과 비교하여, L-이소류신의 생산능이 증가된 것일 수 있다. 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 상기 쓰레오닌 배출 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 미생물은 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하지 않는 동종의 미생물 또는 야생형 미생물일 수 있다.
본 개시에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다. 본 개시에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하도록 변이(형질전환)되기 전의 미생물은 상기 변이된 미생물(재조합 미생물)과 구별하기 위하여, "모균주 (parent microorganism or parent strain) 또는 숙주 세포 (host cell)"로 표현될 수 있다.
일 예에서, 상기 미생물, 예컨대, 숙주 세포로서의 미생물은, (1) 자연적으로 L-이소류신 생산능을 가지는 미생물, (2) 자연적으로 L-이소류신 생산능이 없거나 현저히 적은 미생물, 및/또는 (3) 상기 자연적으로 L-이소류신 생산능을 가지는 미생물 또는 L-이소류신 생산능이 없거나 현저히 적은 미생물에 변이가 도입(형질전환)되어 L-이소류신 생산능을 가지게 되거나 L-이소류신 생산능이 향상된 미생물일 수 있다. 일 구체예에서, 숙주세포로서의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12739P(CA10-3101, US 2023-0098971 A1호) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P (대한민국 등록특허 제10-1335789호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 (genus Corynebacterium) 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위해 추가적으로 L-이소류신의 생합성경로를 강화시킨 미생물일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 피드백 저해가 해제된 미생물일 수 있다.
본 개시에서 용어, “쓰레오닌 디하이드라타아제 (threonine dehydratase, EC 4.3.1.19)”는 쓰레오닌으로부터 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)을 생성하는 효소로서, ilvA 유전자에 의하여 코딩되며, L-이소류신에 의해 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있다. 코리네박테리움 속 미생물은 피루브산 (pyruvate)과 2-케토부티르산 (2-ketobutyrate)을 전구체로 사용하여 3개의 중간대사물질을 거쳐 L-이소류신을 합성한다. 상기 쓰레오닌 디하이드라타아제의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 또는 US 2023-0098971 A1, US 10982244 B2에서 그 서열을 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 호모세린 디하이드로게나제의 피드백 저해가 해제된 것일 수 있다.
본 개시에서 용어, “호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, EC:1.1.1.3)”는 hom 유전자에 의하여 코딩되며, 호모세린의 합성을 촉매하는 효소이다. 호모세린 디하이드로게나제는 이소류신에 의해 피드백 저해를 받는 것으로 알려져 있다. 상기 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 또는 US 10982244 B2에서 그 서열을 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 아스파테이트 키나아제의 피드백 저해가 해제된 것일 수 있다. 본 개시에서 용어, “아스파테이트 키나아제(aspartate kinase, EC: 2.7.2.4)”는 lysC 유전자에 의하여 코딩되며, 상기 아스파테이트 키나아제의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 또는 US 10662450 B2에서 그 서열을 얻을 수 있다.
본 개시에서 용어, 피드백 저해 해제는 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가 또는 강화되거나 내재적 활성에 비해 활성이 저해되지 않게 되는 것을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 미생물은 hom 유전자에 유전적 변이(R407H)를 추가로 도입(US 10982244 B2), ilvA 유전자에 유전적 변이(T381A, F383A 및/또는 V323A)를 추가로 도입(US 2023-0098971 A1, US 10982244 B2), 및/또는 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC 유전자에 유전적 변이(L377K)(미국등록공보 US 10662450 B2)를 추가로 도입한 미생물일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 개시에서, 용어 "형질전환"은 목적 단백질(쓰레오닌 배출 단백질 RhtC)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드나 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(쓰레오닌 배출 단백질 RhtC)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 전기펄스법 (electeopulse), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 도입 (삽입)은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 예컨대, 통상적인 상동성 재조합에 의하거나, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system 또는 CRISPR system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 유전체(염색체)와 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 유전체 내에 통합될 수 있다.
L-이소류신 생산 용도
앞서 설명한 바와 같이, 본 개시에서 제공되는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물은 L-이소류신 생산능을 가지거나, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하지 않는 동종 미생물 또는 야생형과 비교하여, L-이소류신 생산능이 증가한 것을 특징으로 한다.
상기 L-이소류신 생산능은 L-이소류신 생산 기능뿐 아니라, L-이소류신의 배출/분비 기능 등을 포괄하는 것일 수 있다. 상기 L-이소류신 생산능은 배지 내 이소류신 농도, 당소모능 등으로 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물의 L-이소류신 생산능은, 모균주 (숙주 세포, 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하지 않는 동종의 미생물 또는 야생형 미생물)의 L-이소류신 생산능 (예컨대, 배지 내 L-이소류신 농도(g/L), 당소모능, L-이소류신 배출능 등)(100%) 대비, 약 30% 이상(즉, 약 1.3배 이상), 약 40% 이상(즉, 약 1.4배 이상), 약 50% 이상(즉, 약 1.5배 이상), 약 60% 이상(즉, 약 1.6배 이상), 약 70% 이상(즉, 약 1.7배 이상), 약 80% 이상(즉, 약 1.8배 이상), 약 90% 이상(즉, 약 1.9배 이상), 약 100% 이상(즉, 약 2배 이상), 약 110% 이상(즉, 약 2.1배 이상), 약 120% 이상(즉, 약 2.2배 이상), 또는 약 130% 이상(즉, 약 2.3배 이상) (상한값은 특별한 한정이 없으며, 예컨대, 약 300%, 약 200%, 약 150%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에, 본 개시의 일 예는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 L-이소류신 생산용 조성물을 제공한다.
본 개시의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 균주, 배지 및 L-아미노산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
다른 예는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법을 제공한다.
다른 예는 숙주 세포(미생물)에 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 도입하여 형질전환 시키는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 미생물의 제조 방법, 및/또는 미생물의 L-이소류신 생산능 부여 및/또는 증가 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의, L-이소류신 생산, 및/또는 L-이소류신 생산 미생물 제조, 및/또는 미생물의 L-이소류신 생산능 부여 및/또는 증가를 위한 용도를 제공한다.
상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물, 숙주 세포, 형질전환 등은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-이소류신 생산 방법에 있어서, 상기 배양은 미생물의 배양(미생물의 성장 및/또는 L-이소류신 생산 등)에 적절한 배지에서 수행될 수 있다. 상기 배지는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산, 황산, 인산염, 황산염 등)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 7.2)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-이소류신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 배양에 사용 가능한 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산칼륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 등), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 L-이소류신을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 L-이소류신을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
다른 예는 본 개시에 개시된 하나 이상의 요소를 특징으로 하는 조성물, 방법, 제품, 과정, 또는 용도를 제공한다.
본 개시에서 제공되는 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 미생물에 비해 향상된 L-이소류신 생산능을 가지므로, 이를 이용하여 L-이소류신을 효과적으로 생산할 수 있다. 이에, 상기 미생물의 L-이소류신을 활용하는 식품, 사료, 및 의약 등 광범위한 산업적 활용을 기대할 수 있다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예1. 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC 도입을 위한 재조합 벡터 제작
실시예 1-1: 유전자 삽입을 위한 플라스미드의 제작
쓰레오닌 배출 단백질 RhtC(threonine export protein RhtC)를 코딩하는 rhtC 유전자를 삽입하기 위해, 숙주세포(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032) 유전체의 NCgl2533를 삽입 site로 이용하였다. NCgl2533 유전자를 외래 rhtC로 치환하기 위하여 NCgl2533 결손 및 타겟 유전자 삽입 벡터를 제작하였다. 벡터를 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 1 와 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 |
| 1 | Primer1 | TGAATTCGAGCTCGGTACCC TCATATTGAATTTCGCCCCA |
| 2 | Primer2 | CCTAAGCAGGTTGATTTagt actCCGCTGGAAAACATTTT |
| 3 | Primer3 | AAAATGTTTTCCAGCGGagt actAAATCAACCTGCTTAGG |
| 4 | Primer4 | GTCGACTCTAGAGGATCCCC TCCCACCAAATCTGCGCCCA |
PCR 반응을 위한 중합 효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과 각각 1020bp, 1043bp의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 DNA 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 정제한 증폭 산물을 제한 효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDC24 벡터(서열번호 16)와 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 NCgl1756 결손 및 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDC24△N2533을 제작하였다.
실시예 1-2: 프로모터 교체 및 변이 도입을 위한 플라스미드 제작
rhtC의 활성을 강화시키기 위해서, E. coli W3110(ATCC 27325)의 rhtC(야생형; 서열번호 11)의 코딩 유전자(서열번호 12)와 이를 기반으로 한 변이형인 rhtC(L62S; 서열번호 13)의 코딩 유전자(서열번호 14)를 도입하였다(US 20230012923 A1). PlysC를 기반으로 일부 서열을 변경한 PlysCP1 프로모터(US 8426577 B2)를 이용하여, rhtC(야생형) 및 rhtC(L62S) 유전자의 프로모터를 PlysCP1(서열번호 15)로 교체함으로써 rhtC 활성을 강화하는 플라스미드를 제작하였다.
상기 사용된 단백질 및 DNA 서열은 다음의 표 2와 같다:
| 서열번호 | 설명 | 아미노산 서열 (N→C) 또는DNA 서열 (5’→3’) |
| 11 | rhtC wild-type | MLMLFLTVAMVHIVALMSPGPDFFFVSQTAVSRSRKEAMMGVLGITCGVMVWAGIALLGLHLIIEKMAWLHTLIMVGGGLYLCWMGYQMLRGALKKEAVSAPAPQVELAKSGRSFLKGLLTNLANPKAIIYFGSVFSLFVGDNVGTTARWGIFALIIVETLAWFTVVASLFALPQMRRGYQRLAKWIDGFAGALFAGFGIHLIISR |
| 12 | rhtC wild-type coding DNA | atgttgatgttatttctcaccgtcgccatggtgcacattgtggcgcttatgagccccggtcccgatttcttttttgtctctcagaccgctgtcagtcgttcccgtaaagaagcgatgatgggcgtgctgggcattacctgcggcgtaatggtttgggctgggattgcgctgcttggcctgcatttgattatcgaaaaaatggcctggctgcatacgctgattatggtgggcggtggcctgtatctctgctggatgggttaccagatgctacgtggtgcactgaaaaaagaggcggtttctgcacctgcgccacaggtcgagctggcgaaaagtgggcgcagtttcctgaaaggtttactgaccaatctcgctaatccgaaagcgattatctactttggctcggtgttctcattgtttgtcggtgataacgttggcactaccgcgcgctggggcatttttgcgctgatcattgtcgaaacgctggcgtggtttaccgtcgttgccagcctgtttgccctgccgcaaatgcgccgtggttatcaacgtctggcgaagtggattgatggttttgccggggcgttatttgccggatttggcattcatttgattatttcgcggtga |
| 13 | rhtC L62S | MLMLFLTVAMVHIVALMSPGPDFFFVSQTAVSRSRKEAMMGVLGITCGVMVWAGIALLGLHSIIEKMAWLHTLIMVGGGLYLCWMGYQMLRGALKKEAVSAPAPQVELAKSGRSFLKGLLTNLANPKAIIYFGSVFSLFVGDNVGTTARWGIFALIIVETLAWFTVVASLFALPQMRRGYQRLAKWIDGFAGALFAGFGIHLIISR |
| 14 | rhtC L62S coding DNA | atgttgatgttatttctcaccgtcgccatggtgcacattgtggcgcttatgagccccggtcccgatttcttttttgtctctcagaccgctgtcagtcgttcccgtaaagaagcgatgatgggcgtgctgggcattacctgcggcgtaatggtttgggctgggattgcgctgcttggcctgcattcgattatcgaaaaaatggcctggctgcatacgctgattatggtgggcggtggcctgtatctctgctggatgggttaccagatgctacgtggtgcactgaaaaaagaggcggtttctgcacctgcgccacaggtcgagctggcgaaaagtgggcgcagtttcctgaaaggtttactgaccaatctcgctaatccgaaagcgattatctactttggctcggtgttctcattgtttgtcggtgataacgttggcactaccgcgcgctggggcatttttgcgctgatcattgtcgaaacgctggcgtggtttaccgtcgttgccagcctgtttgccctgccgcaaatgcgccgtggttatcaacgtctggcgaagtggattgatggttttgccggggcgttatttgccggatttggcattcatttgattatttcgcggtga |
| 15 | PlysCP1 | ccatcttttggggtgcggagcgcgatccggtgtctgaccacggtgccccatgcgattgttaatgccgatgctagggcgaaaagcacggcgagcagattgctttgcacttgattcagggtagttgactaaagagttgctcgcgaagtagcacctgtcacttttgtctcaaatattaaatcgaatatcaatatatggtctgtttattggaacgcgtcccagtggctgagacgcatccgctaaagccccaggaaccctgtgcagaaagaaaacactcctctggctaggtagacacagtttattgtggtagagttgagcgggtaactgtcagcacgtagatcgaaaggtgcacaaaggtggccctggtcgtacagaaatatggcggttcctcgcttgagagtgcggaacgcattagaaacgtcgctgaacggatcgttgccaccaagaaggctggaaatgatgtcgtggttgtctgctccgcaatgggagacaccacggatgaacttctagaacttgcagcggcagtgaatcccgttccgccagctcgtgaaatggatatgctcctgactgctggtgagcgtatttctaacgctctcgtcgccatggctattgag |
구체적으로, PlysCP1 프로모터를 가진 rhtC(야생형) 및 rhtC(L62S)가 도입된 균주를 제작하기 위해, pDZ_lysCP1를 주형으로 서열번호 5과 서열번호 6를 이용하여 PlysCP1 프로모터 단편(WO2009/096689)을 획득하였다. E. coli W3110의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, rhtC(야생형) 단편을 획득하였다. 또한 E. coli W3110의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8 그리고 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 62번째 아미노산이 류신에서 세린으로 치환된 rhtC(L62S) 단편을 획득하였다. 상기 각각의 PCR을 수행하기 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 |
| 5 | Primer5 | AAAATGTTTTCCAGCGGAGTATTCAGGGTAGTTGACTAAA |
| 6 | Primer6 | AATAACATCAACATCTTTGTGCACCTTTCGATCT |
| 7 | Primer7 | AGATCGAAAGGTGCACAAAGATGTTGATGTTATTTCTCAC |
| 8 | Primer8 | ATTTTTTCGATAATCGAATGCAGGCCAAGC |
| 9 | Primer9 | GCTTGGCCTGCATTCGATTATCGAAAAAAT |
| 10 | Primer10 | CCTAAGCAGGTTGATTTAGTTCACCGCGAAATAATCAAAT |
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링 및 중합반응을 28회 반복하였다. 그 결과, PlysCP1 프로모터 부위의 243 bp DNA 단편, rhtC 부위의 661 bp DNA 단편, rhtC(L62S) 부위의 220 bp, 471 bp DNA 단편을 각각 수득하였다.증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한 효소 ScaⅠ으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDC24△N2533 벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 rhtC(야생형) 및 rhtC(L62S) 변이형을 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDC24△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec), pDC24△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec, L62S)를 제작하였다.
실시예 2: 코리네박테리움 글루타미쿰 L-이소류신 생산균주에서 rhtC 도입 균주의 제작 및 평가 (1)
상기 실시예 1.2에서 제작된 벡터를 전기천공법에 의해 이소류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM12739P(CA10-3101, 대한민국 등록특허 10-2363913)에 형질전환하여, 외래 rhtC(야생형) 및 rhtC(L62S)가 상동 재조합을 통해 유전체 내에 도입된 균주들을 제작하였다. 이렇게 제작된 균주는 각각 CA10-3136 (rhtC(야생형) 도입), CA10-3135 (rhtC(L62S) 도입)으로 명명하였다
상기 균주들의 이소류신 생산성 증감효과를 확인하기 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 이소류신 생산배지 25mL를 함유하는 250mL 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
(pH 7.2) 포도당 10%(w/v), 효모추출물 0.2%(w/v), 황산암모늄 1.6%(w/v), 제1인산칼륨 0.1%(w/v), 황산마그네슘7수염 0.1%(w/v), 황산철7수염 10mg/L, 황산망간1수염 10 mg/L, 비오틴 200 μg/L
배양종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 L-이소류신 생산량(배지 내 이소류신 함량)을 측정하였고, 농도는 하기 표 4에 나타내었다.
| 이소류신 농도 (g/L) | 모균주 대비 수율 향상 (△, %p) | |
| CA10-3101 (모균주) | 2.1 | - |
| CA10-3136[CA10-3101△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec)] | 3.7 | 1.6, 76% |
| CA10-3135[CA10-3101△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec, L62S)] | 4.5 | 2.4, 114% |
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101는 약 2.1 g/L의 이소류신을 생산하는 것을 확인하였다. rhtC가 도입된 균주 CA10-3136에서는 약 3.7 g/L의 이소류신이 생산되어, 모균주 대비 생산능이 약 80% 증가하였고, rhtC(L62S)가 도입된 균주 CA10-3135에서는 당소모속도가 증가하며 약 4.5 g/L의 이소류신이 생산되어, 모균주 대비 생산능이 약 114 % 증가함을 확인하였다.
실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 L-이소류신 생산균주에서의 rhtC 도입 균주의 제작 및 평가 (2)
상기 실시예 1.2에서 제작된 벡터를 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환하여, 염색체 상에 rhtC 또는 rhtC(L62S)이 도입된 변이주를 획득하였다. 이렇게 제작된 균주는 CA10-3137, CA10-3138로 명명하였다. 그 후, 실시예 2과 동일한 방법으로 배양액 중의 L-이소류신 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
| 이소류신 농도 (g/L) | 모균주 대비 수율 향상 (△,%p) | |
| KCCM11248P (모균주) | 1.0 | |
| CA10-3137[KCCM11248P△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec)] | 1.8 | 0.8, 80% |
| CA10-3138[KCCM11248P△N2533::PlysCP1_rhtC(Ec, L62S)] | 2.4 | 1.4, 140% |
그 결과 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P는 약 1.0 g/L의 이소류신이 생산되는 것을 확인하였다. rhtC가 도입된 균주 CA10-3137은 당소모속도가 증가하며 약 1.8 g/L의 이소류신이 생산되어, 모균주 대비 생산능이 약 80 % 증가함을 확인하였고, rhtC(L62S)가 도입된 균주 CA10-3138은 당소모속도가 증가하며 약 2.4 g/L의 이소류신이 생산되어, 모균주 대비 생산능이 약 140 % 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 개시가 속하는 기술분야의 당업자는 본 개시가 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (13)
- 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는, L-이소류신 생산 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, L-이소류신 생산 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC은 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 62번째 위치에 상응하는 아미노산이 원래와 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 원래와 다른 아미노산은 세린인, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC는 강화된 것인, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인, 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC, 상기 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 미생물과 비교하여, L-이소류신의 생산능이 증가된, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 피드백 저해가 해제된, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 호모세린 디하이드로게나제의 피드백 저해가 해제된, 미생물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신의 생산 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-이소류신의 생산 방법.
- 숙주세포에 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는, 미생물의 L-이소류신 생산능 증가 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20230083501 | 2023-06-28 | ||
| KR1020230083501 | 2023-06-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20250001930A true KR20250001930A (ko) | 2025-01-07 |
Family
ID=93938982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020240083511A Pending KR20250001930A (ko) | 2023-06-28 | 2024-06-26 | 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산 용도 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20250001930A (ko) |
| WO (1) | WO2025005633A1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10113190B2 (en) | 2013-06-03 | 2018-10-30 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing L-leucine, L-valine, L-isoleucine, α-ketoisovalerate, α-keto-beta-methylvalerate, or α-ketoisocaproate using recombinant Corynebacteria that contain the ilvBN operon which can be induced by propionate |
| US20230012923A1 (en) | 2019-09-09 | 2023-01-19 | Cj Cheiljedang Corporation | L-threonine export protein variant and method for production of l-threonine using same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004003411A1 (de) * | 2004-01-23 | 2005-09-01 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| CN104845995B (zh) * | 2014-02-14 | 2018-11-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产l-苏氨酸的方法 |
| EP3904521A4 (en) * | 2018-12-26 | 2022-03-23 | Daesang Corporation | E. coli variant strain or corynebacterium glutamicum variant strain producing l-amino acids, and method for producing l-amino acids using same |
-
2024
- 2024-06-26 WO PCT/KR2024/008841 patent/WO2025005633A1/ko unknown
- 2024-06-26 KR KR1020240083511A patent/KR20250001930A/ko active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10113190B2 (en) | 2013-06-03 | 2018-10-30 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing L-leucine, L-valine, L-isoleucine, α-ketoisovalerate, α-keto-beta-methylvalerate, or α-ketoisocaproate using recombinant Corynebacteria that contain the ilvBN operon which can be induced by propionate |
| US20230012923A1 (en) | 2019-09-09 | 2023-01-19 | Cj Cheiljedang Corporation | L-threonine export protein variant and method for production of l-threonine using same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2025005633A1 (ko) | 2025-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6998466B2 (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化された変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法 | |
| EP3109318B1 (en) | Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them | |
| EP3287469B1 (en) | Gluconate repressor variant, l-lysine producing microorganism comprising same, and method for producing l-lysine using same | |
| US20230098971A1 (en) | Novel of l-threonine dehydratase variant and method of producing l-isoleucine using the same | |
| KR102277407B1 (ko) | 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 | |
| US20240043886A1 (en) | Microorganism of the genus corynebacterium for producing l-amino acid and method for producing l-amino acid using the same | |
| JP7576180B2 (ja) | ＧｌｘＲ蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法 | |
| KR20250001930A (ko) | 쓰레오닌 배출 단백질 RhtC를 발현하는 미생물 및 이의 L-이소류신 생산 용도 | |
| KR102727407B1 (ko) | L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법 | |
| KR102673796B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
| KR102727406B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
| AU2023231941A1 (en) | Variant l-threonine export protein and method of producing l-threonine using same | |
| EP4491709A1 (en) | O-acetyl homoserine-producing microorganism and method for producing o-acetyl homoserine or l-methionine using same | |
| EP4491710A1 (en) | O-acetyl homoserine-producing microorganism and method for producing o-acetyl homoserine or l-methionine using same | |
| EP4464718A1 (en) | Mutant l-threonine-releasing protein and method for producing l-threonine using same | |
| KR20250017177A (ko) | 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산 방법 | |
| EP4083214A1 (en) | Microorganism having enhanced l-branched chain amino acid production ability and method for producing l-branched chain amino acid by using same | |
| KR20240055215A (ko) | 변이형 리보뉴클레아제 활성 조절 단백질 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
| KR20240118943A (ko) | 글루타미시박터 할로피토콜라 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도 | |
| KR20240118944A (ko) | 아르카노박테리움 포시시마일 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도 | |
| KR20240105656A (ko) | 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도 | |
| KR20240149035A (ko) | 코리네박테리움 스테이셔니스 유래 음이온 수송 단백질 변이체 및 이를 포함하는 미생물 | |
| JP2023530535A (ja) | 新規なプロモーター及びその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20240626 |
|
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20240626 Comment text: Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application |