KR20240173248A - Predicting or diagnosing composition for the occurrence or timing of allergic rhinitis, Diagnosing kit, Method for providing information and Screening method for drugs for preventing or treating allergic rhinitis using the same - Google Patents
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Abstract
알레르기 비염 발생 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 알레르기 비염의 진단 방법에 관한 발명으로서, 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1 단백질 또는 유전자를 확인하고, 이를 사용한 Decision tree 예측모델 분석을 통해 알레르기비염의 조기 및 후기 발생을 예측할 수 있고, 알레르기비염의 표현형 및 예후예측의 조기진단에 활용될 수 있을 뿐 아니라, 향후 신약개발 타겟 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.An invention relating to a composition for diagnosing the occurrence of allergic rhinitis, a kit and a method for diagnosing allergic rhinitis using the same, wherein COL5A2, CDK2AP2, COQ9, and PYM1 proteins or genes showing differences in expression in blood transcriptome analysis of an early-onset allergic rhinitis group, a late-onset allergic rhinitis group and a normal group are identified, and early and late onset of allergic rhinitis can be predicted through a decision tree prediction model analysis using the same. It can be utilized not only for early diagnosis of allergic rhinitis phenotype and prognosis prediction, but also for use in new drug development targets and treatment fields in the future.
Description
알레르기비염 발생 여부 또는 발생 시기 예측 또는 진단용 조성물, 진단 키트, 정보제공방법 및 알레르기비염 예방 또는 치료제 선별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition, diagnostic kit, information provision method, and method for predicting or diagnosing whether or not allergic rhinitis occurs or the timing of occurrence, and a method for selecting a preventive or therapeutic agent for allergic rhinitis.
비염은 바이러스, 세균 또는 자극물에 의한 코의 점막에서의 만성 또는 급성 염증에 의해 발생한다. 염증은 일반적으로 콧물, 코막힘(nasal congestion) 및 후비루(postnasal drip)를 일으키면서, 과도한 양의 점액질 생산을 야기한다. Rhinitis is caused by chronic or acute inflammation of the nasal mucosa caused by viruses, bacteria, or irritants. The inflammation usually causes excessive mucus production, resulting in a runny nose, nasal congestion, and postnasal drip.
알레르기성 비염은 전 세계 사람들의 20 % 이상에서 발생하는데 유병률은 매년 증가하고 있다. 알레르기성 비염은 먼지나 꽃가루와 같은 실내외의 알레르기 항원(allergen)에 대응한 전염증성 (proinflammatory) 면역 반응으로, 사회 생활, 수면, 학교 및 직장에서 문제를 야기하여 환자의 삶의 질은 비염의 정도와 지속 시간에 의해 달라질 수 있다. 따라서 비염의 조기 진단 및 예방이 중요하다.Allergic rhinitis occurs in more than 20% of people worldwide, and the prevalence rate is increasing every year. Allergic rhinitis is a proinflammatory immune response to indoor and outdoor allergens such as dust or pollen, causing problems in social life, sleep, school, and work, and the patient's quality of life can vary depending on the degree and duration of rhinitis. Therefore, early diagnosis and prevention of rhinitis are important.
최근 비염의 자연경과를 분석한 결과 다양한 표현형이 존재함을 확인되었고, 피검자에게 알레르기 항원 반응에 대한 민감도와 특이도가 떨어지는 경우 등이 있어 비염 여부를 진단함에 어려움이 있다. 또한 소아 알레르기비염은 한국 소아에서 40~50% 유병률을 나타내고 있는 가장 흔한 호흡기질환 중의 하나이지만 어린 나이에 발생하는 콧물, 코막힘(nasal congestion) 또는 후비루(postnasal drip)등의 증상이 비염인지 확진하는 것은 더욱 어렵다. Recent analysis of the natural course of rhinitis has confirmed the existence of various phenotypes, and there are cases where the sensitivity and specificity of the test subject to the allergen reaction are low, making it difficult to diagnose rhinitis. In addition, childhood allergic rhinitis is one of the most common respiratory diseases with a prevalence of 40-50% in Korean children, but it is more difficult to confirm whether symptoms such as runny nose, nasal congestion, or postnasal drip that occur at a young age are rhinitis.
따라서, 알레르기비염의 표현형(phenotype)과 내재형(endotype)에 따른 새로운 예후예측 바이오마커 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need to develop new prognostic biomarkers according to the phenotype and endotype of allergic rhinitis.
일 양상은 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 및 PYM1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 알레르기비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is to provide a diagnostic composition capable of predicting whether or not allergic rhinitis occurs or the timing of its occurrence, comprising a formulation capable of measuring the activity or expression level of any one or more proteins or genes selected from the group consisting of COL5A2, CDK2AP2, COQ9 and PYM1.
다른 양상은 상기 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a kit comprising a diagnostic composition capable of predicting whether or not allergic rhinitis occurs or when it occurs.
또 다른 양상은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 또는 PYM1 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알레르기 비염 발생 여부 및 시기 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다. Another aspect provides a method for providing information for predicting whether and when allergic rhinitis occurs, comprising the step of measuring the activity or expression level of COL5A2, CDK2AP2, COQ9 or PYM1 protein or gene in a biological sample isolated from a target individual.
또 다른 양상은 알레르기비염 예방 또는 치료제의 스크리닝방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a screening method for preventing or treating allergic rhinitis.
일 양상은 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 및 PYM1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 진단용 조성물을 제공한다.One aspect provides a diagnostic composition capable of predicting whether or not allergic rhinitis occurs or the timing of its occurrence, comprising a formulation capable of measuring the activity or expression level of any one or more proteins or genes selected from the group consisting of COL5A2, CDK2AP2, COQ9, and PYM1.
본 명세서의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 진단은 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측하는 것이다. 상기 예측은 병세의 진행, 회복에 관한 전망 내지는 예비적 평가를 의미한다. 구체적으로 상기 예측은 알레르기비염 발생 위험 개체에서 알레르기비염 발생 여부, 발생시기 등을 판단하는 것이다.The term "diagnosis" as used herein may include determining a subject's susceptibility to a specific disease or condition, determining whether a subject currently has a specific disease or condition, determining a prognosis of a subject with a specific disease or condition, or therametrics (e.g., monitoring the condition of a subject to provide information about the efficacy of a treatment). Specifically, the diagnosis is predicting whether or when allergic rhinitis will occur. The prediction means an outlook or preliminary assessment regarding the progression or recovery of the condition. Specifically, the prediction is determining whether or when allergic rhinitis will occur in a subject at risk of developing allergic rhinitis.
본 명세서의 용어, "알레르기비염"은 먼지나 꽃가루와 같은 실내외의 알레르기 항원(allergen)에 대응한 전염증성(proinflammatory) 면역 반응으로 코의 점막에서의 만성 또는 급성 염증에 의해 발생한다. 상기 염증은 일반적으로 콧물, 코막힘(nasal congestion) 및 후비루(postnasal drip)를 일으키면서, 과도한 양의 점액질 생산을 야기한다. The term "allergic rhinitis" as used herein refers to a proinflammatory immune response to indoor or outdoor allergens such as dust or pollen, which is caused by chronic or acute inflammation in the nasal mucosa. The inflammation generally causes excessive mucus production, resulting in a runny nose, nasal congestion, and postnasal drip.
본 명세서의 용어 "알레르기비염 발생시기"는 알레르기비염의 증상이 처음 발생하는 시기를 의미한다. 상기 발생시기는 조기발생과 후기발생으로 나눌 수 있다. 상기 조기발생은 2-3세 이전에 증상이 발생하여 4-5세에 피크에 이르는 것을 의미하고, 상기 후기 발생은 4-5세 이후에 증상이 발생하여 6-8세에 피크에 이르는 것을 의미한다. The term "time of allergic rhinitis onset" in this specification refers to the time when allergic rhinitis symptoms first occur. The time of onset can be divided into early onset and late onset. Early onset refers to symptoms occurring before 2-3 years of age and reaching a peak at 4-5 years of age, and late onset refers to symptoms occurring after 4-5 years of age and reaching a peak at 6-8 years of age.
본 명세서에서 용어 정상군(G1)은 알레르기비염이 발생하지 않은 피험자군을 의미한다.In this specification, the term normal group (G1) refers to a group of subjects who do not develop allergic rhinitis.
본 명세서에서 용어 알레르기비염 조기발생군(G2)은 2-3세 이전에 알레르기비염 증상이 시작된 군을 의미한다.In this specification, the term early-onset allergic rhinitis group (G2) refers to the group in which allergic rhinitis symptoms began before 2-3 years of age.
본 명세서에서 용어 알레르기비염 후기발기발생군(G2)은 4-5세 이후에 알레르기비염 증상이 시작된 군을 의미한다.In this specification, the term late-onset allergic rhinitis group (G2) refers to the group in which allergic rhinitis symptoms began after the age of 4-5.
본 명세서에서 용어 "바이오마커 (biomarker) 또는 마커(marker)"는 정상군 개체와 알레르기 비염 발생 위험이 있는 개체를 구분하여 알레르기비염 발생 여부 진단 또는 알레르기비염 발생 시기를 예측할 수 있는 물질로, 알레르기비염 발생 위험이 있는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체분자들을 모두 포함할 수 있다. 일 구체예에서는, 알레르기 비염 발생 위험이 있는 개체에서 그 발현 수준이 변화되는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The term "biomarker or marker" used herein refers to a substance that can diagnose the occurrence of allergic rhinitis or predict the timing of allergic rhinitis by distinguishing between a normal subject and a subject at risk of developing allergic rhinitis, and may include all organic biomolecules such as polypeptides, proteins, nucleic acids, genes, lipids, glycolipids, glycoproteins, or sugars, which show an increase or decrease in a subject at risk of developing allergic rhinitis. In one specific example, it may be a gene whose expression level changes in a subject at risk of developing allergic rhinitis, but is not limited thereto.
본 명세서의 용어, "COL5A2 (NCBI GenBank accession number, NM_000393), CDK2AP2 (NM_001271849), COQ9 (NM_020312) 및 PYM1 (NM_001143853)"는 정상군(G1), 알레르기비염 조기발생군(G2) 및 후기발생군(G3)의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 유전자 또는 단백질이다. The terms "COL5A2 (NCBI GenBank accession number, NM_000393), CDK2AP2 (NM_001271849), COQ9 (NM_020312), and PYM1 (NM_001143853)" in this specification are genes or proteins that show differences in expression in blood transcriptome analysis of the normal group (G1), early-onset allergic rhinitis group (G2), and late-onset allergic rhinitis group (G3).
상기 유전자는 NCBI GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 COL5A2은 인간에서 NCBI Gene ID: 0000의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 EnsEMBL ID: ENSG00000129988의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 의미하는 것일 수 있다. 또한 상기 유전자가 발현된 단백질인 "COL5A2 (NCBI accession number, NP_000384), CDK2AP2 (NP_001258778), COQ9 (NP_064708) 및 PYM1 (NP_001137325)"을 의미한다.The above gene can be obtained from a known database such as NCBI GenBank. For example, but not limited thereto, the COL5A2 may refer to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of NCBI Gene ID: 0000 in humans or a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of EnsEMBL ID: ENSG00000129988. In addition, the above gene refers to "COL5A2 (NCBI accession number, NP_000384), CDK2AP2 (NP_001258778), COQ9 (NP_064708), and PYM1 (NP_001137325)" which are expressed proteins.
본 명세서에서 용어, "유전자 발현 수준 측정"은 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 마커 유전자의 mRNA 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 수행될 수 있다. 상기 mRNA 수준 측정을 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (Rnase protection assay), 노던 블롯팅 (Northern blotting) 또는 DNA 마이크로어레이 칩(DNA 칩) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The term "gene expression level measurement" used herein refers to a process of confirming the level of mRNA expression of a marker gene that can predict whether or not allergic rhinitis occurs or when it occurs, and can be performed by measuring the amount of mRNA. Analysis methods for measuring the mRNA level include, but are not limited to, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, Northern blotting, or DNA microarray chips (DNA chips).
본 명세서의 용어 "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"란 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기에 따라 발현 수준이 증가 또는 감소하는 마커인 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 상기 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. The term "agent for measuring the expression level of a gene" as used herein means a molecule that can be used to detect a marker by determining the expression level of mRNA or protein of a gene whose expression level increases or decreases depending on whether allergic rhinitis occurs or the timing of occurrence.
일 구체예에 있어서 상기 유전자 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 또는 PYM1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one specific example, the agent capable of measuring the gene expression level may include, but is not limited to, at least one selected from the group consisting of primers, probes and antisense nucleotides that specifically bind to the COL5A2, CDK2AP2, COQ9 or PYM1 gene.
본 명세서의 용어 "프라이머"는 타겟 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하며, 바람직하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍을 의미하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 중합반응 효소 존재, 온도, 완충액 등)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15~30 뉴클레오타이드이다.The term "primer" as used herein includes any combination of primer pairs consisting of forward and reverse primers that recognize a target gene sequence, and may preferably mean a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity. The primer means a single-stranded oligonucleotide that can act as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., the presence of four different nucleoside triphosphates, a polymerization enzyme, temperature, a buffer, etc.). The suitable length of the primer varies depending on various factors, such as temperature and the use of the primer, but is typically 15 to 30 nucleotides.
상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한 상기 프라이머는 표적 유전자의 mRNA(즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 표적 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.The sequence of the above primer does not need to be completely complementary to a part of the template sequence, but it is sufficient to have sufficient complementarity within the range where it can hybridize with the template and perform its own function as a primer. In addition, the primer can be manufactured with a sequence complementary to the mRNA (i.e., cDNA) sequence of the target gene. The design of such a primer can be easily performed by those skilled in the art with reference to the cDNA sequence of the target gene.
본 명세서의 용어 "프로브"는 생물학적 시료 내의 검출하고자 하는 타겟 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 타겟 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 프로브는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 구체적으로 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편일 수 있고, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현 양을 확인할 수 있다.The term "probe" as used herein refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a biological sample, and refers to a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through said binding. Specifically, the probe is a substance commonly used in the art, and can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, an RNA probe, etc., and specifically, can be a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases or at most several hundred bases, and is labeled so that the presence or absence of a specific mRNA and the expression level can be confirmed.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 상기 프라이머 또는 프로브는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The above primers or probes can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods. In addition, the primers or probes can be modified by various methods known in the art. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologues of a natural nucleotide, and modification between nucleotides, such as modification with an uncharged linker (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.) or a charged linker (e.g., phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
본 명세서의 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리 고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기 일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다.The term "antisense oligonucleotide" as used herein refers to DNA or RNA or a derivative thereof comprising a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to the complementary sequence in the mRNA and inhibits translation of the mRNA into a protein. The antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the genes and can bind to the mRNA. It can inhibit the essential activity for translation, translocation into the cytoplasm, maturation or any other overall biological function of the gene mRNA. The length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotide may be synthesized in vitro by a conventional method and administered in vivo, or the antisense oligonucleotide may be synthesized in vivo.
일 구체예에 있어서, 상기 단백질의 활성 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one specific example, the agent for measuring the activity level of the protein may include, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of antibodies, oligopeptides, ligands, peptide nucleic acids (PNAs), and aptamers that specifically recognize the protein.
본 명세서의 용어, "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 등일 수 있다. 또한 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976)European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58,1-597, 1991 참조) 등을 이용하여 제조될 수 있다. The term "antibody" as used herein means a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction. The antibody may include a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as a functional fragment of an antibody molecule. The functional fragment of an antibody molecule means a fragment that has at least an antigen-binding function, and may be, for example, Fab, F(ab'), F(ab')2 or Fv. In addition, the antibody includes all of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. In addition, the antibody can be easily produced using techniques well known in the art. The polyclonal antibody can be produced from any animal, such as a goat, a rabbit, a sheep, a monkey, a horse, a pig, a cow, or a dog. The above monoclonal antibodies can be produced using the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), which is widely known in the art, or the phage antibody library technology (see Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58,1-597, 1991).
본 명세서의 용어, "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 의미한다. 구체적으로 인산-리보스당 골격을 갖는 DNA와는 달리, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가될 수 있다.The term "PNA (Peptide Nucleic Acid)" as used herein refers to an artificially synthesized polymer similar to DNA or RNA. Specifically, unlike DNA which has a phosphate-ribose sugar backbone, PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which can greatly increase binding affinity and stability to DNA or RNA.
본 명세서의 용어, "앱타머"는 표적분자에 친화적, 특이적으로 결합할 수 있는 핵산(DNA, RNA) 또는 펩타이드(peptide)를 의미한다. The term “aptamer” as used herein refers to a nucleic acid (DNA, RNA) or peptide that can bind affinity and specifically to a target molecule.
상기 단백질의 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme linked immunosorbent asay;ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay;RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것일 수 있다. The method for measuring the activity level of the above protein may be by using any one selected from the group consisting of Western Blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemistry, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS), and protein chip.
다른 양상은 상기 알레르기비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 조성물을 포함하는 알레르기비염 진단용 키트를 제공한다.Another aspect provides a kit for diagnosing allergic rhinitis, comprising a composition capable of predicting whether or not allergic rhinitis occurs or when it occurs.
상기 알레르기비염, 유전자 발현의 수준 측정 및 단백질 활성 수준 측정은 전술한 바와 같다.The above allergic rhinitis, measurement of gene expression level and measurement of protein activity level are as described above.
상기 키트는 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드 (rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 키트는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. The above kit may be, but is not limited to, a RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or an MRM (Multiple reaction monitoring) kit. In addition, the kit may be configured to further include one or more other components, solutions, or devices suitable for the analytical method.
예를 들어, 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판 및 형광 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출 할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체 와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되 어 있는 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩은 생물학적 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인하는 방식으로 사용할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체 및/또는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 또한, 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 니트로셀 룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등의 다른 물질을 포함할 수 있다.For example, the RT-PCR kit may include each primer pair specific for the marker gene, and in addition, a test tube or other appropriate container, a reaction buffer (with various pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), an enzyme such as Taq polymerase and reverse transcriptase, a DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water, and the like. The DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, and the like for producing a fluorescent probe, and the substrate may include cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof. The ELISA kit includes an antibody specific for the protein. The antibody is an antibody having high specificity and affinity for the marker protein and little cross-reactivity to other proteins, and may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a recombinant antibody. Other ELISA kits may include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated to antibodies), and substrates or other substances capable of binding to antibodies. The protein chip kit may be a kit in which one or more antibodies against a marker are arranged at a predetermined location on a substrate and immobilized at a high density. The protein chip may be used to isolate a protein from a biological sample, hybridize the separated protein with the protein chip to form an antigen-antibody complex, and read the complex to confirm the presence or expression level of the protein. The term "antigen-antibody complex" as used herein means a combination of a corresponding protein antigen in a biological sample and an antibody that recognizes the same. The antigen-antibody complex may be detected using a method known in the art, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbance, chemical, and other methods. The rapid kit may contain a specific antibody for a protein and/or an antibody specific for a control protein. In addition, the rapid kit may contain other materials capable of detecting the bound antibodies, such as a nitrocellulose membrane on which the specific antibody and the secondary antibody are immobilized, a membrane bound to beads bound to the antibodies, an absorbent pad, and a sample pad.
일 구체예에 있어서, 상기 키트는 통합 자기-전기화학 센서(integrated magneto-electrochemical sensor) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 통합 자기-전기화학 센서는 자성 비드(magnetic bead)를 사용하여 효소적 신호 증폭에 의한 전기적 신호를 검출하는 시스템을 지칭한다. 구체적으로는, 자성 비드에 표적 물질을 검출할 수 있는 물질(예를 들면 항체)을 부착시키고, 상기 표적 물질을 검출할 수 있는 발색 물질(예를 들면 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase: HRP), 알칼리 포스파타제(Alkaline Phosphatase: ALP), α-D-갈락토시다제(α-D-galactosidase, α-Gal)에 의해서 발생되는 효소적 신호 증폭에 의한 전기적 신호를 검출하는 시스템을 지칭할 수 있다. In one specific example, the kit may be, but is not limited to, an integrated magneto-electrochemical sensor kit. The integrated magneto-electrochemical sensor refers to a system that detects an electrical signal by enzymatic signal amplification using magnetic beads. Specifically, it may refer to a system that detects an electrical signal by enzymatic signal amplification generated by attaching a material (e.g., an antibody) capable of detecting a target substance to a magnetic bead, and a chromogenic material capable of detecting the target substance (e.g., horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), α-D-galactosidase (α-Gal)).
일 구체예에 있어서, 상기 키트는 상기 알레르기비염 유전자 발현 수준을 측정하기 위한 제제, 장치, 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함할 수 있고, 상기 알고리즘을 통해 상기 마커의 수준 측정 결과를 알레르기 비염과 연관시키는 키트에 관한 것일 수 있다.In one specific example, the kit may include a computer having a formulation, a device, and an algorithm built into it for measuring the level of expression of the allergic rhinitis gene, and may relate to a kit that associates the result of measuring the level of the marker with allergic rhinitis through the algorithm.
또 다른 양상은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 또는 PYM1 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알레르기비염 발생 여부 및 시기 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Another aspect provides a method for providing information for predicting whether and when allergic rhinitis occurs, comprising the step of measuring the activity or expression level of COL5A2, CDK2AP2, COQ9 or PYM1 protein or gene in a biological sample isolated from a target individual.
상기 알레르기비염, 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현의 수준 측정은 전술한 바와 같다.Measurement of the level of activity or expression of the above allergic rhinitis, protein or gene is as described above.
본 명세서의 용어, "목적하는 개체"란 알레르기비염 발생 여부가 불확실한 개체를 의미한다. As used herein, the term “subject of interest” refers to a subject whose presence or absence of allergic rhinitis is uncertain.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 알레르기비염 관련 질병에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 개체로부터 분리된 시료, 배양된 세포 또는 분변일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물학적 시료는 기관지 생검, 폐 생검, 비강 생검, 부비동 생검, 객담(sputum), 기관지 폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid; BALF), 비강 세척액(nasallavage fluid), 비강 도말(nasal swap), 비강 흡인액 (nasal aspirate), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 흡인액(nasopharyngeal aspirate), 비인두 세척액(nasopharyngeal lavage fluid), 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 눈물(tears), 점액(mucus), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 또는 이들의 조합일 수 있고, 바람직하게는 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "biological sample" as used herein may be a sample, cultured cell, or feces isolated from an individual suffering from or at risk of suffering from a disease associated with allergic rhinitis. Specifically, the biological sample may be a bronchial biopsy, a lung biopsy, a nasal biopsy, a paranasal sinus biopsy, sputum, bronchoalveolar lavage fluid (BALF), nasallavage fluid, nasal swap, nasal aspirate, nasopharyngeal swab, nasopharyngeal aspirate, nasopharyngeal lavage fluid, whole blood, plasma, serum, tears, mucus, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, It may be lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extracts, cerebrospinal fluid or a combination thereof, and preferably is selected from the group consisting of blood, serum and plasma, but is not limited thereto.
일 구체예에 있어서, 상기 알레르기 비염 발생 여부 및 시기 예측을 위한 정보 제공 방법은 상기 COL5A2의 활성 또는 발현 수준이 정상군(G1)에 비해 높게 나타나고, 상기 COQ9의 활성 또는 발현 수준이 대조군에 비해 낮게 나타나면 대상체가 알레르기비염 조기발생군(G2)일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법일 수 있다.In one specific example, the method for providing information for predicting whether or not allergic rhinitis occurs and when it occurs may further include a step of determining that the subject is in the early-onset allergic rhinitis group (G2) if the activity or expression level of COL5A2 is higher than that of the normal group (G1) and the activity or expression level of COQ9 is lower than that of the control group.
또한 일 구체예에 있어서, 상기 알레르기 비염 발생 여부 및 시기 예측을 위한 정보 제공 방법은 상기 COL5A2의 활성 또는 발현 수준이 정상군(G1)에 비해 높게 나타나고, 상기 COQ9의 활성 또는 발현 수준이 대조군에 비해 높게 나타나면 대상체가 알레르기비염 후기발생군(G3)일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법일 수 있다. In addition, in one specific example, the method for providing information for predicting whether or not allergic rhinitis occurs and when it occurs may further include a step of determining that the subject is in the late-onset allergic rhinitis group (G3) if the activity or expression level of COL5A2 is higher than that of the normal group (G1) and the activity or expression level of COQ9 is higher than that of the control group.
또한 일 구체예에 있어서, 상기 COL5A2의 활성 또는 발현 수준이 정상군(G1)에 비해 낮게 나타나고, 상기 CDK2AP2의 활성 또는 발현 수준이 대조군에 비해 낮게 나타나면 대상체가 정상군 또는 알레르기비염 조기발생군(G2)일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법일 수 있다. In addition, in one specific example, the method may further include a step of determining that the subject is a normal group or an early-onset allergic rhinitis group (G2) if the activity or expression level of COL5A2 is lower than that of the normal group (G1) and the activity or expression level of CDK2AP2 is lower than that of the control group.
또한 일 구체예에 있어서, 상기 COL5A2의 활성 또는 발현 수준이 정상군(G1)에 비해 낮게 나타나고, 상기 CDK2AP2의 활성 또는 발현 수준이 정상군에 비해 높게 나타나며, PYM1의 활성 또는 발현 수준이 정상군(G1)보다 낮게 나타나면 대상체가 정상군(G1) 또는 알레르기비염 조기발생군(G2)일 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법일 수 있다. In addition, in one specific example, the method may further include a step of determining that the subject is a normal group (G1) or an early-onset allergic rhinitis group (G2) if the activity or expression level of COL5A2 is lower than that of the normal group (G1), the activity or expression level of CDK2AP2 is higher than that of the normal group, and the activity or expression level of PYM1 is lower than that of the normal group (G1).
상기 정상군(G1), 알레르기비염 조기발생군(G2), 알레르기비염 후기발생군(G3)은 전술한 바와 같다.The normal group (G1), early-onset allergic rhinitis group (G2), and late-onset allergic rhinitis group (G3) are as described above.
본 명세서에서 용어 "유전자 발현의 수준 증가"는 정상군(G1)에 비해 개체의 시료 내 mRNA의 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 예를 들어 1.1배 이상 증가된 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 1.1배 내지 2.5배, 구체적으로, 1.1배, 1.2배, 1.3 배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 증가된 경우를 의미할 수 있다. The term "increased level of gene expression" as used herein means a measurable and significant increase in the concentration of mRNA in a sample of an individual compared to a normal group (G1), and can mean, for example, an increase of 1.1 times or more. For example, it can mean an increase of 1.1 times to 2.5 times, specifically, 1.1 times, 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 1.6 times, 1.7 times, 1.8 times, 1.9 times, 2.0 times, 2.1 times, 2.2 times, 2.3 times, 2.4 times, or 2.5 times.
본 명세서에서 용어 "유전자 발현의 수준 감소"는 정상군(G1)에 비해 개체의 시료 내 mRNA의 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 예를 들어 0.1배 이하로 감소된 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 0.1배 내지 0.9배, 구체적으로, 0.1배, 0.2배,0.3 배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배 또는 0.9배 감소된 경우를 의미할 수 있다.The term "reduced level of gene expression" as used herein means a measurable and significant decrease in the concentration of mRNA in a sample of an individual compared to a normal group (G1), and can mean, for example, a decrease of 0.1 times or less. For example, it can mean a decrease of 0.1 to 0.9 times, specifically, a decrease of 0.1 times, 0.2 times, 0.3 times, 0.4 times, 0.5 times, 0.6 times, 0.7 times, 0.8 times, or 0.9 times.
본 명세서에서 용어 "단백질 활성의 수준 증가"는 정상군(G1)에 비해 개체의 시료 내 단백질의 활성이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 예를 들어 1.1배 이상 증가된 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 1.1배 내지 2.5배, 구체적으로, 1.1배, 1.2배,1.3 배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배,1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배 또는 2.5배 증가된 경우를 의미할 수 있다.The term "increased level of protein activity" as used herein means a measurable significant increase in the activity of a protein in a sample of an individual compared to a normal group (G1), and can mean, for example, an increase of 1.1 times or more. For example, it can mean an increase of 1.1 times to 2.5 times, specifically, 1.1 times, 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 1.6 times, 1.7 times, 1.8 times, 1.9 times, 2.0 times, 2.1 times, 2.2 times, 2.3 times, 2.4 times or 2.5 times.
본 명세서에서 용어 "단백질 활성의 수준 감소"는 정상군(G1)에 비해 개체의 시료 내 단백질의 활성이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 예를 들어 0.1배 이하로 감소된 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 0.1배 내지 0.9배, 구체적으로, 0.1배, 0.2배,0.3 배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배 또는 0.9배 감소된 경우를 의미할 수 있다.The term "reduced level of protein activity" as used herein means that the activity of a protein in a sample of an individual is significantly and measurably reduced compared to a normal group (G1), and can mean, for example, a reduction of 0.1 times or less. For example, it can mean a reduction of 0.1 times to 0.9 times, specifically, a reduction of 0.1 times, 0.2 times, 0.3 times, 0.4 times, 0.5 times, 0.6 times, 0.7 times, 0.8 times or 0.9 times.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 알레르기 비염 발생 여부 또는 발생 시기의 예측을 위한 정보를 제공하기 위해, 상기 유전자의 수준을 측정 및 분석한 결과에 추가하여, 개체의 상기 마커 이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 초음파, 전산화 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 혈관조영술 등을 포함한다.In one specific example, the method may additionally use clinical information of the subject other than the marker, in addition to the results of measuring and analyzing the level of the gene, to provide information for predicting whether or not allergic rhinitis occurs or the timing of occurrence. Such clinical information includes, for example, the patient's age, sex, weight, eating habits, body mass, ultrasound, computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), angiography, etc.
또 다른 양상은 알레르기비염 예방 또는 치료제의 스크리닝방법으로서, 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 생물학적 시료에서 COL5A2, CDK2AP2, COQ9 또는 PYM1 유전자의 발현 수준이 증가 또는 감소한 경우, 상기 후보물질을 알레르기비염 예방 또는 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 스크리닝방법을 제공한다.Another aspect provides a screening method for an agent for preventing or treating allergic rhinitis, comprising: a step of treating a candidate substance with a separated biological sample; and a step of selecting the candidate substance as an agent for preventing or treating allergic rhinitis, if the expression level of a COL5A2, CDK2AP2, COQ9 or PYM1 gene in the biological sample is increased or decreased compared to a control group that is not treated with the candidate substance.
상기 알레르기비염, 유전자 발현의 수준 측정 및 단백질 활성 수준 측정은 전술한 바와 같다.The above allergic rhinitis, measurement of gene expression level and measurement of protein activity level are as described above.
본 명세서에서 용어 "후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 알레르기비염 예방 또는 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나, 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "대조군"은 상기 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로, 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.The term "candidate substance" as used herein may be an individual nucleic acid, protein, other extract or natural product, or compound, which is estimated to have the possibility of preventing or treating allergic rhinitis according to a conventional selection method, or which is selected randomly. The term "control group" as used herein means an isolated cell, isolated tissue, or non-human animal that has not been treated with the candidate substance, and an isolated cell, isolated tissue, or non-human animal that belongs to a parallel relationship with the group treated with the candidate substance.
일 양상에 따른 알레르기비염 발생 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 알레르기 비염의 진단 방법에 따르면, 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1 단백질 또는 유전자를 확인하고, 이를 사용한 Decision tree 예측모델 분석을 통해 알레르기비염 발생 여부 또는 시기를 예측할 수 있다. According to a composition for diagnosing allergic rhinitis occurrence according to daily aspects, a kit, and a method for diagnosing allergic rhinitis using the same, COL5A2, CDK2AP2, COQ9, and PYM1 proteins or genes showing differences in expression in blood transcriptome analysis of early-onset allergic rhinitis group, late-onset allergic rhinitis group, and normal group can be identified, and whether or not allergic rhinitis occurs can be predicted through decision tree prediction model analysis using the same.
도 1은 혈액의 전체 전사체에 대하여, numeric regression을 이용한 그룹별 비교분석을 실시하여 P < 0.001의 유의성 높게 발현의 차이를 보이는 유전자들을 각각 그룹 비교별로 181개, 687개, 349개, 463개 및 Decision tree 예측모델 분석을 위하여 선발된 후보 유전자 14개를 확인한 결과를 나타낸 모식도이다.
도 2는 정상군(G1), 알레르기비염 조기발생군(G2) 및 알레르기비염 후기발생군(G3)의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 유전자들(COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1)을 활용하여 Decision tree 프로그램을 이용해 알레르기비염 발생 여부 또는 시기에 대한 예측모델 분석을 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the results of confirming 181, 687, 349, and 463 genes that showed significant differences in expression at P < 0.001 by group comparison using numeric regression for the entire transcriptome of blood, and 14 candidate genes selected for decision tree prediction model analysis.
Figure 2 is a graph showing the results of a prediction model analysis on whether or not allergic rhinitis occurs using a decision tree program, utilizing genes (COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1) that showed differences in expression in blood transcriptome analysis of the normal group (G1), early-onset allergic rhinitis group (G2), and late-onset allergic rhinitis group (G3).
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, these examples are provided for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 대상 피험자의 특성Example 1. Characteristics of the target subjects
실험에 참여한 피험자의 인구통계학적 및 임상적 특성은 다음과 같다. The demographic and clinical characteristics of the subjects who participated in the experiment are as follows.
구체적으로, 호흡기 알레르기 전문의의 상세한 진료 진행 후, 진찰 내용은 증상기록지로 기록되었다. 알레르기질환 여부는 최근 12개월 동안의 해당 질환과 관련된 증상, 진단, 치료 등에 대한 질문과 신체검사를 통해 정의하였다. 알레르기비염 증상의 경우 최근 12개월 동안 알레르기비염으로 진단 받은 적이 있고, 적어도 2개 이상의 증상(맑은 콧물, 비폐색, 재채기 또는 가려움)이 있었던 경우로 정의하였다.Specifically, after a detailed examination by a respiratory allergist, the examination contents were recorded in a symptom record sheet. Allergic disease was defined through questions about symptoms, diagnosis, treatment, etc. related to the disease in the past 12 months and a physical examination. In the case of allergic rhinitis symptoms, it was defined as having been diagnosed with allergic rhinitis in the past 12 months and having at least two or more symptoms (clear nasal discharge, nasal obstruction, sneezing, or itching).
정상군(G1;Healthy controls) 12명, 알레르기비염 조기 발생군(G2) 12명 및 알레르기비염 후기 발생군(G3) 12명을 선별하였다.Twelve normal controls (G1), 12 early-onset allergic rhinitis (G2), and 12 late-onset allergic rhinitis (G3) subjects were selected.
실시예 2. 각 대상군별 알레르기 증상 확인Example 2. Confirmation of allergic symptoms for each target group
소아 알레르기비염 조기발생군(G2), 후기발생군(G3) 및 정상군(G1)의 알레르기 증상을 확인하기 위해 가장 일반적으로 민감하게 반응하는 알레르겐에 대한 검사를 실시하였다.To identify allergic symptoms in the early-onset (G2) group, late-onset (G3) group, and normal group (G1) group of children with allergic rhinitis, tests were conducted on the most commonly sensitive allergens.
구체적으로, 유럽과 미국 집먼지진드기항원, 곰팡이 항원 2종(알테나리아, 아스페르길루스), 꽃가루 항원 3종 (자작나무, 오리나무, 참나무), 개털 항원, 고양이털 항원, 쑥 항원, 환삼덩굴 항원, 잡초 항원, 바퀴벌레 항원 등을 검사하였다. Specifically, we tested European and American house dust mite antigens, two types of fungal antigens (Alternaria and Aspergillus), three types of pollen antigens (birch, alder, and oak), dog hair antigens, cat hair antigens, mugwort antigens, Chinese chive antigens, weed antigens, and cockroach antigens.
실시예 3. 차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 발현 변화 확인 Example 3. Confirmation of expression changes in differentially expressed genes (DEGs)
3.1 차별적으로 발현된 유전자(DEG)의 확인3.1 Identification of differentially expressed genes (DEGs)
소아 알레르기비염 조기발생군(G2), 후기발생군(G3) 및 정상군(G1)의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 선별하기 위해, 각 대상군별 유전자의 mRNA양을 측정하였다. 구체적으로, RNA 보존제가 포함된 전용 PAXgene Blood RNA Tube(PreAnalytiX, Hombrechtikon, Switzerland)에 보관된 혈액조직에서 PAXgene Blood RNA kit(PreAnalytiX)로 추출한 total RNA로 GeneChip WT 증폭 키트(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 제조사의 지침에 따라 GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array(Affymetrix)로 혼성화하였다. GCS3000 스캐너(Affymetrix)를 사용하여 어레이를 스캔한 후, Affymetrix GeneChip Command Console 소프트웨어를 사용하여 데이터 품질 검사, 배경 보정 및 정화 등의 분석을 수행하였다.To select genes showing differences in expression in the blood transcriptome analysis of the early-onset (G2) pediatric allergic rhinitis group, the late-onset (G3) group, and the normal group (G1), the mRNA amount of the genes in each target group was measured. Specifically, total RNA was extracted from blood tissue stored in a dedicated PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Switzerland) containing an RNA preservative, using the PAXgene Blood RNA kit (PreAnalytiX) to synthesize cDNA using the GeneChip WT amplification kit (Affymetrix, Santa Clara, CA), and then hybridized to the GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix) according to the manufacturer's instructions. After scanning the array using a GCS3000 scanner (Affymetrix), data quality check, background correction, and cleanup were analyzed using the Affymetrix GeneChip Command Console software.
전체 전사체에 대하여, numeric regression을 이용한 그룹별 비교분석(1.조기발생군 vs. 후기발생군, 2.정상군 vs. 전체 비염군, 3.정상군 vs. 조기발생군, 4.정상군 vs. 후기발생군)을 실시하여 P < 0.001의 유의성 높게 발현의 차이를 보이는 유전자들을 각각 181개, 687개, 349개, 463개를 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.For the entire transcriptome, a comparative analysis by group using numeric regression (1. Early-onset group vs. late-onset group, 2. Normal group vs. overall rhinitis group, 3. Normal group vs. early-onset group, 4. Normal group vs. late-onset group) was performed, and 181, 687, 349, and 463 genes showing significant differences in expression at P < 0.001 were identified, and the results are shown in Figure 1.
도 1에 나타낸 바와 같이, 조기발생군과 후기발생군을 구분하면서 정상군을 포함하는 다른 그룹 비교에서도 중복되는 중요한 후보 유전자 14개를 선별하였다. As shown in Figure 1, 14 important candidate genes that were overlapped in comparison with other groups including the normal group while distinguishing between the early-onset and late-onset groups were selected.
선별된 14개 후보 유전자에 대하여 R 언어 3.6.0(http://www.r-project.org)의 조건부 추론 트리(Ctree) 기능을 사용하여 소아 알레르기비염 표현형 간의 유전자 발현에 따른 의사결정(DecisionTree)을 수행하였다.For the 14 selected candidate genes, decision-making (DecisionTree) based on gene expression between pediatric allergic rhinitis phenotypes was performed using the conditional inference tree (Ctree) function of R language 3.6.0 (http://www.r-project.org).
상기 결과에 따라, 소아 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1 유전자를 선별하였다.Based on the above results, the COL5A2, CDK2AP2, COQ9, and PYM1 genes that showed differences in expression in the blood transcriptome analysis of the early-onset, late-onset, and normal groups of pediatric allergic rhinitis were selected.
3.2 COL5A2 발현 변화 확인3.2 Confirmation of changes in COL5A2 expression
실시예 3.1의 방법에 따라 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석하고, COL5A2 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서 언급된 COL5A2의 경우, GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array에서 사용된 31개 probe를 이용하여 유전자발현을 측정하였다. 상기 COL5A2 유전자 발현 측정용 probe 정보는 표 1에 나타내었다.According to the method of Example 3.1, the blood transcriptome of the early-onset allergic rhinitis group, the late-onset allergic rhinitis group, and the normal group were analyzed, and the expression change of the COL5A2 gene was confirmed. Specifically, in the case of COL5A2 mentioned in the present invention, gene expression was measured using 31 probes used in GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array. The probe information for measuring the COL5A2 gene expression is shown in Table 1.
3.3 CDK2AP2 발현 변화 확인3.3 Confirmation of changes in CDK2AP2 expression
실시예 3.1의 방법에 따라 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석하고, CDK2AP2 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서 언급된 CDK2AP2의 경우, GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array에서 사용된 19개 probe를 이용하여 유전자발현을 측정하였다. 상기 CDK2AP2 유전자 발현 측정용 probe 정보는 표 2에 나타내었다.According to the method of Example 3.1, the blood transcriptomes of the early-onset allergic rhinitis group, the late-onset allergic rhinitis group, and the normal group were analyzed, and the expression changes of the CDK2AP2 gene were confirmed. Specifically, in the case of CDK2AP2 mentioned in the present invention, gene expression was measured using 19 probes used in GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array. The probe information for measuring the CDK2AP2 gene expression is shown in Table 2.
3.4 COQ9 발현 변화 확인3.4 Confirmation of COQ9 expression changes
실시예 3.1의 방법에 따라 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석하고, COQ9 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서 언급된 COQ9의 경우, GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array에서 사용된 26개 probe를 이용하여 유전자발현을 측정하였다. 상기 COQ9 유전자 발현 측정용 probe 정보 는 표 3에 나타내었다.According to the method of Example 3.1, the blood transcriptomes of the early-onset allergic rhinitis group, the late-onset allergic rhinitis group, and the normal group were analyzed, and the expression changes of the COQ9 gene were confirmed. Specifically, in the case of COQ9 mentioned in the present invention, gene expression was measured using 26 probes used in GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array. The probe information for measuring the COQ9 gene expression is shown in Table 3.
3.5 PYM1 발현 변화 확인3.5 Confirmation of PYM1 expression changes
실시예 3.1의 방법에 따라 알레르기비염 조기발생군, 후기발생군 및 정상군의 혈액 전사체 분석하고, PYM1 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명에서 언급된 PYM1의 경우, GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array에서 사용된 29개 probe를 이용하여 유전자발현을 측정하였다. 상기 PYM1 유전자 발현 측정용 probe 정보는 표 4에 나타내었다.According to the method of Example 3.1, the blood transcriptomes of the early-onset allergic rhinitis group, the late-onset allergic rhinitis group, and the normal group were analyzed, and the expression changes of the PYM1 gene were confirmed. Specifically, in the case of PYM1 mentioned in the present invention, gene expression was measured using 29 probes used in GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array. The probe information for measuring the PYM1 gene expression is shown in Table 4.
실시예 4. 조건부 추론 트리분석 및 통계분석Example 4. Conditional inference tree analysis and statistical analysis
조건부 추론 트리 기능을 사용하여 알레르기비염의 발생 시기에 따른 유전자 발현여부를 분석하였다. 구체적으로, R 패키지의 조건부 추론 트리(Ctree) 기능을 사용하여 아토피성 피부염 표현형 간의 유전자 발현 컷오프를 결정하기 위해 재귀 분할이 사용되었다. 모델의 매개 변수는 minsplit = 2, minbucket = 1, mincriterion = 0.95, testtype = "Teststatistic"및 maxdepth = 4로 설정하였다. Ctree 분석의 경우, 가장 작은 P-를 가진 각 분기점의 유전자 0.05 미만의 값이 내부 노드로 선택되었다. Ctree 모델은 R 언어 3.6.0 (http://www.r-project.org)에서 개발한 "파티"프로그램을 사용하여 구성되었다. 상기 조건부 추론 트리 기능을 사용하여 알레르기비염의 발생 시기에 따른 유전자 발현 분석결과를 도 2에 나타내었다.The conditional inference tree function was used to analyze gene expression according to the onset time of allergic rhinitis. Specifically, recursive partitioning was used to determine the gene expression cutoff between atopic dermatitis phenotypes using the conditional inference tree (Ctree) function of the R package. The parameters of the model were set as minsplit = 2, minbucket = 1, mincriterion = 0.95, testtype = "Teststatistic", and maxdepth = 4. For the Ctree analysis, the gene with the smallest P-value less than 0.05 at each branch point was selected as the internal node. The Ctree model was constructed using the "party" program developed in R language 3.6.0 (http://www.r-project.org). The results of the gene expression analysis according to the onset time of allergic rhinitis using the conditional inference tree function are shown in Figure 2.
도 2는 정상군(G1), 알레르기비염 조기발생군(G2) 및 알레르기비염 후기발생군(G3)의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 유전자들(COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1)을 활용하여 Decision tree 프로그램을 이용해 알레르기비염 발생 여부 또는 시기에 대한 예측모델 분석을 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the results of a prediction model analysis on whether or not allergic rhinitis occurs using a decision tree program, utilizing genes (COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1) that showed differences in expression in blood transcriptome analysis of the normal group (G1), early-onset allergic rhinitis group (G2), and late-onset allergic rhinitis group (G3).
상기 결과는 정상군(G1), 알레르기비염 조기발생군(G2) 및 후기발생군 (G3)의 혈액 전사체 분석에서 발현의 차이를 보이는 후보 유전자들 중 4개의 유전자 (COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1)로 구성된 조합이 알레르기비염 발생 여부 또는 발생 시기를 예측할 수 있는 유용한 바이오마커임을 의미한다.The above results imply that a combination of four genes (COL5A2, CDK2AP2, COQ9, PYM1) among the candidate genes showing differences in expression in the blood transcriptome analysis of the normal group (G1), early-onset allergic rhinitis group (G2), and late-onset allergic rhinitis group (G3) is a useful biomarker that can predict whether or not allergic rhinitis will occur.
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Claims (14)
A screening method for an agent for preventing or treating allergic rhinitis, comprising: a step of treating a candidate substance with a separated biological sample; and a step of selecting the candidate substance as an agent for preventing or treating allergic rhinitis, if the activity or expression level of a COL5A2, CDK2AP2, COQ9 or PYM1 protein or gene in the biological sample is increased or decreased compared to a control group that is not treated with the candidate substance.
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