KR20240164950A

KR20240164950A - 식물성 추출물

Info

Publication number: KR20240164950A
Application number: KR1020247035184A
Authority: KR
Inventors: 단 리
Original assignee: 퍼포먼스 랩스 피티이 리미티드
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2024-11-21
Also published as: EP4482599A2; JP2025509921A; WO2023183775A2; US20230302073A1; WO2023183775A3

Abstract

본원에서는 식물성 물질로부터 관심 화합물을 추출하는 방법이 개시된다. 이 방법은 최적의 천연 심층 공융 용매(NaDES)를 식별하는 단계, 식별된 NaDES를 식물성 물질과 혼합하는 단계, 및 혼합물로부터 관심 화합물을 단리하는 단계를 포함한다. 또한, NaDES와 함께 단리된 관심 화합물을 포함하는 조성물도 설명한다.

Description

식물성 추출물

본 개시내용은 일반적으로 식물 추출 공정 분야와 관련이 있다. 특히, 본 개시내용은 마테차와 같은 식물로부터 화합물을 추출하는 방법 및 천연 심층 공융 용매를 이용한 식물성 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 방법은 식물로부터의, 개선된 화합물의 추출을 위해 생체 모방 천연 심층 공융 용매의 정밀한 결정 및 모델링을 포함한다.

Ilex paraguariensis(마테차, yerba mate)는 클로로겐산, 사포닌, 및 잔틴 알칼로이드를 포함한, 수많은 생체활성(bioactive) 화합물을 포함하는 약용 식물이다. 마테차로부터 이러한 화합물의 전통적인 추출은 환경 친화적이지 않고 효율적이지 않은 혹독한 공정과 화학 물질을 사용한다.

천연 심층 공융 용매(NaDES)는 다양한 대사산물 및 화합물을 용해시키는 널리 존재하는 화합물이며, 환경 친화적이다.

요약

본 개시내용은 일반적으로 천연 심층 공융 용매를 이용한 식물성 추출물을 포함하는 조성물, 및 상기 천연 심층 공융 용매를 이용하여 식물 추출물을 정제하는 방법에 관한 것이다.

여기에 제공된 일부 구체예는 식물 재료로부터 식물 추출물을 단리하는 방법과 관련된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 식물 재료를 획득하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 식물 재료를 가공하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 가공된 식물 재료를 천연 심층 공융 용매(NaDES)와 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 식물 추출물을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 식물 재료는 마테차로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 포도당, 자당, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 10%에서 80% 범위의 양으로 물을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 식물 추출물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌이다. 일부 구체예에서, 상기 잔틴 알칼로이드는 카페인, 테오브로민, 테오필린, 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 클로로겐산은 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 혼합 단계 이후에 가열, 교반, 원심분리, 및/또는 여과 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 3:1의 비율로 존재하는 염화콜린과 구연산, 및 50%의 양으로 존재하는 물을 포함한다.

여기에 제공된 일부 구체예는 조성물과 관련된다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 식물성 단리물과 천연 심층 공융 용매(NaDES)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 식물성 단리물은 마테차로부터의 단리물을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 식물성 단리물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 식물성 단리물은 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 포도당, 자당, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체, 염화콜린 및 구연산이 3:1의 비율로 존재하는 것과, 50% 물을 포함한다.

이러한 특징은 여기에 더 자세히 설명된 다른 특징과 함께 도면에 대한 다음 설명 및 상세한 설명에서 더 자세히 설명된다.

본 개시내용의 전술한 특징 및 기타 특징은 첨부 도면과 함께 살펴본 다음 설명에서 더욱 완전하게 분명해질 것이다. 이러한 도면은 본 개시내용에 따른 일부 구체예만을 도시한 것이므로 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 첨부된 도면을 사용하여 본 개시내용을 더욱 구체적이고 자세하게 설명할 것이다.
도 1a-1b는 마테차에서 식별된 주요 생체활성 성분 중 일부를 보여준다.
도 2는 마테차 성분에 대한 기존 추출 용매의 추출 수율을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 일반적인 추출 용매는 다음을 포함한다(왼쪽에서 오른쪽으로): 물; 20% 에탄올; 40% 에탄올; 60% 에탄올; 80% 에탄올; 및 100% 에탄올.
도 3은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼을 사용하여 다양한 용매에서 마테차 추출물의 항산화 어세이 결과를 보여주는 선 그래프를 나타낸다.
도 4는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 다음을 포함한 다양한 NaDES들에 의한 마테차로부터의 생체활성 화합물의 추출 수율을 보여주는 막대 그래프를 도시한다: CLCIT1:1, 30% 물; CLGLU1:1, 30% 물; CLSUC1:1, 30% 물; CITGLU1:1, 30% 물; CITSUC1:1, 30% 물; CLCITGLU1:1:1, 30% 물; CLCITSUC1:1:1, 30% 물; CLCIT3:1, 30% 물; CLCIT2:1, 30% 물; CLCIT1:2, 30% 물; CLCIT1:3, 30% 물; CLCIT1:1, 50% 물; CLCIT1:1, 80% 물; 물; 및 완충수. CL은 염화콜린이고; CIT는 구연산이고; GLU는 포도당이고; SUC는 자당이다.
도 5a-5c는 혼합 표준(도 5a 및 5b)과 하나의 마테차 추출물 샘플(도 5c)의 크로마토그램을 도시한다.
도 6a-6d는 반응 표면 방법론(RSM, response surface methodology) 분석 그래프를 도시한다. 도 6a는 마테차 추출물의 총 추출 수율에 대한 모델 예측 값과 실제 값에 관한 그래프를 도시한다. 도 6b는 추출 온도(A), 액체/고체 비율(B), 및 추출 시간(C)이 마테차의 총 추출물의 추출 수율에 미치는 영향을 보여주는 반응 표면 플롯과 등고선 플롯을 도시한다. 클로로겐산에 대한 모델 예측 값과 실제 값을 비교한 내용은 도 6c에 나타나 있다. 추출 온도, 액체/고체 비율, 및 시간에 따라 영향을 받는 마테차로부터의 클로로겐산의 추출 수율의 결과는 도 6d에서 보여준다.
도 7은 다양한 NaDES 시스템을 사용하여 테오브로민의 추출 수율을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것으로, 왼쪽부터 오른쪽으로: 포도당:자당, 포도당:과당, 구연산:포도당, 구연산:자당, 구연산:과당, 염화콜린:구연산, 염화콜린:포도당, 염화콜린:자당, 에리트리톨:염화콜린, 에리트리톨:구연산, 에리트리톨:포도당:과당, 메탄올, 및 물을 포함하며, 각각은 1:1 비율(해당되는 경우)로 존재한다.

다음 상세한 설명에서는 그것의 일부를 형성하는 첨부 도면을 참조한다. 도면에서 유사한 기호는 맥락상 다르게 명시된 경우가 아니면 일반적으로 유사한 구성요소를 나타낸다. 상세한 설명, 도면, 및 청구범위에 기술된 예시적인 구체예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 여기에 제시된 주제의 정신이나 범위를 벗어나지 않고도 다른 구체예를 활용하거나 다른 변경을 가할 수 있다. 본 개시내용의 양상들은 여기에 일반적으로 설명되어 있고 도면에 도시되어 있으며, 매우 다양한 구성으로 배열, 대체, 결합, 분리, 및 설계될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이며, 이러한 모든 구성은 여기에 명확하게 고려되어 있다.

여기에 요약된 바와 같이 식물 재료로부터 화합물을 단리하고 추출하는 방법의 양상과 천연 심층 공융 용매(NaDES)와 결합된 단리된 성분이 여기에 제공된다.

이 개시내용은 기술된 특정 구체예에 국한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

본 개시내용을 읽는 해당 분야의 기술자에게는 명백할 바와 같이, 여기에 기술되고 설명된 개별 구체예 각각은 본 개시내용의 범위 또는 정신에서 벗어나지 않고 다른 여러 구체예의 특징과 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 개별적인 구성 요소 및 특징을 가지고 있다. 나열된 모든 방법은 나열된 사건의 순서나 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 사람이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용의 목적을 위해 다음과 같은 용어가 하기에 정의된다.

일부 구체예에서는 하나 이상의 NaDES를 사용하여 식물로부터 화합물을 추출하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 본 방법에는 NaDES의 조합을 식별하는 단계, NaDES를 식물 재료과 혼합하는 단계, 혼합물을 가공하는 단계, 및 상기 식물로부터 화합물을 추출하는 단계가 포함된다. 추출된 화합물은 추가로 단리될 수 있다.

또한, 여기에는 식물로부터 단리된 화합물과 상기 화합물을 단리하는 데 사용된 NaDES를 조합한 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "식물"은 명세서에 비추어 이해되는 일반적인 의미를 가지며, 전체 식물 또는 그 임의의 일부 또는 유도체, 예컨대 식물 세포, 식물 원형질체, 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양, 식물 캘러스, 배아, 꽃가루, 난자, 과일, 꽃, 잎, 씨앗, 뿌리, 뿌리 끝 등과 같은 것을 지칭한다. 여기에서 "식물성"이라는 용어는 식물과 호환하여 사용되며 식물 또는 그로부터 파생된임의의 부분을 의미한다.

일부 구체예에서, 상기 식물은 식물에서 추출, 정제, 또는 획득하기에 바람직한 성분을 함유하는 모든 식물이다. 예를 들어, 상기 식물은 마카, 헤수우, 이포루루(Alchornea Castaneifolia), 칸나(Sceletium Tortosum), 호노키올(Magnolia grandiflora), 대추(Ziziphi Spinosae), 천궁(Fructus Cnidii), 현호색(Corydalis yanhusuo), 알비지아(Cortex albiziae), 인삼(Panax ginseng), 마디풀(Polygoni Multiflori), 푸링(Poria cocos), 산수유(Fructus corni), 참마(Rhizoma dioscoreae), 무이라 푸아마(muira puama), 덴드로비움 종(Dendrobium sp.), 감초 뿌리 기수 (Glycyrrhizae Preparata), 동충하초(Cordyceps sinensis), 중국당귀(Angelicae sinensis), 크라톰(Mitragyna speciosa), 바코파 몬니에리(bacopa monnieri), 카투아바, 아슈와간다, 페가넘 하말라, 밀, 알팔파, 귀리, 카무트, 에키네시아, 클로렐라, 암라, 쏘는 쐐기풀, 캐롭, 메스킷, 추추화사이, 클라보 후아스카, 찬카 피에드라, 구아유사, 로디올라 로제아, 실라짓, 히게나민, 모링가(Moringa oleifera) , 뿔양초(Epidmedium), 황기, 알로에베라, 강황, 소나무, 커큐민(울금 화합물), 홉, 잔토휴몰(홉 화합물), 시계꽃, 무쿠나 퓨리엔스, 투슬리, 흑후추, 바이오페린(흑후추 화합물), 시베리아산 인삼, 화기삼, 마테차(yerba mate), 레몬밤, 황기, 카바, 오미자, 스컬캡, 발레리안, 캘리포니아 포피, 에피데메디움, 파우다르코, 은행, 연꽃, 백합, 차, 커피, 카카오 또는 이러한 식물의 임의의 구성 요소(나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과일, 꽃가루, 씨앗 또는 이와 유사한 것 포함)이거나 그로부터 유래된다. 식물 성분은 식물 오일를 포함할 수 있으며 이는 예를 들어 다음을 포함하는 것이다: 리날룰; b-카리오필렌; b-미르센; d-리모넨; 후물렌; a-피넨; 일랑(Cananga odorata); 야로우(Achillea millefolium); 바이올렛(Viola odorata); 베티버(Vetiveria zizanoides); 바닐라(Vanilla plantifolia); 튜버로즈(Polianthes tuberosa); 타임(Thymus vulgaris L.); 차 나무(Melaleuca alternifolia); 감귤(Citrus reticulata); 가문비나무(Picea mariana); 가문비나무(Tsuga Canadensis); 즈피케나드(Nardostachys jatamansi); 스피어민트(Mentha spicata); 백단향(Santalum spicatum); 자단(Aniba rosaeodora); 로즈마리 버베논(Rosmarinus officinalis); 로즈마리(Rosmarinus officinalis); 장미(Rosa damascena); 로즈제라늄(Pelargonium roseum); 라벤사라(Ravensara aromatica); 플라이(Zingiber cassumunar); 솔잎(Pinus sylvestris L.); 페티그레인(Citrus aurantium); 페퍼민트(Mentha piperita); 후추(Piper nigrum L.); 파출리(Pogostemon cablin); 팔로산토(Bursera graveolens); 팔마로사(Cymbopogon martini); 오스만투스(Osmanthus fragrans); 오레가노(Origanum vulgare); 오렌지(Citrus sinensis); 참나무 이끼(Evernia prunastri); 육두구(Myristica fragrans); 니아울리(Melaleuca viridifloria); 네롤리(Citrus aurantium); 머틀(Myrtus communis); 몰약(Commiphora myrrha); 미모사(아카시아 디커렌스); 멜리사(Melissa officinalis L.); 마조람(Origanum majorana); 마누카(Leptospermum scoparium); 만다린(Citrus deliciosa); 만다린(Citrus deliciosa); 연꽃(Nelumbo nucifera); 연꽃(Nelumbo nucifera); 연꽃(Nelumbo nucifera); 라임(Citrus aurantifolia); 백합(Lilum aurantum); 레몬그라스(Cymbopogon citratus); 레몬(Citrus limonum); 라벤더(Lavandula angustifolium); 라반딘(Lavandula hybrida Grosso); 카누카(Kunzea ericoides); 주니퍼(Juniperus cummunis); 자스민(Jasminum officinale); 자스민(Jasminum sambac); 헬리크리섬(Helichrysum italicum); 자몽(Citrus xparadisi); 자몽(Citrus paradisi); 생강(Zingiber officinalis); 제라늄(Pelargonium graveolens); 제라늄(Pelargonium graveolens, 'Herit); 치자나무(Gardenia jasminoides); 갈바눔(Ferula galbaniflua); 유향(Boswellia carterii); 프랜지파니(Plumeria alba); 백색 전나무잎(Abies alba); 시베리아 전나무잎(Abies siberica); 캐나다 전나무잎(Abies balsamea); 회향(Foeniculum vulgare); 유칼립투스 스미디(Eucalyptus Smithii). 유칼립투스 라디에타(Eucalyptus Radiata), 유칼립투스 글로불루스(Eucalyptus Globulus), 유칼립투스 시트리오도라(Eucalyptus Citriodora), 유칼립투스 블루 말리(Eucalyptus polybractea); 엘레미(Canarium luzonicum); 딜(Anethum graveolens); 사이프러스(Cupressus sempervirens); 커민(Cuminum cyminum); 고수풀(Coriandum sativum); 코코아(Theobroma cacao); 정향(Eugenia caryophylatta); 클라리세이지(Salvia sclarea); 시스투스(Labdanum)(Cistus ladaniferus L.); 계피(Cinnamomum zeylanicum); 카모마일(Anthemis nobilis); 카모마일(Matricaria chamomilla); 셀러리 종자(Apium graveolins); 삼나무(Thuja plicata); 삼나무(Juniperus virginiana); 삼나무 아틀라스(Cedrus atlantica); 당근 종자(Daucus carota); 카다몬(Elettaria Cardamomum); 캐러웨이 종자(Carum carvi); 카예푸트(Melaleuca cajuputi); 케이드(Juniperus oxycedrus); 자작나무(Betula alba); 자작나무(Betula lenta); 베르가못(Citrus bergamia); 월계수나무(Laurus nobilis); 바질(Ocimum Basilicum); 바질(Ocimum sanctum); 바질(Ocimum Basilicum); 발삼 포플러(Populus balsamifera); 페루 발삼(Myroxylon balsamum); 또는 당귀(Angelica archangelica L.).

일부 구체예에서, 상기 식물은 마테차(yerba mate)이다. 본 명세서에 사용된 "마테차"라는 용어는 명세서에 비추어 이해되는 일반적인 의미를 가지며, 약용 식물인 Ilex paraguariensis를 지칭한다. 마테차 잎은 전통적으로 메탄올, 에탄올 및/또는 아세톤의 수용성 혼합물을 사용하여 통상적인 고체/액체 추출법으로 추출되었다. 이러한 화학물질과 전통적인 추출 방법은 가혹하며, 주요 경제적, 환경적 영향을 초래한다. 환경 친화적인 공정을 개발한다는 목표로, 마테차를 포함한 식물에서 물질을 추출하는 데 사용되는 NaDES가 본원에 개시되는 것이다.

Ilex paraguariensis는 남미에서 가장 상용화된 약용 식물 중 하나이며 자연적으로 자라고 아르헨티나, 우루과이, 브라질 및 파라과이에서 재배된다. 이 식물의 구성 요소는 차와 같은 음료를 만드는 데 사용된다(Croge et al., 2020). 마테차는 전 세계적으로 오랫동안 사용되어 왔다. 유럽에서는 체중 감량, 신체적 및 정신적 피로, 신경성 우울증, 류마티스 통증, 및 심인성- 또는 피로-관련 두통에 사용한다. 독일에서는 체중 감량 보조제로 인기를 얻었다. 마테차는 독일 전문논문에 실린 주제인데, 정신적, 신체적 피로에 대한 승인된 용도를 나열하고 있으며, 각성, 이뇨, 수축력 증가, 심박동 증가, 당원 분해, 및 지방 분해 효과가 있는 것으로 기술되어 있다. 프랑스에서는 마테차가 무력증(쇠약이나 에너지 부족) 치료, 체중 감량 프로그램 보조제로서, 및 신장의 수분 배설 증가를 위해 승인되었다. 1996년 영국 약초 약전에도 피로, 체중 감소, 및 두통 치료에 대한 적응증과 함께 나타나 있다. 미국에서 마테차는 관절염, 두통, 치질, 체액 축적, 비만, 피로, 스트레스, 변비, 알레르기, 꽃가루열에 권장되었으며 혈액을 정화하고, 신경계를 강화하고, 노화를 늦추고, 정신을 자극하고, 식욕을 조절하고, 코르티손 생성을 자극하기 위해 사용되며, 다른 약초의 치유력을 강화하는 것으로 여겨진다. 마테차는 인도에서도 재배되며, 인도 아유르베다 약전에서는 마테를 심인성 두통, 신경성 우울증, 피로, 및 류마티스 통증 치료를 위한 것이라 나열한다(Heck & De Mejia, 2007).

마테차의 주요 알려진 생체활성 화학 성분에는 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산 및 마테스포닌이 포함된다. 예를 들어, 잔틴 알칼로이드에는 카페인(1,3,7-트리메틸잔틴), 테오브로민(3,7-디메틸잔틴), 및 테오필린(1,3-디메틸잔틴) 그리고 이의 유사체 또는 유도체가 포함된다. 예를 들어 클로로겐산에는 카페산과 탄닌, 그리고 이의 유사체 또는 유도체가 포함된다(Oellig et al., 2018). 마테차 잎의 함량을 분석한 결과, 중량 기준으로 0.7-2%의 카페인, 0.3-0.9%의 테오브로민, 비교적 소량의 테오필린, 사포닌, 및 10%의 카페산 유도체(클로로겐산, 카페산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일퀸산 및 4,5-디카페오일퀸산)가 함유되어 있는 것으로 보고되었다(Matei et al., 2016). 마테차에서 발견되는 다른 화학 물질에는 알파-아미린, 알파-테르피네올, 아라키드산, 베타-아미린, 부티르산, 5-o-카페오일퀸산, 칼슘, 카로틴, 콜린, 클로로필, 국화(chrysanthemum), 시아니딘-3-o-크실로실-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드, 에센셜 오일, 유게놀, 게라니올, 게라닐 아세톤, 과야칸 b, 인돌, 이노시톨, 이오논, 이소-부티르산, 이소-카프로산, 이소-클로로겐산, 이소-발레르산, 캠페롤, 라우르산, 레불로스, 리날룰, 리놀레산, 마테 사포닌, 네오클로로겐산, 네롤리돌, 니코틴산, 누디카우신 c, 옥탄-1-올, 옥탄산, 올레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 피리독신, 케르세틴, 라피노스, 사프롤, 스테아르산, 탄닌, 테오브로민, 테오필린, 트리고넬린, 및 우르솔산이 포함된다. 또한 예르바 마테 잎 재료에서도 7%~14%의 탄닌이 보고되었다(Bastos et al., 2007; Bojic et al., 2013; Burris et al., 2012; Chandrasekara & Shahidi, 2018; Chianese et al., 2019; Ferreira Cuelho et al., 2015; Frizon et al., 2018; Isolabella et al., 2010; Junior & Morand, 2016; Puangpraphant, 2012; Riachi et al., 2018; Souza et al., 2015). 도 1a와 1b는 마테차의 주요 성분을 보여준다.

테오브로민은 혈관 확장제, 이뇨제 및 심장 자극제로 사용된다. 테오브로민은 아데노신 수용체 길항제이자 포스포디에스테라제 억제제로 알려져 있으며, 피로와 기립성 저혈압 관리에 도움이 될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물", "추출", "추출하는" 또는 그 파생어는 명세서에 비추어 이해되는 일반적인 의미를 가지며, 출발 물질로부터 물질, 화합물, 조성물, 또는 기타 구성 요소를 제거하는 공정을 의미한다. 추출 공정은 물리적 또는 화학적 추출을 포함한 다양한 수단을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어 압착, 분쇄, 가열, 교반, 또는 출발 물질에서 성분을 추출하는 다른 알려진 방법에 의한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단리물", "단리", "단리하는" 또는 그 파생어는 명세서에 비추어 이해되는 일반적인 의미를 가지며, 식물 추출물의 성분과 같은 물질을 지칭하는데, 이는 자연적으로 발생하는 환경에서 발견되는 물질과 통상적으로 동반되거나 그 물질과 상호 작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없거나, 가공된 예르바 마테 물질과 같이 가공된 형태로 물질 또는 단리 공정 중에 사용되는 물질과 동반되거나 그 물질과 상호 작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 원하는 성분이 조성물의 주요 또는 일차 성분인 조성물을 지칭하며, 예를 들어 조성물의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 구성하는 것을 지칭한다(예: 중량/중량 및/또는 중량/부피). 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 정제된"이란, 마테차에서 유래된 화합물과 같이, 자연 환경이나 그 가공된 형태에서 제거되거나, 단리되거나 분리된 것으로서, 자연적으로 결합된 다른 성분들이 60% 이상, 예를 들어 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%가 없는 화합물을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 심층 공융 용매"(NaDES)는 명세서에 비추어 이해되는 일반적인 의미를 가지며, 일반적으로 실온에서 고체인 당, 아미노산 또는 유기산을 지칭하지만 특정 몰 분율로 결합되면 높은 녹는점 저하를 나타내어 실온에서 액체가 된다.

심층 공융 용매(DES)의 발견은 녹색 화학 분야의 주요 획기적인 진전이다. 심층 공융 용매는 주로 수소 결합을 통해 결합할 수 있는 화합물의 이원 또는 삼원 혼합물로 정의되는 경우가 많다. 이들 화합물을 특정 몰 비율로 결합하면 공융 혼합물이 생성된다. 이러한 용매는 두 개 이상의 저렴한 무독성 성분으로 구성되는데, 그 중 하나는 수소 결합 수용체의 특성을 가지고 있고, 다른 하나는 수소 결합 공여체의 특성을 가지고 있다. 분자 내 수소 결합과 반데르발스 상호 작용의 형성으로 인해 이러한 용매는 개별 구성 요소의 녹는점보다 훨씬 낮은 녹는점을 갖는다. 심층 공융혼합물의 예로는 히드록시에틸트리메틸 암모늄(염화콜린)(녹는점 T_m = 302℃)과 요소(T_m = 133℃)의 혼합물이 있는데, 그 결과 매우 낮은 녹는점(Tm = 12℃)의 공융혼합물이 생성된다. 이러한 용매의 흥미로운 점은 주변 온도에서 액체일 뿐만 아니라 조절이 가능하고 용해성이 매우 높다는 것이다(Abbott et al., 2004).

천연 심층 공융 용매(NaDES)는 예컨대 유기염으로서 염화콜린 및 베타인, 수소 결합 공여체로서 요소, 유기산, 아미노산, 또는 당과 같이 생체분자로부터 제조된 특정 종류의 DES이다(Dai, 2006, 2007). 이 범주에는 유기산, 아미노산, 당, 폴리올, 및 콜린 유도체와 같은 1차 대사산물로 만들어진 DES가 포함된다(Dai et al., 2013). 또한, 물도 NaDES 조성의 일부가 될 수 있다. 놀랍게도 NaDES는 세포 내 및 세포 외 배지 모두에서 살아있는 유기체에 널리 존재하며, 거기서 플라보노이드와 같은 용해성이 낮은 대사산물의 합성 및 용해, 효소 반응성, 및 가뭄 내성에도 역할을 할 수 있다. 이 패러다임에서 NaDES는 물과 지질로부터 분리된 세 번째 유형의 자연 액체를 구성한다(Choi et al., 2011). 콜린 클로라이드와 구연산, 사과산, 말레산 및 아스코르브산의 조합, 프롤린과 구연산, 사과산과 포도당의 조합, 그리고 당 혼합물(예: 과당:포도당, 과당:자당, 포도당:자당)을 포함하여 풍부한 생체 분자로부터 일련의 NaDES가 형성되었다. NaDES는 생체 분자 추출을 위한 환경 친화적인 대체 용매로 간주된다(Liu et al., 2018).

NaDES는 낮은 증기압, 불연성, 낮거나 무시할 수 있는 독성, 환경 친화적, 제조 용이성 및 낮은 비용과 같은 용매로서 유리한 특성을 나타낸다. NaDES 종은 천연물에 대한 뛰어난 용해 능력을 보이기 때문에 NaDES를 추출 매체로 사용하는 데 특별한 이점이 있다. NaDES 구성 요소의 가장 두드러진 작용기는 카르복실산, 히드록실기, 및 카르보닐기이다. NaDES 매트릭스에서 이러한 기들은 물리화학적 환경을 변형시키는 분자 간 상호 작용을 통해 수소 결합 네트워크를 형성할 수 있다. 일반적으로 분자간 인력이 클수록 극성은 커진다. 따라서 극성은 일반적으로 가용화 특성이다. NaDES 매트릭스의 독특한 분자간 상호작용이나 배열은 특별한 용해화 및 안정화 특성을 생성한다. 예를 들어, 프롤린은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 거의 녹지 않지만, 프롤린을 기반으로 한 다중 성분 NaDES는 동일한 유기 용매에 완전히 혼합될 수 있다.

NaDES는 생물학적 활성을 가지고 있으며 특정 생물학적 활성을 갖도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 항산화 및/또는 항암 활성이 있는 용매가 필요한 경우 원하는 생물학적 활성을 가진 화합물을 사용하여 NaDES를 제조할 수 있다. 이전에는 추출 목적으로 사용된 NaDES가 얻은 식물 추출물의 항산화 활성을 향상시킬 수 있다는 것이 입증되었는데, 이는 NaDES 자체 또는 NaDES 형성 화합물의 활성 산소종 소거 활성으로 설명할 수 있다. 이들 NaDES의 항산화 활성은 예상치 못한 것이 아니었는데, 형성하는 화합물(사과산, 구연산, 프롤린 및 베타인) 역시 항산화 활성을 가지고 있기 때문이다. 게다가 NaDES의 성분은 자연에 풍부하게 존재하며 우리의 일상 식단에 포함되어 있을 뿐만 아니라 시중에 이미 존재되는 식품 보충제(예: 콜린, 구연산, 베타인, 아미노산 등)에도 포함되어 있다. NaDES로 얻은 추출물은 값비싼 하류 정제 단계가 필요 없이 식품, 제약, 화장품 및 농약 제품에 직접 사용될 수 있을 것으로 기대된다. NaDES는 페놀산의 생물학적 활성도 향상시키고(Faggian et al., 2016) 식품, 화장품, 및 약학적 제제에 직접 사용될 수 있다.

NaDES는 세포 내 및 세포 외 배지 모두에서 살아있는 유기체에 널리 존재하며 플라보노이드와 같은 용해성이 낮은 대사산물의 합성 및 용해에 역할을 한다. NaDES는 효소 반응성과 가뭄 내성에도 역할을 한다. NaDES는 낮은 증기압, 불연성, 낮거나 무시할 수 있는 수준의 독성, 부정적인 환경 영향 없음, 저비용 및 사용 용이성 등을 포함하여 여러 가지 유리한 특성을 보인다. 또한 NaDES의 구조적 조합의 수가 엄청나기 때문에 각각의 특정 응용 분야에 맞게 NaDES 조합을 최적으로 설계할 수 있다. NaDES는 생체적합성이 뛰어나며 생물학적 활성을 향상시킨다. 따라서 특정 생물학적 활성을 갖는 NaDES를 함유한 조성물을 최적으로 설계하는 것이 가능하다. NaDES로부터 얻어지고 조성물에 NaDES가 존재하는 추출물은 식품, 건강기능식품, 제약, 화장품, 농약, 및 산업적 용도로 사용될 수 있다.

여기에 기술된 방법은 전체 식물, 줄기, 잎, 또는 식물의 다른 부분을 포함하는 마테차 식물 재료과 같은 식물성 재료를 개선되고 효율적이며 환경 친화적인 방법으로 가공하는 것과 관련된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 마테차 식물 재료를 제공하는 단계, 최적의 NaDES를 스크리닝하는 단계, 마테차 식물 재료를 NaDES와 혼합하는 단계, 및 마테차에서 관심 있는 화합물 하나 이상을 단리하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 식물 재료는 직접 재배한 전체 식물 재료과 같은 가공되지 않은 날 것의 원료이다. 일부 구체예에서, 상기 식물 재료는 건조된 식물 재료, 혼합된 식물 재료, 분쇄된 식물 재료, 분쇄된 식물 재료, 분말화된 식물 재료, 액상 식물 재료, 또는 기타 가공된 임의의 재료와 같은 가공된 물질이다. 일부 구체예에서, 마테차 식물 재료는 전체 식물, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 나무껍질, 또는 식물의 임의의 다른 부분이다.

일부 구체예에서, NaDES는 염화콜린, 구연산, 사과산, 말레산, 아스코르브산, 프롤린, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 NaDES를 포함한다. 하나 이상의 NaDES 조합은 다양한 비율 예를 들어, 임의의 두 개의 NaDES에 대해 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:3, 3:2, 2:1, 3:1 또는 4:1로, 또는 임의의 세 개 이상의 NaDES에 대해 이러한 비율의 임의적 조합으로 제공될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 NaDES는 첫 번째 NaDES 및 물, 그리고 적어도 하나의 수소 결합 공여체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 수소 결합 공여체는 유기산 또는 폴리올이다. 일부 구체예에서, 상기 수소 결합 공여체는 유기산이며, 예를 들어 락트산, 사과산, 말레산, 피루브산, 푸마르산, 숙신산, 구연산, 아세트산, 우르솔산, 타르타르산, 아스코르브산, 말론산, 옥살산, 글루쿠론산, 뉴라민산, 시알산, 시키믹산, 피트산, 갈락투론산, 이두론산, 히알루론산, 히드록시구연산, 및 락톤 유도체를 포함하는 것이다. NaDES의 예시적 조합은 표 1에 나와 있다.

표 1: NADES의 대표적인 조합

조합	염화콜린(CL)	구연산(CIT)	포도당(GLU)	자당(SUC)	물
CITGLU 2:1		2	1		30%
CITGLU 1:1		1	1		30%
CITGLU 1:2		1	2		30%
CITSUC 2:1		2		1	30%
CITSUC 1:1		1		1	30%
CITSUC 1:2		1		2	30%
CLCIT 3:1	3	1			30%
CLCIT 2:1	2	1			30%
CLCIT 1:1	1	1			30%
CLCIT 1:2	1	2			30%
CLCIT 1:3	1	3			30%
CLCIT 1:1	1	1			50%
CLCIT 1:1	1	1			80%
CLGLU 1:1	1		1		30%
CLSUC 1:1	1			1	30%
CITGLU 1:1		1	1		30%
CITSUC 1:1		1		1	30%
CLCITGLU 1:1:1	1	1	1		30%
CLCITSUC 1:1:1	1	1		1	30%

일부 구체예에서, 마테차로부터 단리된 관심 화합물은 페놀산, 클로로겐산, 플라보노이드, 알칼로이드, 테르펜, 향료, 항산화제, 또는 사포닌, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 구체예에서, 식물 및/또는 식물 재료를 NaDES와 혼합하는 것은 식물 및/또는 식물 재료를 NaDES 용액에 담그거나, 분무하거나, 코팅하거나, 또는 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 혼합물을 가열하는 단계, 혼합물을 교반하는 단계, 혼합물을 불리는 단계, 또는 혼합물을 함침시키는 단계, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 혼합물을 가열하는 단계는 혼합물을 약 15℃ 내지 약 80℃의 온도 범위, 예를 들어 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80℃로 가열하거나, 상기 언급된 값 중 임의의 두 개로 정의되는 범위 내의 온도로 가열함으로써 수행될 수 있다.

일부 구체예에서, 관심 화합물을 단리하는 단계는 혼합물을 여과하고, 혼합물을 분무 건조하거나, 또는 관심 화합물을 단리하기 위한 다른 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, NaDES는 마테차 잎을 포함한 잎과 같은 식물성 물질을 가공하기 위한 추출 용매로 사용된다. 본 개시내용 전체를 통하여 설명된 대로, NaDES는 식물 및/또는 식물 재료로부터 생체활성 물질을 추출하는 데 이상적인 용매이다. 일부 구체예에서 NaDES는 페놀산의 용해도를 증가시킨다.

NaDES는 유기 용매에 비해 더 친환경적인 대안이며, 설계 능력과 조정 가능한 속성으로 인해 원하는 성분을 추출하기 위해 뿐만 아니라 건강기능식품, 제약, 화장품 및 식품 산업과 같은 다양한 분야에서 사용하기 위해 추가로 맞춤화할 수 있다.

여기에 제공된 일부 구체예는 여기에 기술된 방법을 사용하여 NaDES를 사용하여 식물 및/또는 식물 재료로부터 정제, 추출, 또는 분리된 NaDES 및 생체활성 화합물을 포함하는 조성물과 관련된다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 약학적, 화장품적, 또는 식품 용도로 제제화된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물" 또는 "제제"는 본 명세서에 비추어 일반적인 의미를 가지며 주어진 목적을 위해 함께 제시된 요소, 구성 요소, 또는 조성물의 조합을 의미한다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 식물 및/또는 식물 재료로부터 단리, 정제, 또는 추출된 유효량의 NaDES 및 하나 이상의 생체활성 화합물을 포함할 수 있다. 유효량(및 투여 방법)은 개인에 따라 결정되며, 개체(크기, 나이, 전반적인 건강 상태), 치료하려는 상태의 중증도, 치료하려는 증상의 중증도, 원하는 결과, 사용되는 특정 담체 또는 약학적 제제, 투여 경로,및 해당 분야의 기술자에게 명백한 기타 요소를 고려한 것에 기반한다. 상기 유효량은 해당 분야의 통상의 기술을 가진 자가 해당 분야에 알려진 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 여기에 기술된 화합물 및 화합물의 조합의 치료적 유효량은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 시험관 내 시험, 동물 모델, 또는 기타 용량-반응 연구를 사용하여 결정할 수 있다.

본 개시내용의 약학적 조성물은 피내, 정맥내, 피하, 경구, 직장, 질, 비경구, 복강내, 국소, 폐, 비강내, 협측, 안과, 척추강내, 경막외, 또는 다른 투여 경로에 적합한 제제로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 화합물은 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입이나 볼러스 주사에 의해, 상피나 점막피부 내벽(예: 구강 점막, 직장, 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로 활성인 제제와 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신적일 수도 있고 국소적일 수도 있다. 또한, 투여는 단일 용량 또는 일련의 용량에 의할 수 있다.

따라서 본 개시내용은 또한 개체에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 담체는 액체일 수 있으므로 조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있고, 또는 경구 투여에 적합하게 제제화된 고체, 정제 또는 알약일 수 있다. 또한, 상기 담체는 분무 가능한 액체 또는 고체 형태일 수 있으므로 조성물은 흡입에 적합하도록 변형될 수 있다. 비경구적으로 투여할 경우, 조성물에는 발열원이 없어야 하며, 허용 가능한 비경구용 담체에 담겨 있어야 한다. 활성 화합물은 알려진 방법을 사용하여 대안적으로 리포좀 내에 제제화되거나 캡슐화될 수도 있다. 기타 고려된 제제로는 투사형 나노입자와 면역학 기반 제제가 있다.

리포좀은 갇힌 수성 부피를 포함하는 완전히 폐쇄된 지질 이중층 막이다. 리포좀은 단일막(단일 멤브레인) 또는 다중막(다수의 막 이중층으로 특징되는 양파와 비슷한 구조로서 각 막 이중층은 수용액층으로 분리되어 있음)일 수 있는 소포이다. 이중층은 소수성 "꼬리" 영역과 친수성 "머리" 영역을 갖는 두 개의 지질 단일층으로 구성된다. 막 이중층에서 지질 단일층의 소수성(비극성) "꼬리"는 이중층의 중앙을 향해 배향되고, 친수성(극성) "머리"는 수용성 상을 향해 배향된다.

여기에 제공된 조성물은 약학적으로 허용되는 적절한 담체, 안정제, 희석제, 완충액, 또는 적용, 보관, 생물학적 이용 가능성, 용해도를 위한 구성 요소, 또는 조성물의 효능, 심미성 또는 기타 특성을 개선하는 기타 구성 요소 부분을 추가로 포함할 수 있다.

"약학적으로 허용되는" 담체는 사용된 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 담체이다. 약학적으로 허용되는 담체는 유기 또는 무기, 고체 또는 액체 부형제일 수 있으나, 이에 국한되지 아니하며, 이는 국소, 경구 또는 정맥 주사와 같이 선택된 적용 모드에 적합하며, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 캐플릿과 같은 고체 및 용액, 스프레이, 에멀전, 폼, 현탁액, 크림, 로션, 연고(ointment), 연고(salve), 젤 등과 같은 액체와 같은 통상적인 약학 제제의 형태로 투여된다. 종종 생리학적으로 허용되는 담체는 인산염 완충액이나 구연산염 완충액과 같은 수용성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체는 또한 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 아스코르브산을 포함한 항산화제, 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴, 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 아미노산, 포도당, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올, 및 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온, 트윈^TM, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 및 플루로닉스^TM과 같은 비이온성 계면활성제. 보조제, 안정화제, 유화제, 윤활제, 결합제, pH 조절제, 등장화제, 및 기타 일반적인 첨가제도 상기 담체에 첨가될 수 있다.

본원에서 설명한 바와 같이, NaDES 및 식물 및/또는 식물 재료로부터의 생체활성 화합물을 포함하는 조성물은 국소 제제로 제제화될 수 있다. 국소 제제는 또한 예를 들어 NaDES 및 생체활성 화합물의 기능과 생존력을 방해하지 않는 약학적 담체를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 설명된 "약학적 담체"는 국소 제제의 측정 및 투여를 용이하게 하기 위해 약물을 혼합하는 불활성 물질을 말한다.

일부 구체예에서, 상기 활성 성분 및 활성 성분의 혼합물은 예를 들어 저장 및 후속 투여를 위해 제조된 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 국소 제제에서 사용될 수 있다. 본 문서에서 사용되는 "국소"는 제형을 피부 또는 다양한 신체의 구멍에 투여하거나 적용하는 것을 의미한다. 일부 구현예에는 본원에서 기술된 조성물을 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 사용하는 것이 포함된다. 치료적 용도로 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.(1990)에 설명되어 있으며, 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 국소 제제에는 방부제와 안정제가 제공될 수 있다. 방부제는 피부 세포의 영양분이 분해되는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "담체 또는 희석제"는 고체 제형의 경우 고체 담체 또는 희석제, 액체 제형의 경우 액체 담체 또는 희석제, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 고체 담체/희석제에는 검, 전분(예: 옥수수 전분, 프리젤라탄화 전분), 당(예: 락토오스, 만니톨, 자당, 덱스트로오스), 셀룰로오스 물질(예: 미정질 셀룰로스), 아크릴레이트(예: 폴리메틸아크릴레이트), 탄산 칼슘, 산화 마그네슘, 활석, 또는 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 국소 또는 비경구 제제와 같은 액상 제제의 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 수용액 또는 비수용액, 현탁액, 유화액 또는 오일일 수 있다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 에틸 올레에이트와 같은 주입형 유기 에스테르 등이 있다. 수용성 담체에는 물, 알코올/수용액, 유화액 또는 현탁액이 포함되며 식염수 및 완충매질 포함한다. 오일의 예로는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 올리브유, 해바라기유, 생선-간 기름 등이 있다.

비경구적 담체(피하, 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사용)에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거 및 고정유가 포함된다. 정맥 담체에는 체액 및 영양소 보충제, 링거 덱스트로스를 기반으로 한 것과 같은 전해질 보충제 등이 포함된다. 예를 들어, 계면활성제나 기타 약학적으로 허용되는 아주반트를 첨가하거나 첨가하지 않은 물이나 오일과 같은 멸균 액체가 있다. 일반적으로 물, 식염수, 수용성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 프로필렌 글리콜이나 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜은 특히 주사용 용액의 경우 선호되는 액체 담체이다. 오일의 예로는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 올리브유, 해바라기유, 생선-간 기름 등이 있다.

또한, 상기 조성물은 결합제(예: 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로스, 구아검, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 포비돈), 붕괴제(예: 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 구아검, 글리콜산 나트륨 전분), 다양한 pH 및 이온 강도의 완충액(예: 트리스-HCl, 아세트산염, 인산염), 표면에 대한 흡수를 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 세제(예: 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F68, 담즙산염), 프로테아제 억제제, 계면활성제(예: 라우릴 황산나트륨), 투과성 향상제, 용해제(예: 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예: 아스코르브산, 메타중아황산나트륨, 부틸화 히드록시아니솔), 안정화제(예: 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 점도 증가제(예: 카보머, 콜로이드성 이산화규소, 에틸 셀룰로스, 구아검), 감미료(예: 아스파탐, 구연산), 방부제(예: 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제(예: 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 황산나트륨), 유동 보조제(예: 콜로이드성 이산화규소), 가소제(예: 디에틸 프탈레이트, 트리에틸 시트레이트), 유화제(예: 카보머, 히드록시프로필 셀룰로스, 라우릴 황산나트륨), 폴리머 코팅제(예: 폴록사머 또는 폴록사민), 코팅 및 필름 형성제(예: 에틸 셀룰로스, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 보조제를 더 포함할 수 있다.

국소 제제는 국소 적용을 위한 용액, 스프레이, 에멀전, 폼, 현탁액, 크림, 로션, 연고(ointment), 연고(salve) 또는 젤로 제제화되고 사용될 수 있다. 국소 제제에 적합한 성분으로는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토오스, 레시틴, 알부민 또는 글루탐산나트륨 등이 포함될 수 있다. 원하는 경우 흡수를 증가시키는 제제(예: 리포좀)를 활용할 수 있다. 국소 제제는 또한 예를 들어 하나 이상의 용매 및/또는 적어도 하나의 연화제를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "주입 조성물"은 주사 투여를 위해 제조된 제제를 지칭한다. 이러한 주사는 정맥 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 주사, 관절내 주사 또는 척추강내 주사 등의 경로를 통해 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 약학적 담체는 대두, 자몽 또는 아몬드 오일, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀이다.

코코넛유, 올리브유, 참기름, 땅콩유 및 대두유는 국소 제제에서 현탁제 또는 윤활제로 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 국소 제제는 적어도 하나의 증점제, 적어도 하나의 보습제 및/또는 적어도 하나의 방부제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 증점제에는 트리글리세리드, 팔미테이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 지방 알코올, 공중합체, 셀룰로스 검, 또는 잔탄검이 포함될 수 있다. 보습제는 그것의 보습 능력을 위해 사용될 수 있다. 제한 없이, 보습제로는 PCA나트륨, 나노지질 겔, 글리세린, 알파-히드록시산, 부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 소르비톨, 히알루론산, 요소, 글리세릴 트리아세테이트, 네오아가로비오스, 글리세롤, 자일리톨, 말티톨, 고분자 폴리올, 폴리덱스트로스, 킬라야, MP 디올, 해초 및 조류 추출물, 젖산 등을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예에서, 국소 제제는 적어도 하나의 방부제를 추가로 포함한다. 제한적이지는 않지만 방부제에는 벤조인 수지, 호호바, 비타민 E, 알코올, 페녹시타놀, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 디아졸리디닐 우레아, 소르브산, 및 트리클로산이 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 하나의 방부제는 벤조인 수지, 호호바, 비타민 E, 알코올, 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 디아졸리디닐 우레아, 소르브산 및/또는 트리클로산이다.

관사 "한" 및 "하나"는 본원에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, "한 요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.

"약"이란 기준 수량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 최대 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변하는 수량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.

본 명세서 전체에서 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"이라는 단어는 명시된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 포함하는 것을 의미하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 제외하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

"구성됨"이란 "구성됨"이라는 어구 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 이에 국한됨을 의미한다. 따라서 "구성됨"이라는 어구는 나열된 요소가 필요하거나 의무적이며 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 구성됨"이란 문구 뒤에 나열된 모든 요소를 포함하며, 나열된 요소에 대한 개시내용에서 특정된 활성 또는 행위를 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서 "본질적으로 구성됨"이라는 문구는 나열된 요소가 필수적이거나 의무적이지만 다른 요소는 선택 사항이며 나열된 요소의 활성이나 행동에 중요한 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.

특정 구체예에서, 조성물 내의 주어진 제제의 "순도"는 구체적으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 특정 조성물은 예를 들어 비제한적으로 생화학 및 분석 화학에서 화합물을 분리, 식별, 및 정량화하는 데 자주 사용되는 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피인 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정한 결과, 그 사이의 소수점 이하 모든 자리까지 포함하여 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 이상 순수한 제제를 포함할 수 있다.

일부 구체예는 다음과 같은 열거된 대안에 관한 것이다.

1. 식물 재료로부터 식물 추출물을 단리하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:

식물 재료를 획득하는 단계;

상기 식물 재료를 가공하는 단계;

상기 가공된 식물 재료를 천연 심층 공융 용매(NaDES)와 혼합하는 단계; 및

식물 추출물을 단리하는 단계.

2. 대안 1의 방법에서, 상기 식물 재료를 마테차로부터 얻어지는 방법.

3. 대안 1-2 중 하나의 방법에서, 상기 NaDES는 수소 결합 공여체 분자와 수소 결합 수용체 분자를 포함하는 것인 방법.

4. 대안 1-3 중 하나의 방법에서, 상기 NaDES는 당 기반, 유기산 기반, 염화콜린 기반, 또는 폴리올 기반인 것인 방법.

5. 대안 3의 방법에서, 상기 당 기반 NaDES는 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합인 것인 방법.

6. 대안 3의 방법에서, 상기 유기산 기반 NaDES는 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합과 조합된 구연산인 것인 방법.

7. 대안 3의 방법에서, 상기 염화콜린 기반 NaDES는 구연산, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합과 조합된 염화콜린인 것인 방법.

8. 대안 3의 방법에서, 상기 폴리올 기반 NaDES는 염화콜린, 구연산, 포도당, 과당, 자당, 또는 이들의 조합과 조합된 에리트리톨인 것인 방법.

9. 대안 1-8 대안 중 하나의 방법으로서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 에리트리톨, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.

10. 대안 1-9 중 하나의 방법에서, NaDES는 염화콜린:구연산, 염화콜린:포도당, 염화콜린:자당, 염화콜린:과당, 포도당:자당, 포도당:과당, 구연산:포도당, 구연산:자당, 구연산:과당, 에리트리톨:염화콜린, 에리트리톨:구연산, 또는 에리트리톨:포도당:과당을 포함하는 것인 방법.

11. 대안 1-10 중 하나의 방법으로서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함하는 것인 방법.

12. 대안 11의 방법에서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재하는 것인 방법.

13. 대안 11-12 중 하나의 방법에서, 상기 NaDES는 10% 내지 80% 범위의 양으로 물을 포함하는 것인 방법.

14. 대안 1-13 중 하나의 방법에서, 상기 식물 추출물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌인 것인 방법.

15. 대안 14의 방법에서, 상기 잔틴 알칼로이드는 카페인, 테오브로민, 테오필린, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 방법.

16. 대안 14의 방법에서, 상기 클로로겐산은 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 방법.

17. 대안 1-16 중 하나의 방법에서, 상기 혼합 단계 이후에 가열, 교반, 원심분리, 및/또는 여과 단계를 더 포함하는 것인 방법.

18. 대안 1-16 중 하나의 방법에서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 3:1의 비율로 포함하고, 물은 50%로 존재하는 것인 방법.

19. 대안 10의 방법에서, 상기 NaDES는 1:1의 몰 비율로 존재하는 것인 방법.

20. 대안 1-19 중 하나의 방법에서, 상기 식물 추출물은 중량 기준으로 약 5% 내지 약 10%의 범위의 양으로 추출된 테오브로민인 것인 방법.

21. 다음을 포함하는 조성물:

식물성 단리물; 및

천연 심층 공융 용매(NaDES).

22. 대안 21의 조성물에서, 상기 식물성 단리물은 마테차로 유래의 단리물을 포함하는 것인 조성물.

23. 대안 21-22 중 하나의 조성물에서, 상기 식물성 단리물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌을 포함하는 것인 조성물.

24. 대안 21-23 중 하나의 조성물에서, 상기 식물성 단리물은 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 조성물.

25. 대안 21-24 중 하나의 조성물에서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 에리트리톨, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.

26. 대안 21-25 중 하나의 조성물에서, 상기 NaDES는 염화콜린:구연산, 염화콜린:포도당, 염화콜린:자당, 염화콜린:과당, 포도당:자당, 포도당:과당, 구연산:포도당, 구연산:자당, 구연산:과당, 에리트리톨:염화콜린, 에리트리톨:구연산, 또는 에리트리톨:포도당:과당을 포함하는 것인 조성물.

27. 대안 21-26 중 하나의 조성물에서, 상기 NaDES는 1:1의 몰 비율로 존재하는 것인 조성물.

28. 대안 21-27 중 하나의 조성물에서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함하는 것인 조성물.

29. 대안 28의 조성물에서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재하는 것인 조성물.

30. 대안 21의 조성물에서, 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체, 3:1의 비율로 존재하는 염화콜린 및 구연산, 및 50%의 물을 포함하는 것인 조성물.

실시예

위에서 논의된 구체예의 일부 측면은 다음의 실시예에서 더 자세히 개시되며, 이는 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 해당 기술 분야에 종사하는 사람이라면, 본 명세서의 상기 설명 및 청구범위에 기술된 바와 같이, 다른 많은 구체예 역시 본 개시내용의 범위에 속한다는 점을 이해할 것이다.

여기에 제공된 실시예는 NaDES를 사용하여 마테차로부터 생체활성 화합물을 추출, 정제 및 단리하는 방법에 관한 것이다. 그러나 실시예에 설명된 방법, 기술, 및 분석법을 사용하여 다른 식물 및/또는 식물 재료를 사용할 수도 있다는 점을 이해해야 한다.

재료 및 방법

실험은 Triunfo에서 공급받은 분말 유기 마테차 잎을 대상으로 수행되었다. 현재 연구에 사용되는 화학물질, 시약 및 참조 표준은 표 2에 나열되어 있다.

표 2: 화학 물질, 시약 및 참조 표준

이름	공급업체	제품 번호
물	FISHER, HPLC 등급	ZZLFS/W5-4
메탄올	FISHER, HPLC 등급	ZZLFS/A452-4
아세토니트릴	FISHER, HPLC 등급	ZZLFS/A998-4
수산화나트륨	스케델코 AR 99+%	ZZLSD/S0112-1
염산	허니웰 37%,	ZZLHW/10189005
포름산	Fisher, OPTIMA/CMS 등급	ZZLFS/A117*50
에탄올	FISHER, ABSOLUTE	ZZLFK/E/0650/17
구연산	FISHER, AR 등급	ZZLFK/C/6200/60
자당	FISHER	ZZLFK/S/8600/60
D(+)-포도당	FISHER, ACS 시약	zzlac/41095-5000
염화콜린	시그마, > 98%	ZZLSM/C1879
Folin-Ciocalteu 페놀 시약	시그마, F9252	BCCD8944
염화 알루미늄 6수화물	시그마, 237078	STBJ4732
바닐린	시그마, 시약 PLUE, V1104	BCCF3063
탄산나트륨 일수화물	시그마, 99.5%, 230952	MKCH8168
클로로겐산	시그마 C3878-250mg	wxbd1890V
카페인	시그마 PHR1009-1G	LRAC4115
테오브로민	시그마, PHR1837-100MG	LRAC5082
루틴	시그마, PHL89570-50MG	66853802
3,5-디카페오일퀸산	시그마, PHL80426-10MG	95324746
4,5-디카페오일퀸산	시그마, PHL80427-10MG	111538786
3.4-도카페오일퀸산	시그마, PHL80425	113335440
올레아놀산	시그마, 1478141-15MG	F05100
우르솔산	시그마, 1707770-25mg	F0L539
아스코르브산	시그마, PHR1008-2G	LRAC2886
DPPH	i-DNA Biotechnology, 14805-100	0590386-8

공융 용매의 제조

공융 혼합물의 다양한 성분(염화콜린, 포도당, 자당 및 구연산)을 달아서 지정된 순서 없이 삼각 플라스크에 넣었다. 수돗물, 하지만 바람직하게는 탈염수나 증류수를 물리화학적, 미생물학적 무결성을 유지하는 농도(중량 기준)로 첨가한다. 이 농도는 중량 기준으로 혼합물의 1 내지 50%, 바람직하게는 30 내지 50%, 이상적으로는 50%가 된다. 여기에서 선택된 공융 혼합물은 구연산 대 포도당(2:1, 1:1, 1:2몰), 구연산 대 자당(2:1, 1:1, 1:2몰), 염화콜린 대 구연산(1:1, 1:2, 1:3, 3:1, 2:1몰), 염화콜린 대 포도당(1:1몰), 염화콜린 대 자당(1:1몰)으로, 각각 30중량%의 물을 함유하고; 염화콜린 대 구연산(1:1몰)으로 30%, 50%, 및 80%의 물을 함유한다. 그러나 염화콜린과 정의된 수소 결합 공여체의 다른 조합이 사용될 수도 있음을 인식할 것이다. 혼합물을 50℃±2℃로 가열하고 자석 교반 하에 균질화했다. 일단 매체가 완전히 용해되고 녹으면 실온에 두었다가 사용할 때까지 용기에 담아 보관한다.

침출법에 의한 고체/액체 추출

10그램의 마테차 잎 분말을 통상적인 용매(물, 물/구연산, 수용성 에탄올) 또는 공융 용매에 담갔다. 혼합물을 100ml 유리 비이커 내에서 자석 교반하면서 가열했다. 추출 후, 액체를 튜브에 옮겨 원심분리(3500rpm, 10분)한 다음, 5-7μm 셀룰로스 여과지를 사용하여 여과하여 고체 및 액체 부분을 분리했다.

실험 설계:

3가지 변수, 추출 온도(A), 액체/고체 비율(B), 추출 시간(C)의 효과가 3단계 Box-Behnken Design(BBD)을 사용하여 조사 및 최적화되었다. 따라서 중심점에서 3회 반복하는 15회 실험 BBD를 사용하여 마테차 잎의 추출 수율에 영향을 미치는 공정 요인을 최적화하는 회귀 방정식을 맞추었다. 해당 요인과 수준은 표 3에 나와 있다. 통계적 계산을 위해 변수는 높은 값, 중간 값, 낮은 값에 대해 각각 +1, 0, -1로 코딩되었다.

표 3: 연구에 사용된 독립 요인 및 수준

독립 요인	심볼	수준
독립 요인	심볼	-1	0	1
온도	A	40	55	70
용매/공급 비율	B	5	17.5	30
시간	C	60	120	180

이러한 요인 및 수준은 추출 수율 및 총 클로로겐산(CGA) 및 카페인 함량을 종속 변수로서의 특징으로 하는 최적 추출 조건을 달성하는 데 중요한 것으로 간주되었다. 2차 다항식 모델은 반응 표면 분석에서 종속 변수를 예측하고 각 추출 요인의 효과를 평가하는 데 사용되었다. 이 모델은 방정식 1로 설명된다.

방정식 1

여기서 Y는 반응 변수이고, A₀, A_i, A_ii 및 A_ij는 각각 절편, 선형, 이차 및 상호 작용 항에 대한 회귀 계수이고, X_i 및 X_j는 독립 변수(i ≠ j)를 나타낸다. 이 모델은 각 독립 변수가 반응에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었다.

실험 데이터 분석은 Design Expert Version 13을 사용하여 회귀 방정식을 생성하고 최적의 매개변수 조합을 결정하기 위해 수행되었다. 모델 계수의 통계적 유의성은 분산 분석(ANOVA)과 Fisher의 F-검정을 결합하고 P 값 0.05의 확률로 결정되었다. 모델의 정확도는 또한 모델의 적합도 척도인 결정계수 R2를 통해서도 확인되었다. 적합된 다항식 방정식은 반응과 변수 간의 관계를 설명하기 위해 3차원 반응 표면과 2차원 등고선 그림의 형태로 표현되었다.

고성능 액체 크로마토그래피에 의한 관심 화합물의 정량화

HPLC 분석은 다이오드 어레이 검출기(DAD)와 Accucore C18 컬럼(150mm × 2.1mm, 입자 크기 2.6μm)이 장착된 Thermo Fisher Vanquish 시리즈 시스템에서 수행되었다. 분리를 위한 이동상은 물/포름산(99.9:0.1, v/v)(용매 A) 및 아세토니트릴/포름산(99.9:0.1, v/v)(용매 B)이었다. 컬럼 온도는 30℃로 유지되었고, 자동샘플러는 4℃로 유지되었다. 주입 부피는 1μl이고, 유속은 0.5ml/min으로 설정되었다. 분석에 앞서, 샘플을 0.22 μm PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 필터로 여과하고 표 4에 표시된 용출 구배에 따라 분석했다.

표 4: HPLC 구배 프로그램

시간(분)	아(%)	비(%)
0	95	5
10	80	20
12	80	20
15	95	5
15.1	5	95
16.5	5	95
16.6	95	5
19	95	5

마테차 생활성 물질의 보유 시간과 스펙트럼 데이터는 외부 표준과 비교되었다. 카페인과 테오브로민은 280nm에서 확인되었고, 클로로겐산(3-O-카페오일퀸산)(3-CQA), 4-O-카페오일퀸산(4-CQA), 5-O-카페오일퀸산(5-CQA), 3,4-디카페오일퀸산(3,4-diCQA), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-diCQA), 4,5-디카페오일퀸산(4,5-diCQA) 및 루틴은 350nm에서 확인되었다.

각각의 표준 용액은 메탄올에 3mg/ml의 농도로 제조되었고, 이를 동일한 부피로 혼합하여 농도 0.5mg/ml의 혼합 용액을 만든 다음 단계적으로 0.375, 0.25, 0.125, 0.025 및 0.005mg/ml로 희석하였다.

각 3-CQA 이성질체의 농도는 교정 곡선을 사용한 외부 표준 방법을 사용하여 3-CQA 당량으로 계산되었다. 총 CGA는 주요 CGA 이성질체인 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA 및 4,5-diCQA의 합으로 계산되었다.

항산화제로서의 물리화학적 효능 시험

2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH)은 천연품의 자유 라디칼 소거 특성을 평가하는데 사용되는 자유 라디칼이다. 이는 분자 전체에 걸쳐 비공유 전자가 비국재화됨으로써 안정한 자유 라디칼로 특징지어지므로, 대부분의 다른 자유 라디칼이 그런 것처럼 분자가 이량체화되지 않는다. 비국재화는 또한 짙은 보라색을 낳는다. DPPH 용액을 수소 원자를 줄 수 있는 화합물과 섞으면 보라색이 사라지고 환원된 형태인 디페닐-피크릴-히드라진이 생성된다. 모든 추출물의 자유 라디칼 소거 활성은 이전에 보고된 방법(Shen et al., 2010)에 따라 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(DPPH)에 의해 평가되었다.

각 샘플의 건조 추출물 30mg을 10ml의 메탄올에 희석하여 3mg/mL의 농도를 스톡 용액으로서 얻었다. 이 스톡 용액에서 1.5, 0.75, 0.375, 0.1875, 0.09375, 0.046875, 0.0234275 및 0.01171825 mg/mL의 농도가 얻어졌다. 아스코르브산, 루틴, 클로로겐산을 순수한 기준 표준으로 사용하여 양성 대조군으로 사용하고, 메탄올에 용해하여 동일한 농도의 추출물 용액으로 스톡 용액을 만들었다.

DPPH(7.89mg)는 최소 무게 한계가 10μg 이하인 화학 저울로 칭량되었다. 그 후, 100ml의 메스플라스크(0.2mM DPPH)에 채워 HPLC 등급 메탄올에 녹여 일정한 부피를 얻었다. 그런 다음 이 용액을 0.1 mM로 더 희석한다. DPPH 용액의 흡광도는 제조 후 약 1시간까지 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 경험적으로 알려져 있다. 따라서 흡광도가 안정될 때까지 2시간 동안 어두운 곳에 두었다.

DPPH 용액은 어세이 동안 실온의 어두운 곳에 보관하였으며, 조제 당일에 전부 사용하였다. 각 시료 농도 0.3 mL와 양성 대조군을 0.1 mM DPPH 용액 2.7 mL에 첨가하였다. 반응은 25℃의 어두운 환경에서 알루미늄 종이로 덮인 튜브 안에서 일어났다. 혼합물을 세게 흔든 후 실온에 30분간 방치한다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더(Varioskan LUX, ThermoFisher)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정했다. 대조 샘플은 추출물과 기준 아스코르브산 없이 동일한 부피를 함유하도록 준비하였고; 메탄올은 블랭크로 사용되었으며 DPPH 자유 라디칼의 소거율(%)은 다음 방정식을 사용하여 측정되었다.

DPPH 소거 효과 (% 억제) = {(Ac -As)/Ac)*100}

여기서, Ac = DPPH만의 흡광도, As = 다양한 농도의 추출물과 함께 DPPH의 흡광도이다.

상기 측정은 8개의 집중점에서 수행되었다. 각 농도에 대한 측정과 분석 샘플 용액은 3회 반복되었다.

각 분석 샘플의 IC₅₀은 다음 절차에 따라 계산되었다: 억제율은 6개 지점 모두에서 샘플 농도에 대해 플롯되었고 각각의 회귀선(y = ax + b)이 그려졌다. 회귀선은 원점을 지날 필요는 없었다. 이 단계에서는 모든 측정 지점이 회귀선상에 있는지 입증했다. 또한 억제율이 50% 정도인 두 지점에서는 회귀선으로부터 편차가 없는 것으로 또한 입증되었다. 회귀 방정식의 Y를 50으로 대입하면 X(샘플 농도)가 계산되었다.

실시예 1: 마테차로부터 생체활성 화합물의 추출

다음 실시예는 마테차로부터 생체활성 화합물을 추출하는 방법의 구체예를 보여준다.

NaDES를 사용한 추출 수율은 물 및 완충수와 같은 기존 용매를 사용한 추출 수율보다 2배 높았는데, 이는 NaDES가 마테차에서 생체활성 화합물을 추출하는 데 있어 명백한 이점을 보였다는 것을 나타낸다. 테스트한 20가지 종류의 NaDES 중에서, NaDES의 상이한 종류에 따라 목적 화합물의 추출 수율이 달랐다. 유기산-기반 NaDES는 당류-기반 NaDES의 경우보다 추출 수율이 더 높았다. NaDES에 구연산이 존재하면 상당하고 예상치 못한 영향을 미친다. 예를 들어 5-CQA의 경우 추출 수율이 10배 증가했다. 추출 수율은 용매의 특성 및 용질과 용매 사이의 가능한 상호작용과 밀접한 관련이 있는 것으로 보인다. 따라서 이러한 결과의 이유는 NaDES와 표적 성분 사이에 형성된 수소 결합의 효과였다. 한편, 구연산을 함유한 NaDES 중 염화콜린과 구연산(CLCit)을 몰비 3:1로 첨가한 것이 가장 높은 추출수율을 보였다. 또한, 물을 추가하고 용매의 점도를 낮추는 것은 추출 수율에 눈에 띄는 영향을 미친다. 따라서, 50% 물을 첨가한 CLCit3:1이 마테차에서 생체활성 성분을 추출하는 데 유리한 NaDES로 선택되었다.

CLCit는 폴리페놀 화합물 추출에 일반적으로 사용되는 물 및 극성 유기 용매(에탄올 및 메탄올)의 극성과 유사한 극성뿐만 아니라 낮은 pH 값과 같은 추출 공정에 바람직한 물리화학적 특성을 보유하고 있다. 추출은 50%의 물을 첨가한 CLCit로 수행되었으며, 이는 물로 희석하면 NaDES의 점도가 감소하고 식물 기질에서 용액으로의 물질(mass) 전달이 향상되고 결과적으로 추출 효율이 증가한다. 또한, 유기산을 수소 결합 공여체로 갖는 선택된 콜린 기반 NaDES는 화합물 그 자체(콜린과 구연산)을 형성하는 생물학적 활성으로 인해 흥미롭고, 이는 아마도 식물 추출물의 생물학적 활성도 향상시킬 수 있을 것이다.

콜린은 아세틸콜린, 세포막 및 신호 전달 인지질의 합성에 필요한 인간 식단의 필수 성분이며 중요한 메틸 공여체로 기능한다. 몇몇 연구에 따르면 식이 콜린 섭취량이나 혈장 농도와 일부 암 유형의 위험 사이에 긍정적인 연관성이 있는 것으로 나타났다. 콜린의 권장 일일 섭취량은 하루 550mg이며, 임신하지 않은 여성의 경우 하루 425mg이다. 성인의 일일 상한 섭취량은 3,500mg/일이며, 이는 해를 끼칠 가능성이 없는 최대 섭취량이다. 마찬가지로, 구연산은 항산화, 항염증, 및 항암 효과 등 다양하고 흥미로운 생물학적 활성을 또한 가지고 있다. 구연산은 많은 과일과 채소, 특히 감귤류에 다량으로 함유되어 있으며, 식품 산업에서 화학적 산성화제, 향미제, 또는 방부제로 널리 사용되는 일반적인 식품 및 음료 첨가물이다. 일반적으로 그것은 자연스럽고 건강한 것으로 여겨지며, 미국 식품의약국(FDA)은 음식과 음료에 구연산을 첨가하는 데 제한을 두지 않다.

추출 방법은 가열 및 교반을 사용하며 가열 및 교반 조건 하에 심층 공융 용매 중에서 목표 분석물을 용해하는 것에 기초한다. 후자는 목표 화합물에 따라 최적화된다. 원심분리 및 여과 단계를 사용하면 샘플 용액에서 심층 공융 용매상을 분리할 수 있다. NaDES의 합성과 추출은 한 번의 공정으로 이루어지므로 이는 공정이 간단하고 확장 가능하도록 한다.

용매에 의해 얻어지는 시너지 향상은 "공융 형성"이라 불리는 자연적인 물리화학적 현상에서 유래하는데, 이는 공융점에 상응하는 혼합물의 임계비율에 도달함으로써 생성되는 것이다. 상기 공융점은 상평형도에서 두 액상 곡선의 교차점에 위치한 점으로, 혼합물의 온도가 가장 낮을 때 액상인 조성물을 생성하게 된다.

추출 조성의 관점에서, 산업용으로 양립 가능한 역치까지 점도를 낮추기 위해 중량 기준으로 1 내지 50%, 바람직하게는 30 내지 50%의 비율로 물을 첨가한다.

본 명세서에 기술된 추출 방법은 물, 염화콜린, 및 폴리올과 유기산으로부터 선택된 수소 결합 공여체를 포함하는 3원 혼합물을 사용하여 수행되며, 염화콜린과 수소 결합 공여체 사이의 몰 비율(2원 혼합물(염화콜린: 수소 결합 공여체) 및 3원 혼합물(물; 염화콜린: 수소 결합 공여체)에 공통적인 비율)의 중요한 공융 형성이 1:3 내지 3:1로 유지되도록 한다. 이 공정을 이용하여 추출물에 함유된 활성종의 놀라운 증가가 얻어졌다. 이 공정을 통해 활성 물질 수율을 최소 6배, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 또는 30배 증가시킬 수 있다.

여기에 설명된 추출 방법은 다음의 예시적 단계를 포함한다: 공융 용매에 침지된 분쇄된 또는 분쇄되지 않은 마테차 잎을 예를 들어 40~70℃에서 1~5시간 동안 교반하면서 대기압 하에서 침지, 포화 및/또는 함침시킨다. 상기 추출 상은 공융 추출 용매에 존재하는 어떠한 화합물 간에도 화학적 변형도 포함하지 않는데, 상기 용매는 추출될 생물학적 물질과 천연 물질에 대해 완전히 불활성이다.

최적화 후, 3:1 비율의 염화콜린/구연산이 마테차에 대해 높은 추출 효율을 갖는 것으로 결정되었다. 추출 조건을 최적화하기 위해 반응 표면 방법론(RSM)이 사용되었다. 최적 조건은 다음과 같다: NaDES의 수분 농도는 50%; 액체/고체 비율은 30; 추출 온도는 55℃; 추출 시간은 180분이다. 가장 높은 추출 수율은 78%였다. 최적화된 추출물의 생리활성 화합물 함량은 다음과 같다: 카페인 23 mg/g; 테오브로민 16 mg/g, 루틴 7 mg/g; 총 클로로겐산 241 mg/g; 클로로겐산 55 mg/g; 4-CQA 63 mg/g; 5-CQA 35 mg/g; 3,4-diCQA 12 mg/g; 3,5-diCQA 54 mg/g; 및 4,5-diCQA 21 mg/g. 실험적으로 얻은 값은 RSM 모델에서 예측한 값과 일치하여 사용된 모델의 적합성과 RSM이 추출 조건을 최적화하는 데 성공했음을 나타낸다. DPPH 억제 IC₅₀ 결과를 통해 특징지어지는 항산화 특성은 수용액 형태의 항산화제보다 항산화제가 로딩된 NaDES 용액의 항산화 잠재력이 현저히 높다는 것을 보여주었다. 가장 좋은 항산화 활성(IC₅₀ = 64 μg mL^-1)을 갖는 샘플은 염화콜린:구연산(몰 비율 3:1)에 50% H₂O(v/v)를 첨가한 샘플이었다. 순수한 클로로겐산 258μg/ml의 IC₅₀를 비교할 때, NaDES로 만든 마테차 추출물은 항산화 능력이 4배 더 높다.

실시예 2: 마테차로부터 생체활성 성분의 개선된 추출

다음 실시예는 마테차로부터 생체활성 성분의 추출을 개선하기 위한 구체예를 보여준다.

마테차 잎으로부터 생체활성 성분 추출은 다음의 세 가지 변수를 사용하여 개선되었다: 마테차 잎 대 NaDES의 액체 비율(5-30), 추출 온도(40-70℃), 및 추출 시간(1-3시간). 최적의 수율을 얻고, 추출 효율을 개선하고, 에너지 소비를 줄이고, 오염 물질 배출을 줄이기 위해 Box-Behnken 설계 원칙에 따라 Minitab 소프트웨어를 사용했다.

3가지 변수(추출 온도, 추출 시간, 및 NaDES 액체 대 공급 비율)의 효과는 3단계 Box-Behnken Design(BBD)을 사용하여 조사되었다. 중심점에서 3회 반복을 포함하여 15회 실험 BBD를 사용하여 생체활성 물질 추출 수율과 항산화 특성에 영향을 미치는 공정 요인을 최적화하기 위해 적용하는 회귀 방정식을 맞추었다. 통계적 계산을 위해 상기 변수는 표 5에 나타낸 대로 높은 값, 중간 값 및 낮은 값에 대해 각각 +1, 0 및 -1로 코딩되었다.

표 5: 독립 변수 및 획득 데이터의 Box-Behnken Design(BBD)

A	B	C	온도(℃)	SF	시간(분)	총 수율	수율(mg/g)
A	B	C	온도(℃)	SF	시간(분)	총 수율	테오브로민	카페인	4-CQA	3-CQA	5-CQA	루틴	3,4-DCQA	4.5-DCQA	3.5-DCQA	총 CQA
0	-1	1	55	5	180	30.03	1.51	7.58	20.53	17.94	11. 27	3.24	3.72	16.40	6.68	76.54
1	0	1	70	17.5	180	69.06	8.16	14.43	34.12	33.23	22.09	2.91	6.69	29.61	12.91	138.65
0	0	0	55	17.5	120	70.63	3.90	17.71	48.16	41.37	26.25	7. 30	9.46	41.07	16.53	182.85
0	0	0	55	17.5	120	64.07	2.33	13.97	37.87	33.11	20.74	5.18	7.19	32.20	12.65	143.76
0	-1	-1	55	5	60	55.93	7.03	15.73	44.72	36.68	23.31	7.20	7.98	34.84	13.78	161.30
-1	-1	0	40	5	120	50.67	5.97	15.35	43.31	36.56	23.09	7.06	7.88	34.18	13.98	159.00
-1	0	-1	40	17.5	60	57.70	8.63	18.30	50.05	42.46	26.70	7.29	8.92	40.52	16.46	185.10
1	1	0	70	30	120	74.87	3.57	13.51	35.82	34.19	17.74	1.27	6.61	29.46	12.08	135.89
0	1	1	55	30	180	78.47	16.50	23.27	62.97	55.32	35.30	7.06	12.07	54.17	21.51	241.34
0	1	-1	55	30	60	53.68	9.62	9.70	31.06	26.97	16.95	2.38	5.73	24.79	9.56	115.07
1	0	-1	70	17.5	60	62.74	2.16	14.06	38.07	33.54	20.87	4.77	6.95	30.50	12. 28	142.21
0	0	0	55	17.5	120	62.14	9.97	20.95	56.13	47.01	29.68	8.60	10.62	47.44	18.51	209.38
-1	0	1	40	17.5	180	60.91	9.25	20.92	58.65	51.01	32.42	8.49	10.71	47.60	19.74	22.013
1	-1	0	70	5	120	28.32	0.83	4.72	12. 27	11.69	7.40	1.59	2.30	9.87	4.34	47.86
-1	1	0	40	30	120	74.52	15.18	18.70	55.26	48.17	29.78	4.91	9.81	43.18	16.96	203.15

실험 데이터 분석은 Minitab을 사용하여 수행되어 회귀 방정식을 도출하고 최적의 매개변수 조합을 결정했다. 모델 계수의 통계적 유의성은 P 값 0.05의 확률로 Fisher의 F-검정과 결합된 분산 분석(ANOVA)으로 결정되었다. 모델의 정확도는 또한 모델의 적합도 척도인 결정계수 R2를 통해서도 확인되었다. 이후 적합된 다항식 방정식은 반응과 변수 간의 관계를 설명하기 위해 3차원 반응 표면과 2차원 등고선 플롯의 형태로 표현되었다.

독립 매개변수의 최적 값은 반응 표면 및 등고선 플롯을 분석하는 것과 함께 회귀 방정식을 풀어서 얻어졌다. 이후 통계적 실험 전략의 타당성을 검증하기 위해 추가 실험이 수행되었다.

추출 공정에 대한 최적 조건은 최대 추출 수율뿐만 아니라 더 높은 클로로겐산 함량을 얻는 것을 목적으로 한다. 최적 조건은 다음과 같이 결정되었다: 추출 온도는 55℃, 추출 시간은 3시간, 및 NaDES 용매 대 공급 비율은 30이다. 실제적으로 작동하기 위해 수정된 최적 조건에서 예측을 확인하기 위해 3중 검증 실험을 수행했다: 추출 수율과 총 클로로겐산 함량은 각각 78%와 24%였는데, 이는 회귀 모델에서 예측한 값과 거의 동일했다.

실험 데이터에 대한 다중 회귀 분석을 통해 추출 수율에 대한 예측 반응은 2차 다항식 방정식을 통해 얻을 수 있다. 추출 수율(%) = 0.621377 + -0.0110222 * A + 0.145756 * B + 0.0105304 * C + 0.0567341 * AB + 0.00778068 * AC + 0.126731 * BC + 0.0151577 * A^2 + -0.0655996 * B^2 + -0.0104967 * C^2.

각 계수의 유의성을 결정하기 위해 F 검정과 p 값이 사용되었다. 높은 F 값과 작은 p 값은 해당 변수가 유의하다는 것을 의미한다. 3.64의 모델 F-값은 해당 모델이 노이즈에 비해 유의하지 않음을 의미한다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 15.80%이다. 0.0500 미만의 p값은 모델 항(term)이 유의미함을 나타낸다. 이 경우 액체/고체 비율이 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 큰 값은 모델 항이 유의하지 않음을 나타낸다. 중요하지 않은 모델 항이 많기 때문에(계층 구조를 뒷받침하는 데 필요한 항목은 제외), 모델을 선형으로 축소하여 개선했다. 축소된 방정식은 다음과 같은 추출 수율을 제공하였다. % = 0.583877 + -0.0110222 * A + 0.145756 * B + 0.0105304 * C.

4.42의 모델 F 값은 모델이 유의하다는 것을 의미한다. 모델 예측과 실제값의 비교는 도 6a에 나타나 있다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 3.60%에 불과하다. R² 값이 91.6%이란 것은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 알 수 있다.

다중 비선형 회귀 모델을 프로파일링하는 3차원 반응 표면은 운영 매개변수의 상호 작용 효과를 묘사하기 위해 수행되었다. 이는 각 변인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변인 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공했다. 추출 온도, 시간, 및 용매/공급 비율에 따라 영향을 받는 추출 수율의 결과는 도 6b에 나타나 있다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(테스트 범위의 중앙값)에서 일정하게 고정되었다. 추출 수율은 시험 변수의 사소한 변화에도 민감하다는 것이 분명했다. 추출 온도를 높이면 처음에는 수율이 급격히 증가하지만, 그 후 높은 추출 온도가 어느 정도 추출에 도움이 된다는 것을 서서히 보여주었다. 3차원 및 등고선 플롯에서 기울기의 기울기, 및 이차 다항식 모형의 회귀 계수의 유의성에 따르면, 용매/공급 비율만이 추출 수율에 가장 큰 영향을 미치는 요인이었고, 그 다음이 추출 온도와 시간이었다. 78%의 가장 높은 추출 수율은 중간 추출 온도 55℃, 가장 긴 추출 시간 3시간, 그리고 가장 높은 액체/고체 비율 30에서 달성되었다.

추출 방법은 마테차 추출 공정에 상승효과/강화효과를 발휘한다는 점에서 특히 매력적이었다. 추출물에 함유된 화합물의 생물학적 및/또는 물리화학적 활성이 향상되었다. 염화콜린 기반의 공융용매로 추출하여 유도된 항산화 활성은 물로 추출한 추출물보다 2~3배 높았다.

또한, 공융 용매는 식용이 가능하고 무독성이므로 해당 추출물을 식품 및 음료(인간 및 동물용), 그리고 화장품, 건강기능식품, 약용 화장품, 주류, 향료(향신료 및 향미료), 및 약학적 제품에 완제품으로 직접 제제화할 수 있다.

실시예 3: 마테차의 총 추출 수율 결과

다음 실시예는 마테차로부터 생체활성 화합물의 추출 수율 결과에 대한 구체예를 보여준다.

도 5a-5b는 혼합 표준(도 5a 및 5b)과 하나의 마테차 추출물 샘플(도 5c)의 크로마토그램을 보여준다. 모든 주요 피크가 명확하게 구분되어 식별되었다. 선형성은 5-500 ppm의 농도 범위에서 외부 검량선을 작성하여 평가되었다. 분석물 피크 면적 반응은 6가지 다른 수준에서 농도에 대해 플롯되었다. 이로부터 모든 분석물에 대해 0.993%보다 큰 결정 계수(R²)가 얻어졌으며, 이는 피크 면적 반응이 선형적이고 분석물의 농도와 관련이 있음을 보여주고; 이 접근 방식을 사용하여 마테차 가공 과정에서 생체활성 성분을 정량화할 수 있다.

식물 재료로부터 특정 화합물을 추출하는 공정에 있어서 용매 선택은 매우 중요하다. 현재로서는 화합물을 용해하는 용매가 그 추출에 적합한 상이라고 생각된다. 따라서, 수천 가지의 가능성에서 좋은 추출 용매를 걸러내기 위한 대략적인 스크린은 보통 다음 개념을 고려하는 것이다: "유사한 것은 유사한 것을 용해시킨다"는 일반 원칙이고(유사한 극성을 가진 두 분자 또는 용매는 용해되거나 섞일 수 있음); 용해도는 계의 온도가 증가하면 더 높아지며; 용질의 분자량이 높을수록 주어진 용매에서의 용해도는 더 낮아지고; 추출은 주로 용해도 현상에 의해 결정된다.

마테차 잎은 통상적인 수용성 에탄올로 추출되었다. 추출 수율, HPLC로 시험한 생체활성 물질의 순도 및 항산화제 IC₅₀ 값은 표 6과 도 2에 나타나 있다.

표 6: 다양한 수용성 에탄올을 사용한 마테차 추출 실험 결과

추출용매	추출 수율(%)	HPLC에 의한 순도(%)										CQA 수율(%)	IC₅₀(mg/ml)
추출용매	추출 수율(%)	4-CQA	클로로겐산	5-CQA	루틴	3,4-DCQA	4.5-DCQA	3.5-DCQA	테오브로민	카페인	총 CQA, %	CQA 수율(%)	IC₅₀(mg/ml)
물	20.08	6.18	5.37	3.53	0.68	0.88	3.28	1.40	0.50	2.18	20.65	4.82	510
20% 에탄올	15.90	8.31	7.32	4.76	1.27	1.73	6.52	3.18	0.80	3.34	31.82	5.92	322
40% 에탄올	22.41	6.14	5.59	3.78	0.93	1.33	5.06	2.83	0.57	2.37	24.37	6.41	495
60% 에탄올	17.65	5.75	5.35	3.67	0.95	1.29	4.90	2.89	0.42	2.41	23.86	4.88	437
80% 에탄올	22.25	4.58	4.16	2.95	0.71	1.05	3.89	2.37	0.45	2.06	19.00	4.94	590
100% 에탄올	17.20	1.23	0.82	0.59	0.16	0.19	1.07	0.26	0.29	1.58	4.16	1.07	1970

마테차 잎의 에탄올 추출물에 대한 식물화학적 스크리닝 결과 알칼로이드, 페놀릭스, 및 플라보노이드가 존재하는 것으로 나타났다. 추출에 사용된 에탄올의 농도가 달랐지만, 여전히 마테차 잎에서 동일한 유형의 화합물을 끌어내는 데 성공했다. 에탄올을 추출 용매로 선택하면 다른 유기 용매에 비해 많은 이점을 제공하는 것으로 여겨지는데, 이는 상대적으로 안전(독성이 낮음)한 것이다. 에탄올은 글리코사이드, 폴리아세틸렌, 스테롤, 폴리페놀, 탄닌, 플라보놀, 테르페노이드, 및 알칼로이드를 끌어내는 능력이 있다. 에탄올은 극성지수 값이 5.2이고 유전상수(dielectric constant)가 24.55인 양성자성 유기 용매이다. 이 실시예에서 사용된 여섯 가지 농도의 에탄올의 극성은 혼합 용매에 포함된 물의 농도의 영향을 받았다. 물이 많을수록 무수에탄올(absolute ethanol)에 비해 극성이 높아진다. 극성이 높은 용매는 더 넓은 극성을 갖는 화합물을 추출할 수 있는 능력이 있다. 이를 통해 탄수화물과 단백질과 같은 비페놀성 극성 화합물이 추출 과정 중에 용해될 수 있어 추출 수율이 증가했다. 이 연구에서 40% 에탄올은 다른 에탄올 용매들보다 더 많은 대사산물을 추출할 수 있었다.

이 연구에서 항산화 활성 시험은 DPPH 라디칼을 사용하여 수행되었다. 이 방법은 비교적 비용이 저렴하고 효과적이며 효율적인 것으로 간주되며 UV-Vis 분광광도법을 사용하면 좋은 민감도를 갖는다. DPPH는 진한 파란색을 띠는 자유 라디칼이다. 항산화제가 존재하면 항산화제는 DPPH 라디칼에 자기의 수소 원자를 공여한다(DPPH-H가 된다). 이 반응은 DPPH가 반응성을 잃기 때문에 흡광도가 감소하는 것이 특징이다. 이 연구에서의 항산화 활성은 도 3에서 볼 수 있듯이 샘플의 IC₅₀ 값을 기준으로 결정되었다. IC₅₀ 값은 DPPH 라디칼을 50% 억제하는 데 필요한 샘플 농도를 보여주었다. 이 값은 선형 회귀 분석을 사용하여 계산한 결과로부터 얻어졌다. 항산화제의 IC₅₀ 값이 작을수록, 자유 라디칼을 억제하는 능력이 커진다. 표 6에 요약된 결과에 따르면, 마테차 잎의 20% 에탄올 추출물이 IC₅₀ 값이 322mg/ml로 가장 높은 항산화 활성을 보였다. 이는 마테차 잎의 20% 에탄올 추출물이 강력한 DPPH 라디칼 소거 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 추출물의 항산화 특성은 카페인 유무에 관계없이 총 클로로겐산(총 CQA)과 높은 상관관계를 갖는다. 예상대로 카페인은 추출물의 항산화 특성에 전혀 기여하지 않는다.

수성 추출 매체의 중요한 특성 중 하나는 그것의 pH이다. 추출가능한 것은 일반적으로 산성이나 염기성 화합물이므로 추출 용매의 pH는 중요한 추출 설계 매개변수인데 산성이나 염기성 여과가능물(또는 추출가능물)의 용해도가 pH-의존성이기 때문이다. 본 실험에서는 구연산나트륨을 이용하여 수용액의 pH를 조절하였고, pH가 추출 효율에 미치는 영향을 2-5의 범위 내에서 조사하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

표 7: 마테차 잎 추출 효능에 대한 pH의 영향

pH	추출 수율(%)	HPLC에 의한 순도(%)										IC₅₀(mg/ml)
pH	추출 수율(%)	4-CQA	3-CQA	5-CQA	루틴	3,4-DCQA	4.5-DCQA	3.5-DCQA	테오브로민	카페인	총 CQA, %	IC₅₀(mg/ml)
2	60.90	2.56	2.18	1.41	0.31	0.30	1.00	0.38	0.16	0.97	7.82	727.07
2.32	28.45	5.20	4.71	3.10	0.63	0.57	1.80	0.69	0.49	2.01	16.06	375.19
2.71	21.43	5.71	5.32	3.50	0.67	0.70	2.24	0.90	0.49	2.18	18.37	290.38
2.92	43.71	3.18	3.00	1.93	0.36	0.48	1.69	0.68	0.27	1.22	10.96	486.24
3.42	47.55	3.10	2.71	1.76	0.36	0.37	1.18	0.47	0.20	1.16	9.58	636.75
4.56	48.02	3.68	3.28	2.13	0.43	0.56	1.96	0.82	0.22	1.36	12.43	311.32
4.95	58.96	2.79	2.67	1.74	0.34	0.43	1.57	0.65	0.26	1.10	9.85	416.50
물	20.08	6.18	5.37	3.53	0.68	0.88	3.28	1.40	0.50	2.18	20.65	610

총 추출 수율은 pH가 낮아질수록 크게 증가했다. 강산성 조건에서, 마테차 잎 추출 수율에 대한 pH의 영향은 잎에 H⁺가 작용하여 잎의 구조를 변화시켜 일부 추가 고형물이 방출되기 때문일 수 있다. H⁺는 일반적으로 접근하기 어려운 잎 구조의 부분을 열어 잎에서 더 많은 수용성 성분을 방출할 수 있다. 반면, 폴리사카라이드, 펙틴, 및/또는 단백질과 같은 일부 불용성 물질은 강산성 조건 하에서 추출하는 동안 가수분해될 수 있다. 뜨거운 물로 마테차에서 추출한 최대 고형물은 약 200g/kg인 반면, pH 2에서는 건조한 잎 1kg당 약 600g의 고형물이 추출되었다. 이는 H⁺의 작용으로 마테차 1kg당 약 400g 더 많은 고형물이 방출되었음을 시사한다.

물에 비해 낮은 pH는 생체활성 물질의 회수율도 증가시킨다. 물에 의한 클로로겐산 회수율은 62.29%이고, pH를 4.56으로 낮추면 회수율은 91.12%였다. 이전에 논의한 것처럼, DPPH의 항산화 특성은 클로로겐산 함량과 직접적인 관련이 있다. 4~5로 더 낮은 pH는 IC₅₀ 값을 낮추고 항산화제를 개선시켰다. 수용성 에탄올에 비해 물/구연산은 마테차 잎에 대한 더 나은 추출 용매이다.

NaDES의 성분은 극성, 점도, 용해화능과 같은 물리화학적 특성에 상당한 영향을 미친다. NaDES는 표적 화합물의 추출 효율에 직접적인 영향을 미친다. 적합한 NaDES를 선택하기 위하여, 4가지의 주요 대사산물에 의해 20가지의 다른 유형의 NaDES를 제조하였고, HPLC에 의해 마테차 잎으로부터의 생리활성 성분의 그것들의 추출 수율을 시험하였다. 추출 온도 및 시간은 50℃, 120분이었으며, 추출 용매로는 NaDES를 사용하였고, 점도가 높아 물질 전달 효율이 낮아질 수 있으므로 0, 30, 50, 및 80%(w/w)의 물을 첨가하였다. 물과 물/구연산(완충수)을 비교 대상으로 사용하였으며, 그 결과를 표 8과 도 4에 나타내었다.

표 8: 다양한 NaDES에 의한 마테차 추출 수율

NaDES	추출 수율(%)	4-CQA	3-CQA	5-CQA	루틴	3,4-DCQA	4.5-DCQA	3.5-DCQA	테오브로민	카페인	총 CQA %
clglu1:1, 30%	74.20	1.39	1.18	0.12	0.75	0.24	1.03	0.40	0.12	0.51	4.36
clsuc1:1, 30%	49.94	1.69	1.35	0.09	0.22	0.27	1.17	0.45	0.15	0.59	5.02
citglu1:1, 30%	53.36	1.43	1.20	0.09	0.17	0.22	0.92	0.35	0.10	0.56	4.22
citsuc1:1, 30%	53.72	1.38	1.12	0.09	0.15	0.20	0.83	0.31	0.07	0.53	3.93
clcitglu1:1:1, 30%	49.64	1.71	1.42	0.09	0.24	0.29	1.27	0.50	0.16	0.67	5.28
clcitsuc1:1:1, 30%	59.53	1.47	1.22	0.10	0.17	0.23	0.97	0.37	0.15	0.54	4.36
clcit3:1, 30%	68.76	2.68	2.23	1.44	0.42	0.52	2.23	0.95	0.24	0.94	10.05
clcit2:1, 30%	77.26	1.98	1.68	1.08	0.27	0.37	1.58	0.68	0.13	0.69	7.38
clcit1:1, 30%	73.20	2.01	1.73	1.10	0.29	0.38	1.61	0.69	0.14	0.76	7.52
clcit1:2, 30%	67.51	2.15	1.87	1.19	0.31	0.40	1.68	0.73	0.21	0.87	8.02
clcit1:3, 30%	60.49	2.03	1.73	1.12	0.31	0.38	1.58	0.69	0.14	0.80	7.52
clcit1:1, 50%	50.85	2.12	1.79	1.15	0.32	0.38	1.62	0.67	0.15	0.80	7.73
clcit1:1, 80%	56.36	2.56	2.12	1.37	0.40	0.36	1.41	0.56	0.25	0.96	8.38
물	20.08	1.24	1.08	0.71	0.14	0.18	0.66	0.28	0.10	0.44	4.15
완충수	48.02	2.16	1.93	1.25	0.25	0.33	1.15	0.49	0.12	0.79	7.30

CL은 염화콜린이고; CIT는 구연산이고; GLU는 포도당이고; SUC는 자당이다.

표 8 및 도 4에 나타난 바와 같이, NaDES의 추출 수율은 물보다 3배 더 높았는데, 이는 NaDES가 마테차 추출에 놀랍고 예상치 못한 이점을 보여주었음을 나타낸다. 20가지 종류의 NaDES 중에서, NaDES의 상이한 유형에 따라 목적 화합물의 추출 수율이 달랐다. 유기산-기반 NaDES는 당류-기반 NaDES에 비해 추출 수율이 높았다.

NaDES는 유기산의 존재가 추출 수율 증가에 도움이 된다는 것을 나타낸다. 예상대로 추출 수율은 용매의 특성과 용질과 용매 사이의 가능한 상호작용과 밀접한 관련이 있다. 추출 수율이 더 높은 이유는 NaDES와 목적 성분 사이에 형성된 수소 결합의 효과 때문이다.

또한 데이터는 추출 수율에 대한 다양한 NaDES 비율의 영향을 보여준다. 결과는 염화콜린(Cl)/구연산(Cit) 비율을 1:3에서 3:1로의 비율 변경은 클로로겐산 추출 수율이 향상된다는 것을 보여준다. 이는 수소 결합의 수가 변하여 식물 세포벽 파괴와 표적 성분의 용해에 기여했을 가능성이 있다. 따라서, 몰 비율이 3:1인 염화콜린/구연산의 조합이 추가적인 실시예에 사용되었다.

용매 성분의 몰 비율 뿐만 아니라 NaDES의 다양한 수분 함량도 용매의 점도에 영향을 미쳐 추출 수율에 차이를 초래할 수 있다. 따라서 수분 함량이 0%에서 80%까지 다양한 NaDES의 추출 수율을 연구하였다. 결과는 NaDES의 수분 함량이 0%에서 80%로 증가함에 따라 추출 공정이 개선되었음을 보여주었다. 이는 물을 첨가하면 용매의 점도와 표면 장력이 크게 감소하기 때문이며, 이는 물질에서 용매로 물질이 전달되는 과정에 도움이 된다. 물은 NaDES의 특성과 구조에 중요한 역할을 한다. 물은 밀도와 점도의 감소와 극성의 증가로 이어질 수 있다. 이전 연구에 따르면, 첨가된 물의 부피가 50% 미만이면 NaDES의 초분자 복합체가 보존된다. 이 비율을 넘으면 수소 결합 수용체와 수소 결합 공여체 사이의 H-결합이 과도한 물의 첨가로 점차 약화될 수 있으며, 생성되는 혼합물은 해리된 NaDES 화합물로만 구성될 수 있다. 따라서 추가 연구에는 50%의 수분 함량이 사용되었다.

NaDES를 사용한 녹색 추출의 원리를 고려하여 염화콜린(Cl)/구연산(Cit)이 마테차 잎 추출을 위한 최적화된 NaDES로 선택되었다. ClCit는 낮은 pH 값과 일반적으로 폴리페놀 화합물 추출에 사용되는 물 및 극성 유기 용매(에탄올 및 메탄올)의 극성과 유사한 극성 등 추출 공정에 적합한 물리화학적 특성을 가지고 있다. 50%의 물을 첨가한 ClCit로 추출을 수행하였으며, 이로 인해 물로 희석하면 NaDES의 점도가 낮아지고 식물 기질에서 용액으로의 물질 전달이 향상되어 추출 효율이 증가했다. 또한, 유기산을 수소 결합 공여체로서 갖는 콜린 기반 NaDES를 선별한 것은 화합물 그 자체(콜린과 구연산)을 형성하는 생물학적 활성으로 인해 흥미롭고, 이는 아마도 식물 추출물의 생물학적 활성도 향상시킬 수 있을 것이다.

실시예 4: 마테차의 생리활성 화합물

다음 실시예는 다양한 마테차 생체활성 화합물에 대한 추출 매개변수를 보여준다.

반응 표면 방법론(RSM)과 결합된 박스-벤켄 설계(BBD)를 사용하여 총 클로로겐산(Total CQA), 클로로겐산, 4-카페오일퀸산(4-CQA), 5-o-카페오일퀸산(5-CQA), 3,4-디카페오일퀸산(3,4-diCQA), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-diCQA), 4,5-디카페오일퀸산(4,5-diCQA), 루틴, 테오브로민, 및 카페인의 추출 조건을 최적화했다.

총 CQA

총 클로로겐산(Y1) 수율은 이들 변수의 함수였다. 추출 온도(A), 액체/고체 비율(B), 및 추출 시간(C)은 독립 변수였다. 실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 총 클로로겐산의 추출 수율을 나타내는 하기 2차 다항식 방정식을 발견했다: Y1 = 209.381 + -37.8462 * A + 31.3421 * B + 9.12204 * C + 10.9688 * AB + -9.64654 * AC + 52.7593 * BC + -24.9719 * A^2 + -47.9325 * B^2 + -12.8844 * C^2.

총 클로로겐산의 경우, 31.21의 모델 F 값과 0.05 미만의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의미함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 0.82%에 불과하다. 0.0500 미만의 p값은 모형 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, A², B²는 유의한 모델 항이다. R2(0.9894)와 adj-R2(0.9577)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에, 변동계수(CV)의 낮은 값(7.38)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다. 모델 예측값과 실제값의 비교는 도 6c에 나타나 있다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 추출 온도, 액체/고체 비율, 및 시간에 따라 영향을 받는 추출 수율의 결과는 도 6d에 나타나 있다. 표 9는 ANOVA에 따른 회귀 모델로부터 계산된 계수를 보여준다.

표 9: 총 클로로겐산 추출 수율에 대한 2차 모델의 ANOVA 통계

원천	제곱의 합	df	평균 제곱	F-값	p-값
모델	37525.55	9	4169.51	31.21	0.0082
A-추출온도	11458.67	1	11458.67	85.78	0.0027
B-S/F	7858.60	1	7858.60	58.83	0.0046
C-추출시간	665.69	1	665.69	4.98	0.1118
AB	481.26	1	481.26	3.60	0.1539
AC	372.22	1	372.22	2.79	0.1937
BC	11134.17	1	11134.17	83.35	0.0028
A²	1425.36	1	1425.36	10.67	0.0469
B²	5251.49	1	5251.49	39.31	0.0082
C²	379.45	1	379.45	2.84	0.1905
잔여	400.74	3	133.58
Cor tatal	37926.30	12

반응 표면 및 등고선 플롯에서 총 클로로겐산 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에서 일정하게 고정되었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 클로로겐산의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 일정 값을 넘으면 활성 성분을 분해하는 고온으로 인해 추출 수율이 감소한다. 이는 활성 성분이 장시간 추출 중에도 분해될 수 있음을 보여주었다. 액체/고체 비율은 추출 수율에 상당한 영향을 미친다. 고체/액체 비율이 5에서 30으로 증가함에 따라 수율 백분율은 76mg/g에서 241mg/g로 증가했다. 액체/고체비 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 총 클로로겐산의 최대값 241 mg/g을 얻어졌다.

클로로겐산

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 클로로겐산(Y2)의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y2 = 47.0091 + -8.19396 * A + 7.72104 * B + 2.22975 * C + 2.71997 * AB + -2.21339 * AC + 11.771 * BC + -4.26374 * A^2 + -10.0948 * B^2 + -2.68677 * C^2.

클로로겐산의 경우, 26.57의 모델 F 값과 0.05 미만의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 1.04%에 불과하다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, B²는 유의한 모델 항이다. R2(0.9876)와 adj-R2(0.9504)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(7.71)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 클로로겐산 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다.

반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 클로로겐산의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 일정 값을 넘으면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 활성 성분을 분해할 수 있었기 때문이다. 낮은 추출 온도에서는 액체/고체 비율이 증가함에 따라 추출 수율이 증가하는 것으로 나타났다. 추출 시간과 액체/고체 비율은 모두 추출 수율에 상당한 영향을 미쳤다. 고체/액체 비율이 5에서 30으로 증가했다. 백분율 수율은 17mg/g에서 55mg/g로 증가했다. 총 클로로겐산의 최대값 55mg/g은 액체/고체비를 30 g/g, 온도를 55℃, 추출시간을 180분으로 제어하였을 때 얻어졌다.

4-카페오일퀸산(4-CQA)

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 4-CQA(Y3)의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y3 = 56.1268 + -10.8746 * A + 8.03485 * B + 1.54769 * C + 2.90067 * AB + -3.13905 * AC + 14.025 * BC + -7.03086 * A^2 + -12.4312 * B^2 + -3.87252 * C^2.

4-CQA의 경우, 28.96의 모델 F 값과 0.0092의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 0.924%에 불과하다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, A², B²는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9886)와 adj-R2(0.9545)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(7.73)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 4-CQA 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 4-CQA의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 4-CQA를 분해되도록 할 수 있었기 때문이다. 이는 온도가 높을 때 장시간 추출 중에 4-카페오일퀸산(4-CQA)이 분해될 수도 있음을 보여주었다. 액체/고체가 높을 때 더 긴 추출 시간이 필요하다. 액체/고체 비율 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 4-CQA의 최대값 62.97 mg/g가 얻어졌다.

5-o-카페오일퀸산(5-CQA)

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 5-CQA의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y5 = 29.6757 + -5.48635 * A + 4.33813 * B + 1.65555 * C + 0.913624 * AB + -1.1249 * AC + 7.59666 * BC + -3.18214 * A^2 + -6.99323 * B^2 + -0.975141 * C^2.

5-CQA의 경우, 15.38의 모델 F 값과 0.0229의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 2.29%에 불과하다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, B²는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9788)와 adj-R2(0.9151)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(10.39)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 5-CQA 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 5-CQA의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 장시간 추출 중에 5-CQA이 분해될 수도 있음을 보여주었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다. 액체/고체 비율이 높을수록 더 긴 추출 시간이 필요하다. 액체/고체 비율 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 5-CQA의 최대값 35.3 mg/g가 얻어졌다.

3,4-디카페오일퀸산(3,4-diCQA)

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 3,4-diCQA의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y6 = 10.6223 + -1.84482 * A + 1.54172 * B + 0.451434 * C + 0.593569 * AB + -0.513514 * AC + 2.64981 * BC + -1.5156 * A^2 + -2.4587 * B^2 + -0.787695 * C^2.

3,4-diCQA의 경우, 30.46의 모델 F 값과 0.0085의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 0.85%에 불과하다. 0.0500 미만의 PP 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, A², B² 는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9892)와 adj-R2(0.9567)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(7.59)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 3,4-diCQA 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 3,4-diCQA의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 3,4-diCQA이 분해되도록 할 수도 있음을 보여주었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다고 볼 수 있었다. 액체/고체 비율이 높을수록 더 긴 추출 시간이 필요하다. 액체/고체 비율 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 3,4-diCQA의 최대값 12 mg/g가 얻어졌다.

3,5-디카페오일퀸산(3,5-diCQA)

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 3,5-diCQA의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y7 = 47.4372 + -8.25459 * A + 7.0397 * B + 2.14047 * C + 2.6516 * AB + -1.99397 * AC + 11.9534 * BC + -6.87771 * A^2 + -11.3866 * B^2 + -3.5024 * C^2.

3,5-diCQA의 경우, 41.20의 모델 F 값과 0.0055의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 0.55%에 불과하다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, A², B² 는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9920)와 adj-R2(0.9679)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(6.67)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 3,5-diCQA 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 3,5-diCQA의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 3,5-diCQA이 분해되도록 할 수도 있음을 보여주었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다고 볼 수 있었다. 액체/고체 비율은 추출 수율에 유의하게 영향을 준다. 액체/고체 비율이 높을수록 더 긴 추출 시간이 필요하다. 액체/고체 비율 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 3,5-diCQA의 최대값 21.5 mg/g가 얻어졌다.

4,5-디카페오일퀸산(4,5-diCQA)

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 4,5-diCQA의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y8 = 18.5102 + -3.19188 * A + 2.66662 * B + 1.09715 * C + 1.18942 * AB + -0.661707 * AC + 4.76348 * BC + -2.10181 * A^2 + -4.56793 * B^2 + -1.05986 * C^2.

4,5-diCQA의 경우, 59.61의 모델 F 값과 0.0032의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 0.32%에 불과하다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, C, AB, BC, A², B²는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9944)와 adj-R2(0.9798)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(5.41)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 4,5-diCQA 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 4,5-diCQA의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 4,5-diCQA이 분해되도록 할 수도 있음을 보여주었다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다고 볼 수 있었다. 액체/고체 비율은 추출 수율에 유의하게 영향을 준다. 액체/고체 비율이 높을수록 더 긴 추출 시간이 필요하다. 액체/고체 비율 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 4,5-diCQA의 최대값 54 mg/g가 얻어졌다.

루틴

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 루틴의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y9 = 8.59949 + -2.02475 * A + -0.432504 * B + 0.134262 * C + 0.45758 * AB + -0.516049 * AC + 2.16226 * BC + -1.87299 * A^2 + -3.01976 * B^2 + -0.610253 * C^2.

루틴의 경우, 33.40의 모델 F 값과 0.0075의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, BC, A², B²는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9901)와 adj-R2(0.9605)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(9.84)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 루틴 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 루틴의 추출 수율은 온도가 증가함에 따라 증가했다. 그러나 온도가 특정 값을 넘어서면 추출 수율이 감소했다. 이는 고온이 루틴이 분해되도록 할 수도 있음을 보여주었다. 긴 추출 시간이 루틴이 분해되도록 할 수도 있었을 것이다. 반응 표면의 날카로움으로 볼 때 상호작용은 유의했다고 볼 수 있었다. 액체/고체 비율은 추출 수율에 유의하게 영향을 준다. 액체/고체 비율 17.5 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 120분으로 제어하였을 때 루틴의 최대값 8.6 mg/g가 얻어졌다.

테오브로민

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 테오브로민의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y10 = 9.96722 + -3.03923 * A + 3.69081 * B + 0.996837 * C + -1.61736 * AB + 1.3461 * AC + 3.1009 * BC + -2.5968 * A^2 + -0.983486 * B^2 + -0.320714 * C^2.

테오브로민의 경우, 4.90의 모델 F 값은 모델이 노이즈에 비해 유의하지 않음을 의미한다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 10.91%이다. 따라서 이 모델은 Y10 = 7.56661 + -3.03923 * A + 3.69081 * B + 0.996837 * C로 표현되는 선형으로 축소된다.

6.27의 모델 F 값은 모델이 유의하다는 것을 의미한다. 노이즈로 인해 이렇게 큰 F-값이 발생할 확률은 1.39%에 불과하다. 0.0500 미만의 p값은 모형 용어가 유의미함을 나타낸다. 이 경우 A, B가 유의한 모델 항이다. R2(0.9363) 값과 adj-R2(0.7451) 값은 모형의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 테오브로민 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 액체/고체가 최적 수준으로 유지되었을 때 총 테오브로민의 추출 수율은 액체/고체 비율이 증가함에 따라 증가했다. 액체/고체비 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 테오브로민의 최대값은 16.5 mg/g이 얻어졌다.

카페인

실험 데이터에 다중 회귀 분석을 적용하여 다음의 2차 다항식 방정식이 카페인의 추출 수율을 나타내는 것으로 밝혀졌다: Y11 = 20.9522 + -3.31823 * A + 2.72458 * B + 1.05134 * C + 1.35799 * AB + -0.56039 * AC + 5.43106 * BC + -2.51197 * A^2 + -5.37211 * B^2 + -1.51228 * C^2.

카페인의 경우, 24.58의 모델 F 값과 0.0117의 관련 P 값은 회귀 모델이 유의함을 나타낸다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, BC, A², B²는 유의한 모델 항이다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, B, BC, B²는 유의한 모델 항이다. 0.0500 미만의 P 값은 모델 항이 유의함을 나타낸다. 이 경우 A, BC, B²는 유의한 모델 항이다. 0.1000보다 높은 값은 유의하지 않음을 나타낸다. R2(0.9866)와 adj-R2(0.9465)의 높은 값은 모델의 형태가 반응 변수와 독립 변수 간의 실제 관계를 잘 나타낸다는 것을 나타낸다. 동시에 변동계수(CV)의 낮은 값(8.31)은 실험값의 높은 정밀도와 좋은 신뢰도를 명백히 나타낸다.

3차원(3-D) 반응 표면 및 등고선 플롯은 회귀의 그래프적 표현이었다. 이는 각각의 변수인 매개변수의 반응과 실험 수준 간의 관계와 두 검정 변수 간의 상호작용 유형을 시각화하는 방법을 제공한 것이다. 반응 표면 및 등고선 플롯에서 카페인 추출 수율은 두 개의 연속 변수와 함께 얻어졌고, 다른 하나는 0 수준(시험 범위의 중앙값)에 일정하게 고정되었다. 카페인은 높은 추출 온도에 비교적 안정하나, 카페인의 추출 수율은 액체/고체 비율이 증가할수록 증가하고, 특정 값을 넘으면 추출 수율이 감소한다. 오랜 추출 시간이 카페인을 분해할 수 있기 때문이었다. 표면의 날카로운 모양은 상호작용이 유의하다는 것을 나타낸다. 액체/고체비 30 g/g, 온도 55℃, 및 추출시간 180분으로 제어하였을 때 카페인 최대값 23 mg/g가 얻어졌다.

추출 공정에 대한 최적 조건은 최대 추출 수율과 더 높은 총 클로로겐산 함량을 얻는 것을 목적으로 한다. 위의 결과를 바탕으로 최적화 연구를 수행하였고, 최적 조건은 다음과 같이 결정되었다: 추출 온도는 55℃, 추출 시간은 180분, 및 액체/고체 비율은 30이다. 예측을 확인하기 위해 세 가지 검증 실험을 수행했다. 추출 수율과 총 클로로겐산 함량은 각각 78±2%와 240±3.2 mg/g로, 이는 회귀 모델에서 예측한 수율(77.8%)과 총 클로로겐산 함량(241 mg/g)과 거의 동일했다.

표 10: 실험 샘플의 IC₅₀ 값

용매	IC₅₀(μg/ml)
3,5-diCQA	185.68
4,5-diCQA	199.68
3-CQA	258.81
루틴	246.76
아스코르브산	446.70
물	610.00
20% 에탄올	322.43
40% 에탄올	495.00
60% 에탄올	436.91
80% 에탄올	590.41
에탄올	1696.60
citglu2:1	252.00
citglu1:1	263.00
citglu1:2	310.00
citsuc2:1	256.00
citsuc1:1	280.00
citsuc1:2	510.00
clcit3:1	436.91
clcit3:1	290.42
clcit3:1	282.81
clcit3:1	322.43
clcit3:1	315.00
clcit3:1	320.00
clcit3:1	290.38
clcit3:1	297.77
clcit3:1	64.95
clcit3:1	375.19
clcit3:1	311.32
clcit3:1	148.35
clcit3:1	81.10
clcit3:1	416.50
clcit3:1	140.94

다양한 조건에서 얻은 마테차 추출물을 DPPH 라디칼 소거 어세이를 통해 항산화 능력을 조사했다. DPPH 어세이는 항산화 화합물의 존재를 나타내는 유망한 방법이기 때문에 선택되었다. 라디칼 화합물이 비교적 안정적이고 생성할 필요가 없으므로 어세이가 쉽고 비용이 저렴하다. 주목할 점은 시험된 모든 항산화제-로딩된 NaDES 용액이 수용액 형태의 항산화제보다 더 높은 항산화 잠재력을 보였다는 것이다. DPPH 어세이 결과, 가장 높은 항산화 활성은 수용성 염화염소/구연산에서 나타났으며, 이는 보다 높은 클로로겐산 함량에 높은 상관관계를 갖는 것으로 나타났다. 더 큰 항산화 활성은 NaDES 시스템의 구성 요소 중 하나인 구연산에 기인할 수 있다. 구연산은 자유 라디칼 종(ROS)을 소거하는 능력 덕분에 잘 알려진 천연 항산화제이다. 구연산을 포함시키면 항산화제-CHCL/구연산 NaDES 시스템의 항산화 활성이 증가하는 데 기여할 수 있다. 이는 NaDES의 역할에 대한 우리의 가설과 일치한다. 또 다른 주목할 만한 발견은 수분 함량이 30 wt%, 50 wt%, 및 80 wt%인 CHCL/구연산 NaDES 시스템의 항산화 활성이 순수한 CHCL/구연산 NaDES 시스템보다 약간 더 우수하다는 것이다. 이러한 현상은 항산화 화합물의 용해도에 대한 점도의 효과와 일치한다. 이는 NaDES의 물리화학적 특성이 항산화 활성에 큰 효과를 미칠 수 있음을 의미한다. 이러한 정보를 바탕으로, 50wt%의 물을 첨가한 CHCL/CA NaDES 시스템은 항산화 활성을 향상시키는 데 탁월한 능력을 보인다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 식품, 건강기능식품 및 제약 산업에서 이 시스템이 지닌 잠재력을 다시 한번 강조하는 것이다.

실시예 5: 테오브로민의 추출

다음 실시예는 여기에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 테오브로민을 추출하는 것을 보여준다.

마테차 잎을 얻었고, NaDES를 사용하여 테오브로민을 추출했다. 특히, 표 11에 제시된 바와 같이 다양한 NaDES가 테오브로민 추출에 사용되었다.

표 11: NaDES로 마테차 추출

NaDES 시스템	NaDES	몰 비율
당- 기반	포도당:자당	1:1
	포도당:과당	1:1
유기산-기반	구연산:포도당	1:1
	구연산:자당	1:1
	구연산:과당	1:1
염화콜린-기반	염화콜린:구연산	1:1
	염화콜린:포도당	1:1
	염화콜린:자당	1:1
폴리올-기반	에리트리톨:염화콜린	1:1
	에리트리톨:구연산	1:1
	에리트리톨:포도당:과당	1:1:1

도 7에 도시된 바와 같이, 구연산:자당 및 구연산:과당에 의해 마테차 잎으로부터 테오브로민의 추출 수율은 각각 6.50% 및 8.39%(도 7의 좌측에서 네 번째 및 다섯 번째 막대)로, 다른 NaDES 시스템 및 물을 이용한 추출 수율(도 7의 가장 오른쪽)보다 상당히 높았다. 물에 의한 테오브로민 추출 수율은 0.08%-0.75%였다. 구연산과 과당 또는 자당(포도당과 과당의 비율 1:1)의 조합은 물에 비해 테오브로민 추출 수율이 10~20배 향상되는데, 이는 테오브로민이 이들 NaDES와 수소 결합을 형성하는 능력이 증가했기 때문일 가능성이 크다. 하지만 구연산-포도당에서는 그러한 관찰이 발견되지 않았다.

Jelinski et al.은 다양한 용매와 NaDES에서 순수 테오브로민의 용해도를 연구했다(Jelinski et al., 2021). 저자들은 염화콜린과 글리세롤에서 테오브로민의 용해도가 물에서보다 거의 32배 더 크다고 보고했는데; 포도당 및 과당과의 염화콜린에서 테오브로민의 용해도는 거의 비슷했다. 흥미롭게도 문헌에 보고된 NaDES에서의 테오브로민 용해도와 여기에 설명된 NaDES를 사용한 마테차 잎에서의 테오브로민 추출성 사이에는 상관관계가 없었는데, 이는 추출에 있어서 매트릭스 효과가 있음을 암시한다. 따라서 이러한 결과는 예상치 못했고 놀라운 것이었다.

이 실시예에서 보여지는 바와 같이, 마테차 잎으로부터 테오브로민 추출 수율은 중량 기준으로 약 8-9%에 도달하였는데, 이는 이전에 얻어본 적이 없는 수치이다. 이러한 연구는 3회 반복 수행되었고, 반복 가능한 관찰과 결과가 있었다. 과당이나 과당을 함유한 당(예: 자당)과 구연산의 특정 조합은 테오브로민에 대해 뛰어난 선택성을 보인다. 이 특정 NaDES 시스템은 카카오와 같이 테오브로민이 풍부한 다른 식물을 추출하는 데도 유익하다.

모든 제목은 독자의 편의를 위한 것이며, 특별히 명시되지 않는 한 제목 뒤에 오는 텍스트의 의미를 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 발명이 관련된 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 출판물은 각 개별 출판물이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되도록 명시된 것과 동일한 범위로 여기에 참조로 포함되며, 여기에 구체적으로 참조된 모든 개시내용에 대해서도 마찬가지이다.

다양한 양상 및 구체예가 여기에 공개되었지만, 다른 양상 및 구체예는 해당 기술 분야의 기술자에게는 명백할 것이다. 진정한 범위와 정신은 청구범위에 의해 표시되는 것이고 여기에 공개된 다양한 양상과 구체예는 설명 목적을 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다.

참고문헌

다음 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 명시적으로 본원에 통합된다.

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Claims

식물 재료로부터 식물 추출물을 단리하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:
식물 재료를 획득하는 단계;
상기 식물 재료를 가공하는 단계;
상기 가공된 식물 재료를 천연 심층 공융 용매(NaDES)와 혼합하는 단계; 및
식물 추출물을 단리하는 단계.
청구항 1에 있어서, 상기 식물 재료는 마테차(yerba mate)로부터 획득되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 수소 결합 공여체 분자와 수소 결합 수용체 분자를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 당 기반, 유기산 기반, 염화콜린 기반, 또는 폴리올 기반인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 당 기반 NaDES는 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 유기산 기반 NaDES는 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합과 조합된 구연산인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 염화콜린 기반 NaDES는 구연산, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합과 조합된 염화콜린인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 폴리올 기반 NaDES는 염화콜린, 구연산, 포도당, 과당, 자당, 또는 이들의 조합과 조합된 에리트리톨인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 에리트리톨, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, NaDES는 염화콜린:구연산, 염화콜린:포도당, 염화콜린:자당, 염화콜린:과당, 포도당:자당, 포도당:과당, 구연산:포도당, 구연산:자당, 구연산:과당, 에리트리톨:염화콜린, 에리트리톨:구연산, 또는 에리트리톨:포도당:과당을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함하는 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 10% 내지 80% 범위의 양으로 물을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 식물 추출물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 잔틴 알칼로이드는 카페인, 테오브로민, 테오필린, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 클로로겐산은 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혼합 단계 이후에 가열, 교반, 원심분리, 및/또는 여과 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 3:1의 비율로 포함하고, 물은 50%로 존재하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 NaDES는 1:1의 몰 비율로 존재하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 식물 추출물은 중량 기준으로 약 5%에서 약 10%의 범위의 양으로 추출된 테오브로민인 방법.
식물성 단리물; 및
천연 심층 공융 용매(NaDES)
를 포함하는 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 식물성 단리물은 마테차 유래의 단리물을 포함하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 식물성 단리물은 잔틴 알칼로이드, 클로로겐산, 또는 마테스포닌을 포함하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 식물성 단리물은 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린, 구연산, 에리트리톨, 포도당, 자당, 과당, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린:구연산, 염화콜린:포도당, 염화콜린:자당, 염화콜린:과당, 포도당:자당, 포도당:과당, 구연산:포도당, 구연산:자당, 구연산:과당, 에리트리톨:염화콜린, 에리트리톨:구연산, 또는 에리트리톨:포도당:과당을 포함하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 NaDES는 1:1의 몰 비율로 존재하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 상기 NaDES는 염화콜린 및 구연산을 포함하는 것인 조성물.
청구항 28에 있어서, 상기 염화콜린 및 구연산은 3:1의 비율로 존재하는 것인 조성물.
청구항 21에 있어서, 카페인, 테오브로민, 테오필린, 카페산, 탄닌, 또는 그 유사체 또는 유도체, 3:1의 비율로 존재하는 염화콜린 및 구연산, 및 50%의 물을 포함하는 것인 조성물.