KR20240163698A

KR20240163698A - 분리 웰 마이크로플레이트를 사용한 세포 배양 적용 방법

Info

Publication number: KR20240163698A
Application number: KR1020247034490A
Authority: KR
Inventors: 조세프 아츨러; 사라 소피아 데빌; 옥사나 시렌코; 펠릭스 스피라
Original assignee: 몰레큘러 디바이스즈 (오스트리아) 게엠베하; 몰레큘라 디바이스 엘엘씨
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2023-03-17
Publication date: 2024-11-19
Also published as: WO2023178320A1; EP4493670A1; US20250215398A1; CN119301240A; JP2025509608A

Abstract

단일 분리 웰 마이크로플레이트를 사용하여 세포를 수평 공-배양하는 자동화 가능한 방법이 제공된다. 또한, 본 개시는 배양된 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 개선된 방법 및 단일 분리 웰 마이크로플레이트에서 오가노이드로부터 표적 세포를 단리하는 방법을 제공한다.

Description

분리 웰 마이크로플레이트를 사용한 세포 배양 적용 방법

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2023년 3월 17일에 PCT 국제 출원으로 제출되었고, 2022년 3월 18일에 제출된 미국 가출원 제63/321,373호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본원에 도입된다.

3차원(3D) 환경에서 세포를 배양하면, 인체 내에서 관찰되는 것과 더욱 일치하는 세포의 거동과 형태가 수득된다. 이러한 유형의 배양에 사용되는 3D 하이드로겔/하이드로스캐폴드(hydroscaffold)는 3D 공간의 특정 위치에 세포를 침적하고 장기간 그 위치를 유지할 수 있다는 독특한 속성을 갖는다. 이를 통해, 세포의 상호작용 및 시간 경과에 따른 발달이 관찰되는 구조(예: 구상체, 종양체, 오가노이드(organoid) 및/또는 기타 다세포체(multi-cellular body)) 및 공-배양(co-culturing) 환경이 가능해진다.

지금까지, 수직 공-배양에는 일반적으로 트랜스 웰이 필요했다. 그러나, 트랜스 웰의 취급은 비교적 복잡하고 자동화가 곤란할 수 있으며, 세포의 이미지화가 곤란하다. 상청액은 ELISA 또는 상이한 방법을 사용하여 상이한 검출 플레이트로 이송하여 분석할 수 있다. 그러나, 오가노이드에 의해 분비되는 상이한 호르몬의 동태 측정(kinetic measurement) 및 직접 비교는 아직까지 실용적이지 않다. 추가 포획 플레이트를 사용하여 세척할 경우, 성체 줄기 세포의 포획은 현재까지는 가능하다.

시험관내 독성 연구에서는, 예를 들면, 화학물질을 대사하는 심장 세포와 간 세포, 뉴런과 성상세포(astrocyte), 심장 세포와 내피 세포, 장 세포와 간 세포 등 몇몇 세포 유형을 존재시킬 필요가 종종 있다. 상이한 세포의 공-배양 또는 상청액의 이송이 현재 해결책이지만, 상이한 세포를 구별해야 하거나 소량의 분비 인자로부터 효과를 평가해야 하기 때문에 클린 데이터를 수득하는 것이 곤란할 수 있다.

단일 분리 웰 마이크로플레이트(single separation well microplate)를 사용하여 상이한 세포 유형 사이의 유체 연통을 가능하게 하면서 물리적 분리를 가능하게 할 뿐만 아니라, 시간 경과에 따른 효과를 용이하게 검출하고 평가할 수 있는 방법이 요망된다. 단일 분리 웰 마이크로플레이트를 사용하여 면역 세포 이주(migration), 침윤 및 표적 종양 세포 사멸을 1회의 검정으로 조합하는 생체내-유형 상황의 평가를 가능하게 하는 방법이 요망된다.

세포 이주, 신경세포 성장, 혈관신생, 면역 세포 이주 및 사멸, 전이, 세포 침윤, 단핵구 부착, 아폽토시스, 세포 분화, 줄기 세포 이식, 염증, 및 복수의 성장 인자 및 대사산물의 분비를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 세포 유형 및 조직의 효율적 크로스-토크(cross-talk) 및 상호작용을 가능하게 하는 별개의 구획에서 상이한 세포 유형을 공-배양하는 방법이 제공된다.

본 개시는 자동화-친화적 방식으로 수평 공-배양을 서포트하는 분리 웰 마이크로플레이트를 사용하는 방법을 제공한다. 분리 웰 마이크로플레이트는, 예를 들면, 피펫을 펌프로서 사용하여 유압적으로 접속하거나 적절한 마이크로채널 형상으로 층상 유동에 의해 접속할 수 있는 인접한 웰에서 상이한 세포 유형의 배양을 서포트한다.

분리 웰 마이크로플레이트를 사용하면, 추가 플레이트 또는 특별한 세척 장비를 필요로 하지 않아도 단일 분리 웰 마이크로플레이트에서 세포 배양, 세포 세척 및 (성체) 줄기 세포의 포획이 가능해진다. 또한, 분리 웰 마이크로플레이트를 사용하면, 동태적 방식으로 복수의 판독을 동시에 실행하는 것도 가능해진다.

본 개시는 표적 세포(target cell)를 공-배양하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(well unit)의 1차 웰에 하나 이상의 표적 세포를 도입하고, 초기에 혼합 없이 액체 배지에서 인큐베이팅하여 표적 세포를 1차 웰의 바닥에 부착시키는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어(removable barrier)를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널(closed microchannel)에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되는, 단계; 하나 이상의 피더(feeder) 세포를 2차 웰에 도입하고, 초기에 혼합 없이 피더 세포를 2차 웰의 바닥에 부착시키는 단계; 제거가능한 배리어를 제거하여 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하는 단계; 분리 웰 마이크로플레이트를 락킹(rocking)시켜 개방 마이크로채널을 통한 중력 유동에 의해 1차 웰과 2차 웰 사이의 혼합 및 배지 교환(medium exchange)을 가능하게 하는 단계; 1차 웰로부터 표적 세포를 분리(detaching)하는 단계; 및 분리된 표적 세포를 개방 마이크로채널에서 멀리 떨어진 1차 웰에 침강(settling)시키는 단계를 포함한다. 표적 세포를 공-배양하는 방법은 표적 세포를 공-배양하기 위한 수평적 방법일 수 있다. 표적 세포를 공-배양하는 방법은 분리된 표적 세포를 혼합하고, 분리된 표적 세포를 개방 마이크로채널로부터 멀리 떨어진 1차 웰에 추가로 침강시키는 단계; 침강된 표적 세포를 세척하는 단계; 및 액체 핸들러(liquid handler)를 통해 세척된 표적 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은, 하나 이상의 표적 세포를 1차 웰에 도입하는 단계 및 하나 이상의 피더 세포를 2차 웰에 도입하는 단계가 동시에 또는 본질적으로 동시에 수행되는 것을 포함할 수 있다. 동시는 약 5분, 약 10분 또는 약 15분 이내일 수 있다. 본질적으로 동시는 약 30분, 약 60분 또는 약 90분 이내일 수 있다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널이 마이크로채널 내부 또는 이에 인접하여 에어 갭(airgap), 하이드로겔 씰(hydrogel seal) 또는 실리콘 씰을 포함하는 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄되는 것을 포함할 수 있다. 표적 세포를 공-배양하는 방법은 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널이 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 동안 폐쇄되는 것을 포함할 수 있다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은, 제거가능한 배리어가 에어 갭을 포함하고, 제거가능한 배리어를 제거하는 단계가 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 후에 에어 갭을 제거하는 것을 포함하고, 임의로 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제하기 위해 피펫을 펌프로서 사용하는 것을 포함할 수 있다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은 분리가 피더 세포를 분리하지 않고서 표적 세포를 분리하기 위해 표적 세포를 해리 시약(dissociation reagent)에 노출시키는 것을 포함하는 것일 수 있다. 해리 시약은 임의로 생리학적 완충액 중에 분리 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분리 효소는 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 카탈라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 디스파제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 해리 시약은 EDTA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 표적 세포는 줄기 세포 또는 오가노이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 섬유아세포이다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은, 표적 세포가 액체 배지 중의 웰 유닛의 1차 웰에 배치된 하이드로겔 돔(dome)에 매립(embedding)되는 것을 포함할 수 있다. 표적 세포를 공-배양하는 방법은, 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널이 웰 유닛의 바닥 표면 및 1차 웰과 2차 웰의 공유 측벽의 바닥 부분 사이에 위치하는 것을 포함할 수 있다.

표적 세포를 공-배양하는 방법은 복수의 웰 유닛을 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트의 사용을 포함할 수 있고, 각 웰 유닛은 웰 유닛 내의 1차 웰과 2차 웰을 유체적으로 접속할 수 있는 적어도 하나의 마이크로채널을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 마이크로채널의 높이는 약 10 마이크론 내지 약 100 마이크론 또는 약 10 마이크론 내지 약 75 마이크론의 범위 내이고; 임의로, 마이크로채널의 폭은 약 150 내지 약 500 마이크론, 약 200 내지 약 400 마이크론 또는 약 300 마이크론의 범위 내이다. 분리 웰 마이크로플레이트는 복수의 웰 유닛, 예를 들면, 384 웰 유닛, 96 웰 유닛, 48 웰 유닛, 24 웰 유닛, 12 웰 유닛, 8 웰 유닛 또는 6 웰 유닛을 포함할 수 있다.

본 발명은 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 시간 경과에 따른 동태 측정을 포함하는 배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 표적 세포를 배양하는 단계로서, 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 고정화된 포획 시약(immobilized capture reagent)을 포함하는, 단계; 제거가능한 배리어를 제거하여 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하여, 초기 인큐베이션 기간 후에 개방 마이크로채널을 통해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자의 확산을 가능하게 하는 단계; 분비된 인자가 고정화된 포획 시약에 의해 포획되도록 하는 단계; 포획된 분비 인자에 특이적인 표지된 2차 항체 또는 고정화된 포획 시약을 제1 시점에서 첨가하여 제1 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및 제1 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더(reader)로 정량화하는 단계를 포함한다.

배양된 표적 세포로부터 분비 인자를 정량화하는 방법은, 고정화된 포획 시약이 포획된 분비 인자에 특이적인 1차 항체, 아비딘 및 비오틴으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 제거가능한 배리어를 제거하기 전에 아비딘 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제1 항체 접합체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제1 항체 접합체는 비오틴에 접합된 분비된 인자-특이적 1차 항체를 포함한다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 제거가능한 배리어를 제거하기 전에 비오틴 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제2 항체 접합체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제2 항체 접합체는 아비딘에 접합된 분비 인자-특이적 1차 항체를 포함한다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 포획된 분비 인자, 고정화된 포획 시약 또는 1차 항체에 특이적인 표지된 2차 항체를 제2 시점에서 첨가하여 제2 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및 제2 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더로 정량화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 포획된 분비 인자, 고정화된 포획 시약 또는 1차 항체에 특이적인 표지된 제2 항체를 제3 시점에서 첨가하여 제3 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및 제3 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더로 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 정량화가 플레이트 리더와 동종의 이미징(imaging)에 의한 다중 검출(multiplexed detection)을 포함하는 것을 포함할 수 있다. 배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 분비된 인자의 확산이 분리된 웰 마이크로플레이트를 락킹시켜 개방 마이크로채널을 통한 중력 유동에 의해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자의 확산을 가능하게 하는 것을 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 표적 세포가 다세포(multicellular) 표적 세포인 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다세포 표적 세포는 오가노이드 및 종양체(tumoroid)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 다세포 표적 세포는 표적 조직, 환자의 생검 샘플(biopsy sample), 줄기 세포, 종양체 단편 또는 오가노이드 단편으로부터 유래된다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 배양된 오가노이드가 웰 유닛의 1차 웰 내의 액체 배지 중의 하이드로겔 돔 내에 매립되는 것을 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 제거가능한 배리어가 에어 갭, 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰을 포함하고; 임의로, 제거가능한 배리어가 마이크로채널 내부 또는 이에 인접하여 위치되는 것을 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 제거가능한 배리어의 제거가 에어 갭을 제거하는 것을 포함하고; 임의로, 피펫을 펌프로서 사용하여 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제하는 것을 포함할 수 있다.

배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은 고정화된 포획 시약이 2차 웰의 바닥에 고정화되는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정화된 포획 시약은 복수의 분비된 인자에 특이적인 복수의 1차 항체를 포함하고, 여기서 1차 항체는 검출 어레이의 2차 웰 바닥에 배열(arranging)된다. 배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법은, 분비된 인자가 호르몬, 항체, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 분비되는 것을 포함할 수 있다.

본 개시는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법을 제공하고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 액체 배지 중의 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 고정화된 포획 시약으로 관능화된(functionalized) 표면을 포함하는, 단계; 1차 웰 내의 다세포 표적 세포를 해리시켜 단일 세포 유형 및 관심 없는 세포를 포함하는 개별 세포의 혼합물을 형성하는 단계; 제거가능한 배리어를 제거하여 마이크로채널을 개방하여, 개별 세포의 혼합물이 개방 마이크로채널을 통해 2차 웰로 이동하도록 하고, 단일 세포 유형이 2차 웰 내의 고정화된 포획 시약과 회합하여 고정화된 복합체를 형성하도록 하는 단계; 1차 웰과 2차 웰을 세척하여 관심 없는 비결합된 세포를 제거하는 단계; 및 고정화된 복합체를 해리시키는 것을 포함하는 단일 세포 유형을 단리하는 단계를 포함한다. 개별 세포가 개방 마이크로채널을 통해 이동하도록 하는 것은 적절한 마이크로채널 형상을 갖는 펌프, 확산 또는 층상 유동으로서 피펫을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법은 분리 웰 마이크로플레이트의 1차 웰에 단리된 단일 세포 유형을 재-시딩(reseeding)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 세포 유형은 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 단일 세포 유형은 표적 세포이다.

일부 실시형태에서, 다세포 표적 세포는 오가노이드이다.

배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법은 고정화된 포획 시약이 2차 웰의 바닥에 또는 2차 웰 내의 스캐폴드(scaffold) 상에 배치되는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 고정화된 포획 시약은 단일 세포 유형의 표면 마커, 아비딘 및 비오틴에 특이적인 1차 항체로부터 선택될 수 있다.

배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법은 제거가능한 배리어를 제거하기 전에 아비딘 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제1 항체 접합체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제1 항체 접합체는 비오틴에 접합된 단일 세포 유형 표면 마커-특이적 1차 항체를 포함한다.

배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법은 제거가능한 배리어를 제거하기 전에 비오틴 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제2 항체 접합체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제2 항체 접합체는 아비딘에 접합된 단일 세포 유형 표면 마커-특이적 1차 항체를 포함한다.

배양된 다세포 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법은, 다세포 표적 세포가 1차 웰 내의 액체 배지 중의 하이드로겔 돔에서 배양되는 것을 포함할 수 있다.

본 개시는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내의 다세포 표적 세포 배양물로부터 줄기 세포를 단리하는 방법을 제공하고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰 내의 액체 배지 중의 제1 하이드로겔 돔에서 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되는, 단계; 1차 웰에서 다세포 표적 세포를 해리시켜 줄기 세포 및 관심 없는 세포를 포함하는 개별 세포의 혼합물을 형성하는 단계; 줄기 세포에 특이적인 고정화된 포획 시약을 포함하는 자기 비드(magnetic bead)를 1차 웰에 첨가하고, 추가로 인큐베이팅하여 자기 비드를 줄기 세포에 결합시키는 단계; 1차 웰의 하부에 자석을 적용하여 자기 비드-줄기 세포 복합체를 유지하는 단계; 제거가능한 배리어를 제거하여 마이크로채널을 개방하고, 2차 웰을 통해 액체 배지를 흡인함으로써 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체를 세척하여 관심 없는 비결합된 세포를 제거하는 단계; 제2 하이드로겔 돔을 1차 웰에 세척 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체에 첨가하는 단계; 1차 웰의 하부로부터 자석을 제거하는 단계; 자기 비드로부터 줄기 세포를 해리시키는 단계; 및 1차 웰 상부에 자석을 적용하여 자기 비드를 부유(levitating)시키고, 제2 하이드로겔 돔 중의 줄기 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 다세포 표적 세포 배양물로부터 줄기 세포를 단리하는 방법은, 1차 웰의 하부로부터 자석을 제거하는 단계; 세척 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체를 신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛 내의 신규 1차 웰로 이송시키는 단계; 및 신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛 내의 신규 1차 웰의 하부에 자석을 재적용(reapplying)하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 고정화된 포획 시약은 줄기 세포의 표면 마커, 아비딘 및 비오틴에 특이적인 1차 항체로부터 선택된다.

본 개시는 이를 필요로 하는 대상체(subject)의 암 치료를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공하고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 액체 배지 중의 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰 내에서 대상체로부터 유래된 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 후보 암 치료 면역 세포, 모노클로날 항체, 면역 시스템 조절인자 또는 항암제를 포함하는, 단계; 제거가능한 배리어를 제거하여, 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하여 제2 인큐베이션 기간에 걸쳐 개방 마이크로채널을 통해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 확산을 가능하게 하는 단계; 제2 인큐베이션 기간 후에 2차 웰 및 임의로 1차 웰을 이미징하여 세포 이주 또는 다세포 표적 세포 성장을 정량화하는 단계; 및 다세포 표적 세포를 포함하지 않는 대조군 웰 유닛과 비교하여, 2차 웰 내 또는 2차 웰과 1차 웰 사이의 면역 세포 이주의 증가, 또는 후보 치료제를 포함하지 않는 대조군 웰 유닛과 비교하여, 1차 웰에서 다세포 표적 세포 성장의 감소에 기반하여, 후보 요법을 선택하는 단계를 포함한다.

암 치료를 위한 요법을 선택하는 방법은, 다세포 표적 세포가 액체 배지 중의 웰 유닛의 1차 웰에 배치된 하이드로겔 돔에 매립되는 것을 포함할 수 있다. 암 치료를 위한 요법을 선택하는 방법은, 다세포 표적 세포가 대상체로부터의 생검 샘플 또는 종양체 단편으로부터 유래되는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CAR T-세포일 수 있다.

본 개시는 하이드로겔 돔을 파괴하는 자동화된 방법을 제공하고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 마이크로플레이트 웰 내의 액체 배지 중에서 하이드로겔 돔 내의 제1 세포를 배양하여 다세포 표적 세포를 제공하는 단계; 초기 인큐베이션 기간 후에 액체 핸들러에 부속된 피펫 팁으로 웰 내의 돔의 x, y 중심 위치 또는 이의 부근에서 하이드로겔 돔을 천공하는 단계; 복수의 단계로 돔을 통해 피펫 팁을 이동시켜 하이드로겔 돔으로부터 표적 세포를 방출하는 단계로서, 각 단계는 웰 내의 X, Y 소정 위치를 포함하여 하이드로겔 돔을 파괴하고 임의로 하이드로겔 돔을 액화하는 단계를 포함한다. 피펫은 1개 이상, 2개 이상, 복수의 위치 또는 각각의 소정 위치에서 흡인될 수 있다.

본 개시는 하이드로겔 돔을 파괴하고 표적 세포를 단리하는 자동화된 방법을 제공하고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 마이크로플레이트 웰 내의 액체 배지 중에서 하이드로겔 돔 내의 제1 세포를 배양하는 단계; 초기 인큐베이션 기간 후에 액체 핸들러에 부속된 피펫 팁으로 웰 내의 돔의 x, y 중심 위치 또는 이의 근처에서 하이드로겔 돔을 천공하는 단계; 돔을 통해 피펫 팁을 복수의 단계로 이동시켜 하이드로겔 돔으로부터 표적 세포를 방출하는 단계로서, 각 단계는 웰 내의 X, Y 소정 위치를 포함하여 하이드로겔 돔을 파괴하고 임의로 하이드로겔 돔을 액화하는 단계; 및 하나 이상의 표적 세포를 웰로부터 단리하는 단계를 포함한다. 피펫은 1개 이상, 2개 이상 또는 각각의 소정 위치에서 흡인될 수 있다.

웰 내의 각 X, Y 소정 위치는 하기를 포함하여 계산할 수 있다:

X(단계 수) = X웰 중심 + 알파/단계*단계 수*COS(세타/단계*단계 수); 및

Y(단계 수) = Y웰 중심 + 알파/단계*단계 수*SIN(세타/단계 수*단계 수),

여기서, 알파 = 돔 직경(mm)/1.8; 단계 = 하이드로겔 돔을 통해 피펫 팁을 이동하는 단계의 수, 임의로 2 내지 20의 정수; X웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 x 위치; Y웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 y 위치; 및 세타 = 5 내지 50의 상수 값. 일부 경우에, 단계의 수는 2 내지 20, 3 내지 18, 4 내지 17, 5 내지 15, 6 내지 12 또는 8 내지 10의 정수이다. 일부 경우에, 세타는 5 내지 50, 10 내지 45, 15 내지 40, 15 내지 35 또는 이들 사이의 임의 수의 상수이다. 일부 경우에, 세타는 5, 10, 12, 13, 14, 15, 15.7, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50 또는 이들 사이의 임의 수로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 경우에, 액체 핸들러는 하이드로겔 돔 내에서 피펫 팁을 흡인하고/하거나, 피펫 팁은 하이드로겔 돔을 1개 이상, 2개 이상, 복수의 위치 또는 각각의 소정 위치에서 천공한다.

일부 경우에, 웰은 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰이다.

하이드로겔 돔의 x, y 중심 위치는 웰의 원래 시딩 위치, 웰에 침적된 하이드로겔의 용적, 웰 내의 하이드로겔 돔의 이미징으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다.

하이드로겔 돔의 직경은 웰에 침적된 하이드로겔의 용적 및/또는 웰 내의 하이드로겔 돔의 이미징에 의해 결정될 수 있다.

X, Y 소정 위치는 하이드로겔 돔 내부 및/또는 이를 통해 나선형 패턴, 성상 패턴(star pattern) 및 지그재그 패턴(zig-zag pattern)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 패턴을 웰 내에 형성할 수 있다.

피펫 팁은 각 위치 사이에서 하이드로겔 돔의 표면 하부에 드래그(drag)될 수 있다. 피펫 팁은 각 위치 사이에서 하이드로겔 돔의 표면 상부로 리프팅(lifting)될 수 있다.

표적 세포는 다세포 표적 세포일 수 있고, 임의로 구상체, 종양체 및 오가노이드의 그룹으로부터 선택될 수 있다.

일부 경우에, 이 방법은, 단리하기 전에, 다세포 표적 세포를 서로 해리시켜 개별 표적 세포를 제공하는 것을 추가로 포함한다.

도 1A는 세포/오가노이드 공급을 위한 수평 공-배양에 유용한 분리 웰 마이크로플레이트의 예시적 단일 웰 유닛(100)의 제1 도를 나타낸다. 1차 웰(112)은 적어도 하나의 마이크로채널(118)에 의해 2차 웰(115)로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 배지 교환을 가능하게 하기 위해 개방될 수 있다. 또는, 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 1차 웰과 2차 웰을 서로 단리하기 위한 제거가능한 배리어를 포함할 수 있다.
도 1B는 세포/오가노이드 공급을 위한 수평 공-배양에 유용한 분리 웰 마이크로플레이트에서 예시적 단일 웰 유닛(100)의 제2 도를 나타낸다. 1차 웰(112)은 적어도 하나의 마이크로채널(118)에 의해 2차 웰(115)로부터 분리된다. 배지 교환은 분리 웰 마이크로플레이트가 로커(rocker) 상에 위치하는 동안에 마이크로채널(118)을 통한 중력 유동에 의해 발생한다.
도 1C는 본 개시의 다양한 실시형태에 따른 세포 배양 방법과 관련된 분리 웰 마이크로플레이트의 단일 웰 유닛(100)의 단면의 일례를 나타낸다. 1차 웰(112)은 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이에 적어도 하나의 마이크로채널(118)을 포함하는 공유 측벽에 의해 2차 웰(115)로부터 분리된다. 1차 웰(112)은 하이드로겔 돔(106)에 매립된 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)를 포함할 수 있다. 1차 웰(112) 및 2차 웰(115)은 적어도 부분적으로 액체 배지(109)로 충전될 수 있다. 웰 유닛(100)의 바닥은 이미징을 가능하게 하기 위해 광학적으로 투명한 관찰 윈도우를 포함하는 바닥 층 시트(121)를 포함한다.
도 2는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 세포 배양 및 분비 인자의 동태 측정을 가능하게 하는 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)로부터 복수의 분비 인자를 검출하는 예시적 방법의 대표적 개략도를 나타낸다. 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)는 1차 웰(112)에서 배양된다. 표적 세포는 마이크로채널(118)을 통해 확산할 수 있는 분비 인자(예: 호르몬)를 생성한다. 분비된 인자는 분비된 인자에 특이적인 코팅/표면 관능화된 고정화 항체의 어레이를 포함하는 2차 웰(115)에 포획된다.
도 3은 고정화된 포획 시약(예를 들면, 줄기 세포-특이적 항체, 아비딘 또는 비오틴)으로 관능화된 표면을 포함하는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 다세포 표적 세포 배양물(예를 들면, 오가노이드)로부터 단일 세포 단리(예를 들면, 줄기 세포)를 수행하는 예시적 방법을 나타낸다. 다세포 표적 세포(예: 오가노이드)는 1차 웰(112) 내의 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106)에서 배양되고, 2차 웰(115)은 관심 세포(예: 줄기 세포)에 특이적인 고정화된 항체에 의해 코팅/표면 관능화되며, 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄된다(310). 일정 기간 후, 다세포 표적 세포(예: 오가노이드)가 해리되어 관심 세포를 포함한 개별 세포의 혼합물을 형성한다(320). 배리어는 마이크로채널(118)에서 제거되고, 개별 세포의 혼합물은, 예를 들면, 피펫을 펌프로서 사용하여 또는 적절한 마이크로채널 형상을 갖는 층상 유동에 의해 유압적으로 개방 마이크로채널(118)을 통해 이동할 수 있다. 관심 세포는 2차 웰(115)에서 고정화된 특정 항체에 의해 포획되고, 관심 없는 세포는 마이크로웰로부터 세척된다(330). 관심 세포(예: 줄기 세포)는 항체/세포 복합체로부터 해리된다(340). 관심 세포(예: 줄기 세포)를 사용하여 신규 웰에 재-시딩할 수 있다(350).
도 4는 항체 코팅된 스캐폴드를 포함하는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 오가노이드 배양물로부터 줄기 세포 단리를 수행하는 예시적 방법을 나타낸다. 다세포 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)는 1차 웰(112) 내의 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106)에서 배양되고, 2차 웰(115)은 관심 세포(예를 들면, 줄기 세포)에 특이적인 코팅/표면 관능화된 고정화 항체를 포함하는 스캐폴드를 포함하며, 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄된다(410). 일정 기간 후, 다세포 표적 세포(예: 오가노이드)가 해리되어 관심 세포를 포함한 개별 세포의 혼합물을 형성한다(420). 배리어는 마이크로채널(118)로부터 제거되고, 개별 세포의 혼합물은, 예를 들면, 피펫을 펌프로서 사용하여 또는 적절한 마이크로채널 형상을 갖는 층상 유동에 의해 유압적으로 개방 마이크로채널(118)을 통과할 수 있다. 관심 세포는 2차 웰(115)에서 고정화된 특이적 항체를 포함하는 스캐폴드에 의해 포획되고, 관심 없는 세포는 마이크로웰로부터 세정된다(430). 관심 세포(예: 줄기 세포)는 스캐폴드 내의 항체/세포 복합체로부터 해리된다(440). 관심 세포(예: 줄기 세포)를 사용하여 신규 웰에 재-시딩할 수 있다(450).
도 5는 단일 분리 세포 마이크로플레이트에서 포획 시약(예를 들면, 세포 특이적 항체 또는 비오틴)으로 코팅된 자기 비드를 사용하여 목적하는 단일 세포(예를 들면, 줄기 세포)를 단리하여 다세포 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방식으로 계대하기 위한 예시적 방법을 나타낸다. 다세포 표적 세포(예: 오가노이드)는 1차 웰(112)의 바닥 표면에 배치된 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106) 내에 오가노이드(103)(예: 장 오가노이드)를 함유하는 1차 웰(112)을 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛에서 배양되고, 폐쇄된 마이크로채널(118)은 1차 웰과 2차 웰 사이의 제거가능한 배리어를 포함한다. 일정 기간 후, 다세포 표적 세포(예: 오가노이드)가 해리되어 관심 세포를 포함한 개별 세포의 혼합물을 형성한다(520). 고정화된 포획 시약(예: 줄기 세포 마커 또는 비오틴에 특이적인 항체)으로 표면 관능화된 자기 비드는 1차 웰 유닛의 개별 세포 혼합물에 첨가된다(530). 자기 비드는 개별 세포의 혼합물과 함께 인큐베이팅되어 목적하는 단일 세포(예: 줄기 세포)의 결합을 가능하게 한다(540). 자석을 1차 웰의 바닥에 적용하여 자기 비드-포획 시약-줄기 세포 복합체를 유지하고, 배리어를 제거하여 마이크로채널(118)을 개방하고, 예를 들면, 액체 배지를 액체 핸들러로 흡인하여 비결합된 세포 및 잔해를 2차 웰(115)을 통해 세척한다. 신규 하이드로겔 돔은 줄기 세포 및 자기 비드가 하이드로겔에 매립되도록 1차 웰 내에 형성될 수 있고(560), 자석은 1차 웰의 하부로부터 제거될 수 있다(570). 1차 웰의 상부에 자석을 배치하여 하이드로겔 내의 줄기 세포를 부유시킬 수 있다(580).
도 6A는 단일 분리 웰 마이크로플레이트에서 세포(예를 들면, 림프구) 기능성 및 독성 연구를 평가하는 예시적 방법을 나타낸다. 다세포 표적 세포(예를 들면, 종양체, 오가노이드)는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 1차 웰(112) 내의 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106)에서 배양된다. 2차 웰(115)은 면역 세포(예: CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 기타 림프구)를 포함한다. 주화인자는 다세포 표적 세포에 의해 방출되어 개방 마이크로채널(118)을 통해 확산될 수 있고, 이는 마이크로채널(118) 구성에 따라 특정 면역 세포가 2차 웰(115) 내에서 또는 심지어 1차 웰(112) 내로 이주하게 할 수 있다. 마이크로채널(118)은 5 마이크론의 채널 크기를 가질 수 있지만, 림프구는 7-10 마이크론의 크기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 다세포 표적 세포는 마이크로채널(118) 구성에 따라 면역 세포를 1차 웰(112)로 이주시킬 수 있는 주화인자를 방출할 수 있다.
도 6B는 단일 분리 웰 마이크로플레이트에서 세포(예를 들면, 림프구) 기능성 및 독성 연구를 평가하기 위한 예시적 방법을 나타내고, 여기서 경사진 위치는 면역 세포 이주를 방해하기 위해 사용될 수 있다. 다세포 표적 세포(예: 종양체, 오가노이드)는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 1차 웰(112) 내의 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106)에서 배양된다. 2차 웰(115)은 면역 세포(예: CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 기타 림프구)를 포함한다. 주화인자는 다세포 표적 세포에 의해 방출되어 개방 마이크로채널(118)을 통해 확산될 수 있고, 이는 마이크로채널(118) 구성에 따라 특정 면역 세포가 2차 웰(115) 내에서 또는 심지어 1차 웰(112) 내로 이주하게 할 수 있다. 분리 웰 마이크로플레이트는 1차 웰(112)로의 면역 세포 이주를 방해하기 위해 경사진 위치로 유지될 수 있다.
도 7A는 하기 공식을 사용하여 계산된 자동화 피펫터 이동의 X, Y 소정 위치의 하이드로겔 돔 파괴 패턴에 대한 예시적 스프레드시트 계산을 나타낸다:
X(단계 수) = X웰 중심 + 알파/단계*단계 수 * COS(세타/단계 * 단계 수); 및
Y(단계 수) = Y웰 중심 + 알파/단계 수 * SIN(세타/단계 * 단계 수),
여기서, 돔 직경(mm) = 8, 단계 수 = 9, 알파 = 직경/1.8, 세타 = 15.7이다. 도 7B(우측 하단 패널)에 제시된 바와 같이, 나선형 단계 패턴이 형성된다.
도 7B는 6단계(좌측 상부 패널), 7단계(우측 상부 패널), 8단계(좌측 하부 패널) 및 9단계(우측 하부 패널)로 전술한 공식을 사용하여 하이드로겔 돔 파괴에 대해 계산된 소정 위치의 예시적 피펫터 이동 패턴을 나타낸다. 세타 값 15.7을 사용하면, 각 패턴에 나선형 단계 패턴이 형성된다.
도 7C는 10단계(좌측 상부 패널), 11단계(우측 상부 패널), 12단계(좌측 하부 패널) 및 13단계(우측 하부 패널)로 전술한 공식을 사용하여 하이드로겔 돔 파괴에 대해 계산된 소정 위치의 예시적 피펫터 이동 패턴을 나타낸다. 세타 값 15.7을 사용하면, 각 패턴에 나선형 단계 패턴이 형성된다.
도 7D는 직경(mm) = 8, 단계 수 = 13, 알파 = 직경/1.8, 세타 = 30으로 전술한 공식을 사용하여 하이드로겔 돔 파괴에 대해 계산된 예시적 피펫터 이동 패턴을 나타낸다. 세타 값 30을 사용하면, 단계의 패턴은 나선형 패턴이 아닌 성상-유사 패턴이 출현하기 시작한다.

공-배양과 세포 상호작용의 연구에는 배양과 데이터 분석에 대한 복수의 장애물이 있다. 상이한 세포 유형을 별도의 구획으로 분리하면, 세포 이주, 신경세포 성장, 혈관신생, 면역 세포 이주 및 사멸, 전이, 세포 침윤, 단핵구 부착, 아폽토시스, 세포 분화, 줄기 세포 이식, 염증, 복수 성장 인자 및 대사산물의 분비를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 세포 유형과 조직의 효율적인 크로스-토크와 상호작용이 가능해진다.

분리 웰 마이크로플레이트의 사용을 포함하는 세포/오가노이드 공-배양 검정을 위한 방법이 제공된다. 분리 웰 마이크로플레이트는 자동화-친화적 방식으로 수평 공-배양을 서포트한다.

피펫을 펌프로서 사용하여 유압적으로 접속하거나 1차 웰과 2차 웰 사이에 마이크로채널을 통해 층상 유동으로 접속할 수 있는 인접한 웰에서 상이한 유형의 세포를 공-배양하는 방법이 제공된다.

본 발명을 뒷받침하기 위해, 분리 웰 마이크로플레이트를 사용하여 오가노이드와 세포를 배양하는 방법이 연구되었다. 예를 들면, 오가노이드를 해리시켜 신규 웰로 계대했다. 장기적 오가노이드 배양은 계대 플레이트 내에서 배양된 세포의 양호한 상태를 나타냈다.

섬유아세포의 부착은 혈장 처리된 분리 웰 마이크로플레이트 상에서 평가되었다. 섬유아세포의 부착과 정상 거동이 관찰되었다. 채널을 통한 섬유아세포의 이동은 주화인자를 사용하여 시험되었다.

본 개시의 방법은 1차 웰과 적어도 하나의 채널에 의해 접속된 2차 챔버를 포함하는 웰 형상을 갖는 분리 웰 마이크로플레이트를 사용한다. 예를 들면, 본 개시의 배양 방법은 각각 1차 웰 및 적어도 하나의 채널에 의해 접속된 2차 챔버를 포함하는 복수의 웰 유닛을 갖는 분리 웰 마이크로플레이트를 이용할 수 있다. 예를 들면, 각 웰 유닛은 도 1에 도시된 바와 같이 적어도 하나의 채널을 통해 2차 웰에 유체적으로 접속된 1차 웰을 포함하는 웰 형상을 포함할 수 있다. 분리 웰 마이크로플레이트는 문헌[참조: 2021년 2월 19일에 출원된 "마이크로플레이트 웰 유닛을 이용한 세포 계대 방법 및 장치"라는 명칭의 미국 가출원 제63/151,082호, 2021년 10월 22일에 출원된 "오가노이드 배양을 자동화하기 위한 마이크로플레이트"라는 명칭의 미국 특허 출원 제17/580,193호, 2022년 1월 18일에 출원된 "오가노이드 계대 플레이트의 3D 프린팅"이라는 명칭의 미국 가출원 제63/300,294호, 및 2021년 12월 27일에 출원된 "세포 배양을 위한 마이크로플레이트 웰"이라는 명칭의 PCT 국제 출원 제PCT/IB2021/062356호, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입되어 있다]에 기재되어 있다.

도 1A는 본 개시의 방법과 관련하여 사용될 수 있는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 한 가지 예를 도시한다. 특히, 도 1A는 본 개시의 다양한 실시형태에 따라 배아체, 융합 배아체, 구상체, 오가노이드 또는 기타 다세포체의 성장, 배양, 모니터링 및 검정에 사용될 수 있는 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 예시적 도면을 도시한다. 예를 들면, 분리 웰 마이크로플레이트의 단일 웰 유닛(100)은 세포/오가노이드 공급을 위한 수평 공-배양에 유용하다. 본 개시에 따른 방법에 사용하기 위한 분리 웰 마이크로플레이트는 복수의 웰 유닛을 포함할 수 있고, 각 웰 유닛은 공유 측벽에 의해 2차 웰(115)로부터 분리되는 1차 웰(112)을 포함하고, 1차 및 2차 웰은 적어도 하나의 마이크로채널(118)에 의해 유체적으로 접속될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 1차 웰 및 2차 웰을 서로 단리하기 위한 제거가능한 배리어를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 배지 교환을 가능하게 하기 위해 개방될 수 있다. 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)은 적어도 하나의 마이크로채널(118)에 의해 2차 웰(115)에 유체적으로 접속될 수 있는 1차 웰(112)을 포함한다. 일부 예에서, 1차 웰(112)은 배양 웰로서 사용될 수 있고, 2차 웰(115)은 공급 웰로서 사용될 수 있다. 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄되거나 개방될 수 있다. 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 하나 이상의 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭, 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰과 같은 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄될 수 있다. 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 하나 이상의 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭에 의해 폐쇄될 수 있다. 에어 갭은, 예를 들면, 기포에 의해 형성될 수 있다.

도 1B는 본 개시의 방법과 관련하여 사용될 수 있는 분리 웰 마이크로플레이트의 또 다른 예시적 웰 유닛(100)을 도시한다. 도 1B에서, 웰 유닛(100)은 개방된 적어도 하나의 마이크로채널(118)에 의해 유체적으로 접속될 수 있는 1차 웰(112) 및 2차 웰(115)을 포함한다. 개방된 경우, 적어도 하나의 채널(118) 형상은 1차 웰과 2차 웰 사이에서 배지, 호르몬, 영양소, 성장 인자, 노폐물 및 잔해와 같은 발현된 단백질을 교환하는 동시에, 예를 들면, 1차 웰(112)에 오가노이드와 같은 표적 세포를 유지하고 2차 웰(115)에 피더 세포를 유지하는 것을 가능하게 할 수 있다. 적어도 하나의 마이크로채널(118)의 치수는 마이크로채널(118)을 통한 다세포 표적 세포(예를 들면, 오가노이드, 종양체 등)의 통과를 방지할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 마이크로채널(118) 형상은 150 내지 500 마이크론 이상, 또는 200 내지 400 마이크론, 또는 약 300 마이크론 × 10 내지 100 마이크론 또는 10 내지 75 마이크론 이상의 채널 폭을 갖는 슬릿 구성을 포함할 수 있다. 본 개시의 방법 동안, 1차 웰과 2차 웰 사이의 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄되거나, 예를 들면, 분리 웰 마이크로플레이트를 락킹시키면서 중력 공급에 의해 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 배지, 분비된 인자, 호르몬, 성장 인자, 영양소, 폐기물 및 잔해의 교환을 가능하게 하도록 개방될 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 마이크로채널은, 예를 들면, 피펫을 펌프로서 사용하여 에어 갭을 제거하는 것과 같은 제거가능한 배리어를 제거함으로써, 예를 들면, 피펫 팁을 2차 웰에 밀봉하여 2개 웰 사이에 액체 유동을 강제함으로써 개방될 수 있다.

도 1C는 본 개시의 방법과 관련하여 사용될 수 있는 분리 웰 마이크로플레이트의 추가의 예시적 웰 유닛(100)을 도시한다. 웰 유닛(100)은 1차 웰 섹션(112), 2차 웰 섹션(115), 적어도 하나의 마이크로채널(118) 및 웰 유닛(100)의 1차 웰 섹션(112)에 배치될 수 있는 제1 하이드로겔 돔(106)을 포함한다. 다양한 실시형태에 따르면, 웰 유닛(100)은 마이크로플레이트의 웰 플레이트 본체의 하부에 배치되는 바닥 층 시트(121)를 추가로 포함한다. 바닥 층 시트(121)는 웰 유닛(100)의 바닥 표면을 형성하는 웰 플레이트 본체의 하면에 부착된다. 다양한 예에서, 바닥 층 시트(121)는, 이해될 수 있는 바와 같이, 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)에서 배양되는 구상체, 오가노이드 또는 다른 세포 배양물의 이미징을 가능하게 하도록 광학적으로 투명한 관찰 윈도우를 포함한다. 관찰 윈도우는 명시야, 위상-대비, 형광, 공초점, 2-광자 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 현미경 이미징 양식에 관계없이 현미경 관찰에 적합한 윈도우일 수 있다. 일부 예에서, 바닥 층 시트(121)는 마이크로플레이트의 웰 유닛(100) 내에서 성장하는 구상체, 오가노이드 또는 기타 세포체에 대한 산소 공급을 증가시키도록 구성되는 가스 투과성 시트를 포함할 수 있다. 가스 투과성 시트는, 이해될 수 있는 바와 같이, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), PEFP, 폴리이미드, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리카보네이트 및/또는 기타 재료를 포함하는 재료로 형성될 수 있다. 다양한 예에 따르면, 가스 투과성 시트는 약 5 내지 70 마이크론의 두께를 가질 수 있다. 다양한 예에 따르면, 가스 투과성 시트는 복수의 기공을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 가스 투과성 시트는 분자를 확산에 의해 통과시킬 수 있다. 또는, 가스 투과성 시트는 다른 두께, 기공 직경 및 기공 밀도를 포함할 수 있다.

도 1C에 제시된 바와 같이, 다세포체(103) 형태의 표적 세포(예를 들면, 구상체, 종양체, 오가노이드 등)는 1차 웰(112) 내의 웰 유닛(100)에 배치되고, 액체 배지(109)로 둘러싸여 있는 하이드로겔(106)(예를 들면, Matrigel^®)의 돔에 매립될 수 있다. 다양한 실시형태에 따르면, 액체 배지(109)는 목적하는 다세포체의 성장을 생성 및/또는 자극하기 위한 적절한 성장 인자 및 보충제를 함유할 수 있다. 적합할 수 있는 예시적 성장 인자에는 안지오포이에틴, 골 형성 단백질(BMP), 섬모 신경성장 인자, 콜로니 자극 인자, 에프린, 표피 성장 인자, 에리트로포이에틴, 섬유아세포 성장 인자, 신경교 유래 신경영양 인자, 간세포 성장 인자, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 인터루킨, 백혈병 억제 인자, 각질세포 성장 인자, 뉴레귤린, 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 종양 괴사 인자(알파), 혈관 내피 성장 인자 및/또는 이와 유사한 인자가 포함된다.

다양한 실시형태에 따르면, 도 1C의 웰 유닛(100)은 1차 웰 섹션(112)과 2차 웰 섹션(115)을 포함한다. 다양한 예에서, 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115)은 폐쇄된 마이크로채널에 의해 서로 격리된다. 일부 실시형태에서, 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭, 하이드로겔 또는 실리콘에 의해 폐쇄될 수 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 마이크로플레이트의 경사에 대응하여 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115)이 적어도 하나의 마이크로채널(118)을 통해 서로 유체 접속하도록 개방되어, 1차 웰 섹션(112)과 2차 웰 섹션(115) 사이에서 액체(예를 들면, 액체 배지(109))의 중력 유동을 촉진할 수 있다. 1차 웰 섹션(112)과 2차 웰 섹션(115) 사이에서 액체 배지(109)를 교환하면, 독성 부산물의 제거가 가능해지고, 성장하는 세포 배양물에 신선한 영양소를 공급할 수 있다. 도 1C의 예에서, 하이드로겔(106)과 세포체(103)는 웰 유닛(100)의 1차 웰 섹션(112)에 배치된다.

다양한 실시형태에 따르면, 본 개시에 따른 방법은, 예를 들면, 384 웰 유닛, 96 웰 유닛, 48 웰 유닛, 24 웰 유닛, 12 웰 유닛, 8 웰 유닛 또는 6 웰 유닛과 같은 복수의 웰 유닛(100)을 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트를 사용한다. 마이크로플레이트 내의 웰 유닛(100)의 수에 따라, 1차 웰 섹션(112)의 폭은 최대 약 8mm(예를 들면, 96 웰 플레이트의 경우), 최대 약 11mm(예를 들면, 48 웰 플레이트의 경우), 최대 약 17mm(예를 들면, 24 웰 플레이트의 경우) 및/또는 이해할 수 있는 다른 크기일 수 있다. 또한, 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115)의 깊이는 마이크로플레이트가 각 웰 유닛(100)의 각각의 1차 웰 섹션(112) 또는 2차 웰 섹션(115)으로부터 유체를 유출하지 않으면서 웰 유닛(100) 내에서 유체 교환을 가능하게 하도록 경사질 수 있도록 지정된다.

다양한 실시형태에 따르면, 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)은 1차 웰 섹션(112)을 포함하고, 이는 1차 웰 섹션(112)에 침적되는 하이드로겔(106)에 매립될 수 있는 침적된 세포체(103)(예를 들면, 세포 응집체)를 서포트하도록 크기 및 형상화될 수 있다. 예를 들면, 1차 웰 섹션(112)은, 예를 들면, 배아체, 융합 배아체, 구상체, 오가노이드 및/또는 기타 다세포체와 같은 표적 세포를 성장시키기 위해 사용되는 배양 웰로 간주될 수 있다.

2차 웰 섹션(115)은 피더 세포를 성장시키고, 1차 웰 섹션(112)에 배치된 성장 세포 응집체를 공급하기 위해 사용될 수 있는 공급 배지 및/또는 기타 영양소를 공급하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2차 웰은, 예를 들면, 표적 세포로부터 분비된 인자에 특이적인 1차 항체로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2차 웰 섹션(115)은 세포 응집체로부터 상청액을 수집하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 2차 웰 섹션(115)은 1차 웰 섹션(112)에서 성장하는 세포 배양물에 의해 사용될 수 있는 공급 배지 및/또는 기타 영양소를 포함하는 공급 웰로 간주될 수 있다. 2차 웰 섹션(115)은 본 개시의 다양한 실시형태에 따라 1차 웰 섹션(112)과 교환될 수 있는 유체를 보유하도록 크기 및 형상화될 수 있다.

다양한 실시형태에 따르면, 마이크로플레이트 내의 웰 유닛(100)의 수에 따라, 2차 웰 섹션(115)의 폭은 최대 약 8mm(예를 들면, 96 웰 플레이트의 경우), 최대 11mm(예를 들면, 48 웰 플레이트의 경우), 최대 약 17mm(예를 들면, 24 웰 플레이트의 경우) 및/또는 이해될 수 있는 다른 크기일 수 있다.

다양한 실시형태에 따르면, 1차 웰 섹션(112)과 2차 웰 섹션(115)의 크기와 모양은 서로 상이할 수 있다. 일부 예에서, 1차 웰 섹션(112)은 2차 웰 섹션(115)보다 (예를 들면, 직경, 단면적 또는 용적과 같은 치수에서) 더 크다. 다른 예에서, 2차 웰 섹션(115)은 1차 웰 섹션(112)보다 더 크다. 일부 예에서, 1차 웰 섹션(112)은 2차 웰 섹션(115)의 형상과 상이한 형상을 포함한다.

다양한 예에 따르면, 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛은 특정 크기(예를 들면, 약 25 마이크론(μ) 이상)의 치수(예를 들면, 직경, 높이, 폭 등)를 갖는 물체가 하나의 웰 섹션으로부터 다른 웰 섹션으로 통과하지 못하도록 크기 및 형상을 갖는 적어도 하나의 마이크로채널(118)을 포함한다.

일부 예에서, 적어도 하나의 마이크로채널(118)의 높이는 약 10 마이크론 내지 약 100 마이크론, 또는 약 10 마이크론 내지 약 75 마이크론, 또는 약 10 마이크론 내지 약 25 마이크론 사이의 크기일 수 있다. 적어도 하나의 마이크로채널(118) 형상은 채널 폭이 150 내지 500 마이크론 이상, 또는 200 내지 400 마이크론, 또는 약 300 마이크론 × 10 내지 100 마이크론, 또는 10 내지 75 마이크론 이상인 슬릿 구성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적어도 하나의 마이크로채널(118)의 높이는 1차 웰 섹션(112)에 존재하는 약 25㎛ 이상 크기의 물체(예를 들면, 구상체, 종양체, 오가노이드, 오가노이드 단편 등)가 2차 웰 섹션(115)으로 이주하는 것을 방지할 수 있도록 할 수 있다. 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭, 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰에 의해 폐쇄될 수 있다. 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭을 제거하거나 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰을 제거함으로써 개방될 수 있다.

본 개시의 일부 실시형태에서, 1차 웰(112)은 배양 챔버로서 이용될 수 있다. 초기에, 적어도 하나의 채널(118)은 폐쇄될 수 있고, 예를 들면, 표적 세포는 배양되고, 예를 들면, 혼합 없이 분리 웰 마이크로플레이트의 1차 웰(112)의 바닥에 부착시킬 수 있다. 피더 세포는 배양되고, 예를 들면, 혼합 없이 분리 웰 마이크로플레이트의 2차 웰(115)의 바닥에 부착시킬 수 있다. 표적 세포 및/또는 피더 세포가 웰에 부착된 후, 폐쇄된 적어도 하나의 채널(118)이 개방될 수 있다. 분리 웰 마이크로플레이트는 중력 공급에 의한 배지, 호르몬, 성장 인자, 영양소, 폐기물 및 잔해의 교환을 가능하게 하기 위해 로커(rocker)에 배치될 수 있다. 일부 예에서, 피더 세포는 2차 챔버(115)에서 배양되어, 1차 챔버(112)에서 배양된 표적 세포가 개방된 적어도 하나의 채널을 통해 공급될 수 있도록 한다.

정의

본원에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하는 것만을 목적으로 하고, 본 개시를 한정하기 위한 것은 아니다.

단수형 "a", "an" 및 "the"는, 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 복수형도 포함하도록 의도된다.

"및/또는"이라는 용어는 관련된 나열 항목 중 하나 이상의 임의 및 가능한 모든 조합을 지칭하고 이를 포괄한다.

화합물의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급하는 경우, "약"이라는 용어는 지정된 양의 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 0.1%의 변동을 포괄하는 의미이다.

"항체 접합체"라는 용어는 발색단 또는 형광단 분자, 스트렙트아비딘과 같은 아비딘 또는 비오틴에 접합된 특이적 항체를 지칭하고, 여기서 항체는 분비된 인자와 같은 표적 항원에 특이적이다.

본원에서 사용되는 "포함하다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 기재된 특징, 정수, 단계, 조작, 요소 및/또는 성분의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 조작, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하는 것은 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 설명에 사용된 기술 및 과학 용어를 포함한 모든 용어는 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어가 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다.

본원에서 지칭된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전체가 참조에 의해 도입되어 있다.

본 개시의 일 양태에서 기재된 실시형태는 기재된 양태로 한정되지 않는다. 실시형태는, 본 개시의 이러한 양태가 이의 의도된 목적을 위해 작동하는 것을 방해하지 않는 한, 본 개시의 다른 양태에도 적용될 수 있다.

질환 상태 또는 병태의 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"에는 다음이 포함된다: (i) 질환 상태 또는 병태의 예방, 즉 질환 상태 또는 병태에 노출되거나 질환 상태 또는 병태의 소인이 될 수 있지만 아직 질환 상태 또는 병태의 증상을 경험하거나 나타내지 않는 대상체에서 질환 상태 또는 병태의 임상 증상이 발현하지 않도록 하는 것, (ii) 질환 상태 또는 병태의 억제, 즉 질환 상태 또는 병태 또는 이의 임상 증상의 진행을 중지하는 것, 또는 (iii) 질환 상태 또는 병태의 완화, 즉 질환 상태 또는 병태 또는 이의 임상 증상의 일시적 또는 영구적 퇴행을 유발하는 것.

"피더 세포(feeder cell)"라는 용어는 또 다른 세포의 증식, 성장, 분화 및/또는 동일성 유지를 보조하기 위해 세포외 분비물을 제공하는 세포를 지칭한다. 피더 세포는 세포외 매트릭스(ECM) 성분과 성장 인자의 복잡한 혼합물에 기여함으로써 배양 중의 표적 세포의 성장을 서포트할 수 있다. 일부 경우에, 피더 세포는 분열할 수 없는, 즉 세포 성장이 정지될 수 있다. 피더 세포 성장은, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 정지될 수 있다. 피더 세포 성장은 화학적 고정, 예를 들면, 미토마이신-C 또는 글루타르알데히드 화학적 고정에 의해 정지될 수 있다. 피더 세포 성장은 감마선 조사, x-선 조사 또는 전기 펄스와 같은 물리적 방법에 의해 정지될 수 있다. 예를 들면, 배아 줄기 세포(ESC)와 같은 표적 세포의 공-배양에 사용되는 피더 세포는 섬유아세포일 수 있고, 이 세포는 유사분열적으로 비활성화되어 생존력을 유지할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 분열 가능한 피더 세포의 존재하에 성장할 수도 있다. 일부 살아있는 피더 세포(예: 인간 섬유아세포)는 재-프로그래밍시 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 경우처럼 표적 세포로 될 수도 있다. 예를 들면, 피더 세포는 분열할 수 없는 정지된 피더 세포일 수 있다. 피더 세포 선택은 표적 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 피더 세포는 정지되지 않은 섬유아세포일 수 있다. 피더 세포는 정지된 섬유아세포, 상피 세포, 중간엽 세포, 근육 세포, 간질 세포, 비장 세포 또는 양막 세포일 수 있다. 섬유아세포는, 예를 들면, 인간 피부 섬유아세포, 3T3 섬유아세포, 인간 태아 섬유아세포, 마우스 배아 섬유아세포 등일 수 있다. 상피 세포는, 예를 들면, 인간 성인 나팔관 상피 세포, 인간 양막 상피 세포, HeLa 세포(인간 자궁경부암 암종 상피 세포) 등일 수 있다. 중간엽 세포는 지방-유래 중간엽 줄기 세포, 인간 골수-유래 중간엽 줄기 세포, 인간 골수-유래 중간엽 세포, 인간 양막 중간엽 줄기 세포 등일 수 있다. 간질 세포는, 예를 들면, 인간 골수 간질 세포 또는 마우스 골수 간질 세포일 수 있다. 양막 세포는, 예를 들면, 인간 양막 세포 또는 마우스 양막 세포일 수 있다.

"표적 세포"라는 용어는 오가노이드, 종양체, 구상체, 줄기 세포 또는 생산 세포주와 같은 본 개시의 자동화된 세포 배양 용도를 위한 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 구상체, 종양체, 오가노이드 및/또는 다른 다세포체이다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 생산 세포주일 수 있다. 표적 세포는 표적 조직으로부터 유래될 수 있다. 표적 조직은 포유동물 1차 조직, 오가노이드 또는 종양체일 수 있다. 포유동물 조직은 환자 생검 샘플로부터 유래할 수 있다. 표적 조직은, 예를 들면, 폐, 소장 등의 장, 결장, 위, 췌장, 간, 신장, 피부, 골수, 혈액-뇌 배리어, 뇌, 심장 등과 같은 표적 기관으로부터 유래할 수 있다.

오가노이드, 구상체, 종양체 및 3차원(3D) 세포 배양 모델은 질환 모델링과 재생 의학 등과 같은 다수의 분야에서 유용하다. 오가노이드 또는 구상체와 같은 3D 세포 모델은, 시트 또는 단층으로 성장된 세포의 2D 모델이 성공적이지 않을 수 있는 반면, 세포가 응집체 또는 구상체와 같이 자연적 형상 및 적절한 공간 배향을 종종 유지하기 때문에, 생리학적으로 관련된 상황에서 복잡한 생물학을 보다 충분히 이해하는 데 유용할 수 있다. 3D 세포 배양의 유전자 및 단백질 발현은 유전자 및 단백질의 발현을 보다 엄밀하게 모방할 수 있다. 예를 들면, 3D 세포 배양은 약물 표적 동정, 리드 화합물 동정, 화합물 최적화, 전임상 증명, 고형 종양 모델링, 유전 질환 모델링, 신약 개발, 정밀 의학, 기관-온-칩(organs-on-chips) 및 바이오프린팅에 유용할 수 있다.

"구상체"라는 용어는 성장 및 증식하는 하나 이상의 세포 유형으로 구성된 3차원(3D) 다세포 시험관내 조직 배양 응집체를 지칭하고, 생리학적 반응의 증강을 나타낼 수 있지만, 분화 또는 자가-조직화는 수행되지 않는다. 구상체의 일반적 세포 공급원은 1차 조직 또는 불멸화된 세포주이다. 구상체는 단층과 복잡한 기관 사이의 갭을 브릿징할 수 있다.

"오가노이드"는 하나 이상의 세포 유형으로 구성된 3차원(3D) 다세포 시험관내 조직 배양 응집체를 지칭하고, 여기서 세포는 적어도 한 가지 양태에서 이들의 생체내 대응물과 유사한 적절하게 분화된 기능적 세포 유형 및 전구세포로 자발적으로 자가-조직화된다. 오가노이드는 대응하는 생체내 기관을 모방한다. 오가노이드는 다능성 줄기 세포(PSC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 신생아 조직 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 성체 줄기 세포 또는 1차 조직으로부터 유래할 수 있다. 오가노이드 배양물은 기관의 복잡성의 대부분에 유사하도록 작성될 수 있고, 따라서 질환의 병인 및 치료의 연구에 유용하다. 오가노이드 기술은 최근 기초 및 생물의학 연구에 필수적 도구로 부상하고 있다. 오가노이드 배양물은, 예를 들면, 폐, 소장 등의 장, 결장, 위, 췌장, 간, 신장, 피부, 골수, 혈액-뇌 배리어, 뇌, 심장 등과 같은 상이한 유형의 표적 기관으로부터 선택될 수 있다.

예를 들면, 위 오가노이드 조직 배양물은, 예를 들면, 성체 마우스, 성체 인간, hPSC 등과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 위 오가노이드 조직 배양물은 공급원에 따라 EGF, 노긴(Noggin), R-스폰딘(spondin), Wnt-3A, FGF10 등과 같은 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 줄기 세포 배양 조건(니쉬(niche) 인자)을 사용할 수 있다. 분화 배양 조건은 공급원에 따라 EGF, R-스폰딘 EGF, R-스폰딘 등을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 소장 오가노이드 조직 배양물은, 예를 들면, 성체 마우스, 성체 인간, hPSC 등과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 소장 오가노이드 조직 배양물은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A TGF-베타 억제제, p38 억제제 등과 같은 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 줄기 세포 배양 조건(니쉬 인자)을 사용할 수 있다. 분화 배양 조건은 공급원에 따라 EGF, 노긴, TGF-베타 억제제 등을 포함할 수 있다.

추가 예로서, 결장 오가노이드 조직 배양물은, 예를 들면, 성체 마우스, 성체 인간 등과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 결장 오가노이드 조직 배양물은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A TGF-베타 억제제, p38 억제제 등과 같은 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 줄기 세포 배양 조건(니쉬 인자)을 사용할 수 있다. 분화 배양 조건은 공급원에 따라 EGF, 노긴, TGF-베타 억제제 등을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 췌장 오가노이드 조직 배양물은, 예를 들면, 성체 마우스, 성체 인간 등과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 췌장 오가노이드 조직 배양물은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A, FGF10, 니코틴아미드 등과 같은 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 줄기 세포 배양 조건(니쉬 인자)을 사용할 수 있다. 분화 배양 조건은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A 등을 포함할 수 있다.

추가 예로서, 간 오가노이드 조직 배양물은, 예를 들면, 성체 마우스, 성체 인간 등과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 간 오가노이드 조직 배양물은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A, FGF10, HGF, 니코틴아미드 등과 같은 하나 이상의 배지 성분을 포함하는 줄기 세포 배양 조건(니쉬 인자)을 사용할 수 있다. 분화 배양 조건은 공급원에 따라 EGF, 노긴, R-스폰딘, Wnt-3A, FGF10, TGF-베타 억제제, 노치(Notch) 억제제, BMP7 등을 포함할 수 있다.

"종양체(tumoroid)"라는 용어는 일반적으로 종양 환자로부터 채취한 원발성 종양으로부터 유래된 하나 이상의 세포 유형으로 구성된 3차원(3D) 다세포 시험관내 조직 배양 응집체를 지칭하고, 인간 종양 미세환경을 모방할 수 있다. 종양체는 신규 항암제의 연구 또는 종양학 분야의 정밀 의학에서 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 암 세포주는 방광, 유방, 결장, 조혈 및 림프, 간, 폐, 난소, 전립선, 피부 등일 수 있다.

"줄기 세포"라는 용어는 상이한 기능을 수행하는 다수의 상이한 세포 유형으로 발달할 수 있는 가능성을 갖는 미분화 세포를 지칭한다. 배아에서 발견되는 것과 같은 다능성 줄기 세포는 뇌, 골(bone), 심장, 피부 등의 것과 같은 임의 유형의 세포를 생성할 수 있다. 일부 인간 성체 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)라고 하는 배아 줄기 세포-유사 상태로 재-프로그래밍할 수 있다. 예를 들면, 성인 또는 유아의 제대에서 발견되는 다능성 줄기 세포는 이들이 유래하는 기관 시스템을 구성하는 세포로 발달할 수 있다. 특정 세포 배양 조건하에서 성장하는 경우, 다능성 줄기 세포는 미분화 상태를 유지할 수 있다. 분화된 세포를 생성하기 위해, 배양 배지의 화학 조성을 변경하거나, 배양 접시의 표면을 변경하거나, 특정 유전자를 강제 발현시킴으로써 세포를 변형시킬 수 있다.

"생산 세포주"라는 용어는 효소, 백신, 모노클로날 항체, 사이토카인, 펩타이드, 치료용 독소, 응고 인자, Fc-융합 단백질 또는 호르몬 등의 생산에 사용할 수 있는 세포주를 지칭한다. 생산 세포주는 원핵생물 또는 진핵생물 생산 세포주일 수 있다. 생산 세포주는 단백질 또는 바이러스 생산에 적합한 임의의 생산 세포주일 수 있다. 원핵생물 생산 세포주는 임의의 적절한 원핵생물 세포주를 포함할 수 있다. 원핵생물 생산 세포주는 임의의 적절한 박테리아 세포주(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 포함할 수 있다. 진핵생물 생산 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 뮤린 골수종 세포주(예를 들면, NS0, Sp2/0), 뮤린 C127, HEK293 세포주와 같은 인간 배아 신장(HEK) 세포주, HT-1080 세포주와 같은 인간 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주와 같은 인간 배아 망막 세포주, BHK21 세포주와 같은 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포주, 효모 세포주(예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 바이러스 벡터 바쿨로바이러스(바쿨로바이러스-곤충 세포 발현 시스템)에 감염된 곤충 세포주, 예를 들면, Sf9 세포주, 식물 세포를 포함할 수 있다.

"분비된 인자" 또는 "분비된 인자들"이라는 용어는 본 개시의 자동화된 세포 배양 적용 동안 표적 세포로부터 분비될 수 있는 인자를 지칭한다. 분비 인자는 호르몬, 대사산물, 효소, 백신, 모노클로날 항체, 사이토카인, 펩타이드, 치료용 독소, 응고 인자 또는 Fc-융합 단백질을 포함한 임의의 분비된 인자일 수 있다.

간접 공-배양으로도 공지된 "트랜스 웰" 배양은, 예를 들면, 0.4uM 미세-다공성 막으로 분리된 하부 구획과 트랜스 웰 삽입물과 같은 상부 구획을 갖는 수직으로 배열된 웰을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 조직 배양 방법은 트랜스 웰 배양을 사용하지 않는다.

사용되는 공급원 세포의 유형 및 달성하고자 하는 분화 유형에 따라 각각 상이한 배지 성분이 요구될 수 있다. EGF, 노긴(NOG), R-스폰딘(RSPO1), HGF, BMP, FGF 등과 같은 성장 인자는 오가노이드 배지의 필수 성분일 수 있다. 조직 배양 배지는 성장 인자를 포함할 수 있다. 성장 인자는 피더 세포에 의해 생성될 수 있다. 성장 인자는 재조합 성장 인자일 수 있다. 오가노이드 배양용의 재조합 성장 인자 단백질은, 예를 들면, 재조합 인간 EGF 단백질, 예를 들면, 인간 HGF 단백질, 사이노몰거스 HGF 단백질, 인간 FGF10, 인간 노긴/NOG 단백질, 인간 RSPO1 단백질, 인간 BMP-2 단백질 등과 같은 재조합 HGF 단백질을 포함할 수 있다. 오가노이드 배양용의 추가 재조합 성장 인자는, 예를 들면, EGF, FGF2, FGF7, FGF9, FGF10, HGF, NOG, RSPO1, RSPO3, 액티빈 A, BMP2 및 BMP4 등을 포함할 수 있다. 조직 배양 배지 또는 오가노이드 배양용의 재조합 성장 인자 단백질은, 예를 들면, 시노 바이올로지컬 인코포레이티드(Sino Biological, Inc.) 또는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

오가노이드 및 구상체와 같은 3D 세포 모델은 배지 내의 하이드로겔 돔과 같이 하이드로겔을 포함하는 조직 배양 배지에서 배양할 수 있다.

"하이드로겔" 또는 "하이드로겔들"이라는 용어는 오가노이드의 배양에 유용한 세포외 매트릭스를 지칭한다. 하이드로겔에는, 예를 들면, 마트리겔(Matrigel)(Corning), 쿨텍스(Cultex)(Trevigen), 겔트렉스(Geltrex)(Gibco)로서 상업적으로 입수가능한 뮤린 EHS 육종 매트릭스, 콜라겐 I형, 피브린, 히알루론산(HA), 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA), 탈세포화된 매트릭스, 또는 알기네이트, 실크, 나노셀룰로오스와 같은 생체고분자; 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 인공 재료, RADA16/PuraMatrix bQ13, 폴리(락틱/(코)글리콜) 산, 폴리카프로락톤, 폴리아크릴아미드, 올리고(에틸렌 글리콜)-치환된 폴리이소시아노펩티드, ELP(엘라스틴-유사 단백질) 또는 이들 폴리머의 조합을 포함할 수 있다.

세포/오가노이드 공급을 위한 수평 공-배양

세포/오가노이드 공급을 위한 수평 공-배양의 방법이 제공된다. 도 1A에 도시된 웰 유닛(100)이 사용될 수 있다. 이 방법은 혼합 없이 인큐베이팅하는 것을 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 1차 웰(112)의 바닥에 하나 이상의 표적 세포를 부착시키는 단계로서, 1차 웰은 폐쇄된 적어도 하나의 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰(115)과 분리되는, 단계; 혼합 없이 인큐베이션을 포함하는 2차 웰의 바닥에 하나 이상의 피더 세포를 부착시키는 단계; 폐쇄된 적어도 하나의 마이크로채널을 개방하는 단계; 도 1B에 도시된 바와 같이, 분리 웰 마이크로플레이트를 락킹시켜, 개방된 적어도 하나의 마이크로채널(118)을 통해 중력 유동에 의해 1차 웰(112)과 2차 웰(115) 사이의 혼합 및 배지 교환을 가능하게 하는 단계; 표적 세포를 1차 웰(112)로부터 분리하는 단계; 및 분리된 표적 세포를 개방 마이크로채널에서 멀리 떨어진 1차 웰(112)에 침강시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 분리된 표적 세포를 혼합하고 개방 마이크로채널로부터 멀리 떨어진 1차 웰에서 추가로 침강시키는 단계; 침강된 표적 세포를 세척하는 단계; 및 액체 핸들러를 통해 세척된 표적 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세척은 액체 배지의 도입 및 제거를 포함하는 침강된 표적 세포의 현탁을 포함할 수 있고, 세척은 임의로 복수회 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적 세포를 1차 웰(112)의 바닥에 부착시키는 단계 및 하나 이상의 피더 세포를 2차 웰(115)의 바닥에 부착시키는 단계는 초기 인큐베이션 기간 동안 동시에 또는 본질적으로 동시에 수행된다.

초기에, 적어도 하나의 마이크로채널은, 예를 들면, 마이크로채널 내부 또는 이에 인접한 에어 갭에 의해 폐쇄될 수 있다. 폐쇄된 적어도 하나의 마이크로채널(118)은 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 후에 에어 갭을 제거함으로써 개방될 수 있다. 예를 들면, 적어도 하나의 마이크로채널은 피펫을 펌프로서 사용하여 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제함으로써 개방될 수 있다. 피펫을 펌프로서 사용하기 위해, 피펫의 외부 표면을 2차 웰의 주위와 계합시켜 씰을 형성한다. 이어서, 피펫 내의 액체가 마이크로채널(118)로 압입되고, 이를 통해 에어 갭을 제거한다.

1차 웰(112)로부터 표적 세포의 분리는 피더 세포를 분리하지 않으면서 표적 세포를 분리하기 위해 표적 세포를 해리 시약에 노출시키는 것을 포함할 수 있고, 임의로, 해리 시약은 EDTA를 포함할 수 있다. 해리 시약은 생리학적 완충액 중에 분리 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 분리 효소는 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 카탈라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 디스파제 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

일부 예에서, 표적 세포는 줄기 세포 또는 오가노이드일 수 있다. 일부 예에서, 피더 세포는 섬유아세포일 수 있다. 일부 예에서, 표적 세포는 웰 유닛의 1차 웰에 배치된 하이드로겔에 매립된다.

단일 마이크로플레이트 내에서 동태 측정을 가능하게 하는 세포로부터 분비된 인자의 검출

표적 세포는 분비된 인자를 생산할 수 있다. 예를 들면, 도 2에 도시된 바와 같이, 장 오가노이드는 호르몬(230)을 분비할 수 있고, CHO 세포와 같은 생산 세포주는 항체를 분비할 수 있다. 세포로부터 복수의 분비된 인자를 검출하기 위한 방법이 제공되어 단일 마이크로플레이트 내에서 시간 경과에 따른 동태 측정을 가능하게 한다. 예를 들면, 줄기 세포 또는 오가노이드 단편으로부터 오가노이드의 형성 후에 상이한 시점(동태 측정)(270, 280, 290)에서 복수의 분비 인자가 검출될 수 있다.

도 2는 단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 시간 경과에 따른 동태 측정을 포함하는 표적 세포로부터 분비된 인자를 검출하는 방법을 도시한다. 일부 실시형태에서, 분비된 인자들은 호르몬, 항체, 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자들로부터 선택될 수 있다. 표적 세포, 예를 들면, 오가노이드 또는 종양체와 같은 다세포 표적 세포의 공급원일 수 있는 환자 생검 샘플을 수득할 수 있고(210); 오가노이드 단편 또는 줄기 세포와 같은 기타 오가노이드의 공급원을 이용할 수 있다. 오가노이드와 같은 표적 세포의 배양은 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 수행될 수 있다(220). 오가노이드는 호르몬을 액체 배지로 분비할 수 있다(230). 초기 인큐베이션 기간 동안, 1차 웰은 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 2차 웰로부터 분리되고, 2차 웰 바닥은 분비된 인자에 특이적인 1차 항체(Ab)로 코팅/점착된다(240). 초기 인큐베이션 기간 후, 마이크로채널(250)의 배리어가 제거되어 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자가 개방 마이크로채널을 통해 확산될 수 있다. 분비된 인자는 2차 웰의 1차 항체에 의해 포획된다(260). 1차 항체 또는 포획된 분비 인자에 특이적인 표지된 2차 항체(2' Ab)가 제1 시점에서 2차 웰에 첨가되고, 마이크로플레이트 리더를 통해 2차 웰에서 결합된 2' Ab가 검출된다(270). 분비된 인자의 확산은 분리 웰 마이크로플레이트를 락킹시켜 개방 마이크로채널을 통한 중력 유동에 의해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자를 확산시키는 것을 포함할 수 있다. 검출은 플레이트 리더와 동종의 이미징에 의한 다중 검출을 포함할 수 있다.

도 2에 제시된 바와 같이, 마이크로플레이트에서 표적 세포를 추가로 인큐베이팅한 후(275), 제1 항체 또는 포획된 분비 인자에 특이적인 추가로 표지된 2차 항체(2' Ab)를 제2 시점에서 첨가하고, 마이크로플레이트 리더로 검출한다(280). 임의로, 마이크로플레이트에서 표적 세포를 추가로 인큐베이팅한 후(285), 1차 항체 또는 포획된 분비 인자에 특이적인 추가로 표지된 2차 항체(2' Ab)를 제3 시점에서 첨가하고, 마이크로플레이트 리더로 검출한다(290). 추가의 순차적 인큐베이션 및 검출 조작은 제4, 제5, 제6, 제7 및 추가 시점에 걸쳐 수행될 수 있다. 이 방법은 표적 세포의 배양에 사용되는 동일한 분리 웰 마이크로플레이트에서 시간 경과에 따른 분비된 인자의 동태 측정을 가능하게 한다.

표지된 항체는 형광색소와 같은 적절한 표지로 표지할 수 있다. 상이한 항체는 상이한 형광물질로 차등적으로 표지할 수 있다. 1차 항체(Ab) 및 표지된 2차(2' Ab) 항체는, 예를 들면, 벡크만 코울터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.), 애브캠(Abcam) 또는 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)로부터 상업적으로 구매할 수 있다. 표지된 2차 항체(2' Ab)는 당해 기술분야에 공지된 항체 표지 방법, 예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(NHS 에스테르), 헤테로이관능성 시약 또는 카보디이미드를 사용하여 제조할 수 있다.

일부 실시형태에서, 표적 세포는 환자의 생검 샘플, 줄기 세포 또는 오가노이드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 조직으로부터 유래될 수 있는 오가노이드이다. 오가노이드는 웰 유닛의 1차 웰 중의 하이드로겔 돔 내에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 오가노이드는 하이드로겔 돔(예: Matrigel) 내의 1차(배양) 웰에서 줄기 세포 또는 오가노이드 단편으로부터 배양될 수 있다.

초기에, 1차 웰과 2차 웰은, 예를 들면, 마이크로채널 내에서 포획된 공기(또는 기타 수단)에 의해 분리되어 검출 어레이 상의 비특이적 결합을 회피할 수 있다. 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널은, 임의로 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 동안, 마이크로채널 내부 또는 이에 인접한 에어 갭, 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰을 포함하는 배리어에 의해 폐쇄될 수 있다. 마이크로채널이 에어 갭을 포함하는 배리어에 의해 폐쇄되는 경우, 폐쇄된 마이크로채널의 개방은 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 후에 에어 갭을 제거하는 것을 포함하고; 임의로, 피펫을 펌프로서 사용하여 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 피펫을 펌프로서 사용하여(피펫 팁을 공급 웰에 씰링) 1차 웰과 2차 웰 사이에 액체 유동을 강제함으로써 오가노이드가 완전히 발달한 후에 에어 갭을 제거할 수 있다. 예를 들면, 에어 갭은 1차 웰과 2차 웰 사이의 마이크로채널을 통해 액체를 흡인함으로써 제거할 수 있다. 또 다른 예에서, 중력 유동을 사용하여 웰 사이에 배지를 교환하여 오가노이드의 분비 생성물을, 스팟/코팅된 Ab를 포함하는 2차 웰로 수송할 수 있다.

2차 웰은 복수의 상이한 분비된 인자에 특이적인 복수의 상이한 1차 항체로 스팟/코팅될 수 있고, 1차 항체는 검출 어레이의 2차 웰의 바닥에 배열될 수 있다. 검출된 분비 인자 유형은 검출 어레이의 특정 영역에 배치될 수 있다. 호르몬의 양은 세척 후의 형광 신호의 강도에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 형광체를 이용하여 상이한 시점을 기록할 수 있다(예: 모든 시점에 대해 상이한 형광 색상). 포획 항체(Ab)의 농도는, 예를 들면, 상이한 형광체를 사용하여 정규화할 수 있다.

측정은 현미경 또는 플레이트 리더를 사용하여 수행할 수 있다. 플레이트 리더는 높은 동적 범위를 가능하게 한다는 이점이 있지만, 모든 검출 어레이 포인트에 대해 약 1mm²가 필요할 수 있다. 이미저는 훨씬 더 작은 어레이 포인트를 관찰할 수 있는 더 많은 수의 어레이 포인트를 검출할 수 있지만, 동적 범위가 더욱 제한될 수 있다.

줄기 세포 단리를 위한 항체로 관능화된 표면

일부 오가노이드 유형은 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방식으로 계대해야 한다. 이 경우, 신규 오가노이드를 재-생성할 수 있도록 목적하는 (성체) 줄기 세포를 포획하는 것이 중요하다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 단일 세포 계대를 이용한 오가노이드 계대 방법을 제공하고, 모든 인큐베이션 사이클의 말기에 세척 프로세스 동안 줄기 세포를 특이적으로 포획하기 위해 항체로 관능화된 표면을 갖는 2차 웰을 가질 수 있다. 도 3은 목적하는 줄기 세포를 단리하여 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방식으로 계대하는 예시적 방법을 도시한다. 조작(310)은 줄기 세포(예를 들면, Lgr5+)에 특이적인 고정화된 1차 항체(Ab)로 코팅 또는 표면 관능화된 2차 웰(115)을 갖는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛, 1차 웰(112)의 바닥 표면에 배치된 하이드로겔 돔(106) 내에 오가노이드(예를 들면, 장 오가노이드)를 함유하는 1차 웰(112), 및 초기 폐쇄된 마이크로채널(118)에서 오가노이드를 배양하는 것을 포함한다. 액체 배지(109)는 또한 웰 유닛(100)의 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115) 모두에서 예시된다. 액체 배지(109)는 오가노이드(103)의 성장을 서포트하기 위한 적절한 성장 인자 및 보충제를 포함할 수 있다. 조작(320)은 하이드로겔(106)의 돔을 복수의 하이드로겔 단편(320) 또는 다른 액체 형태로 파괴하여 오가노이드(103)를 액체 배지(109) 중으로 방출하는 것을 포함한다.

본 개시는 하이드로겔 돔을 파괴하기 위한 자동화된 프로세스(320)를 제공한다. 종래 기술에서, 하이드로겔 돔의 파괴는 일반적으로 피펫을 사용하여 수동으로 수행하여, 돔을, 예를 들면, 약 20회 정도 랜덤으로 반복 주입/천공하여 파괴를 보조한다.

하이드로겔 돔을 파괴하는 자동화된 방법(320)이 제공되고, 이 방법은 초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 마이크로플레이트의 웰 내의 액체 배지에서 하이드로겔 돔 내의 제1 세포를 배양하여 다세포 표적 세포를 제공하는 단계; 초기 인큐베이션 기간 후에 액체 핸들러에 부속된 피펫 팁으로 웰 내의 돔의 x, y 중심 위치 또는 이의 부근에서 하이드로겔 돔을 천공하는 단계; 복수의 단계로 피펫 팁을 돔을 통해 이동시키는 단계로서, 각 단계는 하이드로겔 돔을 파괴하고 임의로 하이드로겔 돔을 액화하여 웰 내의 하이드로겔 돔으로부터 표적 세포를 해방하기 위해 웰 내의 X, Y 소정 위치를 포함하는, 단계를 포함한다. 이어서, 표적 세포를 단리할 수 있다. 자동화된 피펫 팁은 표적 세포를 배양한 후에 하이드로겔 돔의 중심 또는 이의 근처에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 제1 세포는 표적 세포 또는 줄기 세포일 수 있다. 액체 핸들러는 1개 이상, 2개 이상 또는 복수의 단계 각각에서 피펫을 흡인할 수 있다. 예를 들면, 피펫 팁은 하이드로겔 돔의 중심에 위치하거나, 하이드로겔 돔의 x, y 중심으로부터 0.1mm, 0.2mm, 0.3mm, 0.4mm, 0.5mm, 0.6mm, 0.7mm, 0.8mm, 0.9mm, 1.0mm, 1.1mm, 1.2mm, 1.3mm, 1.4mm, 1.5mm, 1.6mm, 1.7mm, 1.8mm, 1.9mm, 2.0mm 또는 0-2mm 또는 0.01-1.5mm 이내에 위치할 수 있다. 웰 내의 각 X, Y 소정 위치는 다음을 포함하여 계산할 수 있다:

X(단계 수) = X웰 중심 + 알파/단계 * 단계 수 * COS(세타/단계 * 단계 수); 및 Y(단계 수) = Y웰 중심 + 알파/단계 * 단계 수 * SIN(세타/단계 * 단계 수), 여기서 알파 = 돔 직경(mm)/1.8; 단계 수 = 하이드로겔 돔을 통해 피펫 팁을 이동시키는 단계 수; X웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 x 위치; Y웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 y 위치; 및 세타 = 5 내지 50의 상수 값. 일부 경우에, 단계 수는 2 내지 20, 3 내지 18, 4 내지 17, 5 내지 15, 6 내지 12 또는 8 내지 10의 정수이다. 일부 경우에, 세타는 5 내지 50, 10 내지 45, 15 내지 40, 15 내지 35 또는 이들 사이의 임의 수의 상수이다. 세타는 5, 10, 12, 13, 14, 15, 15.7, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50 또는 이들 사이의 임의 수로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 웰 내의 하이드로겔 돔의 x, y 중심 위치는 웰 내의 원래 시딩 위치, 웰에 침적된 하이드로겔의 용적 및/또는 하이드로겔 돔의 이미징에 기초하여 결정될 수 있다. 피펫 팁은 돔을 천공하거나 돔 내를 흡인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 피펫은 돔 내에 액체 또는 공기를 도포, 제거 또는 흡인하기 위해 사용될 수 있다. 시스템에 대한 입력에는 웰의 시딩 위치 x, y 좌표 및 공지된 돔의 용적이 포함될 수 있다. 또 다른 입력은 돔 피펫 천공 또는 피펫 흡인의 단계의 수일 수 있다. 돔의 직경은 용적에 기초하여 계산할 수 있다. 돔의 직경은 이미징에 의해 결정할 수 있다. 돔의 직경은 임의의 적절한 직경일 수 있다. 예를 들면, 돔의 직경은 1 내지 12mm, 2 내지 10mm, 3 내지 8mm 또는 3 내지 6mm일 수 있다. 단계 수는 임의의 적절한 수일 수 있다. 예를 들면, 단계 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 또는 2 내지 20, 3 내지 18, 4 내지 17, 5 내지 15, 6 내지 12 또는 8 내지 10일 수 있다. 도 7A에 예시된 바와 같이, 입력에는 하이드로겔 돔의 직경(이 경우 8mm), 단계 수 8, 및 웰 중심 위치 X, Y 좌표가 포함된다. 일부 경우에, 공정 시간을 최소화하기 위해, 단계/위치 수를 최소화하여 하이드로겔을 효과적으로 파괴할 수 있다. 출력은 액체 핸들러에 의해 피펫에 의한 돔 내의 천공/흡인 위치의 자동화된 순서/패턴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 천공/흡인 위치의 패턴은 나선형 패턴일 수 있다. 일부 실시형태에서, 천공/흡인 위치의 패턴은 성상 패턴이다. 일부 실시형태에서, 천공/흡인 위치의 패턴은 지그재그 패턴이다. 각 위치에서, 자동화된 피펫은 돔 내를 흡인할 수 있다. 피펫 팁은 단계/위치 사이에서 돔의 표면 하부에 드래그될 수 있다. 예를 들면, Z 축의 피펫 팁 위치는 단계/위치 사이에서 하이드로겔 돔의 표면 하부로 유지되어 돔을 효율적으로 파괴할 수 있다. 단계 사이에서, Z 축의 피펫 팁 위치는 하이드로겔 돔의 바닥 또는 이의 근처에서 유지될 수 있다. 예를 들면, 피펫 팁은 표면 하부, 표면의 0.5, 1.0, 1.5 또는 2mm 이내, Z 축의 중심 근처, 바닥 또는 단계 사이 또는 흡인하는 동안 돔 바닥의 0.5, 1.0, 1.5 또는 2mm 이내에서 유지될 수 있다. Z 축 위치는 하이드로겔 돔의 용적 또는 웰의 이미징에 의해 결정될 수 있다. 예시적 도 7B-7D는 웰 중심 위치, 8mm 돔 직경, 6 내지 13 단계의 입력을 사용하여 웰 내에서 자동화된 피펫터의 나선형 X, Y 좌표의 출력 시리즈를 나타내고, 15.7(도 7B-C) 또는 30(도 7D)의 세타를 사용하여 하이드로겔 돔의 효과적 파괴를 초래한다. 예를 들면, 고체 하이드로겔(106)은 액체로 변형되어 오가노이드(103)를 하이드로겔(106)로부터 분리할 수 있다. 하이드로겔은, 예를 들면, 인큐베이션 온도(약 37℃)로부터 약 4℃ 내지 약 10℃ 또는 약 10℃로의 온도 감소를 수반하거나 수반하지 않으면서, 예를 들면, 가혹한 피펫팅 또는 액체 핸들러의 전단력에 의해 액체로 변형될 수 있다. 오가노이드를 줄기 세포 및 복수의 추가 세포 유형으로 해리하기 위해, 해리 시약을 1차 웰(112)에 첨가할 수 있다. 해리된 오가노이드가 형성된 후, 마이크로채널(118)은, 예를 들면, 에어 갭을 제거함으로써 개방된다. 2차 웰을 통한 액체 흡인은 오가노이드가 파괴된 후에 수행된다. 줄기 세포는 2차 웰(115) 내의 1차 항체(Ab)에 의해 포획된다. 조작(330)은 바람직하지 않은 세포 및 잔해를 제거하기 위해 웰 유닛(100)을 세척하는 단계를 포함한다. 조작(340)은 단리된 줄기 세포를 2차 웰의 항체/세포 복합체로부터 해리하는 단계를 포함한다. 조작(350)은 단리된 줄기 세포를 신규 1차 웰(112) 내의 신규 하이드로겔 돔(106)에 재-시딩하는 단계를 포함한다.

대안적으로, 조작(310)에서, 2차 웰(115)은 비오틴 포획 시약 또는 아비딘 포획 시약과 같은 고정화된 포획 시약으로 코팅되거나 표면 관능화될 수 있다. 비오틴 고정화된 포획 시약과 관련하여, 320에서 오가노이드를 해리 시약으로 처리한 후, 해리된 오가노이드를 스트렙트아비딘(예를 들면, 항체-스트렙트아비딘 접합체)과 같이 포획 시약에 강력한 친화성을 갖는 시약에 결합된 관심 줄기 세포에 특이적인 항체로 용액에서 처리하여 줄기 세포-항체-스트렙트아비딘 복합체를 형성할 수 있다. 마이크로채널(118)은 제거가능한 배리어를 제거함으로써 개방되고, 줄기 세포-항체-스트렙트아비딘 복합체는 2차 웰(115) 내의 고정화된 비오틴에 결합하는 것이 가능해진다. 조작(330)에서 비결합된 세포 및 잔해를 세척한 후, 줄기 세포는 복합체로부터 해리시킬 수 있다. 잔여 조작(340 및 350)은 본원에 제공된 바와 같이 수행될 수 있다. 또는, 제거가능한 배리어를 제거하기 전에, 스트렙트아비딘에 접합된 줄기 세포-특이적 1차 항체를 포함하는 항체 접합체를 고정화된 비오틴 포획 시약에 결합시킬 수 있다.

줄기 세포 단리를 위한 항체로 관능화된 스캐폴드

일부 오가노이드 유형은 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방식으로 계대할 필요가 있다. 신규 오가노이드를 재-생성할 수 있는 목적하는 (성체) 줄기 세포를 포획하기 위한 추가 방법이 제공된다.

본 개시의 또 다른 실시형태는 단일 세포 계대를 사용하는 오가노이드 계대 방법을 제공하고, 모든 배양 사이클의 말기에 세척 프로세스 중에 특정 줄기 세포를 포획하기 위해 고정화된 항체로 코팅되거나 표면 관능화된 스캐폴드를 포함하는 2차 웰을 갖는다.

도 4는 목적 줄기 세포를 단리하여 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방법으로 계대하는 예시적 방법을 도시한다. 조작(410)은, 1차 웰과 2차 웰 사이에 폐쇄된 마이크로채널(118)과 함께, 1차 웰(112)의 바닥 표면에 배치된 하이드로겔 돔(106) 내에 오가노이드(예를 들면, 장 오가노이드)를 함유하는 1차 웰(112), 및 줄기 세포(예를 들면, Lgr5+)에 특이적인 1차 항체(Ab)로 코팅 또는 표면 관능화된 다공성 스캐폴드를 갖는 2차 웰(115)를 포함한다. 액체 배지(109)는 또한 웰 유닛(100)의 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115) 모두에서 예시된다. 액체 배지(109)는 오가노이드(103)의 성장을 서포트하기 위한 적절한 성장 인자 및 보충제를 포함할 수 있다.

조작(420)은 하이드로겔(106)의 돔을 복수의 하이드로겔 단편(320) 또는 다른 액체 형태로 파괴하여 오가노이드(103)를 액체 배지(109) 내로 방출하는 것을 포함한다. 예를 들면, 고체 하이드로겔(106)은 액체로 변형되어 오가노이드(103)를 하이드로겔(106)로부터 분리할 수 있다. 하이드로겔은, 예를 들면, 인큐베이션 온도(약 37℃)로부터 약 4℃ 내지 약 10℃ 또는 약 10℃로의 온도 감소를 수반하거나 수반하지 않으면서, 가혹한 피펫팅 또는 액체 핸들러의 전단력에 의해 액체로 변형될 수 있다. 오가노이드를 줄기 세포 및 복수의 추가 세포 유형으로 해리시키기 위해, 해리 시약이 1차 웰(112)에 첨가된다. 해리된 오가노이드가 형성된 후, 예를 들면, 에어 갭을 제거함으로써 마이크로채널(118)이 개방된다. 2차 웰을 통한 액체 흡인은 오가노이드가 파괴된 후에 수행된다. 줄기 세포는 2차 웰(115) 내의 1차 항체(Ab)에 의해 포획될 수 있다.

조작(430)은 바람직하지 않은 세포 및 잔해를 제거하기 위해 웰 유닛(100)을 세척하는 단계를 포함한다. 조작(440)은 단리된 줄기 세포를 2차 웰의 항체/세포 복합체로부터 해리하는 단계를 포함한다. 조작(450)은 단리된 줄기 세포를 신규 1차 웰(112) 내의 신규 하이드로겔 돔(106)에 재-시딩하는 단계를 포함한다.

줄기 세포 단리를 위한 자기 비드

일부 오가노이드 유형은 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방식으로 계대할 필요가 있다. 줄기 세포에 특이적인 항체로 코팅된 자기 비드는 오가노이드를 파괴한 후에 1차 웰에 첨가하여, 신규 오가노이드를 재-생성할 수 있도록 목적하는 (성체) 줄기 세포를 포획할 수 있다.

세척 조작 중에 1차 웰 하부에 자석을 배치하여 1차 웰 내에 (성체) 줄기 세포를 유지한다. 항체 결합은, 예를 들면, 트립신과 같은 효소적 수단 또는 효소에 의해 소화될 수 있는 링커를 추가하는 등의 몇몇 방법으로 파괴할 수 있다.

도 5는 목적 줄기 세포를 단리하여 오가노이드를 단일 세포 수준으로 파괴하는 방법으로 계대하는 예시적 방법을 도시한다. 조작(510)은 1차 웰(112)의 바닥 표면에 배치된 하이드로겔 돔(106) 내에 오가노이드(103)(예를 들면, 장 오가노이드)를 포함하는 1차 웰(112)을, 1차 웰과 2차 웰 사이에 폐쇄된 마이크로채널(118)과 함께, 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛에서 오가노이드를 배양하는 것을 포함한다. 액체 배지(109)는 또한 웰 유닛(100)의 1차 웰 섹션(112) 및 2차 웰 섹션(115) 모두에 예시되어 있다. 액체 배지(109)는 오가노이드(103)의 성장을 서포트하기 위해 적절한 성장 인자 및 보충제를 포함할 수 있다.

조작(520)은 하이드로겔(106)의 돔을 복수의 하이드로겔 단편(320) 또는 다른 액체 형태로 파괴하여 오가노이드(103)를 액체 배지(109) 내로 방출하는 것을 포함한다. 예를 들면, 하이드로겔(106)은 액체로 변형되어 오가노이드(103)를 하이드로겔(106)로부터 분리할 수 있다. 하이드로겔은, 예를 들면, 인큐베이션 온도(약 37℃)로부터 약 4℃ 내지 약 10℃ 또는 약 10℃로의 온도 감소를 수반하거나 수반하지 않으면서, 액체 핸들러의 전단력 또는 가혹한 피펫팅에 의해 액체로 변형될 수 있다. 오가노이드를 줄기 세포 및 복수의 추가 세포 유형으로 해리시키기 위해, 해리 시약이 1차 웰(112)에 첨가된다.

조작(530)은 줄기 세포 마커에 특이적인 자기 비드 표지된 항체를 첨가하는 단계를 포함한다. 조작(540)은 항체로 코팅된 자기 비드를 해리된 오가노이드와 인큐베이팅하여 목적 줄기 세포의 결합을 가능하게 하는 단계를 포함한다. 조작(550)은 1차 웰의 바닥에 자석을 적용하고, 마이크로채널(118)을 개방하고, 예를 들면, 액체 핸들러로 액체 배지를 흡인함으로써 2차 웰을 통해 비결합된 세포 및 잔해를 세척하는 단계를 포함한다. 임의로, 조작(550)은 세척된 포획 세포를 신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛으로 이송하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 이는 포획된 세포를 신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛으로 이송할 수 있도록 자석을 제거하는 것을 포함한다. 조작(560)을 속행하기 전에, 자석을 신규 웰 유닛 하부에 재적용해야 한다. 조작(560)은 줄기 세포와 자기 비드가 하이드로겔에 매립되도록 1차 웰에 신규 하이드로겔을 첨가하고, 1차 웰 하부로부터 자석을 제거하는 단계를 포함한다. 조작(580)은 1차 웰의 상부에 자석을 배치하여 하이드로겔 내의 줄기 세포를 부유시키는 단계를 포함한다.

독성학 연구를 위한 종양체 및 오가노이드의 면역-요법

CAR T-세포 및 기타 세포 요법은 암 치료에 유익할 수 있다. 이주, 조직 침윤 및 종양 특이적 세포 사멸을 평가할 수 있다. 이 검정은 면역 요법의 평가에 유익할 수 있는 몇몇 판독 값을 포함한다.

본 개시의 또 다른 실시형태는 오가노이드/종양체 배양 방법 및 섬유아세포, 마크로파지 또는 기타 세포가 마이크로채널을 통해 주요 오가노이드 돔으로 이주하는 방법을 관찰하는 방법이다. 이러한 세포의 효과는 오가노이드/종양체의 표현형 변화를 관찰함으로써 평가할 수 있다.

도 6A 및 도 6B는 단일 분리 웰 마이크로플레이트에서 세포(예를 들면, 림프구) 기능 및 독성학 연구를 평가하는 방법을 예시한다. 도 6A는 분리 웰 마이크로플레이트의 마이크로웰 유닛의 1차 웰(112)의 액체 배지(109) 중의 하이드로겔 돔(106) 내의 다세포 표적 세포(예를 들면, 오가노이드)를 포함하는 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛(100)의 도면을 도시한다. 2차 웰(115)은 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T 세포), CAR 천연 킬러 세포(CAR-NK 세포) 또는 기타 림프구를 포함한다. 마이크로채널(118)은 5 마이크론의 채널 크기를 가질 수 있고, 림프구는 7 내지 10 마이크론의 크기를 가질 수 있다. 오가노이드는 마이크로채널 크기에 따라 1차 챔버로 면역 세포의 이주를 유발할 수 있는 주화인자를 방출할 수 있다. 도 6B는 분리 웰 마이크로플레이트의 경사 효과를 도시하고, 여기서 경사 위치는 1차 웰(112)로 면역 세포의 이주를 손상시키기 위해 사용될 수 있다.

추가 검정

상기 기재된 검정 외에도, 분리 웰 마이크로플레이트의 구조는 세포 검정 개발과 세포 검정의 복잡성 증가에 대해 적어도 2개의 주요 이점을 제공한다.

제1 주요 이점은 웰 유닛의 1차 웰과 2차 웰 사이에서 세포 이동 또는 이주가 가능하다는 점이다. 이동 또는 확장을 위한 거리가 짧고, 1차 웰과 2차 웰을 효율적으로 분리할 수 있다. 분리 웰 마이크로플레이트에는 매트릭스 또는 강제 액체 유동이 포함될 필요가 없다.

다수의 응용 방법이 이러한 이점을 예시한다. 혈관신생 연구를 위해, 종양 미세-조직 또는 성장 인자는 웰 유닛의 1개 웰에 존재하고, 내피 세포의 층은 웰 유닛의 다른 웰에 존재할 것이다. 내피 세포는 제1 챔버로 이주할 수 있는 능력을 갖고, 혈관신생 돌기를 형성할 수 있다.

신경발생-신경-재생을 연구하기 위해, 성장 인자 또는 신경독성 물질이 신경돌기 성장에 미치는 영향을 개발할 수 있다. 뉴런은 1개 챔버에 배치되고, 해당 챔버에 존재하는 성장 인자에 따라 제2 챔버로 확장된다. 이 프로세스는 치료제에 따라 달라진다. 이점은 소정 방향으로의 성장을 연구할 수 있다는 것이다.

종양 세포의 회피/침윤, 이주, 창상 치유를 연구하기 위해, 정상 또는 종양 세포가 상이한 챔버로 이동하는 것을 연구할 수 있다. 이주된 세포는 종래의 세포 이주 검정과 비교하여 세포 유닛의 상이한 세포에서 더 용이하고 정확하게 계수할 수 있다.

T 세포 침윤 또는 단핵구 이주를 연구하기 위해, 면역 세포를 챔버에 배치하고, 미세-조직의 주화인자는 제2 챔버에 배치할 수 있다. 면역 세포는 주화성에 따라 다른 챔버로 이동한다.

분리 웰 마이크로플레이트 구조의 제2 주요 이점은 상이한 세포 유형과 미세-조직의 공-배양을 수행하고 크로스-토크를 연구할 수 있다는 것이다. 이 모델에서, 상이한 조직을 대표하는 세포는 웰 유닛의 상이한 웰에서 분리되는 반면, 마이크로플레이트는 웰 유닛의 1차 웰과 2차 웰 사이에서 배지 교환을 가능하게 하고, 따라서 첨가된 화합물 및 분비된 인자의 효과를 연구할 수 있다. 예를 들면, 간 세포는 심장 세포에 영향을 미칠 수 있는 인자를 분비할 수 있다. 내피 세포는 염증에 반응하여 면역 세포를 유인하는 사이토카인을 분비하거나, 간 세포 또는 신경 세포(간 경변증(liver cirrhosis), 뇌졸중(stroke) 모델)의 손상을 유발할 수 있다. 몇몇 기타 용도에는 간-뇌, 간-심장, 신장-간, 장-간 등과 같은 기관 조직 쌍에 대한 다중-조직 독성 평가 등이 포함될 수 있다. 화합물, 독소, 성장 인자, 염증, 대사 스위칭에 반응하는 줄기 세포의 분화 및 자가-재생을 연구할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분비된 인자 단독 또는 세포의 이동의 평가는 세포의 이주를 가능하게 하는 수평 슬릿 구성 또는 공급 및 배지-성장 인자 교환을 위한 수직의 더 넓은 슬릿 구성을 사용함으로써 적용할 수 있다.

Claims

표적 세포(target cell)를 공-배양(co-culturing)하는 방법으로서, 상기 방법은
분리 웰 마이크로플레이트(separation well microplate)의 웰 유닛(well unit)의 1차 웰에 하나 이상의 표적 세포를 도입하고, 초기에 혼합 없이 액체 배지에서 배양하여 표적 세포를 1차 웰의 바닥에 부착시키는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어(removable barrier)를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널(closed microchannel)에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되는, 단계;
하나 이상의 피더(feeder) 세포를 2차 웰에 도입하고, 초기에 혼합 없이 액체 배지에서 배양하여 피더 세포를 2차 웰의 바닥에 부착시키는 단계;
제거가능한 배리어를 제거하여 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하는 단계;
분리 웰 마이크로플레이트를 락킹(rocking)시켜 개방 마이크로채널을 통한 중력 유동에 의해 1차 웰과 2차 웰 사이의 혼합 및 배지 교환(medium exchange)을 가능하게 하는 단계;
1차 웰로부터 표적 세포를 분리하는 단계; 및
분리된 표적 세포를 개방 마이크로채널로부터 멀리 떨어진 1차 웰에 침강(settling)시키는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
분리된 표적 세포를 혼합하고, 분리된 표적 세포를 개방 마이크로채널로부터 멀리 떨어진 1차 웰에서 추가로 침강시키는 단계;
침강된 표적 세포를 세척하는 단계; 및
액체 핸들러(liquid handler)를 통해 세척된 표적 세포를 수집하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1차 웰에 하나 이상의 표적 세포를 도입하는 단계 및 2차 웰에 하나 이상의 피더 세포를 도입하는 단계가 동시에 또는 본질적으로 동시에 수행되는, 방법.
제3항에 있어서, 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널이, 임의로 적어도 일부의 초기 인큐베이션 기간 동안, 마이크로채널의 내부 또는 이에 인접하여, 에어 갭(airgap), 하이드로겔 씰(hydrogel seal) 또는 실리콘 씰을 포함하는 제거가능한 배리어에 의해 폐쇄되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 제거가능한 배리어가 에어 갭을 포함하고, 상기 제거가능한 배리어의 제거가 초기 인큐베이션 기간의 적어도 일부 후에 에어 갭을 제거하는 것을 포함하고, 임의로 피펫을 펌프로서 사용하여 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리가 피더 세포를 분리하지 않으면서 표적 세포를 분리하기 위해 표적 세포를 해리 시약(dissociation reagent)에 노출시키는 것을 포함하고, 임의로 상기 해리 시약이 EDTA를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 해리 시약이 생리학적 완충액 중의 분리 효소를 포함하고; 임의로, 상기 분리 효소가 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 카탈라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 디스파제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 줄기 세포 또는 오가노이드(organoid)인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피더 세포가 섬유아세포인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 액체 배지 중의 웰 유닛의 1차 웰에 배치된 하이드로겔 돔(dome)에 매립(embedding)되고, 임의로, 상기 방법이 표적 세포의 분리 전에 하이드로겔 돔을 파괴하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널이 웰 유닛의 바닥 표면과 1차 웰 및 2차 웰의 공유 측벽의 바닥 부분의 사이에 위치하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 마이크로채널의 높이가 약 10 마이크론 내지 약 100 마이크론 또는 약 10 마이크론 내지 약 75마이크론의 범위이고; 임의로, 상기 마이크로채널의 폭이 약 150 내지 약 500 마이크론, 약 200 내지 약 400 마이크론 또는 약 300 마이크론의 범위인, 방법.
단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 시간 경과에 따른 동태 측정(kinetic measurement)을 포함하는 배양된 표적 세포로부터 분비된 인자를 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은
초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 액체 배지 중의 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 표적 세포를 배양하는 단계로서, 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 고정화된 포획 시약(immobilized capture reagent)을 포함하는, 단계;
제거가능한 배리어를 제거하여 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하여, 초기 인큐베이션 기간 후에 개방 마이크로채널을 통해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자의 확산을 가능하게 하는 단계;
분비된 인자가 고정화된 포획 시약에 의해 포획되도록 하는 단계;
포획된 분비 인자에 특이적인 표지된 2차 항체 또는 고정화된 포획 시약을 제1 시점에서 첨가하여 제1 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및
제1 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더(reader)로 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 포획된 분비 인자, 아비딘 및 비오틴에 특이적인 1차 항체로부터 선택되는, 방법.
제14항에 있어서,
제거가능한 배리어를 제거하기 전에 아비딘 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제1 항체 접합체를 첨가하는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 비오틴에 접합된 분비 인자-특이적 1차 항체를 포함하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제14항에 있어서,
제거가능한 배리어를 제거하기 전에 비오틴 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제2 항체 접합체를 첨가하는 단계로서, 상기 제2 항체 접합체는 아비딘에 접합된 분비된 인자-특이적 1차 항체를 포함하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
포획된 분비 인자, 고정화된 포획 시약 또는 1차 항체에 특이적인 표지된 2차 항체를 제2 시점에서 첨가하여 제2 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및
제2 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더로 정량화하는 단계
를 추가로 포함하고;
임의로,
포획된 분비 인자, 고정화된 포획 시약 또는 1차 항체에 특이적인 표지된 2차 항체를 제3 시점에서 첨가하여 제3 표지된 복합체를 형성하는 단계; 및
제3 표지된 복합체를 마이크로플레이트 리더로 검출하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정량화가 플레이트 리더와 동종의 이미징(imaging)에 의한 다중 검출(multiplexed detection)을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비된 인자의 확산이 분리 웰 마이크로플레이트를 락킹시켜 개방 마이크로채널을 통한 중력 유동에 의해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 분비된 인자의 확산을 가능하게 하는 것을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 다세포 표적 세포이고; 임의로 오가노이드 및 종양체(tumoroid)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 표적 조직, 환자로부터의 생검 샘플(biopsy sample), 줄기 세포, 종양체 단편 또는 오가노이드 단편으로부터 유래되는, 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 배양된 오가노이드가 웰 유닛의 1차 웰 내의 액체 배지 중의 하이드로겔 돔 내에 매립되는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 제거가능한 배리어가 에어 갭, 하이드로겔 씰 또는 실리콘 씰을 포함하고; 임의로, 상기 제거가능한 배리어가 마이크로채널 내부 또는 이에 인접하여 위치되는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 제거가능한 배리어의 제거가 에어 갭을 제거하는 것을 포함하고; 임의로, 피펫을 펌프로서 사용하여 1차 웰과 2차 웰 사이에서 액체 배지 교환을 강제하는 것을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 2차 웰의 바닥에 고정화되는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 복수의 분비된 인자에 특이적인 복수의 1차 항체를 포함하고, 상기 1차 항체는 검출 어레이의 2차 웰의 바닥에 배열(arranging)되는, 방법.
제13항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비된 인자가 호르몬, 항체, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 배양된 다세포(multicellular) 표적 세포 배양물로부터 단일 세포 유형을 단리하는 방법으로서, 상기 방법은
초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 액체 배지 중의 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 고정화된 포획 시약으로 관능화된(functionalized) 표면을 포함하는, 단계;
1차 웰에서 다세포 표적 세포를 해리시켜 단일 세포 유형 및 관심 없는 세포를 포함하는 개별 세포의 혼합물을 형성하는 단계;
제거가능한 배리어를 제거하여 마이크로채널을 개방하여, 개별 세포의 혼합물이 개방 마이크로채널을 통해 2차 웰로 이동하도록 하고, 단일 세포 유형이 2차 웰에서 고정화된 포획 시약과 회합하여 고정화된 복합체를 형성하도록 하는 단계;
1차 웰과 2차 웰을 세척하여 관심 없는 비결합된 세포를 제거하는 단계; 및
고정화된 복합체를 해리하는 것을 포함하는 단일 세포 유형을 단리하는 단계
를 포함하는, 방법.
제28항에 있어서,
분리 웰 마이크로플레이트의 1차 웰에서 단리된 단일 세포 유형을 재-시딩(reseeding)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 단일 세포 유형이 줄기 세포인, 방법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 오가노이드인, 방법.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 2차 웰의 바닥에 또는 2차 웰 내의 스캐폴드(scaffold) 상에 배치되는, 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 단일 세포 유형의 표면 마커, 아비딘 및 비오틴에 특이적인 1차 항체로부터 선택되는, 방법.
제33항에 있어서,
제거가능한 배리어를 제거하기 전에 아비딘 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제1 항체 접합체를 첨가하는 단계로서, 상기 제1 항체 접합체는 비오틴에 접합된 단일 세포 유형 표면 마커-특이적 1차 항체를 포함하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제33항에 있어서,
제거가능한 배리어를 제거하기 전에 비오틴 고정화된 포획 시약을 갖는 2차 웰에 제2 항체 접합체를 첨가하는 단계로서, 상기 제2 항체 접합체는 아비딘에 접합된 단일 세포 유형 표면 마커-특이적 1차 항체를 포함하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 1차 웰 내의 액체 배지 중의 하이드로겔 돔에서 배양되고, 임의로, 상기 방법이 다세포 표적 세포의 해리 전에 하이드로겔 돔을 파괴하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
단일 분리 웰 마이크로플레이트 내에서 다세포 표적 세포 배양물로부터 줄기 세포를 단리하는 방법으로서, 상기 방법은
초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰 내의 액체 배지 중의 제1 하이드로겔 돔에서 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되는, 단계;
제1 하이드로겔 돔을 파괴하는 단계;
1차 웰에서 다세포 표적 세포를 해리시켜 줄기 세포 및 관심 없는 세포를 포함하는 개별 세포의 혼합물을 형성하는 단계;
줄기 세포에 특이적인 고정화된 포획 시약을 포함하는 자기 비드(magnetic bead)를 1차 웰에 첨가하고, 추가로 인큐베이팅하여 자기 비드를 줄기 세포에 결합시키는 단계;
1차 웰의 하부에 자석을 적용하여 자기 비드-줄기 세포 복합체를 유지하는 단계;
제거가능한 배리어를 제거하여 마이크로채널을 개방하고, 2차 웰을 통해 액체 배지를 흡인함으로써 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체를 세척하여 관심 없는 비결합된 세포를 제거하는 단계;
제2 하이드로겔 돔을 1차 웰 내의 세척 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체에 첨가하는 단계;
1차 웰 하부로부터 자석을 제거하는 단계;
자기 비드로부터 줄기 세포를 해리시키는 단계; 및
1차 웰 상부에 자석을 적용하여 자기 비드를 부유(levitating)시키고, 제2 하이드로겔 돔 중의 줄기 세포를 단리하는 단계
를 포함하는, 방법.
제37항에 있어서,
제거가능한 배리어를 제거하여 마이크로채널을 개방하고, 2차 웰을 통해 액체 배지를 흡인함으로써 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체를 세척하여 관심 없는 비결합된 세포를 제거하는 단계가
1차 웰의 하부로부터 자석을 제거하는 단계;
세척 유지된 자기 비드-줄기 세포 복합체를 신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛 중의 신규 1차 웰로 이송시키는 단계; 및
신규 분리 웰 마이크로플레이트의 신규 웰 유닛 중의 신규 1차 웰의 하부에 자석을 재적용(reapplying)하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 고정화된 포획 시약이 줄기 세포의 표면 마커, 아비딘 및 비오틴에 특이적인 1차 항체로부터 선택되는, 방법.
이를 필요로 하는 대상체(subject)의 암 치료를 위한 요법을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은
초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 액체 배지 중의 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰에서 대상체로부터 유래된 다세포 표적 세포를 배양하는 단계로서, 상기 1차 웰은 제거가능한 배리어를 포함하는 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널에 의해 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 2차 웰로부터 분리되고, 상기 2차 웰은 후보 암 치료 면역 세포, 모노클로날 항체, 면역 시스템 조절인자 또는 항암제를 포함하는, 단계;
제거가능한 배리어를 제거하여 적어도 하나의 폐쇄된 마이크로채널을 개방하여, 제2 인큐베이션 기간에 걸쳐 개방 마이크로채널을 통해 1차 웰과 2차 웰 사이에서 확산을 가능하게 하는 단계;
제2 인큐베이션 기간 후에 2차 웰 및 임의로 1차 웰을 이미징하여 세포 이주 또는 다세포 표적 세포 성장을 정량화하는 단계; 및
다세포 표적 세포를 포함하지 않는 대조군 웰 유닛과 비교하여, 2차 웰 내 또는 2차 웰과 1차 웰 사이의 면역 세포 이주(migration)의 증가, 또는
후보 치료제를 포함하지 않는 대조군 웰 유닛과 비교하여, 1차 웰에서 다세포 표적 세포 성장의 감소에 기반하여,
후보 요법을 선택하는 단계
를 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 액체 배지 중의 웰 유닛의 1차 웰에 배치된 하이드로겔 돔에 매립되고, 임의로, 상기 방법이 제거가능한 배리어를 제거하기 전에 하이드로겔 돔을 파괴하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 대상체로부터의 생검 샘플 또는 종양체 단편으로부터 유래되는, 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 CAR T-세포인, 방법.
하이드로겔 돔을 파괴하는 자동화된 방법으로서, 상기 방법은
초기 인큐베이션 기간에 걸쳐 마이크로플레이트 웰의 액체 배지 중에서 하이드로겔 돔 내의 제1 세포를 배양하여 다세포 표적 세포를 제공하는 단계;
초기 인큐베이션 기간의 후에 액체 핸들러에 부속된 피펫 팁으로 웰 내의 돔의 x, y 중심 위치 또는 이의 부근에서 하이드로겔 돔을 천공하는 단계;
복수의 단계로 돔을 통해 피펫 팁을 이동시켜 하이드로겔 돔으로부터 표적 세포를 방출하는 단계로서, 각 단계는 웰 내의 X, Y 소정 위치를 포함하여 하이드로겔 돔을 파괴하고 임의로 하이드로겔 돔을 액화하는 단계; 및
임의로, 웰로부터 하나 이상의 표적 세포를 단리하는 단계
를 포함하는, 방법.
제44항에 있어서, 상기 액체 핸들러가 하이드로겔 돔 내에서 피펫 팁을 1개 이상, 2개 이상, 복수의 위치 또는 각각의 소정 위치에서 흡인하는, 방법.
제44항 또는 제45항에 있어서, 웰 내의 각각의 X, Y 소정 위치가 하기를 포함하여 계산되는, 방법:
X(단계 수) = X웰 중심 + 알파/단계*단계 수*COS(세타/단계*단계 수); 및
Y(단계 수) = Y웰 중심 + 알파/단계*단계 수*SIN(세타/단계*단계 수),
여기서,
알파 = 돔 직경(mm)/1.8;
단계 = 하이드로겔 돔을 통해 피펫 팁을 이동하는 단계의 수, 임의로 2 내지 20의 정수;
X웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 x 위치;
Y웰 중심 = 웰 내의 돔 중심의 y 위치; 및
세타 = 5 내지 50의 상수 값.
제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웰이 분리 웰 마이크로플레이트의 웰 유닛의 1차 웰인, 방법.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 돔의 x, y 중심 위치가 웰 내의 원래 시딩 위치 및 웰 내의 하이드로겔 돔의 이미징으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터에 의해 결정되는, 방법.
제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 돔의 직경이 웰에 침적된 하이드로겔의 용적 또는 웰 내의 하이드로겔 돔의 이미징에 의해 결정되는, 방법.
제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 수가 2 내지 20, 3 내지 18, 4 내지 17, 5 내지 15, 6 내지 12 또는 8 내지 10 단계로부터 선택되는, 방법.
제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소정 위치가 하이드로겔 돔 내부 및/또는 이를 통해 나선형 패턴, 성상 패턴(star pattern) 및 지그재그 패턴(zig-zag pattern)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 패턴을 형성하는, 방법.
제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피펫 팁이 각 위치 사이에서 하이드로겔 돔의 표면 하부로 드래그(drag)되는, 방법.
제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피펫 팁이 각 위치 사이에서 하이드로겔 돔의 표면 상부로 리프팅(lifting)되는, 방법.
제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다세포 표적 세포가 구상체, 종양체 및 오가노이드의 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
단리하기 전에 다세포 표적 세포를 해리하여 개별 표적 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.