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KR20240155220A - 청력 상실을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

청력 상실을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20240155220A
KR20240155220A KR1020247028166A KR20247028166A KR20240155220A KR 20240155220 A KR20240155220 A KR 20240155220A KR 1020247028166 A KR1020247028166 A KR 1020247028166A KR 20247028166 A KR20247028166 A KR 20247028166A KR 20240155220 A KR20240155220 A KR 20240155220A
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KR
South Korea
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cells
population
cell
culture medium
cell culture
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Pending
Application number
KR1020247028166A
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올가 미즈라히
라미 스칼리터
프랑수아 비네트
니만 다나 하윤
오퍼 와이저
릴라흐 알론
Original Assignee
리니지 셀 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 리니지 셀 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 리니지 셀 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

미분화된 줄기 세포를 귀의 감각 세포로 기능할 수 있는 세포로 세포 분화를 유도하는 방법, 및 대상체의 청각 상태를 치료하기 위한 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.

Description

청력 상실을 치료하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 2022년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 63/315,830 및 2022년 3월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 63/322,110에 대한 우선권 및 이익을 주장한다. 앞서 언급한 특허 출원 각각의 내용은 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 다능성 줄기 세포를 귀의 청각 세포로 기능할 수 있는 세포로 세포 분화를 유도하기 위한 조성물 및 방법, 및 대상체의 청각 상태를 치료하기 위해 이러한 청각 세포를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
산업화된 국가 인구의 5% 이상이 언어 이해에 대한 보통의 어려움부터 심각한 청각 장애까지 심각도 범위에서 심각한 난청 또는 청력 상실 상태를 가지고 있다. 청력 상실은 연령과 관련이 있는데, 45세 미만 인구의 약 4%, 65세 이상 인구의 약 34%가 청력 상실을 겪고 있다. 대부분의 경우 원인은 유모 세포 및 관련 나선형 신경절 뉴런의 퇴화 및 사멸과 관련이 있다.
귀는 4개의 주요 부분, 즉 외이, 중이, 내이 및 뇌의 청각 중추로의 전달 경로로 구성된다. 내이는 중이와 소통하는 유체를 함유하는 매우 조밀한 뼈로 구성된 캡슐이다. 중이 내의 작은 뼈(추골, 침골, 등골)는 고막에서 내이 달팽이관 입구에 있는 난원창으로 소리 에너지를 전달한다. 난원창에 있는 등골의 작용으로 달팽이관 내의 유체에 압력이 가해진다. 압력은 달팽이관을 통해 전달되어 궁극적으로 두 번째 창, 즉 와우창이 진동하게 된다. 달팽이관의 유체로 채워진 공간을 정의하는 기저막은 진동을 코르티 기관으로 전달한다. 유모 세포는 내이의 상피 내벽(즉, 코르티의 달팽이관)뿐만 아니라 낭상 황반, 난형낭 황반, 미로의 세 반고리관의 크리스태의 전정 감각 상피에도 위치한다. 달팽이관 유모 세포는 달팽이관 나선형 신경절에 신호를 보내고, 클러스링된 뉴런성 세포체는 이러한 신호를 뇌간의 달팽이관 핵에 전달한다.
기계감각 감각 유모세포는 청각 및 균형감각의 기초이다. 내이는 약 13,000-15,000개의 달팽이관과 거의 동일한 수의 전정 감각 유모 세포를 보유하며, 이는 청력 및 균형 감각을 담당하는 기계수용체이다. 유모 세포의 부족으로 인해 유모 세포에 대한 분자 연구는 제한되어 있으며 결과적으로 유모 세포 기능의 분자 기반은 알려져 있지 않다. 유모세포는 부족한 것 외에도 기계적, 화학적 손상에도 민감하다. 청각적 과잉자극, 화학요법, 아미노글리코사이드 약물 부작용, 노화의 영향, 점점 더 시끄러워지는 환경은 시간이 지남에 따라 청력이 악화되는 원인이 된다. 그 결과, 전 세계적으로 수억 명의 환자가 청력 상실과 균형 문제로 인해 영구적으로 쇠약해지고 있다. 이러한 만성 장애가 지속되는 주된 이유는 포유류 달팽이관 유모 세포가 자발적으로 재생되지 않고 전정계에서 관찰되는 제한된 재생이 기능을 회복하기에 부적절하다는 사실이다.
청각신경병증은 내이가 소리를 성공적으로 감지하지만 귀에서 뇌로 신호를 전달하는 데 문제가 있는 청력 장애이다. 현재의 최신 의학 지식은 청각 신경병증이 청력 손상 및 난청에 상당한 역할을 한다는 것을 암시한다. 청력은 공기 중의 음파를 전기 신호로 변경하는 일련의 복잡한 단계에 의존한다. 청각 신경은 이러한 신호를 뇌로 전달한다. 외유모세포는 중이에서 내이로 들어오는 소리 진동을 증폭시키는 데 도움을 준다. 청력이 정상적으로 작동할 때 내유모세포는 이러한 진동을 전기 신호로 변환하여 뇌에 신경 자극으로 전달하고, 뇌는 이 자극을 소리로 해석한다. 청각 신경병증은 다음을 포함한 여러 요인에 의해 발생할 수 있다: (i) 내이의 특수 감각 세포인 내부 유모세포에서 소리 정보를 뇌로 전달하는 청각 뉴런의 손상; (ii) 내유모 세포 자체의 손상; (iii) 유전적 유전자에 돌연변이가 있거나 청각 시스템에 손상이 생겨 내유모세포와 내이에서 뇌로 이어지는 청신경 사이의 연결에 결함 발생; 또는 (iv) 청각 신경 자체의 손상. 연구자들은 청각 신경병증의 영향을 받는 사람들을 위한 효과적인 치료법을 여전히 찾고 있다.
인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)와 같은 인간 다능성 줄기 세포를 청력 상실 치료를 위한 세포 치료에 사용할 수 있는 귀의 감각 세포로 분화하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었다. 이러한 방법은 귀의 감각 세포를 생성하는 데 성공했지만 기존 프로토콜을 이러한 감각 세포의 임상 상업적 규모 생산 공정으로 변환하는 것과 관련된 품질, 확장성 및 제품 비용과 관련하여 과제가 남아 있다.
따라서, 다능성 줄기 세포를 귀의 감각 세포 집단으로 분화시키기 위한 개선된 방법, 및 이들 분화된 다능성 줄기를 포함하는 조성물이 필요하다. 이러한 방법은 청각 상태의 치료를 위해 원하는 감각 세포 품질 특성을 갖는 표적 감각 세포 및 이의 약제학적 제형을 일관되고 재현가능하게 생산하면서 세포 치료법 적용을 위해 충분한 양의 귀 감각 세포를 생산할 수 있도록 쉽게 확장가능해야 한다.
본 개시내용은 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 적어도 100,000개 세포의 집단을 포함한다. 일부 세포 집단은 100,000개에서 1,000만 개의 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적상 허용되는 담체를 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이하가 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이하가 Myo7A를 발현한다. 본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 CD133을 발현한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 30% 이상의 세포가 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고; (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고; (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고; (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및 (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 약 30% 내지 95%가 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 약 10% 내지 60%가 β 튜불린 III을 발현하고; (c) 집단 내 세포의 약 5% 내지 70%가 TrkB를 발현하고; (d) 집단 내 세포의 0 내지 약 1%가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 약 30% 내지 95%가 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 약 5% 내지 95%가 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0 내지 약 30%가 Myo7A를 발현한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, 청각 세포 집단은 비-뉴런성 외배엽(NNE, non-neuronal ectoderm) 세포, 전-기원판 외배엽(PPE, pre-placodal ectoderm) 세포, 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP, otic neuronal progenitor) 세포, 중기 ONP 세포, 후기 ONP 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현양태에서, 청각 세포 집단은 귀의 감각 세포 집단을 포함한다. 일부 구현양태에서, 감각 세포 집단은 유모 세포, 지지 세포, 귀 뉴런성 전구체 세포 및 감각 뉴런성 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, 조성물은 동결보존 배지를 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 일부 구현양태에서, 조성물은 세포 집합체, 단일 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포로부터 유래된 청각 세포 집단을 수득하는 방법이 제공된다.
본 개시내용은 미분화 다능성 줄기 세포로부터 유래된 청각 세포 집단을 수득하는 방법을 제공하며, 이는 a) 다능성 줄기 세포의 배양물을 수득하는 단계; b) 다능성 세포의 비-뉴런성 외배엽 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에서 제1 기간 동안 다능성 세포를 배양하는 단계; 및 c) 비-뉴런성 외배엽 세포를 청각 세포로 분화시키기에 충분한 배양 조건 하에서 b)로부터의 비-뉴런성 외배엽 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 청각 세포 집단을 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 골형성 단백질 4(BMP4), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 4-[4-(2H-1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542)를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (b) SB431542, FGF2 및 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP-2) 및 4-{6-[4-(피페라진-1-일)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일}퀴놀린(LDN193189)을 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 단계 (a)에서 생산된 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 1-9일 동안 배양하여 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H)-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노)니코티노니트릴(CHIR99021), FGF2 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1)을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 단계 (b)에서 생산된 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 5-9일 동안 배양하여 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 소닉 헤지호그(SHH), 레티노산(RA), 표피 성장 인자(EGF), FGF2 및 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 단계 (c)에서 생성된 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 5-9일 동안 배양하여 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (e) 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT3) 및 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 단계 (d)에서 생성된 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에서 3-65일 동안 배양하여 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (f) 세포 집단을 수집하여 청각 세포 집단을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 FGF2를 포함하지 않는다.
일부 구현양태에서, BMP4는 제1 세포 배양 배지에서 약 1-25 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, BMP4는 제1 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, SB431542는 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지에서 약 0.1-10 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, SB431542는 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지에서 약 1 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, FGF2는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지에서 약 1-25 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, FGF2는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, IWP-2는 제2 세포 배양 배지에서 약 0.5-10 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, IWP-2는 제2 세포 배양 배지에서 2 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, LDN193189는 제2 세포 배양 배지에서 약 20-400 nM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, LDN193189는 제2 세포 배양 배지에서 100 nM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, CHIR99021은 제3 세포 배양 배지에서 약 1-25 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, CHIR99021은 제3 세포 배양 배지에서 6 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, IGF-1은 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, IGF-1은 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지에서 50 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, SHH는 제4 세포 배양 배지에서 약 50-1000 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, SHH는 제4 세포 배양 배지에서 500 ng/mL의 농도로 존재한다.
일부 구현양태에서, RA는 제4 세포 배양 배지에서 약 0.2-2 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, RA는 제4 세포 배양 배지에서 0.5 μM의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, EGF는 제4 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, EGF는 제4 세포 배양 배지에서 20 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, BDNF는 제5 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, BDNF는 제5 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, NT3은 제5 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, NT3은 제5 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)를 포함한다.
일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포 및/또는 청각 세포의 배양은 동적 배양 조건을 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포는 조직 배양 플라스크와 같은 소규모 플랫폼 또는 다층 플라스크와 같은 대규모 플랫폼에서 정적 2차원(2D) 부착 배양에서 성장한다.
일부 구현양태에서, 방법은 단계 (a)-(e) 중 어느 하나에서 동적 배양 조건을 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포는 비부착성 매트릭스 상의 세포 집합체와 같은 정적 3차원(3D) 배양에서 성장한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포는 생물반응기에 현탁된 미세담체와 같은 동적 2차원(2D) 대규모 플랫폼에서 성장한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포는 생물반응기에 현탁된 집합체와 같은 동적 3차원(3D) 대규모 플랫폼에서 성장한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포의 현탁액은 청각 세포의 집합체를 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 단계 (a) 전에, 미분화 다능성 줄기 세포를 단층에 1,200-20,000개의 살아있는 세포/cm2의 밀도로 시당하고, 세포 배양 배지에서 락테이트 농도가 1.5-12.5 mM이고 합류율이 5-80%가 될 때까지 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포 집단은 제1 세포 배양 배지에서 3-7일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, NNE 세포를 포함하는 세포 집단은 제2 세포 배양 배지에서 3-7일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, PPE 세포를 포함하는 세포 집단은 제3 세포 배양 배지에서 7일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단은 제4 세포 배양 배지에서 7일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 단계는 (i) 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 수확하는 단계; (ii) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 수확된 세포 집단을 시딩하는 단계; (iii) 시딩된 세포 집단을 7-35일 동안 배양하는 단계; (iv) 세포 집단을 수확하는 단계; (v) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 세포 집단을 시딩하는 단계; 및 (vi) 세포 집단을 7 내지 30일 동안 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 단계 (e) 전에, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 동결보존하고, 이어서 해동하고 제5 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 청각 세포 집단을 동결보존하는 단계를 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포 집단을 수득하는 방법은 다능성 줄기 세포의 배양물을 수득하는 단계, hESC를 비-뉴런성 외배엽 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 동적 2D 또는 동적 3D 배양 조건 하에서 제1 기간 동안 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계 및 비-뉴런성 외배엽 세포를 청각 세포로 분화하기에 충분한 배양 조건 하에서 비-뉴런성 외배엽 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포 집단을 수득하는 방법은 미분화 hESC의 동적 배양물을 수득하고, hESC의 중-후기 ONP 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에서, 예를 들어 본원에 기술된 세포 배양 배지의 조합을 사용하여 미분화 hESC를 배양하고, 및 중간 세포 은행을 생성하기 위한 동결보존된 중-후기 ONP 세포 조성물을 제형화하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 중-후기 ONP 세포를 청각 세포로 분화시키기에 충분한 동적 배양 조건 하에서 중-후기 ONP 세포를 추가로 배양하기 위해 은행으로부터 해동된 세포를 특성화하고 방출하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 세포 집단을 획득하는 방법은 미분화 hESC의 동적 배양물을 획득하고, hESC의 비-뉴런성 외배엽 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 조건 하에서 제1 기간 동안 미분화 hESC를 배양하고, 비-뉴런성 외배엽 세포를 전-기원판 외배엽 세포로 분화하기에 충분한 배양 조건 하에서 비-뉴런성 외배엽 세포를 배양하고, 전-기원판 외배엽 세포를 초기 귀 신경 전구체로 분화하기에 충분한 배양 조건 하에서 전-기원판 외배엽 세포를 배양하고, 초기 귀 신경 전구체를 중기 귀 신경 전구체로 분화하기에 충분한 배양 조건 하에서 초기 귀 신경 전구체를 배양하고, 중기 귀 신경 전구체를 후기 귀 전구체로 분화하기에 충분한 배양 조건 하에서 중기 귀 신경 전구체를 배양하고, 중-후기 귀 신경 전구체의 중간 세포 은행을 생성하기 위한 동결보존된 세포 조성물을 제형화하는 것을 포함하며, 방법은, 즉 세포를 나선형 신경절 호출과 같은 감각 뉴런 전구체 세포로 분화하기에 충분한 동적 배양 조건 하에서 세포를 추가로 배양하기 위해 은행으로부터 해동된 세포를 특성화하고 방출하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 해동 후 직접 대상체에게 투여하기 위한 동결보존 청각 세포 조성물을 제형화하는 방법을 제공한다.
일부 구현양태에서, 동결보존된 청각 세포 조성물을 제형화하는 방법은 (a) 청각 세포를 동결보존 배지에 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하는 단계, (b) 세포 현탁액을 동결보존 온도(-80℃ 또는 -140℃ 이하)에서 저장하는 단계, 및 (c) 대상체에게 투여하기 위해 동결보존된 현탁액을 해동하는 단계를 포함한다. 구현양태에서, 동결보존된 청각 세포 조성물은 해동 직후 과정의 지속을 위해 재시딩을 위한 장기 보관용으로 제형화된다. 구현양태에서, 동결보존된 청각 세포 조성물은 해동 후 직접 대상체에 투여하기 위해 제형화된다.
본 개시내용은 대상체의 내이 또는 중이에 치료학적 양의 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 청각 상태가 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 청각 상태가 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하며, 여기서 조성물은 대상체의 내이 또는 중이에 투여된다.
본 개시내용의 치료 방법의 일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 30% 이상의 세포가 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고; (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고; (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고; (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및 (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
일부 구현양태에서, 조성물은 주사를 통해 투여된다. 일부 구현양태에서, 주사는 대상체의 고실계 또는 모디올러스의 투여를 포함한다. 일부 구현양태에서, 주사는 미로골낭의 구멍을 통해 캐뉼라를 삽입하거나 와우창을 통해 캐뉼라를 삽입하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 약 100K 내지 100만 개의 세포가 대상체에게 투여된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는, 대상체의 임의의 청각 상태의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는, 대상체의 임의의 청각 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기술된 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 청각 세포 및 동결보존 배지를 포함한다.
구현양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 청각 세포 및 동결보존 배지를 포함한다.
일부 구현양태에서, 청각 청력 상태는 전음성 청력 상실, 감각신경성 청력 상실, 중추성 청력 상실, 혼합성 청력 상실, 청각 신경병증 스펙트럼 장애, 중추 청각 처리 장애, 또는 이명이다.
일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 내이에 투여된다.
일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 중이에 투여된다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 청각 뉴런을 대체하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 존재하지만 손상된 청각 뉴런 집단을 증대시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
도 1a는 기원판 유래 나선형 신경절-유사 감각 뉴런을 향한 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 직접 분화를 위한 계획을 포함하는, 본 개시내용의 예시적인 방법에 대한 청각 뉴런(AN) 분화의 단계를 보여준다. 과정에 따른 예시적인 분화 시간 프레임(DTF)이 포함된다.
도 1b는 본 개시내용의 예시적인 방법에 대한 청각 뉴런 분화의 상이한 단계에서의 성장 인자를 보여준다. hESC는 귀 뉴런성 전구체 세포로의 직접적인 분화를 위해 상이한 성장 인자 조합에 노출된다. 각 DTF에 사용된 분화 인자가 표시된다.
도 2는 실시예 1에 기술된 바와 같이 각 DTF의 말기에서 청각 뉴런(AN) 형태의 이미지를 보여준다.
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 분화 개시 전의 인간 배아 줄기 세포(hESC) 형태의 이미지를 보여준다.
도 4는 표 10 및 실시예 3에 상세히 기술된 바와 같이, 세포가 AN으로 분화됨에 따른 DTF#1 세포 형태의 이미지를 보여준다.
도 5는 표 12 및 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이, 세포가 AN으로 분화됨에 따른 DTF#2 세포 형태의 이미지를 보여준다.
도 6은 표 14 및 실시예 5에 기술된 바와 같이 DTF#1에서 상이한 성장 인자(GF) 조합에 노출된 세포의 형태의 이미지를 보여준다.
도 7은 표 16 및 실시예 6에 기술된 바와 같이 귀 뉴런성 전구체(ONP) 성숙 동안 상이한 배양 시스템(정적, 동적, 단일 세포, 집합체)에서 재시딩된 세포의 형태에 대한 이미지를 보여준다.
도 8은 표 17 및 실시예 7에 자세히 기술된 바와 같이 상이한 배양 시스템(정적, 동적)에서 해동되고 진행 중인 배양 집합체의 형태 이미지를 보여준다.
도 9a는 기원판-유래 나선형 신경절-유사 감각 뉴런을 향한 인간 배아 줄기 세포의 유도된 분화를 위한 예시적인 계획을 보여준다.
도 9b는 귀 뉴런성 전구체 세포를 향한 인간 배아 줄기 세포의 유도된 분화를 위한 계획을 보여준다.
도 9c는 본 개시내용에 따라 인간 배아 줄기 세포를 귀 뉴런성 전구체 세포로 유도된 분화를 위한 예시적인 세포 배양 계획 및 프로토콜을 보여준다. hESC는 iMatrix-511 직접 코팅 용기(1단계 접종)를 사용하여 0-3일 동안 배양된다. 세포 배양 및 분화는 PB 휠 생물반응기에서 직접 코팅된 MC(1단계 접종)에서도 진행될 수 있다. Needham 및 Nayagam 2014에 따르면 임의로 SB431542(TGF-베타 억제제)를 NIC로 대체하여 3-32일 동안 분화가 계속될 수 있다. ONP 생산은 신경 능선 유도(FGF 및 EGF만 사용)를 통해 수행할 수 있으며 FBi 프로토콜과 결합할 수도 있다(FGF 및 BMP 신호 전달의 억제). 26일째에 세포를 동결보존하여 중간 세포 은행(ICB, 대형 생물반응기에서 배양한 후 LONP 단계)을 생성할 수 있다. 생체내 이식 및 성숙을 위한 단일 세포 생존을 테스트할 수 있으며 세포의 불순물도 특성화할 수 있다. 25일에 수확된 세포는 7일 동안 단일 세포 배양으로 PBS 휠에 시딩하여 회전타원체 형성을 위해 시딩될 수 있다. 균질한 회전타원체(최종 생성물)를 위해 회전타원체는 Aggrewell 플레이트에서 형성될 수 있다. 예시적인 프로토콜의 최종 결과는 해동 및 주사(TAI) 제형(단일 세포/회전타원체)을 초래할 수 있다.
도 10은 본 개시내용에 따른 감각 뉴런성 전구체 세포에 대한 예시적인 배치 방출 프로파일을 보여준다.
도 11은 본 개시내용에 따른 감각 뉴런성 전구체 세포에 대한 예시적인 배치 방출 마커 프로파일을 보여준다.
도 12는 본 개시내용에 따른 인간 배아 줄기 세포의 귀 뉴런성 전구체 세포로의 유도된 분화를 위한 예시적인 과정중 제어(IPC) 테스트 계획을 보여준다.
도 13은 본 개시내용에 따른 감각 뉴런성 전구체 세포에 대한 예시적인 IPC 및 마커 프로파일을 보여준다.
이 설명은 본 개시내용이 구현될 수 있는 모든 다른 방식 또는 본 개시 내용에 첨가될 수 있는 모든 특징의 상세한 카탈로그가 되도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 하나의 구현양태와 관련하여 설명된 특징은 다른 구현양태에 통합될 수 있으며, 특정 구현양태와 관련하여 설명된 특징은 해당 구현양태에서 삭제될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 일부 구현양태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 제외되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 또한, 본원에서 제안된 다양한 구현양태에 대한 다양한 변형 및 첨가가 본 개시내용으로부터 벗어나지 않는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 다른 경우에는 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 잘 알려진 구조, 인터페이스 및 공정을 자세히 설명하지 않았다. 본 명세서의 어떤 부분도 본 발명의 전체 범위의 어떤 부분을 부인하는 데 영향을 미치는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 다음의 설명은 본 개시내용의 일부 특정 측면을 예시하기 위한 것이며, 이들의 모든 순열, 조합 및 변형을 철저하게 명시하려는 것은 아니다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 구현양태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아니다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 개시내용의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 본 개시의 일부 구현양태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 제외되거나 생략될 수 있다는 것을 고려한다.
본원에 개시된 방법은 기술된 방법을 달성하기 위한 하나 이상의 단계 또는 동작을 포함할 수 있다. 방법 단계 및/또는 작업은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 서로 교환될 수 있다. 즉, 측면의 적절한 작동을 위해 특정 단계 또는 동작의 순서가 요구되지 않는 한, 특정 단계 및/또는 동작의 순서 및/또는 사용은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형될 수 있다.
표 1. 약어
정의
본 개시내용의 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", 및 "그"는 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안("또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
백분율, 밀도, 부피 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 지정된 양의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "X와 Y 사이" 및 "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 X와 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 본원에서 사용되는 "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 "약 X와 약 Y 사이"를 의미하고 "약 X에서 Y까지"와 같은 문구는 "약 X에서 약 Y까지"를 의미한다.
본원에 사용된 "세포"는 게놈 DNA를 보존하거나 복제하기에 충분한 대사 기능 또는 기타 기능을 수행하는 세포를 의미한다. 세포는, 예를 들어 온전한 막의 존재, 특정 염료에 의한 염색, 자손 생산 능력, 또는 생식세포의 경우 생존가능한 자손을 생산하기 위해 두 번째 생식세포와 결합하는 능력을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 식별될 수 있다. 세포에는 원핵세포와 진핵세포가 포함될 수 있다. 원핵 세포에는 박테리아가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 진핵 세포에는 효모 세포 및 식물 및 동물로부터 유래된 세포, 예를 들어 포유동물, 곤충(예를 들어, 스포도프테라) 및 인간 세포가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 세포는 자연적으로 비부착성이거나, 예를 들어 트립신 처리를 통해 표면에 부착되지 않도록 처리된 경우 유용할 수 있다.
"포함하는" 또는 "포함한다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용되는 "본질적으로 구성되는"은 명시된 목적을 위한 조합에 필수적인 의미를 갖는 다른 요소를 제외하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 재료 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "구성된"은 다른 성분의 미량 원소 및 실질적인 방법 단계를 제외함을 의미한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 구현양태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
"유효량"은 조성물의 부재에 비해 명시된 목적(예를 들어, 투여되는 경우, 질병 치료, 효소 활성 감소, 효소 활성 증가, 신호전달 경로를 감소시키거나 질병 또는 상태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키는 효과를 달성하는)을 달성하기에 충분한 양이다. "유효량"의 예는 질병의 치료, 예방 또는 증상 또는 증상들 감소에 기여하기에 충분한 양을 들 수 있으며, "치료적으로 효과적인 양"이라고도 할 수 있다. 증상 또는 증상들의 "감소"(및 이 문구의 문법적 동등어)는 증상의 심각도 또는 빈도의 감소 또는 증상의 제거를 의미한다. 약물(예를 들어, 본원에 기술된 세포)의 "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 부상, 질병, 병리 또는 상태의 발병(또는 재발)을 예방 또는 지연시키거나 부상, 질병, 병리 또는 상태의 발병(또는 재발) 가능성 또는 그 증상을 감소시키는 등 의도된 예방 효과를 갖는 약물의 양을 의미한다. 완전한 예방 효과는 반드시 1회 용량 투여로 나타나는 것은 아니며, 일련의 용량을 투여한 후에만 나타날 수도 있다. 따라서, 예방학적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "활성 감소량"은 길항제의 부재에 비해 효소의 활성을 감소시키는 데 필요한 길항제의 양을 의미한다. 본원에 사용된 "기능 파괴량"은 길항제의 부재에 비해 효소 또는 단백질의 기능을 파괴하는 데 필요한 길항제의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins. 참조). 본원에 기술된 임의의 조성물에 대해, 치료 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 결정될 수 있다. 표적 농도는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정된 바와 같이 본원에 기술된 방법을 달성할 수 있는 활성 조성물(들)의 농도(예를 들어, 세포 농도 또는 수)일 것이다.
"대조군" 또는 "대조 실험"은 그 평이한 일반적인 의미에 따라 사용되며, 실험의 대상체 또는 시약을 절차, 시약, 시약 또는 실험의 변수의 생략을 제외하고는 병행 실험과 같이 처리하는 실험을 의미한다. 어떤 경우에는 대조군이 실험 효과를 평가할 때 비교 표준으로 사용된다. 일부 구현양태에서, 대조군은 본원에 기술된 바와 같이(구현양태 및 실시예 포함) 조성물의 부재 하에 단백질의 활성을 측정한 것이다.
본원에 사용된 "부식" 또는 "이식"은 적합한 전달 기술(예를 들어, 주사 장치를 사용하여)을 사용하여 표적 조직에 세포 집단을 투여하는 것을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는 부형제" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상체에 대한 활성제의 투여 및 흡수를 돕고 환자에 상당한 유해한 독성학적 효과를 유발하지 않고 본 개시내용의 조성물에 포함될 수 있는 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 비-제한적인 예에는 물, NaCl, 생리 식염수 용액, 락테이트 링거액, 정상 수크로스, 정상 글루코스, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미료, 향료, 염 용액(예를 들어, 링거 용액), 알코올, 오일, 젤라틴, 락토스, 아밀로오스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리딘 및 색소 등이 포함된다. 이러한 제제는 멸균될 수 있고, 원한다면 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제 및/또는 방향성 물질 등과 같은 개시내용의 조성물과 유해하게 반응하지 않는 보조제와 혼합될 수 있다. 당업자는 다른 약제학적 부형제가 본 개시내용에 유용하다는 것을 인식할 것이다.
본원에 사용된 "환자" 또는 "대상체"는 본원에 제공된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 이식가능한 생분해성 스캐폴드의 투여에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 상태를 앓고 있거나 그러한 경향이 있는 살아있는 유기체를 의미한다. 비-제한적인 예에는 인간, 기타 포유동물, 소, 래트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 기타 비-포유동물 동물이 포함된다. 일부 구현양태에서, 환자는 인간이다.
본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상체"는 중추신경계 조직이 손상된 동물 또는 인간을 의미한다. 구현양태에서, 동물 또는 인간은 운동 기능 상실을 겪고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상태 또는 질병과 관련하여 "치료" 또는 "치료하는"은 상태 또는 질병이 대상체에게 나타난 후에 바람직하게는 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 질병과 관련된 유익하거나 원하는 결과에는 다음 중 하나 이상이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 질병과 관련된 상태 개선, 질병 치료, 질병 중증도 완화, 질병 진행 지연, 질병과 관련된 하나 이상의 증상 완화, 질병으로 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 생존 연장 및 이들의 조합. 마찬가지로, 본 개시의 목적을 위해, 상태에 관한 유익하거나 바람직한 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 상태의 개선, 상태의 치료, 상태의 중증도 완화, 상태의 진행 지연, 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 완화, 상태로 고통받는 사람의 삶의 질 향상, 생존 연장 및 이들의 조합.
본원에 사용된 바와 같이, "내이 감각 유모 세포" 또는 간단히 "유모 세포"는 달팽이관(청각 시스템) 및 구형낭, 난원낭, 수정낭 및 반고리관의 기계감각 유모 세포를 의미하고, 이는 소리를 감지하고 증폭시키며 균형을 유지하는 데 각각 기여한다. 유모 세포는 원주형 세포와 비슷하며, 각각 정단 표면에 부동섬모로 구성된 모발 다발을 가지고 있다. 부동섬모의 편향은 기계적으로 개폐된 이온 채널을 열어 작은 양전하 이온(주로 칼륨과 칼슘)이 유모 세포로 들어갈 수 있도록 한다. 전기적으로 활성화된 다른 많은 세포와는 달리 유모세포 자체는 활동 전위를 발생시키지 않는다. 오히려 양이온의 유입으로 세포가 탈분극되어 수용체 전위가 발생한다. 따라서 유모 세포는 일반적으로 다른 뉴런의 전형적인 활동 전위 스파이크보다는 점진적인 전기 반응을 나타낸다. 유모 세포는 다음 마커 중 하나 이상의 검출 가능한 수준을 발현할 수 있다: 아토날 상동체 1(Atoh1/MATH1/HATH1), 미오신 VI(MYO6), 미오신 VIIA(MYO7A), 에스핀(ESPN), 미오신 중쇄 3(MYH2), 카드헤린23(CDH23), 프로토카드헤린15(PCDH15), 오토페린(OTOF) 및 프레스틴(SLC26A5).
본원에 사용된 "내이 지지 세포" 또는 간단히 "지지 세포"는 달팽이관, 예를 들어 데이터스(Deiters') (지골) 세포, 헨센(Hensen's) 세포, 클라우디우스(Claudius) 세포, 보에쳐(Boettcher) 세포, 기둥 세포, 변연 세포 등 및 구형낭, 난원낭, 수정낭 및 반고리관의 복잡한 구조적 및 기능적 특성에 기여하는 세포를 의미한다. 지지 세포는 정점 세포 표면의 짧은 미세융모로 식별할 수 있다. 또한, 이들은 유모 세포와 매우 가까운 곳에서 발견된다. 즉, 유모 세포와의 클러스터로서 유모 세포 바로 옆에서 발견된다. 지지 세포는 다음 마커 중 하나 이상의 검출가능한 수준을 발현할 수 있다: 사이클린-의존성 키나제 억제제 1B(CDKN1B, p27(KIP1)), 프로스페로 호메오박스 1(PROX1), 오토안코린(OTOA), 무사시 동족체 1(MSI1), SRY-박스 2(SOX2), 갭 접합 단백질 베타 2, 26 kDa(Connexin 26), 갭 접합 단백질 베타 6, kDa(Connexin30), 갭 접합 단백질 알파 1, 43 kDa(Connexin43), YRPW 모티브 2와 관련된 모발/분열 촉진제(HEY2).
본원에 사용된 바와 같이, "다능성 줄기 세포" 또는 "다능성 세포"는 유기체 내 모든 유형의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 세포는 살아있는 유기체의 기형종을 형성할 수 있고 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 조직에 기여할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 예로는 배아 줄기(ES) 세포, 배아 생식 줄기(EG) 세포 및 유도 다능성 줄기(iPS) 세포가 있다.
본원에 사용된 "배아 줄기 세포" 또는 "ES 세포"는 a) 자가-재생이 가능하고, b) 분화하여 유기체 내에서 모든 유형의 세포를 생산할 수 있고, c) 발달 중인 유기체의 포배의 내부 세포 덩어리로부터 유래되는 세포를 의미한다. ES 세포는 유기체의 모든 유형의 세포로 분화하는 능력을 유지하면서 장기간에 걸쳐 배양될 수 있다. 배양에서 ES 세포는 일반적으로 큰 핵-세포질 비율, 정의된 경계 및 눈에 띄는 핵을 갖는 평평한 콜로니로 성장한다. 또한, ES 세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA) 5(SSEA-5), POU 클래스 5 호메오박스 1(Oct-4), Nanog 호메오박스(Nanog), SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 항원(TRA-1-60), TRA-1-81 항원(TRA-1-81) 및 SSEA-1은 제외하고 알칼리성 포스파타제를 발현한다. ES 세포를 생성하고 특성화하는 방법의 예는, 예를 들어 미국 특허 7,029,913, 미국 특허. 5,843,780, 및 미국 특허 6,200,806에서 찾을 수 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 "배아 생식 줄기 세포", 배아 생식 세포" 또는 "EG 세포"는 a) 자가-재생이 가능하고, b) 분화하여 유기체 내 모든 유형의 세포를 생산할 수 있고 및 c) 생식 세포 및 생식 세포 전구체, 예를 들어 원시 생식 세포, 즉 정자와 난자가 되는 세포로부터 유래된 세포를 의미한다. 배아 생식 세포(EG 세포)는 위에서 기술한 대로 배아 줄기 세포와 유사한 특성을 가진 것으로 생각된다. EG 세포를 생성하고 특성화하는 방법의 예는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,153,684; Matsui, Y., et al., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113; Shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726; 및 Koshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235에서 찾을 수 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 a) 자가-재생이 가능하고, b) 분화하여 유기체 내 모든 유형의 세포를 생산할 수 있고, c) 체세포에서 유래된 세포를 의미한다. iPS 세포는 ES 세포-유사한 형태를 가지며, 핵-세포질 비율이 크고, 정의된 경계와, 핵이 뚜렷한 편평한 콜로니로 성장한다. 또한, iPS 세포는 당업자에게 알려진 하나 이상의 주요 다능성 마커를 발현하고, 알칼리성 포스파타제, SSEA3, SSEA4, SRY-박스 전사 인자 2(Sox2), Oct-4, Nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, 기형암종-유래 성장 인자 1(TDGF1), DNA 메틸트랜스퍼라제 3 베타(Dnmt3b), 포크헤드 박스 D3(FoxD3), 성장 분화 인자 3(GDF3), 시토크롬 P450 계열 26 하위계열 A 구성원 1(Cyp26a1), 텔로머라제 역전사효소(TERT) 및 ZFP42 징크 핑거 단백질(zfp42)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. iPS 세포는 "재프로그래밍 인자", 즉 전사를 변경하기 위해 세포에 작용하여 세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 생물학적 활성 인자의 하나 이상, 즉 칵테일을 세포에 제공함으로써 생성될 수 있다. 이들 재프로그래밍 인자는 개별적으로 또는 단일 조성물, 즉 재프로그래밍 인자의 사전 혼합된 조성물로서 세포에 제공될 수 있다. 인자는 동일한 몰비로 제공되거나 상이한 몰비로 제공될 수 있다. 인자는 본 발명의 세포를 배양하는 과정에서 1회 또는 여러 번 제공될 수 있다. iPS 세포를 생성하고 특성화하는 방법의 예는, 예를 들어 출원 번호 US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090246875 및 US20090304646에서 찾을 수 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
상업적으로 이용가능한 줄기 세포가 또한 본 개시내용의 측면 및 구현양태에서 사용될 수 있음이 이해된다. 인간 ES 세포는 NIH 인간 배아 줄기 세포 등록 기관, www.grants.nih.govstem_cells/ 또는 기타 hESC 등록 기관에서 구입할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배아 줄기 세포주의 비-제한적인 예에는 H1, HAD-C 102, ESI, BGO 1, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY1O, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WAO 1, UCSF4, NYUES 1, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUESS, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA 13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT I, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR 1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBRS, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BINhem19, BJNhem20, SAGO 1, 및 SAOO1을 포함한다.
본원에 사용된 "체세포"는 실험적 조작이 없을 경우 일반적으로 유기체 내 모든 유형의 세포를 생성하지 않는 유기체 내 임의의 세포를 의미한다. 즉, 체세포는 신체의 세 배엽, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세포를 자연적으로 생성하지 않을 정도로 충분히 분화된 세포이다. 예를 들어, 체세포에는 뉴런과 신경 전구체가 모두 포함되며, 후자는 자가-재생이 가능하고 자연적으로 중추 신경계의 모든 또는 일부 세포 유형을 생성할 수 있지만 중배엽이나 내배엽 계통의 세포는 생성할 수 없다.
본원에 사용된 "내배엽"은 위장관, 호흡기관, 내분비샘 및 기관, 청각계의 특정 구조 및 비뇨기계의 특정 구조를 발생시키는 동물 배아 발생 중에 형성된 배엽층을 의미한다.
본원에 사용된 "중배엽"은 근육, 연골, 뼈, 진피, 생식계, 지방 조직, 장의 결합 조직, 복막, 비뇨기계 특정 구조, 중피, 척색 및 비장을 발생시키는 동물 배아 발생 중에 형성되는 형성된 배엽층을 의미한다.
본원에 사용된 "외배엽"은 신경계, 치아 법랑질, 표피, 모발, 손발톱 및 점막 조직의 내벽을 생성하는 동물 배아 발생 동안 형성된 배엽층을 의미한다. 배아 발생 동안 배아 외배엽은 신경판, 신경 능선, 기원판 및 표피에 대한 계통 전구체로 패턴화된다. "비-뉴런성 외배엽" 또는 "비-신경 외배엽"은 표피와 같은 비-뉴런성 구조를 형성할 외배엽 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "전방 외배엽"은 배아의 전면 또는 "입쪽" 단부, 즉 머리 영역 쪽의 외배엽 배엽층의 영역을 의미한다. 전방 외배엽은 전-기원판 외배엽 및 추정 초기 외배엽, 추정 신경 능선 및 신경 조직과 같은 인접 조직을 포함한다. 외배엽은 IGF1 또는 인슐린과 같은 입측화 인자와의 접촉에 의해 전방 외배엽이 되도록 유도될 수 있다.
본원에 사용된 "전-기원판 외배엽"은 낭배형성 말기의 전방 신경판을 둘러싸며 두개골 기원판을 발생시키고, 이는 차례로 머리의 한 쌍의 감각 구조를 발생시키는 전방 외배엽의 좁은 띠의 세포를 의미한다. 전-기원판 외배엽 세포는 뉴로트로핀 수용체(CD271/NGFR/p75NTR), 섬유아세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1), 섬유아세포 성장 인자 수용체 2(FGFR2), 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3), SIX 호메오박스 1(SIX1), SIX 호메오박스 4(SIX4), 눈 없는 상동체 1(EYA1, eyes absent homolog 1), 눈 없는 상동체 2(EYA2)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 마커의 검출 가능한 수준을 발현할 수 있다. 전-기원판 외배엽 세포는 귀 유도, 즉 FGF의 존재 하에 배양하여 귀 전구체 세포를 유도하여 p75, Pax8, Pax2, GATA3 및 Sox10 발현을 상향 조절하는 데 반응할 수 있다. 전-기원판 외배엽 마커를 발현하고, 전-기원판 외배엽 특징을 갖는 세포는 본원에 기술된 방법을 사용하여 미분화 다분화성 줄기 세포로부터 유도될 수 있다.
본원에 사용된 "귀 전구체 세포" 또는 "귀 신경 전구체 세포"는 a) 자가-재생이 가능하고 b) 분화하여 내이 감각 유모 세포, 청각 뉴런 및 지지세포를 생성할 수 있는 체세포를 의미한다. 귀 전구체 세포는 비-부착 조건에서 배양할 때 세포 구체로 성장하거나, 부착 조건에서 배양할 때 세포 클러스터로 성장한다. 또한, 귀 전구체 세포는 다음 마커 중 하나 이상의 검출 가능한 수준을 발현할 수 있다: 쌍을 이루는 박스 2(PAX2), 쌍을 이루는 박스 8(PAX8), 원위부 없는 호메오박스 5(DLX5), 정형 호메오박스 2(OTX2), 눈 없는 상동체 1(EYA1), SIX 호메오박스 1(SIX1), 들쭉날쭉한 1(JAG1), 섬유아세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1). 다른 마커로는 포크헤드 박스 13(FOXI3), SRY-박스 2(SOX2), NOTCH1, 델타-유사 1(DELTA1), 뼈 형태발생 단백질 7(BMP7), T-박스 1(TBX1), GATA 결합 단백질 3(GATA3), 포크헤드 박스 D3(FOXD3), YRPW 모티프 1과 관련된 털이 있고/분할된 강화제(HEY1), YRPW 모티프 2와 관련된 털이 있고/분할된 강화제(HEY2), 털이 있고 분할된 강화제 1(HES1), 털이 있고 분할된 강화제 6(HES6), 액티빈 수용체(ACTIVIN-R), H6 계열 호메오박스 3(NKX5.1), 클라우딘 8(CLDN8), 클라우딘 14(CLDN14)를 포함한다. 귀 신경 전구체 세포는 본원에 기술된 바와 같이 마커 발현에 기반하여 초기, 중기 및 후기 귀 전구체 세포로 나눌 수 있다.
본원에 사용된 "간질 세포"는 임의의 기관, 예를 들어 섬유아세포, 혈관주위세포, 내피세포 등의 결합 조직 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미세담체" 또는 "MC"는 부착성 세포가 동적 또는 정적 세포 배양에서 성장할 수 있게 하고, 부드럽게 혼합하여 현탁 상태로 머무를 수 있는 현탁성 지지 매트릭스를 의미한다. 미세담체는 폴리스티렌, 표면-변형된 폴리스티렌, 화학적으로 변형된 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 셀룰로오스, 아크릴아미드, 콜라겐, 알기네이트, 젤라틴, 유리, DEAE-덱스트란 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 구성될 수 있다. 미세담체는 라미닌, Matrigel®, 콜라겐, 폴리-라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 테나신, 덱스트란, 펩티드 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 생물학적 지지 매트릭스로 코팅될 수 있다. HyQSphere(HyCloneTM), Hillex(SoloHill Engineering) 및 저농도 Synthemax® II(Corning) 브랜드를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 미세담체가 상업적으로 이용가능하다. 미세담체는 Cytodex® 브랜드(GE Healthcare)와 같은 가교 덱스트란으로 만들어질 수 있다. 미세담체는 구형이고 매끄러울 수 있으며, CYTOPORETM 브랜드(GE Healthcare)와 같은 미세다공성 표면을 가질 수 있고/있거나 DE-53(WhatmanTM)과 같은 막대-모양 담체일 수 있다. 미세담체는 비드로부터 세포 분리를 도울 수 있는 자성 입자(예를 들어, Global Cell Solutions의 GEM 입자)로 함침될 수 있다. μHex 제품(Nunc)과 같은 칩-기반 미세담는 기존 미세담체의 높은 표면 대 부피 비율을 유지하면서 세포 성장을 위한 평평한 표면을 제공한다. 미세담체의 특성은 확장 속도와 세포의 다중 또는 다능성에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 "동적 배양"은 정적 조건(예를 들어, 페트리 접시)에서 수행되는 세포 배양과 달리, 대량 전달 및 기계적 전달 효과(예를 들어, 생물반응기)를 향상시키기 위해 의도적인 활성 동작으로 수행되는 세포 배양을 의미하며, 이는 종종 더 많은 수의 기능성 세포를 초래한다. 예를 들어, 동적 분화 과정에서 생물반응기는 기계적 힘을 직접 적용하여 생리적 조건을 생성하고 특정 세포 계통으로의 분화를 향상시킨다. 동적 배양에서는 세포가 더욱 균질한 환경을 가질 수도 있는데, 이는 확산만으로는 정적 배양에 제공될 수 없다. 예를 들어, 혈관 주변과 혈관 내부 영역에서 성장하는 세포이다. 또한 정적 배양은 동적 배양에서는 지속 가능하지 않은 다양한 세포 밀도를 가진 미세 환경을 유지하므로 생물학적으로 분리된 다양한 틈새를 생성할 수 있다.
본원에 사용된 "동적 2차원" 또는 "동적 2D"는 성장하여 미세담체 상에서 단층을 형성하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 세포가 부착되어 동적 2D 배양을 형성할 수 있게 하는 현탁된 접착제(예를 들어, 미세담체)를 사용하여 동적 배양(예를 들어, 생물반응기)에서 세포가 배양된다.
본원에 사용된 "동적 3차원" 또는 "동적 3D"는 생물학적 세포가 모든 3차원에서 성장하거나 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 인공적으로 만들어진 환경에서의 세포 배양과 같이 현탁액에서 집합체로서 성장하는 세포를 의미한다. 2D 환경과 달리, 3D 세포 배양을 사용하면 생체내에서 세포가 성장하는 방식과 유사하게 시험관내 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있다. 이러한 3차원 배양은 예를 들어 생물반응기, 세포가 회전타원체로 성장할 수 있는 작은 캡슐 또는 3D 세포 집합체에서 성장할 수 있다.
본원에 사용된 "감각 뉴런성 전구체 세포"는 배아 발달 동안 모든 동물의 신경계의 뉴런 및 신경교를 생성하는 방사형 신경교 전구체 세포를 먼저 생성하는 자가 재생, 다능성 세포를 의미한다. 감각 뉴런성 전구체 세포는 자연적으로 발생할 수 있지만, 이들의 세포 구성은 본원에 개시된 방법을 사용하여 미분화 다능성 줄기 세포로부터 유도된 세포와 다르다.
본원에 사용된 바와 같이, "청각 뉴런", "청각 뉴런들"(AN으로 약칭), "청각 세포" 또는 "청각 세포들"은 하나 이상의 유모 세포, 지지 세포, 귀 전구체 세포, 감각 뉴런성 전구체 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 귀의 감각 세포 집단을 의미하거나 지칭한다. "청각 세포"라는 용어는 어떤 경우에는 위에서 설명한 세포 유형의 임의의 조합을 임의의 비율로 포함하는 혼합된 세포 집단을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, '청각 장애' 또는 '청각 상태' 또는 '청력 장애' 또는 '청력 상태'는 전음성 청력 상실, 감각신경성 청력 상실, 중추성 청력 상실, 혼합성 청력 상실, 청각 신경병증 스펙트럼 장애, 중추 청각 처리 장애 및 이명을 포함하되 이에 제한되지 않는 상태 또는 장애를 지칭한다.
본원에서 사용되는 '전음성 청력 상실'은 외이도를 통해 중이 뼈까지 음파가 전달되는 데 있어 장애를 의미한다.
본원에서 사용된 '감각신경성 청력 상실'은 내이 또는 청신경 구조의 병리학적 변화를 의미한다.
본원에서 사용되는 '중추성 청력 상실'은 청신경과 뇌간의 접합부 위의 병리학적 상태를 의미한다.
본원에서 사용된 '혼합성 청력 상실'은 전음성 청력 상실과 감각신경성 청력 상실을 모두 앓고 있는 대상체을 의미한다.
본원에 사용된 '청각 신경병증 스펙트럼 장애'는 청각 신경이 뇌의 청각 중추에 일관된 메시지를 전달하지 못하는 일종의 감각신경성 청력 상실을 의미한다.
본원에 사용된 '중추 청각 처리 장애'는 중추 청각 신경계의 청각 정보에 대한 신경 처리 장애를 의미한다.
청각 세포 집단을 생산하는 방법
본 개시내용은 미분화 다능성 줄기 세포로부터 청각 세포 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 일련의 분화 단계를 통해 청각 뉴런 운명을 향한 미분화 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 일련의 단계로 성장 인자 및 성장 인자 억제제의 상이한 조합으로 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 배양하는 것을 포함한다. 예시적인 분화 경로에서, 인간 배아 줄기 세포(hESC)는 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포로 분화되도록 유도되고, 이는 전-기원판 외배엽(PPE) 세포로 분화되도록 유도되며, 이는 차례로 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포, 중기 귀 전구체 세포, 후기 귀 전구체 세포 및 나선형 신경절 뉴런으로 분화되도록 유도된다. 생성된 세포 집단에는 여러 종류의 세포가 혼합되어 있을 수 있다. 그러나 경로의 후기 단계의 세포가 우세할 수 있으며 잔여 hESC는 최소이거나 없을 수 있다. 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 세포 유형의 범위가 대상체에게 투여될 때 세포가 생착할 수 있는 틈새를 증가시키고 세포가 투여시 채택할 수 있는 운명의 수를 증가시키기 때문에, 혼합된 세포 집단을 포함하는 조성물은 균질한 세포 집단을 포함하는 조성물보다 청각 질병 및 장애의 치료제로서 더 적합할 수 있다고 생각된다.
인간 배아 줄기 세포(hESC)를 확장하고 유지하는 방법
한 측면에서, 미분화 다능성 상태에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 확장하고 유지하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (a) 정적 확장을 위해 조직 배양 플라스크의 성장 배지에 인간 배아 줄기 세포와 세포외 매트릭스 성분(ECM)을 동시에 조합하는 단계 및 (b) 부착된 hESC를 일정 시간 동안 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현양태에서, 정적 확장의 배양된 인간 배아 줄기 세포는 ReLeSRTM을 사용하여 비-효소적으로 수확되고 iMatrix-511 코팅 용기 상의 mTeSRTM 플러스 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, hESC는 단계 (a) 및 (b)를 반복함으로써 추가로 확장된다.
일부 구현양태에서, 정적 확장의 배양된 인간 배아 줄기 세포는 수확되고 추가로 분화된다.
한 측면에서, 미분화 다능성 상태에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 확장하고 유지하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 (a) 성장 배지 내 인간 배아 줄기 세포, 세포외 매트릭스 성분(ECM) 및 미세담체를 동시에 조합하여 현탁성 확장 복합체를 형성하고, (b) 일정 기간 동안 현탁성 확장 복합체를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현양태에서, 현탁성 확장 복합체의 배양된 인간 배아 줄기 세포는 수확되고 단계 (a) 및 (b)를 반복함으로써 추가로 확장된다.
일부 구현양태에서, 현탁성 확장 복합체의 배양된 인간 배아 줄기 세포는 수확되고 추가로 분화된다.
인간 배아 줄기 세포는 인간 배반포로부터 분리될 수 있다. 인간 배반포는 일반적으로 인간 생체내 착상전 배아 또는 체외 수정(IVF) 배아로부터 수득된다. 대안적으로, 단일 세포 인간 배아를 배반포 단계로 확장할 수 있다. 인간 ES 세포를 분리하기 위해 투명대를 배반포에서 제거하고 내부 세포 덩어리(ICM)를 영양외배엽 세포를 용해시키고 부드러운 피펫팅을 통해 손상되지 않은 ICM에서 제거하는 절차로 분리한다. 그런 다음 ICM을 성장을 가능하게 하는 적절한 배지를 함유하는 조직 배양 플라스크에 위치시킨다. 9-15일 후, ICM 유래 파생물은 기계적 분리 또는 효소적 분해에 의해 덩어리로 해리되고, 세포는 새로운 조직 배양 배지에 다시플레이팅한다. 미분화 형태를 나타내는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선택하고 기계적으로 덩어리로 해리한 후 다시 플레이팅한다. 생성된 ES 세포는 4-7일마다 정기적으로 분할된다. 인간 ES 세포 제조 방법에 대한 자세한 내용은 문헌을 참조한다: Reubinoff et al. Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559; Thomson et al., [U.S. Patent No. 5,843,780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; 및 Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].
또한, ES 세포는 마우스(Mills and Bradley, 2001), 골든 햄스터[Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7], 래트[Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92], 토끼[Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36:130-8; Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 30 36: 424-33], 여러 가축 종 [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipovaet al., 2001, Cloning. 3: 59-67] 및 비-인간 영장류 종(붉은 털 원숭이 및 마모셋)[Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9]을 포함하는 다른 종으로부터 수득될 수 있다.
확장된 배반포 세포(EBC)는 낭배형성 전 단계에서 수정 후 적어도 9일의 배반포로부터 수득할 수 있다. 배반포를 배양하기 전에 투명대를 소화하여(예를 들어, Tyrode의 산성 용액(Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)) 내부 세포 덩어리를 노출시킨다. 그런 다음 배반포는 표준 배아 줄기 세포 배양 방법을 사용하여 시험관내에서 수정 후(즉, 낭배형성 전) 적어도 9일에서 최대 14일 동안 전체 배아로 배양된다.
ES 세포를 제조하는 또 다른 방법은 Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008에 기술되어 있다. 이 방법은 체외 수정 과정 동안 배아로부터 단일 세포를 제거하는 것을 포함한다. 이 과정에서 배아는 파괴되지 않는다.
EG(embryonic germ) 세포는 당업자에게 공지된 실험실 기술을 사용하여 임신 약 8-11주의 태아(인간 태아의 경우)로부터 얻은 원시 생식세포로부터 제조된다. 생식기 능선이 분리되고 작은 부분으로 절단된 후 기계적 해리에 의해 세포로 분해된다. 그런 다음 EG 세포를 적절한 배지와 함께 조직 배양 플라스크에서 성장시킨다. 세포는 EG 세포와 일치하는 세포 형태가 관찰될 때까지, 전형적으로 7-30일 또는 1-4 계대 후에 매일 배지를 교체하면서 배양된다. 인간 EG 세포의 제조 방법에 대한 추가 세부사항에 대해서는 Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] 및 미국 특허 번호 6,090,622를 참조한다.
ES 세포를 제조하는 또 다른 방법은 처녀생식에 의한 것이다. 배아는 또한 그 과정에서 파괴되지 않는다.
세포는 현탁액에서, 미세담체가 있거나 없이, 또는 단층으로 확장될 수 있다. 단층 배양 또는 현탁 배양에서 혼합된 세포 집단의 확장은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 생물반응기 또는 다중/하이퍼 스택에서 대규모 확장으로 변형될 수 있다.
일부 구현양태에 따르면, 확장 단계는 적어도 1주 내지 20주 동안, 예를 들어 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 심지어 10주까지 동안 실시된다. 구현양태에서, 확장 단계는 1주 내지 10주, 예컨대 2주 내지 10주, 3주 내지 10주, 4주 내지 10주, 또는 4주 내지 8주 동안 실시된다. 기간은 종료점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
다른 구현양태에 따르면, 확장 단계는 세포 배양 배지 내 적합한 락테이트 농도 및/또는 합류율이 달성될 때까지 수행된다. 합류율은 현미경으로 관찰했을 때 세포층으로 덮여 있는 것처럼 보이는 배양 용기 표면적의 백분율이다. 일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포는 세포 배양 배지 내 락테이트 농도가 약 1.0 내지 13.0 mM, 또는 약 1.5-12.5 mM이 될 때까지 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포는 세포 배양 배지 내 락테이트 농도가 약 1.68-12.29 mM이 될 때까지 배양된다. 일부 구현양태에서, 합류율은 5% 내지 85% 사이이다.
다른 구현양태에 따르면, 혼합된 세포 집단은 확장 단계 동안 적어도 1회, 확장 단계 동안 적어도 2회, 확장 단계 동안 적어도 3회, 확장 단계 동안 적어도 4회, 확장 단계 동안 적어도 5회, 확장 단계 동안 적어도 6회 또는 확장 단계 동안 적어도 7회 계대된다.
세포가 효소적으로 수집되는 경우, 8회 이상 계대, 9회 이상 계대, 심지어 10회 이상 계대(예를 들어, 11-15회 계대) 동안 확장을 계속하는 것이 가능하다. 총 세포가 2배가 되는 횟수는 30 이상, 예를 들어 31, 32, 33, 34 이상으로 증가할 수 있다.(전체 내용이 참조로 본원에 포함된 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/021973 참조).
세포외 매트릭스(ECM)는 주변 세포에 구조적 및 생화학적 지지를 제공하는 콜라겐, 효소, 당단백질 및 하이드록실화인회석과 같은 세포외 거대분자와 미네랄로 구성된 3차원 네트워크이다. 다세포성은 상이한 다세포 계통에서 독립적으로 진화했기 때문에, ECM의 구성은 다세포 구조마다 다르지만; 그러나 세포 뷰착, 세포 간 통신 및 분화는 ECM의 일반적인 기능이다.
동물 세포외 매트릭스는 간질 매트릭스와 기저막을 포함한다. 간질 매트릭스는 다양한 동물 세포 사이(즉, 세포간 공간)에 존재한다. 다당류와 섬유질 단백질의 젤은 간질 공간을 채우고 ECM에 가해지는 스트레스에 대한 압축 완충 역할을 한다. 기저막은 다양한 상피 세포가 놓여 있는 시트 모양의 ECM 퇴적물이다. 동물의 결합 조직 각 유형에는 일종의 ECM이 있다: 콜라겐 섬유와 뼈 미네랄은 뼈 조직의 ECM을 포함하고; 망상섬유와 기저 물질은 느슨한 결합조직의 ECM을 포함하고; 혈장은 혈액의 ECM이다.
본 개시내용의 범위 내에서 사용하기에 적합한 세포외 매트릭스 성분은 Matrigel®, 비트로넥틴, 젤라틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌(예를 들어, 라미닌 521), 피브로넥틴 폴리-D- 라이신, 이들의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 반드시 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현양태에서, 인간 라미닌은 인간 라미닌 511 E8 단편이다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 자성 입자, 마이크로칩, 셀룰로오스, 하이드록실화 메타크릴레이트, 콜라겐, 젤라틴, 폴리스티렌, 플라스틱, 유리, 세라믹 또는 실리콘 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리스티렌, 표면-변형된 폴리스티렌, 화학적으로 변형된 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 셀룰로오스, 아크릴아미드, 콜라겐, 알기네이트, 젤라틴, 유리, DEAE-덱스트란, 또는 이들의 조합으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 표면-변형된 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 화학적으로 변형된 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 가교결합된 덱스트란으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 셀룰로오스로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 아크릴아미드로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 콜라겐으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 알기네이트로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 젤라틴으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 유리로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 DEAE-덱스트란으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 코팅되지 않는다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 코팅된다. 구현양태에서, 미세담체는 Matrigel®, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 이들의 유도체 또는 이들의 조합으로 코팅될 수 있다. 구현양태에서, 미세담체는 폴리-라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 피브로넥틴, 테나신, 덱스트란, 펩티드, 또는 이들의 조합으로 코팅될 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 라미닌으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 Matrigel®로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 콜라겐으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리-라이신으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리-L-라이신으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리-D-라이신으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 비트로넥틴으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 피브로넥틴으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 테나신으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 덱스트란으로 코팅된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 펩티드로 코팅된다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 구형, 매끄럽고, 거대다공성, 막대형, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 프로타민 또는 폴리라이신과 커플링될 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 구형이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 타원형이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 막대형이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 디스크형이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 다공성이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 비-다공성이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 매끄럽다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 편평하다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 중성이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 음으로 하전된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 친수성이다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 25 cm2, 50 cm2, 75 cm2, 100 cm2, 125 cm2, 150 cm2, 175 cm2, 200 cm2, 225 cm2, 250 cm2, 500 cm2, 625 cm2, 750cm2, 1,000 cm2, 1,250 cm2, 5,000 cm2 또는 7,500 cm2의 표면적을 가질 수 있다. 표면적은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
특정 구현양태에서, 미세담체는 표면 처리되어 세포 부착을 향상시켜 세포 수율 및 생존율을 최대화한다. 미세담체는 일관된 플랫폼을 제공하는 USP 클래스 VI 폴리스티렌 재료로 구성될 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 줄기 세포 확장을 위해 미세담체 상에 합성 표면을 생성한다. 향상된 부착 표면 처리는 미세담체 표면에 산소를 주입하여 세포 부착을 개선한다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 비발열성이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 중간엽 줄기 세포 적용을 위해 최적화된다. 특정 구현양태에서, 비드의 크기는 125-212 μm로 다양할 수 있다. 특정 구현양태에서, 미세담체의 밀도는 1.026 ± 0.004일 수 있다. 특정 구현양태에서, 미세담체는 360 cm2/g일 수 있다.
일부 구현양태에서, 방법은 담체 표면에 대한 세포 부착을 개선하기 위해 hESC를 라미닌 또는 이의 유도체와 조합하는 것을 포함한다. 특정 구현양태에서, 라미닌은 인간 라미닌 511이다. 대안적인 구현양태로서, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐, Matrigel® 또는 이들의 유도체를 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는 몇몇 다른 세포외 매트릭스가 세포 부착을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현양태에서, 세포는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일,또는 14일 동안 배양될 수 있다.
일부 구현양태에서, 세포는 10 mL 내지 3,000 mL, 예를 들어 약 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1,000 mL 또는 3,000 mL의 작업 부피에서 배양될 수 있다. 부피는 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 모든 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 구현양태에서, 배양된 세포는 추가로 확장될 수 있다.
일부 구현양태에서, 배양된 세포는 미분화된 상태로 남아 있을 수 있다. 미분화 세포는 SSEA-5, TRA-1-60, Oct-4 및 Nanog를 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는 다양한 마커의 발현에 의해 식별될 수 있다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 SSEA-5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 TRA-1-60을 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 Oct-4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 Nanog를 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 SSEA-5 및 TRA-1-60 둘 다를 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 Oct-4 및 Nanog 둘 다를 발현한다. 일부 구현양태에서, 미분화 세포는 SSEA-5, TRA-1-60, Oct-4 및 Nanog를 발현한다(도 2 IPC#0 참조).
일부 구현양태에서, 세포는 배양보조 세포-조절 배지에서 배양될 수 있다. ES 배양 방법에는 줄기 세포 증식에 필요한 인자를 분비하는 동시에 분화를 억제하는 배양보조 세포층의 사용이 포함될 수 있다. 배양은 일반적으로 고체 표면, 예를 들어 젤라틴 또는 비멘틴으로 코팅된 표면에서 수행된다. 예시적인 배양보조층에는 인간 배아 섬유아세포, 성체 나팔 상피 세포, 원발성 마우스 배아 섬유아세포(PMEF), 마우스 배아 섬유아세포(MEF), 뮤린 태아 섬유아세포(MFF), 인간 배아 섬유아세포(HEF), 인간 배아 줄기 세포의 분화로부터 얻은 인간 섬유아세포, 인간 태아 근육 세포(HFM), 인간 태아 피부 세포(HFS), 인간 성인 피부 세포, 인간 포피 섬유아세포(HFF), 인간 탯줄 섬유아세포, 탯줄 또는 태반에서 얻은 인간 세포, 인간 골수 간질 세포(hMSC)가 포함된다. ESC를 미분화된 상태로 유지하기 위해 성장 인자를 배지에 첨가할 수 있다. 이러한 성장 인자에는 bFGF 및/또는 TGF가 포함된다. 다른 구현양태에서, hESC를 미경험 미분화 상태로 유지하기 위해 제제를 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어, Kalkan et al., 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540. 참조.
hESC는 전형적으로 1-4일 후에 지지 배지(예를 들어, NUTRISTEM®, 인간 혈청 알부민을 함유한 NUT(+), mTeSR™ plus, 또는 mTeSR™1 StemFit®)에서 배양보조 세포의 상부에 플레이팅된다. bFGF 및 TGFβ3과 같은 ESC의 분화를 방지하기 위해 추가 인자를 배지에 첨가할 수 있다. 충분한 양의 hESC가 수득되면 세포를 기계적으로 파괴할 수 있다(예를 들어, 멸균 팁 또는 일회용 멸균 줄기 세포 도구 사용; 14602 Swemed). 대안적으로, 세포는 효소 처리(예를 들어, 콜라게나제 A 또는 TrypLE™ Select)에 의해 제거될 수 있다. 이 과정은 필요한 양의 hESC에 도달하기 위해 여러 번 반복될 수 있다. 일부 구현양태에 따르면, 첫 번째 확장 라운드 후에 hESC는 TrypLE™ Select를 사용하여 제거되고 두 번째 확장 라운드 후에 hESC는 콜라게나제 A를 사용하여 제거된다.
배양보조 세포가 없는 시스템도 ES 세포 배양에 사용되었으며, 이러한 시스템은 배양보조 세포층을 대체하기 위해 혈청 대체물, 사이토카인 및 성장 인자(IL6 및 가용성 IL6 수용체 키메라 포함)가 보충된 매트릭스를 활용한다. 줄기 세포는 배양 배지(예를 들어, Lonza L7™ 시스템, mTeSR™, StemPro™, XFKSR, E8, NUTRISTEM®) 존재 하에 세포외 매트릭스(예를 들어, MATRIGEL®, 라미닌 또는 비트로넥틴)과 같은 고체 표면에서 성장할 수 있다. 배양보조 세포와 줄기 세포의 동시 성장이 필요하고 혼합된 세포 집단이 발생할 수 있는 배양보조-기반 배양과 달리, 배양보조-없는 시스템에서 성장한 줄기 세포는 표면에서 쉽게 분리된다. 줄기세포 성장에 사용되는 배양배지는 MEF-조절 배지 및 bFGF와 같은 줄기세포의 분화를 효과적으로 억제하고 성장을 촉진하는 인자를 함유한다.
또한, 본 개시내용의 범위에는 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 미분화 상태로 확장 및 유지하는 방법이 포함되며, 이는 비-부착성 표면에서 인간 다능성 줄기 세포를 배양하여 미분화 hESC 집단을 수득하는 단계, 성장 배지에서 상기 미분화 hESC 집단을 미세담체와 조합하는 단계, 및 상기 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
비-부착성 세포 배양 플레이트의 예에는 Nunc에서 제조한 것(예를 들어, Hydrocell Cat No. 174912) 등이 포함된다. 다른 구현양태에서, 비-부착성 현탁 배양 접시가 사용될 수 있다(예를 들어, Corning).
일부 구현양태에 따르면, 세포가 비-부착성 기질 상에서, 예를 들어, 세포 배양 플레이트에서 배양될 때, 대기 산소 조건은 20%이다. 그러나, 대기 산소 퍼센트가 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 심지어 약 5% 미만(예를 들어, 1%-20%, 1%-10% 또는 0-5%)이 되도록 대기 산소 조건을 조작하는 것도 고려된다. 다른 구현양태에 따르면, 세포는 처음에는 정상 대기 산소 조건 하에서 비-부착성 기질상에서 배양되고, 이후 정상 대기 산소 조건 미만으로 낮아진다.
상기 기재된 방법은 hESC를 확장하고 유지하는 방법에 관한 것이지만, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)에 관한 유사한 방법도 본 개시내용의 범위 내에 있다. iPSC는 다능성 관련 유전자의 도입을 통해 다시 다능성 상태로 재프로그래밍된 체세포에서 유래된 줄기 세포의 일종이며 다양한 공급원으로부터 이용가능하다. 당업자는 iPSC 등과 함께 사용하기 위해 위에서 설명한 hESC 방법을 적용하는 데 필요한 변화를 인식할 것이다.
확장 조성물
다른 측면에서, 인간 배아 줄기 세포 또는 IPSC, 세포외 매트릭스 성분(ECM), 및 미세담체를 포함하는 현탁가능한 확장 복합체 조성물이 본원에 제공된다.
인간 배아 줄기 세포, 세포외 매트릭스 및 미세담체는 본원의 다른 곳에서 자세히 설명되어 있다.
확장 복합체 범위는 다양할 수 있다. 다음 표에서는 복잡체 성분의 범위가 ECM 성분의 다양한 단위로 자세히 설명되어 있다.
표 2.
ECM 성분은 라미닌 511 E8 단편의 분자량(150 KDa)을 사용하여 mol/cm2로 표시될 수 있다.
표 3.
ECM 성분은 또한 분자량(150 KDa)에 아보가드로 수(6.022×1023)를 곱하여 분자 수/cm2로 표시할 수 있다.
표 4.
일부 구현양태에서, 다음의 사양 매개변수가 확장될 수 있다: hESC(세포)의 수 - 미세담체 cm2당 4,000 - 600,000개 세포; 라미닌 511 E8 단편(미세담체 cm2 당 μg) cm2당 0.125 μg 이상.
일부 구현양태에서, 조성물은 성장 배지를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따라 활용될 수 있는 시판되는 기본 배지(즉, 화학적으로 정의된 배지 또는 CDM)의 비-제한적 예는 NUTRISTEM®(ESC 분화를 위한 bFGF 및 TGF 없음, ESC 확장을 위한 bFGF 및 TGF 포함), NEUROBASAL™, KO-DMEM, DMEM, DMEM/F12, CELLGRO™ 줄기 세포 성장 배지 또는 X-VIVOTM을 포함한다. 기본 배지에는 세포 배양을 다루는 분야에 공지된 다양한 제제가 보충될 수 있다. 다음은 본 개시내용에 따라 사용될 배양물에 포함될 수 있는 다양한 보충제에 대한 비-제한적인 언급이다: 혈청 또는 혈청 대체물 함유 배지, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 녹아웃 혈청 대체물(KOSR), NUTRIDOMA-CS, TCH™, N2, N2 유도체, 또는 B27 또는 조합; 세포외 매트릭스(ECM) 성분, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및 젤라틴. 일부 구현양태에서, 세포 배양 배지는 N2, B27 또는 이들의 조합이 보충되고, 임의로 BrainPhys™(그런 다음 ECM은 TGFI3 슈퍼패밀리의 성장 인자 중 하나 이상의 구성원을 운반하는 데 사용될 수 있다); 예를 들어 L-글루타민, 베타 메르캅토에탄올, 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 이에 제한되지 않는 항균제; 및 및 비-필수 아미노산(NEAA), 이에 제한되지 않지만 BDNF, NT3, NT4와 같은 배양에서 SC의 생존을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려진 뉴로트로핀이 보충된 화학적으로 정의된 배지(CDM)를 포함한다.
위에서 설명한 바와 같이, 미세담체는 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 자기 입자, 마이크로칩, 셀룰로오스, 하이드록실화 메타크릴레이트, 콜라겐, 젤라틴, 폴리스티렌, 플라스틱, 유리, 세라믹, 실리콘 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 표면-변형된 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 화학적으로 변형된 폴리스티렌으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 가교결합된 덱스트란으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 셀룰로오스로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 아크릴아미드로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 콜라겐으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 알기네이트로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 젤라틴으로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 유리로 구성된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 DEAE-덱스트란으로 구성된다.
전술한 바와 같이, 미세담체는 구형, 매끄럽고, 거대다공성, 막대형, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 마트리겔, 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐, 이들의 유도체, 또는 이들의 조합으로 코팅될 수 있다. 일부 구현양태에서, 라미닌은 인간 라미닌 511이다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 코팅되지 않는다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 표면적(그램당)이 25 cm2 내지 7,500 cm2, 예를 들어 약 25 cm2, 50 cm2, 75 cm2, 100 cm2, 125 cm2, 150 cm2, 175 cm2, 200 cm2, 225 cm2, 250 cm2, 500 cm2, 625 cm2, 750 cm2, 1,000 cm2, 1,250 cm2, 5,000 cm2 또는 7,500 cm2이다. 표면적은 끝점을 포함하여 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 구현양태에서, 미세담체는 프로타민 또는 폴리라이신과 커플링된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 중성이다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 음으로 하전된다. 일부 구현양태에서, 미세담체는 친수성이다.
청각 세포를 제조하는 방법
본 개시내용에 따르면, 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)는 hESC 배양 배지 내 미세담체 상에서 동적 배양으로 성장할 수 있고, 상기 기재된 바와 같이 hPSC 배지를 매일 교체함으로써 다능성 상태로 유지될 수 있다. hPSC는 비뉴런성 외배엽(NNE) 형성을 유도하는 배양 배지(DMEM/F12 및 신경기저 배지의 1:1 혼합물)로 배지 교체를 통해 분화될 것이다. 이 배지에는, 예를 들어 B27 및 N2 보충제, BMP4(1-25 ng/mL)와 같은 TGF 베타 작용제, 비타민 b3 유도체 니코틴 아미드(NIC, 1-25 mM), SB431542 및/또는 FGF2(1-25 ng/mL)가 포함될 수 있다. 동적 정적 배양은 3-7일 동안 지속되며 배지는 완전히 또는 점진적으로 교체된다(매일 부피의 75-100%). 분화일 4-8일에 분화 인자는 전-기원판 외배엽을 생성하기 위해 FGF2, LDN193189(20-400 nM), IWP-2(2 uM), SB431542(1 μM), NIC(1-25 mM), Wnt 억제제 IWR-엔도(1-10 μM)로 대체될 것이다. 동적 배양은 1-3일마다 배지 교체와 함께 3-7일 동안 계속된다. 분화일 8-14일에 분화 인자는 초기 ONP를 생성하기 위해 FGF2, CHIR99021(6 uM) 및 IGF1(50 ng/ml)로 대체될 것이다. 동적 배양은 2-3일마다 배지교체와 함께 7-10일 동안 계속된다. 17-22일에 분화 인자는 중-후기 ONP를 생성하기 위해 FGF2, EGF, 레티노산(RA 0.2-2 μM), SHH(500 ng/ml) 및 IGF1(50 ng/ml)로 대체될 것이다. 동적 배양은 1-3일마다 배지 교체와 함께 7-10일 동안 계속된다. 22-28일에 중-후기 ONP 세포를 수확하고 BDNF(10 ng/mL), NT3(10 ng/mL) 및 IGF-1 Rock 억제제(예를 들어, Y-27632 이염산염, 10 μM) 존재 하에 3일 동안 단일 세포로서 정적/동적 현탁액에 접종되어 작은 집합체를 형성한다. 분화 22-28일에 세포는 최종 성숙을 위해 추가로 확장될 것이다(도 1b 및 9b 참조).
일부 구현양태에서, hPSC는, 예를 들어 약 14일 동안 50-2000 ng/ml Noggin 및 0.5-20 ng/ml FGF2로 2D 배양하여 신경 능선 형성을 유도하는 배양 배지(DMEM/F12와 신경기저 배지의 1:1 혼합물)로 배지 교체하여 hPSC를 분화할 수 있다. 14일 또는 약 14일에 세포를 5-100 ng/ml EGF 및 5-100 ng/ml FGF2와 함께 약 5일 동안 3D 배양으로 옮긴다. 19일 또는 약 19일에 후기 ONP를 생성하기 위해 세포를 분화 인자인 FGF2, 푸르모르파민(0.1-1 μM), EGF, 레티노산(RA 0.2-2μM) 및 IGF1(50 ng/ml)을 사용한 2D 배양으로 다시 전환한다. 동적 배양은 약 7일 동안 계속되며 약 2-3일마다 배지를 교체한다. 25일 또는 약 25일에 후기 ONP 세포를 수확하여 작은 집합체를 형성하기 위해 FGF 및 EGF와 Rock 억제제(2-50 μM) 존재 하에서 약 3일 동안 단일 세포로 동적 현탁액에 접종한다.
hPSC는 성장 인자 및 성장 인자 억제제를 포함하는 다양한 상이한 배지에서의 배양을 통해 상이한 세포 집단으로 분화될 수 있다. 일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포는 청각 세포 집단, 예를 들어 NNE, PPE, ONP 세포, 뉴런(예를 들어, 나선형 신경절 뉴런) 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 집단을 포함하는 조성물을 생산하기 위해 유도된 분화에 충분한 조건에 적용된다. 일부 구현양태에서, 방법은 세포 집단을 세포의 집단을 표적 세포 유형으로 유도하기에 충분한 조건하에 성장 인자 및/또는 성장 인자 억제제의 조합을 포함하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 배양 배지에서 hPSC 집단을 배양하여 표적 세포 유형을 포함하는 세포 집단을 생성하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 임의로 단층에 1,200-20,000개의 살아있는 세포/cm2의 밀도로 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 시딩하고, 세포 배양 배지 중 락테이트 농도가 1.68-12.29 mM 및 5-80%의 합류율에 도달할 때까지 세포를 배양하는 것으로 시작된다. 일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포는 세포 배양 배지 내 락테이트 농도가 약 1.0-13.0 mM, 또는 약 1.5-12.5 mM이 될 때까지 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포는 세포 배양 배지 내 락테이트 농도가 약 1.68-12.29 mM이 될 때까지 배양된다. 일부 구현양태에서, 합류율은 5%-90% 사이, 5%-85% 사이, 또는 5%-80% 사이이다.
일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포 집단은 골 형성 단백질 4(BMP4) 및 4-[4-(2H-1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542)를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4, SB431542, 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함한다.
일부 구현양태에서, 미분화 다능성 줄기 세포(PSC)의 집단은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 15일 또는 적어도 20일 동안 표적 세포 유형, 예를 들어 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포로의 분화를 생성하기에 충분한 조건 하에서 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 적어도 1일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 적어도 4일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 적어도 5일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 적어도 7일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 약 1-20일, 1-9일, 2-10일, 3-7일, 또는 4-6일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 약 1-9일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, PSC 집단은 약 3-7일 동안 제1 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지에서 미분화 PSC 집단을 배양하는 것은 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 포함하는 세포 집단을 생성한다.
일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지에서 PSC를 배양함으로써 생성된 세포 집단, 예를 들어 NNE 세포를 포함하는 세포 집단은 SB431542, 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP-2) 및 4-{6-[4-(피페라진-1-일)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일}퀴놀린(LDN193189)을 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 15일, 또는 적어도 20일 동안 표적 세포 유형, 예를 들어 전-기원판 외배엽(PPE) 세포로의 분화를 생성하기에 충분한 조건 하에서 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 4일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 5일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 6일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 7일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 1-20일, 1-9일, 2-10일, 3-7일, 또는 4-6일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 1-9일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 3-7일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 5일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 6일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 7일 동안 제2 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지에서 세포 집단을 배양하면 PPE 세포를 포함하는 세포 집단이 생성된다.
일부 구현양태에서, 제2 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 생산된 세포 집단, 예를 들어 PPE 세포를 포함하는 세포 집단은 6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노)니코티노니트릴(CHIR99021), FGF2 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1))을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 15일, 또는 적어도 20일 동안 표적 세포 유형, 예를 들어 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포로의 분화를 생성하기에 충분한 조건 하에서 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 4일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 5일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 7일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 5일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 7일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 9일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 1-20일, 1-10일, 1-17일, 2-10일, 3-7일 또는 4-6일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 3-10일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 5-9일 동안 제3 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지에서 세포 집단을 배양하면 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단이 생성된다.
일부 구현양태에서, 제3 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 생산된 세포 집단, 예를 들어, 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단은 소닉 헤지호그(SHH), 레티노산(RA), 표피 성장 인자(EGF), FGF2 및 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 9일, 적어도 11일, 적어도 15일, 또는 적어도 20일 동안 표적 세포 유형, 예를 들어 중-후기 ONP 세포로의 분화를 생성하기에 충분한 조건 하에서 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 4일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 5일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 7일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 5일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 7일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 9일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 1-20일, 1-10일, 1-17일, 2-10일, 3-7일 또는 4-6일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 3-10일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 5-9일 동안 제4 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지에서 세포 집단을 배양하면 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단이 생성된다.
일부 구현양태에서, 제3 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 생산된 세포 집단, 예를 들어, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단은 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT3) 및 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 배양된다.
일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일, 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일 또는 적어도 100일 동안 표적 세포 유형, 예를 들어 후기 ONP 세포로의 분화를 생성하기에 충분한 조건 하에서 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 1일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 10일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 20일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 30일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 45일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 적어도 60일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 약 1-65일, 1-60일, 1-50일, 1-40일, 1-20일, 7-65일, 5-50일, 10-40일, 10-30일, 10-20일, 20-60일, 20-50일, 20-45일 또는 30-45일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 7-65일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 3-45일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 10-60일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포 집단은 20-45일 동안 제5 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지에서 세포 집단을 배양하면 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단이 생성된다.
일부 구현양태에서, 배양 배지에서 세포 집단을 배양하는 것은 (i) 제4 세포 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 생산된 세포 집단, 예를 들어 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 수확하는 단계; (ii) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 세포 집단을 시딩하는 단계; (iii) 세포 집단을 배양하는 단계; (iv) 세포 집단을 수확하는 단계; (v) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 세포 집단을 시딩하는 단계; 및 (vi) 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서 제5 세포 배양 배지는 ROCK 억제제를 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포는 단계 (iii)에서 5-35일, 7-35일, 7-30일, 또는 10-25일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포는 단계 (iii)에서 7-35일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포는 단계 (vi)에서 7-30일, 10-30일, 또는 15-25일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 세포는 단계 (vi)에서 7-30일 동안 배양된다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 단계 (iii)은 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에서 세포 집단을 적어도 1일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일 또는 적어도 70일 동안 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 상기 기재된 단계 (vi)는 세포 집단을 적어도 1일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일 동안 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 약 1 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 또는 약 40 ng/mL의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 약 1 ng/mL-40 ng/mL, 1 ng/mL-25 ng/mL, 5 ng/mL-30 ng/mL, 또는 10 ng/mL-15 ng/mL의 농도로 BMP4를 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 1 ng/mL-40 ng/mL 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 1 ng/mL-25 ng/mL 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 5 ng/mL-30 ng/mL 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 10 ng/mL-15 ng/mL 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 약 10 ng/mL의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 약 5 ng/mL의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 세포 배양 배지는 BMP4를 약 20 ng/mL의 농도로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 5 μM, 약 10 μM, 약 15 μM, 또는 약 20 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 약 0.1μM -20μM, 0.1-10 μM, 5 μM-15 μM, 또는 7 μM-13 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 1 μM-20 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 5 μM-15 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 0.1 μM-10 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지는 SB431542를 약 1 μM의 농도로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 약 1 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 또는 약 40 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 약 1 ng/mL-40 ng/mL, 1 ng/mL-30 ng/mL, 1 ng/mL-25 ng/mL, 5 ng/mL-30 ng/mL, 5 ng/mL-15 ng/mL, 또는 10 ng/mL-15 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 1 ng/mL-40 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 1 ng/mL-25 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 10 ng/mL-15 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지는 FGF2를 약 10 ng/mL의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IWP-2를 약 0.5 μM, 1 μM, 약 2 μM, 약 3 μM, 약 5 μM, 또는 약 10 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IWP-2를 약 0.5 μM-20 μM, 0.5 μM-10 μM, 1 μM-10 μM, 1 μM-5 μM, 2 μM-7 μM, 또는 3 μM-5 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IWP-2를 약 0.5 μM-10 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IWP-2를 약 2 μM-4 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IWP-2를 약 2 μM의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 약 10 nM, 약 50 nM, 약 100 nM, 약 150 nM, 약 200 nM, 약 250 nM, 약 300 nM, 약 350 nM, 약 400 nM, 약 450 nM, 약 500 nM, 약 550 nM, 또는 약 600 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 약 1 nM-600 nM, 50 nM-500 nM, 75 nM-200 nM, 100 nM-400 nM, 또는 200 nM-300 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 1 nM-600 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 50 nM-500 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 20 nM-400 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 75 nM-150 nM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제2 세포 배양 배지는 LDN193189를 약 100 nM의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 약 1 μM, 약 5 μM, 약 6 μM, 약 7 μM, 약 10 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 30 μM 또는 약 40μM의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 약 1 μM-40 μM, 1 μM-30 μM, 1 μM-25 μM, 5 μM-20 μM, 2 μM-10 μM, 또는 5 μM-15 μM의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 1 μM-40 μM의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 1 μM-25 μM의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 2μM-8μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3 세포 배양 배지는 CHIR99021을 약 6 μM의 농도로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 약 1 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 150 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 250 ng/mL, 또는 약 300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 1 ng/mL-300 ng/mL, 20 ng/mL-200 ng/mL, 5 ng/mL-100 ng/mL, 25 ng/mL-300 ng/mL, 또는 40 ng/mL-100 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 1 ng/mL-300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 25 ng/mL-300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 5 ng/mL-100 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지는 IGF-1을 약 50 ng/mL의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 약 10 ng/mL, 30 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 300 ng/mL, 약 500 ng/mL, 약 600 ng/mL, 약 700 ng/mL, 약 800 ng/mL, 약 900 ng/mL, 약 1000 ng/mL, 약 1100 ng/mL, 약 1200 ng/mL, 또는 약 1300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 10 ng/mL-1300 ng/mL, 50 ng/mL-1000 ng/mL, 300 ng/mL-1000 ng/mL, 또는 400 ng/mL-600 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 10 ng/mL-1300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 300 ng/mL-1000 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 400 ng/mL-600 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 SHH를 약 500 ng/mL의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 RA를 약 0.1 μM, 약 0.2 μM, 약 0.3 μM, 약 0.5 μM, 약 1 μM, 약 2 μM, 약 3 μM, 약 5 μM, 약 10μM, 약 15μM, 또는 약 20μM의 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 배양 배지는 RA를 0.1 μM-20 μM, 0.1 μM-5 μM, 0.5 μM-5 μM, 0.2 μM-5 μM, 또는 0.5 μM-2 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 RA를 0.1 μM-20 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 RA를 0.2 μM-5 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 RA를 0.2 μM -2 μM 농도로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 RA를 약 0.5 μM의 농도로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 EGF를 약 5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 150 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 250 ng/mL, 또는 약 300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 EGF를 1 ng/mL-300 ng/mL, 10 ng/mL-200 ng/mL, 20 ng/mL-300 ng/mL, 5 ng/mL-100 ng/mL 또는 10 ng/mL-50 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 EGF를 1 ng/mL-300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 EGF를 5 ng/mL-100 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 EGF를 10 ng/mL-50 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제4 세포 배양 배지는 약 20 ng/mL의 양으로 EGF를 포함한다.
일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 약 5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 150 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 250 ng/mL, 또는 약 300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 1 ng/mL-300 ng/mL, 5 ng/mL-200 ng/mL, 5 ng/mL- 100 ng/mL, 또는 5 ng/mL-50 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 1 ng/mL-300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 5 ng/mL-100 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 5 ng/mL-30 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 BDNF를 약 10 ng/mL의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 뉴로트로핀 3(NT3, NT-3 및 NTF3으로도 지칭됨)을 포함한다. NT3은 포유류 뉴런의 생존과 분화에 관여하는 뉴로트로핀 계열의 구성원이다. NT3는 성인 신경계의 유지와 배아의 뉴런 발달에 관여하는 것으로 생각된다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 약 5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 150 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 250 ng/mL, 또는 약 300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 1 ng/mL-300 ng/mL, 5 ng/mL-200 ng/mL, 5 ng/mL-100 ng/mL, 또는 5 ng/mL-50 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 1 ng/mL-300 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 5 ng/mL-100 ng/mL의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 5 ng/mL-30 ng/mL의 양으로 NT3을 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 NT3을 10 ng/mL의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 Rock 억제제, 예를 들어 ROCK1 및/또는 ROCK2 매개 신호전달을 억제하는 소분자 억제제를 포함한다. 일부 구현양태에서, Rock 억제제는 Y-27632 디히드로클로라이드(트랜스-4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐시클로헥산카복스아미드 디히드로클로라이드)를 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 Rock 억제제를 약 0.5 μM, 1.0 μM, 1.5 μM, 2.0 μM, 3.0 μM, 5 μM, 7 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 15 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM 또는 60 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 Rock 억제제를 약 0.5 μM-60 μM, 1 μM-50 μM, 2 μM-50 μM, 1 μM-30 μM, 2 - μM, 5 μM-20 μM, 1 μM-15 μM 또는 5 μM-15 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 Rock 억제제를 약 2 μM-50 μM의 양으로 포함한다. 일부 구현양태에서, 제5 세포 배양 배지는 Rock 억제제를 약 10 μM의 양으로 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 (a) 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 1-25 ng/mL 농도의 BMP4 및 0.1-10 μM 농도의 SB431542를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 0.1-10 μM 농도의 SB431542, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 0.5-10 μM 농도의 IWP-2 및 20-400 nM 농도의 LDN193189를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 단계 (c) 1-25 μM 농도의 CHIR99021, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 5-9일 동안 배양하여 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 50-1000 ng/mL 농도의 SHH, 0.2-2 μM 농도의 RA, 5μM-100 ng/mL 농도의 EGF, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 5-9일 동안 배양하여 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; (e) 5-100 ng/mL 농도의 BDNF, 5-100 ng/mL 농도의 NT3, 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1를 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 3-45일 동안 배양하여 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (f) 후기 ONP를 포함하는 세포 집단을 수집하여 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 대안적인 구현양태에서, 단계 (a)의 제1 세포 배양 배지는 1-25 ng/mL 농도의 BMP4 및 0.1-10 μM 농도의 SB431542를 포함하고, FGF2를 포함하지 않는다.
일부 구현양태에서, 방법은 (a) BMP4 및 SB431542 및 FGF2를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE)을 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; (b) SB431542, FGF2, IWP-2 및 LDN193189를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여, PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; 단계 (c) CHIR99021, FGF2 및 IGF-1을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에서 5-9일 동안 배양하여, 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; (d) SHH, RA, EGF, FGF2 및 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에서 5-9일 동안 배양하여 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; (e) BDNF, NT3 및 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 3-45일 동안 배양하여 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (f) 후기 ONP를 포함하는 세포 집단을 수집하여 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 대안적인 구현양태에서, 단계 (a)에서 제1 세포 배양 배지는 BMP4 및 SB431542를 포함하고, FGF2를 포함하지 않는다.
일부 구현양태에서, 방법은 (a) 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 1-25 ng/mL 농도의 BMP4 및 0.1-10μM 농도의 SB431542를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양하여 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 0.1-10 μM 농도의 SB431542, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 0.5-10 μM 농도의 IWP-2 및 20-400 nM 농도의 LDN193189를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양하여 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 1-25 μM 농도의 CHIR99021, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2, 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양하여 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 50-1000 ng/mL 농도의 SHH, 0.2-2 μM 농도의 RA, 5-100 ng/mL 농도의 EGF, 1-25 ng/mL 농도의 FGF2 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양하여, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (e) 5-100 ng/mL 농도의 BDNF, 5-100 ng/mL 농도의 NT3 및 5-100 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양하여, 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (f) 후기 ONP를 포함하는 세포 집단을 수집하여 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 대안적인 구현양태에서, 단계 (a)에서 제1 세포 배양 배지는 1-25 ng/mL 농도의 BMP4 및 0.1-10 μM 농도의 SB431542를 포함하고, FGF2를 포함하지 않는다.
일부 구현양태에서, 방법은 (a) 10 ng/mL 농도의 FGF2, 10 ng/mL 농도의 BMP4 및 1 μM 농도의 SB431542를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 3-7일 동안 배양하여 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 1 μM 농도의 SB431542, 10 ng/mL 농도의 FGF2, 및 2 μM 농도의 IWP-2와 100 nM 농도의 LDN193189를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 3-7일 동안 배양하여 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 6 μM 농도의 CHIR99021, 10 ng/mL 농도의 FGF2, 및 50 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 7일 동안 배양하여 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (d) 500 ng/mL 농도의 SHH, 0.5 μM 농도의 RA, 20 ng/mL 농도의 EGF, 10 ng/mL 농도의 FGF2 및 50 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 7일 동안 배양하여 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; (e) 10 ng/mL 농도의 BDNF, 10 ng/mL 농도의 NT3 및 50 ng/mL 농도의 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 3-45일 동안 배양하여, 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (f) 후기 ONP를 포함하는 세포 집단을 수집하여 조성물을 생산하는 단계를 포함한다. 대안적인 구현양태에서, 단계 (a)에서 제1 세포 배양 배지는 10 ng/mL 농도의 BMP4 및 1 μM 농도의 SB431542를 포함하고, FGF2를 포함하지 않는다.
일부 구현양태에서, 위에 기술된 방법 중 어느 하나는 단계 (a) 전에 미분화 다능성 줄기 세포를 단층에 1,200-20,000개의 살아있는 세포/cm2의 밀도로 시딩하고, 세포를 세포 배양 배지의 락테이트 농도가 1.68-12.29 mM에 및 합류율이 5-80%에 도달할 때까지 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 상기 기재된 방법 중 어느 하나는 후기 ONP를 포함하는 세포 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함한다.
당업자는 상기 기재된 임의의 단계에서, 생성된 세포 집단이 동결보존될 수 있고, 이어서 분화 과정의 다음 단계에 적합한 배양 배지에 시딩 및 배양될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
치료 방법
청각 장애가 있거나 발병할 위험이 있는 대상체을 치료하는 방법도 기재되어 있으며 이는 본 발명의 범위 내에 속한다. 청각 장애에는 전음성 청력 상실, 감각신경성 청력 상실, 혼합성 청력 상실, 청각 신경병증 스펙트럼 장애, 중추 청력 상실, 중추 청각 처리 장애 및 이명이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 방법은 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 세포 집단을 대상체의 귀에 투여하는 것을 포함한다. 투여된 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 수득될 수 있고, 출발 물질은 치료할 대상체로부터 수득된 조직일 수 있다. 다른 구현양태에서, 방법은 내이 내의 세포 내 청각 단백질의 발현을 촉진하는 치료제(예를 들어, 본원에 기술된 분화제)를 투여하는 단계를 포함한다. 사용되는 경우, 분화제는 배양 중인 세포에 투여될 수 있거나, 단독으로(대상체의 내이 내 줄기 세포 또는 전구체 세포의 분화를 자극하기 위해) 또는 미분화 세포(예를 들어, 본원에 설명된 방법에 따라 분리된 미분화 세포)와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 분화제는, 예를 들어 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)의 작용제 또는 푸르모르파민(예를 들어 Hh-Ag1.3)과 같은 헤지호그 경로의 작용제일 수 있다.
내이 장애가 있거나 그러한 장애가 발생할 위험이 있는 대상체는 본원에 기술된 청각 세포로 치료될 수 있다. 성공적인 생착에서는, 예를 들어 적어도 일부 이식된 나선형 신경절 뉴런이 유모 세포 및 달팽이관 핵의 표적과 시냅스 접촉을 형성할 것이다. 세포의 생착 능력을 향상시키기 위해, 분화 전에 줄기 세포를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 세포는 전구세포 또는 분화된 세포에서 하나 이상의 항-아폽토시스 유전자를 과발현하도록 조작될 수 있다. Fak 티로신 키나제 또는 Akt 유전자는 이러한 목적에 유용할 수 있는 후보 항-아폽토시스 유전자이고; FAK 또는 Akt의 과발현은 나선형 신경절 세포에서 세포 사멸을 방지하고 코르티의 외식된 기관과 같은 다른 조직에 이식될 때 생착을 촉진할 수 있다(예를 들어, Mangi et al., Nat. Med. 9:1195-201, 2003 참조). 알파.sub.v.베타.sub.3 인테그린을 과발현하는 신경 전구체 세포는 신경돌기를 조직 외식편으로 확장하는 향상된 능력을 가질 수 있는데, 이는 인테그린이 라미닌 기질 상의 나선형 신경절 뉴런으로부터 신경돌기 확장을 매개하는 것으로 나타났기 때문이다(Aletsee et al., Audiol. Neurootol. 6:57-65, 2001). 다른 예에서, 에프린B2 및 에프린B3 발현은 EphA4 신호전달 이벤트를 변형하기 위해 RNAi로 침묵시키거나 외인성으로 발현된 cDNA로 과발현시켜 변경될 수 있다. 나선형 신경절 뉴런은 에프린-B2 및 -B3의 세포 표면 발현에 의해 매개되는 EphA4로부터의 신호에 의해 유도되는 것으로 나타났다(Brors et al., J. Comp. Neurol. 462:90-100, 2003). 이 유도 신호의 비활성화는 성인 내이의 표적에 도달하는 뉴런의 수를 증가시킬 수 있다. 뉴로트로핀 BDNF, NT3 및 LIF와 같은 외인성 인자를 조직 이식에 첨가하여 신경돌기의 확장과 생체내 및 생체외 조직 배양에서 표적 조직을 향한 신경 돌기의 성장을 향상시킬 수 있다. 감각 뉴런의 신경돌기 확장은 뉴로트로핀(BDNF, NT3) 및 LIF의 첨가에 의해 향상될 수 있다(Gillespie et al., NeuroReport 12:275-279, 2001). 소닉 헤지호그(Shh) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편(예를 들어, SHH-N)은 또한 신경돌기 확장을 향상시키는 내인성 인자로서 유용할 수 있다. Shh는 내이의 발달 조절제이자 축삭의 화학유인물질이다(Charron et al., Cell 113:11 23, 2003).
청력 상실을 겪고 있거나 발병할 위험이 있는 대상체은 본원에 설명된 치료 방법의 후보자이다. 예를 들어, 대상체는 분화제에 대한 노출에 의해 생성된 내이 유모 세포 또는 나선형 신경절 세포의 이식을 받을 수 있거나, 줄기 세포를 내이 세포로 분화시킬 수 있는 것으로 확인된 제제를 대상체에게 투여할 수 있다. 청력 상실이 있거나 발생할 위험이 있는 대상체은 평균적인 대상체보다 잘 들을 수 없거나 청력 상실을 경험하기 전의 대상체보다 덜 잘 들을 수 있다. 예를 들어, 청력은 적어도 5, 10, 30, 50% 이상 감소할 수 있다. 대상체는 귀의 감각 부분(달팽이관)이나 신경 부분(청신경)의 손상이나 기능 장애로 인해 발생하는 감각신경성 청력 상실, 또는 외이 및/또는 중이의 막힘 또는 손상으로 인한 전음성 청력 상실을 가질 수 있거나 또는 전음성 경로(외이 또는 중이)와 신경 경로(내이) 모두에 문제가 있어 발생하는 혼합성 청력 상실을 가질 수 있다. 혼합성 청력 상실의 예로는 중이 감염으로 인한 전음성 상실과 노화와 관련된 손상으로 인한 감각신경성 상실이 있다.
대상체은 어떤 이유로든 또는 어떤 유형의 사건의 결과로든 난청이 있거나 청력 상실을 가질 수 있다; 예를 들어, 대상체는 유전적 또는 선천적 결함으로 인해 태어날 때부터 난청이었을 수도 있고, 유전적 또는 선천적 결함으로 인한 점전적인 청력 상실의 결과로 귀머거리이거나 난청일 수도 있다. 다른 예에서, 대상체는 귀 구조에 대한 신체적 외상, 갑작스러운 큰 소음, 또는 큰 소음에 장기간 노출과 같은 외상적 사건의 결과로 귀머거리 또는 난청이 될 수 있다. 예를 들어, 콘서트장, 공항 활주로 및 건설 현장에 장기간 노출되면 내이 손상 및 그에 따른 청력 상실이 발생할 수 있다. 대상체는 화학적-유발된 이독성을 경험할 수 있으며, 이독소에는 항종양제, 살리실레이트, 퀴닌 및 아미노글리코사이드 항생제를 포함한 치료 약물, 식품 또는 의약품의 오염물질, 환경 또는 산업 오염물질이 포함된다. 대상체는 노화로 인해 청각 장애를 겪을 수도 있고, 이명(귀울림을 특징으로 함)을 겪을 수도 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물 및 방법에 적합한 대상체에는 양측성 및 일측성 전정 기능 장애를 포함하는 전정 기능 장애가 있는 대상체가 포함될 수 있다. 전정 기능 장애는 어지럼증, 불균형, 현기증, 메스꺼움, 흐릿한 시야 등의 증상을 특징으로 하는 내이 기능 장애이며 청력 문제, 피로 및 인지 기능 변화를 동반할 수 있다. 전정 기능 장애는 유전적 또는 선천적 결함으로 인해 발생할 수 있고; 바이러스 또는 박테리아 감염과 같은 감염; 또는 외상성 또는 비외상성 부상과 같은 부상의 결과일 수 있다. 전정 기능 장애는 장애의 개별 증상(예를 들어, 현기증, 메스꺼움, 흐릿한 시력)을 측정하여 가장 일반적으로 테스트된다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 감각신경 유모 세포 상실 또는 청각 신경병증으로 인한 청각 장애의 치료에 사용될 수 있다. 청각 신경병증을 앓고 있는 대상체는 달팽이관 감각 뉴런의 상실을 경험하지만 내이의 유모세포는 그대로 유지된다. 그러한 대상체는 세포(줄기 세포 또는 전구체 세포)가 나선형 신경절 세포로 분화되도록 하는 치료, 또는 나선형 신경절 세포를 내이로 투여함으로써 특히 이익을 얻을 것이다. 감각신경성 유모 세포 상실이 있는 대상체는 달팽이관 유모 세포의 변성을 경험하며, 이는 유모 세포 상실 영역에서 나선형 신경절 뉴런의 상실을 자주 초래한다. 이러한 대상체는 코르티 기관의 지지 세포 상실, 측두골 물질의 윤부, 나선형 인대 및 혈관조의 퇴화를 경험할 수도 있다. 이러한 대상체는 세포가 유모 세포로 분화되도록 하는 제제로 치료를 받거나, 내이에 생착되거나 주사된 유모 세포를 포함하는 조직 이식을 받을 수 있다. 대상체는 세포가 나선형 신경절 세포로 분화되도록 하는 치료, 또는 나선형 신경절 세포를 내이로 투여하는 것으로부터 추가로 이익을 얻을 수 있다. 예를 들어, 기계적 압박으로 인한 청각 신경 퇴행의 경우, 대부분의 청각 나선형 신경절 세포는 로젠탈관의 지속적인 압박에 따라 퇴화(달팽이관 핵 세포의 신경세포 사멸 유발)하고, 성상세포 및 슈반 세포주와 함께 연속적인 "자연 발생적 자가 세포 브리지"을 형성하며, 이는 PNS와 CNS 사이를 연결하기 위해 생착된 세포 이동을 위한 해부학적 스캐폴드 역할을 한다(Sekiya et al. 2021 Cell Transplantation Volume 30: 1-20).
일부 구현양태에서, 본원에 제공된 방법은 이를 필요로 하는 대상체의 청각 뉴런을 교체하기 위한 방법이다. 일부 구현양태에서, 본원에 제공된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 존재하지만 손상된 청각 뉴런 집단을 증대시키는 방법이다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 청각 세포는 세포 현탁액의 형태로, 예를 들어 주사에 의해 달팽이관의 내강 또는 망막 경로를 통한 청각 신경과 같은 내이 또는 중이 내에 상에 또는 근처에 투여될 수 있다. 주사는 예를 들어 귀의 와우창을 통해 또는 달팽이관을 둘러싼 뼈 캡슐을 통해 이루어질 수 있다. 세포는 하기에 기술된 것처럼 와우창을 통해 내이도의 청신경 줄기 또는 고실계에 주입할 수 있다. 본원에 기술된 청각 세포의 투여는 예를 들어, 본원에 기술된 청각 또는 청력 상실 상태의 치료를 위해, 예를 들어 내이 또는 중이의 원하는 표적 해부학적 구조에 대한 바늘의 탐색 및 위치를 제어할 수 있는(예를 들어, 수동으로 또는 로봇 인터페이스를 통해) 능력을 갖는 당업자에게 알려진 주사 바늘 또는 주사기 위치 지정 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 청각 세포의 농도 또는 부피의 전달을 보장하기 위해 일정 기간 동안 청각 세포의 안전하고 효과적인 전달을 용이하게 하는 데 필요한 안정화를 포함한다. 투여의 예시적인 경로는, 예를 들어 otosurgeryatlas.stanford.edu/otologic-surgery-atlas/cochlear-implantation/cochlear-implant-surgical-variations/에 기술되어 있다.
예를 들어, 달팽이관 절개술에 의한 고실계에 대한 투여의 예시적인 경로에서, 달팽이관 기저부의 미로골낭(Otic capsule)을 통해 작은 구멍이 뚫어 캐뉼라를 수용한다. 구멍은 작은 근막 조각으로 덮여 있다. 세포를 30G 캐뉼라에 로딩하고 식염수로 프라이밍하고 약 1 μL 공기로 흡인한 후 조성물을 흡인한다. 세포는 펌프를 사용하여 고실계에 약 1 μL/분의 속도로 주입된다. 두 번째 예시적인 투여 경로에서, 달팽이관절개술은 미로골낭을 통해 수행한다. 치과용 드릴을 사용하여 33G의 니즈와 캐뉼라를 모디올러스에 삽입할 수 있는 구멍을 만든 다음 구멍 천공을 통해 모디올러스의 뼈 벽을 통과시킨다. 구멍은 작은 근막 조각으로 덮는다. 상기에서 기술한 대로 세포를 캐뉼라에 로딩하고 모디올러스에 주입한다. 캐뉼라는 유체가 평형을 이루도록 약 10분 동안 제자리에 둔다. 대안적으로, 본 개시내용의 조성물은 와우창을 통해 전달될 수 있다. 먼저 와우창을 노출시킨 후 와우창 점막을 제거하거나 절개하고 뼈가 있는 돌출부를 드릴링한다. 와우창을 통해 캐뉼라를 고실계 또는 모디올러스로 유도하고, 상기에서 기술한 대로 세포를 투여한다.
따라서, 본 개시내용은 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 청각 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서: (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하며; 여기서 조성물은 대상체의 내이 또는 중이에 투여된다. 일부 구현양태에서, 방법은 (a) 집단 내 세포의 30% 이상의 세포가 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고; (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고; (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고; (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및 (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 방법은 대상체에게 약 100,000 내지 5000만개 세포, 약 100,000 내지 1000만개 세포, 약 100,000 내지 100만개 세포, 약 200,000 내지 1000만개 세포, 약 500,000 내지 100만개 세포, 또는 약 100,000 내지 500,000개의 세포를 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현양태에서, 본원에 기술된 조성물의 투여는 대상체의 청각 질병 또는 상태의 징후 또는 증상을 완화시킨다. 일부 구현양태에서, 방법은 대상체의 청력을 개선하고, 청력 상실의 중증도를 완화하며, 청력 상실의 진행을 지연시키고, 청력 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 완화시킨다.
본원에 기술된 청각 세포의 투여는, 예를 들어 이식된 감각 뉴런의 부착 및 통합을 향상시킬 수 있는 매트릭스 성분, 혈청 성분 또는 생분해성 스캐폴드와 같은 코팅 물질의 사전 주입에 의해 달성되어, 본원에 기술된 청각 세포의 농도 또는 부피의 전달을 보장할 수 있다. 세포 생성물은 플라스틱, 유리, 기타 중합체 또는 고무 및 고리형 올레핀 공중합체와 같은 플라스틱 공중합체로 만들어진 냉동바이알에 동결보존될 수 있다. 바이알은 세포 생성물을 전달 장치로 무균적으로 전달할 수 있도록 열가소성 엘라스토머와 같은 고무 및 플라스틱 공중합체로 만들어진 나사 캡이나 마개로 밀봉될 수 있다. 세포 생성물은 주사기, 주사기 카트리지 또는 주사 캐뉼러 내에 사전로딩되어 동결보존될 수 있으며, 이는 대상체에게 투여하기 전에 해동된다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 본원에 기재된 마커를 발현하는 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 당업자는 본원에 기술된 조성물이 세포 유형의 혼합된 집단을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이며, 그의 신원은 본원에 기술된 마커 중 하나 이상을 발현하는 집단 내 세포의 백분율 중 세포의 백분율로 반영된다. 집단내의 개별 세포는 세포의 분화 상태에 따라 하기에 기술된 단일 마커만을 발현할 수 있거나, 개별 세포는 하기에 기술된 마커의 조합을 발현할 수 있다. 집단에서 세포는 PAX2, PAX8 및/또는 SOX2와 같은 네스틴 ONP 마커, β 튜불린 III과 같은 뉴런성 마커, TrkB 및/또는 GluA4와 같은 청각 뉴런 마커, Myo7A와 같은 비-특이적 뉴런성 마커 또는 TRA-1-60 및/또는 SSEA5와 같은 hESC 마커 등의 신경 전구체 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 SOX2를 발현하고; 집단 내의 세포는 β 튜불린 III을 발현하고; 집단의 세포는 TrkB를 발현하고; 집단의 세포는 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 SOX2를 발현하고; 집단 내의 세포는 PAX2를 발현하고; 집단 내의 세포는 β 튜불린 III을 발현하고; 집단 내의 세포는 TrkB를 발현하고; 집단 내의 세포는 GluA4를 발현하고; 집단 내의 세포는 Myo7A를 발현하고; 임의로 집단 내의 세포는 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 네스틴을 발현한다. 네스틴은 중간 필라멘트 단백질 계열의 구성원이며 뉴런에서 발현된다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 80% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 90% 이상이 네스틴을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 내지 95%, 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 30% 내지 60%가 네스틴을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 SOX2를 발현한다. SOX2는 배아 발달 조절 및 세포 운명 결정에 관여하는 전사 인자의 SRY-관련 HMG-박스(SOX) 계열 구성원을 코딩한다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 80% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 90% 이상이 SOX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 내지 95%, 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 30% 내지 60%가 SOX2를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 PAX8을 발현한다. PAX8은 쌍을 이루는 박스 도메인, 옥타펩티드 및 쌍을 이루는-유형 호메오도메인 도메인을 함유하는 쌍을 이루는 박스 계열 전사 인자의 구성원을 코딩한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 PAX8을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 내지 60%, 1% 내지 50%, 0.1% 내지 30%, 1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 또는 5% 내지 8%가 PAX8을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 Six1을 발현한다. Six1은 염색체 14의 관련 유전자 클러스터에서 발견되는 호메오박스 단백질 유전자이고 사지 발달에 관여하는 것으로 생각된다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 80% 이상이 Six1을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 내지 95%, 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 30% 내지 60%가 Six1을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 PAX2를 발현한다. PAX2는 쌍을 이루는 박스 유전자 2를 코딩하며 종양 억제 유전자 WT1에 의한 전사 억제 표적이다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 80% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 90% 이상이 PAX2를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 내지 99%, 20% 내지 95%, 30% 내지 80%, 40% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%가 PAX2를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 GluA4를 발현한다. GluA4는 뇌의 흥분성 신경전달물질 분비 뉴런에서 발현되는 글루타메이트 수용체를 코딩하며 다양한 정상적인 신경생리학적 과정에서 활성화된다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포의 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 90% 이상이 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 내지 99%, 10% 내지 95%, 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 60%, 또는 20% 내지 50%가 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 약 10% 내지 95%가 GluA4를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 내지 90가 GluA4를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 CD133을 발현한다. CD133은 막 돌출부에 위치하며 종종 성체 줄기 세포에서 발현되는 펜타스팬 막횡단 당단백질을 코딩하며 분화를 억제하여 줄기 세포 특성을 유지하는 기능을 한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 셀의 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 70% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 80% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 90% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 95% 이상이 CD133을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 내지 99%, 10% 내지 95%, 20% 내지 90%, 30% 내지 80%, 또는 40% 내지 70%가 CD133을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 GATA3을 발현한다. GATA3는 T-세포 발달의 조절인자이며 내피 세포 생물학에서 역할을 한다. GATA3에서 결함은 감각신경성 난청을 동반한 부갑상선 기능저하증의 원인이다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만이 GATA3을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 GATA3을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 GATA3을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 미만이 GATA3을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 1%가 GATA3을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 β 튜불린 III(β III 튜불린 또는 베타 3 튜불린 등으로도 지칭됨)을 발현한다. β 튜불린 III은 이종이량체화 및 조립되어 미세소관을 형성하는 베타 튜불린 단백질 계열의 구성원을 코딩한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 80% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 50% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 β 튜불린 III을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 내지 80%, 10% 내지 70%, 30% 내지 60%, 또는 40% 내지 50%가 β 튜불린 III을 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 트로포미오신-관련 키나제 수용체 B(TrkB)를 발현한다. TrkB는 신경계 발달에 관여하며 뇌-유래 신경영양 인자 결합 활성 및 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)-활성화 수용체 활성을 가능하게 한다. 일부 구현양태에서 집단 내 세포의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 60% 이상이 TrkB를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 내지 80%, 10% 내지 70%, 20% 내지 50%, 또는 30% 내지 40%가 TrkB를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 트로포미오신-관련 키나제 수용체 C(TrkC)를 발현한다. TrkC는 신경발생, 뉴헌성 활동 전위 전파를 포함한 여러 과정의 업스트림 또는 내부에서 작용하며 GPI-연결 에프린 수용체 활성; 뉴로트로핀(NT3) 결합 활성; 및 p53 결합 활성을 포함한 여러 기능을 활성화할 것으로 예상된다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만이 TrkC를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 TrkC를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 TrkC를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 미만이 TrkC를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.01% 내지 10%, 0.01% 내지 5%, 또는 0.01% 내지 1%가 TrkC를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 뇌 특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3a(BRN3A)를 발현한다. BRN3A는 DNA 결합 활동; DNA-결합 전사 활성제 활성을 포함한 여러 기능을 가능하게 하며 신경계 발달에 관여한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만이 BRN3A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 BRN3A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 BRN3A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 미만이 BRN3A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 1%가 BRN3A를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 Myo7A를 발현한다. MYO7A에서 돌연변이는 난청 및 실명 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Myo7A는 신경계에서 발현되고, 단백질 도메인 특이적 결합 활성을 가능하게 하며, 기관 형태 형성을 포함한 여러 과정의 업스트림 또는 내에서 작용한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 30% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 20% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 미만이 Myo7A를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 내지 40%, 1% 내지 30%, 5% 내지 20%, 또는 10% 내지 15%가 Myo7A를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA-5)을 발현한다. 미분화된 세포는 SSEA-5를 포함한 다양한 마커의 발현에 의해 식별될 수 있다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만이 SSEA-5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 SSEA-5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 SSEA-5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.1% 미만이 SSEA-5를 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.01% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 1%가 SSEA-5를 발현한다.
일부 구현양태에서, 집단 내의 세포는 T 세포 수용체 알파 유전자좌(TRA-1-60)를 발현한다. 미분화 세포는 TRA-1-60을 포함한 다양한 마커의 발현에 의해 식별될 수 있다. 일부 구현양태에서, 집단 내의 세포의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 세포가 TRA-1-60을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 5% 미만이 TRA-1-60을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 1% 미만이 TRA-1-60을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 중 0.1% 미만의 세포가 TRA-1-60을 발현한다. 일부 구현양태에서, 집단 내 세포의 0.01% 내지 10%, 0.1% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 1%가 TRA-1-60을 발현한다.
일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
일부 구현양태에서, (a) 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현하고; (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고; (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고; (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고; (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고; (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및 (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현한다.
본원에 기술된 방법에 따라 수확한 후, 청각 세포의 확장된 집단은 특정 치료 용량(예를 들어, 세포 수)으로 제형화되고 병원으로 배송하기 위해 동결보존될 수 있다. 이어서, 투여 준비 완료된(ready to administer, RTA) 청각 세포 치료 조성물은 추가 가공 없이 해동 후 직접 투여될 수 있다. 동결보존에 적합한 배지의 예로는 90% 인간 혈청/10% DMSO, CRYOSTOR®, CRYOSTOR® CS10(10% DMSO), CRYOSTOR® CS5(5% DMSO), CRYOSTOR® CS2(2% DMSO), STEM-CELLBANKER®, PRIME XV® FREEZIS, HYPOTHERMASOL®, 트레할로스 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 구현양태에서, 동결보존 배지는 약 0.5% 내지 약 50% DMSO, 예를 들어 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50%를 포함한다. 구현양태에서, 동결보존 배지는 약 0.5% 내지 약 30% DMSO를 포함한다. 구현양태에서, 동결보존 배지는 약 1% 내지 약 20% DMSO를 포함한다.
일부 구현양태에서, 최종 세포 조성물은 담체, 세포 잔해 또는 매트릭스로부터 세포 집합체를 분리하기 위해 여과된 세포 집합체이다. 다른 구현양태에서, 세포는 동결보존 전에 단일 사용 필터, 세포 여과기 또는 기공 크기가 적어도 40μm, 약 50 μm, 약 70 μm, 약 100 μm, 약 60 μm인 메쉬를 사용하여 세포 집합체, 담체, 세포 잔해 또는 매트릭스로부터 단일 세포를 분리하기 위해 여과된다. 필터는 폐쇄 시스템 내에 있을 수 있다. 다른 구현양태에서, 세포 집합체, 담체, 세포 파편 또는 매트릭스로부터 단일 세포의 분리는 접선 흐름 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 여과 시스템은 100만개, 1천만개, 1억개, 10억개, 100억개, 1000억개 세포의 기공 I 양을 통해 단일 세포를 안전하게 여과할 수 있는 능력을 갖췄다. 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 여과 후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 생존율은 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다. 다른 구현양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 여과 후 세포의 회수율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 회수율은 인용된 범위 내의 모든 값이나 하위 범위일 수 있다.
대안적인 구현양태에서, 최종 세포 조성물의 세포는 현탁액 중의 단일 세포이다. 예를 들어, 생존 가능한 단일 세포를 생성하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본원에 기술된 집합체를 해리함으로써 조성물 중 단일 세포가 생성될 수 있다.
추가 구현양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 저장된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 후 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 다른 구현양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 저장된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 생존율은 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
다른 구현양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 저장된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장되고, 동결보존된 조성물의 해동 후 여과후 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 다른 구현양태에서, 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 저장된 후 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장되고, 동결보존된 조성물의 해동 후 여과후 세포의 회수율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 생존율은 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 구현양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 배지에 저장된 여과 후 청각 세포의 생존율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 일부 구현양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 여과 후 청각 세포의 생존율은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 추가 구현양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 용액에 저장된 후 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 후 여과후 청각 세포의 생존율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 다른 구현양태에서, 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 중화 용액에 저장된 후 실온에서 약 0 내지 약 8시간 동안 동결보존 배지에 저장된 후 여과후 청각 세포의 회수율은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%이다. 생존율은 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
해동 후 투여 준비 완료된(RTA) 적용에 적합한 동결보존 배지에 제형화된 청각 세포는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 물에 현탁된 청각 세포를 포함할 수 있다. 이러한 동결보존 배지의 예는 상표명 CryoStor®로 상업적으로 이용가능하며 BioLife Solutions, Inc.에서 제조된다. 일부 구현양태에서, 청각 세포 집합체는 체세포 핵 전달 및 세포질 내 정자 주입에 사용되며 최근 ONP 회전타원체에 사용되는 Sutter Xenowork 시스템과 같은 집합체 특이적 전달 시스템을 사용하여, 주입 준비가 완료된 생성물로서 CryoStem®과 같은 적합한 동결보존 배지에 집합체로 제형화된다(Heuer et al. 2020).
DMSO는 동결 보존 과정 동안 세포를 죽일 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지하기 위한 동결보호제로서 사용될 수 있다. 일부 구현양태에서, 동결보존 가능한 청각 세포 치료법 조성물은 약 0.1% 내지 약 2% DMSO(v/v)를 포함한다. 일부 구현양태에서, RTA 청각 세포 치료법 조성물은 약 1% 내지 약 20% DMSO를 포함한다. 일부 구현양태에서, RTA 청각 세포 치료법 조성물은 약 10% DMSO를 포함한다. 일부 구현양태에서, RTA 청각 세포 세포 치료법 조성물은 약 5% DMSO를 포함한다. 농도는 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
일부 구현양태에서, 해동 후 투여 준비 완료된(RTA) 적용에 적합한 동결보존 배지에 제형화된 청각 세포 치료법 조성물은 DMSO를 함유하지 않는 동결보존 배지에 현탁된 청각 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, RTA 감각 치료 세포 조성물은 DMSO(디메틸 설폭사이드, (CH3)2SO) 또는 기타 쌍극성 비양성자성 용매 없이 Trolox, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, H2PO4 -, HEPES, 락토비오네이트, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트란-40, 아데노신, 글루타티온에 현탁된 청각 세포를 포함할 수 있다. 이러한 동결보존 배지의 예는 상표명 HYPOTHERMOSOL® 또는 HYPOTHERMOSOL®-FRS로 상업적으로 이용가능하며 또한 BioLife Solutions, Inc.에서 제조된다. 다른 구현양태에서, 해동 후 투여 준비 완료된 적용에 적합한 동결 보존 배지로 제형화된 청각 세포 조성물은 트레할로스에 현탁된 청각 세포를 포함할 수 있다.
RTA 청각 세포 치료법 조성물은 임의로 청각 세포 생착, 통합, 생존, 효능 등을 지원하는 추가 인자를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, RTA 청각 세포 치료법 조성물은 본원에 기술된 청각 세포 제제의 기능 활성화제를 포함한다.
일부 구현양태에서, RTA 청각 세포 치료법 조성물은 자유 라디칼 소거, pH 완충, 종양성/삼투성 지지 및 이온 농도 균형 유지에 의해 동결 및 해동 과정 동안 분자 세포 스트레스를 감소시키는 성분을 포함하는 배지에 제형화될 수 있다.
일부 구현양태에서, 해동 후 투여 준비 완료된 적용에 적합한 동결보존 배지에 제형화된 청각 세포 치료법은 하나 이상의 면역억제 화합물을 포함할 수 있다. 특정 구현양태에서, 해동 후 투여 준비 완료된 적용에 적합한 동결보존 배지에 제형화된 청각 세포 치료법은 하나 이상의 면역억제 화합물의 서방성을 위해 제형화된 하나 이상의 면역억제 화합물을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 제형과 함께 사용하기 위한 면역억제 화합물은 다음과 같은 부류의 면역억제 약물에 속할 수 있다: 글루코코르티코이드, 세포증식 억제제(예를 들어, 알킬화제 또는 항대사제), 항체(다클론 또는 단클론), 면역필린에 작용하는 약물(예를 들어, 사이클로스포린, 타크로리무스 또는 시롤리무스). 추가 약물에는 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 마이코페놀레이트 및 소형 생물학적 제제가 포함된다. 면역억제제의 예에는 중간엽 줄기세포, 항-림프구 글로불린(ALG) 다클론 항체, 항-흉선세포 글로불린(ATG) 다클론 항체, 아자티오프린, BAS 1L1 X 1MABO(항-I L-2Ra 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), 다클리주맙(항-IL-2Ra 수용체 항체), 에베로리무스, 마이코페놀산, 리툭시맙(항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크로리무스 및/또는 마이코페놀레이트 모페틸이 포함된다.
구현양태에서, 약제학적 조성물은 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주사에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태, 예를 들어 방부제가 첨가된 앰플 또는 다회 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수와 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 이전에 기재된 제형에 더하여, 조성물은 또한 데포 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 지속성 제제는 이식(예를 들어, 피하)으로 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화되거나, 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 성질은 투여 방식에 따라 다르며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본원에 기술된 약제학적 조성물은 담체 또는 부형제를 함유할 수 있으며, 이들 중 다수는 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 사용할 수 있는 부형제에는 완충액(예를 들어, 시트레이트 완충액, 인산염 완충액, 아세테이트 완충액, 중탄산염 완충액), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 폴리펩티드(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤이 포함된다. 조절 화합물은 상응하는 투여 경로에 따라 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 액체 용액은 귀에 점적하여 투여하거나 주사 또는 섭취할 수 있도록 만들어질 수 있고; 섭취 또는 국소 적용을 위해 젤이나 분말을 만들 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에서 찾아볼 수 있다.
예를 들어, 약제학적 조성물은 귀에 점적, 흡입(예를 들어, 귀에), 국소 또는 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 다른 투여 방식에서, 약제학적 조성물은 캐뉼라, 카테터 또는 펌프를 통해 내이의 달팽이관에 현장에서 직접 투여될 수 있다. 캐뉼라, 카테터 또는 펌프는, 예를 들어 약제학적 조성물을 달팽이관 내강 또는 귀의 와우창으로 유도할 수 있다. 다른 투여 경로에서, 약제학적 조성물은 달팽이관의 내강(예를 들어, 중막, 전정 및 고실)과 같은 귀에 주사될 수 있다. 주사는, 예를 들어 귀의 와우창이나 달팽이관 캡슐을 통해 주입할 수 있다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 구현양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함할 수 있다. 한 구현양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 디메틸 설폭사이드를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이, 조성물은 -80℃ 내지 -195℃ 이하에서 동결보존을 위해 추가로 조정될 수 있다. 구현양태에서, 조성물은 투여 전에 추가적인 조작 없이 해동하여, 예를 들어 주사를 통해 대상체 내에 직접 투여할 수 있도록 제형화될 수 있다. 구현양태에서, 조성물은 동결보존 배지(10% DMSO를 함유하는 동물 성분이 없는 정의된 동결보존 배지)로서 CRYOSTOR®10(CS10)과 같은 동결용액을 포함하여 제형화될 수 있다. 일부 구현양태에서, 조성물은 CRYOSTOR®10으로 제형화된다. 구현양태에서, 조성물은 좁은 캐뉼라, 주사기 바늘 또는 카테터를 통한 투여 동안 막힘을 피하기 위해 동결보존 전에 필터 키트를 사용하여 여과될 수 있다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 밀리리터당 약 1백만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 150만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 2백만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 5백만 개의 세포, 밀리리터당 약 1천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 2천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 2천5백만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 3천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 4천만 개의 세포, 예를 들어 약 6천만 개의 세포 밀리리터당 약 7천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 8천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 9천만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 1억 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 50만 개의 세포, 밀리리터당 약 60만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 80만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 90만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 100만 개의 세포, 예를 들어 밀리리터당 약 150만 개의 세포, 또는 밀리리터당 약 5천만 개의 세포를 포함할 수 있다. 세포 수는 인용된 범위 내의 임의의 값이나 하위 범위일 수 있다.
다른 구현양태에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 약 2 마이크로리터 내지 약 2 밀리리터, 예를 들어 약 3 마이크로리터, 예를 들어 약 4 마이크로리터, 예를 들어 약 5 마이크로리터, 약 6 마이크로리터, 예를 들어 약 7 마이크로리터, 예를 들어 약 10 마이크로리터, 예를 들어 약 20 마이크로리터, 예를 들어 약 50 마이크로리터, 예를 들어 약 80 마이크로리터, 예를 들어 약 100 마이크로리터, 예를 들어 약 200 마이크로리터, 약 500 마이크로리터, 예를 들어, 약 1 밀리리터 또는 약 2 밀리리터 범위의 부피를 가질 수 있다. 부피는 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다. 한 구현양태에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 동결보존을 위해 또는 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위해 구성된 용기 내에 있을 수 있다. 구현양태에서, 용기는 사전충전형 주사기일 수 있다.
일 구현양태에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 약 1 마이크로리터 내지 약 1,800 마이크로리터, 예를 들어 약 2 마이크로리터, 예를 들어 약 3 마이크로리터, 예를 들어 약 4 마이크로리터, 예를 들어, 약 50 마이크로리터, 예를 들어 약 100 마이크로리터, 예를 들어 약 200 마이크로리터, 예를 들어 약 450 마이크로리터, 약 1800 마이크로리터, 예를 들어 약 10 마이크로리터, 예를 들어 약 20마이크로리터, 또는 예를 들어 약 40 마이크로리터 범위의 부피로 투여될 수 있다. 부피는 인용된 범위 내의 임의의 값이나 하위 범위일 수 있다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 적어도 약 100,000개의 세포, 적어도 약 200,000개의 세포, 적어도 약 300,000개의 세포, 적어도 약 400,000개의 세포, 적어도 약 500,000개의 세포, 적어도 약 600,000개 세포, 적어도 약 700,000개 세포, 적어도 약 800,000개 세포, 적어도 약 900,000개 세포, 적어도 약 100만개 세포, 적어도 약 150만개 세포, 적어도 약 200만개 세포, 적어도 약 250만개 세포, 적어도 약 3백만개 세포, 적어도 약 4백만개 세포, 적어도 약 5백만개 세포, 적어도 약 1천만개 세포, 적어도 약 2천만개 세포, 적어도 약 3천만개 세포, 적어도 약 4천만개 세포, 또는 적어도 약 5900만개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약 50,000개 내지 5천만개 세포, 약 100,000개 내지 2천만개 세포, 약 100,000개 내지 1천만개 세포, 약 100,000개 내지 100만개 세포, 약 500,000개 내지 1천만개 세포, 약 500,000개 내지 100만 개, 약 100만 개의 세포 내지 5천만 개의 세포, 또는 약 1천만 개의 세포 내지 5천만 개의 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약 100,000개 내지 1천만개 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약 100,000개 내지 100만개의 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약 100,000개 내지 500,000개의 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약 500,000개 내지 100만개의 세포를 포함한다.
키트 및 제조품
본 개시내용은 본원에 기술된 약제학적 조성물, 및 냉동바이알, 주사기, 주사기 카트리지 캐뉼라 등과 같은 제조 물품을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현양태에서, 키트는 사용 지침을 포함한다.
일부 구현양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 동결보존되고 냉동바이알, 캐뉼라, 주사기 또는 주사기 카트리지에 투여량 단위로 사전 포장되어 적합한 온도(예를 들어 -80℃ 이하 또는 -140℃ 이하)에서 저장되고, 실온과 같은 적절한 온도로 해동된 후에 대상체에게 투여할 준비가 된다.
이제 본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 이는 예시로서 제공되는 다음 실시예를 참조하여 본 개시내용을 용이하게 이해할 수 있을 것이며, 본 개시를 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기술된 실시예 및 구현양태는 단지 예시의 목적일 뿐이며 이에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부된 특허청구의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다.
예시적인 구현양태
본 발명은 다음에 열거된 구현양태를 참조하여 이해될 수 있다.
구현양태 1. 미분화 다능성 줄기 세포로부터 유래된 청각 세포 집단을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 다능성 줄기세포의 배양물을 수득하는 단계;
b) 다능성 줄기 세포의 비-뉴런성 외배엽 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에서 제1 기간 동안 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
c) 비-뉴런성 외배엽 세포를 청각 세포로 분화시키기에 충분한 배양 조건 하에서 b)로부터 비-뉴런성 외배엽 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
구현양태 2. 구현양태 1에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)인, 방법.
구현양태 3. 구현양태 1에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)인, 방법.
구현양태 4. 구현양태 1에 있어서, 상기 청각 세포는 청각 세포의 집합체를 포함하는, 방법.
구현양태 5. 구현양태 1에 있어서, 상기 청각 세포는 귀의 감각 세포 집단을 포함하는, 방법.
구현양태 6. 구현양태 5에 있어서, 상기 감각 세포 집단은 유모 세포, 지지 세포, 귀 전구체 세포 및 감각 뉴런성 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
구현양태 7. 구현양태 6에 있어서, 상기 감각 세포 집단은 유모 세포, Myosin7a로부터 선택된 유모 세포를 발현하는 마커, 지지 세포, 네스틴, PAX2, PAX8, GATA3 및 SOX2 중 하나 이상을 발현하는 귀 전구체 세포, 및 페리페린, BRN3a, FOXG1, β-튜불린 3, TrkB, TrkC, /MafB 및 GluA4로부터 선택된 마커를 발현하는 하나 이상의 감각 뉴런성 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
구현양태 8. 구현양태 7에 있어서, 상기 감각 뉴런성 전구체 세포의 치료 기능은 전기생리학적 기록으로 평가될 수 있으며, 예를 들어 배지에 글루타메이트를 투여할 때 증가된 뉴런성 활성을 입증할 수 있는, 방법.
구현양태 9. 구현양태 8에 있어서, 상기 뉴런성 활성의 증가는 세포내 칼슘 민감성 염료에 의해 검출될 수 있는, 방법.
구현양태 10. 구현양태 1에 있어서, 상기 청각 세포는 감각 뉴런성 전구체 세포의 집합체를 포함하는, 방법.
구현양태 11. 구현양태 1에 있어서, 단계 a)의 다능성 세포의 배양은 동적 현탁액에 있는, 방법.
구현양태 12. 구현양태 12에 있어서, 상기 동적 현탁액이 hESC, MC(미세담체) 및 ECM(세포외 매트릭스)의 조합을 포함하는, 방법.
구현양태 13. 구현양태 1에 있어서, 단계 b)의 비-뉴런성 외배엽 세포의 배양은 동적 배양 조건 하에 있는, 방법.
구현양태 14. 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 해동 후 대상체에게 직접 투여 준비 완료된 제형으로서 구현양태 1에 따른 청각 세포 및 동결보존 배지를 포함하는, 약제학적 조성물.
구현양태 15. 구현양태 14에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 청력 상태를 치료하는 방법.
구현양태 16. 구현양태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 치료 유효량이 5천만 AN 세포/ml 및 10% DMSO를 포함하는, 방법.
구현양태 17. 구현양태 17에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 내이에 투여되는, 방법.
구현양태 18. 구현양태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 중이에 투여되는, 방법.
구현양태 19. 구현양태 15에 있어서, 상기 청각 청력 상태는 전음성 청력 상실, 감각신경성 청력 상실, 중추 청력 상실, 혼합성 청력 상실, 청각 신경병증 스펙트럼 장애 또는 중추 청각 처리 장애인, 방법.
구현양태 20. 해동 직후 과정의 지속을 위해 재-시딩을 위한 장기 저장을 위한 중간 분화 상태의 동결보존 청각 세포 조성물을 제형화하는 방법으로서, 상기 방법은: (a) 구현양태 1에 따른 청각 세포를 동결보존 배지에 현탁시키켜 세포 현탁액을 형성하는 단계, (b) 세포 현탁액을 동결보존 온도에서 저장하는 단계, 및 (c) 추가 분화를 위해 동결보존된 현탁액을 해동시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현양태 21. 해동 후 직접 대상체에게 투여하기 위한 동결보존된 청각 세포 조성물을 제형화하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 구현양태 1에 따른 청각 세포를 동결보존 배지에 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하는 단계, (b) 세포 현탁액을 동결 보존 온도에서 저장하는 단계, (c) 상기 대상체에 투여하기 위해 동결보존된 현탁액을 해동하는 단계를 포함하는, 방법.
구현양태 22. 구현양태 10에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 청각 뉴런을 대체하는 방법.
구현양태 23. 구현양태 10에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 존재하지만 손상된 청각 뉴런 집단을 증대시키는 방법.
실시예
실시예 1: 다능성 줄기 세포를 청각 세포로 분화하는 일반적인 방법
일반 과정:
인간 배아 줄기 세포(hESC)의 청각 뉴런-유사 세포로의 분화는 hESC가 청각 뉴런(AN) 계통(도 1a)의 여러 단계를 통해 분화되는 단계적 과정을 기반으로 하였으며, 각 단계마다 관련 성장인자를 세포에 보충하였다(도 1b). 이 과정은 hESC를 수확하여 세포를 단일 세포 또는 작은 덩어리로 분리하고 시딩하는 것으로 시작되었다. 세포가 원하는 밀도 및 락테이트 농도(1.68-12.29 mM 사이)에 도달하면 분화가 시작되었다.
처음에, 세포를 비-신경 외배엽(NNE) 계통으로 유도하는 BMP4, SB431542 및 임의로 FGF2와 같은 성장 인자를 함유하는 배지로 보충하였다. GF의 이러한 조합은 3-7일의 기간 동안 사용되었으며 분화 시간 프레임 번호 1(DTF#1)로 지칭되었다.
그런 다음 세포에 LDN193189, SB431542, FGF2 및 IWP-2를 포함하는 GF의 다음 조합을 제공하여 세포를 전-기원판 외배엽(PPE) 계통으로 유도했다. 이러한 GF 조합은 3-7일의 기간 동안 사용되었으며 분화 시간 프레임 번호 2(DTF#2)로 지칭되었다.
초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 계통으로의 분화는 7일 동안 성장 인자 CHIR99021, FGF2, IGF-1을 함유하는 배지로 세포를 보충함으로써 개시되었으며, 이를 분화 시간 프레임 번호 3(DTF#3)으로 지칭되었다. 기존 배지를 제거하고 새로운 성장 인자 조합이 포함된 새로운 배지를 첨가했다.
청각 발달의 다음 단계는 Shh, RA, EGF, FGF2 및 IGF-1의 GF 조합을 함유하는 배지를 세포에 보충하는 후기 귀 뉴런성 전구체의 분화였다. 이 단계의 기간은 7일이었고 분화 시간 프레임 번호 4(DTF#4)로 지칭되었다.
성숙한 청각 뉴런을 향한 마지막 단계에는 6-40일 동안 세포에 IGF-1, BDNF 및 NT-3을 보충하는 것이 포함되었으며, 이는 분화 시간 프레임 번호 5(DTF#5) 및 분화 시간 프레임 번호 6(DTF#6)으로 지칭되었다. 각 분화 시간 프레임(DTF)이 끝나면 모든 발달 단계에 대한 일반적인 마커를 유세포 분석기(FCM)로 평가했다. 포함된 식별 마커: 귀 뉴런성 전구체(GATA3, PAX8, PAX2, 네스틴, SOX2; Matsouka 2017), 귀 뉴런성 전구체 연결성(TrkB, TrkC) 및 뉴런성 기능(GluA4, Neuro-D, Brn3A, V-Glut1, β-튜불린 III, 페리페린, MafB, FOXG1. 세포는 위에 나열된 다양한 식별 마커로 염색되었으며 각 DTF에서 테스트된 마커의 결과와 양성 세포의 비율이 표 5에 제시되어 있다.
전체 과정에 걸쳐 세포 배양은 2D 또는 3D 시스템에서 이루어졌으며, 어떤 경우에는 주어진 시간 프레임에서 세포를 수확하고 세포를 다시 시딩하여 분화 과정을 최적화하는 것이 유익했다. 표 5의 데이터는 2D 시스템을 사용하여 생성되었다.
표 5 - DTF# 1-4
표 5 - DTF# 5-6
H1 hESC에서 ANP로의 분화 과정:
AN 분화의 개시는 1차 분화 기간 프레임(DTF#1) 성장 인자를 함유하는 배지의 교체로 시작되었다(표 6). 세포를 6일 동안 배양하였고(도 2), 세포를 두 배의 배지로 처리한 1일째를 제외하고는 배지를 매일 교체하였으며, 외배엽 세포에 도달할 때까지 3일째(주말로 인해)까지 손을 대지 않고 그대로 두었다. 이 기간 프레임이 끝나면 세포를 수확하고 PAX6, SOX2 및 NNE 마커와 같은 일반적인 외배엽 마커 발현에 대해 형광-활성화 세포 분류(FACS)로 분석했다(표 7).
DTF#2에서 분화:
분화 과정은 다음 분화 시간 프레임(DTF#2)까지 계속되었다. 이 시점에서 세포를 표 6에 따른 새로운 GF 조합을 포함하는 배지로 처리했다. 세포를 두 배의 배지로 처리하는 8일을 제외하고는 매일 배지를 교체하고 총 6일 동안 10일까지(주말로 인해) 손대지 않고 그대로 두었다(도 2). 이 기간 프레임이 끝나면 세포를 수확하고 P75 및 GATA3과 같은 태반 전-기원판 외배엽(PPE) 마커에 대해 FACS를 통해 분석했다(표 7).
DTF#3에서 분화:
다음으로, 분화 과정은 다음 분화 시간 프레임(DTF#3)까지 계속되었다. 세포를 표 6에 따른 새로운 GF 조합을 함유하는 배지로 처리했다. 세포를 두 배의 배지로 처리하는 15일을 제외하고는 매일 배지를 교체했고 해당 기간 동안 주말로 인해 17일까지 총 7일동안 손대지 않고 그대로 두었다(도 2). 이 시간 프레임이 끝나면 세포를 수확하고 p75 발현 세포와 같은 전형적인 비-뉴런성 외배엽 전-기원판 외배엽(PPE) 및 PAX2 및 GATA3과 같은 신경 전구체 마커에 대해 FACS를 통해 분석했다(표 7).
DTF#4에서 분화:
19일째에, 세포를 표 7에 따른 새로운 GF 조합을 함유하는 배지로 처리하는 다음 분화 기간 프레임(DTF#4)까지 과정을 계속했다. 두 배 부피의 배지로 처리하는 22일을 제외하고 배지는 매일 교체되었고 24일(주말로 인해)까지 세포를 총 7일동안 손대지 않고 그대로 두었다(도 2). 이 기간 프레임이 끝나면 세포를 수확하고 PAX2, PAX8과 같은 일반적인 신경 전구체 마커와 β 튜불린 III과 같은 추가 신경 마커에 대해 FACS를 통해 분석했다(표 7).
DTF#5와 DTF#6의 분화:
DTF#4의 말기(26일)에, 세포를 단일 세포로서 수확하고(TrypLE™ Select 사용) DTF#5(표 6) 및 ROCK 억제제의 GF 조합이 포함된 배지를 함유하는 플라스크에 시딩했다. 이 단계에서 배지는 35일까지 2일마다 교체되었다(세포를 두 배의 배지로 처리하는 28일을 제외하고 주말로 인해 31일까지 손대지 않고 그대로 두었다)(도 2). 이 시간 프레임이 끝나면 세포를 수확하고 네스틴 및 PAX2와 같은 더 많은 신경 마커에 대해 FACS를 통해 평가했다(표 7).
이 과정은 DTF#5의 말기에서 수확한 세포를 (다시 한번 단일 세포로) 두 배 부피의 배지를 DTF#6 GF 조합(표 6) 및 ROCK 억제제와 함께 포함하는 플라스크에서 재시딩하여 계속 진행되었다. 세포를 시딩한 후 3일 동안 인큐베이션한 후 42일까지 2일마다 배지를 교체했다(도 2). 42일째에 세포를 수확하고 TrkB 및 GluA4와 같은 성숙한 신경 마커에 대해 FACS로 분석했다(표 7).
표 6 - AN 분화 동안 각 DTF의 GF 조합
표 7 - AN 분화 중 마커 발현
FACS 분석은 AN 분화의 상이한 단계를 통해 세포의 마커 발현을 보여주었다. DTF#1의 말기에는 외배엽으로의 성공적인 분화를 나타내는 높은 수준의 SOX2 및 PAX6과 NNE 계통으로의 분화 시작을 나타내는 AP2의 일부 발현이 있었다. DTF#2 말기에 세포는 PPE 계통의 마커인 P75를 높은 수준으로 발현했으며, 또한 P75에 대해 양성으로 염색되고 TRA-1-60에 대해 음성으로 염색된 대부분의 집단은 PPE 계통에 대한 높은 헌신을 보여주었다. 이 단계에서 세포는 ONP 세포 분화 방향을 나타내는 높은 수준의 GATA3도 발현했다.
DTF#3 말기에 세포는 신경 전구체에 대한 또 다른 마커인 CD133도 발현했는데, 이는 신경 계통의 촉진을 암시한다. DTF#4의 말기에는 ONP 마커 PAX2 및 PAX8뿐만 아니라 신경 마커 β 튜불린 III도 높은 수준으로 존재했다. DTF#5의 말기에서 PAX2 발현의 약간의 증가와 신경 전구체의 또 다른 마커인 네스틴의 높은 수준을 감지할 수 있었다. DTF#6의 말기에서 세포는 신경 마커 TrkB와 성숙한 청각 뉴런을 나타내는 높은 수준의 GluA4를 발현했다. 종합적으로, 이러한 결과는 세포가 AN의 분화를 향해 상이한 계통을 거쳤음을 시사한다.
실시예 2: hESC 배양 조건 및 청각 세포로의 분화
상이한 조건에서의 hESC 배양은 AN으로의 성공적인 분화를 초래한다. hESC는 작은 덩어리 또는 단일 세포로 수확되었으며 다양한 밀도(1,200-20,000개의 살아있는 세포/cm2)로 시딩되었다. 세포를 iMatrix-511 E8로 코팅된 T-플라스크 및 플레이트와 같은 다양한 용기의 단층 환경에서 배양하고 표 8에 따라 분화 개시 전에 5-80%의 합류율로 분화 개시에 필요한 락테이트 농도(1.68-12.29 mM)에 도달할 때까지 2-5 계대 동안 배양했다. 분화 개시 시 이러한 매개변수는 FACS 결과가 분화 제1 단계에서 AP2, P75와 같은 NNE/PPE 계통의 마커 발현과 더 진행된 분화 단계에서는 PAX8 및 β 튜불린 III와 같은 높은 수준의 신경 전구체 마커를 보여주기 때문에, AN 세포로의 성공적인 분화를 초래한다(표 9). 오류있는 군의 사전 분화된 hESC의 형태! 유효한 북마크가 아닌 자체 참조 8이 도 3에 제시되어 있다.
표 8 - 사전-AN 분화의 hESC 매개변수
표 9 - DTF#1/4에서 상이한 군의 마커
실시예 3: 분화 시간 프레임 1의 시기
분화 시간 프레임 #1(DTF#1) 기간은 AN으로의 성공적인 분화를 초래한다. 도 1에 제시된 전체 과정은 비-뉴런성 외배엽(NNE)을 전-기원판 외배엽(PPE) 단계로의 분화를 포함한다. DTF#1에서의 배양은 표 10에 제시된 바와 같이 상이한 기간 동안 테스트되었다. 표 10에 상세하게 설명된 바와 같이 AN에 대한 DTF#1의 형태학적 평가가 도 4에 제시되어 있다. 또한, 모든 군의 각 DTF 말기에서 세포의 AN 마커 발현을 표 11에 나타내었다.
표 10 - 분화 동안 GF 조합
표 11 - AN 분화를 위해 배양된 세포의 마커 발현
DTF#1의 말기에서, 결과는 높은 수준의 SOX2(95-84%) 및 PAX6(82-36%) 마커에 의해 외배엽으로의 분화를 보여준다. DTF#2의 말기에서 세포는 PPE 계통에 대한 마커인 P75(85-97%)를 높은 수준으로 발현했다. DTF#3의 말기에 세포는 신경 전구체의 마커인 CD133(15-29%)을 발현했다. DTF#4 말기에는 신경 전구체 마커인 네스틴(96%)과 뉴런성 마커인 β 튜불린 III(22-49%)이 높은 수준으로 존재했다. 또한, DTF#4의 말기에서 DTF#3의 말기보다 CD133 및 GATA3 발현이 약간 증가한 것이 감지되었다. 이 결과는 모두 세포가 AN의 분화를 향한 다양한 계통을 거쳤음을 시사한다.
hESC는 모든 날의 기간(3-7일) 동안 성공적으로 배양되어 비-뉴런성 외배엽(NNE)에서 전-기원판 외배엽(PPE) 단계(DTF#1)로 분화되었다.
실시예 4: 분화 시간 프레임 #2의 시기
분화 시간 프레임 #2(DTF#2) 기간은 AN으로의 성공적인 분화를 초래한다. 도 1에 제시된 전체 과정은 전-기원판 외배엽(PPE)에서 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 단계로의 분화를 포함한다. DTF#2에서의 배양은 다양한 기간에서 테스트되었다. 며칠 동안의 기간에 대한 예가 표 12에 제시되어 있다.
표 12의 AN에 대한 DTF#2의 형태 평가가 도 5에 제시되어 있다.
또한, 모든 군의 각 DTF 말기에서 세포의 AN 마커 발현은 표 13에 제시되어 있다.
표 12 - 분화 동안 GF 조합
표 13 - AN 분화를 위해 배양된 세포의 마커 발현
DTF#1의 말기에서, 결과는 높은 수준의 SOX2(97%) 및 PAX6(78%) 마커에 의해 외배엽으로의 분화를 보여준다. DTF#2의 말기에 세포는 PPE 계통에 대한 마커인 P75(89-92%)를 높은 수준으로 발현했으며, 또한 P75에 대해 양성으로 염색되고 TRA-1-60에 대해 음성으로 염색된 세포의 높은 수준의 발현을 나타냈다(63-79%). DTF#3 말기에 세포는 신경 전구체 마커인 CD133(5-9%)과 ONP 마커인 PAX8(9-15%)을 발현했다. DTF#4의 말기에 세포는 뉴런성 마커인 β 튜불린 III(14-29%)과 AN 마커인 TrkB(30-46%)를 발현했다. 신경 전구체에 대한 마커인 네스틴(79-87%)의 수준이 높았다. 또한, DTF#4의 말기에서 DTF#3의 말기로부터 CD133 발현의 약간의 증가를 감지할 수 있었다. 이 결과는 모두 세포가 AN의 분화를 향한 다양한 계통을 거쳤음을 시사한다.
세포는 전일(5-7일) 동안 성공적으로 배양되어 전-기원판 외배엽(PPE)에서 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 단계(DTF#2)로 분화되었다.
실시예 5: 분화 시간 프레임 #1의 성장 인자 조합
분화 시간 프레임 #1(DTF#1)에 대한 상이한 GF 조합. 이 시간 프레임에서 세포는 외배엽 계통으로 세포를 유도하는 BMP4, SB431542 및 FGF2 성장 인자와 함께 배양된다. 이전 실시예에서는 DTF#1의 기간을 보여 주었고 본 실시예에서는 DTF#1에서 FGF2가 있는 경우와 FGF2가 없는 경우 등 상이한 GF 조합을 보여준다. 두 상이한 조합이 표 14에 자세히 설명되어 있다.
표 14 - 분화 동안 GF 조합
표 14의 AN에 대한 FGF2가 있거나 없는 DTF#1의 형태 평가가 도 6에 제시되어 있다.
또한, 모든 군의 각 DTF 말기에 있는 세포의 AN 마커 발현이 표 15에 제시되어 있다.
표 15 - AN 분화를 위해 배양된 세포의 마커 발현
DTF#1의 말기에서, 결과는 높은 수준의 SOX2(84-95%) 및 PAX6(36-82%) 마커에 의해 외배엽으로의 분화를 보여준다. DTF#2 말기에 세포는 PPE 계통에 대한 마커인 P75(90-99%)를 높은 수준으로 발현했으며, 또한 P75에 대해 양성으로 염색되고 TRA-1-60에 대해 음성으로 염색된 세포도 높은 수준의 발현을 나타냈다(59-85%). DTF#3 말기에 세포는 신경 전구체 마커인 CD133(33-41%)과 ONP 마커인 PAX8(6-21%)을 발현했다. DTF#4 말기에는 신경 전구체 마커인 네스틴(69-92%)과 뉴런성 마커 β 튜불린 III(37-53%)이 높은 수준으로 존재했다. 또한, DTF#4의 말기에서 DTF#3의 말기로부터 CD133 및 PAX8 발현의 약간의 증가를 감지할 수 있었다. 이 결과는 모두 세포가 AN의 분화를 향한 상이한 계통을 거쳤음을 시사한다.
hESC는 2개의 상이한 GF 조합을 사용하여 성공적으로 배양되어 비-뉴런성 외배엽(NNE)에서 전-기원판 외배엽(PPE) 단계(DTF#1)로 분화되었다.
실시예 6: 분화 배양 시스템
ONP 성숙을 위한 상이한 배양 시스템. 발달 과정 동안, AN 분화 동안 ONP 성숙 단계를 최적화하기 위해 여러 시스템을 테스트했다(도 7). 0.1L PBS 휠에서 집합체를 형성하기 위해 동적 시스템을 사용한 반면, 96w 플레이트 또는 플라스크(상기 실시예 2에서 설명된 바와 같음) 및 6웰 플레이트에서 배양하는 단층 단일 세포에서 집합체 형성을 위해 정적 시스템을 사용했다. 이들 시스템을 사용하기 전에, 분화 과정(DTF#5/6)의 최종 단계에서 세포를 수확하고(TrypLETM Select에 의해 또는 홀 집합체(hole aggregate)로 전달되거나) 각 배양 시스템에서 상이한 밀도로 시딩했다(표 16).
ONP 성숙에 사용된 기술에는 또한 PBS 휠의 동적 배양에서 플라스크의 정적 배양 - 집합체의 효소적 및 기계적 해리 후 홀 집합체로서 또는 단일 세포로서으로 집합체의 전이가 포함되었다. 다른 군에서는 96w 플레이트에서 배양된 집합체를 DTF#5 말기까지 0.1L PBS 휠로 (해리 없이) 옮겼다가 홀 집합체로 T25 플라스크에 다시 옮기거나 단일 세포로 수확하고 DTF#6 말기까지 T25 플라스크에 다시 시딩했다.
표 16 - ONP 성숙에 사용되는 시스템
실시예 7: 중간 세포 은행의 동결보존
중-후기 ONP의 중간 세포 은행을 동결보존하고 AN 성숙 단계 전에 해동한다. DTF#4의 말기에 세포를 계속해서 AN 분화(DTF#5)의 최종 단계로 분화하거나 수확하고 동결보존(CS10 사용)하여 중-후기 ONP의 중간 세포 은행(ICB)을 생성하였다. 96웰에서 배양할 때, 세포를 집합체로 동결보존하였고, 나중에 해동하여 1L PBS 휠에서 배양하였다(도 8). FACS 분석은 진행 중인 배양된 집합체와 DTF#5의 말기에서 해동된 집합체 사이의 유사한 마커 발현을 보여준다(표 17).
표 17 - DTF#5의 말기에 해동되고 진행 중인 세포의 마커 발현
FACS 결과는 진행 중인 배양된 집합체뿐만 아니라 해동된 집합체도 hESC 마커 SSEA-5의 낮은 수준을 보이는 것으로 낮은 다능성으로 유지되었음을 보여준다. 두 군 모두 높은 수준의 CD133 및 낮은 수준의 GATA3와 같은 유사한 신경 마커 발현을 나타내며, 또한 두 군 모두 TrkB를 발현한다.
실시예 8: 청각 세포의 동결보존
해동 및 주입(TAI) 제형에서 청각 뉴런 전구체(ANP)의 동결보존. 분화 35일차의 세포를 수확하여 투여 준비 완료된(RTA) 최종 생성물로 Cryostor® 10%에서 최종 농도 5천만 세포/ml로 제형화했다. 0.25 ml의 제형화된 세포를 냉동바이알에 분취하고 제어된 냉동 프로토콜(CryoMed, Thermo Scientific)을 사용하여 냉동시켰다. 냉동바이알을 증기상 N2 탱크의 장기 보관소로 옮겼다. 여러 배치의 바이알을 조직 배양 플레이트에 14일 동안 50만개 세포/cm2로 시딩하여 해동 후 생존율과 확장 가능성을 테스트했다. 배양 배지는 2-3일마다 교체되었으며 BDNF, IGF1 및 NT3이 포함되었다. 14일째에 세포를 수확하고 표 18에 설명된 바와 같이 생존율 및 수율(수집된 세포/접종된 세포)의 퍼센트를 평가하기 위해 계수했다. 표 18은 동결 보존 후 시딩을 위해 해동하고 14일 동안 성장시킨 여러 AN 배치(임상적으로 유효한 세포 농도에서 CryoStor® 10% 중 RTA 제형으로 제형화됨)의 세포 생존율 및 수율을 예시한다.
표 18
세포는 생존 가능했고 RTA 제형으로부터 해동한 후 잘 성장했다.
청각 세포 프로파일
제안된 기능 검정에는 단일 세포 패치 클램프의 다양한 구성 또는 청각 뉴런의 전기 활동을 유도하는 특이적 약리학적 제제 및 칼슘 의존성 염료와 조합하여 세포외 전극을 사용하여 전체 세포 집단에서 모든 단일 세포를 기록하는 다중 전극 어레이를 사용하는 전기적 행동 축삭 연결 및 칼슘 유입이 포함된다. 표 19를 참조.
표 19 - 청각 뉴런 예비 배치 방출
FCM: 유세포 분석
FLOU-8: 플루오-8 칼슘 유량 검정
NC200: 뉴클레오카운터 NC-200TM
투여 시 청각 세포 단계
대상체에게 투여될 때 청각 세포 단계는 다능성 줄기 세포 유래 귀 뉴런성 전구체(ONP)이다. 이러한 청각 세포는 단일 세포 현탁액과 달리 집합체 형태로 더 잘 생존하고 통합될 가능성이 있다. 세포는 세포 집합체로 전달되거나 전달 후 세포 집합체를 형성할 수 있는 고밀도 단일 세포 현탁액으로 전달될 수 있다.
청각 세포 용량
약제학적 조성물의 대략적인 용량은 약 30,000 내지 약 100,000개의 청각 세포(나선형 신경절 핵의 뉴런 수를 기준으로)이다.
주사 부위
약제학적 조성물의 주사 부위는 나선형 신경절 핵이다. 고실계 주입을 위해 30G 캐뉼라를 사용하여 미로골낭을 통해 구멍을 뚫고, 33G 캐뉼러를 사용하여 모디올러스 주입을 위해 모디올러스의 뼈 벽을 통해 추가 드릴을 수행할 수 있다.
성숙한 청각 세포 단계
이식편/시험관내 성숙 시 청각 세포 단계는 나선형 신경절 핵 구심성 감각 뉴런(SGN)이다.
등가물
전술한 설명은 예시의 목적으로만 제시되었으며, 개시된 정확한 형태로 개시를 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 하나 이상의 구현양태의 세부사항은 위의 첨부된 설명에 기재되어 있다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 참조로 포함된다.

Claims (81)

  1. 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서
    (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고;
    (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고;
    (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; 및
    (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하며;
    여기서 상기 약제학적 조성물은 약제학적상 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 50% 이상이 네스틴을 발현하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 60% 이하가 PAX8을 발현하는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 10% 이상이 GluA4를 발현하는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 40% 이하가 Myo7A를 발현하는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현하고;
    (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고;
    (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 튜불린 III을 발현하고;
    (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고;
    (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고;
    (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및
    (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내의 세포의 50% 이상이 CD133을 발현하는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 집단 내 세포의 약 30% 내지 95%가 SOX2를 발현하고;
    (b) 집단 내 세포의 약 10% 내지 60%가 β 튜불린 III을 발현하고;
    (c) 집단 내 세포의 약 5% 내지 70%가 TrkB를 발현하고; 및
    (d) 집단 내 세포의 0 내지 약 0.1%가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하는, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 집단 내 세포의 약 30% 내지 95%가 PAX2를 발현하는, 약제학적 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 집단 내 세포의 약 5% 내지 95%가 GluA4를 발현하는, 약제학적 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 집단 내 세포의 0 내지 약 30%가 Myo7A를 발현하는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포 집단이 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포, 전-기원판 외배엽(PPE) 세포, 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포, 중기 ONP 세포, 후기 ONP 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포 집단이 귀의 감각 세포 집단을 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 감각 세포 집단이 유모 세포, 지지 세포, 귀 뉴런성 전구체 세포 및 감각 뉴런성 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집합체, 단일 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보존 배지를 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포의 집단이 적어도 100,000개의 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포의 집단이 100,000개 세포 내지 1천만 개의 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. a) 미분화 다능성 줄기 세포의 배양물을 수득하는 단계;
    b) 다능성 세포의 비-뉴런성 외배엽 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 배양 조건 하에서 미분화 다능성 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 비-뉴런성 외배엽 세포를 청각 세포로 분화시키기에 충분한 배양 조건 하에서 b)로부터의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  25. (a) 골형성 단백질 4(BMP4), 및 4-[4-(2H-1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(피리딘-2-일)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542)를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 미분화 다능성 줄기 세포 집단을 비-뉴런성 외배엽(NNE) 세포를 생성하기에 충분한 조건 하에서 1-9일 동안 배양하여, NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계;
    (b) SB431542, 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드(IWP-2) 및 4-{6-[4-(피페라진-1-일)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일}퀴놀린(LDN193189)을 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 단계 (a)에서 생산된 NNE 세포를 포함하는 세포 집단을 전-기원판 외배엽(PPE) 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 1-9일 동안 배양하여, PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계;
    (c) 6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H)-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노)니코티노니트릴(CHIR99021), FGF2 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1)을 포함하는 제3 세포 배양 배지에서 단계 (b)에서 생산된 PPE 세포를 포함하는 세포 집단을 초기 귀 뉴런성 전구체(ONP) 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 5-9일 동안 배양하여 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계;
    (d) 소닉 헤지호그(SHH), 레티노산(RA), 표피 성장 인자(EGF), FGF2 및 IGF-1을 포함하는 제4 세포 배양 배지에서 단계 (c)에서 생성된 초기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 중-후기 ONP 세포를 생산하기에 충분한 조건에서 5-9일 동안 배양하여, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계;
    (e) 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT3) 및 IGF-1을 포함하는 제5 세포 배양 배지에서 단계 (d)에서 생성된 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 후기 ONP 세포를 생산하기에 충분한 조건 하에서 3-45일 동안 배양하여, 후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 단계; 및
    (f) 세포 집단을 수집하여, 청각 세포 집단을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함하는, 청각 세포 집단을 포함하는 조성물을 생산하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지가 FGF2를 포함하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 BMP4가 상기 제1 세포 배양 배지에서 약 1-25 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 BMP4가 상기 제1 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SB431542가 상기 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지에서 약 0.1-10 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  30. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SB431542가 상기 제1 및/또는 제2 세포 배양 배지에서 약 1 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF2가 상기 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지에서 약 1-25 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  32. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF2가 상기 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IWP-2가 상기 제2 세포 배양 배지에서 약 0.5-10 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  34. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IWP-2가 상기 제2 세포 배양 배지에서 2 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LDN193189가 상기 제2 세포 배양 배지에서 약 20-400 nM의 농도로 존재하는, 방법.
  36. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LDN193189가 상기 제2 세포 배양 배지에서 100 nM의 농도로 존재하는, 방법.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CHIR99021이 상기 제3 세포 배양 배지에서 약 1-25 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  38. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CHIR99021이 상기 제3 세포 배양 배지에서 6 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1이 상기 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  40. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1이 상기 제3, 제4 및/또는 제5 세포 배양 배지에서 50 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH가 상기 제4 세포 배양 배지에서 약 50-1000 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  42. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH가 상기 제4 세포 배양 배지에서 500 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RA가 상기 제4 세포 배양 배지에서 약 0.2-2 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  44. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RA가 상기 제4 세포 배양 배지에서 0.5 μM의 농도로 존재하는, 방법.
  45. 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGF가 상기 제4 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  46. 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGF가 상기 제4 세포 배양 배지에서 20 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  47. 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BDNF가 상기 제5 세포 배양 배지에서 약 5-100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  48. 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BDNF가 상기 제5 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  49. 제25항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NT3가 상기 제5 세포 배양 배지에서약 5 ng/mL-100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  50. 제25항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NT3이 상기 제5 세포 배양 배지에서 10 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  51. 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)를 포함하는, 방법.
  52. 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포 집단이 NNE 세포, PPE 세포, 초기 ONP 세포, 중기 ONP 세포, 후기 ONP 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  53. 제25항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포가 귀의 감각 세포 집단을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 감각 세포 집단은 유모 세포, 지지 세포, 귀 뉴런성 전구체 세포 및 감각 뉴런성 전구체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제25항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 세포 집단이 집합체를 포함하는, 방법.
  56. 제25항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기 세포를 배양하는 것이 동적 배양 조건을 포함하는, 방법.
  57. 제25항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)-(e) 중 어느 하나 이상에서 동적 배양 조건을 포함하는, 방법.
  58. 제25항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 이전에, 미분화 다능성 줄기 세포를 단층에 1,200-20,000 살아있는 세포/cm2의 밀도로 시딩하고, 세포를 세포 배양 배지에서 락테이트 농도가 1.5-12.5 mM, 및 합류율이 5-80%가 될 때까지배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제25항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기 세포의 집단이 상기 제1 세포 배양 배지에서 3-7일 동안 배양되는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 미분화 다능성 줄기 세포가 동적 배양 조건 하에 배양되는, 방법.
  61. 제25항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, NNE 세포를 포함하는 상기 세포 집단이 상기 제2 세포 배양 배지에서 3-7일 동안 배양되는, 방법.
  62. 제25항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, PPE 세포를 포함하는 상기 세포 집단이 상기 제3 세포 배양 배지에서 7일 동안 배양되는, 방법.
  63. 제25항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 ONP 세포를 포함하는 상기 세포 집단이 상기 제4 세포 배양 배지에서 7일 동안 배양되는, 방법.
  64. 제25항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 단계가:
    (i) 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 수확하는 단계;
    (ii) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 수확된 세포 집단을 시딩하는 단계;
    (iii) 7-35일 동안 시딩된 세포 집단을 배양하는 단계;
    (iv) 세포 집단을 수확하는 단계;
    (v) 제5 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 세포 집단을 시딩하는 단계; 및
    (vi) 세포 집단을 7-30일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제5 세포 배양 배지가 ROCK 억제제를 포함하는, 방법.
  66. 제25항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e) 이전에, 중-후기 ONP 세포를 포함하는 세포 집단을 동결보존하고, 이어서 해동하고 상기 제5 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 제25항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 청각 세포 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 동결보존이 동결보존 배지에 세포 집단을 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고 세포 현탁액을 -80℃ 이하, 또는 -140℃ 이하에서 저장하는 단계를 포함하는, 방법.
  69. 치료학적 양의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체의 내이 또는 중이에 투여하는 단계를 포함하는, 청각 상태가 있는 대상체를 치료하는 방법.
  70. 청각 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 청각 상태가 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서
    (a) 집단 내 세포의 20% 이상이 SOX2를 발현하고;
    (b) 집단 내 세포의 10% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고;
    (c) 집단 내 세포의 5% 이상이 TrkB를 발현하고; 및
    (d) 집단 내 세포의 1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하며;
    여기서 조성물은 상기 대상체의 내이 또는 중이에 투여되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    (a) 집단 내 세포의 30% 이상이 SOX2를 발현하고;
    (b) 집단 내 세포의 30% 이상이 PAX2를 발현하고;
    (c) 집단 내 세포의 30% 이상이 β 튜불린 III을 발현하고;
    (d) 집단 내 세포의 20% 이상이 TrkB를 발현하고;
    (e) 집단 내 세포의 30% 이상이 GluA4를 발현하고;
    (f) 집단 내 세포의 20% 이하가 Myo7A를 발현하고; 및
    (d) 집단 내 세포의 0.1% 이하가 TRA-1-60 및/또는 SSEA5를 발현하는, 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 청각 상태가 전음성 청력 상실, 감각신경성 청력 상실, 중추성 청력 상실, 혼합성 청력 상실, 청각 신경병증 스펙트럼 장애, 중추 청각 처리 장애 또는 이명을 포함하는, 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 주사를 통해 투여되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 주사가 대상체의 고실계(Scala tympani) 또는 모디올러스에(modiolus)의 투여를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 주사가 미로골낭(otic capsule)의 구멍을 통해 캐뉼라를 삽입하거나, 와우창(round window)을 통해 캐뉼라를 삽입하는 것을 포함하는, 방법.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결보존되고, 상기 방법은 투여 전에 조성물을 해동하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100K 내지 1백만 개의 세포가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  78. 대상체의 임의의 청각 상태를 치료하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  79. 대상체의 임의의 청각 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  80. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  81. 제80항에 있어서, 상기 조성물이 냉동바이알, 주사기, 주사기 카트리지 또는 캐뉼러내에서 제형화되는, 키트.
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