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KR20240154848A - 항염증, 피부 재생, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이의 색상 안정화 방법 - Google Patents

항염증, 피부 재생, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이의 색상 안정화 방법 Download PDF

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KR20240154848A
KR20240154848A KR1020230051287A KR20230051287A KR20240154848A KR 20240154848 A KR20240154848 A KR 20240154848A KR 1020230051287 A KR1020230051287 A KR 1020230051287A KR 20230051287 A KR20230051287 A KR 20230051287A KR 20240154848 A KR20240154848 A KR 20240154848A
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KR
South Korea
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skin
platycodon grandiflorum
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color
flower extract
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KR1020230051287A
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김지효
황지영
남보미
한지원
이범석
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재단법인 남원시바이오산업연구원
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Publication date
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Abstract

본 발명은 항염증, 피부 재생, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이의 색상 안정화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 항염증, 피부 재생, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물, 도라지 꽃 추출물이 가지는 고유의 색상을 변색하지 않고 오랜 기간 동안 유지하는 색상 안정화 방법 및 상기 고유의 색상이 유지된 도라지 꽃 추출물은 천연 색조 화장품, 모발 염료, 식품, 의약품 등의 천연 색소로 이용함과 동시에 도라지 꽃 추출물이 가지는 항염증, 피부 재생, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 및 피부 진정의 효과를 제공하는 용도에 관한 것이다.

Description

항염증, 피부 재생, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이의 색상 안정화 방법 {Platycodon grandiflourm flower extracts having anti-inflammation, skin regeneration, and skin soothing effects and method for stabilizing color thereof}
본 발명은 항염증, 피부 재생, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이의 색상 안정화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 항염증, 피부 재생, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 및 피부 진정의 효능을 가지는 도라지 꽃 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물, 도라지 꽃 추출물이 가지는 고유의 색상을 변색하지 않고 오랜 기간 동안 유지하는 색상 안정화 방법 및 상기 고유의 색상이 유지된 도라지 꽃 추출물은 천연 색조 화장품, 모발 염료, 식품, 의약품 등의 천연 색소로 이용함과 동시에 도라지 꽃 추출물이 가지는 항염증, 피부 재생, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 및 피부 진정의 효과를 제공하는 용도에 관한 것이다.
식품에 있어서 색소는 일반적으로 식품의 색을 선명하게 하거나, 다른 색으로 변화시켜 소비자에게 시각적으로 돋보이게 하며, 구매 욕구를 일으키기 위해 사용된다. 또한, 화장품에 있어서 색소는 피부의 결점을 은폐하고 피부나 이목구비에 아름다운 색상을 부여하여 시각적으로 돋보이게 하기 위해 사용된다.
이러한 색소는 천연색소와 인공색소가 있다. 인공색소는 현재 많이 사용되고 있는 색소로서, 타르계 색소와 비타르계 색소가 있다. 타르계 색소는 원래 직물의 염료가 합성된 것으로서, 유해한 것이 많기 때문에 그 사용을 엄격히 규제하고 있는 추세에 있다. 비타르계 색소는 천연색소를 화학합성하거나 화학 처리한 것으로 카로틴, 수용성 안나토, 황산구리, 산화제이철, 캐러멜, 구리 및 철 크로로필린나트륨, 산화티타늄 등이 있다. 그리고, 인공색소는 그 색이 다양하여 활용도 높고, 대량생산이 가능하기 때문에 값이 저렴하고, 착색이 잘되며 안정적이기 때문에 맛과 영양, 보존과는 무관하게 과자 음료수 등에 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 이러한 인공색소가 일으키는 단점들이 최근 부각되고 있다. 이들 인공색소 중, 적색 2호, 적색 40호, 적색 102호, 황색 4호, 황색 5호 등의 타르계 색소는 알러지를 유발할 수 있으며, 아토피나 천식의 원인이 된다. 한편 미국의 식품의약품 안전청(FDA)에서는 이들 색소를 첨가할 경우 제품에 사용상의 주의를 표기하도록 하고 있으며, 적색 2호는 사용 자체를 금지하고 있다.
반면, 천연색소는 동물 및 식물의 생체에서 얻어지는 것이나, 미생물에 의하여 생화학적으로 생산되는 것으로 나눌 수 있고, 예로부터 사용된 황색의 심황, 치자, 사프란, 녹색의 엽록소 등을 이용하여 왔으며, 염료와 식품, 의약품, 화장품 등의 착색료로써 널리 사용되고 있으며, 부작용이 없다는 장점이 있다.
도라지(Platycodon grandiflourm)는 초롱꽃과의 여러해살이풀로 여름에 흰색 또는 보라색의 꽃이 피며 이의 뿌리는 식용으로 사용한다. 도라지의 주요 성분은 사포닌으로, 이의 길경은 뿌리의 껍질을 벗기거나 그대로 말린 것이며, 한방에서는 치열, 폐열, 편도염, 설사에 사용한다. 또한, 한국 공개특허 제10-2014-0096753호는 플라티코딘 D 함유 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 한국 공개특허 제10-2022-0093718호는 도라지 용매 추출물을 가수분해효소로 처리한 후 발효시켜 추출한 면역력 증진 효과를 갖는 도라지 추출물의 제조 방법을 개시하고 있고, 한국 공개특허 제10-2022-0088984호는 백도라지 분말을 물에 혼합하고 40 내지 80℃에서 1시간 내지 4시간 동안 증숙하여 수득한 백도라지 숙성물을 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대하여 개시하고 있고, 한국 공개특허 제10-2022-0087969호는 플라티코사이드 E 및 플라티코딘 D를 포함하는 도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 대하여 개시하고 있다.
이와 같이 종래의 도라지 추출물은 사포닌계 물질인 플라티코딘 D 등의 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 용도에 대하여 개시하고 있을 뿐 도라지 꽃 추출물의 색소와 관련한 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 천연색소로 도라지 꽃 추출물에 주목하고, 오랜 기간 도라지 꽃 추출물의 색상을 유지할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하게 되었다. 그와 더불어, 도라지 꽃 추출물이 항염증, 피부 재생, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 및 피부 진정의 효과를 나타내어 이를 목적으로 하는 조성물을 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허 제10-2014-0096753호(2014.08.06. 공개) 한국 공개특허 제10-2022-0093718호(2022.07.05. 공개) 한국 공개특허 제10-2022-0088984호(2022.06.28. 공개) 한국 공개특허 제10-2022-0087969호(2022.06.27. 공개)
Tadao Kondo et al., Polyacylated Anthocyanins in Bluish-Purple Petals of Chinese Bellflower, Platycodon grandiflorum, Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4044. https://doi.org/10.3390/ijms22084044
본 발명의 하나의 목적은 도라지 꽃 추출물의 고유의 색상을 안정화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 도라지 꽃 추출물을 천연색소로서 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증, 피부 재생, 상처 치유, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 진정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 피부 외용제 조성물, 화장료 조성물, 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법은,
(S10) 도라지 꽃을 건조하고 분쇄하여 분말화하는 도라지 꽃 분말화 단계;
(S20) 상기 (S10) 단계의 도라지 꽃 분말을 40 내지 60% 에탄올에서 55 내지 65℃, 230 내지 250분 동안 환류 추출하는 도라지 꽃 추출물 제조 단계; 및
(S30) 상기 (S20) 단계의 도라지 꽃 추출물에 말토덱스트린을 첨가하고 농축하는 농축 단계;를 포함한다.
본 발명에 있어서, 도라지 꽃은 초롱꽃과의 여러해살이풀인 도라지(Platycodon grandiflourm)에서 여름에 피는 자색 또는 자감(bluish-purple)의 꽃을 말한다. 도라지 꽃의 색상이 보라색을 나타내는 것은 플라티코닌(platyconin)을 포함한 디아실안토시아닌 화합물에 의한 것으로 밝혀졌다(Tadao Kondo et al., Polyacylated Anthocyanins in Bluish-Purple Petals of Chinese Bellflower, Platycodon grandiflorum, Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4044. https://doi.org/10.3390/ijms22084044).
본 발명에 있어서, 도라지 꽃 추출물의 색상은 자색 또는 자감(bluish-purple)을 말한다.
본 발명에 있어서, 색상 또는 색소 안정화는 색상 또는 색소의 유지와 동일한 의미로 사용할 수 있으며, 0 내지 50℃에서 60일 이상, 바람직하게는 30 내지 60일 동안 보관되는 경우에 미국 국립 표준 사무국에서 규정하는 변색등급 5 내지 6을 유지하는 것을 말한다. 상기 미국 국립 표준 사무국에서 규정하는 변색등급은 표 3과 같다.
이하, 본 발명의 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법을 구체적으로 설명한다.
(S10) 단계는 도라지 꽃 분말화 단계로서, 도라지 꽃을 건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계이다.
상기 건조는 자연 건조, 열풍 건조, 저온 건조 등의 통상의 방법에 따라 이루어지며, 특별히 제한되지 않는다. 하나의 구체적 예로서, 38 내지 45℃에서 40 내지 52시간 동안 열풍건조하여 이루어질 수 있다.
상기 분쇄는 건조된 도라지 꽃을 분말화하는 것으로 당해 분야의 통상의 분쇄 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
(S20) 단계는 도라지 꽃 추출물의 제조 단계로서, 상기 (S10) 단계의 도라지 꽃 분말을 40 내지 60% 에탄올에서 55 내지 65℃, 230 내지 250분 동안 환류 추출하는 단계이다.
상기 도라지 꽃 추출물의 제조 단계에서 본 발명자들은 상기 도라지 꽃 분말을 다양한 용매, 용매 중 에탄올의 농도, 추출 온도 및 시간, 추출 방법으로 도라지 꽃 추출물을 제조한 경우 상기와 같은 조건에서 도라지 꽃 추출물의 총 안토시아닌 함량이 높고 색상이 변색되지 않음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 도라지 꽃 분말을, 40 내지 60% 에탄올, 바람직하게는 45 내지 55% 에탄올, 보다 바람직하게는 48 내지 52% 에탄올, 가장 바람직하게는 50% 에탄올에서, 55 내지 65℃, 바람직하게는 56 내지 64℃, 보다 바람직하게는 57 내지 63℃, 보다 더 바람직하게는 58 내지 62℃, 보다 더욱 더 바람직하게는 59 내지 61℃, 가장 바람직하게는 60℃의 온도 조건으로, 230 내지 250분 동안, 바람직하게는 235 내지 245분 동안, 보다 더 바람직하게는 238 내지 242분 동안, 가장 바람직하게는 240분 동안 환류 추출하는 경우 도라지 꽃 추출물의 총 안토시아닌 함량이 높고 색상이 변색되지 않는다.
(S30) 단계는 농축 단계로서, 상기 (S20) 단계의 도라지 꽃 추출물에 말토덱스트린을 첨가하고 농축하는 단계이다.
하나의 구체적 예로서, 상기 (S20) 단계의 도라지 꽃 추출물의 농축 전에 다양한 변색방지제를 첨가하고 농축한 경우 또는 상기 (S20) 단계의 도라지 꽃 추출물의 농축 후에 다양한 변색 방지제를 첨가한 경우에 농축 전 변색방지제로 말토덱스트린을 추출물의 100 중량부 기준으로 4 내지 6 중량부, 바람직하게는 5 중량부를 첨가하고 농축하였을 때 도라지 꽃 추출물의 색상이 60일 이상, 바람직하게는 35 내지 50일 동안 변하지 않고 거의 동일한 수준으로 유지되었다.
상기 농축은 회전감압농축기 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 (S30) 단계 이후에 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물의 보관을 용이하게 하기 위하여 (S40) 단계로서 상기 (S30) 단계의 도라지 꽃 추출물의 농축물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 동결건조에 의하여 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물은 동결 온도(예로, 영하의 온도) 뿐만 아니라 상온, 예를 들면 0 내지 50℃에서 색상의 변색 없이 보관을 용이하게 할 수 있다.
상기한 방법에 의하여 제조된 도라지 꽃 추출물은 고유의 색상인 자색 또는 자감(bluish-purple)이 오랜 기간 동안 변색되지 않고 유지되는 효과가 있다. 따라서, 색상 안정성을 가지는 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 천연 색소로서 인체에 무해하므로 식품의 착색료, 색조 화장품, 의약품의 착색료, 천연 안료, 천연 염색 등의 다양한 용도로서 안전하게 사용할 수 있다.
또한, 상기한 방법에 의하여 제조된 도라지 꽃 추출물은 하기에서 서술하는 바와 같이 염증의 예방, 개선 또는 치료 효과, 피부 재생 효과, 상처 치유 효과, 피부 보습 효과, 피부 장벽 강화 효과, 및 피부 진정 효과가 있으므로, 천연 색소로서 식품, 화장품, 의약품, 안료 등에 사용할 경우 천연색소 용도 이외에 상기한 효과를 동시에 얻을 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방, 개선, 또는 치료용, 피부 재생용, 상처 치유용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 또는 피부 진정용 조성물을 제공한다.
상기 도라지 꽃 추출물은 도라지 꽃을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출, 분획하여 수득한 액상성분, 상기 액상 성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물이다. 또한, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이의 농축액, 이의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함할 수 있다.
상기 용매는 물 또는 다양한 유기용매일 수 있다. 상기 유기용매는 염증의 예방, 개선, 또는 치료, 피부 재생, 상처 치유, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 진정 효과를 갖는 추출물을 수득할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 극성용매 또는 비극성용매가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올 등), 이들의 혼합용매 등이 될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법 역시 염증의 예방, 개선, 또는 치료, 피부 재생, 상처 치유, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 진정 효과를 갖는 추출물을 수득할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 추출 방법은 열수 추출, 저온 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출 방법 등이 있다.
하나의 구체적 예로서, 상기 도라지 꽃 추출물은 건조된 도라지 꽃 분말을 40 내지 90% 에탄올을 이용하여 50 내지 85℃에서 환류 추출하여 제조할 수 있다.
또 하나의 구체적 예로서, 상기 도라지 꽃 추출물은 상술한 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물일 수 있다. 상기 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물의 제조 방법 및 이의 색상 안정화 효과는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 염증의 예방, 개선, 또는 치료 효과가 있다.
상기 염증은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질 등)의 침입에 의하여 유발되는 질환을 말하며, 상기 염증의 예방, 개선, 또는 치료를 항염증이라고도 한다. 상기 질환으로는 아토피성 피부염, 알러지성 피부염, 염증성 장질환, 위궤양, 또는 천식 등이 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 세포의 NO 생성을 억제하는 효과가 우수하고, 생체 내 발현되는 염증성 물질인 IL-6 등의 생성을 억제하는 효과가 우수하다.
본 발명에서, 예방은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 치료는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명에서, 개체는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫드, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 피부 재생 또는 상처 치유 효과가 있다.
상기 피부 재생은 손상에 대한 조직의 회복 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제, 기질 단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생 및 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다. 한편, 상기 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상, 화상, 스트레스 등에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상처는 피부가 물리적인 신체 손상으로 인해, 피부 구조물의 정상적인 연속성이 붕괴된 것을 의미하며, 구체적으로 좌상(contusion or bruise), 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound), 비-치유외상성 상처, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상(abrasion), 골괴저, 총상(gunshot wound), 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부 건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환상처, 각막상처 등의 상처, 욕창, 와창, 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 상처, 부인과적 상처, 화학적 상처 및 여드름 등 개체의 일부에 대한 손상을 포괄적으로 의미한다.
상기 상처 치유는 상처 후, 피부 또는 신체 조직이 그 불연속성을 저절로 회복하는 복합과정을 말하는 것이다. 따라서, 궁극적으로 상처 치료란 피부상처 치유 과정에 관여하는 하나 이상의 단계 또는 과정의 촉진, 개선, 진행, 가속 또는 진전을 의미한다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 세포 자살을 유도하는 TNF-α의 활성을 억제하여 피부 세포 등의 세포의 생성 및 성장을 유도하는 효과가 우수하다.
본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 피부 보습 효과가 있다.
상기 피부보습은 피부의 수분이 체외로 증발되는 것을 억제하고 외부 물질의 과잉 침투를 차단함으로써, 피부 각질층의 수분을 유지하고 피부가 건조해지거나 표면이 거칠어지는 것을 방지하여, 피부가 부드럽고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 하는 것 등을 의미한다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 히알루론산 합성 효소의 활성을 증가시켜 히알루론산의 생성을 증가시키므로 피부 보습 효과가 우수하다.
본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 피부 장벽 강화 효과가 있다.
상기 피부 장벽은 피부를 구성하는 구조 중 표피의 가장 바깥쪽에 있는 각질층에 존재하는 부분을 말하며, 이는 각질층을 이루는 각질세포와 이들 세포 사이를 채우는 세포 간 지질로 이루어져 있다. 피부장벽 기능의 중추적인 역할을 하는 피부의 각질층은 외부 자극 및 외래 물질 침입에 대한 보호 장벽 역할을 하는 것으로서, 세포간지질(Intercellular lipids)을 통해 피부의 수분을 유지하고 피부장벽의 기능을 수행한다.
상기 피부 장벽 강화는 피부장벽을 유지시켜 피부의 수분을 손실을 방지하고 피부의 수분을 유지하는 것을 말하며, 피부 장벽 개선이라고도 할 수 있다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 피부 장벽을 구성하는 단백질인 필라그린 및 인볼루크린 등의 단백질 발현을 증가시키므로 피부 장벽 강화 및 개선 효과가 우수하다.
본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 피부 진정 효과가 있다.
상기 피부 진정은 외부 자극 등으로 인하여 손상된 피부 상태가 호전하거나 양호화 되는 것을 의미한다. 바람직하게는 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제함으로써 염증성 피부질환을 개선하거나 치료하고, 피부 보습을 유지함과 동시에 피부 장벽을 개선하여 피부의 수분 손실을 방지하여 외부 자극으로 인하여 손상된 피부를 개선 또는 치료하는 것을 말한다.
하나의 구체적 예로서, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 세포의 NO 생성을 억제하고, 염증성 물질인 IL-6 등의 생성을 억제할 뿐만 아니라 히알루론산의 생성을 촉진하고 피부 장벽을 개선하여 외부 자극 등으로 인하여 손상된 피부 상태를 호전하거나 양호화시는 효과가 우수하다.
본 발명의 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증을 예방 또는 치료용, 피부 재생 또는 상처 치유용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 상술한 도라지 꽃 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물의 투여량은 염증 또는 상처의 중증도 및 범위, 염증 또는 상처가 발생된 이후 경과된 시간, 치료 기간 등을 고려하여 당해 기술분야의 의사 또는 약사가 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 투여 기간은 염증 또는 상처의 중증도와 치료 경과에 따라 달라질 수 있지만 염증 또는 상처 발생일로부터 6일 동안만 지속하더라도 원하는 효과를 얻을 수 있다.
투여 방법에 특별한 제한이 있는 것은 아니므로 상처 부위에 주사의 형태로 직접 주입하는 것도 가능하며, 바르는 형태로 투여할 수도 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 여러 제형의 의약품, 치유 보조제, 의료기구(연고제, 겔제 등의 반고형 제제, 마스크팩, 드레싱제, 밴드/거즈, 액제 등)으로 제형 적용이 가능한 물질이고, 특별히 제형의 종류가 제한되지 않으며, 당해 기술분야 통상의 기술자에 자명한 기술에 의해 자명한 제형으로 제조될 수 있다. 이에 대한 비제한적 예시로, 연고제, 액제, 패취제, 겔제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 또는 에어로졸제 제형 등을 들 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 투여 경로는 특별히 제한되지 않으나, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 구체적으로는 비경구 투여할 수 있으며, 보다 구체적으로 피부에 도포하는 방식(즉, 경피투여)으로 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항염증, 피부 재생 또는 상처 치유 방법은 개체에 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 피부 외용제로 제공될 수 있다.
본 발명의 용어 "피부 외용제"는 일반적으로 피부 외용에 사용하는 물질 전반을 포함하는 포괄하는 개념으로, 피부 외용제 제형의 비제한적인 예로는 경고제(plaster), 로션제(lotion), 리니멘트제(liniment), 액제(liquid and solution), 에어로솔제(aerosol), 엑스제(extracts), 연고제(ointment), 유동엑스제(fluid extracts), 유제(emulsion), 현탁제(suspesions), 캅셀제(capsules), 크림제(creams), 연질, 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 또는 서방화제제가 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 도라지 꽃 추출물을 포함하는 염증의 예방, 개선, 또는 치료용, 피부 재생용 또는 상처 치유용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증의 예방, 개선 또는 치료 방법, 피부 재생 방법 또는 상처 치유 방법을 제공한다.
상기 “염증의 예방, 개선 또는 치료”, "피부 재생", "상처 치유"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "개체"는 염증의 예방, 개선 및 치료, 피부 재생, 또는 상처 치유가 필요한 인간을 포함하는 모든 동물, 예컨대 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 투여 경로는 특별히 제한되지 않으나, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 구체적으로는 비경구 투여할 수 있으며, 보다 구체적으로 피부에 도포하는 방식(즉, 경피투여)으로 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 염증의 예방, 개선 또는 치료, 피부 재생 또는 상처 치유 방법은 개체에 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 개선용, 피부 재생 또는 상처 치유용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 또는 피부 진정용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 상술한 도라지 꽃 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 개선용, 피부 재생 또는 상처 치유용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 또는 피부 진정용 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 상술한 도라지 꽃 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 도라지 꽃 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 도라지 꽃 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 도라지 꽃 추출물은 식용으로 사용 가능한 도라지 꽃의 추출물로서 인체에 유해하지 않고 안전하므로, 상기한 바와 같은 의약품, 화장료, 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물은 장기간 보관하더라도 도라지 꽃 추출물의 고유의 색상인 자색 또는 자담색이 안정적으로 유지되므로 인체에 무해한 천연색소로서 천연색소를 필요로 하는 식품, 의약품, 화장품, 안료 등에 안정적으로 사용 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 염증의 예방, 개선 또는 치료 효과, 피부 재생 효과, 및 상처 치유 효과, 피부 보습 효과, 피부 장벽 강화 효과, 피부 진정 효과가 있으므로, 단독 또는 천연 색소로서 식품, 화장품, 의약품, 안료 등에 사용할 경우 천연색소 용도 이외에 염증의 예방, 개선 또는 치료 용도, 피부 재생 용도, 및 상처 치유 용도로서 유용하게 사용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 추출 방법 및 조건에 따른 총 안토시아닌 함량을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 추출 방법 및 조건에 따른 도라지 꽃의 고유의 색상 유지 정도를 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 농축 전과 후에 각각 변색방지제(5% 말토덱스트린, 0.01% EDTA-2Na, 0.5MN 시트르산)를 첨가하고 동결건조하였을 때의 총 안토시아닌 함량을 나타낸 그림이다. 여기서, 도라지는 농축 전 도라지 꽃 추출물을 의미하고, (후)도라지는 농축 후 도라지 꽃 추출물을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물에 변색방지제를 첨가하지 않고 농축 및 동결건조한 도라지 꽃 추출물을 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 일별 변색계수를 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라자 꽃 추출물의 농축 후 변색방지제로 0.01% EDTA-2Na을 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 일별 변색계수를 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라자 꽃 추출물의 농축 후 변색방지제로 5% 말토덱스트린을 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 일별 변색계수를 나타낸 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라자 꽃 추출물의 농축 후 변색방지제로 0.5M 시트르산을 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 일별 변색계수를 나타낸 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 농축 후 변색방지제(5% 말토덱스트린, 0.01% EDTA-2Na, 0.5MN 시트르산)를 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 변색 정도를 나타낸 그림이다. 여기서, 도라지 control은 변색방지제를 첨가하지 않고 농축 및 동결건조한 도라지 꽃 추출물이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 농축 전 5% 말토덱스트린을 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 일별 변색계수를 나타낸 그림이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 농축 전 5% 말토덱스트린을 첨가하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 보관하였을 때의 변색 정도를 나타낸 그림이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 세포 내 NO 생성 억제 효과를 측정한 그림이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 세포 내 IL-6 발현 억제 효과를 측정한 그림이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 세포 재생 및 상처 치유 효과를 관찰한 그림이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 HAS-2 단백질의 발현율을 대조군과 비교하여 나타낸 그림이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 HAS-3 단백질의 발현율을 대조군과 비교하여 나타낸 그림이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 필라그린 단백질의 발현율을 대조군과 비교하여 나타낸 그림이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 도라지 꽃 추출물의 인볼루크린 단백질의 발현율을 대조군과 비교하여 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 도라지 꽃 추출 방법에 따른 총 안토시아닌 함량 측정
42℃에서 48시간동안 열풍 건조하고 분쇄한 도라지 꽃 5g에 농도별(50%, 80%) 에탄올 100ml을 4℃, 상온, 60℃, 또는 80℃에서 추출 시간 및 방법을 달리하여 도라지 꽃 추출물을 제조하였다. 그 구체적인 추출 방법 및 시간은 다음과 같다.
(1) 4℃, 에탄올(50%, 80%), 24시간 침지 추출
(2) 상온, 에탄올(50%, 80%), 24시간 침지 추출
(3) 60℃, 에탄올(50%, 80%), 2 또는 4시간 환류 추출
(4) 80℃, 에탄올(50%, 80%), 2 또는 4시간 환류 추출
상기 제조된 도라지 꽃 추출물의 총 안토시아닌 함량은 AOAC 방법에 따른 pH differential method을 활용하여 확인하였다. 구체적으로, 2.5mM 염화칼륨 완충액 (pH1.0)과 400mM 아세트산나트륨 완충액 (pH4.5)을 제조하고 이들 각각의 완충액 190 ㎕에 시료 10 ㎕를 혼합한 후 510 nm 및 700 nm에서 흡광도를 측정한 다음 하기 실험식 1로 총 안토시아닌 함량을 계산하였다.
[실험식 1]
A : pH1.0(A510-A700)-pH4.5(A510-A700)
MW : cyanidin-3-glucoside 분자량 449.2g/mol
DF : 희석배수
ε : cyanidin-3-glucoside 몰흡광계수 (26900L/mol x cm)
그 결과, 하기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 총 안토시아닌 함량은 50% 에탄올로 60℃, 4hr 환류 추출 시 0.1454 ± 0.02 mg/100g이었고, 80% 에탄올로 80℃, 2hr 환류 추출 시 0.1885 ± 0.02mg/100g으로 다른 추출 조건에 비하여 높은 함량을 나타내었다.
추출조건 에탄올농도
50% 80%
4℃, 24hr 0.0072±0.01 0.1148±0.01
25℃, 24hr 0.0052±0.00 0.1541±0.01
60℃, 2hr 0.1228±0.02 0.173±0.03
60℃, 4hr 0.1454±0.02 0.1689±0.03
80℃, 2hr 0.1330±0.02 0.1885±0.03
80℃, 4hr 0.1091±0.03 0.1569±0.02
실시예 2: 도라지 꽃 추출 방법에 따른 색 유지 정도 측정
도라지 꽃의 색은 안토시아닌계 화합물 중 플라티코닌(platyconin) 화합물이 주성분으로 작용한 것으로 알려져 있다(Tadao Kondo et al., Polyacylated Anthocyanins in Bluish-Purple Petals of Chinese Bellflower, Platycodon grandiflorum, Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4044. https://doi.org/10.3390/ijms22084044). 따라서, 상기 실시예 1에서 제조한 각 추출 조건별 도라지 꽃 추출물에 대하여 본래의 도라지꽃 색상(보라색)을 나타내는지 확인하여 추출 방법 및 조건에 따른 플라티코닌(platyconin) 화합물이 함유되어 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 80% 에탄올 추출물은 추출 조건 및 방법과 관계없이 도라지 꽃의 본래 색상을 나타내지 않아 플라티코닌(platyconin) 화합물이 변형되는 등 함량이 감소한 것으로 확인되었으며, 50% 에탄올 추출물, 그 중에서도 60℃에서 2시간 또는 4시간 환류 추출한 경우에 도라지 꽃의 본래 색상을 가장 잘 나타내어 플라티코닌(platyconin) 화합물이 잘 보존되고 함유량이 우수한 것으로 확인하였다.
상기 실시예 1 및 실시예 2의 결과로부터 50% 에탄올, 60℃, 4시간 환류 추출한 경우에 총 안토시아닌 함량이 우수하고 도라지 꽃의 고유의 색이 유지(플라티코닌 화합물의 함량이 높음)되므로, 상기 방법을 도라지 꽃 추출물의 최적의 추출 방법으로 선정하고 이하의 실험을 진행하였다.
실시예 3: 도라지 꽃 추출물의 변색 방지 및 안정성 평가
상기 실시예 1 및 2로부터 선정된 도라지 꽃의 추출물(50% 에탄올, 60℃, 4시간 환류 추출한 추출물)의 농축 전과 후의 변색방지제 첨가에 따른 변색 정도 및 보관 안정성을 평가하였다.
구체적으로, 도라지 꽃의 추출물을 회전 감압 농축하기 전과 후에 변색방지제(5% 말토덱스트린, 0.01% EDTA-2Na, 0.5MN 시트르산)를 처리하고 동결건조하였다. 이후 동결건조된 도라지 꽃의 추출물에 대한 총 안토시아닌 함량을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.
추출조건 총안토시아닌 함량
농축 전 도라지 꽃 추출물 0.13±0.01
농축 전 도라지 꽃 추출물 + 시트르산 0.02±0.00
농축 전 도라지 꽃 추출물 + EDTA-2Na 0.15±0.02
농축 전 도라지 꽃 추출물 + 말토덱스트린 0.05±0.02
농축 후 도라지 꽃 추출물 + 시트르산 0.05±0.01
농축 후 도라지 꽃 추출물 + EDTA-2Na 0.21±0.04
농축 후 도라지 꽃 추출물 + 말토덱스트린 0.08±0.01
상기 결과에서 볼 수 있듯이, 도라지 꽃 추출물을 농축한 후에 변색방지제를 첨가한 경우에 총 안토시아닌 함량이 우수하였다.
다음으로, 상기 농축 후 변색방지제를 처리하고 동결건조한 도라지 꽃 추출물을 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에서 35일간 보관을 한 후 0.1% 농도로 재용해하고 색차계를 이용하여 보관 0 일차와 비교하여 도라지 꽃의 색상 안정성을 확인하고 그 결과를 하기 표 4 및 도 4 내지 7 및 도 8에 나타내었다. 변색 등급 기준은 하기 표 3의 미국 국립 표준 사무국(National Bureau of Standards)의 기준(Unit)을 사용하였다. 상기 변색 등급 기준에서 ΔE*ab 값이 낮을수록 변색도 낮으며, 변색등급이 높을수록 변색도가 낮음을 의미한다.
변색등급 ΔE*ab Critical remarks of color differences
6 0.0~0.5 Trace(미약한 차)
5 0.5~1.5 Slight(근소한 차)
4 1.5~3.0 Noticeable(약간의 차, 인지가능)
3 3.0~6.0 Appreciable(주목할 정도)
2 6.0~12.0 Much(상당한 차)
1 above 12.0 very much(다른색상으로 변화)
ΔE*ab(등급) 25℃ 4℃ 45℃
도라지꽃 control 2.04(4) 2.07(4) 4.38(3)
0.01% EDTA-2Na 2.90(4) 2.80(4) 9.62(2)
5% Maltodextrin 1.99(4) 2.73(4) 3.50(3)
0.5M Ctric acid 0.47(6) 0.10(5) 6.28(2)
상기 표 4 및 도 4 내지 7과 도 8에서 볼 수 있듯이, 모든 온도 조건을 고려하면 5% 말토덱스트린을 변색방지제로 사용한 경우에 가장 변색도가 낮았다. 또한, 시트르산을 변색방지제로 첨가한 경우에 도라지 꽃 추출물의 색상이 붉은 색으로 변하여 부적합하였다(도 8 참조).
실시예 4: 도라지 꽃 추출물의 안정성 평가에 대한 추가 실험
상기 실시예 3의 안정성 평가 결과 농축 후 변색방지제로 5% 말토덱스트린을 첨가하고 동결건조하였을 때 변색이 가장 적게 나타났다. 이에 농축 전 변색방지제로 5% 말토덱스트린을 첨가하고 동결건조하였을 때 변색 안정성이 보다 우수한지 확인하고자 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 실험하였다. 구체적으로, 도라지 꽃 추출물을 농축하기 전에 5% 말토덱스트린을 처리하고 동결건조한 후 35일 동안 25℃, 4℃, 및 45℃의 온도에 보관하였다. 이후 0.1% 농도로 재용해하고 색차계를 이용하여 보관 0일차와 비교하여 도라지 꽃의 색상 안정성을 확인하였으며, 그 결과를 표 5 및 도 9 및 10에 나타내었다.
ΔE*ab(등급) 25℃ 4℃ 45℃
농축후 1.99(4) 2.73(4) 3.50(3)
농축전 0.94(5) 1.07(5) 0.95(5)
상기 표 5와 도 9 및 10에서 볼 수 있듯이, 도라지 꽃 추출물의 농축 전에 말토덱스트린을 첨가하고 농축하였을 때 농축 후에 말토덱스트린을 첨가하는 경우에 비하여 변색 안정도가 더 우수하였다.
따라서, 비록 농축 후 말토덱스트린을 첨가하였을 때 총 안토시아닌 함량이 높았지만(표 2 및 도 3 참조), 총 안토시아닌 중 플라티코닌(platyconin)의 성분 변화가 적어 변색 안정도가 우수한 경우로 농축 전 말토덱스트린을 첨가하는 것이 도라지 꽃 추출물의 색상을 유지하는데 바람직한 것으로 판단하였다.
실시예 5: 도라지 꽃 추출물의 항염 활성 평가
상기 실시예 1 내지 4에 따라 도라지 꽃 추출물의 변색 안정성이 우수한 것으로 결정된 추출 방법으로 도라지 꽃 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 건조 후 분쇄된 도라지 꽃을 50% 에탄올로 60℃, 4시간 환류 추출하여 도라지 꽃 추출물을 제조하고 하기 실험을 수행하였다.
5-1. NO 생성 억제 효과
마우스 대식세포(Raw 264.7 cell)를 5×105 cells/ml 농도로 96 웰플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때, 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 상기 도라지 꽃 추출물을 25ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml의 농도별로 첨가하고 동일한 배양조건에서 30분 배양한 후 LPS 1ug/ml을 넣고 24시간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 그리스 시약(Griess reagent) Ⅰ과 Ⅱ를 동량 섞은 후 배양한 배지와 50㎕씩 96 웰플레이트에 넣은 후 37℃, 인큐베이터에서 10분 반응시킨 후, 마이크로플레이트 계수기(Micro plate reader) 540nm에서 NO 생성값을 측정하고, NO 억제율에 대한 값을 도 11에 나타내었다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이 본 발명에 따라 장기 보관된 도라지 꽃 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.
5-2. IL-6 발현 억제 효과
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포를 2x105 cells/ml의 농도로 24웰 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 24시간 배양하였다. 이때, 배지는 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% FBS(Fetal bovine serum)이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다. 이후 상기 제조한 도라지 꽃 추출물을 각각 25ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml 농도별로 DMSO 용매로 희석한 후, 같은 농도별로 1시간 전 처리하였고, 이후 LPS 1ug/ml을 24시간 동안 처리하였다. 24시간 이후에는 세포 처리액의 상등액을 수거하여 IL-6의 발현을 면역측정법으로 확인하였다. 양성대조군은 도라지 꽃 추출물 대신에 덱사메타손(dexamethasone; Dex)을 100uM 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이 본 발명에 따라 장기 보관된 도라지 꽃 추출물은 농도 의존적으로 염증성 사이토카인인 IL-6 생성을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 도라지 꽃 추출물의 상처 치유 및 피부 재생 효과
사람 각질세포주인 HaCaT 세포를 8 x 104 cells/well의 농도로 Culture-insert 2 Well 24 ibiTreat에 분주하고 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때, 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 상기 실시예 5에서 제조한 도라지 꽃 추출물 또는 양성대조군(TGF-β)을 첨가하고 1시간 배양한 후 TNF-α를 넣고 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 그 후, 현미경으로 세포 사이의 갭(Gap)이 메꾸어진 정도를 확인하며 촬영하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 TNF-α에 의해 억제된 갭(Gap)을 메꾸어 상처치유 및 피부 재생 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 도라지 꽃 추출물의 피부 보습 효과
피부보습을 유지하는 히알루론산(Hyaluronic acid)은 HAS(hyaluronic acid synthase)에 의해 생성된다. HAS 유전자 발현의 증가는 피부의 표피에 위치하는 기저층, 유극층에서 히알루론산의 보다 많은 합성으로 이어지게 되고 증가한 히알루론산에 의해 피부의 보습력이 증가된다. 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에 상기 실시예 5에서 제조한 도라지 꽃 추출물 100 ㎍/㎖을 48 시간 동안 처리하고 Real-time PCR을 이용하여 각질형성세포에서 생성된다고 알려진 HAS-2와 HAS-3의 mRNA의 발현을 확인하였다. 구체적으로, 상기 도라지 꽃 추출물이 처리된 피부각질형성세포주 HaCaT 세포로부터 RNAiso Plus (Takara)를 이용하여 mRNA를 분리하고 Reverse Transcriptase Premix (Elpis Biotech, Inc.)에 동일한 양의 mRNA를 넣은 뒤, Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems)을 이용하여 42℃, 55분, 70℃, 15분의 조건으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 각각의 표적 유전자에 대한 프라이머를 HiPi PCR PreMix (Elpis Biotech, Inc.)에 넣고, Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머의 염기서열을 표 6에 나타냈으며, PCR은 95℃에서 15초 동안 초기 변성(denaturation)한 후, 60℃에서 10초 동안 어닐링(annealing)하고, 72℃에서 10초 동안 신장(extension)으로, 45 사이클을 수행하였다. 역치주기(Threshold cycle, Ct) 값을 측정하기 위해, 상대정량(comparative Ct (2-ΔΔCt))법을 사용하였다. β-액틴은 내부 대조군으로 사용하였으며, 양성대조군은 트레티노인(all trans retinoic acid, ATRA) 2uM을 세포에 처리하였다.
유전자 방향 서열(5'-3')
HAS2 정방향 GCAGTGTAAGATATTGGATGGC
역방향 CCCATAAATTCTTGATTGTACCAATCTTC
HAS3 정방향 TGTCCAGATCCTCAACAAGTACGA
역방향 CTGGAGGAGGCTGTTGC
Filaggrin 정방향 GGCTAAGTGAAAGACTTGAAGAGA
역방향 AATAGACTATCAGTGGTGTCATAGG
Involucrin 정방향 GGCAGCTGAAGTACCTGGAA
역방향 TCCAGCTGCTCCAGTTG
β-actin 정방향 CACTGTGCCCATCTACG
역방향 CTTAATGTCACGCACGATTTC
도 14 및 15에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 HAS-2 및 HAS-3의 mRNA를 각각 57% 및 181%로 증가시켜 피부 보습에 효과적임을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 도라지 꽃 추출물의 피부 장벽 강화 효과
피부장벽으로 구성되는 단백질로 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin), 코르니핀(cornifin), small proline-rich protein, transglutaminase 1, 3 등의 단백질들이 알려져 있다. 이들은 각질형성세포의 분화와 함께 발현량이 증가되어 피부장벽 중 핵심기능을 수행하는 각질세포막의 주요 구성원으로써 위치한다. 이러한 피부장벽기능의 손상은 건조증 및 아토피 등의 질병으로 연결되지만 피부는 장벽의 손상을 회복하기 위해 표피의 칼슘농도변화, 지질합성, 지질이중막 형성 등으로 이를 극복하는 시스템을 가지고 있다. 이처럼, 피부장벽 관련 주요 인자의 발현은 피부 가장 바깥쪽에서 장벽 역할을 수행하는 화학적·물리적 방어막으로 유·수분 조절 및 유해물질 침투를 막아 내부를 보호하는 역할을 수행하게 된다. 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에 상기 실시예 5에서 제조한 도라지 꽃 추출물 100 ㎍/mL을 48 h 동안 처리하고 피부장벽기능 개선의 지표인 필라그린(filaggrin) 및 인볼루크린(involucrin)의 mRNA 발현 정도를 상기 실시예 7과 동일한 방법에 의하여 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. 이때, 필라그린 및 로리크린에 대한 프라이머 서열은 상기 표 5에 나타내었으며, PCR 조건은 필라그린은 상기 실시예 7과 동일하나, 인볼루크린은 95℃에서 15초 동안 초기 변성(denaturation)한 후, 64℃에서 10초 동안 어닐링(annealing)하고, 72℃에서 10초 동안 신장(extension)으로, 45 사이클을 수행하였다. β-액틴은 내부 대조군으로 사용하였으며, 양성대조군은 CaCl2 2mM을 세포에 처리하였다.
도 16 및 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 도라지 꽃 추출물은 필라그린(filaggrin) 및 인볼루크린(involucrin)의 단백질 발현량이 현저히 상승하여 피부 장벽 개선 및 강화에 매우 효과적임을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. (S10) 도라지 꽃을 건조하고 분쇄하여 분말화하는 도라지 꽃 분말화 단계;
    (S20) 상기 (S10) 단계의 도라지 꽃 분말을 40 내지 60% 에탄올에서 55 내지 65℃, 230 내지 250분 동안 환류 추출하는 도라지 꽃 추출물 제조 단계; 및
    (S30) 상기 (S20) 단계의 도라지 꽃 추출물에 말토덱스트린을 첨가하고 농축하는 농축 단계;를 포함하는, 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (S30) 단계 이후에 (S40) 상기 (S30) 단계의 도라지 꽃 추출물의 농축물을 동결건조하는 동결건조 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (S30) 단계의 말토덱스트린은 도라지 꽃 추출물의 100 중량부를 기준으로 4 내지 6 중량부로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 도라지 꽃 추출물의 색상은 자색 또는 자담색인 것을 특징으로 하는, 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 도라지 꽃 추출물의 색상은 0 내지 50℃에서 60일 이상 동안 미국 국립 표준 사무국에서 규정하는 변색등급 5 내지 6을 유지하는 것을 특징으로 하는, 도라지 꽃 추출물의 색상 안정화 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 색상이 안정화된 도라지 꽃 추출물로 이루어진 천연색소.
  7. 제6항에 있어서, 상기 천연색소는 식품, 의약품, 화장품, 또는 안료에 천연색소로 사용되는 것을 특징으로 하는 천연색소.
  8. 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용, 피부 재생용, 또는 상처 치유용 약학적 조성물.
  9. 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 개선용, 피부 재생용, 또는 상처 치유용 피부 외용제 조성물.
  10. 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 개선용, 피부 재생용, 상처 치유용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 또는 피부 진정용 화장료 조성물.
  11. 도라지 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 개선용, 피부 재생용, 상처 치유용, 피부 보습용, 피부 장벽 강화용, 또는 피부 진정용 식품 조성물.
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