KR20240141784A - 다중불포화 지방산 생산을 증가시키기 위한 배지 조정 및 영양소 공급 접근법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 발효 동안 다량 영양소 및/또는 미량 영양소를 조정하는 것을 포함하는, 미생물에서 다중불포화 지방산, 특히 에이코사펜타엔산(EPA)의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 이 방법에 의해 생산된 모든 배양물, 바이오매스 및 오일을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 2022년 1월 25일에 출원된 미국 가특허출원 제63/302,696호에 대한 우선권을 주장하는 특허협력조약(Patent Cooperation Treaty)에 따른 국제 출원이다.
기술 분야
본 개시는, 미생물의 배양 동안 미량 및/또는 다량 영양소를 조정하는 것을 포함하는, 미생물에서 다중불포화 지방산, 특히 에이코사펜타엔 산(EPA)의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생산된 임의의 배양물, 바이오매스 또는 오일에 관한 것이다.
다중불포화 지방산(PUFA)은 영양학적 응용, 제약 응용, 산업 응용 및 기타 목적에 유용하다. 다중불포화 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단기로부터 첫 번째 이중 결합의 위치에 따라 분류된다. 오메가-3(n-3) 지방산은 세 번째 탄소에 첫 번째 이중 결합을 포함하고, 오메가-6는 (n-6) 지방산은 여섯 번째 탄소에 첫 번째 이중 결합을 포함한다. 예를 들어, 도코사헥사엔산(DHA)은 22개의 탄소 사슬과 6개의 이중 결합을 가진 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)으로, 종종 "22:6 n-3"으로 지정된다.
장쇄 PUFA(LC-PUFA)는 최소 3개의 이중 결합을 포함하고 사슬 길이가 탄소 18개 이상 또는 탄소 20개 이상인 지방산이다. 오메가-3 계열의 LC-PUFA에는 에이코사트리엔산(C20:3n-3), 에이코사테트라엔산(C20:4n-3), EPA(C20:5n-3), 도코사펜타엔산(C22:5n-3)(DPA) 및 DHA(C22:6n-3)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 오메가-6 시리즈의 LC-PUFA에는 디-호모-감마리놀레산(C20:3n-6), 아라키돈산(C20:4n-6)(ARA), 도코사테트라엔산 또는 아드렌산(C22:4n-6) 및 도코사펜타엔산(C22:5n-6)(DPA n-6)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. LC-PUFA는 또한 22개 이상의 탄소 및 4개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산, 예컨대 비제한적으로 C24:6(n-3) 및 C28:8(n-3)을 포함한다.
LC-PUFA EPA 및 DHA는 "필수" 지방산이다. 오메가-3 지방산은 인체에서 새로 합성되지 않기 때문에 이러한 지방산은 영양소 공급원에서 유도되어야 한다.
PUFA는, 부분적으로는 남획으로 인해, 어유에서는 상업적으로 사용하기에 충분한 양으로 생산될 수가 없다. 폴리케타이드 합성효소(ynthase)-유사 시스템은 해양 박테리아에 존재하며, 특정 미세조류(microalgae)는 아세틸-CoA와 말로닐-CoA 로부터 다중불포화 지방산(PUFA)을 혐기적으로 합성할 수 있다. 미세조류는 세포 건조 중량의 최대 80%까지 지질을 축적할 수 있으므로 PUFA의 공급원이다. 예를 들어, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 종의 균주(strain)는, 미생물에 의해 생산된 총 지방산의 최대 20%에 달하는 높은 비율로 DHA 및 EPA를 포함하는 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되었다(미국 특허 제5,130,242호; 문헌[Huang, J. et al., J. Am. Soc. 78: 605-610 (2001)]; [Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)] 참조).
트라우스토키트리드는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목에 속하는 미생물이다. 트라우스토키트리드는 스키조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 구성원을 포함하며, DHA 및 EPA를 포함한 오메가-3 지방산의 대체 공급원으로 인식되어 왔다 (미국 특허 제5,130,242호 참조).
스키조키트리움(Schizochytrium)으로부터의 고급 오일 생산은, 글루코스, 질소, 나트륨과 같은 영양소과 산소 농도, 온도, 염도(salinity) 및 pH와 같은 기타 환경 요인을 조절하여 높은 세포 밀도와 DHA 생산성을 달성함으로써, 높은 성장 속도의 결과로서 얻을 수 있다. 합성 경로의 유전적 조작은 또한, 비-트라우스토키트리드 미생물에서의 EPA의 수율을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌[Xia et al., Algal Res. 2020; 51; 102038]; [Adarme-Vega et al., Microbial Cell Factories. 2012; 11:96] 참조).
일부 미생물은 자연적으로 DHA 또는 EPA와 같은 더 고급 물질을 생산하는 것으로 알려져 있지만, 미세조류 균주에서 EPA 및 DHA(이에 국한되지 않음)를 포함하는 PUFA 비율을 제어-조작하는 것이 유익할 것이다. PUFA는 심혈관계에 도움이 되는 콜레스테롤 및 고혈압 저하 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나 최적의 오메가-3/오메가-6 비율은 약 1:1-4 이어야 하지만, 서구식 식단에서는 1:10 내지 1:20 범위이다(문헌[Peltomaaet al., MarDrugs. 2018 Jan; 16(1): 3] 참조). n-6:n-3 PUFA 비율의 식이 불균형은 하류 경로에서 변경된 유전자 조절 및 발현을 일으켜 단백질 발현 및 활성을 변화시키며, 이는, 세포막 구성과 유동성 및 기관 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서 원하는 1:1-4에 가까운 비율을 달성하기 위해 EPA 및/또는 DHA를 늘리는 것이 식이에 도움이 될 것이다.
PUFA는 또한, 세포 활동을 중재하는 것으로 보이는 염증 및 항염증 특성을 모두 갖고 있으며, n-3 대 n-6의 비율은 세포 대사에 미치는 영향을 변경할 수 있다. 일반적으로, n-6 PUFA는 전(pro)-염증성이고 n-3 PUFA는 항염증성이지만, 이는 상황에 따라 다르다. 일부 항염증 용도에서는 DHA가 EPA보다 더 강력한 것으로 보고되었다.
전체적인 지질 생산을 감소시키지 않으면서 트라우스토키트리드와 같은 미세조류에서 EPA와 같은 특정 PUFA의 생산을 선택적으로 증가시키거나 풍부하게 하는 방법에 대한 지속적인 요구가 존재한다. 즉, PUFA의 효능, 즉 지방산의 총량에 대한 PUFA의 백분율(percentage)을 증가시킬 필요가 존재한다. 또한, PUFA들의 백분율을 감소시키지 않으면서 EPA와 같은 특정 PUFA의 백분율을 선택적으로 증가시킬 필요가 있다.
본 개시는, PUFA를 생산하는 미세조류의 발효 배지 내의 미량 영양소 및/또는 다량 영양소를 조정함으로써, EPA 및 DHA와 같은 오메가-3 다중불포화 지방산(PUFA)이 풍부하고/하거나 선택적으로 EPA가 풍부한 지질을 생산하는 방법을 제공한다.
EPA 및 DHA 둘다를 생성하는 스키조키트리움과 같은 트라우스토키트리드 균주는 발효 배지 조정(refinement)에 의해 조작되어 다양한 비율의 EPA(오메가-3) 대 DHA(오메가-3)를 생성할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, EPA 또는 DHA의 지방 함량 및/또는 역가(titer), 및/또는 PUFA 함량이 선택적으로 증가될 수 있다는 것이 확인되었다.
하나의 실시양태에서, PUFA 함량 및/또는 비율은 배지 다량 영양소 또는 미량 영양소를 변경함으로써 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량 영양소의 변경은 생성된 총 지방산 함량에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 다른 실시양태에서, 다량 영양소 또는 미량 영양소의 변경은, 일부 종에서 지질 생산을 증가시키기 위해 이전에 보고(문헌[Boelen et al., Aquaculture International. 2017; 25: 277-87] 참조)된 바와 같은 성장 단계 또는 속도의 변경을 필요로 하지 않는다.
하나의 특정 실시양태에서, 총 지방 함량은 다량 영양소의 변경에 의해 증가되고, 그 결과 지질(지방) 생성 증가를 통해 PUFA 수준이 증가된다.
다른 하나의 특정 실시양태에서는, 총 지방 함량이 증가되지 않고 감소될 수 있지만, 총 지방 함량 중의 백분율로서의 PUFA의 비율((gPUFA/gFat) * 100)은 증가된다. 다시 말해서, 다량 영양소 조정은 선택적으로 PUFA 생산에 유리한 지질 프로필을 풍부하게 한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 발효 배지의 영양소 함량의 변경에 의해 더 높은 EPA 대 DHA 비율이 달성된다.
제1 실시양태에서, 오일 중 EPA 함량은 나트륨 대 칼륨(Na:K) 비율을 낮춤으로써 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 비율은 칼륨을 증가시킴으로써 낮아진다.
추가 실시양태에서, 칼륨은 황산칼륨(K2SO4)이다.
하나의 실시양태에서, 증가된 칼륨 대 나트륨 비율은 총 지방 함량 중의 %로서의 EPA의 백분율을 증가시킨다.
또 다른 특정 실시양태에서, Na:K 비율은 나트륨을 감소시킴으로써 낮아진다.
특정 실시양태에서, 감소된 나트륨 대 칼륨 비율의 결과로서, 총 지질 중의 %로서의 에이코사펜타엔산의 백분율은 약 8 내지 약 20%, 선택적으로 약 9 내지 약 18%, 선택적으로 약 10-16%, 선택적으로 약 11-14%, 예컨대 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 및 약 20%이다. 증가량은 원래 양에 상대적인 값이며, 예를 들어 20%의 EPA 출발량이 30% EPA 양으로 증가하는 것은 10%의 증가량을 제공한다.
다른 실시양태에서, EPA 농도는 중량 기준으로 총 지방산 중의 1% 내지 60%, 1% 내지 50%, 1% 내지 40%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 또는 1% 내지 20% EPA이다.
추가 실시양태에서, Na:K 비율은 EPA 생산 %를 증가시키기 위해 약 1.5 내지 약 3.5로 조정된다.
특정 실시양태에서, Na:K 비율은 약 1.87, 약 1.89 또는 약 3.36이다.
또 다른 특정 실시양태에서, Na:K 비율은 EPA 생산 %를 증가시키기 위해 약 2.0 내지 약 3.0이다.
추가 실시양태에서, 감소된 Na:K 비율은 생산되는 DHA 또는 지방의 백분율에 역효과를 미치지 않지만, EPA 생산 %를 선택적으로 증가시킨다.
제2 실시양태에서, 영양소 조정은 질소 함량 및/또는 인 함량을 변경하는 것을 포함한다.
하나의 양태에서, 질소 대 인 비율(N:P)은 N:P 비율을 증가시키도록 조정된다.
하나의 실시양태에서, 더 높은 질소 대 인 비율은 EPA 생산을 선택적으로 증가시킨다.
추가 실시양태에서, N:P 비율의 증가는 총 지질 중의 백분율로서 EPA 함량을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 또는 적어도 15%만큼 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 상기 N:P 비율은 EPA 백분율을 8% 내지 14% 증가시킨다.
하나의 실시양태에서, N:P 비율은 인의 농도를 감소시킴으로써 증가된다.
특정 실시양태에서, 인은 KH2PO4이다.
이 실시양태의 한 양태에서, 인 감소는 총 지질 함량의 감소와 연관되지 않는다.
다른 실시양태에서, N:P 비율은 질소 농도를 증가시킴으로써 증가된다.
특정 실시양태에서, EPA 백분율을 증가시키는 N:P 비율은 약 9.5 내지 약 15, 선택적으로 약 10 내지 14.5이다.
특정 실시양태에서, 약 9.85 내지 약 14.26의 N:P 비율을 달성하기 위해 질소 함량을 증가시키는 것은 역가 및 총 지방 함량의 백분율로서 EPA를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, N:P 비율은 약 7 내지 약 13이며, 이는 총 지방 함량 및 지방 역가를 증가시킨다.
하나의 실시양태에서, 총 지방 함량(백분율)은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 또는 약 5% 증가한다.
하나의 실시양태에서, 약 7.5 내지 약 10, 선택적으로 약 9.85의 N:P 비율은 총 지방 함량(백분율) 및 지방 역가(g/kg)를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 약 9.5 내지 약 14의 N:P 비율은 총 지방 함량의 백분율로서의 EPA를 증가시킨다.
하나의 실시양태에서, EPA 역가는 약 15%로 증가된다.
다른 실시양태에서, 약 15 내지 약 16의 N:P 비율은 DHA 역가를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 약 9.85의 N:P 비율은 가장 높은 지방 %를 제공하고 DHA 및 EPA 역가를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, N:P 비율은 생산 단계 동안 조정된다.
또 다른 특정 실시양태에서, N:P 비율은 성장 단계 동안 조정된다.
제3 실시양태에서, 생산 단계 동안 질소 공급원을 변경하고/하거나 질소를 첨가하는 것이 지방 및 PUFA 생산에 영향을 미친다.
하나의 실시양태에서, PUFA 생산을 증가시키기 위해 생산 단계 동안 질소가 첨가된다.
하나의 실시양태에서, 사용되는 질소 공급원은 황산암모늄 또는 글루타메이트, 예컨대 비제한적으로 글루타민산나트륨이다.
다른 실시양태에서, 사용되는 질소 공급원은 암모니아 가스 및 NH4OH이다.
특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루타메이트를 증가시키면 PUFA의 생산이 약 25% 이상 증가한다.
하나의 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루타메이트를 첨가하면 EPA 또는 DHA가 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 45% 증가한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루타메이트를 첨가하면 총 지질 역가(g/kg)가 증가하고, 결과적으로 EPA 및 DHA 생산이 둘 다 적어도 50% 내지 100%만큼 증가한다.
특정 실시양태에서, EPA 역가는 약 0.6g/kg에서 1.2g/kg으로 증가된다.
추가의 특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루타메이트를 첨가하면 총 지방의 q-비율(rate)이 증가한다. 본원에 사용되는 "q-비율"은 t-시간에 걸쳐 세포 g에 의해 생성된 지방 g(즉, g-지방/(g-세포* 시간))이다.
특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 공급된 글루타메이트는, DHA가 일반적으로 EPA의 약 2배인 대조군(control) 발효와 비교하여 DHA에 비해 EPA의 q-비율을 증가시킨다.
다른 실시양태에서, 글루타메이트는 생산 단계 동안 약 2.9g/L(20mM)로 첨가된다.
다른 실시양태에서, 질소 공급원은 황산암모늄이다.
하나의 실시양태에서, 황산암모늄의 첨가는 총 지방 중의 백분율(효능(potency))로서의 PUFA 생산은 증가시키지만, 글루타민산 일나트륨의 첨가에 비해 총 지방 함량은 감소한다.
추가 실시양태에서, 황산암모늄은 10mM 또는 0.36g/L의 암모늄 이온으로 첨가된다.
나트륨 대 칼륨 비율을 감소시키고/거나 질소 대 인 비율을 증가시키거나 생산 중에 질소 공급원을 변경하는 것이, 지방 함량의 증가 또는 선택적으로 EPA의 증가를 위한 발효 조건에 대한 다른 조정과 함께 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 지방의 총 그램 중의 비율로서의 DHA+EPA의 그램인 EPA 및 DHA 효능은 증가하거나 감소할 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 예를 들어 EPA의 증가는 생성된 총 지질 중의 %로서의 증가된 EPA, 또는 증가된 지질 생성으로 인해 증가된 EPA 역가(예를 들어, 그램 단위)를 의미한다.
제4 실시양태에서, 다량 영양소의 조정과 함께 글루코스 또는 글리세롤과 같은 탄소 공급원을 조정하는 것이 또한 EPA를 증가시킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루코스와 글리세롤을 혼합하여 공급하면 EPA 및 총 지질 역가 둘 다를 증가시킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, EPA 백분율은 약 20%에서 약 25%로, 보다 구체적으로는 약 19%에서 약 23%로 증가한다.
다른 실시양태에서, 지질 역가는 약 3% 내지 약 10%, 선택적으로 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% 만큼 증가한다.
특정 실시양태에서, 약 5g/L 내지 약 60g/L의 글루코스 농도 및 1g/L 초과 내지 약 30g/L의 글리세롤 농도가 생산 단계에서 사용될 수 있다.
제5 실시양태에서, 용존 산소의 제어가 또한, 예를 들어 EPA 생산을 증가시키기 위한, 영양소 조정과 함께 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 지질 생산 단계에서 약 5-15%, 선택적으로 약 10%의 용존 산소는 미량 영양소 조정과 함께 EPA 생산을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 용존 산소는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15%이다.
하나의 실시양태에서, 프로브(probe)는 주변 압력 및 22.5℃의 온도, 약 9mg/L의 용존 산소 함량에서 보정된다.
다른 실시양태에서, 영양소 조정과 동시에 이루어진 온도 조정 또한 EPA 역가를 증가시키고/시키거나 EPA/DHA 비율을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 온도는 지질 생산 단계 동안 약 20℃로 감소된다.
예를 들어, EPA는 온도를 약 20℃로 감소시킴으로써 약 22%에서 약 28%로 증가할 수 있다. 특정 실시양태에서, EPA는 약 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27% 또는 28%증가한다.
추가 실시양태에서, pH 조정 또한 EPA의 백분율을 증가시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 7.5-8.0의 pH 범위를 유지하면 EPA 백분율이 증가한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지의 pH는 지질 생산(발효) 단계 동안 7.5 초과, 약 7.6 이상, 바람직하게는 약 7.7 이상, 보다 바람직하게는 약 7.8 이상, 예를 들어 약 7.9 이상 또는 약 8.0 이상으로 조정된다. pH는, 예를 들어 수산화나트륨(예를 들어 1N NaOH), 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화칼륨 등의 염기를 사용하여 조정될 수 있다.
특정 실시양태에서, pH는 8.0으로 유지된다.
하나의 실시양태에서, pH 8.0은 EPA의 백분율을 약 8.5%에서 약 15%로 증가시킨다.
제6 실시양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 미생물 오일, 및 이 오일을 포함하거나 이 오일로부터 제조된 제품에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 미생물 오일은 DHA 또는 다른 PUFA에 비해 더 높은 EPA 백분율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 미생물 오일은, 본원에 기술된 배지 조정을 사용하지 않고 생산된 오일과 비교하여, 선택적으로 DHA 및 EPA 둘 다를 포함하는 총 지방의 백분율이 더 높다.
특정 실시양태에서, 미생물 오일은 중량을 기준으로 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 약 45% 이상의 EPA를 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 오일은, 식품, 식이 보충제, 의약품 및 화장품을 포함하지만 이에 국한되지 않는 제품에 사용된다.
도 1a 내지 1c는 진탕 플라스크에서 EPA 생산에 대한 다양한 Na:K 비율을 시험한 결과를 보여준다. 도 1a는 2.0 내지 3.0 약간 미만 범위의 비율이 EPA 백분율(gEPA/gFat * 100)을 증가시켰음을 보여준다. 도 1b는 Na:K 비율의 범위가 DHA 생산에 어떠한 역효과도 갖지 않음을 보여준다. 도 1c는 더 낮은 Na:K 비율이 생산된 전체 지방 백분율을 약간 낮추었음을 보여준다.
도 2a 내지 2c는 스키조키트리움(Schizochytrium)의 10L 발효에서 소정 범위의 Na:K 비율을 사용한 EPA 및 DHA 생산에 대한 결과를 묘사한다. 도 2a는 1.87 및 2.5의 Na:K 비율이 3.56의 비율보다 더 높은 EPA 생산 %를 낳음을 보여준다. 도 2b는 Na:K 비율의 조정이 DHA 백분율에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 도 2c는 10L 발효에서 총 지방 백분율에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 3a 내지 도 3e는 진탕 플라스크 실험에서 KH2PO4 구배를 통해 N:P 7.74 내지 15.95의 다양한 N:P 비율에서 스키조키트리움에 의한 EPA 및 DHA 생산에 대한 결과를 보여준다. 도 3a는 지방 역가를 나타내고, 도 3b는 10일차의 지방 퍼센트를 보여준다. N:P=9.85에서 가장 높은 전체 지방 %와 높은 역가를 얻었다. 도 3c는 EPA 역가가 N:P 7.74 및 9.85에서 감소하고 다른 비율에서 더 높았음을 보여준다. 도 3d는 EPA의 백분율이 N:P 14.26에서 증가함을 보여준다. 도 3d는 DHA 백분율에 미치는 상기 비율의 효과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는 스키조키트리움에서 EPA 및 DHA 생산에 미치는 생산 중의 질소 공급의 효과를 보여준다. 5일차에 황산암모늄 또는 글루타민산 일나트륨(MSG)으로서 질소를 첨가하였다. 도 4a는 글루코스 소비에 대한 영향을 보여준다. 도 4b는 두 가지 질소 공급원 모두, 특히 글루타메이트를 첨가하면, 10일 후에 린(lean) 바이오매스가 증가함을 보여준다. 도 4c는 질소 첨가에 의해 지방 %가 감소했음을 보여준다. 도 4d는, MSG가 대조군에 비해 지방 역가를 증가시킨 반면 황산암모늄은 역가를 감소시켰음을 보여준다.
도 5a 내지 도 5e는 EPA 및 DHA 생산에 미치는 질소 공급의 효과를 보여준다. 황산암모늄은 지방 역가의 감소에도 불구하고 총 지질 대비 PUFA 비율을 증가시켰다(도 5a). 도 5b는 질소 공급 10일 후 EPA 및 DHA의 백분율이 대조군과 크게 다르지 않았음을 보여준다. 도 5c 및 도 5d는 글루타메이트 첨가 시 EPA 및 DHA 역가의 증가를 각각 보여준다.
도 6a 내지 도 6e는 지방, DHA 및 EPA의 q-비율에 미치는 질소 공급의 효과를 보여준다. 도 6a 내지 도 6c는 지방, DHA 및 EPA q-비율에 대한 글루타메이트 공급의 효과를 각각 보여준다. 도 6c 및 도 6d는 DHA 및 EPA q-비율에 대한 황산암모늄 공급의 효과를 보여준다.
도 2a 내지 2c는 스키조키트리움(Schizochytrium)의 10L 발효에서 소정 범위의 Na:K 비율을 사용한 EPA 및 DHA 생산에 대한 결과를 묘사한다. 도 2a는 1.87 및 2.5의 Na:K 비율이 3.56의 비율보다 더 높은 EPA 생산 %를 낳음을 보여준다. 도 2b는 Na:K 비율의 조정이 DHA 백분율에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 도 2c는 10L 발효에서 총 지방 백분율에 부정적인 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 3a 내지 도 3e는 진탕 플라스크 실험에서 KH2PO4 구배를 통해 N:P 7.74 내지 15.95의 다양한 N:P 비율에서 스키조키트리움에 의한 EPA 및 DHA 생산에 대한 결과를 보여준다. 도 3a는 지방 역가를 나타내고, 도 3b는 10일차의 지방 퍼센트를 보여준다. N:P=9.85에서 가장 높은 전체 지방 %와 높은 역가를 얻었다. 도 3c는 EPA 역가가 N:P 7.74 및 9.85에서 감소하고 다른 비율에서 더 높았음을 보여준다. 도 3d는 EPA의 백분율이 N:P 14.26에서 증가함을 보여준다. 도 3d는 DHA 백분율에 미치는 상기 비율의 효과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는 스키조키트리움에서 EPA 및 DHA 생산에 미치는 생산 중의 질소 공급의 효과를 보여준다. 5일차에 황산암모늄 또는 글루타민산 일나트륨(MSG)으로서 질소를 첨가하였다. 도 4a는 글루코스 소비에 대한 영향을 보여준다. 도 4b는 두 가지 질소 공급원 모두, 특히 글루타메이트를 첨가하면, 10일 후에 린(lean) 바이오매스가 증가함을 보여준다. 도 4c는 질소 첨가에 의해 지방 %가 감소했음을 보여준다. 도 4d는, MSG가 대조군에 비해 지방 역가를 증가시킨 반면 황산암모늄은 역가를 감소시켰음을 보여준다.
도 5a 내지 도 5e는 EPA 및 DHA 생산에 미치는 질소 공급의 효과를 보여준다. 황산암모늄은 지방 역가의 감소에도 불구하고 총 지질 대비 PUFA 비율을 증가시켰다(도 5a). 도 5b는 질소 공급 10일 후 EPA 및 DHA의 백분율이 대조군과 크게 다르지 않았음을 보여준다. 도 5c 및 도 5d는 글루타메이트 첨가 시 EPA 및 DHA 역가의 증가를 각각 보여준다.
도 6a 내지 도 6e는 지방, DHA 및 EPA의 q-비율에 미치는 질소 공급의 효과를 보여준다. 도 6a 내지 도 6c는 지방, DHA 및 EPA q-비율에 대한 글루타메이트 공급의 효과를 각각 보여준다. 도 6c 및 도 6d는 DHA 및 EPA q-비율에 대한 황산암모늄 공급의 효과를 보여준다.
질소 결핍(starvation)은 지질 축적에 유익하지만 세포 성장 속도와 총 지방산내의 EPA 백분율을 감소시키는 것으로 보고되었다. 트라우스토키트리드의 표준 발효 동안, DHA는 총 지방 함량 중의 백분율로서 증가하지만 EPA는 감소한다.
발효 과정 중에 EPA 백분율은 감소하면서 동시에 지방 내의 DHA 백분율은 증가한다. DHA 백분율의 증가는, EPA 역가의 증가에 비해 DHA 역가의 주요 증가에 의해 유발된다.
본 발명의 방법은, 다량 영양소를 조작함으로써 총 지방 백분율을 증가시키거나 생성된 지방에서 EPA 백분율 및 역가를 선택적으로 증가시킴으로써 EPA 백분율을 증가시키는 것에 관한 것이다.
미생물
본원에 기술된 방법은 미생물 집단으로부터 지질을 발효 및 회수하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 미생물 집단은 조류(예를 들어, 미세조류), 진균(효모 포함), 박테리아 또는 원생생물일 수 있다. 바람직하게는, 미생물은 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 트라우스토키트리드, 보다 구체적으로는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 스키조키트리움(Schizochytrium) 속의 트라우스토키트리알레스를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 트라우스토키트리드로 기술된 균주는 하기 미생물을 포함할 수 있다: 목(Order): 트라우스토키트리알레스; 과(Family): 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae); 속(Genera): 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) (종: sp., 아루디멘탈레(arudimentale), 아우레움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보숨(globosum), 키네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘탈레(multirudimentale), 파키데르뭄(pachydermum), 프롤리페룸(proliferum), 로제움(roseum), 스트리아툼(striatum)), 울케니아(Ulkenia) (종: sp., 아모데보이데아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로푼다(profunda), 라디아타(radiata), 사이렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 스키조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis)), 스키조키트리움(Schizochytrium) (종: sp., 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 만그로베이(mangrovei), 미누투른(minuturn), 옥토스포룸(octosporum)), 자포노키트리움(Japonochytrium) (종: sp., 마리눔(marinum)), 아플라노키트리움(Aplanochytrium) (종: sp., 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 프로푼다(profunda), 스토키노이(stocchinoi)), 알토르니아(Althornia) (종: sp., 크로우키이(crouchii)) 또는 엘리나(Elina) (종: sp., 마이살바(marisalba), 시노리피카(sinorifica)). 본 발명의 목적을 위해, 울케니아(Ulkenia) 내에 드는 것으로 기술된 종은 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 구성원으로 간주된다. 본 발명에 포함되는 추가 속은 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium), 오블롱기키트리움(Oblongichytrium), 보트리오키트리움(Botryochytrium), 파리에티키트리움(Parietichytrium) 및 시시오이도키트리움(Sicyoidochytrium)이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 트라우스토키트리드는 스키조키트리움, 트라우스토키트리움, 또는 이들의 혼합물이다. 실시양태에서, 트라우스토키트리드는 스키조키트리움 종(Schizochytrium sp.), 스키조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum), 스키조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum), 스키조키트리움 미누툼(Schizochytrium minutum), 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.), 트라우스토키트리움 스트리아툼(Thraustochytrium striatum), 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum), 트라우스토키트리움 로제움(Thraustochytrium roseum), 자포노키트리움 종(Japonochytrium sp.), 및 이로부터 유래된 균주로부터 선택된 종으로부터 유래된다.
보다 바람직한 실시양태에서, 트라우스토키트리드는 스키조키트리움이다.
미생물 집단에는 미국 특허 제5,340,594호 및 제5,340,742호에 기술된 바와 같은 트라우스토키트리알레스가 포함되며, 이들 특허가 본원에 그 전체 내용이 참조로 포함된다. 상기 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-6245로 기탁된 트라우스토키트리움 종(즉, ONC-T18)과 같은 트라우스토키트리움 종일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 추가로, ATCC 수탁 번호 PTA-9695로 기탁된 것과 같은 돌연변이 균주를 포함하는 배양물에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 상기 미생물은 미국 특허 제10,798,952호에 기술되어 있고, ATCC 수탁 번호 PTA-10208, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10209, PTA-10210, 또는 PTA-10211로 기탁된 것 또는 이들의 혼합물이다.
본원의 방법에는 유전자 변형된 트라우스토키트리드를 사용하는 것도 포함된다. 이러한 변형된 미생물은 예를 들어 PUFA를 생산하기 위한 폴리케타이드 합성효소(PKS)를 함유할 수 있거나, 달리 PUFA 생산을 향상시키도록 조작된(engineered) 것일 수 있다. 이러한 변형된 미생물은 예를 들어 미국 특허 제8,309,796호; 제8,426,686호; 제8,859,855호; 제8,940,884호; 제9,012,616호; 제9,382,521호; 제9,133,463호; 제9,540,666호; 제9,873,880호; 제10,085,465호; 제10,087,430호 및 제10,973,837호에 기술되어 있다.
배양 및 발효
배양 배지 중 미량 영양소 및 다량 영양소의 특정 농도를 조정(배지 조정)하면 EPA 백분율 및/또는 역가를 선택적으로 증가시킬 수 있다는 것이 놀랍게도 확인되었다. 일부 조건에서는 EPA 증가에도 불구하고 DHA 함량 및/또는 지방 함량이 감소하지 않는다.
트라우스토키트리드와 같은 미생물은 대규모 산업용 생물반응기(bioreactor)에서 배양될 수 있다. 본원에 개시된 발효 배지에 대한 특정 조정에도 불구하고, 일반적인 발효 조건은 예를 들어, 본원에 참고로 인용되어 포함되는 미국 특허 제9,045,785호에 기재되어 있다. 여기에서 제공되는 미생물은 바이오매스 및/또는 관심 화합물(예를 들어 오일 또는 총 지방산 함량)의 생산을 증가시키는 조건 하에서 배양된다.
원하는 지질의 생산은, 더 많은 양의 바람직한 PUFA를 얻기 위해 하나 이상의 배양 조건의 변화를 포함하는 방법에 따라 세포를 배양함으로써 향상될 수 있다.
본 개시는 또한, 본 개시의 지방산 프로필을 포함하는 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%가 지방산이다. 일부 실시양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량을 기준으로 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 55%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 또는 약 60% 내지 약 80%가 지방산이고, 지방산의 약 50중량% 이상이 오메가-3 지방산이다.
실시양태에서, EPA 대 DHA의 중량비는 적어도 약 0.5:1 내지 2:1, 바람직하게는 0.5:1 내지 1:1이다. 실시양태에서, EPA 대 DHA의 중량비는 0.5 이상:1, 또는 바람직하게는 1 이상:1, 즉 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1.5:1, 2:1 등이다.
일반적으로, PUFA는, 폭기(aeration)을 통해 초기 성장 단계에서 바이오매스를 증가시킨 후 지질 합성이 일어나는 저산소 단계(발효 단계)를 수행하는 것을 포함하는 2단계 과정으로 미생물을 배양하여 생산된다.
선택적으로, 세포는 먼저 바이오매스를 최대화하는 조건 하에서 배양되고, 이어서 하나 이상의 배양 조건을 지질 생산성을 선호하는 조건으로 전환한다. 본원에 기술된 배지 다량 영양소에 대한 특정 조정에 더하여, 변경되는 조건에는 산소 농도, C:N 비율, 온도 및 이들의 조합이 포함될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스 생산을 선호하는 제1 단계(예를 들어, (예컨대 일반적으로 또는 제2 단계에 비해) 높은 산소 조건, 낮은 C:N 비율 및 주변 온도 사용), 및 이어서, 지질 생산을 선호하는 제2 단계(예를 들어, 산소가 감소하고 C:N 비율이 증가하며 온도가 감소함)로 2단계 배양이 수행된다.
트라우스토키트리드는 일반적으로 식염수 배지에서 배양된다. 선택적으로, 트라우스토키트리드는 염 농도가 약 2.0g/L 내지 약 50.0g/L인 배지에서 배양될 수 있다. 선택적으로, 트라우스토키트리드는 염 농도가 약 2g/L 내지 약 35g/L(예를 들어, 약 18g/L 내지 약 35g/L)인 배지에서 배양된다. 선택적으로, 본원에 설명된 트라우스토키트리드는 저염 조건에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 트라우스토키트리드는 염 농도가 약 5g/L 내지 약 20g/L(예를 들어, 약 5g/L 내지 약 15g/L)인 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지에는 NaCl이 선택적으로 포함된다. 선택적으로, 배지에는 천연 또는 인공 해염(sea salt) 및/또는 인공 해수가 포함된다.
배양 배지의 염화물 농도는 전통적인 방법에 비해 감소할 수 있다(즉, 양이 더 적음). 배양 배지는 나트륨 공급원으로서 염화물을 함유하지 않는 나트륨 염(예컨대, 황산나트륨)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 내 총 나트륨의 약 100%, 75%, 50% 또는 25% 미만이 염화나트륨에 의해 공급되도록, 총 나트륨의 상당 부분이 비-염화물 염에 의해 공급될 수 있다.
선택적으로, 배양 배지는 약 3g/L, 500mg/L, 250mg/L 또는 120mg/L 미만의 염화물 농도를 갖는다. 예를 들어, 배양 배지는 약 60mg/L 내지 120mg/L의 염화물 농도를 갖는다. 본 방법에 따라 사용하기에 적합한 비-염화물 나트륨 염의 예에는 소다회(탄산나트륨과 산화나트륨의 혼합물), 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 황산나트륨 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다(예를 들어, 각각의 전체 내용이 본원에 참고로 인용되어 포함되는 미국 특허 제5,340,742호 및 제6,607,900호를 참조한다).
트라우스토키트리드 배양용 배지에는 임의의 다양한 탄소 공급원이 포함될 수 있다. 탄소 공급원의 예로는 지방산; 지질; 글리세롤; 트리글리세롤; 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 전분, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 프룩토스, 덱스트로스, 자일로스, 락툴로스, 갈락토스, 말토트리오스, 말토스, 락토스, 글리코겐, 젤라틴, 전분(옥수수 또는 밀), 아세테이트, m-이노시톨(옥수수 침지액(steep liquor)에서 추출), 갈락투론산(펙틴에서 유래), L-푸코스 (갈락토스에서 유래), 겐티오비오스, 글루코사민, 알파-D-글루코스-1-포스페이트(글루코스에서 유래), 셀로비오스, 덱스트린 및 알파-사이클로덱스트린 (전분에서 유래); 수크로스(당밀에서 추출); 폴리올, 예를 들어 말티톨, 에리트리톨, 아도니톨, 및 올레산, 예를 들어 글리세롤 및 트윈 80; 아미노당, 예를 들어 N-아세틸-D- 갈락토사민, N-아세틸-D-글루코사민 및 N-아세틸-베타-D- 만노사민; 및 모든 종류의 바이오매스나 폐기물 스트림이 포함된다.
배지는 탄소 공급원을 약 5g/L 내지 약 200g/L, 약 5g/L 내지 약 100g/L, 약 10g/L 내지 약 50g/L, 또는 약 10g/L 내지 약 30g/L의 농도로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 탄소 공급원은 글루코스이다. 특정 실시양태에서, 글루코스는 약 50g/L의 농도로 존재한다. 글루코스과 글리세롤을 사용하는 혼합 공급물 실시양태에서, 글루코스 농도는 약 5 내지 60g/L일 수 있는 반면, 글리세롤 농도는 약 1g/L 초과 내지 약 30g/L일 수 있다. 배지는 약 1:1 내지 약 40:1의 C:N(탄소 대 질소) 비율을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 혼합 공급물은 글리세롤보다 적어도 약 15% 더 많은 탄소를 포함한다. 글루코스과 글리세롤을 사용하는 혼합 공급물 실시양태에서, 글루코스 농도는 약 5 내지 60g/L일 수 있는 반면, 글리세롤 농도는 약 0g/L 초과 내지 약 30g/L일 수 있다. 배지는 약 1:1 내지 약 40:1의 C:N(탄소 대 질소) 비율을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 공급되는 글루코스와 글리세롤의 혼합 공급물은 오일 중 EPA를 선택적으로 증가시킬 뿐만 아니라 DHA 및 EPA 역가를 증가시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 평균 EPA 수준은 혼합 공급물로부터의 지방 생성 증가로 인해 적어도 약 20% 증가할 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, EPA 백분율은 생산 단계 동안 공급되는 글루코스와 글리세롤의 혼합 공급물을 사용하여 약 19%에서 약 23%로 증가된다.
추가의 특정 실시양태에서, EPA 역가는 생산 단계 동안 공급되는 글루코스와 글리세롤의 혼합 공급물을 사용하여 약 105g/kg에서 약 130g/kg으로 증가될 수 있다.
2단계 배양이 사용되는 경우, 일반적인 배지는 제1 단계의 경우 약 1:1 내지 약 5:1, 그 다음에 제2 단계에서는 약 1:1 내지 약 1:0(즉, 없거나 또는 최소한의 질소)의 C:N 비율을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "최소한"이라는 용어는 약 10% 미만(0.1% 내지 10%의 모든 범위 포함)을 의미한다.
트라우스토키트리드 배양용 배지에는 다양한 질소 공급원이 포함될 수 있다. 예시적인 질소 공급원에는 암모늄 용액(예컨대, H2O 중의 NH4), 암모늄 또는 아민 염(예컨대, NH2SO4, (NH4)3PO4, NH4NO3, NH4OCH2CH3(암모늄 아세테이트)), 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 어분(fish meal), 글루타민산나트륨, 대두 추출물, 카사 미노산 및 증류기 그레인(distiller grain)이 포함된다.
트라우스토키트리드의 성장을 위한 일반적인 배지는 미국 특허 제9,045,785호의 표 2를 재현한 아래 표 1에 나와 있다.
표 1:
글루코스, 글리세롤 또는 둘 다의 탄소 공급원은 일반적으로 30 내지 50g/L 범위이다. 성장 단계에서 질소는 약 23.6ml/L의 농도로 첨가되지만 약 5g/L 내지 약 30g/L 범위 (이 사이의 모든 범위 포함)일 수 있다.
전형적인 배양 조건은 약 6.5 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.0, 또는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH; 약 15℃ 내지 약 30℃; 약 18℃ 내지 약 28℃; 또는 약 21℃ 내지 약 23℃의 온도; 약 0.1 내지 약 100% 포화도; 약 5 내지 약 50% 포화도; 또는 약 10 내지 약 30% 포화도의 용존 산소를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은, 다량 영양소를 변경하거나 첨가 시기를 변경함으로써 총 지방 함량 및/또는 역가가 증가하여, 지질(지방) 생성 증가 또는 특정 PUFA의 선택적 풍부화(selective enrichment)를 통해 PUFA의 수준 또는 역가가 증가됨을 입증한다.
대안적으로, 총 지방 함량은 증가되지 않고 감소될 수 있지만, 총 지방 함량 중의 백분율로서의 PUFA의 선택적 비율은 증가된다.
아래 실시예는, i) 선택적으로 배지 내 칼륨 수준을 증가시킴으로써, 나트륨 대 칼륨(Na:K) 비율을 낮추고; ii) 선택적으로 인의 농도를 조정함으로써, 질소 대 인(N:P) 비율을 낮추고; iii) 생산 단계에서 질소, 선택적으로 글루타메이트 또는 이들의 조합물을 공급하는 것을 통해, 오일 중의 총 지방 및/또는 EPA 함량의 백분율 및/또는 역가가 증가될 수 있음을 보여준다.
예를 들어, 표준 발효 조건에서, 발효 중 나트륨과 칼륨의 비율(Na:K)이 약 1:75에서 약 3.75 사이일 때, 총 지방이나 DHA의 백분율에 부정적인 영향을 미치지 않으면서도 EPA의 백분율이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 약 2 내지 약 3의 Na:K 비율은 EPA 증가에 더욱 최적이었다. 상기 Na:K 비율은 K2SO4의 양을 증가시켜 달성되었으며, 이는 EPA 백분율을 약 8.5%에서 약 12%로 증가시켰다.
생산 단계 동안 공급된 약 9 내지 약 12, 선택적으로 약 9.85의 N:P 비율이 총 지방(역가 및 백분율 모두)을 증가시키는 것으로 추가로 밝혀졌다.
특정 N:P 비율(약 9 내지 약 15)이 EPA 백분율을 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14% 또는 적어도 15%만큼 선택적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. N:P 비율은 KH2PO4 농도를 증가시킴으로써 감소되었다.
또한, DHA 백분율은 N:P 비율이 낮을수록 7일차에 증가하는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, 지방 및 PUFA 생산에 영향을 주기 위해 생산 단계 동안 질소를 첨가하는 방법을 제공한다. 질소 공급원은 또한 이 단계 동안 지질 생산에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
하나의 실시양태에서, 지질 생산 단계 동안 첨가되는 질소 공급원은 황산암모늄, NH4SO4 또는 글루타메이트(예컨대, 비제한적으로, 글루타민산 일나트륨 포함)이다.
글루타메이트의 증가는 PUFA의 생산을 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25% 또는 그 이상 만큼 증가시키는 것으로 예상치 않게 확인되었다.
또 다른 특정 실시양태에서, 글루타메이트의 첨가는 대조군과 비교하여 총 지질 역가(g/kg)를 증가시키고 결과적으로 EPA 및 DHA 역가 모두를 증가시킨다.
추가의 특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 글루타메이트를 첨가하면 q-비율 총 지방이 증가한다. 본원에 사용되는 "q-비율"는 t-시간에 걸쳐 세포 g에 의해 생성된 지방 g (즉, g-지방/(g-세포* 시간))이다.
특정 실시양태에서, 생산 단계 동안 공급된 글루타메이트는, DHA가 일반적으로 EPA의 약 2배인 대조군 발효와 비교하여, DHA에 비해 EPA의 q-비율을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 글루타메이트는 생산 단계 동안 약 2.5g/L 내지 약 3.5g/L, 선택적으로 약 2.9g/L(20mM)로 첨가된다.
다른 실시양태에서, 질소 공급원은 황산암모늄이다.
하나의 실시양태에서, 황산암모늄의 첨가는 총 지방 중의 백분율(효능)로서의 PUFA 생산을 증가시키지만, 글루타민산 일나트륨의 첨가에 비해 총 지방 함량은 감소한다.
추가 실시양태에서, 황산암모늄은 약 10mM 또는 약 0.36g/L의 암모늄 이온으로 첨가된다.
나트륨 대 칼륨 및/또는 N:P 농도로 감소시키는 것은, 지방 함량을 증가시키거나 선택적으로 EPA를 증가시키기 위한 발효 조건에 대한 다른 조정과 함께 수행될 수 있다.
배지의 pH는, 적절한 경우, 산이나 염기를 사용하고/하거나 질소 공급원을 사용하여 3.0 내지 10.0 범위로 조정할 수 있다. 선택적으로, 배지는 EPA를 증가시키는 것으로 나타나는 7.5 내지 8.0의 pH로 조정된다. 배지는 멸균될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발효 부피(배양 부피)은 약 2리터 이상, 약 10리터 이상, 약 50리터 이상, 약 100리터 이상, 약 200리터 이상, 약 500리터 이상, 약 1000리터 이상, 약 10,000리터 이상, 약 20,000리터 이상, 약 50,000리터 이상, 약 100,000리터 이상, 약 150,000리터 이상, 약 200,000리터 이상, 또는 약 250,000리터 이상이다. 일부 실시양태에서, 발효 부피는 약 2리터 내지 약 300,000리터, 약 2리터, 약 10리터, 약 50리터, 약 100리터, 약 200리터, 약 500리터, 약 1,000리터, 약 10,000리터, 약 20,000리터, 약 50,000리터, 약 100,000리터, 약 150,000리터, 약 200,000리터, 약 250,000리터, 또는 약 300,000리터이다.
세포는 1일 내지 60일 범위 동안 배양될 수 있다. 선택적으로, 배양은 14일 이하, 13일 이하, 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하, 5일 이하, 4일 이하, 3일 이하, 2일 이하, 1일 이하 동안 수행된다. 배양은 선택적으로 약 4℃ 내지 약 30℃, 예를 들어 약 18℃ 내지 약 28℃의 온도에서 수행된다.
하나의 실시양태에서, 약 20℃의 트라우스토키트리드에 대한 배양 온도는 EPA 백분율을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다.
배양에는 통기 진탕 배양, 진탕 배양, 정치 배양, 회분식 배양, 반연속식 배양, 연속 배양, 롤링 회분식 배양, 파동 배양 등이 포함될 수 있다. 배양은 통상적인 교반발효기, 기포탑 발효기(회분식 또는 연속식 배양), 파동발효기 등을 이용하여 수행할 수 있다.
배양물은 진탕을 비롯하여 하나 이상의 다양한 방법으로 폭기될(aerated) 수 있다. 선택적으로, 진탕 범위는 약 100rpm 내지 약 1000rpm, 예를 들어 약 350rpm 내지 약 600rpm 또는 약 100rpm 내지 약 450rpm이다. 선택적으로, 바이오매스 생성 단계와 지질 생성 단계 동안 다양한 진탕 속도를 사용하여 배양물에 공기를 공급한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 진탕 속도는 배양 용기의 유형(예컨대, 플라스크의 모양 또는 크기)에 따라 달라질 수 있다.
일반적으로 용존 산소(DO) 수준은, 질소가 모두 소모되는 지질 생산 단계(약 10 내지 20%)보다 바이오매스 생산 단계(50 내지 100%) 동안 더 높다. 따라서 DO 수준은 지질 생산 단계 동안 감소한다(즉, DO 수준은 바이오매스 생산 단계의 용존 산소량보다 적다). 그러나 지질 생산 단계에서 용존 산소를 낮추면 예기치 않게 EPA가 증가한다.
하나의 실시양태에서, 지방 생산 동안 약 10%의 DO는 EPA의 백분율을 약 23%에서 약 27%로 증가시킨다.
저온살균(pasteurization)
선택적으로, 생성된 바이오매스는 저온살균되어 세포를 죽이고 바이오매스에 존재하는 바람직하지 않은 물질을 비활성화한다. 예를 들어, 바이오매스를 저온살균하여 화합물 분해 물질을 불활성화할 수 있다. 바이오매스는 발효 배지에 존재할 수도 있고, 저온살균 단계를 위해 발효 배지로부터 분리될 수도 있다. 저온살균 단계는 바이오매스 및/또는 발효 배지를 상승된 온도로 가열함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 50℃ 내지 약 50℃(예를 들어, 약 50℃ 내지 약 90℃ 또는 약 65℃ 내지 약 80℃)의 온도로 가열될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스 및/또는 발효 배지는 약 30분 내지 약 120분(예를 들어, 약 45분 내지 약 90분, 또는 약 55분 내지 약 75분) 동안 가열될 수 있다. 저온살균은 직접 스팀 주입과 같이 당업자에게 공지된 적합한 가열 수단을 사용하여 수행될 수 있다.
수확 및 세척
선택적으로, 바이오매스는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수확될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 원심분리(예컨대, 고체 방출 원심분리기) 또는 여과(예컨대, 직교류 여과)와 같은 다양한 통상적인 방법을 사용하여 발효 배지로부터 선택적으로 수집될 수 있으며, 또한 상기 방법은 세포 바이오매스의 가속화된 수집을 위한 침전제(예컨대, 인산나트륨 또는 염화칼슘)의 사용을 포함할 수 있다.
선택적으로, 바이오매스는 물로 세척된다. 선택적으로, 바이오매스는 고형분이 약 20%까지 농축될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 고형분 약 5% 내지 약 20%, 고형분 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 고형분 약 15% 내지 약 20% 또는 언급된 범위 내의 모든 백분율로 농축될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스는 고형분 함량 약 20% 이하로 농축될 수 있다.
가수분해
세포 가수분해(즉, 세포 파괴)는 화학적, 효소적 및/또는 기계적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 세포를 가수분해하기 위한 화학적 방법은 세포에 산을 첨가하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 산 가수분해로 지칭된다. 산 가수분해 방법에서, 바이오매스는 예를 들어 원심분리를 사용하여 물로 세척되고, 세포를 가수분해하기 전에 전술한 바와 같이 농축될 수 있다. 선택적으로, 바이오매스는 물과 함께 약 15% 고형분으로 농축된다.
이어서 세척된 습윤 바이오매스에 산이 첨가된다. 선택적으로, 바이오매스는 산 첨가 전에 건조되지 않는다. 산 가수분해 단계에 사용하기에 적합한 산에는 황산, 염산, 인산, 브롬산(hydrobromic acid), 질산, 과염소산, 및 당업자에게 공지된 기타 강산이 포함된다. 세척된 습윤 바이오매스에 적합한 양의 산을 첨가하여 약 100mM 내지 약 200mM (예를 들어, 약 120mM 내지 약 180mM 또는 약 140 mM 내지 약 160 mM)의 최종 농도를 달성할 수 있다. 세척된 습윤 바이오매스에 황산을 최종 농도 160mM까지 첨가할 수 있다.
물, 바이오매스 및 산을 포함하는 생성된 혼합물은 이어서 일정 시간 동안 배양되어 세포를 가수분해할 수 있다. 선택적으로, 혼합물은 약 30℃ 내지 약 200℃의 온도에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 약 45℃ 내지 약 180℃, 약 60℃ 내지 약 150℃, 또는 약 80℃ 내지 약 130℃의 온도에서 배양될 수 있다. 선택적으로, 혼합물은 121℃ 온도의 오토클레이브에서 배양된다. 혼합물은 세포의 50% 이상(예를 들어, 세포의 60% 이상, 세포의 70% 이상, 세포의 80% 이상, 세포의 90% 이상, 세포의 95% 이상 또는 세포의 100%)을 가수분해하는 데 적합한 기간 동안 배양될 수 있다. 세포를 배양하는 기간은 배양 온도에 따라 다르다. 혼합물을 더 높은 온도에서 배양하면 가수분해가 더 빠른 속도로 진행될 수 있다(즉, 가수분해에 더 짧은 시간이 필요함). 일부 예에서, 세포는 60℃에서 1시간 동안 배양될 수 있다. 선택적으로, 배양 단계는 직접 또는 간접 저온살균 장비, 예를 들어 MicroThermics (예컨대, MicroThermics UHT/HTST Lab 25 EHV Hybrid)(노쓰캐롤라이나 롤리 소재)에서 시판되는 연속 흐름 열 시스템을 사용하여 수행된다.
전술한 바와 같이, 세포 가수분해(즉, 세포 파괴)는 효소적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 미생물 집단은 미생물을 파괴시키는 조건 하에서 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다. 선택적으로, 효소는 프로테아제이다. 적합한 프로테아제의 예는 ALCALASE 2.4L FG(Novozymes; 노쓰캐롤라이나 프랭클린턴 소재)이다. 선택적으로, 효소 가수분해 전에 세포는 물로 세척되지 않는다.
미생물 집단은 발효되어 수성 배지 중에 부유될 수 있다. 발효 배지는 발효기 내에서 중력-침전될 수 있고, 배지는 디캔팅되거나 다른 방법으로 제거되어 원하는 농도의 미생물 집단을 제공할 수 있다. 대안적으로, 발효 배지는 원심분리에 의해 농축되어 원하는 농도의 미생물 집단을 제공할 수 있다. 미생물 집단은 최대 20%의 고형분까지 농축될 수 있다. 예를 들어, 미생물 집단은 약 5% 내지 약 20% 고형분, 약 7.5% 내지 약 15% 고형분, 또는 약 15% 내지 약 20% 고형분, 또는 명시된 범위 내의 임의의 비율까지 농축될 수 있다. 미생물 집단은 미생물을 하나 이상의 효소와 접촉시키기 전에 농축될 수 있다.
미생물의 집단이 발효 배지에 있는 동안, 미생물은 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다(즉, 접촉 단계는 발효 배지 중에서 일어난다). 선택적으로, 발효 배지에 첨가되는 효소는 약 0.2% 내지 약 0.4% 부피/부피(v/v)의 농도로 존재한다. 예를 들어, 발효 배지에 첨가되는 효소는 0.2%(v/v), 0.25%(v/v), 0.30%(v/v), 0.35%(v/v) 또는 0.4%(v/v)의 농도일 수 있다.
접촉단계는 70℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 접촉 단계는 약 1시간 내지 약 20시간, 예를 들어 2시간 내지 18시간, 4시간 내지 16시간, 6시간 내지 14시간, 또는 8시간 내지 12시간, 또는 명시된 범위 내의 임의의 시간 동안 수행될 수 있다. 선택적으로, 접촉 단계는 약 4시간 동안 수행될 수 있고 가수분해 온도는 선택적으로 약 70℃일 수 있다.
최적의 온도, 시간, pH 및 효소 농도는 특정 효소에 따라 달라지며, 당업자는 주어진 효소에 대해 적절하게 온도, 시간, pH 및 효소 농도를 조정할 수 있을 것이다.
선택적으로, 접촉 단계는 약 0.2% 또는 약 0.4% 효소의 존재하에 약 55℃에서 약 18 내지 20시간 동안 수행된다. 예를 들어, 접촉 단계는 0.4% 효소의 존재하에 55℃에서 18시간 동안 수행될 수 있다. 대안적으로, 접촉 단계는 70℃에서 4 내지 6시간 동안 0.4% 효소의 존재하에 수행된다. 선택적으로, 접촉 단계는 계면활성제 부재 하에(즉, 계면활성제가 존재하지 않은 상태에서) 수행된다.
선택적으로, 세포 파괴는 당업자에게 알려진 다른 화학적 및 기계적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 파괴는 알칼리성 가수분해, 비드 밀링(bead milling), 초음파 처리, 세제(detergent) 가수분해, 용매 추출, 급속 감압(rapid decompression)(즉, 세포 폭탄(cell bomb) 방법) 또는 고전단 기계적 방법, 화학 물질과의 접촉, 균질화, 초음파 처리, 밀링, 전단력. 프렌치 프레스, 냉압착, 가열, 건조, 삼투압 충격, 압력 진동, 자가분해 유전자 발현 또는 이들의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 세포 파괴는 본원에 기술된 화학적, 효소적 및/또는 기계적 방법 중 둘 이상의 조합(예를 들어, 비드밀링과 조합된 효소 가수분해)을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 파괴 방법은 순차적으로(예컨대, 비드밀링 후 효소 가수분해) 수행될 수 있다.
추출
지질은 감소된 양의 유기 용매 존재(즉, 유기 용매 추출) 또는 유기 용매 부재 하에 미생물 집단으로부터 추출된다.
선택적으로, 추출 단계는, 전체 건조 미생물 세포로부터 지질을 추출하는 데 필요한 유기 용매의 양과 비교하여 감소된 양의 유기 용매를 사용하여 수행된다. 본원에 사용되는 "전체 건조 미생물 세포로부터 지질을 추출하는 데 필요한 유기 용매의 양과 비교하여 감소된 양의 유기 용매"라는 표현은, 전체 건조 미생물 세포로부터 지질을 추출하는 데 필요한 것보다 적은 유기 용매의 양을 의미한다. 예를 들어, 전체 건조 미생물 세포에 필요한 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비율은 일반적으로 1:4 또는 그 이상이다. 따라서, 유기 용매의 감소된 양은 약 1:4 미만의 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비율을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 가수분해된 습식 바이오매스로부터 오일을 추출하기 위한 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비율은 약 1:0.2 내지 약 1:1(예를 들어, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8 또는 1:0.9)일 수 있다. 선택적으로, 추가 양의 유기 용매가 사용될 수 있어, 미생물 또는 바이오매스 대 유기 용매의 비율이 약 1:6 까지일 수도 있다.
추출 단계에 사용하기에 적합한 유기 용매에는 헥산, 이소프로필 알코올, 염화메틸렌, 도데칸, 메탄올, 에틸화 오일 및 초임계 이산화탄소가 포함된다. 극성 지질(예컨대, 인지질)은 일반적으로 극성 용매(예컨대, 클로로포름/메탄올)로 추출되고, 중성 지질(예컨대, 트리아실글리세롤)은 일반적으로 비극성 용매(예컨대, 헥산)로 추출된다. 바람직한 용매는 순수한 헥산이다.
유기 용매 및 미생물 또는 바이오매스는 미생물 또는 바이오매스로부터 지질을 추출하기에 적합한 기간 동안 혼합될 수 있다. 예를 들어, 유기용매와 미생물 또는 바이오매스는 약 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 1시간 이상 또는 2시간 이상 혼합될 수 있다. 이어서, 용액을 원심분리하여 혼합물의 나머지 성분으로부터 지질을 분리할 수 있다.
선택적으로, 미생물에 의해 이론적으로 생산된 지질의 약 50% 이상이 이 방법을 사용하여 미생물 집단으로부터 추출된다(즉, 이 방법은 50% 이상의 수율을 제공한다). 예를 들어, 미생물 집단으로부터 추출된 지질의 수율은 600% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상일 수 있다.
지질은 또한 유기 용매 부재하에 미생물 집단으로부터 추출될 수 있다. 본원에 사용되는 "유기 용매 부재 하에"는, 유기 용매가 미생물 집단의 중량을 기준으로 약 0.5% 미만(예를 들어, 약 0.4% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.01% 미만, 약 0.005% 미만, 또는 0%)을 의미한다.
선택적으로, 지질은 오일(예컨대, 코코넛 오일) 또는 바이오연료(biofuel)를 사용함으로써 상기 파괴된 미생물로부터 추출될 수 있다.
선택적으로, 추출 단계 동안 첨가된 오일은 영양 오일(예를 들어, 영양소 공급원으로부터 유도되거나 얻어진 오일)일 수 있다. 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한 영양 오일의 예에는 코코넛 오일, 팜유, 카놀라유, 해바라기유, 대두유, 옥수수유, 올리브유, 홍화유, 팜핵유, 면실유 및 이들의 조합이 포함된다. 알킬화된 유도체(예를 들어, 메틸화된 또는 에틸화된 오일)와 같은 임의의 오일의 유도체도 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 "바이오연료"는 바이오매스 출발 물질로부터 유래된 임의의 연료, 연료 첨가제, 방향족 및/또는 지방족 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한 바이오연료는 식물 공급원 또는 조류(algal) 공급원으로부터 유래될 수 있다. 바이오연료에 적합한 공급원의 예에는 조류, 옥수수, 스위치그래스, 사탕수수, 사탕무, 유채, 대두 등이 포함된다.
선택적으로, 바이오연료는, 생물학적 공급원으로부터 오일을 수확하고 오일을 바이오연료로 전환함으로써 얻을 수 있다. 생물학적 공급원으로부터 얻은 오일(예를 들어 식물 및/또는 조류 공급원으로부터 얻은 오일)을 전환하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 선택적으로, 바이오연료를 얻는 방법은, 오일 생산 바이오매스(예컨대, 조류)를 배양하고, 오일(예컨대, 조류 오일)을 추출하고, 오일(예컨대, 조류 오일)을 전환하여 바이오연료를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 오일은 에스테르 교환반응을 사용하여 바이오연료로 전환될 수 있다. 본원에 사용ㄷ되는 "에스테르 교환반응"은 에스테르의 알콕시 기를 다른 알코올로 교환하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 에스테르교환 공정은 조류 오일(예를 들어 트리글리세리드)를 바이오디젤(예를 들어 지방산 알킬 에스테르 및 글리세롤)로 전환시키는 것을 포함할 수 있다. 에스테르 교환반응은 산 또는 염기 촉매 반응과 같은 전통적인 화학 공정을 사용하거나 효소 촉매 반응을 사용하여 수행될 수 있다.
선택적으로, 미생물에 의해 이론적으로 생산된 지질의 40% 이상이 이 방법을 사용하여 미생물 집단으로부터 추출된다(즉, 이 방법은 약 40% 이상의 수율을 제공한다). 예를 들어, 미생물 집단으로부터 추출된 지질의 수율은 적어도 약 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%일 수 있다.
대안적으로, 지질은 기계적 방법을 사용하여 추출될 수 있다. 가수분해된 바이오매스와 미생물은 원심분리될 수 있으며, 지질은 나머지 성분으로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 지질은 원심분리된 물질의 상부 층에 함유되어 있으며, 예를 들어 다른 물질로부터 흡입 또는 디캔팅에 의해 제거될 수 있다.
또 다른 대안에서, 지질 추출은, 유기 용매 사용 없이, 염을 첨가하거나 첨가하지 않고 pH를 조정함으로써 (예컨대 pH를 낮추거나 pH를 8 이상으로 높임으로써) 용해된 세포 조성물을 해유화함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 방법은 약 3g/kg 이상, 약 3.5g/kg 이상, 약 4g/kg 이상, 또는 약 5g/kg 이상의 평균 지질 생산 속도를 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 약 15% 초과, 바람직하게는 약 20% 초과, 더 바람직하게는 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 35% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과의 양으로 다중불포화 지질을 함유한다. 일반적으로, 본 발명의 공정에서 미생물에 의해 생산된 지질 중의 약 20% 이상이 오메가-3 및/또는 오메가-6 PUFA이고, 바람직하게는 지질 중의 약 30% 이상이 오메가-3 및/또는 오메가-6 PUFA이고, 보다 바람직하게는 지질 중의 약 40% 이상이 오메가-3 및/또는 오메가-6 PUFA이고, 가장 바람직하게는 지질 중의 약 50% 이상이 오메가-3 및/또는 오메가-6 PUFA이다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15% 또는 적어도 약 20%의 평균 EPA 함량을 제공한다.
제품
본원에 기재된 방법에 따라 생산된 다중불포화 지방산(PUFA) 및 기타 지질은 임의의 다양한 용도에, 예를 들어 생물학적 또는 영양학적 특성을 활용하는 용도에 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 화합물은 의약품, 식품 보충제, 동물 공급물 첨가제, 화장품 등에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 지질은 또한 다른 화합물의 생산에서 중간체로서 사용될 수 있다.
선택적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 최종 제품(예컨대, 식품 또는 공급물 보충제, 유아용 조제유, 의약품, 연료 등)에 포함될 수 있다. 본원에 기술된 지질을 포함시키기에 적합한 식품 또는 공급물 보충제에는 음료, 예컨대 우유, 물, 스포츠 음료, 에너지 음료, 차 및 주스; 과자류, 예컨대 젤리 및 비스킷; 지방 함유 식품 및 음료, 예컨대 유제품; 가공식품, 예컨대 연미(또는 죽); 유아용 조제분유; 아침 식사용 시리얼 등이 포함된다.
선택적으로, 하나 이상의 생산된 지질은 예를 들어 종합비타민과 같은 식이 보충제에 포함될 수 있다. 선택적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 식이 보충제에 포함될 수 있고, 선택적으로 식품 또는 사료의 성분(예컨대, 식품 보충제)에 직접 포함될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 생산된 지질이 혼입될 수 있는 사료의 예에는 애완동물 사료, 예컨대 고양이 사료; 개 사료 등; 관상어, 양식어류 또는 갑각류 등의 사료; 농장에서 사육되는 동물(예컨대 가축, 양식업에서 사육되는 어류 또는 갑각류 포함)의 사료이다. 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 지질이 혼입될 수 있는 식품 또는 사료 물질은 의도된 수용자인 유기체의 입맛에 맞는 것이 바람직하다. 이러한 식품 또는 사료 재료는 식품 재료에 대해 현재 알려진 임의의 물리적 특성(예컨대, 고체, 액체, 연질)을 가질 수 있다.
선택적으로, 생산된 화합물(예컨대, PUFA) 중 하나 이상을 의약품에 혼입할 수 있다. 이러한 의약품의 예에는 다양한 유형의 정제, 캡슐, 음용가능한 제제 등이 포함된다. 선택적으로, 의약품은 국소(topical) 적용에 적합한다. 투여 형태에는 예를 들어 캡슐, 오일, 과립, 미세과립, 분말, 정제, 환, 산제 등이 포함될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 생산된 지질은 임의의 다양한 제제와의 조합에 의해 본원에 기술된 제품 또는 조성물에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물은 하나 이상의 결합제 또는 충전제와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제품은 하나 이상의 킬레이트제, 안료, 염, 계면활성제, 보습제, 점도 조절제, 증점제, 연화제, 향료, 방부제 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 사용되는 부형제는 "약학적으로 허용되는" 것일 수 있다. "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 국제 약전에 동물, 특히 인간에 사용하기 위한 것으로 등재된 것을 의미한다. 본원에 논의된 것 이외에 부형제는 비제한적으로 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)]에 열거된 부형제를 포함할 수 있다. 본원의 특정 분류에 부형제(예컨대, "용매")를 포함시키는 것은 부형제의 역할을 제한하기보다는 설명하기 위한 것이다. 특정 부형제는 여러 분류에 속할 수 있다.
하기 실시예는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 양태를 추가로 설명하기 위한 것이며 청구범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 양태를 추가로 설명하기 위한 것이며 청구범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
이 예에서는, Na:K 비율이 59.7; 12.0; 6.0; 3.0; 및 2.0으로 평가되도록 하는 K2SO4 구배에서 성장할 때, 트라우스토키트리드의 성장 및 지방 생성 동역학(kinetics)을 결정하기 위해 실험을 수행했다. 초기 진탕 플라스크 실험에서, 스키조키트리움의 새로운 극저온 바이알(cryovial)은 초기에 해동되었고, 이후 22.5℃, 10% CO2 조건 하에서 배지에서 여러 회 성장 및 전달되었다. 배지(아래 참조)에서 성장한 7일된 스톡 배양물을 사용하여 접종(4%: 50mL 배지에 2mL 접종)하여, 배지가 포함된 3개의 접종 플라스크를 준비했으며, 이는 22.5℃, 10% CO2 조건에서 유지되었다.
오토클레이브-전(Pre-Autoclave) 성분
오토클레이브-후(Post-Autoclave) 첨가 성분
4일 동안 성장한 후, 3개의 접종 플라스크를 하나의 플라스크로 합치고, 실험 플라스크에 접종하는 데 사용했다. 시험될 K2SO4의 각 농도에 대해 600 nm에서의 광학 밀도 측정법을 사용하여 이론적 건조 중량 0.1 g/L로 8개의 진탕 플라스크를 접종했다. 실험용 진탕 플라스크 배양물을, 50g/L 글루코스를 사용하여 200rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기에서 22.5℃, 10% CO2 조건 하에 성장시켰다. 성장 3일째부터 10일째까지 매일, 시험될 K2SO4의 각 농도로부터 하나의 실험용 진탕 플라스크 배양물을 수확하여 건조 중량을 측정했다. 동결 건조 바이오매스를 FAME 분석으로 분석하여 지방산 프로필을 결정했다.
결과는 도 1a 내지 도 1c에 도시되어 있다. 약 2.0 내지 약 3.0의 낮은 Na:K 비율은 더 높은 비율에 비해 EPA의 백분율(gEPA/gFat * 100)을 증가시켰다 (도 1a).
K2SO4를 증가시켜 달성된 낮은 Na:K 비율은 EPA의 백분율을 선택적으로 증가시킬 수 있다.
이러한 결과는 유사한 조건 및 표준 용존산소 수준 및 pH 하에서 10L 발효를 사용하여 확인되었다. 구체적으로, 사용된 배지는 미국 특허 제9,045,785호의 표 2(아래)에 나와 있다. 세 가지 Na:K 비율(1.87; 2.50 및 3.56)이, 스키조키트리움의 세 가지 균주의 10L 발효에서 168시간 동안에 걸쳐 평가되었다. 결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다. 다시 말하면, 더 많은 양의 칼륨(K2SO4)(낮은 Na:K 비율)은 가장 낮은 수준에 비해 EPA의 백분율을 증가시켰다 (도 2a). 증가된 칼륨 수치는 DHA 백분율이나 총 지방 함량에 부정적인 영향을 미치지 않았다(각각 도 2b 및 도 2c 참조).
실시예 2
최적의 비율을 찾기 위해 KH2PO4 구배를 통해 질소 대 인 비율을 변경하는 효과를 조사했다. 스키조키트리움 균주와 함께 실시예 1에 제시된 배지를 사용하였다. 진탕 플라스크를 24℃ 및 5% CO2 배양기에서 200rpm의 진탕기에 넣었다. 실험은 3중으로 수행되었다.
배지 내 영양소의 초기 농도는 아래 표 2에 명시되어 있다.
표 2: 배지 내 영양소의 초기 농도
아래 표 3은 상기 실험의 실험적 설정치를 보여준다.
표 3: 플라스크 실험의 실험적 설정치
*엔젤 효모는 질소 11.8w%, 인 13407ppm을 함유함.
결과는 표 4에 나와 있으며, 이는 실험 10일차의 결과를 나타낸다. 이 결과는, 더 낮은 N:P 비율(NP=7.74 & NP=9.85)에 의한 더 높은 지방 %를 보여주지만, 가장 높은 KH2PO4 농도(N:P=7.74)은 또한 가장 많은 양의 포화물(16:0) 및 더 낮은 EPA 역가를 가졌다.
표 4: 10일차의 FAME, LFBM 및 역가 결과(LH240)
9.85의 N:P는 총 지방 백분율(64.37 ± 0.42) 및 DHA+EPA 역가(5.92 ± 2.1)에서 최고의 전체 성능을 나타냈다. DHA의 백분율은 임의의 N:P 비율에서 유의적으로 다르지 않았지만, EPA 백분율은 KH2PO4의 최고량 및 최저량에서 영향을 받았다. KH2PO4가 가장 낮은 조건 (N:P = 15.95, 14.26 및 12.38)에서 총 글루코스 소비가 가장 낮았다.
10일차 결과에 기초하면, 더 낮은 N:P가 더 높은 지방 %의 경향이 있다. N:P =9.85는 전체적으로 가장 많은 지방%인 64.4%(11% EPA 및 52.9% DHA) 및 5.93의 DHA+EPA 역가를 제공하였다.
10일차의 지방 역가와 지방 %는 각각 도 3a 및 도 3b에 나와 있으며, 이들은 각각, 표준 편차와 함께 각 조건의 수준이 N:P 9.85 내지 12.38에서 유의적인 차이를 나타냄을 보여준다. 이러한 차이는, KH2PO4 농도가 지질 생산 단계에 미치는 영향을 나타내며, 이는 시험된 N:P 비율 중 어느 것에서도 린(lean) 지방 바이오매스(LFBM)에 영향을 미치지 않기 때문이다. 한 가지 가능한 설명은 KH2PO4가 말산 효소(ME), 글루코스-6-인산 탈수소효소(GD6PDH) 및 이소시트레이트 탈수소효소 활성 수준에 영향을 미친다는 것이며, 이는 초기 발효부터 후기 발효까지 스키조키트리움 종 HX-308의 지방산 합성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
KH2PO4 배취되지 않은 조건(N:P 15.95)은 5 g/Kg 초과의 LFBM을 나타냈는데, 이는 다른 비율과 유사하지만 지질 생성의 증가를 나타내지 않는다.
EPA는 또한 N:P 비율 구배에서도 달랐다. KH2PO4의 최고 농도 (N:P=7.74)는 지질 프로필에 영향을 미쳤으며, 포화물의 양(16:0)은 증가하고 EPA 백분율은 유의적으로 감소했다. 이는 더 많은 양의 KH2PO4가 이 균주에서의 지질 생산 프로필에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 또한 가장 낮은 KH2PO4 농도(N:P=15.95)에서도 EPA 백분율이 감소한 것으로 나타났으나, 이는 N:P 비율이 더 높은 조건에서 총 지방 생산이 더 낮기 때문일 가능성이 높다.
역가 및 EPA 백분율은 10일차에 약 14.26의 N:P 비율(각각 도 3c 및 도 3d)에서 크게 증가했다.
DHA의 역가는 3 가지의 더 낮은 N:P 비율(7.74, 9.85 및 12.38)에서 유의적으로 변하지 않았고 높은 비율(14.26 및 15.95)에서만 약간 변화했는데, 이는 이러한 조건에서 총 지방 생산이 더 낮기 때문일 가능성이 높다 (도 3e).
본 실험에서 얻어진 글루코스 농도/소비 속도는, 제1 수확 시점(LH72)까지 NH4와 PO4의 농도가 0이었기 때문에, 지질 생산 단계 동안이었다. 질소 제한 후에 지질 생산이 시작된다고 가정하면, N:P가 가장 높은 조건 (더 낮은 KH2PO4)에서 LH168에 의해 소비 속도가 유의적으로 감소했다. 배취된 KH2PO4의 낮은 수준은 세포가 이용가능한 모든 글루코스를 대사하는 능력에 영향을 미쳤다. 7.74 및 9.85의 더 낮은 N:P 조건은 대부분의 당을 소비하고 더 많은 바이오매스를 생성했다. 그러나 LFBM은 모든 조건(대략 5g/L)에서 유사했다. 이는 KH2PO4가 지질 생산 단계에서 더 큰 영향을 미친다는 것을 의미할 수 있다.
실시예 3
추가 질소 공급이 없는 대조군과 비교하여 생산 단계 동안의 질소 첨가를 평가하기 위해 실험을 수행했다. 제한 없이, 생산 단계 동안 황산암모늄 또는 글루타메이트와 같은 질소 공급원을 첨가하면 NADPH 풀(pool)을 재생하고 후기 지질 생산 단계 동안 지방 및 PUFA의 더 높은 생산성을 유지할 수 있다는 가설이 세워졌다.
배지내 배취된 질소 및 인산염이 고갈된 후, 5일차에, 황산암모늄 또는 글루타민산나트륨을 각각 10mM(0.36g/L 암모늄 이온) 또는 20mM(2.9g/L 글루타메이트)로 첨가한 것을 제외하고는, 스키조키트리움을 사용하여 실시예 1에 설명된 대로 발효를 수행했다.
글루코스 소비(도 4a): 황산암모늄을 첨가하면 표준 발효와 비교하여 글루코스 소비에 큰 영향을 미치지 않은 반면, 글루타민산 일나트륨(상단선)을 첨가하면 표준 발효에 비해 글루코스 소비가 약 1.25g에서 10일 후 1.6g으로 증가했다. 질소 공급과 표준 발효의 글루코스 소비를 비교하는 도 4a를 참조한다.
린(lean) 바이오매스에 대한 영향(도 4b): 두 가지 질소 공급원 모두의 첨가는 린 바이오매스를 증가시켰다. LFBM의 증가는 10일 후 황산암모늄(중간선)보다 글루타메이트(상단선)에서 훨씬 더 크고 더 빨랐다.
지방 함량(도 4c): (유형에 관계없이) 질소를 첨가하면 FAME에 의해 측정된 지방 함량 %가 감소했다. 지방 함량의 감소는 황산암모늄 첨가(하단선)의 경우 더 높았다.
지방 역가(도 4d): 총 지방 백분율이 낮음에도 불구하고, 글루타메이트와 황산암모늄을 첨가하면 지방 역가(g/kg)에 반대 효과가 나타났다. 글루타메이트(상단선)는 대조군(중간선)에 비해 지방 역가를 증가시킨 반면, 황산암모늄(하단선)은 대조군에 비해 지방 역가를 감소시켰다.
효능(도 5a): 황산암모늄을 첨가하면 총 지방 함량이 감소하는 반면, PUFA 효능은 증가했다(상단선, 즉 총 지질 대비 PUFA %). 글루타메이트는 10일 후 효능에 반대 효과를 나타냈다(하단선). 전반적으로, 변화는 몇 퍼센트 포인트 이내였다.
DHA 및 EPA 조성 (도 5b): DHA 및 EPA의 백분율은 10일 후에, DHA(점선)가 더 많고 EPA(실선)가 더 적은, 두 가지 질소 공급원을 사용한 대조군과 유사하게 유지되었다.
PUFA 역가(도 5c 및 도 5d): 글루타메이트를 첨가하면 또한 대조군에 비해 g/kg DHA(도 5c, 상단선) 및 EPA(도 5d, 상단선)이 증가했다. 황산암모늄은 총 지방 함량을 감소시켰지만 PUFA 효능을 감소시켰다.
q-비율: DHA, EPA 및 지방에 대한 q-비율은 t-시간에 걸쳐 세포 g에 의해 생산된 생성물(g-생성물/(g-세포*hr))로 계산되었다. 글루타메이트를 첨가하면 총 지방 역가가 증가했고(도 5, 위), 이러한 증가는 대조군(도 6a의 중간선)과 비교하여 평균 q-지방(도 6a, 상단선)의 상응하는 증가에 의해 주도되었다.
DHA 및 EPA 역가 증가에 대한 글루타메이트의 효과는 해당 q-비율의 유사한 증가로 설명될 수도 있다. 글루타메이트는 EPA의 q-비율의 개선에 가장 큰 영향을 미쳤으며(도 6b 및 도 6c), 7일차와 10일차 사이에 더 높은 q-EPA를 유지한다. 글루타메이트를 첨가하면 지방 및 PUFA 역가가 증가했지만 린 바이오매스도 증가했고, 그 결과 글루코스 수율이 낮아졌다. 본 발명을 제한하지 않으면서, 생산 단계 동안 질소를 첨가하면 NADPH 풀을 재생하고 중간 및 후기 지질 생산 단계 동안 PUFA의 더 높은 생산성을 유지할 수 있다는 가설이 세워졌다. DHA의 q-비율은 증가하지 않았지만(도 6d), 총 DHA(g/kg)은 또한 대조군과 비교하여 황산암모늄으로도 증가했다(도 6e).
0.36 g/L(10mM) 농도의 암모늄을 첨가하는 것이 지질 생산을 희생하면서 성장을 유발시켰고, 이는 수율을 상당히 낮아지게 저하시켰다. 역사적으로는 성장 단계 동안 10L에서 0.1g/L 미만의 암모니아 수준이 성장의 지연을 초래하였기 때문에 이 결과는 놀라운 것이다.
개시된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 본원에 인용되어 포함된다.
Claims (25)
- 성장 및 발효 배지에서 칼륨을 증가시키거나 나트륨을 감소시켜 나트륨 대 칼륨 비율을 낮추는 것을 포함하는, 미생물에서의 에이코사펜타엔산(EPA)의 생산을 증가시키는 방법.
- 제1항에 있어서,
칼륨이 황산칼륨인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
나트륨 대 칼륨 비율이 약 1.85 내지 약 3.5인, 방법. - 제3항에 있어서,
나트륨 대 칼륨 비율이 약 2 내지 3인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
총 지질 중의 %로서의 에이코사펜타엔산의 백분율이, 나트륨 대 칼륨 비율이 더 높은 표준 발효 배지에 비해 약 8 내지 20% 증가되는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
미생물이 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목(order)인, 방법. - 제6항에 있어서,
트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)의 종이 스키조키트리움(Schizochytrium)인, 방법. - 성장 및 발효 배지에서 인의 양을 감소시켜 질소 대 인 비율을 증가시키는 것을 포함하는, 미생물에서의 지질 생산을 증가시키는 방법.
- 제8항에 있어서,
인은 인산칼륨으로 제공되는, 방법. - 제8항 또는 제9항에 있어서,
지질이 다중불포화 지방산인, 방법. - 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
약 7 내지 약 13, 선택적으로 약 10의 질소 대 인 비율이, 생산된 지질의 백분율을 증가시키고/시키거나 지질 역가(lipid titer)를 증가시키는, 방법. - 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
약 9.5 내지 15, 선택적으로 약 14 내지 15의 질소 대 인 비율이, 총 지질 중의 %로서의 생산된 에이코사펜타엔산(EPA)의 백분율을 증가시키는, 방법. - 제12항에 있어서,
EPA 백분율이 약 5% 이상 증가되는, 방법. - 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
미생물이 트라우스토키트리알레스 목인, 방법. - 제14항에 있어서,
트라우스토키트리알레스의 종이 스키조키트리움(Schizochytrium) 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)인, 방법. - 지질 생산(발효) 단계 중에 질소를 첨가하는 것을 포함하는, 미생물에서의 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법.
- 제16항에 있어서,
질소가 글루타메이트, 선택적으로 글루타민산 일나트륨, 또는 황산암모늄인, 방법. - 제16항 또는 제17항에 있어서,
질소가 글루타메이트인, 방법. - 제18항에 있어서,
글루타메이트가 약 3.0 g/L로 첨가되는, 방법. - 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
다중불포화 지방산이 EPA 및/또는 도코사헥사엔산(DHA)인, 방법. - 제20항에 있어서,
EPA 및/또는 DHA가 25% 이상 증가되는, 방법. - 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
질소가 황산암모늄인, 방법. - 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
생산 증가가 다중불포화 지방산 역가에서의 증가인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
EPA 대 DHA의 비가 약 0.5:1 내지 2:1인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
EPA 대 DHA의 비가 약 0.5:1 내지 1:1인, 방법.
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