KR20240130711A

KR20240130711A - 불안 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서 포스트바이오틱스의 용도

Info

Publication number: KR20240130711A
Application number: KR1020247022840A
Authority: KR
Inventors: 마리아 엠파르 체놀 꾸아드로스; 패트리샤 마르토렐 게롤라; 마르타 토르타자다 세라; 다니엘 라몬 비달; 안토니아 로자스 마르티네즈; 페란 발라구에르 비달; 실비아 로피스 플라; 로버토 마르티네즈 아빌라; 바네사 로블레스 로드리게즈; 마르타 페르난데즈 리에스코
Original assignee: 바이오폴리스, 에스.엘.
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2024-08-29
Also published as: CA3239145A1; WO2023111270A1; CN118922199A; AU2022410395A1; EP4429686A1; US20250049863A1; JP2024546663A; MX2024006254A

Abstract

본 발명은 비생존성(non-viable) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주를 포함하는 포스트바이오틱스(postbiotic) 조성물과 불안 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서 이와 관련된 용도에 관한 것이다.

Description

불안 장애의 치료 및/또는 예방에 있어서 포스트바이오틱스의 용도

"장-뇌 축(the gut-brain axis)"이라고 불리는 뇌와 장 사이의 양방향 소통이 장의 항상성뿐만 아니라 뇌 기능 유지에 잠재적인 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있다. 연구에 따르면 경구 투여되는 프로바이오틱스(probiotics)와 같은 특정 유형의 미생물이 장-뇌 축을 수정하고 스트레스 반응을 조절할 수 있으며, 이는 프로바이오틱스가 "미생물군-장-뇌 축(the microbiota-gut-brain axis)"을 조절하여 우울증이나 불안 장애와 같은 기분 장애(mood disorder)를 관리하는 데 치료적 역할을 할 수 있음을 시사한다.

여러 가지 생존 가능한 프로바이오틱스 균주 및 혼합물이 불안 및 기타 행동 지표에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 무생물(inanimate) 형태의 프로바이오틱스를 포함하되 이에 국한되지 않으며, 이들 모두는 포스트바이오틱스(postbiotics)로 알려져 있고, 고스트(ghost) 프로바이오틱스 또는 파라프로바이오틱스(paraprobiotics)라고도 불리는, 비생존성, 무생물, 불활성화 또는 열처리된 형태의 미생물을 사용하는 것과 관련된 불안에 대한 긍정적인 결과에 대한 증거는 매우 제한적이다.

이러한 비생존성 미생물 균주의 사용은 산업적 응용과 매우 관련이 있으며, 까다로운 환경에서 제품을 사용하고 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 가혹한 매트릭스나 공정을 사용하는 것을 가능하게 한다.

따라서, 불안 장애의 치료를 위한 포스트바이오틱스 조성물을 개발할 필요가 있다.

본 발명의 저자들은 비생존성 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주의 혼합물을 장기간 섭취하면 다니오 레리오(Danio rerio)(제브라피쉬)에 기반한 행동 및 불안 모델에서 긍정적인 결과를 가져온다는 사실을 발견하였다. 놀랍게도, 가장 좋은 결과는 생존성 또는 비생존성인 각각의 종 단독이나 생존성 프로바이오틱스 혼합물(blend) 자체보다 열처리된 포스트바이오틱스 혼합물에서 얻어졌다.

또한, 열처리된 락토바실러스 람노서스(L. 람노서스)와 비피도박테리움 롱 검(B. 롱검) 균주의 다양한 조합을 이용한 비교 분석을 카엔노랩디티스 엘레간 스(Caenorhabditis elegans)(C. 엘레간스) 불안 모델에서 수행하였으며, 열처리된 B. 롱검 균주 CECT 7347(HT-ES1 또는 HT-IATA-ES1이라고도 함)과 L. 람노서스 균주 CECT 8361(HT-BPL15 또는 HT-BPL0015라고도 함)의 혼합물을 처리한 경우 B. 롱검과 L. 람노서스 종에 속하는 다른 열처리된 균주를 조합한 경우보다 불안 행동의 현저히 개선된 감소를 나타내었다(실시예 3).

따라서, 일 측면에서, 본 발명은 비생존성 비피도박테리움 롱검 균주 CECT 7347 및 비생존성 락토바실러스 람노서스 균주 CECT 8361을 포함하는 포스트바이오틱스 조성물("본 발명의 포스트바이오틱스 조성물" 또는 "본 발명의 조성물")에 관한 것이다.

L. 람노서스 CECT 8361(BPL15 또는 BPL0015)은 생후 3개월 미만의 건강하고 모유 수유 중인 어린이의 대변에서 분리되었다. 이 균주는 2013년 5월 27일 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁 기관인 스페인 타입 컬쳐 컬렉션(Spanish Type Culture Collection)에 기탁되었다(Building 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, C/ Catedratico Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN에 소재함). 할당된 기탁 번호는 CECT 8361이다.

B. 롱검 CECT 7347(ES1 또는 IATA-ES1)은 생후 3개월 미만의 건강하고 모유 수유 중인 어린이의 대변에서 분리되어 2007년 12월 20일 부다페스트 조약에 따라 국제 기탁 기관인 스페인 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었다(Building 3 CUE, Parc Cientific Universitat de Valencia, C/ Catedratico Agustin Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN에 소재함). 할당된 기탁 번호는 CECT 7347이다.

본원에서 사용되는 용어 "포스트바이오틱스 조성물"은 무생물 박테리아 또는 그 성분을 포함하여 적어도 하나의 포스트바이오틱스를 포함하는 모든 조성물과 관련된다. 국제 프로바이오틱스 및 프리바이오틱스 과학 협회(International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics, ISAPP)에서 제공하는 정의에 따르면, 포스트바이오틱스는 "숙주에게 건강상의 이점을 부여하는 무생물 미생물 및/또는 그 성분의 제제"이다(Sallines et al. 2021 Nature Rev Gastroenterol Hepatol. 18(9):649-667). 반대로, 세계보건기구에 따르면, 프로바이오틱스는 "적절한 양으로 투여할 경우 숙주에게 건강상의 이점을 부여하는 살아있는 미생물"이다.

지난 몇 년 동안은 경쟁적 배제나 면역 체계의 조절을 통해 병원균으로부터 숙주를 보호하는 것과 같은 건강 증진 효과를 나타내는 장내 미생물군(gut microbiota)의 구성원에 대한 연구가 집중되었다. "장내 미생물군"이라는 용어는 인간의 위장관에서 적응하고 생존하도록 진화한 다양한 미생물 군집과 관련이 있다. 장내 미생물군은 다양한 방식으로 인간 숙주와 상호 작용한다; 미생물은 무해한 공생균(commensal), 기회 병원균 또는 건강 증진 또는 프로바이오틱스 미생물일 수 있다. 후자의 활성에 대한 연구는 지난 20년 동안 상당히 증가하였으며, 많은 임상 및 동물 모델 기반 연구에서 프로바이오틱스 제제가 조사되고 있다.

본 발명에서, 포스트바이오틱스 조성물은 B. 롱검 및 L. 람노서스에 속하는 비생존성 박테리아를 포함한다. 두 종의 분류학은 아래에 자세히 설명되어 있다.

비피도박테리움 속의 구성원은 인간의 위장관(GIT)에 처음으로 정착한 미생물 중 하나이며 숙주에게 긍정적인 건강상의 이점을 제공하는 것으로 여겨진다. 비피도박테리아는 이들의 관련된 건강상의 이점과 일반적으로 안전하다고 인식되어 프로바이오틱스 제제로 상업적으로 활용되어 왔다. 건강을 증진하는 것으로 알려진 특성 때문에, 이 박테리아는 많은 기능성 식품에 활성 성분으로 포함되어 왔다.

비피도박테리아는 동물의 GIT, 예컨대 인간의 구강, 곤충의 장 및 하수(sewage)에 직접 또는 간접적으로 연결된 다양한 생태적 틈새(niche)에서 자연적으로 발생한다. 이러한 특정 생태적 틈새에서 생존하기 위해서는, 비피도박테리아는 경쟁력을 갖추기 위해 특정 적응력을 보유해야 한다.

비피도박테리움은 그람 양성, 비운동성(non-motile)이며, 종종 분지형인 혐기성 박테리아이다. 이들은 포유류의 GIT 미생물군을 구성하는 주요 박테리아 속 중 하나이며, 30개 이상의 다양한 종으로 구성되어 있다. 그 중 B. 롱검은 카탈라아제(catalase) 음성, 분지형 막대 모양의 박테리아이다.

락토바실러스(현재 락티카제이바실러스(Lacticaseibacillus)로 알려짐)는 Lactobacillaceae 과에서 가장 큰 속이다. 23개의 다른 속으로 재분류되기 전에는(Zheng et al. 2020 Int J Syst Evol Microbiol. 70(4):2782-2858), 과일, 육류, 사워도우, 채소 및 와인과 같은 발효 식품과 관련된 환경뿐만 아니라 인간과 동물의 위장관 및 질에서도 일반적으로 분리된 196종의 유효하게 발표된 종으로 구성되어 있었다. 현재 식품, 사료, 제약 및 생명공학과 관련된 분야에서 널리 활용되고 있으며; 예를 들어 유제품 스타터, 프로바이오틱스, 백신 운반체 및 사일리지 접종제(silage inoculant)로 사용되고 있다.

락토바실러스는 그람 양성, 막대 모양, 통성 혐기성 또는 미호기성(microaerophilic), 비포자 형성, 내산성(acid-tolerant) 및 카탈라아제 음성 박테리아로 DNA G+C 함량은 46 내지 58 mol%이다. 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei ), 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 및 락토바실러스 람노서스는 계통발생학적으로나 표현형적으로 밀접한 관련이 있으며, 이전에는 L. 카제이 그룹으로 간주되었다(Zheng et al. 2020 Int J Syst Evol Microbiol. 70(4):2782-2858). 이 그룹에 속하는 프로바이오틱스 균주는 전 세계적으로 발효 유제품이나 식품 보충제 및 숙주 건강 증진을 위한 프로바이오틱스로 사용되고 있다.

본 발명의 포스트바이오틱스 조성물은 비생존성 형태의 박테리아 B. 롱검 및 L. 람노서스를 포함한다. 본원에서 사용되는 "비생존성", "무생물", "비활성" 또는 "비활성화"라는 용어는 대사적으로 또는 생리적으로 비활성인 미생물, 즉 영양소를 투여한 후 대사 활동 및 신장하는 능력을 유지하지 않는 모든 미생물과 관련된다. 생존성은 미생물이 고체 배지에서 콜로니를 형성하는 능력, 즉 배양 능력과는 별개이다.

식품 산업에서 열처리는 오랜 역사를 가지고 있기 때문에 미생물을 비활성화하기 위해 많은 경우에 열처리가 사용될 가능성이 높다. 미생물을 비활성화하는 일반적인 절차는 열처리이다. 열은 미생물에게 치명적이지만, 각 종은 고유한 내열성을 가지고 있다. 저온 살균(pasteurization), 틴달리제이션(tyndallisation) 및 오토클레이빙(autoclaving)와 같은 열적 파괴 과정에서, 박테리아의 파괴 속도는 성장 속도와 마찬가지로 대수적이다. 따라서, 열에 노출된 박테리아는 존재하는 유기체의 수에 비례하는 비율로 사멸된다. 이 과정은 노출 온도와 이 온도에서 원하는 파괴 속도를 달성하는 데 필요한 시간 양자 모두에 따라 달라진다.

본 발명의 일부 구현예에서, 비생존성 비피도박테리움 롱검 및 락토바실러스 람노서스 균주는 열처리된다. 따라서, 바람직한 구현예는 본 발명의 조성물을 제공하며, 여기서 비생존성 비피도박테리움 롱검 균주 CECT 7347은 열처리되고 비생존성 락토바실러스 람노서스 균주 CECT 8361은 열처리된다.

본 발명은 또한 본 발명의 포스트바이오틱스 조성물의 일부가 될 수 있는 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 균주("모 균주")에서 유래된 박테리아 균주도 고려하며 이는 이들이 대상체의 불안 장애 증상을 감소 및/또는 개선하는 능력을 보유하기 때문이다.

본 발명의 조성물 내에 포함된 모 균주로부터 유래된 박테리아 균주의 예로는 본 발명의 균주의 게놈과 비교하여 게놈에 변이를 나타내는 유전자 변형 유기체를 포함하며, 여기서 변이는 대상체의 불안 장애 증상을 감소 및/또는 개선하는 균주 및/또는 그 성분의 능력에 영향을 미치지 않는다.

B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361으로부터 유래된 균주는 돌연변이 유발제 또는 스트레스 요인의 존재 하에 모 균주를 배양하거나, 특정 유전자를 변형, 삭제 및/또는 삽입하기 위한 유전자 조작을 포함하되 이에 국한되지 않는, 당해 기술 분야에서 알려진 돌연변이 유발 방법을 통해 자연적으로 또는 의도적으로 생산될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체의 불안 장애 증상을 예방, 감소 및/또는 개선하는 능력을 보유하는 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 균주에서 유래한 유전자 변형 유기체를 고려하며, 따라서 상기 조성물은 상기 장애의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

일부 특정 구현예에서, 본 발명은 또한 B. 롱검 CECT 7347 및/또는 L. 람노서스 CECT 8361 균주에 의해 분비되는 박테리아 성분, 대사산물 및 분자 및/또는 상기 성분을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 불안 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 이들의 용도를 고려한다.

박테리아 성분에는 제한 없이 세포벽 성분(비제한적인 예로, 펩티도글리칸); 핵산; 막 성분; 및 단백질, 지질, 탄수화물, 및 이들의 조합(예컨대 지단백질, 당지질 또는 당단백질)이 포함된다. 대사산물에는 박테리아가 성장하는 동안, 기술적 공정에서 사용하는 동안 또는 보관하는 동안 대사 활성의 결과로 생성되거나 변형된 모든 분자가 포함될 수 있다. 이러한 대사산물의 예로는 유기산 및 무기산, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 지질, 탄수화물, 지단백질, 당지질, 당단백질, 비타민, 염, 미네랄 또는 핵산이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 분비 분자에는 박테리아가 성장하는 동안, 기술적 공정(예: 식품 가공 또는 약물)에서 사용하는 동안 또는 보관하는 동안 외부로 분비되거나 방출되는 모든 분자가 포함된다. 이러한 분자의 예로는 유기산 및 무기산, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 효소, 지질, 탄수화물, 지단백질, 당지질, 당단백질, 비타민, 염, 미네랄 또는 핵산이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제학적 투여, 즉 대상체에게 임의의 투여 수단으로 투여되는 약제학적 제품의 일부를 형성하기 위해 제형화될 수 있으며; 및/또는 식품 투여, 즉 대상체의 식단에서 소비되는 식품 또는 영양 보충제의 일부를 형성하기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물("본 발명의 약제학적 조성물") 및/또는 영양학적 조성물("본 발명의 영양학적 조성물")이다.

본 발명의 조성물은 비생존성 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 (및/또는 이로부터 유래된 균주 및/또는 세포 성분)을 임의의 적합한 농도로 포함한다.

추가적으로, 본 발명의 조성물은 (i) 대상체의 불안 장애의 예방 및/또는 치료에 유용한 활성으로서, 생물학적, 약리학적 및/또는 수의학적으로 유용한 활성을 갖는 하나 이상의 성분 또는 화합물; 및/또는 (ii) 대상체에게 투여 시 본 발명의 조성물에 포함된 포스트바이오틱스의 활성을 증가, 향상 및/또는 촉진할 수 있는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 추가 성분 또는 화합물은 본 발명의 조성물의 비생존성 균주에 의해 발휘되는 효과와 양립 가능해야 한다.

용어 "약제학적 조성물"은 수의학적 조성물도 포함한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다.

용어 "부형제"는 본 발명의 조성물의 모든 성분 또는 화합물, 즉 본 발명의 균주의 흡수를 돕거나, 성분 또는 화합물을 안정화하고, 및/또는 약제학적 조성물의 제조를 보조하여 농도나 풍미를 부여하여 더욱 좋게 하는 물질을 지칭한다. 따라서, 부형제는 예시적으로 성분(예를 들어, 전분, 설탕 또는 셀룰로스)을 결합시키고, 감미하고, 착색하고, 활성 성분을 보호(예를 들어, 공기 및/또는 습기로부터 절연)하고, 알약, 캡슐 또는 기타 제제를 충진하는 기능, 또는 성분의 용해를 촉진하기 위한 붕해 기능을 가질 수 있지만, 이에 국한되지는 않으며, 이 단락에 나열되지 않은 다른 부형제를 배제하지 않는다. 따라서 "부형제"라는 용어는 갈레닉(galenic) 형태에 포함된 물질이 활성 성분 또는 그 결합물에 첨가되어 제조 및 안정성을 가능하게 하고, 관능적 특성을 변형하거나 약제학적 조성물의 물리적 및 화학적 특성과 생물학적 이용가능성을 결정하는 물질로 정의된다. "약제학적으로 허용되는" 부형제는 약제학적 조성물의 성분 또는 화합물의 활성을 허용해야 하며, 즉 본 발명의 균주가 발휘하는 효과와 양립할 수 있어야 한다.

"갈레닉 형태" 또는 "약제학적 형태"는 활성 성분과 부형제가 약제학적 조성물 또는 약물을 제공하도록 적응되는(adapted) 구성이다. 이는 제조업체가 약제학적 조성물을 제시하는 형태와 투여되는 형태의 조합으로 정의된다.

"비히클" 또는 "담체"는 바람직하게는 불활성 물질이다. 담체의 기능은 다른 성분 또는 화합물의 통합을 용이하게 하고, 더 나은 투여량 및 투여를 허용하고, 및/또는 약제학적 조성물에 일관성과 형태를 부여하는 것이다. 따라서, 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 성분 또는 화합물을 주어진 부피 또는 중량으로 희석하기 위해 약물에서 사용되는 물질이거나; 또는 이러한 성분 또는 화합물을 희석하지 않고도 더 나은 투여량 및 투여를 허용하고/하거나 약물에 일관성 및 형태를 부여할 수 있는 물질이다. 제시(presentation)가 액체일 때, 약제학적으로 허용되는 담체는 희석제이다. 담체는 천연 또는 비천연일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염 용액, 알코올, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 전분, 아밀로스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산의 모노글리세리드 및 디글리세리드, 지방산 에스테르 석유(fatty acid esters petroetral), 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

또한, 부형제와 담체는 약리학적으로 허용 가능해야 하며, 즉, 부형제와 담체는 투여되는 대상체에게 손상을 일으키지 않도록 허용되고 평가된 것이어야 한다.

각 경우에 조성물의 제시는 사용되는 투여 유형에 맞게 조정될 것이다. 따라서, 조성물은 용액 또는 임상적으로 허용되는 투여의 다른 형태로, 그리고 치료적 유효량으로 제시될 수 있다. 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 용액, 좌약, 겔 또는 마이크로스피어와 같은 고체, 반고체 또는 액체 제제로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 액체 형태 또는 고체 형태로 제형화된다.

또 다른 특정 구현예에서, 고체 제형은 정제, 로젠지, 과자(sweet), 츄어블 정제, 츄잉껌, 캡슐, 사쉐, 분말, 젤, 과립, 코팅 입자 또는 코팅 정제, 정제, 알약, 트로키, 위장 내성 정제 및 캡슐 및 분산성 스트립 및 필름으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 특정 구현예에서, 액체 제형은 경구 용액, 현탁액, 액적(droplet), 에멀전 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

마찬가지로, 예를 들어 리포좀, 마이크로버블, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 등에 캡슐화하는 것을 포함하여, 본 발명의 조성물의 서방형(sustained release) 투여에 사용될 수 있는 다양한 시스템이 알려져 있다. 적합한 서방형 형태와 이의 제조를 재료 및 방법은 최신 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 경구 투여 형태는 적어도 하나의 코팅 또는 매트릭스를 더 포함하는 서방형 형태이다. 서방형 코팅 또는 매트릭스는 천연 반합성 또는 합성 폴리머, 수불용성 또는 변형, 왁스, 지방, 지방 알코올, 지방산, 천연, 반합성 또는 합성 가소제 또는 이들 두 가지 이상의 조합을 포함하되 이에 국한되지 않는다. 장용 코팅은 당해 기술 분야의 숙련자에게 알려진 통상적인 공정을 사용하여 적용할 수 있다.

위에서 설명한 것 외에도, 본 발명은 또한 본 발명의 조성물이 다른 성분 또는 화합물과 함께 대상체에 투여될 수 있는 가능성도 포함하지만, 이들은 본 발명의 조성물의 일부가 아니다. 이러한 성분 또는 화합물의 예는 앞의 단락에 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 영양학적 조성물이다. 본 발명의 영양학적 조성물은 또한 비생존성 박테리아 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 (및/또는 이로부터 유래된 균주 및/또는 세포 성분)을 임의의 적합한 농도로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 L. 람노서스 CECT 8361 및 B. 롱검 CECT 7347 (및/또는 이로부터 유래된 균주 및/또는 세포 성분)을 임의의 적합한 농도로 포함한다.

본 발명의 조성물이 영양학적 조성물로 제형화되는 경우, 상기 영양학적 조성물은 식품이거나 인간 및/또는 동물 소비를 목적으로 하는 식품 또는 식품 제품에 통합될 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 식품 또는 영양 보충제이다.

본 발명의 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 특정 영양학적 및/또는 기능적, 생물학적 및/또는 생리적 목적을 위한 식품이다. 본 발명의 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 의약용 식품이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 영양 또는 식이 보충제이다.

본 발명에서, 용어 "영양학적 조성물"은 그것을 섭취하는 대상체에게 영양을 제공하는 것과 상관없이, 더 나은 건강과 웰빙을 활용 및/또는 제공하도록 신체의 하나 이상의 기능에 유익하게 영향을 미치는 모든 식품을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 영양학적 조성물은 불안 장애를 완화, 감소, 치료 및/또는 예방하기 위한 것이다.

"보충제"라는 용어는 "식이 보충제", "영양 보충제", "식품 보충제" 또는 "영양 보충제(alimentary supplement)" 또는 "영양 보완제(alimentary complement)"라는 용어와 동의어로, 농축 영양소 또는 영양 또는 생리적 효과가 있는 기타 물질의 공급원으로 구성된 대상체의 정상적인 식단을 보충하는 것을 목적으로 하는 제품 또는 제제를 지칭한다. 본 발명에서, B. 롱검 CECT 7347, L. 람노서스 CECT 8361 및/또는 이들로부터 유래된 균주 및/또는 세포 성분은 대상체에게 영양 및/또는 생리적 효과를 갖는 "물질"이다.

식품 보충제는 단일 또는 복합 형태일 수 있으며, 복용 형태(dosage form, 제형), 즉 캡슐, 알약, 정제 및 기타 유사한 형태, 분말 사쉐, 액상 앰플 및 액적 디스펜싱 병(drop dispensing bottle) 및 단일 양으로 섭취하도록 설계된 기타 유사한 형태의 액체 및 분말로 판매될 수 있다.

영양 보충제(alimentary complement)에 존재할 수 있는 광범위한 영양소 및 기타 요소가 있으며, 그 중에서도 특히 비타민, 미네랄, 아미노산, 필수 지방산, 섬유질, 효소, 식물 및 식물 추출물을 포함한다. 이들의 역할은 식단에서 영양소 공급을 보완하는 것이므로, 균형 잡힌 식단의 대체물로 사용되어서는 안 되며 섭취량은 의사 또는 영양사가 명시적으로 권장하는 일일 복용량을 초과해서는 안 된다. 본 발명의 조성물은 소위 "특수 그룹을 위한 식품", 즉 특정 영양 요구 사항을 충족하는 식품의 일부가 될 수도 있다.

본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 식품의 예로는 사료, 유제품, 채소 제품, 육류 제품, 스낵, 초콜릿, 음료, 이유식, 시리얼, 튀긴 음식, 산업용 제빵 제품 및 비스킷이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 유제품의 예로는 발효유(예를 들어, 요거트 또는 치즈, 이에 국한되지 않음) 또는 비발효유(예를 들어, 아이스크림, 버터, 마가린 또는 유청, 이에 국한되지 않음)에서 파생된 제품이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 채소 제품은 예를 들어, 모든 형태의 시리얼, 발효(예를 들어, 콩 요거트, 귀리 요거트 등) 또는 비발효 시리얼 및 스낵이며, 이에 국한되지 않는다. 음료에는 비발효 우유가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

일부 구현예에서, 식품 제품 또는 식품은 과일 또는 채소 주스, 아이스크림, 유아용 조제분유, 우유, 요거트, 치즈, 발효유, 분유, 시리얼, 구운 식품, 우유 기반 제품(예컨대 밀크셰이크 또는 스무디), 육류 제품 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 이외에 다른 미생물을 포함할 수 있다.

당업자가 이해하는 바와 같이, B. 롱검 및 L. 람노서스 균주는 불안 장애의 완화, 감소, 치료 및/또는 예방 효과와 같은 효과를 발휘하기 위해 본 발명의 조성물에 치료적 유효량으로 공동으로 또는 개별적으로 존재해야 한다.

본 발명의 맥락에서, "치료적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 원하는 효과를 나타내기에 충분한 영양학적 또는 약제학적 조성물의 성분 또는 화합물의 임의의 양이다. 상기 영양학적 또는 약제학적 조성물의 성분 또는 화합물은 박테리아 균주 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361을 지칭한다. 치료적 유효량은 예를 들어 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식단, 뿐만 아니라 투여 방식 및 시간, 배설 속도 또는 다른 약물과의 잠재적 병용 치료에 따라 달라질 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위해, 상기 약물은 불안 장애의 예방 및 치료 또는 기타 질환을 위해 처방될 수 있다.

본 발명의 조성물의 일부 구현예에서, B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361의 미생물의 총 농도는 10³ 내지 10¹² cfu 또는 세포, 바람직하게는 10⁹ cfu 또는 세포이다.

본 발명의 조성물의 일부 특정 구현예에서, B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361의 미생물의 양은 10³ 내지 10¹² cfu 또는 세포, 바람직하게는 10⁹ cfu 또는 세포이다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 인간을 위한 식품 또는 영양 보충제이다.

일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 농장 동물 및/또는 반려동물을 위한 식품 또는 영양 보충제이다.

일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 건강한 인간의 불안 장애 예방을 위한 식품 또는 영양 보충제이다.

일부 특정 구현예에서, 본 발명의 영양학적 조성물은 건강한 농장 동물 및/또는 반려동물의 불안 장애 예방을 위한 식품 또는 영양 보충제이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바실러스속(Bacillus sp.), 락토바실러스속(Lactobacillus sp .), 스트렙토코커스속(Streptococcus sp .), 비피도박테리움속(Bifidobacterium sp .), 사카로마이세스속(Saccharomyces sp .), 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces sp .) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물 또는 이들의 성분을 추가로 포함한다.

위에서 언급했듯이, 다양한 질환이나 전반적인 건강을 개선하기 위해 프로바이오틱스를 사용하는 것은 잘 확립되어 있다; 그러나, 포스트바이오틱스를 사용하는 경우는 그렇지 않다. 특히, 많은 프로바이오틱스 균주와 혼합물이 불안과 다른 행동 지표에 효과가 있는 것으로 보고되었지만, 포스트바이오틱스 사용과 관련된 불안에 대한 긍정적인 결과에 대한 증거는 많지 않았다. 본 출원은 비생존성 L. 람 노서스 및 B. 롱검 균주를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물의 불안 장애 치료에 대한 효능을 처음으로 입증하는 데이터를 제공한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 의약(medicament)으로 사용하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 "의약"이라는 용어는 대상체의 질병의 예방, 진단, 완화, 치료 또는 치유를 위해 사용되거나, 또는 약리학적, 면역학적 또는 대사적 작용을 발휘하여 생리적 기능을 회복, 교정 또는 변경할 목적으로 대상체에게 투여될 수 있는 모든 조성물/물질을 지칭한다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 불안 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 질병 또는 병리학적 상태를 억제하는 것, 즉, 발병을 멈추는 것; 질병 또는 병리학적 상태를 완화하는 것, 즉, 질병 또는 병리학적 상태의 퇴행을 유발하는 것; 및/또는 대상체의 질병 또는 병리학적 상태를 안정화시키는 것을 포함한다. 본 발명에서, 질병 또는 병리학적 상태는 적어도 하나의 불안 장애이다.

본원에서 사용되는 용어 "예방"은 대상체에서 질병 또는 병리학적 상태의 발생을 피하는 것을 의미하며, 특히 대상체가 병리학적 상태에 대한 소인이 있지만 아직 진단받지 않은 경우에 그러하다. 본 발명에서, 질병 또는 병리학적 상태는 적어도 하나의 불안 장애이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "대상체"는 모든 종의 모든 동물과 관련된다. 대상체의 예로는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 상업적인 관심사의 동물, 예컨대 새(암탉, 타조, 병아리, 거위, 자고새(partridge) 등), 토끼, 산토끼, 반려동물(개, 고양이 등), 양, 염소, 소(염소 등), 돼지(멧돼지, 돼지 등), 말 가축(말, 조랑말 등) 및 소(황소, 암소, 수소 등); 사냥용 동물, 예컨대 수사슴, 사슴, 순록 등; 및 인간.

일부 구현예에서, 대상체는 포유류이고; 일부 바람직한 구현예에서, 포유류는 모든 인종, 성별 또는 연령의 인간이다.

일부 다른 바람직한 구현예에서, 포유류는 농장 동물이며, 여기에는 소, 말, 염소, 라마, 양, 돼지, 닭 또는 상업적 목적으로 사육되거나 번식된 모든 동물이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 일부 다른 바람직한 구현예에서, 포유류는 반려동물이며, 여기에는 개, 고양이 또는 토끼가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 식단을 통해 대상체에게 투여된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물의 투여 용법은 적어도 1일 1회; 1일 2회; 또는 1일 3회이며, 각 주요 음식 섭취(아침 및/또는 점심 및/또는 저녁)와 함께 1회씩 투여된다.

포스트바이오틱스의 사용은 산업상 이용가능성, 특히 제조와 매우 관련이 깊다; 기존 프로바이오틱스의 안정성을 저해할 수 있는 열이나 습기에 노출되는 까다로운 환경에서도 제품을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 프로바이오틱스 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 가혹한 매트릭스나 공정(예: 사료 압출)에서도 사용할 수 있기 때문이다.

더욱이, 포스트바이오틱스와 프로바이오틱스를 모두 사용하면 플루옥세틴(Fluoxetine)과 같은 표준 약물의 전형적인 부작용 및 불면증, 근육 긴장, 메스꺼움 및 성기능 장애를 포함하되 이에 국한되지 않는 부작용을 피할 수 있어 불안 장애의 기존 치료법에 비해 많은 이점이 있을 수 있다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 불안 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 비생존성 B. 롱검 CECT 7347 및 L. 람노서스 CECT 8361 균주를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물에 관한 것이다.

불안은 긴장감, 걱정스러운 생각 및 혈압 상승과 같은 신체적 변화를 특징으로 하는 감정이다. 불안은 스트레스에 대한 정상적인 반응이며 일부 상황에서는 유익할 수 있지만, 불안 장애는 정상적인 긴장감이나 불안감과는 다르며, 과도한 두려움이나 불안을 수반한다. 불안은 인간뿐만 아니라 다른 동물, 특히 인간이 아닌 다른 포유류도 경험할 수 있다.

불안 장애는 인간의 정신 장애 중 가장 흔한 질환으로, 성인의 약 30%가 생애 어느 시점에서 영향을 받는다. 불안 장애에는 범불안장애(generalized anxiety disorder), 공황 장애(panic disorder), 특정 공포증(specific phobia), 광장 공포증(agoraphobia), 사회 불안 장애(social anxiety disorder)(이전에는 사회 공포증(social phobia)이라고 함), 소음 혐오증(noise aversion), 및 분리 불안 장애(separation anxiety disorder)가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

범불안장애는 일상 활동을 방해하는 지속적이고 과도한 걱정을 수반한다. 안절부절 못함, 초조함 또는 쉽게 피로함, 집중력 저하, 근육 긴장 및 수면 문제와 같은 신체적 증상이 동반될 수 있다.

공황 장애는 일반적으로 반복적인 공황 발작, 신체적, 정신적 고통과 다소 심각한 증상의 복합적인 조합을 특징으로 한다. 발작은 두려운 대상에 대한 반응과 같이 예상할 수 있거나, 또는 예상치 못하게 아무 이유 없이 발생할 수 있다. 우울증이나 외상 후 스트레스 장애(PTSD)와 같은 다른 정신 장애와 함께 발생할 수 있다.

특정 공포증은 일반적으로 해롭지 않은 특정 대상, 상황 또는 활동에 대한 과도하고 지속적인 두려움이다.

광장 공포증은 탈출이 어렵거나 당혹스러울 수 있는 상황에 처하거나 공황 증상이 발생할 경우 도움을 받을 수 없는 상황에 처하는 것에 대한 두려움이다. 두려움은 실제 상황에 비례하지 않으며 일반적으로 6개월 이상 지속되고 기능에 문제를 일으킨다.

사회 불안 장애는 사회적 상호작용에서 당혹스러움, 굴욕, 거부 또는 무시당하는 것에 대한 상당한 불안과 불편함을 특징으로 한다. 두려움이나 불안은 일상 생활에 문제를 일으키고 적어도 6개월 동안 지속된다.

불안 장애의 원인은 현재 알려져 있지 않지만 유전적, 환경적, 심리적 및 발달적 요인을 포함한 여러 요인이 결합된 것일 가능성이 높다.

각 불안 장애는 고유한 특성을 가지고 있지만 대부분은 심리 치료와 약물 치료에 잘 반응한다. 약물은 불안 장애를 치료하지 못하지만 증상을 상당히 완화한다. 가장 일반적으로 사용되는 약물은 항불안제(일반적으로 단기간만 처방)와 항우울제이다. 심장 질환에 사용되는 베타 차단제는 때때로 불안의 신체적 증상을 조절하는 데 사용된다.

본 발명에서 "불안 장애"라는 용어는 상기 기술된 불안 장애뿐만 아니라 외상 후 스트레스 장애(PTSD); 급성 스트레스 장애; 강박 장애(obsessive-compulsive disorder); 및 적응 장애(adjustment disorder)를 포함하되 이에 국한되지 않는 관련 상태도 포함한다.

PTSD는 자연 재해, 심각한 사고, 테러 행위 등과 같은 외상적 사건을 경험하거나 목격했거나 사망, 성폭력 또는 심각한 부상으로 위협을 받은 사람에게 발생할 수 있는 정신 장애이다. 모든 인종, 국적 또는 문화의 모든 사람에게, 모든 연령대에서 발생할 수 있다. PTSD가 있는 사람들은 외상적 사건이 끝난 후에도 오랫동안 지속되는 그들의 경험과 관련된 강렬하고 불안한 생각과 감정을 갖는다. 그들은 또한 슬픔, 두려움 또는 분노를 경험하며 다른 사람들과 분리되거나 소외감을 느낄 수 있다.

급성 스트레스 장애는 PTSD와 마찬가지로 외상적 사건에 대한 반응으로 발생하며 증상은 유사하다. 그러나, 증상이 사건 후 3일에서 1개월 사이에 발생하여 대상자의 일상 생활에 큰 고통과 문제를 일으킨다. 급성 스트레스 장애가 있는 사람의 약 절반은 PTSD를 겪게 된다. 심리 치료와 약물 치료는 증상을 조절하고 급성 스트레스 장애가 PTSD로 발전하는 것을 예방하는 데 도움이 될 수 있다.

강박 장애(OCD)는 사람들이 반복적으로 원치 않는 생각, 관념 또는 감각을 느끼고(강박관념(obsession)) 이로 인해 무언가를 반복적으로 하고 싶은 충동을 느끼게 하는(강박행동(compulsion)) 장애이다. 이러한 강박증은 개인의 일상 활동과 사회적 상호 작용을 크게 방해하고, 상당한 고통을 유발하며, 일이나 사회적 기능을 손상시킬 수 있다.

적응 장애 또한 스트레스가 많은 삶의 사건(또는 사건들)에 대한 반응으로 발생한다. 스트레스 요인에 대한 반응으로 사람이 경험하는 감정적 또는 행동적 증상은 발생한 사건의 유형에 대해 합리적으로 예상되는 것보다 더 심각하거나 더 강렬하다. 증상에는 슬픔, 절망, 그리고 떨림, 심계항진 및 두통과 같은 신체적 증상이 포함될 수 있다. 이러한 증상은 대상자의 삶의 중요한 영역에서 상당한 고통이나 기능 문제를 유발하며, 일반적으로 스트레스가 많은 사건 후 3개월 이내에 시작되어; 스트레스 요인이나 그 결과가 끝난 후 6개월 이상 지속되지 않는다. 이 장애는 전형적으로 심리 치료로 치료한다.

위에서 언급했듯이, 동물, 특히 포유류도 불안을 겪을 수 있다. 예를 들어, 분리 불안은 반려동물에게서 흔히 나타난다. 분리 불안은 개나 고양이가 보호자와 분리될 때 유발되며; 동물의 탈출 시도는 종종 극단적이며 자해로 이어질 수 있다. 사회적 스트레스도 반려동물의 복지에 중요한 역할을 할 수 있다는 증거가 있다. 또한, 사회적 스트레스, 운송 및 농장의 높은 수준의 밀집도 역시 농장 동물의 질병 예방과 동물 농장의 복지에 중요한 역할을 할 수 있으며, 일반적인 관리 관행이 질병 위험을 증가시킬 수 있는 매개체가 될 수 있다는 증거가 있다. 사회적 접촉의 박탈('사회적 고립'), 공간 허용량의 감소('밀집') 및 사회적 질서 교란('사회적 불안정')을 포함한 사회적 요인은 가축의 스트레스에 대한 생리적 및 행동적 지표를 유발한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법("본 발명의 치료 또는 예방 방법")을 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 대상체의 불안 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 조성물의 용도("본 발명의 용도")에 관한 것이다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법 및 본 발명의 용도에서 사용되는 용어에 대한 모든 바람직한 구현예 및 설명은 상기에 설명되어 있다. 본 발명의 이전 측면의 모든 특정 용어, 정의 및 실시양태는 본 발명의 치료 방법 및 용도에 적용 가능하다.

불안 장애의 치료 및/또는 예방과 관련된 용도 외에도, 본 발명의 조성물은 비병리적 불안을 개선하는 데에도 사용될 수 있다. 본 명세서에서 위에서 언급한 바와 같이, 불안은 스트레스에 대한 정상적인 반응이며 일부 상황에서는 유익할 수 있다. 따라서, 정상적인 긴장감이나 불안감과 불안 장애를 구분할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 불안의 개선에 있어서 본 발명의 조성물의 비치료적 사용에 관한 것이다.

불안은 개인의 스트레스 및 새로운 상황에 대한 전형적인 반응일 수 있으며, 대상체에서 걱정, 불안함 또는 긴장감을 포함하되 이에 국한되지 않는 감정을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상체의 긴장 및/또는 걱정의 개선에 있어서 본 발명의 조성물의 비치료적 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 보충제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 조성물의 식품 보충제로서의 사용에 관한 것이다.

"식품 보충제"라는 용어는 상기에 정의되어 있으며, 그 정의 및 관련된 특정 구현예는 여기에서도 동일하게 적용된다.

발명의 설명 및 청구 범위 전체에서 "포함하다"라는 단어와 그 변형은 다른 기술적 특성, 첨가제, 구성 요소 또는 단계를 배제하려는 의도가 아니다.

도 1. 실험 시작 시 각 실험 그룹의 동물 체중(평균 ± SEM), t=0.
도 2. 위쪽과 아래쪽에 두 개의 경기장이 있는 표본의 유영 분석에 사용된 Noldus Ethovision®로 생성된 템플릿 이미지.
도 3. t= 2 mpi 및 t= 4 mpi에서 각 실험 그룹의 동물 길이 및 체중(평균 ± SEM). 별표는 통계적으로 유의미한 차이를 나타낸다 *(p>0.050).
도 4. t= 2 mpi 및 t= 4 mpi에서 각 실험 그룹의 총 헤엄치는 거리와 물고기 속도(평균 ± SEM).
도 5. t= 2 mpi 및 t= 4 mpi에서 각 실험 그룹에서 수조의 상부 구역에서 보낸 시간(초)으로 표시된 구역 선호도(평균 ± SEM) 및 NTT 기록 동안 정규화된 백분율(평균 ± SEM).
도 6. 실험 시작 후 (A) 2개월(2 mpi) 및 (B) 4개월(4 mpi)에서 NTT 동안 상부 구역에서 30초 미만을 보낸 물고기의 비율(어두운 점).
도 7. 상부 구역에 처음 진입하기까지의 잠복기(초). 별표는 수조의 상부 영역에서 모든 NTT를 보낸 물고기를 나타낸다. 해시는 수조의 하부 영역에서 모든 NTT를 보낸 물고기를 나타낸다.
도 8. 2 mpi 샘플링에서 각 실험 그룹의 모든 궤적(trajectory)에 대한 병합 히트맵.
도 9. 4 mpi 샘플링에서 각 실험 그룹의 모든 궤적에 대한 병합 히트맵.
도 10. 대조군 조건(OP50 사용), 대조군 불안 조건(먹이 박탈) 및 열처리된 L. 람노서스 CECT8361과 열처리된 B. 롱검 CECT7347의 혼합물(HT-BPL15+HT-ES1)로 처리한 불안 선충에서 옥탄올에 대한 C. 엘레간스의 반응 시간의 표시.
도 11. 한천 플레이트에서 선충의 분포를 정량화하여 분산도 분석. 선충을 스트레스(콜린성 자극제)에 노출시키고 열처리된 L. 람노서스 CECT8361과 열처리된 B. 롱검 CECT7347의 혼합물(HT-BPL15+HT-ES1)을 처리하였다. 회색 음영의 차이는 플레이트 중앙에서 선충의 위치(cm)가 다르다는 것을 나타낸다.
도 12. HT-ES1+HT-BPL15 혼합물(10⁸개 세포) 및 대체 균주(BPL33, BPLA3, BPL31 및 BPL8)로 제조한 기타 혼합물이 C. elegans의 회피 행동(불안)에 미치는 영향. 단방향 분산 분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 평균이다. **p<0,01.

실시예

실시예 1. 6가지 서로 다른 프로바이오틱스 / 포스트바이오틱스 보충제의 경구 투여가 성체 제브라피쉬의 행동에 미치는 영향

재료 및 방법

6가지 서로 다른 프로바이오틱스 보충제^*의 경구 투여가 성체 다니오 레리오(Danio rerio)(제브라피쉬)의 행동에 미치는 영향을 새로운 수조 테스트(Novel Tank Test, NTT)를 사용하여 평가한다. 물고기의 헤엄치는 패턴을 개별 수준에서 분석하고 결과와 결론을 담은 보고서를 작성한다.

* 혼합 제형(Blend Formulation) 004009

HT(Heat Treated, 열처리) 혼합 제형 004009

비피도박테리움 롱검 ES1(CECT 7347)

HT 비피도박테리움 롱검 ES1

락토바실러스 람노서스 BPL15(CECT 8361)

HT 락토바실러스 람노서스 BPL15

본 보고서에 설명된 모든 절차는 레온 대학교(the University of Leon)(스페인)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 모든 동물은 실험동물 사용에 관한 스페인 규정(RD/2013)에 따라 유럽 연합 이사회 지침(2010/63/EU)에 따라 표준적으로 조작하였다.

수정 후 4개월이 지난(month post fertilization, mpf) 70마리의 제브라피쉬(AB 균주) 형제자매의 배치를 물고기 무게를 고려하여 7개 그룹(n=10)으로 균질하게 나누었다(도 1, 표 1).

표 1.- 실험 시작 시점의 체중 데이터(mg).

각 물고기를 110 mg/L 완충 트리카인 메탄 설포네이트(MS222)로 마취시키고, 개체 식별 및 동물 추적을 위해 가시적인 임플란트 엘라스토머(Northwest Marine Technology, WA, USA)로 개별적으로 태그를 붙였다. 제브라피쉬를 기계적, 화학적 및 생물학적 필터가 장착된 재순환 시스템에서 지속적으로 물이 교체되는 3 L 수조에서 사육하였다. 물은 평균 26℃의 온도로 유지하였으며, 실내 광 주기는 14/10의 명/암 주기로 구성되었다.

프로바이오틱스 및/또는 포스트바이오틱스 보충제와 위약은 10⁹ cfu 또는 세포를 함유하는 캡슐로 제공하였다. 캡슐의 내용물을 두 개로 나누고 섭취를 보장하기 위해 각 용량(내용물의 절반)을 일상적인 사료 급여 30분 전에 사육수(rearing water)에 넣어 실험용 수컷에게 제공하였다(하루 2회). 이러한 급여 조건을 모든 실험 기간(4개월) 동안 유지하였다. 유지 관리, 사료 공급 및 동물 복지를 담당하는 기술 인력은 캡슐의 내용물을 알지 못했다. 실험 그룹은 1부터 7까지 맹검으로 번호를 매겼다.

동물의 탐색 행동을 테스트하기 위해 새로운 수조 테스트(NTT)를 사용하였다. 이 테스트는 "안전한" 다이빙 행동과 "탐색" 수영 행동 사이에 갈등이 있기 때문에 특정 실험 조건에서 물고기의 지오택시스(geotaxis) 탈출 다이빙 본능의 강도를 연구할 수 있게 해준다. 정상적으로 통제된 실험실 조건에서, 물고기는 일반적으로 모니터링 초기 첫 몇 분 동안 수조 바닥에서 더 많은 시간을 보내는 경향이 있으며, 불규칙한 움직임과 움직이지 않는 사건(immobility event)의 빈도가 더 높다. 익숙해지는 기간 후, 동물은 점차 수심의 위쪽 영역을 탐색한다.

프로토콜은 다음과 같이 섭취 시작 후 2개월과 4개월(months post the start of ingestion, mpi)에 두 번 수행하였다: 각 동물을 사각형 유리 수족관(20 × 8 × 18 cm; 길이 × 너비 × 깊이; 수영 용량: 3.5 L) 바닥에 개별적으로 배치하였다. 물고기를 6분 동안 촬영하였다(1920 × 1080 px). 첫 1분은 새로운 환경에의 적응 시간으로 간주하였고 나머지 5분은 동안 행동 분석으로 간주하였다. 개별 수영 활동을 Noldus Ethovision® 추적 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 수조를 두 개의 경기장(상부와 하부; 도 2)으로 나누는 가상 격자를 생성하였다.

각 동물에 대해 탐색 행동의 다음 추정치를 정량화하였다:

ㆍ 이동 거리.

ㆍ 속도.

ㆍ 구역 선호도.

ㆍ 상부 구역의 첫 번째 진입까지의 잠복기(latency).

결과를 평균 ± 표준 오차로 표시하였다. 백분율 데이터는 아크신-제곱근 변환(arcsine-square root transformation)을 사용하여 정규화하였다. 2 및 4 mpi에서 각 변수의 평균 값 간의 통계적 차이는 단측 비페어 t-스튜던트 검정(one-tail unpaired t-Student test)(정규 분포 변수) 또는 단측 맨-휘트니 검정(one tail Mann-Whitney test)(비모수 변수)을 사용하여 결정하였다. 모든 통계 분석은 Prism 9(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. P-값 < 0.0500은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 포스트바이오틱스 실험은 다니오 레리오(제브라피쉬) 불안 모델을 사용하여 수행하였다. 이 모델은 제브라피쉬가 새로운 수조에 처음 놓였을 때 바닥 가까이에서 헤엄치는 것을 선호하는 것을 기반으로 한다. 물고기가 수조 바닥을 떠나 다른 영역을 탐색하기 시작하기까지 걸리는 시간의 차이는 물고기가 경험하는 불안을 반영하는 것으로 간주된다. 헤엄치는 패턴, 평균 헤엄치는 속도 및 수조 전체의 분포와 관련된 파라미터를 분석하였다.

생체 측정(Biometry)

생체 측정 파라미터에 대한 프로바이오틱스 및 포스트바이오틱스 섭취 효과를 도 3에 나타내었다. 물고기 길이는 2 mpi에서 균일하였다. 4 mpi에서는 통계적으로 유의미한 차이는 보고되지 않았지만, 평균값은 모든 포스트바이오틱스-섭취 동물에서 더 높았으며, 예외적으로 HT L. 람노서스 BPL15에서는 위약과 유사하였다(표 2)

표 2.- 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서의 길이 데이터(cm).

통계 분석 결과, HT B. 롱검 ES1 그룹은 위약에 비해 2 mpi(p=0.0402) 및 4 mpi(p=0.0140)에서 체중 증가가 촉진된 것으로 나타났다. 길이와 유사하게, 나머지 실험 그룹은 HT L. 람노서스 BPL15를 제외하고 4 mpi에서 대조군에 비해 더 높은 유의미하지 않은 평균값을 나타내었다(표 3).

표 3.- 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서의 체중 데이터(mg).

동역학(Kinetics)

연구 대상 물고기의 동역학은 그룹 간에 유사한 결과를 나타내었다(도 4). 흥미롭게도, 물고기가 헤엄친 총 거리는 4개월 샘플링에 비해 2개월 샘플링에서 더 길었고 거리는 약 1800-2100 cm이었다(표 4). 최대 거리는 두 샘플링 모두에서 혼합 제형 004009 및 HT 혼합 제형 004009를 보충한 그룹에 포함된 물고기에 해당하였다.

표 4. 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서 이동한 거리 데이터(cm).

거리 데이터와 유사하게, 물고기 속도를 분석했을 때 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 발견되지 않았다. 상관 관계에 따라, 이 파라미터에서 가장 높은 수치는 혼합 제형을 보충한 그룹의 어류에 해당하였다(표 5).

표 5. 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서의 속도 데이터(cm/s).

구역 선호도

앞서 설명한 속도와 이동 거리에서 그룹 간의 유사성에 대한 결과를 고려하면 다음 데이터는 훨씬 더 흥미롭다.

물고기의 구역 선호도는 연구된 여러 실험 그룹에서 통계적으로 유의미한 선호도를 나타내었다(도 5, 6 및 7).

그래프에서 볼 수 있듯이(상부 구역에서 보낸 총 시간(초) 및 정규화된 백분율 모두에서) 2개월 샘플링의 데이터는 정말 유망하다. 프로바이오틱스 또는 포스트바이오틱스를 먹인 그룹 중 4개는 대조군과 비교하여 유의미한 차이를 보고하였다:

ㆍ 혼합 제형 004009 ｜ p=0.0112

ㆍ HT 혼합 제형 004009 ｜ p=0.0024

ㆍ B. 롱검 ES1 ｜ p=0.0165

ㆍ L. 람노서스 BPL15 ｜ p=0.0112

2 mpi에서 가장 좋은 결과(도 8, 표 6)는 HT 혼합 제형 004009 그룹에서 발견되었으며, 위약 그룹에서 보고된 34.64 ± 12.48초와 비교하여 상부 구역에서 평균값 106.2 ± 14.98초로 나타났다

표 6. 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서 상부 영역에서 보낸 시간(초).

섭취 후 4개월 후의 결과는 HT 혼합 제형 004009 그룹(p=0.0423)과 B. 롱검 ES1 그룹(p=0.0429)에서만 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 이 두 실험 그룹은 샘플링에서 수조의 상부 구역에서 가장 높은 비율을 가진 물고기를 포함한다(도 8, 표 7).

표 7. 2 mpi(2m) 및 4 mpi(4m)에서 상부 영역에서 보낸 시간(정규화 %).

구역 선호도 데이터는 수조의 상부에서 거의 시간을 보내지 않는 동물의 수에 초점을 맞춰 분석하였으며, 총 NTT의 30초(10%)를 임계값으로 설정하였다(표 8).

표 8. 새로운 수조 테스트 동안 상부 구역에서 보낸 시간의 %(원시 백분율 데이터). 데이터는 가장 작은 것부터 가장 큰 것 순으로 정리하였으며, 해석을 쉽게 하기 위해 색상으로 구분된 조건을 적용하였다. 실험 그룹 코드: P) 위약; 블렌드) 혼합 제형 0044009; HT혼합) HT 혼합 제형 004009; ES1) B. 롱검 ES1; HTES1) HT B. 롱검 ES1; BPL15) HT L. 람노서스 BPL15; HTBPL15) L. 람노서스 BPL15

프로바이오틱스 또는 포스트바이오틱스 섭취 2개월 후, 이러한 유형의 행동을 보이는 동물의 가장 낮은 비율은 혼합 제형 004009 및 HT 혼합 제형 004009 그룹에서 발견되었다. 반대로, 이러한 개체의 가장 높은 비율은 위약 그룹에서 보고되었다.

실험을 시작한 지 4개월 후, 이 두 그룹은 이러한 추세를 유지하는 반면, B. 롱검 ES1과 L. 람노서스 BPL15에서는 비율이 이전 샘플링에 비해 감소하였다(도 9).

상부 구역의 첫 번째 진입까지의 잠복기

전형적으로, 물고기를 새 수조에 넣었을 때, 새로운 환경에 적응하는 기간 동안 물고기의 초기 선호도는 보통 수조의 바닥이다.

1분간의 적응 후, 각 실험 그룹의 동물이 보인 잠복기를 정량화하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, 2개월 샘플링에서, 위약 그룹에서는 4마리의 물고기가 상부 구역에서 점수를 받지 못했으며, 그 중 2마리에서 상승하는 잠복기가 2분 이상 지연되었다. 다른 그룹에서는, 특히 혼합 제형 004009, HT 혼합 제형 004009 및 B. 롱 검 ES1에서는 물고기가 처음 진입했을 때의 잠복기가 전반적으로 더 낮았다.

프로바이오틱스 또는 포스트바이오틱스 보충제를 섭취한 지 4개월 후, 위약 그룹에서는 이러한 경향이 완화되었지만 앞서 언급한 그룹에서는 계속 낮은 수치를 나타내었으며, 특히 HT 혼합 제형 004009의 경우 기록 시작 1분 후에 최대 4마리의 물고기가 이미 상부 구역에 있었다.

실시예 2. C. 엘레간스 에서의 실험

C. 엘레간스는 수명, 비만 및 대사 증후군 연구에 좋은 모델이 되어 왔다. 또한, 이것은 인지 장애(학습 및 기억력, AD, PD)를 드러내는 많은 행동을 분석하거나 다양한 정신 장애의 측면을 모델링하는 간단한 모델로도 사용되었다(Dwyer DS. Crossing the Worm-Brain Barrier by Using　Caenorhabditis elegans　to Explore Fundamentals of Human Psychiatric Illness. Mol Neuropsychiatry. 2018, 3:170-179). C. 엘레간스에서 신경전달물질과 신경펩타이드는 포유류의 신경계(도파민, GABA, 아세틸콜린, 세로토닌 등)와 유사하며, 선충은 포유류의 학습 및 기억과 유사한 놀라운 행동 가소성을 보여준다.

발달, 섭식 및 운동과 같은 기본 기능은 신경계에 의해 제어된다.

여기서는 C. 엘레간스 불안 및 스트레스 모델에서 B. 롱검 CECT7347(ES1)과 L. 람노서스 CECT8361(BPL15)로 구성된 열처리된 포스트바이오틱스 혼합물을 평가하였다. 혼합물을 최종 농도 1×10⁸ 세포/플레이트(0.5×10⁸ 세포/플레이트 HT-BPL15 + 0.5×10⁸ 세포/플레이트 HT-ES1)에서 평가하였다.

불안 모델

스트레스나 혐오성 자극에 대한 지각은 인간의 불안 행동의 첫 번째 구성 요소이며, 이는 편도체(amygdala), HPA(시상하부-뇌하수체-부신) 축, 및 신경 조절 물질(예: 세로토닌)에 의해 차례로 조절된다.

세로토닌 경로는 혐오성 냄새 물질인 옥탄올에 대한 회피를 매개하는 C. 엘 레간스 혐오 행동의 기저에 있다. 따라서 C. 엘레간스에서 회피 행동을 불안 관련 행동으로 사용하였다.

회피 행동 분석을 통해 불안 분석을 수행하였다. 실험은 이전에 기재된 "스틱에 냄새 맡기(smell-on-a-stick)" 분석법을 사용하여 수행하였다(Chao, M. Y., et al. 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 26;101(43):15512-7. doi: 10.1073/pnas.0403369101. Epub 2004 Oct 18. PMID: 15492222; PMCID: PMC524441). "Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 15512-15517). 옥탄올 회피 분석을 위해, Loew-Cornell(Teaneck, NJ) 9000 Kolinsky 7 페인트브러시 털의 뭉툭한 끝을 파스퇴르 피펫에 테이프로 붙인 다음, 새로 준비한 30% 옥탄올에 담그고 앞으로 움직이는 선충 앞에 놓은 후, 선충이 뒤로 움직이기 시작하는 데 걸리는 시간(옥탄올 회피)을 실험실 타이머를 사용하여 측정하였다.

불안 조건을 위해, 선충을 OP50이 없는 NGM 플레이트에서 인큐베이션하였다. 이러한 먹이 박탈은 세로토닌 수치의 감소로 인한 불안감의 증가를 유발하였다(Chao, M. Y., et al. 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 26;101(43):15512-7. doi: 10.1073/pnas.0403369101. Epub 2004 Oct 18. PMID: 15492222; PMCID: PMC524441). 이러한 불안한 상태는 선충이 옥탄올 자극에서 뒤로 이동하는 데 필요한 시간을 증가시켰다.

도 10은 선충이 옥탄올 냄새를 맡았을 때 뒤로 이동하기 시작하는 데 걸리는 시간을 나타낸다. 앞서 언급했듯이, 먹이가 없는 대조군 불안한 벌레는 OP50이 있는 대조군 조건의 선충보다 옥탄올을 피하는 데 더 오랜 시간이 걸린다. 열처리된 L. 람노서스 CECT8361 및 열처리된 B. 롱검 CECT7347의 혼합물(HT-BPL15+HT-ES1)과 함께 인큐베이션한 선충은 먹이 박탈 상태에서 회피 시간을 유의적으로 감소시켰다(p 값<0.05). 따라서, 열처리된 L. 람노서스 CECT8361과 열처리된 B. 롱검 CECT7347의 혼합물(HT-BPL15+HT-ES1)은 먹이 부족으로 인한 불안 관련 행동에 대응하는 것으로 나타났다.

스트레스 모델

C. 엘레간스의 운동은 아세틸콜린(흥분성 신경전달물질)에 의해 매개되는 근육 수축을 통한 정현파(sinusoidal wave)로 특징지어진다.

이 실험에서는 스트레스 조건에서 선충의 탐색 행동을 분석하고 열처리된 혼합물인 열처리된 L. 람노서스 CECT8361과 열처리된 B. 롱검 CECT7347(HT-BPL15+HT-ES1)이 이러한 행동 패턴에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 약물 데누빌(Denubil)을 사용하여 콜린성 자극(cholinergic stimulation)을 가하였다.

플레이트를 3개의 동심원 영역, <0.9 cm, 0.9-1.8 cm 및 1.8-2.8 cm로 나누었다. 선충을 플레이트 중앙에 놓은 다음 2분 후에 다른 위치에서 선충의 위치를 채점하였다.

도 11은 대조군(스트레스를 받지 않음)과 스트레스를 받은 집단을 모두 포함하여 급여 조건에서 벌레의 분포를 보여준다. 대조군 조건에서는 선충이 플레이트 중앙에 모이는 경향이 있는 반면, 정신 자극제로 스트레스를 받으면 선충이 플레이트 가장자리로 분산되는 경향이 있다. 게다가, 열처리된 L. 람노서스 CECT8361과 열처리된 B. 롱검 CECT7347의 혼합물(HT-BPL15+HT-ES1)을 먹인 선충은 대조군-스트레스를 받지 않은 상태에서 관찰된 행동 패턴을 회복하여(p 값 <0.001) 다시 플레이트 중앙에 모였다(그리고 분산되지 않았다).

실시예 3. 다양한 열처리된 L. 람노서스 및 B. 롱검 균주 혼합물 간의 비교 분석

락토바실러스 람노서스 및 비피도박테리움 롱검 균주

비피도박테리움 롱검에 속하는 두 가지 균주(BPL33 및 BPL31)와 락토바실러스 람노서스 종에서 두 가지 종(BPLA3 및 BPL8)을 출원인의 컬렉션, 즉 Biopolis, S.L. 컬렉션에서 수득하였으며, 이들을 불안 C. 엘레간스 모델에서 평가하였다. 모든 균주는 열처리된 형태로 평가하였다.

네 가지 다른 조합을 테스트하였다:

ㆍ B. 롱검 HT-BPL33 + L. 람노서스 HT-BPLA3

ㆍ B. 롱검 HT-BPL33 + L. 람노서스 HT-BPL8

ㆍ B. 롱검 HT-BPL31 + L. 람노서스 HT-BPLA3

ㆍ B. 롱검 HT-BPL31 + L. 람노서스 HT-BPL8

비교 분석을 위해, 본 발명의 불안 혼합물 B. 롱검 HT-ES1 + L. 람노서스 HT-BPL15를 사용한 추가 조건을 포함시켰다.

C. 엘레간스 의 불안 모델

옥탄올 회피를 C. 엘레간스의 불안 관련 행동 분석으로 사용하였다. 실험은 "스틱에 냄새 맡기(smell-on-a-stick)" 분석을 사용하여 수행하였다. 옥탄올 회피 분석을 위해, 털(Loew-Cornell (Teaneck, NJ) 9000 Kolinsky 7 페인트브러시)의 뭉툭한 끝을 파스퇴르 피펫에 테이프로 붙이고, 새로 준비한 EtOH 중의 30% 옥탄올(vol/vol)에 담그고 앞으로 움직이는 선충 앞에 두었다. 벌레가 뒤로 이동하는 데 걸리는 시간을 측정하였다. 대조군 조건 선충은 대장균 OP50과 함께 NGM에서 유지하였다. 하룻밤 동안 갓 배양한 대장균 OP50 100 μL를 시딩한 NGM 플레이트에 동물을 옮겼다. 선충을 이 플레이트에서 20분간 인큐베이션한 후 테스트하였다. 불안 조건을 위해, 선충을 OP50이 없는 NGM 플레이트에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 먹이 박탈은 세로토닌 수치의 감소로 인한 불안 관련 행동을 유도한다. 치료법을 평가하기 위해, 야생형 선충을 10⁸개 세포(최종 용량)의 두 가지 열처리 균주의 상응하는 혼합물로 보충한 NGM 플레이트에서 연령 동기화(age-synchronized)하였다. 어린 성충 단계에서, 선충을 각 처리와 함께 NGM 플레이트에 옮겼지만 30분 동안은 먹이를 주지 않았다. 그 후, 벌레를 OP50이 없고 각 처리를 한 NGM 플레이트에 넣고 20분 후에 테스트하였다. 옥탄올에 반응하는 시간이 줄어든 비율을 불안한 대조군과 비교하여 나타내었다.

결과

불안 관련 행동으로서 C. 엘레간스의 옥탄올에 대한 회피 행동을 대체 B. 롱 검 및 L. 람노서스 균주의 다양한 혼합물을 평가하는 데 사용하였다.

이 분석에서 불안한 대조군 벌레는 대조군 조건 선충(NGM, 불안이 없는 대조군)보다 옥탄올을 피하는 데 더 오랜 시간이 걸린다. 결과는 불안한 대조군 집단에 대한 각 처리의 상대적 백분율을 나타낸다(도 12).

그 결과, ES1 및 BPL15를 사용한 열처리 균주의 혼합물(본 발명의 조성물)은 옥탄올을 벌레에게 제시했을 때 반응 시간을 34% 감소시켜 불안 행동을 감소시키는데 매우 긍정적인 효과를 나타낸 반면, 다른 4가지 혼합물은 8 내지 14% 감소에 그쳤다(도 12 및 표 9).

표 9. 이 연구에 포함된 다양한 혼합물을 통해 얻은 C. 엘레간스의 회피 행동(불안 모델) 감소 시간의 백분율. 회피 행동에 대한 HT-ES1 + HT-BPL15 혼합물.

따라서, 이러한 결과는 본 발명의 균주의 혼합물이 이들 종의 다른 균주 혼합물보다 놀라울 정도로 더 나은 효과를 가지고 있음을 나타낸다.

스페인 생물자원센터(SPANISH TYPE CULTURE COLLECTION, CECT)

CECT7347

20071220

스페인 생물자원센터(SPANISH TYPE CULTURE COLLECTION, CECT)

CECT8361

20130527

Claims

비생존성(non-viable) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주 CECT 7347 및 비생존성 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 CECT 8361을 포함하는 포스트바이오틱스(postbiotic) 조성물.
제1항에 있어서, 비생존성 비피도박테리움 롱검 및 락토바실러스 람노서스 균주가 열처리되는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 포스트바이오틱스 조성물이 약제학적 조성물 또는 영양학적 조성물인, 포스트바이오틱스 조성물.
제3항에 있어서, 약제학적 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제3항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체 형태 또는 고체 형태로 제형화되는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제5항에 있어서, 고체 제형이 정제, 로젠지, 과자(sweet), 츄어블 정제, 츄잉껌, 캡슐, 사쉐, 분말, 젤, 과립, 코팅 입자 또는 코팅 정제, 정제 및 위장 내성 정제 및 캡슐 및 분산성 스트립 및 필름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제5항에 있어서, 액체 제형이 경구 용액, 현탁액, 액적(droplet), 에멀전 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제3항에 있어서, 영양학적 조성물이 식품 또는 영양 보충제인, 포스트바이오틱스 조성물.
제8항에 있어서, 식품이 과일 또는 채소 주스, 아이스크림, 유아용 조제분유, 우유, 요거트, 치즈, 발효유, 분유, 시리얼, 구운 식품, 우유 기반 제품, 육류 제품 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포스트바이오틱스 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 B. 롱검 및 L. 람노서스의 총 농도가 10³ 내지 10¹² 세포인, 포스트바이오틱스 조성물.
의약(medicament)으로 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 포스트바이오틱스 조성물.
불안 장애의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 포스트바이오틱스 조성물.