KR20240093933A

KR20240093933A - 인간 전뇌 신경 전구 세포의 생성 및 그의 파르브알부민+ 개재뉴런으로의 성숙화를 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20240093933A
Application number: KR1020247017499A
Authority: KR
Inventors: 누신 아미니; 샤오광 팡
Original assignee: 트레일헤드 바이오시스템즈 인크.
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2024-06-24
Also published as: CA3236867A1; JP2024541967A; AU2022375573A1; US20230332103A1; WO2023075913A1; IL312358A; EP4423252A1

Abstract

화학적으로 정의된 배양 배지를 사용하여 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 전뇌 신경 전구 세포 및 성숙한 전뇌 뉴런을 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포의 초기 생성을 가능하게 하며, 추가 배양은 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포의 생성 및 후속적으로 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)의 생성을 가능하게 한다. MGE-NPC는 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런으로 추가로 분화된다. 배양 배지, 단리된 세포 집단 및 키트를 또한 제공한다.

Description

인간 전뇌 신경 전구 세포의 생성 및 그의 파르브알부민+ 개재뉴런으로의 성숙화를 위한 방법 및 조성물

관련 출원

본 출원은 2021년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 63/273,742, 및 2022년 7월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 63/391,206에 대한 우선권을 주장한다. 이들 우선 출원의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정부 허가 권리

본 발명은 미국 육군 ACC-AGP-RTP에 의해 수여된 승인 번호: W911NF-17-3-0003 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

전뇌는 중추 신경계 (CNS)의 필수적인 기능 영역이다. 전뇌 뉴런의 기능장애는 심각한 신경계 질환으로 이어질 수 있다. 전뇌의 GABA작동성 개재뉴런은 CNS의 주요 억제성 뉴런이다. GABA작동성 개재뉴런은 피질의 기능적 성숙의 주요 측면에 기여한다. 피질 GABA 개재뉴런은 복측 전뇌 영역인 내측 신경절 융기 (MGE)로부터 유래한다. GABA작동성 개재뉴런의 기능장애는 신경퇴행성 또는 정신 질환을 초래하는 것으로 보고된 바 있다 (Fishell and Rudy (2011) Annu . Rev. Neurosci . 34:535:567; Le Magueresse and Monyer (2013) Neuron 77:388-405). 따라서, GABA작동성 개재뉴런으로 발생할 수 있는 세포를 포함하여, 전뇌 계통으로 수임되는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 신경 전구 세포를 수득하는 능력은 상기 전뇌 관련 신경계 및 정신 질환을 잠재적으로 치료할 수 있는 수단을 제공한다.

hPSC로부터 신경 전구 세포를 수득하기 위한 초기 접근법은 피더 세포 층 및 혈청 및/또는 다른 정의되지 않은 성분을 함유하는 배양 배지를 사용했는데, 이는 임상 용도에 적합하지 않다. 보다 최근에는 화학적으로 정의된 피더 무함유 시스템이 개발된 바 있다. 예를 들어, 배아체 프로토콜을 사용하여 hPSC를 먼저 전뇌 신경상피 세포를 유도하도록 분화시킨 후 (이는 10일이 소요됨), 이어서 생성된 세포를 SHH 효능제와 함께 배양하여 몇 주 동안에 걸쳐 NKX2-1-발현 MGE 전구체, 및 GAB개재뉴런 서브타입의 성숙화를 유도하는 접근법이 보고된 바 있다 (Liu et al. (2013) Nat Protoc. 8:1670-1679; Yuan et al. (2015) Sci Rep 5:18550). 부착성 분화 프로토콜 (Yan et al. (2013) Stem Cells Transl . Med . 2:862-870) 및 비부착성 분화 프로토콜 (Crompton et al. (2013) Stem Cell Res. 11:1206-1221)로 지칭되는 접근법을 포함한, 추가적인 전뇌 분화 프로토콜이 관련 기술분야에 보고된 바 있다.

Wnt 억제는 전뇌 신경 전구체를 분화하기 위한 전략법에 도입된 바 있고, Wnt 억제 시기는 GABA작동성 개재뉴런의 내측 신경절 융기 전구체의 분화를 조정하는 것으로 보고된 바 있다 (Ihnatovych et al. (2018) Stem Cells International, vol. 2018, Article ID 3983090).

보다 최근에는 추가적인 화학 성분을 사용하는 피더 무함유 프로토콜이 개발된 바 있다. 한 접근법은 신경외배엽 전구체 (로제트)로 이어지는 8일 신경 유도 단계, 이어서 16일차까지 전뇌 전구체로 이어지는 추가 8일 국재화 단계를 수반한다 (Comella-Bolla et al. (2020) Mol . Neurobiol. 57:2766-2798).

전뇌 신경 전구체의 분화를 위한 추가적인 프로토콜은 배양 배지에 TGFβ 길항제를 포함시키는 것과 같은 SMAD 2/3 억제의 사용을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Nicholas et al. (2013) Cell Stem Cell 12:573-586]; 미국 특허 공개 번호 2016/0272940; 미국 특허 공개 번호 2019/0062700; 미국 특허 공개 번호 2021/0040443 참조).

전뇌 신경 전구체의 분화를 위한 추가적인 프로토콜은 또한 미국 특허 공개 번호 2015/0361393 및 미국 특허 공개 번호 2017/0292112에 또한 기술되어 있다.

따라서, 일부 진전이 있었지만, 인간 만능 줄기 세포로부터 전뇌-수임 신경 전구 세포 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하기 위한 효율적이고 강건한 방법 및 조성물이 여전히 요구되고 있다.

본 개시내용은 9일 소요되는 3 스테이지 프로토콜로 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC), 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC) 및 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 포함한 인간 전뇌 신경 전구 세포를 생성하는 방법으로서, 여기서 MGE-NPC는 추가 17일이 소요되는 2 스테이지 프로토콜로 성숙한 GABA작동성 개재뉴런으로 추가로 분화될 수 있는 것인 방법을 제공한다. 본 방법은 배양 3일 이내에 FB-NSC, 배양 6일 이내에 VFB-NSC, 배양 9일 이내에 MGE-NPC, 배양 12일 이내에 미성숙 뉴런 및 배양 26일 이내에 성숙한 파르브알부민 양성 개재뉴런의 생성을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배양 배지를 사용한다. 상이한 유형의 신경 전구 세포 및 성숙화된 뉴런을 수득하는데 사용되는 정의된 배양 배지는 전뇌 신경 계통을 따라 분화가 촉진되어 세포 성숙화 및 전뇌 신경 전구체-연관 바이오마커의 발현을 유도하도록 만능 줄기 세포에서 특정한 신호전달 경로 활성을 효능작용 또는 길항시키는 소분자 작용제를 포함한다. 본 개시내용의 방법은 특정 시약의 필요성을 피하면서, 이전 프로토콜의 것과는 상이한 구성요소를 포함하는 분화를 위한 배양 배지를 사용한다 (예를 들어, 본 개시내용의 방법은 이중 SMAD 억제를 필요로 하지 않음). 본 개시내용의 방법은 또한 배양 배지에서 소분자 작용제의 사용이 배양 구성요소의 정확한 제어를 가능하게 하고, 신경 유도 단계의 필요성을 피하며, MGE-NPC로의 분화, 이어서 성숙한 GABA작동성 개재뉴런으로의 추가 성숙화를 위해 소요되는 시간이 선행 기술의 프로토콜과 비교하여 유의적으로 단축된다는 이점이 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 생성하는 방법으로서, 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 수득하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 방법은 FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 방법은 VFB-NSC를 6-9일차에 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 방법은 MGE-NPC를 9-12일차에 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 미성숙 뉴런을 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 방법은 인간 미성숙 뉴런을 12-26일차에 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 수득하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 한 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 한 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포는 배양 동안 비트로넥틴-코팅된 플레이트에 부착된다.

한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189, DMH1, DMH2, 도르소모르핀, K02288, LDN214117, LDN212854, 폴리스타틴, ML347, Noggin, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이며, 이는 배양 배지 중에 250-275 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901, 비니메티닙 (MEK162), 코비메티닙 (XL518), 셀루메티닙, 트라메티닙 (GSK1120212), CI-1040 (PD-184352), 레파메티닙, ARRY-142886 (AZD-6244), PD98059, U0126, BI-847325, RO 5126766, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이며, 이는 배양 배지 중에 100-110 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939, ICG001, 카프마티닙, 엔도-IWR-1, IWP-2, IWP-4, MSAB, CCT251545, KY02111, NCB-0846, FH535, LF3, WIKI4, 트립토니드, KYA1797K, JW55, JW 67, JW74, 카디오노겐 1, NLS-StAx-h, TAK715, PNU 74654, iCRT3, WIF-1, DKK1, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939이며, 이는 배양 배지 중에 100-110 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민 (Pur), GSA 10, SAG, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이며, 이는 배양 배지 중에 500-550 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206, GSK690693, 페리포신 (KRX-0401), 이파타세르팁 (GDC-0068), 카피바세르팁 (AZD5363), PF-04691502, AT 7867, 트리시리빈 (NSC154020), ARQ751, 미란세르팁 (ab235550), 보루세르팁, 세리세르팁, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 배양 배지 중에 50-200 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이며, 이는 배양 배지 중에 138 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983, 소트라스타우린, 엔자스타우린, 스타우로스포린, LY31615, Go 6976, GF 109203X, Ro 31-8220 메실레이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 배양 배지 중에 50-200 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983이며, 이는 배양 배지 중에 110 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙, 데히드로아비에트산, NG25, 사르사사포게닌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 배양 배지 중에 1-5 uM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙이며, 이는 배양 배지 중에 2 uM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01, SB-431542, GW788388, SB525334, TP0427736, RepSox, SD-208, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이며, 이는 배양 배지 중에 500 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 GNF-5837, BMS-754807, UNC2020, 탈레트렉티닙, 알티라티닙, 셀리트렉티닙, PF 06273340, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 배양 배지 중에 25-75 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 GNF-5837이며, 이는 배양 배지 중에 50 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX, RO4929097, 세마가세스타트, 디벤즈아제핀, LY411575, 크레니가세스타트, IMR-1, IMR-1A, FLI-06, DAPT, 발프로산, YO-01027, CB-103, 탄게레틴, BMS-906024, 아바가세스타트, 브루세인 D, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX이며, 이는 배양 배지 중에 100 nM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1, IGF1-Ado, X10, 메카세르민, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 배양 배지 중에 5-15 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP, 디부티릴-cAMP, 8-Br-cAMP, cAMPS-Sp, CW 008, 포르스콜린, 8-CPT-cAMP, CW 008, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-벤조일-, 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염 일수화물, (S)-아데노신, 시클릭 3',5'-(히드로겐포스포로티오에이트) 트리에틸암모늄, Sp-아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트 트리에틸암모늄 염, Sp-5,6-DCI-cBiMPS, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포티오에이트, Sp-이성질체 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트,8-브로모-, Sp-이성질체,소듐 염, Sp-8-pCPT-시클릭 GMPS 소듐, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-모노부티릴아데노신 3':5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염, 8-PIP-cAMP, Sp-cAMPS, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 배양 배지 중에 0.5-2.5 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP이며, 이는 배양 배지 중에 1.0-1.5 μM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 발프로산 또는 유사체는 발프로산, 발프로에이트, 소듐 발프로에이트 및 발프로에이트 세미소듐으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 발프로산 또는 유사체는 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 발프로산은 배양 배지 중에 450-550 nM 범위 내의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 물질 P는 배양 배지 중에 100-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF, BT13, BT44, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 배양 배지 중에 5-50 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 MHY1458, NV-5138, 테스토스테론, 3-벤질-5-((2-니트로페녹시)메틸)-디히드로푸란-2(3H)-온 (3BDO), 3BDO, L-류신, NV-5138 히드로클로라이드, NV-5138, L-류신-d1, L-류신-2-13C,15N, 류신-13C6, L-류신-d7, L-류신-d10, L-류신-d2, l-류신-d3, L-류신-18O2, L-류신-13C, L-류신-2-13C, L-류신-13C6-15N, L-류신-15N, L-류신-1-13C,15N, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 배양 배지 중에 1-3 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, mTOR 효능제는 MHY1458이며, 이는 배양 배지 중에 2 μM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF, 로티고틴, 7,8-DHF, 케타민, 트리시클릭 이량체성 펩티드-6 (TDP6), LM22A-4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 배양 배지 중에 5-50 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 아스코르브산 또는 그의 유사체는 비타민 C, 2-포스포-L-아스코르브산, L-아스코르브산, 소듐 아스코르빌 포스페이트, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코시드, 테트라헥실데실 아스코르베이트 (THD), 에틸화된 L-아스코르브산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 아스코르브산 또는 유사체는 배양 배지 중에 100-400 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 2-포스포-L-아스코르브산은 배양 배지 중에 200 μM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 소듐 피루베이트는 배양 배지 중에 100-300 μM의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, LPA 또는 그의 유사체는 리소포스파티드산 (LPA), 2-[[3-(1,3-디옥소-1H-벤즈[de]이소퀴놀린-2(3H)-일)프로필]티오]벤조산, 1-올레오일 리소포스파티드산 (O-LPA), UCM-05194, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, LPA 또는 유사체는 배양 배지 중에 100-400 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, LPA 또는 유사체는 O-LPA이며, 이는 배양 배지 중에 200-300 nM 범위 내의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, N2 보충제는 배양 배지 중에 0.5%-1.5% 범위 내의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, NEAA 보충제는 배양 배지 중에 0.5%-1.5% 범위 내의 농도로 존재한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 인간 NKX2-1 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 생성하는 방법을 제공한다:

(a) 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하는 단계; 및

(b) 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하고 AKT 경로 길항제 및 PKC 경로 길항제가 결여된 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 단계.

한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이고, MEK 경로 길항제는 PD0325901이고, WNT 경로 길항제는 XAV939이고, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이고, AKT 경로 길항제는 MK2206이고, PKC 경로 길항제는 Go 6983이다.

한 실시양태에서, LDN193189는 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재하고, PD0325901은 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, XAV939는 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 푸르모르파민은 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, MK2206은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, Go 6983은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, LDN193189는 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 275 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 250 nM의 농도로 존재하고, PD0325901은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, XAV939는 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, 푸르모르파민은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 550 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, MK2206은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 138 nM의 농도로 존재하고, Go 6983은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 존재한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 생성하는 방법에 관한 것이다:

(a) 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하는 단계;

(b) 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하고 AKT 경로 길항제 및 PKC 경로 길항제가 결여된 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 단계; 및

(c) 인간 NKX2-1+ VFB-NSC를 6-9일차에 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하는 단계.

한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이고, MEK 경로 길항제는 PD0325901이고, WNT 경로 길항제는 XAV939이고, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이고, AKT 경로 길항제는 MK2206이고, PKC 경로 길항제는 Go 6983이고, TAK1 경로 길항제는 타키닙이고, TGF-β 경로 길항제는 A 83-01이고, TRK 경로 길항제는 GNF-5837이고, Notch 경로 길항제는 GSI-XX이고, IGF1 경로 효능제는 IGF-1이다.

한 실시양태에서, LDN193189는 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재하고, PD0325901은 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, XAV939는 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 푸르모르파민은 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, MK2206은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, Go 6983은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 타키닙은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 1-5 uM 범위 내의 농도로 존재하고, A 83-01은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, GNF-5837은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 25-75 nM 범위 내의 농도로 존재하고, GSI-XX는 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, IGF-1은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 5-15 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, LDN193189는 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 275 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 250 nM의 농도로 존재하고, PD0325901은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, XAV939는 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, 푸르모르파민은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 550 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, MK2206은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 138 nM의 농도로 존재하고, Go 6983은 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 존재하고, 타키닙은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 2 uM의 농도로 존재하고, A 83-01은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, GNF-5837은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 50 nM의 농도로 존재하고, GSI-XX는 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, IGF-1은 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 10 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 인간 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)로부터 인간 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 생성하는 방법에 관한 것이다:

(a) 인간 MGE-NPC를 0-3일차에 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 미성숙 뉴런을 수득하는 단계; 및

(b) 인간 미성숙 뉴런을 3-17일차에 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 수득하는 단계.

한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP이고, 발프로산 또는 유사체는 발프로산이고, 물질 P 또는 유사체는 물질 P이고, GDNF 경로 효능제는 GDNF이고, mTOR 경로 효능제는 MHY1458이고, BDNF 경로 효능제는 BDNF이고, IGF-1 경로 효능제는 IGF-1이고, 아스코르브산 또는 유사체는 2-포스포-L-아스코르브산이고, 소듐 피루베이트 또는 유사체는 소듐 피루베이트이고, LPA 또는 유사체는 O-LPA이다.

한 실시양태에서, cAMP는 1.0-1.5 μM 범위의 농도로 존재하고, 발프로산은 450-550 nM 범위의 농도로 존재하고, 물질 P는 100-150 nM 범위의 농도로 존재하고, GDNF는 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, MHY1458은 1-3 μM 범위의 농도로 존재하고, BDNF는 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, IGF-1은 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, 2-포스포-L-아스코르브산은 100-400 μM 범위의 농도로 존재하고, O-LPA는 100-400 μM 범위의 농도로 존재하고, 소듐 피루베이트는 100-300 μM 범위의 농도로 존재하고; N2 보충제는 0.5%-1.5% 범위의 농도로 존재하고, NEAA 보충제는 0.5%-1.5% 범위의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, cAMP는 1.0 μM의 농도로 존재하고, 발프로산은 500 nM의 농도로 존재하고, 물질 P는 100 nM의 농도로 존재하고, GDNF는 10 ng/ml의 농도로 존재하고, MHY1458은 2 μM의 농도로 존재하고, BDNF는 10 ng/ml의 농도로 존재하고, IGF-1은 10 ng/ml의 농도로 존재하고, 2-포스포-L-아스코르브산은 200 μM의 농도로 존재하고, 소듐 피루베이트는 100 μM의 농도로 존재하고, O-LPA는 200 μM의 농도로 존재하고, N2 보충제는 1.0%의 농도로 존재하고, NEAA 보충제는 1.0%의 농도로 존재한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 전뇌 신경 줄기 또는 전구 세포를 생성하기 위한 다양한 배양 배지에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는, 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는, 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는, 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는, 인간 미성숙 뉴런을 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는, 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 전뇌 신경 줄기 또는 전구 세포의 단리된 세포 배양물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NPC를 포함하는 배양물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 NKX2-1+ VFB-NPC를 포함하는 배양물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)의 단리된 세포 배양물로서, TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 ASCL1+ MGE-NPC를 포함하는 배양물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 미성숙 뉴런을 포함하는 인간 미성숙 뉴런의 단리된 세포 배양물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런의 단리된 세포 배양물로서, BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 포함하는 배양물을 제공한다.

추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 전뇌 신경 줄기 또는 전구 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 미성숙 뉴런을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 인간 파르브알부민+ 성숙한 개재뉴런을 제공한다,

본 개시내용의 방법 및 조성물은 신경계 장애 치료 (예를 들어, 간질 치료를 위한 이식)와 같은 연구 또는 치료 목적을 위한 인간 전뇌 신경 줄기 또는 전구 세포의 생성에 유용하다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.

도 1은 FEZF2의 최대 발현을 위해 최적화된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 모델의 상부 섹션은 FEZF2에 대해 최적화되었을 때, 미리 선택된 53개의 유전자의 발현 수준의 예측을 제시한다. 모델의 하부 섹션은 이 모델에서 시험된 이펙터 및 FEZF2의 최대 발현에 대한 그의 기여도를 제시한다. 값 열은 모델을 모방하기 위한 각 이펙터의 요구되는 농도를 지칭한다.
도 2는 SIX3의 최대 발현을 위해 최적화된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기술된 바와 같다. 이 조건은 인자 기여도가 24.9 및 23.7인 이펙터 LDN193189 및 TTNPB를 SIX3의 높은 발현을 위한 중요한 입력으로서 강조한다.
도 3은 OTX2의 최대 발현을 위해 최적화된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기술된 바와 같다. 이 조건은 인자 기여도가 28.8인 이펙터 TTNPB를 OTX2의 최소 발현을 위한 중요한 입력으로서 강조한다.
도 4는 시험된 12개의 이펙터의 농도 대비 OTX2, FEZF2 및 SIX3 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. OTX2의 발현에 대한 LDN193189 및 XAV939의 긍정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 5는 FEZF2의 최대 발현을 위해 최적화된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기술된 바와 같다. 이 조건은 인자 기여도가 12.2인 이펙터 MK2206을 FEZF2의 최대 발현을 위한 중요한 입력으로서 강조한다.
도 6은 시험된 12개의 이펙터의 농도 대비 FEZF2의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. FEZF2의 발현에 대한 LDN193189, XAV939, PD0325901, MK2206, 푸르모르파민 및 GO6983의 긍정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 7은 분화의 스테이지 2에 대한 레시피를 생성하기 위해 스테이지 1 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 이 모델은 NKX2-1의 최대 발현을 위해 최적화된 것이다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기술된 바와 같다. 이 설정은 인자 기여도가 26.3인 SANT-1의 NKX2-1의 발현에서의 부정적인 역할을 강조한다.
도 8은 12개의 이펙터의 농도 대비 NKX2-1, PAX6 및 NKX2-2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. NKX2-1에 대한 PD0325901 및 XAV939의 긍정적인 영향 및 SANT-1 및 TTNPB의 부정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 9는 분화의 스테이지 3에 대한 레시피를 생성하기 위해 스테이지 2 신경 줄기 세포에 적용된 12-인자 실험의 HD-DoE 모델로부터의 결과를 제시한다. 이 모델은 ASCL1의 최대 발현을 위해 최적화된 것이다. 상부 및 하부 섹션은 도 1에 대해 기술된 바와 같다. 이 설정은 인자 기여도가 18 및 14인 A8301 및 GSI-XX의 긍정적인 역할을 강조한다.
도 10은 12개의 이펙터의 농도 대비 ASCL1, DLX1 및 LHX6 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. ASCL1 및 LHX6의 발현 수준에 대한 A8301, GSI-XX 및 푸르모르파민의 긍정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 11A-11B는 분화의 스테이지 1의 레시피에서 6개의 검증된 이펙터의 농도 대비 OTX2, FEZF2 및 SIX3 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 도 11A는 확정된 이펙터 모두의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다. 도 11B는 나머지 다른 것은 존재하는 동안 한 번에 하나의 확정된 이펙터가 부재하는 상태에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 12는 분화의 스테이지 1의 레시피에서 6개의 검증된 이펙터의 농도 대비 FEZF2의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. FEZF2의 발현 수준은 나머지 다른 것은 존재하는 동안 한 번에 하나의 확정된 이펙터가 부재하는 상태에서의 것으로 제시되어 있다.
도 13A-13B는 분화의 스테이지 2의 레시피에서 4개의 검증된 이펙터의 농도 대비 NKX2-1, PAX6 및 NKX2-2 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 도 13A는 확정된 이펙터 모두의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다. 도 13B는 나머지 다른 것은 존재하는 동안 한 번에 하나의 확정된 이펙터가 부재하는 상태에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 14는 NKX2-1의 발현 수준의 최적화를 위해 사용된 12-인자 HD-DoE 모델에서 2개의 이펙터의 상호작용 플롯을 제시한다. 청색 플롯은 푸르모르파민의 농도가 그의 최고 농도 (500 nM)로 유지되는 동안 XAV939의 농도가 증가함에 따른 NKX2-1 발현 수준을 제시한다. 녹색 플롯은 푸르모르파민의 농도가 0으로 유지되는 동안 XAV93의 농도가 증가함에 따른 NKX2-1 발현 수준을 제시한다.
도 15A-15B는 분화의 스테이지 3의 레시피에서 6개의 검증된 이펙터의 농도 대비 ASCL1, DLX1 및 LHX6 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 도 15A는 6개의 인자 모두의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다. 도 15B는 나머지 다른 것은 존재하는 동안 한 번에 하나의 확정된 인자가 부재하는 상태에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 16A-16C는 스테이지 1, 2 및 3 처리 종료 시 복측 전뇌-유래 신경 전구 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다. 세포를 SIX3, OTX2, 배측 전뇌 마커 PAX6, 복측 전뇌 바이오마커 NKX2-1, DLX5 및 MASH1, MGE 특이적 바이오마커 LHX6 및 SOX6, 범 뉴런 바이오마커 베타 III-튜불린, GABA작동성 개재뉴런 바이오마커 GABA, 증식 바이오마커 KI67 및 신경교 바이오마커 OLIG2 및 GFAP를 포함한 전뇌 바이오마커로 염색한다. 도 16A는 3일차 (스테이지 1 종료 시) 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다. 도 16B는 6일차 (스테이지 2 종료 시) 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다. 도 16C는 9일차 (스테이지 3 종료 시) 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다.
도 17은 만능 줄기 세포로부터 MGE-NPC를 생성하기 위한 3 스테이지 프로토콜에 관한 본 개시내용의 대표적인 배양 방법의 개략도이다.
도 18은 MGE-NPC로부터 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하기 위한 2 스테이지 프로토콜에 관한 본 개시내용의 대표적인 배양 방법의 개략도이다.
도 19는 MEF2C의 최대 발현을 위해 최적화된 12-인자 실험의 모델로부터의 결과를 제시한다. 모델의 상부 섹션은 MEF2C에 대해 최적화되었을 때, 미리 선택된 53개의 유전자의 발현 수준의 예측을 제시한다. 모델의 하부 섹션은 이 모델에서 시험된 이펙터 및 MEF2C의 최대 발현에 대한 그의 기여도를 제시한다. 값 열은 모델을 모방하기 위한 각 이펙터의 요구되는 농도를 지칭한다.
도 20은 12개의 이펙터의 농도 대비 MEF2C 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. MEF2C에 대한 cAMP, 발프로산, 물질 P, 및 GDNF의 긍정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 21은 PVALB의 최대 발현을 위해 최적화된 8-인자 실험의 모델로부터의 결과를 제시한다. 상부 및 하부 섹션은 도 19에 기술된 바와 같다. 이 조건은 인자 기여도가 14.6, 12.8, 15.04인 이펙터 BDNF, IGF-1, 및 2-포스포-L-아스코르브산을 PVALB의 최대 발현을 위한 중요한 입력으로서 강조한다.
도 22는 8개의 이펙터의 농도 대비 PVALB의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 인돌락탐-V, 올레산, 2-포스포-L-아스코르브산, BDNF, IGF-1의 긍정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 23은 분화의 스테이지 5에 대한 레시피를 생성하기 위해 스테이지 4 신경 줄기 세포에 적용된 8-인자 실험의 모델로부터의 결과를 제시한다. 이 모델은 PVALB의 최대 발현을 위해 최적화된 것이다. 상부 및 하부 섹션은 도 19에 기술된 바와 같다. 이 설정은 인자 기여도가 15.9인 N2의 PVALB의 발현에서의 긍정적인 역할을 강조한다.
도 24는 8개의 이펙터의 농도 대비 PVALB 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. PVALB에 대한 N2의 긍정적인 영향 및 GSI-XX, THI0019 및 헤파린의 부정적인 영향 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 25는 분화의 스테이지 5에 대한 레시피를 생성하기 위해 스테이지 4 신경 줄기 세포에 적용된 8-인자 실험의 모델로부터의 결과를 제시한다. 이 모델은 PVALB의 최대 발현을 위해 최적화된 것이다. 상부 및 하부 섹션은 도 19에 기술된 바와 같다. 이 설정은 인자 기여도가 3.14 및 17.1인 포르스콜린 및 소듐 피루베이트의 긍정적인 역할을 강조한다.
도 26은 8개의 이펙터의 농도 대비 PVALB 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. PVALB의 발현 수준에 대한 소듐 피루베이트 및 그의 인자 기여도는 각 이펙터에 대한 플롯의 기울기에 의해 제시된다.
도 27A-27B는 분화의 스테이지 4의 레시피에서 5개의 이펙터의 농도 대비 MEF2C, PVALB 및 소마토스타틴 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 결과는 7개의 인자 모두의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 28A-28B는 분화의 스테이지 5의 레시피에서 3개의 이펙터의 농도 대비 PVALB 및 소마토스타틴 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 결과는 명시된 인자의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 29는 분화의 스테이지 5의 레시피에서 N2 이펙터의 농도 대비 PVALB 및 소마토스타틴 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 결과는 N2 인자의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 30은 분화의 스테이지 5의 레시피에서 소듐 피루베이트의 농도 대비 PVALB 및 소마토스타틴 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 결과는 소듐 피루베이트 인자의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 31A-31B는 분화의 스테이지 5의 레시피에서 이펙터 농도 대비 LHX6 및 GAD1 유전자의 발현 수준의 동적 프로파일을 제시한다. 결과는 모든 인자의 존재 하에서의 관심 유전자의 발현 수준을 제시한다.
도 32는 스테이지 4 처리 종료 시 분화된 개재뉴런 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다. 세포를 NeuN, 배측 전뇌 마커 PAX6, GAD65, 네스틴, MASH1, 범 뉴런 바이오마커 베타 III-튜불린, SOX2, 및 SOX6을 포함한 전뇌 바이오마커로 염색하였다. 결과는 3일차 (스테이지 4 종료 시) 세포의 형광 이미지를 제시한다.
도 33은 5 처리 종료 시 분화된 개재뉴런 세포의 형광 이미지의 사진을 제시한다. 세포를 GAD65, MASH1, MAP2, 시냅신, GABA작동성 개재뉴런 바이오마커 GABA, LHX6, 뉴로필라멘트, 파르브알부민 및 GFAP를 포함한 전뇌 바이오마커로 염색하였다. 결과는 17일차 (스테이지 5 종료 시) 세포의 형광 이미지를 제시한다.

본원에서는 소분자 기반 접근법을 사용하여 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포로부터 전뇌 신경 전구체, 뿐만 아니라 성숙화된 GABA작동성 개재뉴런의 생성을 가능하게 하는 방법론 및 조성물을 기술한다. 본 개시내용의 방법은, OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)가 3일 이내에 생성된 후, 이어서 배양 6일차까지 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)가 생성되고, 이어서 배양 9일차까지 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)가 생성되는 3 스테이지 프로토콜로 내측 신경절 융기 신경 전구체 (GABA작동성 개재뉴런에 대한 전구체)를 생성한다. 따라서, 본 개시내용은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하는 선행 기술 프로토콜보다 유의적으로 더 짧은 시간 내에 MGE-NPC를 획득할 수 있게 한다. MGE-NPC는 MGE-NPC가 3일 (MGE-NPC를 생성하는 9일 프로토콜에 따라 배양 12일차) 내에 미성숙 뉴런으로 먼저 분화된 후, 이어서 14일 (배양 26일차) 내에 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런으로 분화되는 2 스테이지 프로토콜에 따라 추가로 분화될 수 있다.

실시예 1에 기술된 바와 같이, 유전자 발현과 같은 출력 반응에 대한 다중 프로세스 입력 (예를 들어, 소분자 효능제 또는 길항제)을 동시에 시험하기 위해 고차원 실험 디자인 (HD-DoE) 접근법을 사용하였다. 상기 실험을 통해 단기간 내에 정의된 조건 하에서 FB-NSC, VFB-NSC, 및 MGE-NPC를 포함한 전뇌 신경 줄기 및 전구 세포를 생성하는데 충분한, 특정한 신호전달 경로의 효능제 및/또는 길항제를 포함하는 화학적으로 정의된 배양 배지를 확인할 수 있었다. 최적화된 배양 배지는 실시예 2에 기술된 바와 같이 개별 효능제 또는 길항제 작용제 제거 효과를 조사한 인자 임계성 분석에 의해 추가로 검증되었다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 분화 프로토콜에 의해 생성된 세포의 표현형을 면역조직화학법을 통해 추가로 확인하였다.

도 17은 3 스테이지 프로토콜을 이용하여 FB-NSC, VFB-NSC 및 MGE-NPC를 생성하기 위한 본 개시내용의 방법의 실시양태를 개략적으로 예시한다.

도 18은 2 스테이지 프로토콜을 이용하여 MGE-NPC로부터 미성숙 뉴런 및 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 생성하기 위한 본 개시내용의 방법의 실시양태를 개략적으로 예시한다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 더 상세하게 기술된다.

I. 세포

본 개시내용의 배양에 사용되는 출발 세포는 인간 만능 줄기 세포이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 만능 줄기 세포" (hPSC로 약칭됨)는 여러 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력이 있는 인간 줄기 세포를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "만능"이라는 용어는 상이한 조건 하에서 3개의 모든 배세포 층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 특징적인 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력이 있는 세포를 지칭한다. 만능 세포는 주로 예를 들어, 누드 마우스 및 기형종 형성 검정법을 사용하여 3개의 모든 배엽으로 분화할 수 있는 그의 능력을 특징으로 한다. 만능분화능에 대한 바람직한 시험은 3개의 배엽 각각의 세포로 분화할 수 있는 능력을 입증하는 것이지만, 만능분화능은 또한 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해 입증될 수 있다.

인간 만능 줄기 세포는, 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 인간 배아 줄기 세포, 예컨대 ES 세포주를 포함한다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 비제한적인 예로는 (예를 들어, 문헌 [Yu, J. et al. (2009) Science 324:797-801]에 기술된 바와 같이) 19-11-1, 19-9-7 또는 6-9-9 세포를 포함한다. 인간 배아 줄기 세포주의 비제한적인 예로는 ES03 세포 (와이셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)) 및 H9 세포 (Thomson, J.A. et al. (1998) Science 282:1145-1147)를 포함한다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC)는 세포를 PSC인 것으로 확인하는데 사용될 수 있는 세포 마커를 발현한다. 만능 줄기 세포 마커의 비제한적인 예로는 TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-54, SSEA1, SSEA3, SSEA4, CD9, CD24, OCT3, OCT4, NANOG 및/또는 SOX2를 포함한다. 본 개시내용의 전뇌 신경 전구체를 생성하는 방법은 출발 만능 줄기 세포 집단을 분화시키는데 (성숙화시키는데) 사용되는 바, 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 전뇌 신경 전구 세포 집단은 하나 이상의 줄기 세포 마커, 예컨대 TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-54, SSEA1, SSEA3, SSEA4, CD9, CD24, OCT3, OCT4, NANOG 및/또는 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현이 결여되어 있다.

만능 줄기 세포는 세포 분화를 유도하는 본원에 기술된 바와 같은 배양 조건에 적용된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "분화"는 더욱 원시적인 스테이지로부터 더욱 성숙한 (즉, 덜 원시적인) 세포로의 세포의 발생을 지칭하고, 전형적으로는 특정한 세포 계통으로의 수임의 표현형 특색을 나타낸다.

본원에 사용되는 바와 같이, "신경 줄기 세포"는 신경 계통으로 수임되지만, 신경 계통을 따라 상이한 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력이 여전히 있다는 점에서 만능 줄기 세포보다 더 분화된 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "신경 전구 세포"는 신경 줄기 세포보다 더 분화되고, 특정한 유형의 신경 세포로 추가로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다.

실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이오마커, 예컨대 신경 전구체 또는 전뇌 영역-수임 신경 세포의 특정한 바이오마커의 발현에 기초하여 확인 및 특징화될 수 있다. "양성" 바이오마커는 관심 세포 상에서 발현된 것인 반면, "음성" 바이오마커는 관심 세포에서 발현되지 않는 것이다.

발현이 관심 세포의 특징화에서 평가될 수 있는 것인 바이오마커의 비제한적인 예로는 OTX2 (Hoch et al. (2015) Cell Reports 12:482-494), SIX3 (Lagutin et al. (2003) Genes & Development 17:368-379) 및 FEZF2 (Zhang et al. (2014) Development 141:4794-47805)를 포함한, 전방 신경외배엽 및 전뇌의 발생 및 패턴화에 수반되는 유전자, NKX2 -1 및 PAX6의 부재 (즉, 음성 바이오마커로서 PAX6) (이는 배측 전뇌 마커임) (Stoykova et al. (2000) J. Neurosci. 20:8042-8050)를 포함한, 복측 전뇌에서 발현되는 유전자, 및 ASCL1, LHX6 및 DLX1을 포함한, 내측 신경절 융기 (MGE) 영역 중 뉴런 전구 세포에서 발현되는 유전자 (Silberberg et al. (2016) Neuron 92:59-74)를 포함한다. 실시양태에서, FB-NSC는 OTX2+ FEZF2+ SIX3+이다. 실시양태에서, VFB-NSC는 NKX2-1+이다. 실시양태에서, VFB-NSC는 NKX2-1+ 및 PAX6 음성 (PAX6-)이다. 실시양태에서, MBE-NPC는 ASCL1+이다. 실시양태에서, MBE-NPC는 ASCL1, LHX6 및 DLX1로부터 선택되는 적어도 2개의 마커에 대해 양성이다. 실시양태에서, MBE-NPC는 ASCL1+ LHX6+ DLX1+이다.

다른 바이오마커는 베타 III-튜불린 (범 뉴런 마커), KI67 (증식 마커), DLX5 (전뇌의 LGE 및 MGE 영역에서 발현되는 뉴런 전구체 마커 (Wang et al. (2010) J. Neurosci. 30:5334-5345)), OLIG2 (희소돌기아교세포 마커), GFAP (신경교 마커), DCX (미성숙 뉴런을 지정하는 마커), SOX6 (MGE 영역의 유사분열 후 전구체에서 발현되는 마커 (Batista-Brito et al. (2009) Neuron 63:466-481)) 및 GABA (GABA작동성 개재뉴런에 의해 특이적으로 발현되는 마커)를 포함하였다.

본원에 사용되는 바와 같이, 단지 "낮은" 수준의 관심 바이오마커의 세포에 의한 발현은 배경 수준보다 최대 20%, 더욱 바람직하게는, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만 높은 수준을 지칭하는 것으로 의도된다 (여기서 배경 수준은, 예를 들어, 세포에 의해 발현되지 않는 것으로 간주되는 음성 대조군 마커의 발현 수준에 상응함).

실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 세포는 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "전뇌 신경 줄기 세포" 또는 "FB-NSC"는 OTX2, FEZF2 및 SIX3으로부터 선택되는, 적어도 하나의 바이오마커, 및 바람직하게는 2개 또는 3개의 모든 바이오마커를 발현하는 줄기 세포-유래 신경 줄기 세포를 지칭한다. FB-NSC는 또한 베타 III-튜불린 및/또는 KI67을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 추가적인 바이오마커를 발현할 수 있다.

실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 세포는 FB-NSC보다 더 분화된 (더욱 성숙한) 세포이고, 복측 계통을 따라 수임된 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "복측 전뇌 신경 줄기 세포" 또는 "VFB-NSC"는 바이오마커 NKX2-1을 발현하는 줄기 세포-유래 신경 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, VFB-NSC는 바이오마커 PAX6을 발현하지 않거나, 또는 단지 낮은 수준으로만 발현한다. 추가로, VFB NSC는 또한 베타 III-튜불린 및/또는 KI67을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 추가적인 바이오마커를 발현할 수 있다.

실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 세포는 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "내측 신경절 융기 신경 전구 세포" 또는 "MGE-NPC"는 ASCL1, LHX6 및 DLX1로부터 선택되는, 적어도 하나의 바이오마커, 및 바람직하게는 2개 또는 3개의 모든 바이오마커를 발현하는 줄기 세포-유래 신경 세포를 지칭한다. MGE-NPC는 또한 베타 III-튜불린 및/또는 KI67을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 추가적인 바이오마커를 발현할 수 있다.

본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 수임된 MGE-NPC는, 예를 들어, 본원에 기술된 배양 프로토콜에 따라 시험관내에서 추가로 배양되어 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 성숙한 GABA작동성 뉴런은 바이오마커 파르브알부민을 발현하고, LHX6, MAP2, GABA 및/또는 GAD1 또한 발현할 수 있는 뉴런-유래 세포를 지칭한다.

II. 배양 배지 구성요소

FB-NSC, VFB-NSC 및 MGE-NPC, 뿐만 아니라 MGE-NPC로부터 미성숙 뉴런 및 파르브알부민+ 개재뉴런을 생성하는 본 개시내용의 방법은 인간 만능 줄기 세포를 세포 신호전달 경로의 특이적 효능제 및/또는 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 배양 배지에는 혈청이 결여되어 있고/거나, 외인적으로 첨가된 성장 인자가 결여되어 있고/거나, 동물 생성물이 결여되어 있고/거나, 제노-프리이고/거나, 피더 층 프리이다. 다양한 실시양태에서, 배양 배지에는 SMAD2/3 억제제 또는 길항제가 결여되어 있거나, 이중 SMAD 억제제 또는 길항제가 결여되어 있거나, TGFβ 경로 길항제가 결여되어 있다.

실시예 1에 기술된 바와 같이, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지는 3일만에 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 생성하기에 충분하였다 (본원에서 분화 프로토콜의 "스테이지 1"로 지칭됨). BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서의 FB-NSC의 추가 분화는 추가 3일 내에 NKX2-1+ VFB-NSC를 생성하기에 충분하였다 (본원에서 "스테이지 2"로 지칭됨). TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서의 VFB-NSC의 추가의 또 다른 분화는 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 생성하기 위한 전체 3-스테이지 9일 프로토콜의 경우 추가 3일 내에 ASCL1+ MGE-NPC를 생성하기에 충분하였다 (본원에서 "스테이지 3"으로 지칭됨). MGE-NPC는 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 그의 유사체, 물질 P 또는 그의 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 3일 동안 추가로 배양함으로써 미성숙 뉴런으로 추가로 분화될 수 있다 (본원에서 "스테이지 4"로 지칭됨). 마지막으로, 미성숙 뉴런은 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트, O-LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 비필수 아미노산을 포함하는 배양 배지에서 2주 (14일) 동안 추가로 배양함으로써 성숙한 GABA작동성 개재뉴런으로 추가로 분화될 수 있다 (본원에서 "스테이지 5"로 지칭됨).

본원에 사용되는 바와 같이, 세포 신호전달 경로의 "효능제"는 세포 신호전달 경로를 자극하는 (상향조절하는) 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 세포 신호전달 경로의 자극은, 예를 들어, 신호전달 경로에 수반되는 세포 표면 수용체를 활성화시키는 효능제 (예를 들어, 효능제는 수용체 리간드일 수 있음)의 사용에 의해 세포외에서 개시될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포 신호전달의 자극은, 예를 들어, 신호전달 경로의 구성요소(들)와 세포내 상호작용하는 소분자 효능제의 사용에 의해 세포내에서 개시될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 세포 신호전달 경로의 "길항제"는 세포 신호전달 경로를 억제하는 (하향조절하는) 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다. 세포 신호전달 경로의 억제는, 예를 들어, 신호전달 경로에 수반되는 세포 표면 수용체를 차단하는 길항제의 사용에 의해 세포외에서 개시될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세포 신호전달의 억제는, 예를 들어, 신호전달 경로의 구성요소(들)와 세포내 상호작용하는 소분자 길항제의 사용에 의해 세포내에서 개시될 수 있다.

본 개시내용의 방법에 사용되는 효능제 및 길항제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 이는 원하는 결과, 예를 들어, 관심 전뇌 마커를 발현하는 전뇌 신경 줄기 또는 전구 세포의 생성을 달성하는데 효과적인 농도로 배양 배지에서 사용된다. 적합한 효능제 및 길항제 작용제의 비제한적인 예, 및 유효 농도 범위는 하기에 추가로 기술된다.

BMP (골 형태발생 단백질) 경로의 길항제는, 액티빈 수용체 유사 키나제 (ALK) (예를 들어, ALK2 및 ALK3을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 타입 I BMP 수용체)인 BMP 수용체에의 BMP의 결합에 의해 생물학적으로 활성화되는 BMP 신호전달 경로를 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189, DMH1, DMH2, 도르소모르핀, K02288, LDN214117, LDN212854, 폴리스타틴, ML347, Noggin, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 배양 배지 중에 100-500 nM, 100-400 nM, 150-350 nM 또는 200-300 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이며, 이는 배양 배지 중에 100-500 nM, 100-400 nM, 150-350 nM 또는 200-300 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BMP 경로 길항제는 LDN193189이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 275 nM 농도로 및 단계 (b) (스테이지 2)에서는 250 nM 농도로 존재한다.

MEK 경로의 길항제는 MAPK/ERK 경로 (Ras-Raf-MEK-ERK 경로로도 공지)의 구성요소 중 하나 이상의 것의 신호전달 경로를 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901, 비니메티닙 (MEK162), 코비메티닙 (XL518), 셀루메티닙, 트라메티닙 (GSK1120212), CI-1040 (PD-184352), 레파메티닙, ARRY-142886 (AZD-6244), PD98059, U0126, BI-847325, RO 5126766, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 배양 배지 중에 25-300 nM, 50-150 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-120 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이며, 이는 배양 배지 중에 25-300 nM, 50-150 nM, 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-120 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, MEK 경로 길항제는 PD0325901이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 110 nM 농도로 및 단계 (b) (스테이지 2)에서는 100 nM 농도로 존재한다.

WNT 경로의 길항제는 Wnt-단백질 리간드의 프리즐드(Frizzled) 패밀리 수용체에의 결합에 의해 생물학적으로 활성화되는 정규 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939, ICG001, 카프마티닙, 엔도-IWR-1, IWP-2, IWP-4, MSAB, CCT251545, KY02111, NCB-0846, FH535, LF3, WIKI4, 트립토니드, KYA1797K, JW55, JW 67, JW74, 카디오노겐 1, NLS-StAx-h, TAK715, PNU 74654, iCRT3, WIF-1, DKK1, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 배양 배지 중에 10-500 nM, 50-250 nM 또는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939이다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939이며, 이는 배양 배지 중에 10-500 nM, 50-250 nM 또는 50-150 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, WNT 경로 길항제는 XAV939이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 110 nM 농도로 및 단계 (b) (스테이지 2)에서는 100 nM 농도로 존재한다.

SHH (소닉 헤지호그) 경로의 효능제는 Patched-1 (PTCH1) 수용체에의 SHH의 결합 및 스무슨드 (SMO) 막횡단 단백질을 통한 형질도입을 생물학적으로 수반하는 SHH 경로를 통한 신호전달을 자극할 (활성화할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민, GSA 10, SAG, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 배양 배지 중에 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 500-600 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이며, 이는 배양 배지 중에 100-1000 nM, 200-800 nM, 250-750 nM 또는 500-600 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, SHH 경로 효능제는 푸르모르파민이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 550 nM 농도로 및 단계 (b) 및 (c) (스테이지 2 및 3)에서는 500 nM 농도로 존재한다.

AKT 경로의 길항제는 AKT1 (또한 PKB 또는 RacPK로도 지정됨), AKT2 (또한 PKBβ 또는 RacPK-β로도 지정됨) 및 AKT 3 (또한 PKBγ 또는 흉선종 바이러스 프로토-온코진 3으로도 지정됨)을 포함하는 세린/트레오닌 키나제 AKT 패밀리 구성원 중 하나 이상의 것의 신호전달 경로를 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206, GSK690693, 페리포신 (KRX-0401), 이파타세르팁 (GDC-0068), 카피바세르팁 (AZD5363), PF-04691502, AT 7867, 트리시리빈 (NSC154020), ARQ751, 미란세르팁 (ab235550), 보루세르팁, 세리세르팁, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 배양 배지 중에 25-300 nM, 50-200 nM, 75-200 nM 또는 125-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이며, 이는 배양 배지 중에 25-300 nM, 50-200 nM, 75-200 nM 또는 125-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, AKT 경로 길항제는 MK2206이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 138 nM의 농도로 존재한다.

PKC (단백질 키나제 C) 경로의 길항제는 생물학적으로 PKC 패밀리 구성원에 의해 매개되는 PKC 신호전달 경로를 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 세린/트레오닌 키나제의 PKC 패밀리는 이소폼 α, β1, β2 및 γ를 함유하는 "고전적" PKC 서브카테고리를 포함하는 15종의 이소자임을 포함한다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 PKCα, PKCβ1, PKCβ2 및 PKCγ로부터 선택되는 적어도 하나의 (및 다른 실시양태에서, 적어도 2개 또는 3개의) PKC 효소의 활성을 억제한다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983, 소트라스타우린, 엔자스타우린, 스타우로스포린, LY31615, Go 6976, GF 109203X, Ro 31-8220 메실레이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 배양 배지 중에 10-500 nM, 50-300 nM, 50-150 nM 또는 75-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983이다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983이며, 이는 배양 배지 중에 10-500 nM, 50-300 nM, 50-150 nM 또는 75-150 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, PKC 경로 길항제는 Go 6983이며, 이는 배양 배지 중에 단계 (a) (스테이지 1)에서는 110 nM 농도로 존재한다.

TAK1 (또한 MAP3K7로도 공지) 경로의 길항제는 TAK1 (MAP3K7)을 통한 신호전달을 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙, 데히드로아비에트산, NG25, 사르사사포게닌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 배양 배지 중에 1-5 uM, 1-3 uM 또는 1.5-2.5 uM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙이다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙이며, 이는 배양 배지 중에 1-5 uM, 1-3 uM 또는 1.5-2.5 uM의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TAK1 경로 길항제는 타키닙이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (c) (즉, 스테이지 3)에서, 2 uM의 농도로 존재한다.

TGFβ (형질전환 성장 인자 베타) 경로의 길항제는 세린/트레오닌 키나제 수용체의 패밀리인 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 통한 신호전달을 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01, SB-431542, GW788388, SB525334, TP0427736, RepSox, SD-208, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 배양 배지 중에 300-800 nM, 250-750 nM, 300-650 nM 또는 400-600 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이며, 이는 배양 배지 중에 300-800 nM, 250-750 nM, 300-650 nM 또는 400-600 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TGFβ 경로 길항제는 A 83-01이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (c) (즉, 스테이지 3)에서는 500 nM 농도로 존재한다.

TRK 경로의 길항제는 TrkA, TrkB 및/또는 TrkC 티로신 키나제를 통한 신호전달을 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 GNF-5837, BMS-754807, UNC2020, 탈레트렉티닙, 알티라티닙, 셀리트렉티닙, PF 06273340, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 배양 배지 중에 30-80 nM, 25-75 nM, 30-65 nM 또는 40-60 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 GNF-5837이다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 A GNF-5837이며, 이는 배양 배지 중에 30-80 nM, 25-75 nM, 30-65 nM 또는 40-60 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 GNF-5837이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (c) (즉, 스테이지 3)에서는 50 nM 농도로 존재한다.

Notch 경로의 길항제는 Notch 전사 인자의 활성을 통해 신호전달을 억제할 (하향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX, RO4929097, 세마가세스타트, 디벤즈아제핀, LY411575, 크레니가세스타트, IMR-1, IMR-1A, FLI-06, DAPT, 발프로산, YO-01027, CB-103, 탄게레틴, BMS-906024, 아바가세스타트, 브루세인 D, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, TRK 경로 길항제는 배양 배지 중에 25-200 nM, 50-150 nM 또는 75-125 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX이다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX이며, 이는 배양 배지 중에 25-200 nM, 50-150 nM 또는 75-125 nM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, Notch 경로 길항제는 GSI-XX이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (c) (즉, 스테이지 3)에서는 100 nM 농도로 존재한다.

IGF1 (인슐린 유사 성장 인자 1) 경로의 효능제는 IGF1 경로를 통한 신호전달을 자극할 (활성화할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1, IGF1-Ado, X10, 메카세르민, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 배양 배지 중에 2-20 ng/ml, 5-15 ng/ml 또는 7.5-12.5 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1이다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1이며, 이는 배양 배지 중에 2-20 ng/ml, 5-15 ng/ml 또는 7.5-12.5 ng/ml의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (c) (스테이지 3)에서는 10 ng/ml의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, IGF1 경로 효능제는 IGF1이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 단계 (e) (스테이지 5)에서는 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

CREB 또는 PKA 경로 효능제는 CREB 또는 PKA 경로를 통한 신호전달을 자극할 (활성화할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP, 디부티릴-cAMP, 8-Br-cAMP, cAMPS-Sp, CW 008, 포르스콜린, 8-CPT-cAMP, CW 008, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-벤조일-, 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염 일수화물, (S)-아데노신, 시클릭 3',5'-(히드로겐포스포로티오에이트) 트리에틸암모늄, Sp-아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트 트리에틸암모늄 염, Sp-5,6-DCI-cBiMPS, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포티오에이트, Sp-이성질체 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트,8-브로모-, Sp-이성질체,소듐 염, Sp-8-pCPT-시클릭 GMPS 소듐, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-모노부티릴아데노신 3':5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염, 8-PIP-cAMP, Sp-cAMPS, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 배양 배지 중에 0.5-2.5 μM, 0.75-2.0 μM 또는 1.0-1.5 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP이다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP이며, 이는 배양 배지 중에 0.5-2.5 μM, 0.75-2.0 μM 또는 1.0-1.5 μM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, CREB 또는 PKA 경로 효능제는 cAMP이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 4에서는 1.0 μM 농도로 존재한다.

스테이지 4 배지는 발프로산 또는 그의 유사체를 포함한다. 한 실시양태에서, 발프로산 또는 그의 유사체는 발프로산, 발프로에이트, 소듐 발프로에이트 및 발프로에이트 세미소듐으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 발프로산 또는 유사체는 배양 배지 중에 250-750 nM, 300-600 nM 또는 450-550 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 발프로산이 사용된다. 한 실시양태에서, 발프로산은 250-750 nM, 300-600 nM 또는 450-550 nM 농도로 사용된다. 한 실시양태에서, 발프로산이 사용되고, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 4에서는 500 nM 농도로 존재한다.

스테이지 4 배지는 물질 P 또는 그의 유사체를 포함한다. 물질 P는 11개 아미노산의 뉴로펩티드이며, 그의 유사체가 다수 관련 기술분야에 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Datar et al. (2004) Curr. Top. Med. Chem. 4:75-103]에서 검토됨). 한 실시양태에서, 물질 P 또는 그의 유사체는 배양 배지 중에 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-150 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 물질 P가 사용된다. 한 실시양태에서, 물질 P는 50-250 nM, 75-200 nM 또는 100-150 nM 농도로 사용된다. 한 실시양태에서, 물질 P가 사용되고, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 4에서는 100 nM 농도로 존재한다.

신경교 세포주-유래 신경영양성 인자 (GDNF) 경로의 효능제는 GDNF 신호전달 경로를 자극할 (상향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF, BT13, BT44, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 배양 배지 중에 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF이다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF이며, 이는 배양 배지 중에 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, GDNF 경로 효능제는 GDNF이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 4에서는 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

mTOR (포유동물 라파마이신 표적) 경로의 효능제는 mTORC1 및 mTORC2 복합체의 코어 구성요소인 PI3K-관련 키나제 패밀리 구성원인 mTOR을 통한 신호전달을 자극할 (상향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 MHY1458, NV-5138, 테스토스테론, 3-벤질-5-((2-니트로페녹시) 메틸)-디히드로푸란-2(3H)-온 (3BDO), 3BDO, L-류신, NV-5138 히드로클로라이드, NV-5138, L-류신-d1, L-류신-2-13C,15N, 류신-13C6, L-류신-d7, L-류신-d10, L-류신-d2, l-류신-d3, L-류신-18O2, L-류신-13C, L-류신-2-13C, L-류신-13C6-15N, L-류신-15N, L-류신-1-13C,15N, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 배양 배지 중에 1-5 μM, 1-3 μM 또는 1.5-2.5 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 MHY1458이다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 MHY1458이며, 이는 배양 배지 중에 1-5 μM, 1-3 μM 또는 1.5-2.5 μM 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, mTOR 경로 효능제는 MHY1458이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 4에서는 2 μM 농도로 존재한다.

뇌-유래 신경영양성 인자 (BDNF) 경로의 효능제는 BDNF 신호전달 경로를 자극할 (상향조절할) 수 있는 작용제, 분자, 화합물 또는 물질을 포함한다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF, 로티고틴, 7,8-DHF, 케타민, 트리시클릭 이량체성 펩티드-6 (TDP6), LM22A-4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 배양 배지 중에 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF이다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF이며, 이는 배양 배지 중에 1-100 ng/ml, 5-50 ng/ml, 10-25 ng/ml 또는 12.5-17.5 ng/ml의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, BDNF 경로 효능제는 BDNF이며, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 10 ng/ml의 농도로 존재한다.

스테이지 5 배지는 아스코르브산 또는 그의 유사체를 포함한다. 한 실시양태에서, 아스코르브산 또는 그의 유사체는 비타민 C, 2-포스포-L-아스코르브산, L-아스코르브산, 소듐 아스코르빌 포스페이트, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코시드, 테트라헥실데실 아스코르베이트 (THD), 에틸화된 L-아스코르브산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 아스코르브산 또는 유사체는 배양 배지 중에 50-500 μM, 100-400 μM 또는 200-300 μM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 2-포스포-L-아스코르브산이 사용된다. 한 실시양태에서, 2-포스포-L-아스코르브산은 50-500 μM, 100-400 μM 또는 200-300 μM 농도로 사용된다. 한 실시양태에서, 2-포스포-L-아스코르브산이 사용되고, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 200 μM 농도로 존재한다.

스테이지 5 배지는 소듐 피루베이트 또는 그의 유사체를 포함한다. 한 실시양태에서, 소듐 피루베이트 또는 그의 유사체는 50-500 μM, 100-300 μM 또는 150-250 μM 농도로 사용된다. 한 실시양태에서, 소듐 피루베이트가 사용되고, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 200 μM 농도로 존재한다.

스테이지 5 배지는 리소포스파티드산 (LPA) 또는 그의 유사체를 포함한다. 한 실시양태에서, LPA 또는 그의 유사체는 리소포스파티드산, 2-[[3-(1,3-디옥소-1H-벤즈[de]이소퀴놀린-2(3H)-일)프로필]티오]벤조산, 1-올레오일 리소포스파티드산 소듐 염, UCM-05194, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, LPA 또는 유사체는 배양 배지 중에 50-500 nM, 100-400 nM 또는 200-300 nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, O-LPA가 사용된다. 한 실시양태에서, O-LPA는 50-500 nM, 100-400 nM 또는 200-300 nM 농도로 사용된다. 한 실시양태에서, O-LPA가 사용되고, 이는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 200 nM 농도로 존재한다.

스테이지 5 배지는 N2 보충제를 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "N2 보충제"는 신경-유래 세포의 성장을 촉진하기 위한 세포 배양 보충제의 혼합물을 지칭한다. N-2 보충제 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)), N2 보충제-A (스템 셀 테크놀러지즈(Stem Cell Technologies)), N-2 MAX 배지 보충제 (R&D 시스템즈(R&D Systems)) 및 N-2 보충제 (CSH 프로토콜즈(CSH Protocols))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 다양한 N2 보충제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. N2 보충제는 트랜스페린 패밀리 분자 뿐만 아니라 추가적인 성장-촉진 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, N2 보충제는 홀로-트랜스페린, 인슐린 (재조합 전체 쇄), 프로게스테론, 푸트레신, 셀레나이트, 레트로프로게스테론, 메드로게스톤, 노레틴드론, 클로르마디논 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트를 포함한다. 한 실시양태에서, N2 보충제는 배양 배지 중에 0.1%-5%, 0.5%-3% 또는 1-2% nM 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, N2 보충제는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 1% 농도로 존재한다.

스테이지 5 배지는 비필수 아미노산 (NEAA) 보충제는 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "NEAA 보충제"는 세포 성장을 촉진하기 위한 아미노산의 혼합물을 지칭한다. MEM 비필수 아미노산 용액 (써모피셔 사이언티픽), 오리셀(OriCell)™ NEAA 세포 배양 보충제 (시아겐(Cyagen)), 및 슈퍼컬트(SuperCult)® 비필수 아미노산 (NEAA) 세포 배양 보충제 (크리에이티브 바이오어레이(Creative Bioarray))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 다양한 NEAA 보충제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, NEAA 보충제는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신을 포함한다. 한 실시양태에서, NEAA 보충제는 배양 배지 중에 0.1%-5%, 0.5%-3% 또는 1-2% 범위 내의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, NEAA 보충제는 배양 배지 중에 본 방법의 스테이지 5에서는 1% 농도로 존재한다.

효능제 또는 길항제가 본 방법의 하나 초과의 단계에서 사용되는 경우, 한 실시양태에서, 이는 작용제가 배양 배지 중에 존재하는 각 단계에 사용되는 것과 동일한 특정한 효능제 또는 길항제이다. 또 다른 실시양태에서, 동일한 신호전달 경로에 영향을 미치는 상이한 효능제 또는 길항제가 방법의 상이한 단계에서 사용된다. 예를 들어, 단계 (a) 및 (b) (스테이지 1 및 2)에서 사용되는 BMP 길항제의 경우, 한 실시양태에서, 동일한 BMP 길항제가 단계 (a) 및 (b)에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 BMP 길항제가 단계 (a) 및 (b)에서 사용된다. 유사하게, 단계 (c) 및 (e) (스테이지 3 및 5)에서 사용되는 IGF-1 경로 효능제의 경우, 한 실시양태에서, 동일한 IGF-1 경로 효능제가 단계 (c) 및 (e)에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 IGF-1 경로 효능제가 단계 (c) 및 (e)에서 사용된다.

효능제 또는 길항제가 본 방법의 하나 초과의 단계에서 사용되는 경우, 한 실시양태에서, 이는 작용제가 배양 배지 중에 존재하는 각 단계에 사용되는 것과 동일한 효능제 또는 길항제의 동일한 농도이다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 농도의 동일한 효능제 또는 길항제가 본 방법의 상이한 단계에서 사용된다. 예를 들어, 단계 (a) 및 (b) (스테이지 1 및 2)에서 사용되는 BMP 길항제의 경우, 한 실시양태에서, 동일한 농도의 동일한 BMP 길항제가 단계 (a) 및 (b)에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 농도의 동일한 BMP 길항제가 단계 (a) 및 (b)에서 사용된다. 유사하게, 단계 (c) 및 (e) (스테이지 3 및 5)에서 사용되는 IGF-1 효능제의 경우, 한 실시양태에서, 동일한 농도의 동일한 IGF-1 효능제가 단계 (c) 및 (e)에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 상이한 농도의 동일한 IGF-1 효능제가 단계 (c) 및 (e)에서 사용된다.

III. 배양 조건

상기 서브섹션 II에 기술된 화학적으로 정의되고 최적화된 배양 배지와 조합하여, 본 개시내용의 FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하는 방법은 세포 배양을 위해 관련 기술분야에 확립된 표준 배양 조건을 이용한다. 예를 들어, 세포는 37℃에서 및 5% O₂ 및 5% CO₂ 조건 하에 배양될 수 있다. 세포는 표준 배양 베슬 또는 플레이트, 예컨대 96-웰 플레이트에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 출발 만능 줄기 세포는 바람직하게는 세포외 기질 물질, 예컨대 비트로넥틴으로 코팅된 플레이트에 부착된다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 비트로넥틴 코팅된 배양 표면 (예를 들어, 비트로넥틴 코팅된 96-웰 플레이트) 상에서 배양된다.

만능 줄기 세포는 분화 전에 상업적으로 이용가능한 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 분화 프로토콜의 시작 전에 에센셜 8 플렉스(Essential 8 Flex) 배지 (써모 피셔 # A2858501)에서 적어도 1일 동안 배양될 수 있다. 비제한적인 예시적 실시양태에서, 줄기 세포를 비트로넥틴 (써모 피셔 # A14700) 코팅된 96-웰 플레이트 상에서 150,000개 세포/cm2 밀도로 계대접종하고, 분화 전에 에센셜 8 플렉스 배지에서 1일 동안 배양한다.

분화 프로토콜을 시작하기 위해, 줄기 세포가 배양되는 배지를 상기 서브섹션 II에서 기술된 바와 같은 신호전달 경로 효능제 및/또는 길항제로 보충된 기본 분화 배지로 교체한다. 기본 분화 배지는, 예를 들어, 세포 생존능 및 성장을 유지하는데 필요한 추가적인 표준 배양 배지 구성요소로 보충되지만, 혈청이 결여되거나 (기본 분화 배지는 무혈청 배지임) 또는 임의의 다른 외인적으로 첨가된 성장 인자, 예컨대 FGF2, PDGF 또는 HGF가 결여된 상업적으로 이용가능한 베이스를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적 실시양태에서, 기본 분화 배지는 1x IMDM (써모 피셔 #12440046), 1x F12 (써모 피셔 #11765047), 1 mg/ml의 폴리(비닐 알콜) (시그마(써모 피셔) #p8136), 1%의 화학적으로 정의된 지질 농축물 (써모 피셔 #11905031), 450 uM의 1-티오글리세롤 (시그마 #M6145), 0.7 ug/ml의 인슐린 (시그마 #11376497001) 및 15 ug/ml의 트랜스페린 (시그마 #10652202001)을 함유한다 (도 17 및 도 18에 제시된 예시적인 분화 프로토콜에 사용된 바와 같이, 본원에서 "CDM2" 배지로도 지칭됨).

배양 배지는 전형적으로 신선한 배지로 정기적으로 교체된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 배지는 매 24시간마다 교체된다.

FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하기 위해, 출발 줄기 세포를 세포 분화 및 수임 FB-NSC-, VFBNSC-, -MGE-NPC-, 미성숙 뉴런- 또는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런-연관 마커의 발현에 충분한 시간 동안 최적화된 배양 배지에서 배양한다. 실시예에 기술된 바와 같이, 하나는 FB-NSC의 생성을 위해 최적화되고, 제2의 것은 VFB-NSC의 생성을 위해 최적화되고, 제3의 것은 MGE-NPC의 생성을 위해 최적화되고, 제4의 것은 미성숙 뉴런의 생성을 위해 최적화되고, 제5의 것은 성숙한 GABA작동성 개재뉴런의 생성을 위해 최적화된 것인 5-스테이지 방법에서의 만능 줄기 세포의 배양은 배양 9일만에 MGE-NPC의 생성을 유도할 수 있고, 배양 26일만에 성숙한 개재뉴런의 생성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. (FB-NSC를 유도하는) 제1 스테이지를 위한 배양 기간은 0-3일차이고, (VFB-NSC를 유도하는) 제2 스테이지를 위한 배양 기간은 3-6일차이고, (MGE-NPC를 유도하는) 제3 스테이지를 위한 배양 기간은 6-9일차이고, (미성숙 뉴런을 유도하는) 제4 스테이지를 위한 배양 기간은 9-12일차이고, (성숙한 개재뉴런을 유도하는) 제5 스테이지를 위한 배양 기간은 12-26일차이다.

따라서, 본원에서 "단계 (a)" 또는 "스테이지 1"로도 지칭되는, FB-NSC를 생성하는 본 방법의 제1 스테이지에서, 만능 줄기 세포는 스테이지 1-최적화된 배양 배지에서 0-3일차에, 또는 0일차에 시작하여 3일차까지 계속, 또는 72시간 (3일) 동안, 또는 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안, 또는 60시간 동안, 또는 64시간 동안, 또는 68시간 동안, 또는 70시간 동안, 또는 72시간 동안 계속하여 배양된다.

따라서, 본원에서 "단계 (b)" 또는 "스테이지 2"로도 지칭되는, VFB-NSC를 생성하는 본 방법의 제2 스테이지에서, 단계 (a)에서 생성된 FB-NSC는 스테이지 2-최적화된 배양 배지에서 4-6일차에, 또는 4일차에 시작하여 6일차까지 계속, 또는 4일차에 시작하여 72시간 (3일) 동안 계속, 또는 4일차에 시작하여 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안 계속, 또는 4일차에 시작하여 60시간 동안, 또는 64시간 동안, 또는 68시간 동안, 또는 70시간 동안, 또는 72시간 동안 계속하여 추가로 배양된다.

따라서, 본원에서 "단계 (c)" 또는 "스테이지 3"으로도 지칭되는, MGE-NPC를 생성하는 본 방법의 제3 스테이지에서, 단계 (b)에서 생성된 VFB-NSC는 스테이지 3-최적화된 배양 배지에서 6-9일차에, 또는 6일차에 시작하여 9일차까지 계속, 또는 6일차에 시작하여 72시간 (3일) 동안 계속, 또는 6일차에 시작하여 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안 계속, 또는 6일차에 시작하여 60시간 동안, 또는 64시간 동안, 또는 68시간 동안, 또는 70시간 동안, 또는 72시간 동안 계속하여 추가로 배양된다.

따라서, 본원에서 "단계 (d)" 또는 "스테이지 4"로도 지칭되는, 미성숙 뉴런을 생성하는 본 방법의 제4 스테이지에서, 단계 (c)에서 생성된 MGE-NPC는 스테이지 4-최적화된 배양 배지에서 9-12일차에, 또는 9일차에 시작하여 12일차까지 계속, 또는 9일차에 시작하여 72시간 (3일) 동안 계속, 또는 9일차에 시작하여 적어도 60시간, 또는 적어도 64시간, 또는 적어도 68시간, 또는 적어도 70시간, 또는 적어도 72시간 동안 계속, 또는 9일차에 시작하여 60시간 동안, 또는 64시간 동안, 또는 68시간 동안, 또는 70시간 동안, 또는 72시간 동안 계속하여 추가로 배양된다.

따라서, 본원에서 "단계 (e)" 또는 "스테이지 5"로도 지칭되는, 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하는 본 방법의 제5 스테이지에서, 단계 (d)에서 생성된 미성숙 뉴런은 스테이지 5-최적화된 배양 배지에서 12-26일차에, 또는 12일차에 시작하여 26일차까지 계속, 또는 12일차에 시작하여 파르브알부민+ 성숙한 개재뉴런을 생성하는데 충분한 시간 동안 계속 배양하는 것으로 (예를 들어, 스테이지 5 배지에서 14일, 또는 2주 배양) 계속하여 추가로 배양된다.

IV. 용도

FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하기 위한 본 개시내용의 방법 및 조성물은 다양한 용도를 위한 이들 세포 집단의 효율적이고 강건한 이용가능성을 가능하게 한다. 예를 들어, 본 방법 및 조성물은 전뇌 신경 전구체 발생 및 생물학, 예컨대 GABA작동성 개재뉴런으로의 분화의 연구에 사용되어 GABA작동성 개재뉴런의 기능장애를 수반하는 신경퇴행성 및 정신 질환 및 장애의 이해 및 잠재적 치료를 보조할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법을 사용하여 생성된 FB-NSC, VFB-NSC, MBE-NPC, 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런은 세포 상에서 발현된 표면 마커에 결합하는 작용제를 사용하여 관련 기술분야에 확립된 방법에 따라 추가로 정제될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 또는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 단리시키는 방법을 제공한다:

본 개시내용의 방법에 의해 생성된 FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 또는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 또는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런에 의해 발현되는 세포 표면 마커에 결합하는 적어도 하나의 결합제와 접촉시키는 단계; 및

결합제에 결합하는 세포를 단리시켜 FB-NSC, VFB-NSC, MBE-NPC, 미성숙 뉴런 또는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 단리시키는 단계.

한 실시양태에서, 결합제는, 예를 들어, 세포 표면 마커에 결합하는 모노클로날 항체 (mAb)와 같은 항체이다. 항체에 결합하는 세포는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 및 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 단리될 수 있다.

전뇌 신경 계통의 전구체 또한 GABA작동성 개재뉴런의 기능장애를 수반하는 임의의 신경퇴행성 또는 정신 질환 또는 장애를 포함한 상기 질환 또는 장애를 앓는 대상체에게 세포를 전달하는 것을 통한 신경퇴행성 또는 정신 질환 및 장애 치료에 사용하기 위해 고려된다. 배아 내측 신경절 융기 (MGE) 세포를 성인 뇌로 이식하면 이식된 세포가 확산 및 이동하고, GABA를 발현하는 뉴런으로 분화되는 것으로 제시된 바 있다 (Alvarez-Dolado et al. (2006) J. Neurosci . 26:7380-7389). 따라서, 한 실시양태에서, 전뇌 신경 계통 전구체는 간질 치료에 사용된다. GABA작동성 개재뉴런의 전구체를 마우스의 출생 후 신피질로 이식하면 간질 발작이 감소되는 것으로 제시된 바 있다 (Baraban et al. (2009) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 106:15472-15477). 간질 치료에서 신경 전구체의 사용은 또한 문헌 [Shetty and Upadhya (2016) Neurosci. Biobehav . Rev. 62:35-47] 및 [Lybrand et al. (2020) Neuropharm . 168:107781]에서도 검토되고 있다.

GABA작동성 개재뉴런의 결핍, 또는 활동 감소는 알츠하이머병 또는 자폐증 환자의 인지 결손과도 연관이 있다. 따라서, 본 개시내용의 전뇌 계통 세포는 또한 알츠하이머병 및 자폐증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, GABA작동성 개재뉴런 기능 회복이 이익이 될 수 있는 인지 장애와 연관된 장애의 치료에 사용될 수 있다.

본 개시내용의 세포는 또한 잠재적인 약물의 스크리닝, 또는 GABA작동성 개재뉴런의 기능장애를 수반하는 질병 또는 장애의 치료를 위한 신규 세포 요법의 개발에 유용하다.

V. 조성물

다른 측면에서, 본 개시내용은 배양 배지 및 세포 배양물, 뿐만 아니라 단리된 전구 세포 및 세포 집단을 포함한, FB-NSC, VFB-NSC, MGE-NPC, 미성숙 뉴런 및 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 생성하는 방법과 관련된 조성물을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는, 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는, 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는, 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하기 위한 배양 배지를 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 MGE-NPC로부터 인간 미성숙 뉴런을 수득하기 위한 배양 배지로서, CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배지를 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 수득하기 위한 배양 배지로서, BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배지를 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 포함하는 배양물을 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 NKX2-1+ VFB-NPC를 포함하는 배양물을 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)의 단리된 세포 배양물로서, TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 ASCL1+ MGE-NPC를 포함하는 배양물을 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 미성숙 뉴런의 단리된 세포 배양물로서, CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 미성숙 뉴런을 포함하는 배양물을 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런의 단리된 세포 배양물로서, BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 포함하는 배양물을 제공한다. 적합한 작용제 및 그에 대한 농도는 서브섹션 II에 기술된 것을 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 (즉, 배양 프로토콜의 단계 (a) 또는 스테이지 1)에 의해 생성된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 (즉, 배양 프로토콜의 단계 (a) 및 (b), 또는 스테이지 1 및 2)에 의해 생성된 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 (즉, 배양 프로토콜의 단계 (a), (b) 및 (c), 또는 스테이지 1, 2 및 3)에 의해 생성된 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 (즉, 배양 프로토콜의 단계 (a), (b), (c), 및 (d) 또는 스테이지 1, 2, 3, 및 4)에 의해 생성된 인간 미성숙 뉴런을 제공한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법 (즉, 배양 프로토콜의 단계 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 또는 스테이지 1, 2, 3, 4 및 5)에 의해 생성된 인간 성숙화된 파르브알부민+ GABA작동성 개재뉴런 제공한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전역에 걸쳐 인용된 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

실시예

실시예 1 : NKX2 -1 및 ASCL1을 발현하는 줄기 세포 유래 내측 신경절 융기 신경 전구체의 생성을 위한 프로토콜 개발

배양 9일 후 인간 만능 줄기 세포를 NKX2 -1 및 ASCL1을 발현하는 전구체로 가이드할 수 있는 내측 신경절 융기-유래 신경 전구체의 생성을 위한 3-스테이지 레시피를 개발하였다. 이들 세포는 성숙한 GABA작동성 개재뉴런으로 추가로 분화될 수 있다.

본 실시예는 이전에 문헌 [Bukys et al. (2020) Iscience 23:101346]에 기술된 바와 같은 고차원 실험 디자인 (HD-DoE)의 방법을 이용한다. 본 방법은 동시에 다중 프로세스 입력을 시험하고, 깊은 이펙터/반응 공간의 수학적 모델링을 제공하는 컴퓨터화된 디자인 기하구조를 사용한다. 본 방법을 통해, 예컨대 세포 분화 동안, 복잡한 프로세스를 제어하는 조합 신호전달 입력을 발견할 수 있다. 이를 통해 다수의 타당한 중요한 프로세스 파라미터를 시험할 수 있는데, 이는 상기 파라미터가 출력 반응, 예컨대 유전자 발현에 영향을 미치기 때문이다. 유전자 발현이 예를 들어, 인간 세포의 표현형의 특징적 특색을 제공하기 때문에, 본 방법은 어느 신호전달 경로가 세포 운명을 제어하는지를 확인하고, 이해하는데 적용될 수 있다. 본 실시예에서, HD-DOE 방법은 만능 줄기 세포 상태로부터 직접 중뇌 신경 전구체 발현 유전자의 유도를 위한 조건을 발견하기 위한 의도로 적용되었다.

각 스테이지에 대한 레시피를 개발하기 위해, 3일 처리 후의 53개의 미리 선택된 유전자로 이루어진 2개의 세트의 발현에 대한 다중 신호전달 경로의 효능제 및 길항제 (본원에서 이펙터로 불림)의 영향을 시험하고, 모델링하였다. 이들 이펙터는 줄기 세포의 특정 운명으로의 단계적 분화 동안 통상적으로 사용되는 소분자 또는 단백질이다. 이펙터의 선택은 발생 중인 뇌의 전뇌 영역에서의 신경 유도 및 줄기 세포의 신경 전구체로의 분화에 대한 현행 문헌에 기초하였다.

이펙터를 시험하기 위해, 일정 범위의 농도에서 48개 이상의 상이한 이펙터 조합에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있는 적어도 8개의 인자를 사용한 실험을 디자인하였다. 모델을 분석하기 위해, 본 발명자들은 OTX2 (Hoch et al. (2015) Cell Reports 12:482-494), SIX3 (Lagutin et al. (2003) Genes & Development 17:368-379) 및 FEZF2 (Zhang et al. (2014) Development 141:4794-47805)를 포함한, 전방 신경외배엽 및 전뇌의 발생 및 패턴화에 수반되는 유전자의 발현에 초점을 맞추었다. 나중 스테이지에서 본 발명자들은 종뇌의 배복측 패턴화, 및 배측 전뇌 마커인 NKX2 -1, 및 PAX6의 부재를 포함한, 복측 전뇌에서 발현되는 유전자에 초점을 맞추었다 (Stoykova et al. (2000) J. Neurosci. 20:8042-8050). 유전자 발현 수준에 대한 각 이펙터의 영향은 모델링 중에 각 이펙터에 대해 계산되는 인자 기여도로 불리는 파라미터에 의해 정의된다.

스테이지 1 전뇌- 수임 신경 줄기 세포로의 분화

분화의 스테이지 1의 레시피를 확인하기 위해, D-최적성을 통한 실험 디자인 압축을 사용하여 생성된 96개의 상이한 이펙터 조합을 로봇 방식으로 제조하였다. 이펙터 조합을 기본 배지에서 제조하고, 후속적으로 세포에 첨가한 후, 이어서 분화되도록 하였다. 3일 후, RNA 추출을 수행하고, 정량적 PCR 분석을 이용하여 유전자 발현을 수득하였다. 데이터를 정규화하고, 부분 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여 이펙터 디자인에 대해 모델링하여 유전자 특이적 모델을 생성하고, 최대 Q2 예측력에 대한 모델 조정 후, 개별 유전자의 발현을 제어하는 이펙터 능력을 조합적으로 및 개별적으로 설명하였다. 이어서, 시험된 공간 내의 솔루션을 탐색하여 요망성을 해결할 수 있었다.

SIX3의 최대 발현을 3300 발현 값으로, 및 FEZF2를 1355 발현 값으로 최적화함으로써 강건한 솔루션에 이르게 되었다. 상기 모델은 AGN193109, LDN193189, CHIR99021, XAV939, IGF2, 푸르모르파민, 4-옥소-RA, TTNPB, SR11237, FGF8, PD0325901 및 A8301을 포함하는 12개의 이펙터를 시험함으로써 도출되었다. 도 1에 제시된 바와 같이, 3개의 인자, BMP 신호전달 경로의 억제제인 LDN193189, WNT 신호전달 경로의 억제제인 XAV939, 및 SHH 경로의 효능제인 푸르모르파민은 각각 16, 5 및 5의 인자 기여도로 SIX3 발현에 대해 긍정적인 영향을 미쳤다. 상기 모델에서는 또한 RA 효능제인 TTNPB가 21의 인자 기여도로 SIX3 발현에 상당한 부정적인 영향을 미친 것으로 나타났다. SIX3의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.6이었고, 이는 3.4%의 실패 위험에 상응하는 값이다.

전뇌 유전자의 발현을 부스팅할 수 있는 임의의 추가적인 인자를 찾기 위해 상기 모델을 또한 별도로 FEZF2의 최대 발현을 3576 발현 값으로 최적화하였다. FEZF2의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.61이었고, 이는 3.3%의 실패 위험에 상응하는 값이다. 도 2에 제시된 바와 같이, LDN193189는 다시 25의 인자 기여도로 FEZF2 발현에 상당한 긍정적인 영향을 미치는 것으로 확인되었고; MEK 억제제인 PD0325901, TTNPB 및 푸르모르파민 또한 10, 24 및 7의 인자 기여도로 FEZF2 발현에 대해 긍정적인 영향을 미쳤다. OTX2의 최대 발현 또한 6348로 모델링하였고, OTX2의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.49였고, 이는 6.6%의 실패 위험에 상응하는 값이다. 도 3에 제시된 바와 같이, 상기 모델에서는 LDN193189가 8의 인자 기여도로 가장 높은 양성 이펙터인 것으로 나타났다. XAV939 및 PD0325901 또한 긍정적인 영향을 보였지만, 그의 인자 기여도는 낮았다. 인자 기여도가 가장 높은 이펙터는 29의 인자 기여도로 상당한 부정적인 영향을 미친 TTNPB였다.

본 실험에서 3개 유전자 모두를 최적화시킬 수 있는 잠재능이 있는 인자 세트를 찾기 위해, OTX2, FEZF2 및 SIX3의 최대 발현에 초점을 맞춘 동적 프로파일 분석을 통해 새로운 평가를 수행하였다. 결과는 도 4에 제시되어 있다. 이 분석에 기초하여 OTX2 및 SIX3 둘 다에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타난 TTNPB는 레시피에서 제거하였고; OTX2에는 부정적인 영향을 미치지만, SIX3 및 FEZF2에는 긍정적인 영향을 미치는 푸르모르파민은 포함하였다.

만능분화능으로부터 전뇌 분화를 위한 조건을 추가로 증진시키기 위해 추가적인 HD-DoE 실험을 수행하였다. 분화 프로토콜의 제조를 위해 사용된 추가적인 유전자 조절 모델을 수득하였다. 본 실험에서의 인자는 LDN193189, PD173074, BLU9931, 푸르모르파민, SC79, MK2206, ZM336372, PD0325901, CHIR99021, XAV939, UCLA-GP130, 토파시티닙 (Tofa) 및 GO6983을 포함하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, FEZF2에 대해 최적화되었을 때, LDN193189, 푸르모르파민, AKT 억제제인 MK2206, PD0325901 및 XAV939는 각각 18, 11, 11, 15 및 12의 인자 기여도로 FEZF2 발현에 대해 긍정적인 영향을 미쳤다. FEZF2의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.63이었고, 이는 2.7%의 실패 위험에 상응하는 값이다. 동적 프로파일 분석 또한 사용하여 이펙터 간의 상호 작용을 평가하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, FEZF2 발현 수준을 표적 범위 밖으로 가져오는 인자는 제거하였고, 남은 이펙터로는 LDN193189, PD0325901, XAV939, 푸르모르파민, MK2206 및 GO6983을 포함하였다.

HD-DoE 실험 둘 다를 고려하여, 신경 줄기 세포 동일성을 갖는 전뇌 영역으로의 세포 분화를 최대화하는 조건은 FEZF2, SIX3 및 OTX2의 강건하고 상승된 발현과 관련되어 하기 이펙터 입력을 포함하였다: LDN193189, PD0325901, XAV939, 푸르모르파민, MK2206 및 GO6983. 스테이지 1 분화를 위한 대표적인 레시피는 하기 표 1에 요약되어 있다.

표 1: 스테이지 1 레시피를 위한 검증된 이펙터

스테이지 2 복측 전뇌 신경 줄기 세포로의 분화

스테이지 2에서 전뇌-수임 신경 줄기 세포의 복측 전뇌 신경 줄기 세포로의 분화를 추가로 가이드하기 위해, 스테이지 1 처리 종결 후 3일 동안 HD-DoE 실험을 수행하였다. 여기서 본 발명자들은 복측 전뇌 영역에서 발현되는 NKX2 -1의 최대 발현, 및 배측 전뇌 영역에서 발현되는 PAX6의 최소 발현에 초점을 맞추었다. 본 12-인자 실험은 LDN193189, BMP7, PD0325901, MK2206, A8301, XAV939, CHIR99021, 푸르모르파민, SANT-1, AGN193109, TTNPB 및 GSI-XX를 포함하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, NKX2 -1의 발현을 위해 모델을 최대화하였을 때, LDN193189, PD0325901, MK2206, XAV939, 푸르모르파민 및 Notch 신호전달 경로의 억제제인 GSI-XX를 포함한 6개의 이펙터는 NKX2 -1의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 확인하였다. 동적 프로파일 분석을 사용하여, PAX6 및 NKX2 -2의 최소 발현 수준을 동시에 달성하기 위해 모델을 수정하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 이 결과를 통해 MK2206 및 GSI-XX를 제거하였다.

복측 전뇌로의 최대 세포 분화를 위한 상이한 최적화 설정에서 모델을 고려하여, 분화 스테이지 2를 위한 레시피는 LDN193189, PD0325901, XAV939 및 푸르모르파민을 포함하였다. 스테이지 2 분화를 위한 대표적인 레시피는 하기 표 2에 요약되어 있다.

표 2: 스테이지 2 레시피를 위한 검증된 이펙터

스테이지 3 내측 신경절 융기 전구체로의 분화

세포를 내측 신경절 융기 전구체 운명으로 추가로 가이드하기 위해, 실험 시작 전 총 6일 동안 스테이지 1 및 스테이지 2 배지로 처리된 세포에 대해 3일 동안 추가적인 HD-DoE 실험을 수행하였다. 본 실험은 13개의 이펙터, LDN193189, A8301, GNF5837, AZD3147, GSI-XX, 타키닙, PD0325901, PD173074, BLU9931, IGF-1, MHY1485, 푸르모르파민 및 프로스트라틴을 포함하였다. 본 모델에서, 본 발명자들은 ASCL1, LHX6 및 DLX1을 포함한, 내측 신경절 융기 (MGE) 영역 중 뉴런 전구 세포에서 발현되는 유전자의 최대 발현에 초점을 맞추었다 (Silberberg et al. (2016) Neuron 92:59-74). 1700으로의 ASCL1의 최대 발현을 위해 모델을 최적화하였을 때, A8301, GSI-XX, 푸르모르파민 및 TAK1 경로의 억제제인 타키닙은 각각 18.1, 14.1, 12.7 및 10.1의 가장 높은 인자 기여도를 보였다. GNF5837 및 IGF-1 또한 9.4 및 7의 인자 기여도로 그의 발현에 대해 긍정적인 영향을 미쳤다. MHY1485 또한 긍정적으로 기여하였지만, 인자는 2 미만이었다 (도 9). ASCL1의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.59였고, 이는 3.6%의 실패 위험에 상응하는 값이다.

동적 프로파일 분석을 사용하여 ASCL1, LHX6 및 DLX1의 발현에 대해 긍정적인 영향을 미치는 공통 인자를 찾았다. 도 10에 제시된 바와 같이, GSI-XX, 타키닙 및 GNF5837은 3개의 모든 유전자의 발현에 대해 유사한 영향을 미치고, A8301 및 푸르모르파민은 ASCL1 및 LHX6에 대해서만 긍정적인 경향을 보인 반면, DLX1에 대해서는 어떤 상당한 부정적인 영향도 미치지 않는 것으로 관찰되었다. IGF-1이 DLX1의 발현 수준에 부정적인 영향을 미쳤음에도 불구하고, ASCL1 및 LHX6에 대해서는 긍정적인 영향을 미쳤기 때문에, 레시피에 추가하였다. 따라서, A8301, GSI-XX, 타키닙, GNF5837, IGF-1 및 푸르모르파민을 포함한 6개의 이펙터를 스테이지 3 분화 배지의 성분으로 확정하였다. 스테이지 3 분화를 위한 대표적인 레시피는 하기 표 3에 요약되어 있다.

표 3: 스테이지 3 레시피를 위한 검증된 이펙터

실시예 2 : 줄기 세포 유래 복측 전뇌 신경 전구체 유도 배양 조건의 인자 임계성 분석

검증된 각 인자 제거의 영향을 평가하기 위해, 동적 프로파일 분석을 사용하고, 다른 것은 존재하지만, 확정된 각 인자의 부재 하에서 관심 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 관심 유전자의 발현 수준이 원하는 결과에 도달할 수 있는지 여부를 나타내기 때문에, 상기 인자 임계성 분석을 통해 각 입력 이펙터의 중요성 정도를 밝혀냈다.

스테이지 1 레시피에서, 다른 5개의 인자는 존재하는 동안 확정된 인자 6개를 각각 개별적으로 제거하고, 전뇌 유전자의 발현 수준을 6개의 인자가 모두 함께 존재하는 것과 비교 평가하였다. 본 결과는 도 11A-B에 요약되어 있다. LDN193189를 제거하였을 때, FEZF2, OTX2 및 SIX3의 발현 수준은 각각 2000에서 1000으로, 5500에서 4000으로, 및 3000에서 0으로 급격하게 감소하였다. XAV939 부재는 유사한 효과를 보였고, FEZF2, OTX2 및 SIX3의 수준은 각각 1700, 5000 및 1000으로 하락하였다. 푸르모르파민을 제거하였을 때, FEZF2 및 SIX3 수준은 1000, 및 3000 미만으로 감소된 반면, OTX2 수준은 6500으로 증가하였다. PD0325901 제거 시에는 그 결과로 FEZF2 수준이 하락하였지만, 다른 2개의 유전자에 대해서는 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다. MK2206 및 GO6983 부재가 미치는 효과 또한 조사하였고, 인자 둘 다는, 도 12에 제시된 바와 같이, FEZF2의 발현 수준을 3500에서 2700 및 3200으로 감소시켰다.

스테이지 2 레시피에서, 다른 3개의 인자는 그대로 존재하는 동안 확정된 인자 4개를 각각 제거하고, NKX2 -1, PAX6 및 NKX2 -2의 발현 수준을 4개의 인자가 모두 존재하는 것과 비교 평가하였다. 본 결과는 도 13A-B에 요약되어 있다. PD0325901 부재 시에는 각각 5000에서 3200, 100 에서 0 및 0에서 5000으로 NKX2 -1 및 NKX2 -2 수준은 감소된 반면, PAX6은 증가하였다. LDN193189의 부재 하에서 NKX2-1 수준에 유의적인 변화는 없었지만, PAX6 및 NKX2 -2 둘 다의 수준은 0 미만으로 감소하였다. XAV939 제거 시에는 NKX2 -1 수준이 5000에서 3000으로 감소된 반면, PAX6 및 NKX2 -2 둘 다의 것은 각각 10000 및 200으로 증가하였다. 또 다른 관찰결과는 XAV939와 푸르모르파민 사이의 상호작용이었다. XAV939의 부재 하에서 푸르모르파민이 NKX2 -1에 미치는 영향은 부정적인 영향이 되었고, 도 14의 상호작용 플롯에 제시된 바와 같이, NKX2 -1 수준은 인자 둘 다가 존재할 때 더 높다.

스테이지 3 레시피에서, 다른 5개의 인자는 그대로 존재하는 동안 확정된 인자 6개를 각각 제거하고, ASCL1, DLX1 및 LHX6의 발현 수준을 6개의 인자가 모두 존재하는 것과 비교 평가하였다. 본 결과는 도 15A-B에 요약되어 있다. A8301 제거에 의해, ASCL1 수준은 1650에서 1000으로 감소하였지만, DLX1 및 LHX6 값에는 유의적인 변화는 없었다. GSI-XX 제거는 3개의 모든 유전자의 값에 유의적인 영향을 미쳤고, ASCL1, DLX1 및 LHX6의 발현 수준을 각각 1650, 220 및 240에서 1200, 50 및 140으로 감소시켰다. 타키닙 제거는 ASCL1에 대해 유사한 효과를 미쳤지만, DLX1 및 LHX6의 발현 수준은 180 및 170으로 하락하였다. 푸르모르파민의 부재 하에서 ASCL1 및 LHX6 값은 1200 및 190으로 하락하였지만, DLX1은 그대로 유지되었다. 푸르모르파민과 유사하게, GNF5837 제거 시에는 그 결과로 ASCL1은 1300으로, 및 LHX6은 160으로 발현이 하락한 반면, DLX1에 대해서는 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다. 예상대로, IGF-1의 부재 하에서 DLX1 값은 410으로 증가하였지만, ASCL1 및 LHX6은 각각 1390 및 220으로 감소하였다.

실시예 3 : NKX2 -1 및 ASCL1 을 발현하는 줄기 세포 유래 복측 전뇌 신경 전 구체의 면역세포화학법에 의한 검증

실시예 1에 기술된 개발된 레시피를 검증하기 위해, 세포를 스테이지 1, 스테이지 2 및 스테이지 3 분화 배지로 처리하고, 면역세포화학법을 사용하여 각 스테이지의 종료 시 복측 전뇌 영역 및 신경 전구체의 바이오마커를 평가하였다. 바이오마커는 SIX3, OTX2, 베타 III-튜불린 (범 뉴런 마커), NKX2-1, PAX6, KI67 증식 마커, DLX5 (전뇌의 LGE 및 MGE 영역에서 발현되는 뉴런 전구체 마커) (Wang et al. (2010) J. Neurosci. 30:5334-5345), LHX6, OLIG2 희소돌기아교세포 마커, MASH1 (ASCL1), GFAP 신경교 마커, DCX (미성숙 뉴런을 지정하는 마커), SOX6 (MGE 영역의 유사분열 후 전구체에서 발현되는 마커) (Batista-Brito et al. (2009) Neuron 63:466-481) 및 GABA (GABA작동성 개재뉴런에 의해 특이적으로 발현되는 마커)를 포함하였다. 본 결과는 도 16, 도 17 및 도 18에 제시되어 있다.

면역세포화학법 이미지에서는 스테이지 1 종료 시까지 90% 초과의 세포에서 SIX3 및 OTX2의 발현이 확인되었고, PAX6 및 OLIG2는 검출되지 않았다. KI67 또한 대부분의 세포에서 검출되었고, 이를 통해 세포는 상기 시점에서 증식성이라는 것이 확인되었다 (도 16). 스테이지 2 배지로 처리한 후, 배양물 중의 대부분의 세포에서 NKX2-1 및 GABA의 발현이 관찰되었으며, 그 중 일부는 MASH1 또한 발현하였고, 이를 통해 분화 세포의 복측 국재화가 확인되었고, 반면 PAX6은 비검출 상태 그대로 유지되었다 (도 17). 스테이지 3이 끝나는 9일차까지 배양물 중의 대부분의 세포에서 NKX2-1, DLX5 및 MASH1이 검출되었고, 베타 III-튜불린, DCX, LHX6, 및 SOX6은 절반 이상의 배양물에서 검출되었고, 이를 통해 세포의 전뇌의 MGE 영역으로의 수임을 확인하였다 (도 18). KI67 또한 배양물 중 일부 세포에서도 검출되었으며, 이는 이들 세포가 여전히 증식 및 확장 능력을 갖고 있다는 것을 보여주었으며, 따라서 이 레시피는 증식성 및 유사분열 후 MGE-수임 세포의 혼합 배양을 일으킨다.

9일 후 분화된 세포에서의 복측 전뇌 신경 전구체 마커의 검출 및 배측 전뇌 마커의 부재를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포-유래 MGE-수임 신경 전구체에 대한 3-스테이지 분화 프로토콜을 위한 생성된 레시피의 효율성 및 강건성을 확인하였다.

실시예 4 : 파르브알부민 및 GABA를 발현하는 MGE -신경 전구체-유래 뉴런을 위한 프로토콜 개발

본 실시예에서는 배양 17일 후 MGE 전구 세포를 파르브알부민 및 GABA를 발현하는 성숙화된 PVALB 개재뉴런으로 가이드할 수 있는 내측 신경절 융기 (MGE)-유래 신경 전구체로부터의 뉴런 성숙화를 위한 2-스테이지 레시피를 개발하였다.

각 스테이지에 대한 레시피를 개발하기 위해, 3일 처리 후의 53개의 미리 선택된 유전자로 이루어진 2개의 세트의 발현에 대한, 본원에서 이펙터로 불리는 다중 신호전달 경로의 효능제 및 길항제의 영향을 평가하고, 모델링하였다. 이들 이펙터는 소분자 또는 단백질이다. 이는 줄기 세포의 특정 운명으로의 단계적 분화 동안 통상적으로 사용된다. 이펙터의 선택은 발생 중인 뇌의 전뇌 영역에서의 신경 유도 및 줄기 세포의 신경 전구체로의 분화에 대한 현행 문헌에 기초하였다.

본원에서 개발된 최종 스테이지 4 및 스테이지 5 레시피에서 이펙터는 각각 하기 표 4 및 5에 제시되어 있다.

표 4: 스테이지 4 레시피에서 검증된 이펙터

표 5: 스테이지 5 레시피에서 검증된 이펙터

이펙터를 평가하기 위해, 일정 범위의 농도에서 48개 이상의 상이한 이펙터 조합에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있는 적어도 8개의 인자를 사용한 실험을 디자인하였다. 모델을 분석하기 위해, 본 발명자들은 LHX6 (Yuan et al. (2018) Elife, 7:e37382), DLX5 (Wang et al. (2010) J. Neuroscience 30:5334-5345), ASCL1 (Shi et al. (2016) J. Biol . Chem . 291:13560-13570)을 포함한, 전뇌 개재뉴런 성숙화의 발생 및 패턴화에 수반되는 유전자의 발현에 초점을 맞추었다. 나중 스테이지에서 본 발명자들은 파르브알부민을 포함하고, 소마토스타틴은 부재하는 개재뉴런 성숙화 유전자에 초점을 맞추었다 (Horn and Nicoll (2018) Proc . Natl . Acad. Sci . 115:589-594). 유전자 발현 수준에 대한 각 이펙터의 영향은 모델링 중에 각 이펙터에 대해 계산되는 인자 기여도로 불리는 파라미터에 의해 정의된다.

분화의 스테이지 4의 레시피를 확인하기 위해, D-최적성을 통한 실험 디자인 압축을 사용하여 생성된 48개의 상이한 이펙터 조합을 로봇 방식으로 제조하였다. 이펙터 조합을 기본 배지에서 제조하고, 후속적으로 세포에 첨가한 후, 이어서 분화되도록 하였다. 3일 후, RNA 추출을 수행하고, 정량적 PCR 분석을 이용하여 유전자 발현을 수득하였다. 데이터를 정규화하고, 부분 최소 제곱 회귀 분석을 이용하여 이펙터 디자인에 대해 모델링하여 유전자 특이적 모델을 생성하고, 최대 예측력에 대한 모델 조정 후, 개별 유전자의 발현을 제어하는 이펙터 능력을 조합적으로 및 개별적으로 설명하였다. 이어서, 시험된 공간 내의 솔루션을 탐색하여 요망성을 해결할 수 있었다. MEF2C (Pai et al. (2020) Elife 9:54903)의 최대 발현을 453 값으로 최적화함으로써 강건한 솔루션에 이르게 되었다. 상기 모델은 cAMP, IGF-1, 발프로산, GSI-XX, LDN193189, 물질 P, SB431542, PD173074+BLU-554, MK2206, GDNF, PD0325901 및 MHY1458을 포함하는 12개의 이펙터를 시험함으로써 도출되었다. 발프로산은 히스톤 데아세틸라제를 억제하고, γ-아미노부티르산 (GABA)을 증가시킬 수 있다. MHY1458은 mTOR 신호전달 경로의 활성화제이고, 물질 P는 타키키닌 뉴로펩티드 패밀리의 구성원이고, cAMP는 CREB 및 PKA 경로의 활성화제이다. GDNF는 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자의 리간드이고, GDNF 경로를 활성화시킬 수 있다. 이들은 각각 12, 0.04, 9, 15, 및 5의 인자 기여도로 MEF2C 발현에 대해 긍정적인 영향을 미쳤다 (도 19). 상기 모델에서는 또한 BMP 억제제인 LDN193189, TGFβR 억제제인 SB431542, FGFR 억제제인 PD17/BLU, Notch 억제제인 GSI-XX가 11, 7.9, 7.5, 11.6의 인자 기여도로 MEF2C 발현에 상당한 부정적인 영향을 미친 것으로 나타났다. MEF2C의 80% 최대 발현을 달성하는 사양 내에서 이 복합 배지 조성의 Cpk 값 (공정 능력 지수)은 0.4였고, 이는 6.7%의 실패 위험에 상응하는 값이다.

본 실험에서 MEF2C를 최적화시킬 수 있는 잠재능이 있는 인자 세트를 찾기 위해, MEF2C의 최대 발현에 초점을 맞춘 동적 프로파일 분석을 통해 새로운 평가를 수행하였다 (도 20). 이 분석에 기초하여 MEF2C에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타난 IGF-1은 레시피에서 제거하였고; MEF2C에 부정적인 영향을 미친 GSI-XX, LDN19, SB431542, 및 PD17 또한 제거하였다.

스테이지 5에서 전뇌-수임 신경 줄기 세포의 PVALB 개재뉴런 세포로의 분화를 추가로 가이드하기 위해, 본 발명자들은 스테이지 4 처리 종결 후 3일 동안 HD-DoE 실험을 수행하였다. 여기서 본 발명자들은 파르브알부민 (+) 개재뉴런에서 발현되는 PVALB의 최대 발현, 및 또 다른 유형의 개재뉴런에서의 소마토스타의 최소 발현에 초점을 맞추었다. 본 8-인자 실험은 JQ1, 인돌락탐-V, 올레산, BDNF, IGF-1, 2-포스포-L-아스코르브산, 알부맥스, MK2206을 포함하였다. PVALB의 발현을 위해 모델을 최대화하였을 때, 본 발명자들은 인돌락탐-V, 올레산, BDNF, IGF-1, 2-포스포-L-아스코르브산 (BDNF는 BDNFR 신호전달 경로의 리간드임)을 포함한 5개의 이펙터는 PVALB의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 확인하였다 (도 21). 동적 프로파일 분석을 사용하여, 본 발명자들은 PVALB의 최대 발현 수준을 동시에 달성하기 위해 모델을 수정하였고, 따라서, 2-포스포-L-아스코르브산, BDNF, IGF1은 포함된 반면, MK2206, 알부맥스, 및 JQ1은 제외된다 (도 22). 복측 전뇌로의 최대 세포 분화를 위한 상이한 최적화 설정에서 모델을 고려하여, 분화 스테이지 5를 위한 레시피는 상기 HD-Doe 실험으로부터 BDNF, IGF-1, 2-포스포-L-아스코르브산을 포함하였다.

다른 인자가 전뇌-수임 신경 줄기 세포의 PVALB 개재뉴런 세포로의 분화에 미치는 효과를 조사하기 위해, 실험 시작 전 총 12일 동안 스테이지 1 내지 스테이지 4 배지로 처리된 세포에 대해 3일 동안 추가적인 HD-DoE 실험을 수행하였다. 본 실험은 8개의 이펙터, 프로스트라틴, 로시글리타존, GSI-XX, 헤파린, GW0742, N2, THI0019, 및 GDNF를 포함하였다. 본 모델에서, 본 발명자들은 PVALB (+) 개재뉴런에서 발현되는 PVALB 유전자의 최대 발현에 초점을 맞추었다 (Nahar et al. (2021) Front. Psych. 12:679960). PVALB의 최대 발현을 위해 모델을 최적화하였을 때, GW0742, N2, 및 GDNF는 각각 13.56, 19.499, 15.9 및 8.2의 가장 높은 인자 기여도를 보였다 (도 23). N2의 기여는 PVALB 유전자 발현에 유의적인 영향을 미치는 바, 이에 본 발명자들의 스테이지 5 레시피에 포함된다.

동적 프로파일 분석을 사용하여 PVALB의 발현에 긍정적인 영향을 미치는 공통 인자를 찾았다 (도 24). GW0742, N2, 프로스트라틴, 및 GDNF는 PVALB 유전자의 발현에 대해 유사한 영향을 미치고, GSI-XX, THI0019, 헤파린은 PVALB 유전자 발현에 대해 부정적인 영향을 미쳤다. 이에, 레시피에서 제외되었다.

전뇌-수임 신경 줄기 세포의 PVALB 개재뉴런 세포로의 분화를 추가로 가이드하기 위해, 실험 시작 전 총 12일 동안 스테이지 1 내지 스테이지 4 배지로 처리된 세포에 대해 3일 동안 추가적인 HD-DoE 실험을 수행하였다. 본 실험은 8개의 이펙터, 포르스콜린, 아라키돈산, VPA, BDNF, BT13, O-LPA, GW7646, 및 소듐 피루베이트를 포함하였다. 본 모델에서, 본 발명자들은 PVALB (+) 개재뉴런에서 발현되는 PVALB 유전자의 최대 발현에 초점을 맞추었다 (Nahar et al. (2021) Front. Psych. 12:679960). PVALB의 최대 발현을 위해 모델을 최적화하였을 때, 포르스콜린, GW7646, 소듐 피루베이트는 각각 3.14, 27.2, 및 17.1의 가장 높은 인자 기여도를 보였다 (도 25). 소듐 피루베이트는 PVALB 발현에 유의적인 영향을 미쳤는 바, 이에 스테이지 5 레시피에 포함된다.

동적 프로파일 분석을 사용하여 PVALB의 발현에 긍정적인 영향을 미치는 공통 인자를 찾았다 (도 26). GW7646, 소듐 피루베이트, 및 포르스콜린은 PVALB 유전자의 발현에 대해 유사한 영향을 미치고, BT13은 PVALB 유전자 발현에 대해 상당한 부정적인 영향을 미쳤다. 이에, 레시피에서 제외되었다.

실시예 5 : 전뇌 신경 전구체 유래 개재뉴런 유도 배양 조건의 인자 임계성 분석

검증된 각 인자 제거의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 다시 동적 프로파일 분석을 사용하고, 다른 것은 존재하지만, 확정된 각 인자의 부재 하에서 관심 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 관심 유전자의 발현 수준이 원하는 결과에 도달할 수 있는지 여부를 나타내기 때문에, 상기 인자 임계성 분석을 통해 각 입력 이펙터의 중요성 정도를 밝혀냈다.

스테이지 4 레시피에서, 다른 4개의 인자는 존재하는 동안 확정된 인자 5개를 각각 개별적으로 제거하고, 전뇌 유전자의 발현 수준을 5개의 인자가 모두 존재하는 것과 비교 평가하였다. 본 결과는 도 27에 요약되어 있다. MEF2C는 PVALB 전구체 세포 운명을 결정하는 것으로 보고된 바 있다 (Mayer et al. (2018) Nature 555:457-462). 본 발명자들은 본 스테이지에서 MEF2C 발현을 최적화한다. C AMP 및 물질 P는 MEF2C 발현을 증가시키고, 소마토스타틴 발현은 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 이에 스테이지 4 레시피에 포함된다. GDNF 및 발프로산은 PVALB 발현에 기여하지만, 소마토스타틴 발현은 최소로 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 이 또한 스테이지 4 레시피에 포함된다. MHY1458은 PVALB 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 레시피에 포함된다. (도 27).

스테이지 5 레시피에서, 다른 인자는 그대로 존재하는 동안 확정된 인자 7개를 각각 제거하고, PVALB 및 SST의 발현 수준을 7개의 인자가 모두 존재하는 것과 비교 평가하였다. 본 HD-DoE 실험에서, 2-포스포-L-아스코르브산, BDNF, 및 IGF-1은 PVALB 발현에 긍정적인 기여를 한 반면, 또 다른 개재뉴런 마커였던 소마토스타틴의 발현에는 변함이 없었다. 2-포스포-L-아스코르브산, BDNF, IGF-1은 스테이지 5 레시피에 포함되었다 (도 28). 또 다른 HD-DoE 실험에서, N2 및 다른 이펙터는 파르브알부민 발현에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 나머지 다른 것들은 SST 개재뉴런 마커인 소마토스타틴의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이에, 레시피에서 제거하고, N2는 스테이지 5 레시피에 포함되었다 (도 29). 마지막 HD-DoE 실험에서, 소듐 피루베이트는 PVALB 발현에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 소듐 피루베이트는 스테이지 5 레시피에 포함되었다 (도 30). 마지막으로, O-LPA는 LHX6 및 GAD1 발현에 기여하는 것으로 밝혀졌고, 이에 레시피에 포함되었다 (도 31).

실시예 6 : 파르브알부민 을 발현하는 전뇌 신경 전구체 유래 개재뉴런의 면역 세포화학법에 의한 검증

실시예 4에서 개발된 레시피를 검증하기 위해, 세포를 먼저 실시예 1에 따른 스테이지 1, 스테이지 2 및 스테이지 3 분화 배지로 처리한 후, 이어서 실시예 4에 따른 스테이지 4 및 스테이지 5 분화 배지로 처리하고, 면역세포화학법을 사용하여 각 스테이지의 종료 시 전뇌 뉴런 및 신경 전구체의 바이오마커를 평가하였다. 바이오마커는 MAP2, NeuN, 뉴로필라멘트, 베타 III-튜불린 (범 뉴런 마커), PAX6, LGE 마커 (Kioussi et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . 96:14378-14382; Kioussi et al. (1999) Proc . Natl. Acad . Sci . 96:14378-14382), SOX2 (복측 전뇌에서 발현되는 뉴런 전구체) (Hansen et al. (2013) Nature Neurosci . 16:1576-1587), LHX6 (피질 개재뉴런 마커), MASH1 (ASCL1), GFAP 신경교 마커, SOX6 (MGE 영역의 유사분열 후 전구체에서 발현되는 마커) (Batista-Brito et al. (2009) Neuron 63:466-481) 및 GABA (GABA작동성 개재뉴런에 의해 특이적으로 발현되는 마커)를 포함하였다 (도 32).

면역세포화학법 이미지에서는 스테이지 4 종료 시까지 90% 초과의 세포에서NeuN (Gusel'Nikova et al. (2015) Acta Naturae 7:42-47)의 발현이 확인되었고, PAX6은 검출되지 않았다. Mash1 및 SOX6은 배양된 세포 대부분에서 관찰되었고, 이를 통해 분화 세포의 복측 국재화가 확인되었다 (도 32). 대부분의 세포에서 GAD65가 검출됨에 따라 세포가 개재뉴런이라는 것인 확인되었다.

스테이지 5가 끝나는 27일차까지 배양물 중의 대부분의 세포에서 GABA, MASH1, 및 LHX6이 검출되었고, MAP2, 뉴로필라멘트, 및 파르브알부민은 절반 이상의 배양물에서 검출되었고, 이를 통해 세포의 전뇌의 MGE 영역이 분화된 PVALB (+) 개재뉴런으로 된 것을 확인하였다 (도 33). 본 발명자들은 또한 배양물 중의 대부분의 세포에서 뉴로필라멘트, 시냅신 및 GAD65를 검출하였고, 이는 이들 세포가 성숙화된 뉴런의 기능을 갖고 있다는 것을 제시한다 (Nguyen et al. (2014) J. Neurosci. 34:14948-14960) (도 33).

27일차에 분화된 세포에서의 성숙화된 신경 분화 마커의 검출 및 배측 전뇌 마커의 부재를 통해 MGE-수임 신경 전구체의 분화된 파르브알부민 (+) 개재뉴런으로의 2-스테이지 분화 프로토콜을 위한 생성된 레시피의 효율성과 강건성을 확인하였다.

등가물

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims

인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 생성하는 방법으로서, 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 수득하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하고 AKT 경로 길항제 및 PKC 경로 길항제가 결여된 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 것인 방법.
제2항에 있어서, VFB-NSC를 6-9일차에 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하는 것인 방법.
제3항에 있어서, MGE-NPC를 9-12일차에 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 미성숙 뉴런을 수득하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 인간 미성숙 뉴런을 12-26일차에 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 수득하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 배양 동안 비트로넥틴-코팅된 플레이트에 부착되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189, DMH1, DMH2, 도르소모르핀, K02288, LDN214117, LDN212854, 폴리스타틴, ML347, Noggin, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, BMP 경로 길항제가 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제9항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189이며, 이는 배양 배지 중에 250-275 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 경로 길항제가 PD0325901, 비니메티닙 (MEK162), 코비메티닙 (XL518), 셀루메티닙, 트라메티닙 (GSK1120212), CI-1040 (PD-184352), 레파메티닙, ARRY-142886 (AZD-6244), PD98059, U0126, BI-847325, RO 5126766, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제12항에 있어서, MEK 경로 길항제가 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제12항에 있어서, MEK 경로 길항제가 PD0325901이며, 이는 배양 배지 중에 100-110 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, WNT 경로 길항제가 XAV939, ICG001, 카프마티닙, 엔도-IWR-1, IWP-2, IWP-4, MSAB, CCT251545, KY02111, NCB-0846, FH535, LF3, WIKI4, 트립토니드, KYA1797K, JW55, JW 67, JW74, 카디오노겐 1, NLS-StAx-h, TAK715, PNU 74654, iCRT3, WIF-1, DKK1, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, WNT 경로 길항제가 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제15항에 있어서, WNT 경로 길항제가 XAV939이며, 이는 배양 배지 중에 100-110 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민, GSA 10, SAG, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제18항에 있어서, SHH 경로 효능제가 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제18항에 있어서, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민이며, 이는 배양 배지 중에 500-550 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AKT 경로 길항제가 MK2206, GSK690693, 페리포신 (KRX-0401), 이파타세르팁 (GDC-0068), 카피바세르팁 (AZD5363), PF-04691502, AT 7867, 트리시리빈 (NSC154020), ARQ751, 미란세르팁 (ab235550), 보루세르팁, 세리세르팁, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제21항에 있어서, AKT 경로 길항제가 배양 배지 중에 50-200 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제21항에 있어서, AKT 경로 길항제가 MK2206이며, 이는 배양 배지 중에 138 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PKC 경로 길항제가 Go 6983, 소트라스타우린, 엔자스타우린, 스타우로스포린, LY31615, Go 6976, GF 109203X, Ro 31-8220 메실레이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제24항에 있어서, PKC 경로 길항제가 배양 배지 중에 50-200 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제24항에 있어서, PKC 경로 길항제가 Go 6983이며, 이는 배양 배지 중에 110 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TAK1 경로 길항제가 타키닙, 데히드로아비에트산, NG25, 사르사사포게닌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제27항에 있어서, TAK1 경로 길항제가 배양 배지 중에 1-5 uM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제27항에 있어서, TAK1 경로 길항제가 타키닙이며, 이는 배양 배지 중에 2 uM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 A 83-01, SB-431542, GW788388, SB525334, TP0427736, RepSox, SD-208, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제30항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제30항에 있어서, TGFβ 경로 길항제가 A 83-01이며, 이는 배양 배지 중에 500 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TRK 경로 길항제가 GNF-5837, BMS-754807, UNC2020, 탈레트렉티닙, 알티라티닙, 셀리트렉티닙, PF 06273340, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제33항에 있어서, TRK 경로 길항제가 배양 배지 중에 25-75 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제33항에 있어서, TRK 경로 길항제가 GNF-5837이며, 이는 배양 배지 중에 50 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Notch 경로 길항제가 GSI-XX, RO4929097, 세마가세스타트, 디벤즈아제핀, LY411575, 크레니가세스타트, IMR-1, IMR-1A, FLI-06, DAPT, 발프로산, YO-01027, CB-103, 탄게레틴, BMS-906024, 아바가세스타트, 브루세인 D, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제36항에 있어서, Notch 경로 길항제가 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제36항에 있어서, Notch 경로 길항제가 GSI-XX이며, 이는 배양 배지 중에 100 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IGF1 경로 효능제가 IGF1, IGF1-Ado, X10, 메카세르민, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제39항에 있어서, IGF1 경로 효능제가 배양 배지 중에 5-15 ng/ml 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제39항에 있어서, IGF1 경로 효능제가 IGF1이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CREB 또는 PKA 경로 효능제가 cAMP, 디부티릴-cAMP, 8-Br-cAMP, cAMPS-Sp, CW 008, 포르스콜린, 8-CPT-cAMP, CW 008, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-벤조일-, 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염 일수화물, (S)-아데노신, 시클릭 3',5'-(히드로겐포스포로티오에이트) 트리에틸암모늄, Sp-아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트 트리에틸암모늄 염, Sp-5,6-DCI-cBiMPS, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포티오에이트, Sp-이성질체 소듐 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포로티오에이트,8-브로모-, Sp-이성질체,소듐 염, Sp-8-pCPT-시클릭 GMPS 소듐, 8-브로모아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트, N6-모노부티릴아데노신 3':5'-시클릭 모노포스페이트 소듐 염, 8-PIP-cAMP, Sp-cAMPS, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제42항에 있어서, CREB 또는 PKA 경로 효능제가 배양 배지 중에 0.5-2.5 μM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제42항에 있어서, CREB 또는 PKA 경로 효능제가 cAMP이며, 이는 배양 배지 중에 1.0-1.5 μM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 발프로산 또는 유사체가 발프로산, 발프로에이트, 소듐 발프로에이트 및 발프로에이트 세미소듐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제45항에 있어서, 발프로산 또는 유사체가 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제45항에 있어서, 발프로산이 배양 배지 중에 450-550 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 물질 P가 배양 배지 중에 100-150 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, GDNF 경로 효능제가 GDNF, BT13, BT44, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제49항에 있어서, GDNF 경로 효능제가 배양 배지 중에 5-50 ng/ml 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제49항에 있어서, GDNF 경로 효능제가 GDNF이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR 경로 효능제가 MHY1458, NV-5138, 테스토스테론, 3-벤질-5-((2-니트로페녹시) 메틸)-디히드로푸란-2(3H)-온 (3BDO), 3BDO, L-류신, NV-5138 히드로클로라이드, NV-5138, L-류신-d1, L-류신-2-13C,15N, 류신-13C6, L-류신-d7, L-류신-d10, L-류신-d2, l-류신-d3, L-류신-18O2, L-류신-13C, L-류신-2-13C, L-류신-13C6-15N, L-류신-15N, L-류신-1-13C,15N, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제52항에 있어서, mTOR 경로 효능제가 배양 배지 중에 1-3 μM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제52항에 있어서, mTOR 효능제가 MHY1458이며, 이는 배양 배지 중에 2 μM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, BDNF 경로 효능제가 BDNF, 로티고틴, 7,8-DHF, 케타민, 트리시클릭 이량체성 펩티드-6 (TDP6), LM22A-4, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제55항에 있어서, BDNF 경로 효능제가 배양 배지 중에 5-50 ng/ml 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제55항에 있어서, BDNF 경로 효능제가 BDNF이며, 이는 배양 배지 중에 10 ng/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아스코르브산 또는 그의 유사체가 비타민 C, 2-포스포-L-아스코르브산, L-아스코르브산, 소듐 아스코르빌 포스페이트, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코시드, 테트라헥실데실 아스코르베이트 (THD), 에틸화된 L-아스코르브산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제58항에 있어서, 아스코르브산 또는 유사체가 배양 배지 중에 100-400 μM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제58항에 있어서, 2-포스포-L-아스코르브산이 배양 배지 중에 200 μM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 소듐 피루베이트가 배양 배지 중에 100-300 μM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LPA 또는 그의 유사체가 리소포스파티드산, 2-[[3-(1,3-디옥소-1H-벤즈[de]이소퀴놀린-2(3H)-일)프로필]티오]벤조산, 1-올레오일 리소포스파티드산 소듐 염, UCM-05194, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제62항에 있어서, LPA 또는 유사체가 배양 배지 중에 100-400 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제62항에 있어서, LPA 또는 유사체가 O-LPA이며, 이는 배양 배지 중에 200 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, N2 보충제가 배양 배지 중에 1%의 농도로 존재하는 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, NEAA 보충제가 배양 배지 중에 1%의 농도로 존재하는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 인간 NKX2-1 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 생성하는 방법:
(a) 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하는 단계; 및
(b) 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하고 AKT 경로 길항제 및 PKC 경로 길항제가 결여된 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 단계.
제67항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189이고, MEK 경로 길항제가 PD0325901이고, WNT 경로 길항제가 XAV939이고, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민이고, AKT 경로 길항제가 MK2206이고, PKC 경로 길항제가 Go 6983인 방법.
제68항에 있어서, LDN193189가 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재하고, PD0325901이 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, XAV939가 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 푸르모르파민이 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, MK2206이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, Go 6983이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제69항에 있어서, LDN193189가 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 275 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 250 nM의 농도로 존재하고, PD0325901이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, XAV939가 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, 푸르모르파민이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 550 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, MK2206이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 138 nM의 농도로 존재하고, Go 6983이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 생성하는 방법:
(a) 인간 만능 줄기 세포를 0-3일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하는 단계;
(b) 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NSC를 3-6일차에 BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하고 AKT 경로 길항제 및 PKC 경로 길항제가 결여된 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하는 단계; 및
(c) 인간 NKX2-1+ VFB-NSC를 6-9일차에 TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하여 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하는 단계.
제71항에 있어서, BMP 경로 길항제가 LDN193189이고, MEK 경로 길항제가 PD0325901이고, WNT 경로 길항제가 XAV939이고, SHH 경로 효능제가 푸르모르파민이고, AKT 경로 길항제가 MK2206이고, PKC 경로 길항제가 Go 6983이고, TAK1 경로 길항제가 타키닙이고, TGF-β 경로 길항제가 A 83-01이고, TRK 경로 길항제가 GNF-5837이고, Notch 경로 길항제가 GSI-XX이고, IGF1 경로 효능제가 IGF-1인 방법.
제72항에 있어서, LDN193189가 배양 배지 중에 100-500 nM 범위 내의 농도로 존재하고, PD0325901이 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, XAV939가 배양 배지 중에 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 푸르모르파민이 배양 배지 중에 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, MK2206이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, Go 6983이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, 타키닙이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 1-5 uM 범위 내의 농도로 존재하고, A 83-01이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 250-750 nM 범위 내의 농도로 존재하고, GNF-5837이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 25-75 nM 범위 내의 농도로 존재하고, GSI-XX가 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 50-150 nM 범위 내의 농도로 존재하고, IGF-1이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 5-15 ng/ml 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
제73항에 있어서, LDN193189가 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 275 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 250 nM의 농도로 존재하고, PD0325901이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, XAV939가 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, 푸르모르파민이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 550 nM의 농도로 및 단계 (b)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, MK2206이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 138 nM의 농도로 존재하고, Go 6983이 배양 배지 중에 단계 (a)에서는 110 nM의 농도로 존재하고, 타키닙이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 2 uM의 농도로 존재하고, A 83-01이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 500 nM의 농도로 존재하고, GNF-5837이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 50 nM의 농도로 존재하고, GSI-XX가 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 100 nM의 농도로 존재하고, IGF-1이 배양 배지 중에 단계 (c)에서는 10 ng/ml 범위 내의 농도로 존재하는 것인 방법.
하기 단계를 포함하는, 인간 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)로부터 인간 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 생성하는 방법:
(a) 인간 MGE-NPC를 0-3일차에 CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 미성숙 뉴런을 수득하는 단계; 및
(b) 인간 미성숙 뉴런을 3-17일차에 BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 인간 성숙한 파르브알부민+ 개재뉴런을 수득하는 단계.
제75항에 있어서, CREB 또는 PKA 경로 효능제가 cAMP이고, 발프로산 또는 유사체가 발프로산이고, 물질 P 또는 유사체가 물질 P이고, GDNF 경로 효능제가 GDNF이고, mTOR 경로 효능제가 MHY1458이고, BDNF 경로 효능제가 BDNF이고, IGF-1 경로 효능제가 IGF-1이고, 아스코르브산 또는 유사체가 2-포스포-L-아스코르브산이고, 소듐 피루베이트 또는 유사체가 소듐 피루베이트이고, LPA 또는 유사체가 O-LPA인 방법.
제76항에 있어서, cAMP가 1.0-1.5 μM 범위의 농도로 존재하고, 발프로산이 450-550 nM 범위의 농도로 존재하고, 물질 P가 100-150 nM 범위의 농도로 존재하고, GDNF가 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, MHY1458이 1-3 μM 범위의 농도로 존재하고, BDNF가 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, IGF-1이 5-50 ng/ml 범위의 농도로 존재하고, 2-포스포-L-아스코르브산이 100-400 μM 범위의 농도로 존재하고, O-LPA가 100-400 μM 범위의 농도로 존재하고, 소듐 피루베이트가 100-300 μM 범위의 농도로 존재하고; N2 보충제가 0.5%-1.5% 범위의 농도로 존재하고, NEAA 보충제가 0.5%-1.5% 범위의 농도로 존재하는 것인 방법.
제77항에 있어서, cAMP가 1.0 μM의 농도로 존재하고, 발프로산이 500 nM의 농도로 존재하고, 물질 P가 100 nM의 농도로 존재하고, GDNF가 10 ng/ml의 농도로 존재하고, MHY1458이 2 μM의 농도로 존재하고, BDNF가 10 ng/ml의 농도로 존재하고, IGF-1이 10 ng/ml의 농도로 존재하고, 2-포스포-L-아스코르브산이 200 μM의 농도로 존재하고, 소듐 피루베이트가 100 μM의 농도로 존재하고, O-LPA가 200 μM의 농도로 존재하고, N2 보충제가 1.0%의 농도로 존재하고, NEAA 보충제가 1.0%의 농도로 존재하는 것인 방법.
BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는, 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지.
BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는, 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)를 수득하기 위한 배양 배지.
TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는, 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)를 수득하기 위한 배양 배지.
CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는, 인간 미성숙 뉴런을 수득하기 위한 배양 배지.
CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는, 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 수득하기 위한 배양 배지.
인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제, AKT 경로 길항제, SHH 경로 효능제 및 PKC 경로 길항제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ FB-NPC를 포함하는 배양물.
인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC)의 단리된 세포 배양물로서, BMP 경로 길항제, MEK 경로 길항제, WNT 경로 길항제 및 SHH 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 NKX2-1+ VFB-NPC를 포함하는 배양물.
인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC)의 단리된 세포 배양물로서, TAK1 경로 길항제, SHH 경로 효능제, TGF-β 경로 길항제, TRK 경로 길항제, Notch 경로 길항제 및 IGF1 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 ASCL1+ MGE-NPC를 포함하는 배양물.
인간 미성숙 뉴런의 단리된 세포 배양물로서, CREB 또는 PKA 경로 효능제, 발프로산 또는 유사체, 물질 P 또는 유사체, GDNF 경로 효능제 및 mTOR 경로 효능제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 미성숙 뉴런을 포함하는 배양물.
인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런의 단리된 세포 배양물로서, BDNF 경로 효능제, IGF-1 경로 효능제, 아스코르브산 또는 유사체, 소듐 피루베이트 또는 유사체, LPA 또는 유사체, N2 보충제 및 NEAA 보충제를 포함하는 배양 배지에서 배양된 인간 성숙한 GABA작동성 개재뉴런을 포함하는 배양물.
제1항의 방법에 의해 생성된 인간 OTX2+ FEZF2+ SIX3+ 전뇌 신경 줄기 세포 (FB-NSC).
제2항의 방법에 의해 생성된 인간 NKX2-1+ 복측 전뇌 신경 줄기 세포 (VFB-NSC).
제3항의 방법에 의해 생성된 인간 ASCL1+ 내측 신경절 융기 신경 전구 세포 (MGE-NPC).
제4항의 방법에 의해 생성된 인간 미성숙 뉴런.
제5항의 방법에 의해 생성된 인간 파르브알부민+ 성숙한 GABA작동성 개재뉴런.