KR20240090208A - 코발트-함유 산성 아미노산 복합체 및 암 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents
코발트-함유 산성 아미노산 복합체 및 암 치료를 위한 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코발트-함유 산성 아미노산 복합체 및 암 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 화학식 I 또는 II로 표현된다.
Description
본 발명은 코발트-함유 산성 아미노산 복합체 및 암 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
암은 세계에서 가장 중요한 건강 문제들 중 하나이다. 이는 제어할 수 없이 성장하고 사멸하지 않고 신체의 어느 곳에서든 발달하는 오래된 세포로서 규정된다. 환자는 전통적인 요법, 예컨대 수술, 방사선 요법 및 화학요법, 또는 새로운 형태의 치료, 예컨대 면역요법, 표적 요법, 유전자 요법 등으로 치료된다. 화학요법은 하나 이상의 항암 약물을 사용하는 효과적이고 광범위한 암 치료이다.
시스플라틴은 Pt(II) 복합체이고 많은 유형의 암을 치료하기 위한 화학치료 약물로 사용된다. 이의 화학식은 [Pt(NH3)2Cl2]이고, 몰 질량은 300.05 g·mol-1이다. 이는 DNA와의 가교에 의해 세포 유사분열을 방해하고, 세포가 손상된 DNA를 복구하지 못할 때 아폽토시스를 활성화시킨다. 따라서, 시스플라틴은 암 세포를 포함하는 증식하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 이는 또한 골수, 위장관 및 모낭과 같이 빠르게 분열하는 정상 세포를 손상시킬 수 있다. 신독성, 이독성, 간독성, 위장 불내성, 및 신경독성과 같은 일반적인 부작용. 후천성 또는 고유 내성, 비특이적 및 독성 부작용, 및 암 재발 예방의 불능으로 인해, 시스플라틴의 임상적 사용은 제한적이다(Sumit Ghosh Chemistry. 88, 102925, (2019)).
본 발명에서, 글루탐산(GA, Glu) 또는 아스파르트산(AA, Asp)을 포함하는 산성 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체가 암 세포 성장을 억제하는데 효과적이라는 것이 예상치 못하게 발견되었다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체는 다양한 유형의 암 세포에 대한 이의 효과로 인해 광역-스펙트럼 항암제로서 효과적이다.
따라서, 본 발명은 유효량의 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체의 용도를 제공한다. 또한, 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 산성 아미노산은 글루탐산(GA) 및 아스파르트산(AA)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체는 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체 또는 코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체는 하기 화학식 I, 또는 하기 화학식 II로 표현된다:
[화학식 I]
[화학식 II]
일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 결정의 형태이다.
일부 구현예에서, 암은 간암(간종양), 뇌암(교모세포종), 피부암(흑색종), 폐암, 두경부암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 백혈병, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 고환암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 암 세포의 증식을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 암 세포에서 myca, mycb, cdk1, cdk2, ccnd1 및/또는 ccne1의 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 여러 구현예의 하기 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명을 예시하기 위해, 도면에 구현예가 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도시된 바람직한 구현예로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 도면에서,
도 1은 트랜스진의 발현에 대한 리포터로서 형광 강도(약함, 중간 또는 강함)를 갖는 tert 트랜스제닉 어류에서의 GFP 발현을 도시한다.
도 2는 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체로 처리된 tert 트랜스제닉 어류의 배아 독성 검정의 결과를 도시한다.
도 3a 내지 도 3g는 tert 과발현이 수정 후 15일(dpf)만큼 일찍 세포 증식 및 β-카테닌 하류 표적 유전자를 유도함을 도시한다. 도 3a는 제브라피쉬 유충의 섭식 프로토콜을 도시한다. 도 3b는 tert 과발현이 ccne1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3c는 tert 과발현이 cdk1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3d는 tert 과발현이 cdk2의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3e는 tert 과발현이 ccnd1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3f는 tert 과발현이 myca의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3g는 tert 과발현이 mycb의 발현을 유도함을 도시한다.
도 4는 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류 및 WT 어류의 유사분열상 및 삼핵화된 간세포를 도시한다.
도 5는 COGA 처리가 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류에서 세포 증식 및 β-카테닌 하류 표적 유전자(ccne1, cdk1, cdk2, myca, mycb 및 ccnd1)의 발현을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 6은 COGA 처리가 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류에서 유사분열상, 삼핵화된 세포, 및 거대핵화된 세포를 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 7은 COGA 처리가 간독성을 유도하지 않는다는 것을 도시한다.
도 8은 COGA 처리가 간암 세포 증식을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 9는 각 실험에서 COGA에 의한 NCI-H226 세포 증식의 억제를 나타내는 용량-반응 곡선을 도시한다. 각 실험에서 GraphPad Prism을 사용하여 약물 농도의 로그의 함수로서 세포 증식 비율을 피팅함으로써 S자형 용량-반응 곡선이 생성되었다.
도 1은 트랜스진의 발현에 대한 리포터로서 형광 강도(약함, 중간 또는 강함)를 갖는 tert 트랜스제닉 어류에서의 GFP 발현을 도시한다.
도 2는 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체로 처리된 tert 트랜스제닉 어류의 배아 독성 검정의 결과를 도시한다.
도 3a 내지 도 3g는 tert 과발현이 수정 후 15일(dpf)만큼 일찍 세포 증식 및 β-카테닌 하류 표적 유전자를 유도함을 도시한다. 도 3a는 제브라피쉬 유충의 섭식 프로토콜을 도시한다. 도 3b는 tert 과발현이 ccne1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3c는 tert 과발현이 cdk1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3d는 tert 과발현이 cdk2의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3e는 tert 과발현이 ccnd1의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3f는 tert 과발현이 myca의 발현을 유도함을 도시한다. 도 3g는 tert 과발현이 mycb의 발현을 유도함을 도시한다.
도 4는 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류 및 WT 어류의 유사분열상 및 삼핵화된 간세포를 도시한다.
도 5는 COGA 처리가 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류에서 세포 증식 및 β-카테닌 하류 표적 유전자(ccne1, cdk1, cdk2, myca, mycb 및 ccnd1)의 발현을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 6은 COGA 처리가 15 dpf에서 tert 트랜스제닉 어류에서 유사분열상, 삼핵화된 세포, 및 거대핵화된 세포를 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 7은 COGA 처리가 간독성을 유도하지 않는다는 것을 도시한다.
도 8은 COGA 처리가 간암 세포 증식을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 9는 각 실험에서 COGA에 의한 NCI-H226 세포 증식의 억제를 나타내는 용량-반응 곡선을 도시한다. 각 실험에서 GraphPad Prism을 사용하여 약물 농도의 로그의 함수로서 세포 증식 비율을 피팅함으로써 S자형 용량-반응 곡선이 생성되었다.
하기 설명은 단지 본 발명의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이, 본원에 논의된 특정 구현예 또는 변형은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 다양한 변경 또는 균등물이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 명확하고 용이한 이해를 제공하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "성분"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 복수의 이러한 성분 및 이의 등가물을 포함한다.
용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하는(comprising)"은 일반적으로 하나 이상의 특징, 구성성분 또는 성분의 존재를 허용하는 것을 의미하는 포함하는/포함하는(include/including)의 의미로 사용된다. 용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하는(comprising)"은 용어 "~로 구성된다(consist)" 또는 "~로 구성된(consisting of)"을 포함한다.
코발트는 주로 비타민 B12, 코발라민의 형태로 모든 동물에 존재하는 필수 미량 원소이고, 여러 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 많은 조사는 상이한 형태의 코발라민의 참여가 DNA 합성 및 조절, 적혈구의 발달, 및 정상적인 뇌 및 신경 기능의 유지에 필요함을 보여준다. 코발트는 백금과 같은 비필수 금속보다 독성이 덜하다.
산성 아미노산은 음으로 하전된 측쇄를 갖는 극성 아미노산의 일종이다. 특히, 이러한 아미노산은 아미노산 구조에 2개의 카복실기를 갖는다: 하나의 카복실기는 측쇄에 있으며, 다른 하나는 중심 탄소 원자에 부착되어 있다. 산성 아미노산의 예에는 글루탐산 및 아스파르트산이 있다.
글루탐산(GA)은 화학식 C5H9NO4 및 147.130 g·mol-1의 몰 질량을 갖는다. 글루탐산 및 이의 유도체인 글루타민은 암 세포의 빠른 성장에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 글루탐산은 인체 내부의 글루타민 합성효소에 의한 에너지 의존적 반응에서 글루타민으로 전환된다. 종양 발생에서, 글루타민은 뉴클레오타이드 및 아미노산 생합성에서 질소 공여체이다. 이는 또한 필수 아미노산의 흡수를 돕고, TOR 키나제의 활성화를 유지하고, NADPH 생산을 지원하고, 종양 세포에서 호흡 연료로서 작용한다.
아스파르트산(AA)은 화학식 C4H7NO4 및 133.103 g·mol-1의 몰 질량을 갖는다. 아스파르테이트는 뉴클레오타이드 합성에서 전구체로서 작용하고 세포 증식에서 중요한 역할을 한다. 또한, 아스파르테이트는 미토콘드리아 대사를 억제함으로써 종양 성장 및 암 세포 생존의 제한 인자가 된다는 많은 보고서가 있다. 또한, 클리닉 또는 임상 시험에서 다양한 치료제에 대한 민감성 또는 내성은 아스파르테이트 이용 가능성과 관련이 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 적어도 부분적으로 코발트-함유 산성 아미노산 복합체가 암 세포 성장을 억제하는데 효과적이라는 발견에 기초로 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 산성 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체는 코발트와 산성 아미노산, 예컨대, 글루탐산 또는 아스파르트산의 복합체이다. 구체적으로, 본원에서 사용되는 코발트는 +2(코발트(II) 및 +3(코발트(III))과 같은 일반적인 산화 상태일 수 있다. 본원에서 사용되는 글루탐산 및 아스파르트산은 L 또는 D 배위뿐만 아니라 적절한 경우 로타머(rotamer)의 혼합물일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 산성 산 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체는 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체 또는 코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코발트-함유 복합체는 하기 화학식 I(COGA)을 갖는다
[화학식 I]
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코발트-함유 복합체는 하기 화학식 II(COAA)를 갖는다
[화학식 II]
본원에 기재된 바와 같은 코발트-함유 복합체는, 예를 들어, 이전에 문헌[Yugen Zhang et al. 2003, CrystEngComm. 5(5):34-37]에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 간략하게, 수 중 코발트(II) 클로라이드-6-수화물을 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 함유하는 수용액에 첨가하고, 혼합물을 코발트와 글루탐산 또는 아스파르트산의 혼합물을 형성하기에 충분한 기간 동안 유지한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코발트-함유 복합체는 수화물 또는 무수물이다.
일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 결정의 형태이다.
일부 구현예에서, 코발트-함유 복합체는 공간군 P2 및 단위 셀 치수 a=7.1 Å, b=10.4 Å, 및 c = 11.2 Å에 의해 정의된 분자 패킹 배열을 갖는 결정 형태의 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체이다.
일부 구현예에서, 코발트-함유 착물은 a=7.7 Å, b=9.3 Å, 및 c=11.5 Å에 의해 정의된 분자 패킹 배열을 갖는 결정 형태의 코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "개체" 또는 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물, 예컨대, 반려 동물(예컨대, 개, 고양이 등), 농장 동물(예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등), 또는 실험실 동물(예컨대, 래트, 마우스, 기니피그 등)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 장애, 장애의 증상 또는 병태, 장애에 의해 유발된 장애, 또는 장애 또는 이의 증상 또는 병태의 진행을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 교정, 개량, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로, 장애, 장애의 증상 또는 병태, 또는 장애의 진행을 앓는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 치료받는 대상체에서 요망되는 치료 효과를 부여하기 위한 활성 성분의 양을 지칭한다. 예를 들어, 암을 치료하기 위한 유효량은 하나 이상의 증상 또는 병태 또는 이의 진행을 억제, 개선, 경감, 감소 또는 예방할 수 있는 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 유효량은 암 세포의 성장을 억제하고/거나 아폽토시스를 유도하는데 효과적인 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 유효량은 암 세포에서 myca, mycb, cdk1, cdk2, ccnd1 및 ccne1의 발현을 억제하는데 효과적인 양일 수 있다. 바람직하게는, 유효량은 환자에서 정상 세포에 대한 세포독성과 같은 부작용을 일으키지 않는다.
치료적 유효량은 투여 경로 및 빈도, 상기 약제를 투여받는 개체의 체중 및 종, 및 투여 목적과 같은 다양한 이유에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 본원의 개시, 확립된 방법, 및 그들 자신의 경험에 기초하여 각각의 경우에 투여량을 결정할 수 있다.
전달을 위해, 치료적 유효량의 활성 성분은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 전달 및 흡수를 위한 적절한 형태의 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 투여 방식에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 약 0.1 중량% 내지 약 100 중량%의 활성 성분을 포함하고, 여기서 중량 백분율은 전체 조성물의 중량을 기준으로 계산된다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"은 담체가 조성물 중 활성 성분과 상용성이고, 바람직하게는 상기 활성 성분을 안정화시킬 수 있고 치료를 받는 개체에게 안전하다는 것을 의미한다. 상기 담체는 활성 성분에 대한 희석제, 비히클, 부형제, 또는 매트릭스일 수 있다. 적절한 부형제의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르보스, 만노스, 전분, 아라비아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트래거캔스 검, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽, 및 메틸셀룰로스를 포함한다. 조성물은 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 메틸 및 프로필 하이드록시벤조에이트와 같은 보존제; 감미료; 및 향미제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분의 신속, 연속 또는 지연 방출 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 조성물의 형태는 정제, 알약, 분말, 로젠지, 패킷, 트로키, 엘릭시르, 현탁액, 로션, 용액, 시럽, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 멸균된 주사 유체, 및 패키징된 분말일 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 허용되는 경로, 예컨대, 경구, 비경구(예컨대, 근육내, 정맥내, 피하, 및 복강내), 경피, 좌제, 및 비강내 방법을 통해 전달될 수 있다. 비경구 투여와 관련하여, 이는 바람직하게는 용액을 혈액에 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 글루코스와 같은 다른 물질을 포함할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 사용된다. 수용액은 필요에 따라 적절하게 완충될 수 있다(바람직하게는 3 내지 9의 pH 값으로). 멸균 조건 하에서 적절한 비경구 조성물의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약리학적 기술로 달성될 수 있고, 추가적인 창조적인 노동이 필요하지 않다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 코발트-함유 복합체는 암을 치료하기 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 치료될 암의 예는 간암(간종양), 뇌암(교모세포종), 피부암(흑색종), 폐암, 두경부암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 백혈병, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 고환암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한이 아니라 설명의 목적으로 제공된다. 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1
이전 연구는 인간 종양 세포를 수정 후 2일 배아에 주사하여 제브라피쉬 배아로 이종이식한 후, 제브라피쉬 배아에서 종양 세포의 증식 및 이동 거동이 인간 환자의 것과 유사하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 이종이식 모델을 사용하고, 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체로 배아를 처리하여 COGA의 항-증식 및 항-이동 효과를 시험하였다. 간암 환자의 최대 60%가 간암에서 텔로머라제 역전사효소(TERT) 프로모터에서 돌연변이를 발견하였다. 이러한 돌연변이는 간암 세포에서 텔로머라제의 과발현을 야기할 수 있고, 암 세포의 성장을 촉진할 수 있다. 본 발명자들은 간-특이적 tert 과발현 트랜스제닉 어류를 확립하고, qPCR을 사용하여 수정 15일 후에 tert 트랜스제닉 어류에서 세포 증식 유전자(ccne1/cdk1/cdk2)를 분석하였다. 제브라피쉬의 야생 종과 비교하여, 유의한 증가가 있었다. 또한, 간암의 형성과 밀접한 관련이 있는 β-카테닌 다운스트림 유전자(ccnd1/myca/mycb)도 유의하게 증가하였다. 따라서, 본 발명자들은 COGA가 공급된 tert 트랜스제닉 어류 HCC 모델을 사용하여 간암 억제에 있어서 COGA의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 또한 COGA의 간독성을 시험하기 위해 간 적색 형광 트랜스제닉 제브라피쉬 배아를 사용하였고, COGA의 배아 독성을 조사하기 위해 제브라피쉬 배아를 사용하였다. 본 발명자들은 COGA가 간암에 대한 효과적이고 안전한 개인 맞춤형 치료법인지 시험하기 위해 정상 간 세포와 간암 세포를 비교하였다. 또한, 본 발명자들은 COGA가 다양한 암 세포의 성장을 억제하는데 효과적인지 여부를 시험하였다.
1. 물질 및 방법
1.1 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체 및 코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체의 제조 및 구조적 결정
제조는 문헌[Yugen Zhang et al. 2003, CrystEngComm. 5(5):34-37]을 기초로 하여 수행되었다. 간략하게, L-글루타메이트(0.735 g)를 함유하는 수용액(25 ml)에 물(5 ml) 중의 Co(ClO4)2·6H2O(1.830 g)를 25℃에서 첨가하였다. 생성된 용액의 pH를 묽은 NaOH를 사용하여 7.5로 조정하고 60℃에서 몇 시간 동안 유지하여 L-글루타메이트 복합체를 제조하였다.
1 mL COGA 용액을 25℃에서 1 mL Eppendorf에 넣고, 30일 후 느린 증발에 의해 0.05 g의 적자색 결정을 수득하였다. 결정을 하기와 같이 X선 회절에 의해 분석하였다.
대략적인 치수 0.101 mm × 0.165 mm × 0.370 mm인 C5H11CoNO6의 적자색 타원-유사 시편을 X-선 결정학 분석에 사용하였다. 결정의 단결정 X-선 회절 데이터는 Mo-표적(Kα = 0.71073 Å) 마이크로포커스 X-선 발생기 및 PHOTON-II CMOS 검출기가 장착된 Bruker D8 Venture 회절계에서 사내에서 수집되었다. 온도를 질소 흐름(Oxford Cryosystems)으로 200 K로 조정하였다. 수집 후, 데이터를 좁은 프레임 알고리즘을 사용하여 Bruker SAINT 소프트웨어 패키지와 통합하고, 멀티-스캔 방법(SADABS)을 사용하여 흡수 효과에 대해 보정하였다. 이후, 분자 구조는 Bruker SHELXTL 소프트웨어 패키지에 의해 해결되고 정제되었고, 최종 이방성 전체-매트릭스 최소-제곱 방법은 화학식 단위 C5H11CoNO6에 대해 Z는 4인, 공간군 P 21 21 21(사방정계)을 사용하여, 결정 구조를 결정하기 위해 가변 파라미터로 F2에 대해 정제하기 위해 사용하였다. a = 7.12700(10) Å, b = 10.4397(3) Å, c = 11.2621(3) Å, 부피 = 837.94(3) Å3의 최종 셀 상수는 5.715° < 2θ < 66.97°로 20 σ(I) 초과의 7520개 반사의 XYZ-중심의 정제(refinement)를 기반으로 한다. 163개의 변수와 함께 F2에 대한 최종 이방성 전체-매트릭스 최소-제곱 정제는 관찰된 데이터에 대해 R1 = 2.76% 및 모든 데이터에 대해 wR2 = 7.59%로 수렴되었다. 최소 대 최대 겉보기 투과의 비율은 0.798이었다. 계산된 최소 및 최대 투과 계수(결정 크기를 기준으로 함)는 0.5180 및 0.8200이다.
COGA의 스톡 용액은 실온에서 저장된 ddH2O 중 100 mM 용액이다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 0.05 mM(50 μM)에 평형을 이루는 0.5X 작업 농도 또는 0.1 mM(100 μM)에 평형을 이루는 1X 작업 농도를 사용하였다.
코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체를 유사한 공정으로 제조하였다.
1.2 야생형 및 트랜스제닉 제브라피쉬 계통
야생형 AB 균주(WT) 제브라피쉬 및 3개의 트랜스제닉 제브라피쉬 계통, Tg(fabp10a:tert:cmlc2:GFP), Tg(fli1:EGFP), Tg(fabp10a:EGFP-mCherry)를 본 연구에 사용하였다.
내피 프로모터(endothelial promote)(flil)의 제어 하의 Tg(fli1:EGFP) 트랜스제닉 어류 발현 EGFP 단백질을 전술한 바와 같이 생성하였다(Developmental Biology 248, 307-318, doi:10.1006/dbio.2002.0711 (2002)). 간 특이적 프로모터(fabp10a)의 제어 하의 Tg(fabp10a:EGFP-mCherry) 발현 EGFP-mCherry 융합 단백질을 전술한 바와 같이 생성하였다(PLoS One 8, e76951, doi:10.1371/journal.pone.0076951 (2013)).
지방산 결합 단백질 10a(fabp10a), 텔로머라제 역전사효소(tert) 및 심장 미오신 경쇄 2(cmlc2)를 포함하는 조합 프로모터의 제어 하의 Tg(fabp10a:tert:cmlc2:GFP) 트랜스제닉 어류 발현 GFP 단백질을 전술한 바와 같이 생성하였다(Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists 236, 3088-3099, doi:10.1002/dvdy.21343 (2007)). 구체적으로, tert 유전자를 cDNA 말단의 급속 증폭(RACE)으로부터 클로닝된 제브라피쉬 tert cDNA로부터 증폭하였고, 중간 엔트리 클론(middle entry clone): p5E-fapb10a, p3E-pA, 및 pDEST-Tol2-CG2와 함께 LR 반응에 의해 발현 작제물을 생성하는 데 사용된 pME-tert를 생산하였다. 발현 플라스미드-pTol2-fabp10a-tert-pA/CG2를 정제하고, 시퀀싱을 확인한 후 AB 야생형 제브라피쉬에 미세주사하였다. 수정 후 3일(dpf)에 심장에서 녹색 형광 단백질 발현을 스크리닝함으로써 트랜스진을 보유하는 배아를 선택하였다. 트랜스제닉 어류를 성적 성숙(sexual mature)으로 키우고(약 3개월), AB 야생형 어류와 교배하여 F1 어류를 생성한 다음, 자가 교배하여 F2 트랜스제닉 어류를 수득하였다. 본 발명자들은 모든 트랜스제닉 어류가 tert DNA 삽입을 갖고 qPCR에 의해 tert mRNA를 과발현하도록 하기 위해 핀-클립(fin-clip) 방법을 사용하였다. 본 연구의 모든 실험을 F2 동형접합성 어류를 사용하여 수행하였다.
제브라피쉬(Danio rerio)를 NTHU-NHRI(ZeTH)의 제브라피쉬 코어 시설(Zebrafish Core Facility)에서 유지하였다. 제브라피쉬를 제브라피쉬 코어 시설에서 연속 흐름 하에 14시간 명/10시간 암 주기의 자동 제어와 함께 28℃에서 인큐베이션하였다. 모든 제브라피쉬 실험을 NHRI의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인 하에 수행하였다.
1.3 배아 수집 및 배아 독성 시험
수정 1일 전에, 수컷 및 암컷 성체 AB(WT) 및 tert 트랜스제닉 제브라피쉬를 내부 메시를 갖는 교배 탱크에 개별적으로 넣었다. 수컷 및 암컷 어류를 분리기에 의해 분리하고 짝짓기 케이지에 밤새 방치하였다. 분리기를 제거한 다음 날 아침, 제브라피쉬를 빛에 의해 자극시켰고, 수컷이 암컷을 쫓기 시작하였고 정자는 난자를 수정시켰다. 1시간 후, 배아를 수집하고 28℃에서 인큐베이션된 E3 용액(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7.0)을 갖는 100-mm 디쉬(dish)로 옮겼다. 16 내지 22 hpf에서, 배아를 0.0016% 표백제 용액으로 세척하여 배아를 세정하고 이의 생존율을 개선시켰다. 수정되지 않은 배아 및 죽은 배아를 수정 6시간 후에 제거하고, 나머지 살아있는 배아에 신선한 E3 용액을 보충하고 인큐베이션을 위해 유지하였다.
1.4 섭식 프로토콜 및 COGA 처리
50마리의 제브라피쉬 유충을 800 ml의 시스템 물(system water)을 갖는 어항에 넣고, 물을 매일 오후 4시에 다시 채웠다. 5일부터 15일까지, AB(WT) 및 tert 트랜스제닉 제브라피쉬에 정상 유충 사료 및 20 ml의 파라메시움(Paramecium)을 공급하였고, 식사(하루에 4회 식사) 사이는 2시간이어야 한다. 마지막 식사는 물을 교체하기 1시간 후에 공급되어야 한다. 제브라피쉬 유충을 25 ml의 깨끗한 E3 물(대조군) 또는 E3 물 중 0.5X COGA를 함유하는 페트리 디쉬에 넣고, 유충을 다음날 아침 9시까지 밤새 약물에 담그고, 이후 어류를 시스템 물용 800 ml의 어항으로 이동시켰다. RNA 추출 및 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 위한 샘플을 수집하기 전에 어류를 하루 동안 금식시켰다.
1.5 간 조직 수집 및 파라핀 섹션
RO 주사 1개월 후, 어류를 희생시키고, 간을 꺼내어 RNA 단리 및 파라핀 섹션을 위해 두 부분으로 나누었다. 간 조직을 섹션화 직후 액체 질소에서 동결시키고, 후속 RNA 단리를 위해 -80℃에서 저장하였다. 조직화학 분석을 위해, 간 조직을 10% 포르말린 용액(Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)에 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 포매하고, 5-㎛ 두께로 섹션화하여 폴리-L-리신 코팅된 슬라이드에 장착하고, 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였고(H&E 염색), 이러한 부분을 병리학 코어 시설에 의해 수행하였다.
1.6 총 RNA 단리
총 RNA를 NucleoSpin® RNA 키트(MACHEREY-NAGEL, USA)에 의해 단리하였다. 약 30 mg의 조직을 수집하고, 350 ㎕ 완충제 RA1 및 3.5 ㎕ β-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich, USA) 혼합물에 넣었고, 이러한 단계에서 샘플을 -80℃에서 저장할 수 있다. RNA 단리 시에, 샘플을 실온에서 천천히 해동시킨 다음, 막자(pestle)에 의해 파괴하여 조직을 용해시켰다. 용해물을 11000 g에서 1분 동안 원심분리하여 NucleoSpin® Filter(보라색 고리)로 여과하여 점도를 감소시키고 용해물을 제거하였다. 원심분리 후, 여액에 DEPC 물(디에틸 피로카보네이트 물)에 의해 제조된 350 ㎕의 70% 에탄올을 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 용해물을 NucleoSpin® RNA 컬럼(밝은 청색 고리)에 로딩하고 11000 g에서 30초 동안 원심분리하였다. 이후, 350 ㎕의 멤브레인 탈염 완충제를 컬럼에 첨가하고, 11000 g에서 1분 동안 원심분리하였다.
각 컬럼에 10% RNase-비함유 DNase 및 DNase용 90% 반응 완충제를 함유하는 95 ㎕의 DNase 반응 혼합물을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 놓아서 게놈 DNA를 소화하였다. DNase 소화 후, DNase를 불활성화시키기 위해 200 ㎕ 완충제 RAW2를 컬럼에 첨가하고, 11000 g에서 30초 동안 원심분리하였다. 이후, RNA를 함유하는 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브로 옮기고, 600 ㎕ 및 250 ㎕ 완충제 RA3을 순차적으로 첨가한 다음, 11000 g에서 30초 및 2분 동안 원심분리하여 RNA 샘플을 2회 세정하였다. 마지막으로, 컬럼을 RNase가 없는 새로운 1.5 ml 튜브로 옮기고 40 ㎕ RNase-비함유 H2O에서 RNA 샘플을 용리시킨 다음, 11000 g에서 1분 동안 원심분리하였다. 모든 RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
1.7 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)
상보적 DNA(cDNA)를 High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems, USA)에 의해 합성하였다.
역전사(RT) 반응 혼합물은 하기와 같다:
2X RT 완충제
10 ㎕
20X 효소 믹스
1 ㎕
RNA 샘플
1 ㎍
RNase-비함유 H2O
20 ㎕까지 보충하는 양
총 부피
20 ㎕
PCR 기계에서 열 순환 프로그램의 역전사를 하기와 같이 설정하였다: RT 반응을 시작하기 위해 60분 동안 37℃ → 효소 활성을 불활성화시키기 위해 5분 동안 95℃ → 보존을 위해 4℃. 장기 저장을 위해, 본 발명자는 샘플을 -20℃ 냉동고에 넣었다.
1.8 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(Q-PCR)
RT가 완료된 후, RNase가 없는 물로 cDNA를 100X로 희석하였다. 각 샘플에 대해, 하기 반응 혼합물을 384-웰 Q-PCR 플레이트의 하나의 웰에 첨가하였다:
정량적 실시간 PCR 반응 혼합물:
cDNA(RNase가 없는 물로 희석됨)
3.8 ㎕
프라이머 믹스(정방향 및 역방향) 2.5 μM
1.2 ㎕
2x SybrGreen 믹스
5.0 ㎕
합계
10.0 ㎕
2x SybrGreen은 감광성이기 때문에 이를 마지막에 첨가하였다. Q-PCR 프로그램을 ABI HT-7900 기계에서 하기와 같이 설정하였다:
1. 스테이지 I: 50℃ - 2분, 95℃ - 5분, 4℃ - 오랜 시간.
2. 스테이지 II: 95℃ - 10분
3. 스테이지 III(40 주기): 95℃ - 15초
60℃ - 1분
4. 스테이지 IV: 95℃ - 15초
60℃ - 15초
95℃ - 15초
생성된 제1-가닥 cDNA를 ABI PRISM 7900 시스템을 사용하는 SYBR Green Q-PCR 마스터 믹스 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 정성적 PCR을 위한 주형으로 3회 사용하였다. 내부 대조군 액틴으로 표준화한 후, 비교용 Ct 방법을 사용하여 실험군과 대조군 사이의 발현 비율을 계산하였다. 상대 발현 비율(배수 변화)을 △△Ct, △△Ct = (Ct표적 - Ct액틴)처리 - (Ct표적 - Ct액틴)대조군, 및 배수 변화 = 2-△△Ct에 기초하여 계산하였다. 모든 실험을 3회 수행하였고, 3개 값의 평균 값을 제시하였다. 적어도 3개의 독립적인 샘플을 Q-PCR에 사용하였고, 표준 오차를 계산하여 제시된 데이터에 중간값 ± 표준 오차로 포함시켰다. 변수 간의 차이를 양측 스튜던트 t 검정에 의해 평가하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었고 하기와 같이 표시된다: *: 0.01 < P ≤ 0.05; **: 0.001 < P ≤ 0.01; 및 ***: P ≤ 0.001.
1.9 제브라피쉬에서 세포 증식 및 이동을 조사하기 위한 이종이식 검정
AB(WT) 제브라피쉬의 수정란을 28℃에서 E3/PTU 용액 중에서 인큐베이션하고 표준 제브라피쉬 실험실 조건 하에 키웠다. 수정 후 2일의 제브라피쉬 배아를 미세주입 전에 탈융모막 제거하고 0.016% 트리카인(MS-222)으로 마취시켰다. PBS에서 수집된 293T/EDN1 세포를 시험관내에서 CM-Dil(적색 형광)(Vybrant; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 표지하였다. 각 주입 부피는 약 200개의 세포를 함유하는 4.6 nl이었고, Nanoject IITM 나노리터 주입기(Drummond Scientific)를 사용하여 유리 모세관을 통해 2 dpf 제브라피쉬 배아의 각 난황에 이식되었다. 주사 후, 제브라피쉬 배아를 E3/PTU 용액으로 1회 세척하고, 28℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이식 2시간 후에 형광 세포의 존재를 확인하였다. 이식 24시간 후, 제브라피쉬를 0.5X COGA로 처리하고, 형광 현미경(LEICA DM IRB)을 사용하여 3 내지 5일 후에 세포 증식 및 이동 능력을 관찰하였다.
1.10 간독성 검정
EGFP-mCherry 배아 수집 및 인큐베이션 조건은 상기와 같이 언급되었다. 약 3 dpf, 50개의 배아를 5 dpf가 될 때까지 6-웰 플레이트에서 10 ml 화학 용액/웰(화학물질/E3 용액)에 분배하고 새로운 화학 용액을 매일 보충하였다. 5 dpf에서, 배아를 트리카인(0.016%)으로 마취시키고, 웰 당 무작위로 8 내지 10개의 배아의 이미지를 ZEISS AxioCam MRc로 촬영하였다. 3개의 상이한 이미지가 존재하는데, 하나의 이미지는 가장 선명한 시야를 위한 자동 노출 시간을 갖는 이미지이고, 하나의 이미지는 강도 측정 및 비교를 위해 포화 미만의 RFP(적색 형광 단백질) 강도를 포착하기 위한 고정 노출 시간이고, 마지막 하나는 크기 측정을 위한 전체 간 영역을 나타내기 위한 충분한 실시간이다. 이후, 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 RFP의 강도 및 간 크기를 정량화하였다. 간에서 평균 RFP 강도를 계산하고 동일한 배율 및 고정 노출-시간 하에 측면도 프라이(lateral view fry)의 동일한 그룹 내에서 비교하였다.
1.11 통계적 분석
결과의 통계적 분석을 양측 스튜던트 t 검정을 사용하여 수행하였다. 모든 통계적 분석에서, p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었고, 하기와 같이 표시된다: *: 0.01 < P ≤ 0.05; **: 0.001 < P ≤ 0.01; 및 ***: P ≤ 0.001.
1.12 세포 증식 검정 I
U-87 MG 세포(인간 원발성 아교모세포종 세포주)를 MEM 배지(Gibco, New York, NY, USA)에서 배양하였다. A375 세포(인간 흑색종 세포주) 및 Huh7 세포(인간 간세포 암종(HCC) 세포주)를 DMEM 배지(HyClone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 배양 배지에 10% 열-불활성화된 우태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타메이트(HyClone, Logan, UT, USA)를 보충하였다. 세포를 2000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후, 세포를 37℃ 인큐베이터로 옮겼다. 24시간 후, 세포를 지시된 농도의 COGA로 72시간 동안 처리하였다. 인큐베이션 종료시, PrestoBlue™ 세포 생존율 시약(Invitrogen, Eugene, OR, USA)을 세포에 분배하였다. 플레이트를 가습된 5% CO2 분위기 중, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 형광을 Ex/Em: 560 nm / 590 nm에서 기록하였다. 3회 실험을 수행하였다.
1.13 세포 증식 검정 II
인간 폐암 세포주 NCI-H226은 미국 세포주 은행(American type culture collection)(에서 구입하였다CRL-5826). NCI-H226을 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 10% FBS가 보충된 RPMI에서 성장시켰다. 인간 흑색종 세포주 A375, 인간 인두 편평 세포 암종 FaDu, 인간 자궁 경부 상피양 암종 HeLa 및 인간 만성 골수성 백혈병 K-562를 Bioresource Collection and Research Center(BCRC), Hsinchu 300, Taiwan에서 구입하였다. A375 세포를 37℃에서 가습 대기 5% CO2에서 10% FBS가 보충된 DMEM에서 성장시켰다. FaDu 세포를 37℃에서 가습 대기 5% CO2에서 10% FBS가 보충된 DMEM에서 성장시켰다. HeLa 세포를 37℃에서 가습 대기 5% CO2에서 10% FBS가 보충된 DMEM에서 성장시켰다. K-562 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 10% FBS가 보충된 IMDM에서 성장시켰다. U87 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 10% FBS가 보충된 EMEM에서 성장시켰다.
COGA 화합물을 ddH2O 중 100 mM 스톡 용액으로 제조하고, 사용하지 않을 때 실온(RT)에서 저장하였다. COGA 100 mM 스톡 용액을 세포 시딩 24h 후에 적절한 작업 농도로 희석하였다. 화합물의 최고 작업 농도를 100 mM 스톡 용액 ddH2O에서 설정하였다. 이러한 최고 작업 농도로부터, ddH2O로 7개 지점에 대한 연속 3-배수 희석을 수행한 다음, 배양 배지로 5X 추가로 희석하였다. 8개 농도 모두는 필요한 최종 농도의 2배였다. 100 ㎕의 희석액을 100 ㎕의 배지를 함유하는 웰에 첨가하였다. 배경 대조군 샘플로서 세포를 첨가하지 않고 동일한 일련의 희석액을 제조하였다. 최종 농도는 10 mM 내지 0.00457 mM의 범위였다. 최종 ddH2O 농도는 10%였다.
지수 성장된 세포를 수확하고 배양 배지에 재현탁시켰다. 현탁된 세포를 웰 당 최적화된 세포 수로 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 37℃, 5% CO2 가습 대기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 희석된 화합물 용액을 함유하는 배양 배지의 분취량(통상적으로 100 ㎕)을 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 첨가하였다. 양성 대조군(비히클 대조군)에 대한 세포를 배양 배지 중 10% ddH2O로 처리하였다. 각각의 희석된 화합물 용액을 3회 시험하였다. 플레이트를 가습 대기 하에 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 생존력을 Cell Titer 96 수성 비-방사성 세포 증식 검정(Promega)에 의해 조사하였다. MTS를 수성, 가용성 포르마잔으로 전환시킴으로써 살아있는 세포를 검출할 수 있었다.
MTS/PMS 용액을 새로 제조하고 96-웰 배양된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다(웰 당 20 ㎕). 검정 플레이트를 가습 대기 하에 37℃, 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션하고, Multiskan™ GO 마이크로플레이트 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
모든 다른 흡광도 값으로부터 음성 대조군 웰(배지만, 배경 대조군으로서 세포 없음)의 평균 490 nm 흡광도를 빼서 보정된 흡광도 값을 얻었다. 화합물 처리에 대한 세포 성장의 억제 백분율을 하기 수학식을 사용하여 계산하였다:
% 억제 = 100% ×{1-[(처리된 웰의 흡광도 - 음성 대조군 웰의 흡광도)/(양성 대조군 웰의 흡광도 - 음성 대조군 웰의 흡광도)]}.
GraphPad Prism 소프트웨어(v.5.0)를 사용하여 화합물 농도의 로그의 함수로서 억제 백분율 값을 피팅함으로써 S자형 용량-반응 곡선을 생성하였다. IC50 값은 세포 성장의 50% 억제에 필요한 농도로 정의된다. 시험을 2회 동안 삼중으로 수행하였다.
2. 결과
2.1 COGA 및 COAA
COGA 및 COAA 용액을 제조하고 결정을 수득하고 X선 회절에 의해 분석하였다. X선 회절의 데이터는 하기와 같다.
COGA
COAA
2.2 COGA 처리에 대해 유사한 강도를 갖는 tert 배아를 선택하고 배아 독성에 기반한 투여량 확인
48 hpf에서, 형광 현미경을 사용하여 tert 트랜스제닉 제브라피쉬 배아를 관찰하였고(도 1), 심장에서 발현된 유사한 강도의 녹색 형광을 갖는 배아를 추가 처리를 위해 수집하였다. 본 발명자들은 이들이 강한 트랜스진(tert) 발현을 갖는지 확인하기 위한 추가 실험을 위해 중간 및 강한 형광 강도를 갖는 배아를 선택한다.
배아 독성 시험 실험을 통해, 본 발명자들은 제브라피쉬 배아가 0.01X(1 μM) 내지 20X(2000 μM)의 농도로 침지되었음을 발견하였다. 결과는 도 2에 도시되어 있다. 배아의 사망률은 0.01X(1 μM), 0.1X(10 μM) 및 1X(100 μM)가 가장 낮으므로, 본 발명자들은 추가 실험을 위해 0.5X(50 μM) 농도의 COGA를 선택한다.
2.3 tert 과발현 제브라피쉬는 15 dpf에서 세포 증식을 유도하고 β-카테닌 다운스트림 표적을 활성화시킬 수 있다
간에서 tert 과발현의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 먼저 WT 유충과 비교하여 정상 식이 하에 수정 후 15일에 tert 트랜스제닉 어류를 조사하였다(도 3a). 비정상적인 증식은 암의 특징 중 하나이다48. HCC의 개시는 E-타입 사이클린 E1(CcnE1) 및 사이클린-의존성 키나제 2(Cdk2)에 의존적이다49. Ccne1 과발현은 마우스에서 간 종양 발달을 일으켰고50, Cdk2는 간세포에서 세포 주기 진행에서 중요한 역할을 하고51, 사이클린-의존성 키나제 1(Cdk1)은 간암의 세포 분열에 필수적이다52. 따라서, 본 발명자들은 qPCR에 의한 세포 주기/증식에 대한 마커로서 ccne1, cdk1, 및 cdk2에 대한 발현 수준을 조사하였다. 세포 주기/증식 마커(ccne1/cdk1/cdk2)의 발현은 15 dpf에서 WT 어류와 비교하여 유의하게 증가하였다(도 3b 내지 도 3d). 이러한 결과는 간세포에서 tert의 과발현이 세포 증식을 촉진할 수 있음을 나타내었다.
이전 연구는 β-카테닌이 HCC 발달에 관여하는 주요 종양유전자 중 하나이며53, 재활성화된 TERT가 Wnt/β-카테닌 신호전달의 전사 조절제로서 작용하여 β-카테닌 다운스트림 표적 유전자의 발현을 향상시킨다는 것을 확인하였다54. 따라서, 본 발명자들은 15 dpf tert 트랜스제닉 어류에서 β-카테닌 다운스트림 표적 유전자(ccnd1/myca/mycb)의 발현 수준을 조사하였다. 본 발명자들의 결과로부터, 이러한 β-카테닌 다운스트림 표적 유전자는 또한 야생형 어류와 비교하여 tert 트랜스제닉 어류에서 유의하게 상향조절되었다(도 3e 내지 도 3g). 이러한 결과는 tert 과발현이 세포 증식의 상향조절을 유도하고 β-카테닌 신호전달 경로를 활성화시킴을 나타내었다.
2.4 tert 과발현은 15 dpf에서 제브라피쉬에서 유사분열상 및 삼핵 세포를 유의하게 증가시켰다
본 발명의 발견을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 H&E 염색에 의한 조직병리학 검사를 사용하였다. H&E 염색 분석(도 4)에서, 본 발명자들은 트랜스제닉 어류 간 조직에서 유사분열상 및 삼핵 세포의 비율이 WT와 비교하여 유의하게 증가하였음을 밝혔다55(도 4). qPCR 결과와 함께, 이러한 결과는 tert 트랜스제닉 어류가 제브라피쉬 유충에서 초기 발달 스테이지에서 발암을 유도하였음을 나타내었다.
2.5 COGA는 tert 과발현에 의해 유도된 HCC에 대한 항-HCC 효과를 나타낸다
본 발명자들은 0.5X(50 μM) COGA의 유무에 관계없이 15일 동안 정상 식이와 함께 야생형 및 tert 트랜스제닉 제브라피쉬를 공급하고, 세포 증식 마커(ccne1, cdk1, cdk2), 및 베타-카테닌 다운스트림 표적 유전자(myca, mycb, ccnd1)의 발현을 분석하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 약물 처리가 없는 tert 트랜스제닉 제브라피쉬의 유전자 발현은 일반적으로 더 높다. 대조적으로, COGA로 처리된 TERT 제브라피쉬의 유전자 발현은 세포 증식 마커 및 베타-카테닌 다운스트림 표적 유전자의 발현을 유의하게 감소시켰다. 따라서, COGA는 tert 트랜스제닉 제브라피쉬에서 간암을 억제하는 효과적인 약물인 것이 제안된다.
2.6 COGA 처리는 15 dpf에서 tert 제브라피쉬에서 유사분열상 및 삼핵 세포를 유의하게 감소시켰다
H&E 염색은 주로 간세포가 발암을 겪는 것을 나타내는 유사분열상, 삼핵 세포, 및 거대핵 세포의 상태를 관찰하기 위한 것이다. 하기 도 8은 제브라피쉬 간 세포의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색의 본 발명자들의 분석 결과를 보여준다. 도 6에 도시된 바와 같이, tert 트랜스제닉 제브라피쉬는 WT와 비교하여 높은 비율의 유사분열상, 삼핵 세포, 및 거대핵 세포를 갖는다. COGA 처리는 tert 트랜스제닉 제브라피쉬에서 유사분열상, 삼핵 세포, 및 거대핵 세포의 수를 WT 제브라피쉬와 유사한 것들로 유의하게 감소시켰다.
2.7 COGA 처리는 간독성을 갖지 않는다
Gong의 연구실은 제브라피쉬 배아를 사용하여 생체내 간독성 검정을 개발하였다43. COGA가 제브라피쉬 간에 독성을 갖는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 지시제로서 간에서 녹색 및 적색 형광을 나타내는 3 dpf Tg(fabp10a:EGFP-mCherry) 배아를 사용하였고, 1% DMSO, 1X(100 μM) COGA, 및 10 μM 소라페닙으로 별도로 처리하였다. 이미지를 Image J 소프트웨어로 분석하였다. 본 발명자들은 DMSO 처리된 대조군과 비교하여, 소라페닙이 간 크기를 유의하게 감소시키는 것을 발견하였고, 10 μM의 소라페닙이 간 독성이 있을 수 있음을 시사하였다(도 7). 그러나, 본 발명자들은 100 μM COGA 처리가 간 크기로 표현된 바와 같이 DMSO 대조군과 유사하게 간 독성을 갖지 않는다는 것을 발견하였다.
2.8 이종이식 모델에서 COGA는 세포 증식을 감소시켰다
이종이식을 사용하여, 본 발명자들은 제브라피쉬 배아에 Hep3B 간종양 세포를 주사하였고, COGA 및 소라페닙으로 2일 동안 처리하였고, 약물 처리 후 세포 증식 변화를 측정하였다(도 8). 본 발명자들은 0.5X(50 μM) COGA 및 1X(100 μM) COGA 둘 모두가 DMSO 처리에 비해 간종양 세포 증식을 유의하게 감소시켰다는 것을 발견하였다.
2.9 COGA 처리는 다양한 암 세포에서 세포 증식을 감소시켰다
결과는 표 1 내지 표 3에 제시되어 있다. COGA 처리는 A375, Huh7, 및 U-87 MG 세포 생존을 감소시켰다. COGA로 처리된 A375, Huh7, 및 U-87 MG 세포는 각각 68.7±15.8, 286.6±61.8, 및 10,000 nM 초과의 IC50 값을 나타내었다.
표 1. A375 세포의 생존에 대한 COGA의 효과에 대한 데이터가 제시되었다.
표 2. Huh7 세포의 생존에 대한 COGA의 효과에 대한 데이터가 제시되었다.
표 3. U-87 MG 세포의 생존에 대한 COGA의 효과에 대한 데이터가 제시되었다.
NCI-H226(폐 암종 세포)에 대한 COGA의 항-증식 검정을 MTS(Promega) 비색 검정을 사용하여 처리 72시간 후에 결정하였다. 약물 처리를 웰에서 3중으로 수행하였고, 실험을 2회 반복하였다. 시험된 화합물의 50% 억제 농도(IC50)를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 도 9에 도시된 바와 같은 각 실험의 용량-반응 곡선은 COGA에 의한 NCI-H226 세포 증식의 농도 의존적 억제를 입증한다. 결과는 COGA가 0.045 mM의 평균 IC50 값으로 NCI-H226 세포 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
표 4. A375, FaDu, HeLa, K-562, NCI-H226 및 U87 세포에 대한 약물 처리의 추정된 IC50 및 평균 IC50 값.
추정된 IC50 값은 각 실험에서 약물 농도의 로그 함수로서 세포 증식 비율(%)의 용량-반응 곡선의 비선형 회귀에 기초하여 계산되었다. 평균 IC50 데이터는 2 내지 3회의 실험으로부터 평균 ± SD 값으로 표현된다.
결과는 COGA가 A375, FaDu, HeLa, K-562, NCI-H226 및 U87 세포 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
3. 결론
본 발명자들의 실험은 산성 산 아미노, 예를 들어, COGA를 갖는 코발트-함유 복합체가 간독성 및 배아 독성을 갖지 않음을 입증한다. 코발트-함유 복합체는 tert 트랜스제닉 어류 및 이종이식 모델에서 강력한 항-간암 효과를 나타낸다. 이는 또한 교모세포종 세포, 흑색종 세포, 간세포 암종 세포, 폐암 세포, 인두 편평 암종 세포, 자궁경부 상피양 암종 세포 및 백혈병 세포를 포함하는 다양한 암 세포에서 항-증식 활성을 나타낸다.
Claims (18)
- 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 산성 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 산성 아미노산이 글루탐산(GA) 및 아스파르트산(AA)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 복합체가 코발트-함유 글루탐산(COGA) 복합체 또는 코발트-함유 아스파르트산(COAA) 복합체인, 방법.
- 제3항에 있어서, COGA 복합체가 하기 화학식 I로 표현되고/되거나; COAA 복합체가 하기 화학식 II로 표현되는, 방법:
[화학식 I]
[화학식 II]
. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 결정 형태인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 폐암, 두경부암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 백혈병, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 고환암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 암 세포의 증식을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 암 세포에서 myca, mycb, cdk1, cdk2, ccnd1 및/또는 ccne1의 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
- 암을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 산성 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체의 용도.
- 제9항에 있어서, 복합체가 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 용도.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 폐암, 두경부암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 백혈병, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 고환암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 암 세포의 증식을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 용도.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 암 세포에서 myca, mycb, cdk1, cdk2, ccnd1 및/또는 ccne1의 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 용도.
- 유효량의 산성 아미노산을 갖는 코발트-함유 복합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 복합체가 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 약학적 조성물.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 폐암, 두경부암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 백혈병, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 고환암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 암 세포의 증식을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 약학적 조성물.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 암 세포에서 myca, mycb, cdk1, cdk2, ccnd1 및/또는 ccne1의 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 투여되는, 약학적 조성물.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20240419 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application |