KR20240087518A

KR20240087518A - 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법

Info

Publication number: KR20240087518A
Application number: KR1020230070361A
Authority: KR
Inventors: 류기현; 송은경; 이혜민
Original assignee: 서울여자대학교 산학협력단
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2023-05-31
Publication date: 2024-06-19

Abstract

본 발명은 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 식물바이러스 불활성화 효과뿐만 아니나, 보호 효과도 있어 식물바이러스를 친환경적으로 방제 또는 예방할 수 있는, 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법에 관한 것이다.

Description

카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법{Composition for controlling plant viruses comprising caffeic acid, and method for controlling plant viruses using the same}

본 발명은 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법에 관한 것이다.

바이러스는 비세포로 구성되어 있고, 세포 내의 전사 및 번역 기작에 의존하여 물질대사를 하는 기생생물체이다. 특히 바이러스는 기주 세포 (host cell)와 세포 과정 (cellular porcess)를 공유하기 때문에 바이러스의 기능만 저해하는데 어려움이 따른다 (Yanmei et al., 2007).

식물바이러스는 식물 세포를 감염시키는 바이러스를 의미하며 1890년대에 그 존재가 처음 밝혀졌다. 2022년도 기준으로 3,206종이 보고되고 있으며, 그 중 일부 바이러스들에 의해 주요 작물들의 생산량 및 품질의 저하로 연간 100억 달러 이상의 경제적 손실을 일으키고 있다 (Wang et al., 2022; http://47.90.94.155/PlantVirusBase/#/home). 이러한 주요 작물들에서 바이러스 병 피해를 막기 위해 항바이러스제 개발을 진행하고 있으며, 자연 유래 추출물 및 antofines, phenanthroindolizidines, quassinoids, limmonoids, tylophorine, B-carboline alkaloids 등 화합물등이 담배모자이크바이러스에 일부 효과가 있는 것으로 보고되고 있다 (An et al., 2001; Ge et al., 2012; Song et al., 2014; Wang et al., 2010; Wang et al., 2012; Yan et al., 2010.).

또한 아담자에서 분리된 quassinoid과 trichodermin, trichoderminol에서 고추모틀바이러스에 대한 항바이러스 효과가 있음을 보고하였다 (Ryu et al., 2017a; Ryu et al., 2017b).

최근에는 ferulic acid-eugenol과 isoeugenol 화?d물이 담배모자이크바이러스와 오이모자이크바이러스에 일부 효과가 있음을 보고하였다 (Gan et al., 2021).

하지만 상기 물질들의 대부분은 부분 병반 (local lesion)만 보이는 담배모자이크바이러스를 대상으로 항바이러스 활성을 확인한 것에 불가해 항바이러스제 개발 적용에는 한계가 있다.

한국등록특허 제 10-0882194 호 한국등록특허 제 10-0831645 호 한국등록특허 제 10-0347651 호 한국공개특허 제 10-2008-0015769 호 한국공개특허 제 10-2001-0005603 호 한국공개특허 제 10-2000-0010847 호 한국공개특허 제 10-2017-0005110 호

An, T., Huang, R., Yang, Z., Zhang, D., Li, G., Yao, Y., Gao, J. 2001. Alkaloids from Cynanchum komarovii with inhibitory activity against the tobacco mosaic virus. Phytochemistry 58; 1267-1269. Gan, X.., Wang, Z., Hu, D. 2021. Synthesis of novel aniviral ferulic acid-eugenol and isoeugenol hybrids using various link reactions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 69:13724-13733. Ge, Y., Liu, K., Zhang, J., Mu, S., Hao, X. 2012. The limonoids and their antitobacco mosaic virus (TMV) activities from Munronia unifoliolata Oliv. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: 4289-4295 Li, Y., Wang, L., Li, S., Hao, X. 2007. Seco-pregnane steroids target the subgenomic RNA of alphavirus-like RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unitied Sates of America 104:8083-8088. Ryu, S.M., Lee, H.M, Song, E.G., Seo, Y.H., Lee, J., Guo, Y., Seok, Kim, B.S., Kim, J., Hong, J.S., Ryu, K.H., Lee, D. 2017a. Journal of Agricultural and Food Chemistry 65:4273-4279. Ryu, S.M., Kwon, J., Seo, Y.H., Song, E.G., Hong, S.S. Kim, B.S., Hong, J.S., Ryu, K.H., Lee, D. 2017b. Quassinoids isolated from Brucea javanica inhibit pepper mottle virusin pepper. Virus Research 227:49-56. Song, H., Liu, Y., Liu, Y., Wang, L., Wang, Q. 2014. Synthesis and antiviral and fungicidal activity evaluation of β-carboline, dihydro-β-carboline, tetrahydro-β-carboline alkaloids, and their derivatives. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62: 1010-1018. Wang, J. Hao, K., Yu, F., Shen, L., Wang, F., Yang, J., Su, C. 2022. Field application of nanoliposomes delivered quercetin by inhibiting specific hsp70 gene expression against plant virus disease. Journal of Nanobiotechnology 20:16. Wang, K., Hu, Y., Liu, Y., Mi, N., Fan, Z., Liu, Y., Wang, Q. 2010. Design, synthesis, and antiviral evaluation of phenanthrene-based tylophorine derivatives as potential antiviral agents. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58: 12337-12342. Wang, Z., Wei, P., Wang, L., Wang, Q. 2012. Design, synthesis, and antitobacco mosaic virus (TMV) activity of phenanthroindolizidines and their analogues. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: 10212-10219. Yan, X., Chen, J., Di, Y., Fang, X., Dong, J., Sang, P., Wang, Y., He, H. P., Zhang, Z., Hao, X. 2010. Anti-tobacco mosaic virus (TMV) quassinoids from Brucea javanica (L.) Merr. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58: 1572-1577.

본 발명자들은 카페산을 이용하여 바이러스에 감염된 식물에서 저항성 효과를 검정하였고, 카페산이 식물바이러스에 대한 항바이러스 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물로 식물바이러스 방제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기한 과제 해결을 위하여 본 발명은 하기와 같은 과제의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 식물바이러스 방제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 카페산(Caffeic acid)을 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV), 고추모틀바이러스(PepMoV), 오이모자이크바이러스, (CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저바이러스(TSWV), 딸기바이러스(SMoV) 또는 선인장X바이러스(CVX) 인, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 식물바이러스는 고추모틀바이러스(PepMoV) 인, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 용액 형태이며, 상기 카페산은 상기 용액에 대하여 7mM 이상 포함되는, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 용액의 용매는 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 메탄올, 1-프로파놀, 2-프로파놀, 설포 부틸 에테르 베타 시클로 덱스트린 (Sulfobutylether-β-Cyclodextrin, SBE-β-CD) 및 다이메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 선택된 유기용매인, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 카페산은 유기 합성된 카페산 혹은 천연 식물에서 추출된 카페산인, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 항바이러스 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 농약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 식물바이러스 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면에 있어서, 상기 처리하는 단계는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리, 또는 농기구 처리를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 식물바이러스 방제용 조성물은 카페산을 유효성분으로 포함하여, 식물바이러스에 대한 또는 고추모틀바이러스에 대한 방제용도의 신규한 효과가 있다.

본 발명은 환경 친화적인 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산에 활용될 수 있다.

본 발명은 카페산이라는 천연물을 기반으로 한 것으로 유효성분의 대량생산이 용이하며, 식물체에 피해를 주지 않는 안전한 물질을 이용한 환경 친화적인 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산 등, 농업분야에서 댜양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 담배에서 카페산 (caffeic acid)를 대상으로 불활성화 효과 검정결과이다.
도 2는 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR과 western blot 분석 (7 dpi). A, 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR 결과. B, 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 western blot 결과. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 20 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 2: 10 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 3: 5 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 4: 2.5 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 5: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 담배의 상엽 (positive control), 6: DMSO만 접종된 담배의 상엽 (negative control).
도 3은 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR과 western blot 분석 (14 dpi). A, 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR 결과. B, 담배에서 카페산을 대상으로 불활성화 효과 검정을 위한 western blot 결과. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 20 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 2: 10 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 3: 5 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 4: 2.5 mM 카페산과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 담배의 상엽, 5: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 담배의 상엽 (positive control), 6: DMSO만 접종된 담배의 상엽 (negative control).
도 4는 담배에서 카페산을 대상으로 CMV에 대한 불활성화 효과 검정 결과이다.
도 5는 담배에서 카페산을 대상으로 CMV 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR과 western blot 분석 (7, 14 dpi). A, 담배에서 카페산을 대상으로 CMV 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR 결과. B, 담배에서 카페산을 대상으로 CMV 불활성화 효과 검정을 위한 western blot 결과. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 20 mM 카페산과 CMV를 함께 접종한 담배, 2: 10 mM 카페산과 CMV를 함께 접종한 담배, 3: 5 mM 카페산과 CMV를 함께 접종한 담배, 4: 2.5 mM 카페산과 CMV를 함께 접종한 담배, 5: CMV만 접종된 담배 (positive control), 6: DMSO만 접종된 담배 (negative control).

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 카페산은 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있어, 식물바이러스에 의해 발생하는 식물바이러스병 방제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 상세히 설명한다.

카페익산은 화학식이 C₉H₈O₄이고 분자량은 180.16이다. 석탄산(phenolic) 화합물에 포함되며, 뜨거운 물과 알코올에 용해하기 쉬운 노란색 결정체이다. 두 개의 수산기를 가지고 있으며, 계피산과 관계가 있다. 카페익산과 계피산은 탄소가 순환하는 카르복시산 그룹의 한 부분이며, 카페인(Caffeine)과는 다른 화합물이다. 식품에 따라 용량은 많이 다르지만 커피콩을 포함한 배(Pear)와 같은 과일과 바질(Basil), 타임(Thyme), 버베나(Verbena), 타라곤(Tarragon), 오레가노(Oregano), 터머릭(Turmeric), 곽향초석잠(Wood Betony), 로즈마리(Rosemary), 민들레 같은 약용식물 및 채소에 포함되어 있다. 카페익산은 발암억제제로서 작용하고, 생체 안과 밖에서 항산화제로서 알려져 있으며 다른 항산화제보다 효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 또한 카페익산은 95%이상 아플라톡신(aflatoxin)의 생산을 줄여줄 뿐만 아니라, 산화 스트레스를 유발하는 것을 방지할 수 있다

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 용액 형태이며, 상기 카페산은 상기 용액에 대하여 7mM 이상 포함되는, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다. 카페산의 농도가 7mM 미만일때는 식물바이러스 방제 효과를 충분히 발휘하지 못한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 용액 형태이며, 상기 카페산은 상기 용액에 대하여 23 mM 이하로 포함되는, 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다. 카페산의 농도가 23 mM 을 초과할 때에는 대상 식물이 약해를 입는 부작용이 발생한다.

본 발명의 식물바이러스 방제용 조성물은 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 식물바이러스 조성물은 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 식물바이러스 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 카페산의 PepMoV 식물바이러스 방제능 실험

카페산의 항바이러스 효과를 확인하기 위해 바이러스 전신감염 기주 (담배)에서 바이러스에 대한 불활성화 효과를 검정하였다.

카페산

100 mg 카페산을 1 ml dimethyl sulfoxide (Sigma, 미국)에 반응시켜 녹인 후, 그 물질 (555.06 mM)로 항바이러스 효과를 검정하였다.

바이러스

본 연구진에 의해 특허등록 (제 10-1103705)된 PepMoV-Vb1/GFP를 사용하였다.

불활성화 효과 (Inactivation effect)

1.5 ml tube에 100 ul (20 mM, 10 mM, 5 mM, 2.5 mM) 카페산과 100 ng PepMoV-Vb1/GFP를 30분 동안 반응시킨 후, carborundum (Fisher Scientfic, 미국)이 처리된 담배 잎 두장에 기계식 접종한 후, 25 ℃가 유지되는 온실에 14일 동안 병징과 UV아래에서 GFP 발현을 관찰하였다. 또한, 상엽에서 총 RNA와 총 단백질을 분리하여 PepMoV-CP 프라이머를 사용한 RT-PCR과 PepMoV-CP 항체를 사용한 western blot 분석하여 항바이러스 효과를 검증하였다.

RNA 분리

식물의 잎에서 총 RNA를 추출하였다. 잎 절편 (leaf disc) 및 잎 조직을 1.5 ㎖ 튜브의 추출 용액(50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.1% 2-머캅토에탄올)에 넣어 균질화하였다.

반응 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀아코올(PCI, 25:24:1, v/v/v)로 2번 추출하였다. 총 RNA를 3배 부피의 완전 에탄올을 처리하여 침전시키고 -80℃에서 30분 동안 보관하였다. 원심분리 후, 침전된 총 RNA를 70% 에탄올로 세척하고 진공 원심분리기(Tomy, 미국)로 건조하였다. RNA 추출의 결과물을 RNase-프리 증류수에 용해하였다.

단백질 분리

식물의 잎에서 총 단백질을 추출하였다. 잎 절편 (leaf disc) 및 잎 조직을 1.5 ㎖ 튜브의 추출 용액(50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.1% 2-머캅토에탄올)에 넣어 균질화하였다.

반응 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀아코올(PCI, 25:24:1, v/v/v)로 처리하여 중간층의 단백질 부분을 분리하였고, 100% 아세톤 (Duksan, 대한민국) 1 ml을 넣고 -20℃에서 30분 동안 보관하였다. 원심분리 후, 침전된 총 진공 원심분리기(Tomy, 미국)로 건조하였다. 단백질 추출의 결과물을 100 ul 2×sample loading buffer (100mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol, 200mM 2-mercaptoethanol)에 넣고 80 ℃에서 15분간 반응시켰다.

RT-PCR

식물의 잎에서 분리한 총 RNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT 반응은 42℃에서 60분 동안 800 ng 총 RNA, 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2.5 mM 각 dNTP 혼합물, 0.5 ㎕ random hexamer (Qiagen, Germany) 및 20 유닛 Revertaid reverse transcriptase (Thermo scientific, 미국)을 포함하는 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.3)에서 SimpliAmp^TM Thermal Cycler (Thermo Fisher, 미국)로 실시하였다.

합성 cDNA, PCR 버퍼(10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂ 및 50 mM KCl), 10 pMol 프라이머 쌍(정방향 프라이머 및 역방향 프라이머) 및 2.5 mM 각 dNTP 혼합물을 포함하는 50 ㎕에 1 유닛 재조합 Taq DNA 폴리머라아제 (BioFact, 대한민국)을 사용하여 cDNA를 증폭하였다. cDNA를 SimpliAmp^TM Thermal Cycler (Thermo Fisher, 미국)을 사용하여 30 사이클 증폭하였다. 변성은 95℃로 30초 동안 실시하였고 프라이머 어닐링은 58 ℃에서 30초 동안 실시하였으며, DNA 신장은 72℃에서 40초 동안 실시하였다. 30 사이클이 종료되고 10분 동안 72℃에서 연장하였다. RT-PCR 산물을 1.0% 아가로즈 젤 전기영동 및 GelRed 젤 염색을 통해 확인하였다.

PepMoV-Vb1/GFP를 확인하기 위한 프라이머를 [표 1]에 나타내었다.

프라이머	서열	크기 (bp)
PepMoV-CP UP	ATGGCAATTAACGTTATT	822 bp
PepMoV-CP DN	ATACTGTTCCATATGAAG	822 bp

Western blot

식물의 잎에서 분리한 총 단백질을 사용하여 western blot을 수행하였다. 총 단백질을 SDS-polyacrylamide gel (12% (w/v) polyacrylamide separate gel and 5% (w/v) polyacrylamide stacking gel)에 로딩 한 후, 100 V로 110분간 전기 영동하였다. 총 단백질이 전기 영동된 polyacrylamide gel를 nitrocellulose (NC) membrane (Osmonics, 미국), 6장의 3 MM 종이 (Whatman, 미국)와 함께 Protein Electrophoresis System (Bio-Rad, 미국)을 사용하여 1×transfer buffer (2.9 g glycine, 5. Tris-base, 0.37 g SDS, 200 ml methanol per liter) 안에서 총 단백질이 NC membrane으로 이동되게 하였다. 그 NC membrane을 1×TBS-T buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간 동안 반응시킨 후, 1×TBS-T buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. PepMoV-CP 항체 (식물바이러스은행, 대한민국)가 1/1000로 희석된 1×TBS-T buffer에 1시간 동안 반응시킨 후, 1×TBS-T buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secodary antibody (Promega, 미국)가 1/7500로 희석된 1×TBS-T buffer에 1시간 동안 반응시킨 후, 1×TBS-T buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. AP-substrate buffer (0.1 M Tris (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂)로 1분 반응시킨 후, 항체-항원 반응의 발색을 위해 1 ml Western Blue Stabilized Substrate Solution (Promega, 미국) 처리하여 확인하였다.

[결과]

카페산과 PepMoV-Vb1/GFP를 함께 30분 동안 반응시킨 후, 담배에 접종하여 14일 까지 바이러스 감염을 관찰하였다 (도 1). 그 결과, UV 아래서 20 mM 카페산과 10 mM 카페산을 함께 반응한 PepMoV-Vb1/GFP는 접종 후, 14일까지 GFP 발현이 관찰되지 않았다. 5 mM 카페산과 2.5 mM 카페산에서는 접종 7일 후부터 GFP 발현이 관찰되었다. 양성대조군으로 사용된 PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 담배에서는 접종 7일 후부터 GFP 발현이 관찰되었고, 음성대조군으로 사용된 DMSO만 접종된 담배에서는 GFP 발현이 관찰되지 않았다.

카페산과 함께 반응한 PepMoV-Vb1/GFP 접종 담배의 상엽에서 분리된 총 RNA와 총 단백질들에 대한 각각 RT-PCR과 western blot 분석에서는 접종후, 7일 후에서는 5 mM 카페산과 2.5 mM 카페산을 처리한 상엽에서 PepMoV-Vb1/GFP가 검출되었으나, 10 mM 카페산과 20 mM 카페산을 처리한 상엽에서는 PepMoV-Vb1/GFP가 모두 검정되지 않았다. (도 2). 접종후, 14일 후에도 5 mM 카페산과 2.5 mM 카페산을 처리한 상엽에서 PepMoV-Vb1/GFP가 검출되었으나, 10 mM 카페산과 20 mM 카페산을 처리한 상엽에서는 PepMoV-Vb1/GFP가 모두 검정되지 않았다. (도 3) 따라서 카페산은 PepMoV-Vb1/GFP에 대하여 불활성화 효과를 나타내는 것으로 분석된다.

실시예 2. 카페산의 CMV(Ca-P1 strain) 식물바이러스의 방제능

실시예 1과 동일한 실험을 진행하되, CMV 식물바이러스를 대상으로 카페산의 방제효과를 확인하였다.

CMV를 확인하기 위한 프라이머를 [표 2]에 나타내었다.

프라이머	서열	크기 (bp)
CMV-Ca-P1 UP	ATGGACAAATCTGAATCAAC	607 bp
CMV-Ca-P1 DN	TCAAACTGGGAGCACCCC	607 bp

카페산과 CMV를 함께 30분 동안 반응시킨 후, 담배에 접종하여 14일 까지 바이러스 감염을 관찰하였다 (도 4).

그 결과, 20 mM 카페산과 함께 반응한 CMV는 접종 후, 14일까지 병징이 관찰되지 않았다. 또한, 바이러스 핵산과 단백질이 검정되지 않았다 (도 5). 10 mM, 5 mM, 2.5 mM 카페산에서는 접종 7일 후부터 병징이 관찰되었으며, 바이러스 핵산과 단백질도 함께 검정되었다. 대조군으로 사용된 CMV만 접종된 담배에서는 접종 7일 후부터 병징이 관찰되었으며, 바이러스 핵산과 단백질도 함께 검정되었다. 음성대조군으로 사용된 DMSO만 접종된 담배에서는 병징이 관찰되지 않았고, 바이러스 핵산과 단백질도 모두 검출되지 않았다.

실시예 3. 다른 식물 바이러스 방제제와의 비교

최근에 ferulic acid-eugenol과 isoeugenol가 TMV에 대해 효과가 있다고 보고 되었으나, 항바이러스 효과 검정을 위한 실험을 국부 감염 기주를 대상으로 반엽법으로 수행하여 전신 감염 기주에서의 그 물질들의 항바이러스 효과를 확인할 수 없습니다.

이에 반하여, 본 연구진은 항바이러스 효과 검정을 위해 전신 감염 기주를 대상으로 수행하여 물질에 대한 효과를 보여주었으므로, 방제제 개발을 위해 좀 더 진일보한 방제제 였다고 평가할 수 있다.

이상, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예를 통해 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

식물바이러스 방제용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 카페산(Caffeic acid)을 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV), 고추모틀바이러스(PepMoV), 오이모자이크바이러스, (CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저바이러스(TSWV), 딸기바이러스(SMoV) 또는 선인장X바이러스(CVX) 인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 식물바이러스는 고추모틀바이러스(PepMoV) 또는 오이모자이크바이러스(CMV)인, 방제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 용액 형태이며,
상기 카페산은 상기 용액에 대하여 7mM 이상 포함되는, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 용액의 용매는 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 메탄올, 1-프로파놀, 2-프로파놀, 설포 부틸 에테르 베타 시클로 덱스트린 (Sulfobutylether-β-Cyclodextrin, SBE-β-CD) 및 다이메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 선택된 유기용매인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 카페산은 유기 합성된 카페산 혹은 천연 식물에서 추출된 카페산인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 1항에 있어서,
항바이러스 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 농약 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 식물바이러스 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법.
제 10항에 있어서,
상기 처리하는 단계는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리, 또는 농기구 처리를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법.