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KR20240086735A - 암 표적 펩티드, 이를 포함하는 전구약물 나노입자 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

암 표적 펩티드, 이를 포함하는 전구약물 나노입자 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR20240086735A
KR20240086735A KR1020220160375A KR20220160375A KR20240086735A KR 20240086735 A KR20240086735 A KR 20240086735A KR 1020220160375 A KR1020220160375 A KR 1020220160375A KR 20220160375 A KR20220160375 A KR 20220160375A KR 20240086735 A KR20240086735 A KR 20240086735A
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KR
South Korea
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cancer
dox
prodrug nanoparticles
prodrug
nanoparticles
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020220160375A
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English (en)
Inventor
김광명
심만규
윤홍열
심나연
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이화여자대학교 산학협력단, 한국과학기술연구원 filed Critical 이화여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020220160375A priority Critical patent/KR20240086735A/ko
Priority to PCT/KR2023/014328 priority patent/WO2024111844A1/ko
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Abstract

본 발명은 암세포의 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 암 표적 펩티드에 관한 것으로서 항암제와 함께 전구약물 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 하며, 담체없는 전구약물 나노입자를 제조함으로써 암 치료에 대한 새로운 접근방식을 제공할 수 있으며, 암 표적화 및 항암제의 치료 효능을 현저히 향상시킬 수 있다.

Description

암 표적 펩티드, 이를 포함하는 전구약물 나노입자 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Tumor-targeting peptide, prodrug nanoparticles containing the same and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same}
본 발명은 암 표적 펩티드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 암 표적 능력이 우수하면서 생체 내 항암제의 부작용은 최소화할 수 있는 암 표적 펩티드, 이를 포함하는 전구약물 나노입자 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
우리나라에서 암 사망률은 37년째 1위를 유지하고 있으며, 그 수는 매해 증가하고 있다. 모든 원인을 통틀어 사망률이 100명을 넘는 것은 암이 유일하며, 전체 사망자의 27.5%를 차지하고 있다. 이러한 암을 치료하는 방법으로는 수술, 항암 화학요법, 방사선 치료가 있으며, 이러한 치료는 다른 질환의 치료에 비해 탈모, 설사, 사망 등의 심각한 부작용이 동반된다.
이에 암을 비교선택적으로 죽일 수 있는 다양한 화학 치료제의 개발에 대한 관심이 높아졌고, 돌연변이에 의한 발암 유전자(oncogene) 등을 표적으로 하는 표적 치료법이 개발되었다. 그러나 돌연변이 표적 암 치료제는 암의 체성변이에 의한 이종성(heterogeneity) 속성 때문에 암에는 무수히 많은 돌연변이가 있어, 암을 정상조직과 다르게 100% 구별할 수 없었으며, 암 특이적 돌연변이를 가진 암조직은 전체 암조직에서 5%-20%에 불과하여 암 치료에 뚜렷한 효과를 나타내지 못하였다.
상술한 문제를 해결하기 위하여 암이 갖고 있는 대사의 보편적 특이성을 사용한 암 치료제들이 연구되었다. 이는 수많은 돌연변이에도 암 유도 대사를 찾아 암을 선택적으로 사멸함으로써 암을 치료하는 것으로, 암세포의 돌연변이 특성에 상관없이 모든 암에 적용 가능한 암치료제인 것이다. 대표적으로 lactate transporter(MCT1), glucose transporter(glut1), glutaminase 1(GLS1), acetyl-coA carboxylase(ACC) 등을 표적으로 하는 항암제가 개발되었으나, 아직까지 암대사 기전이 명확히 밝혀지지 않았으며 대부분 단일 활성화 메커니즘에 의존하기 때문에 이질적 성질의 종양의 일부만을 타겟할 수 있고, 결과적으로 약물내성을 촉진할 수 있다는 문제점이 존재한다.
따라서 본 발명자들은 종래 항암제의 부작용을 억제하면서도 암에 대한 표적 특성을 부여할 수 있는 새로운 접합체에 대한 효능을 밝히기 위하여 예의 노력한 결과, 최적 설계된 암 표적 펩티드가 항암제와의 접합을 통해 항암제의 부작용은 최소화하면서도 암 치료 효율은 높이는 현저한 효과가 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
특허문헌 1. 일본 공개특허공보 제10-2019-0039153호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 암세포의 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 암 표적 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드와 항암제가 결합된 형태의 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 접합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드로, 암세포의 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 암 표적 펩티드를 제공한다.
[일반식 1]
Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
상기 식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것일 수 있다.
상기 식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1일 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드와 항암제가 결합된 형태의 접합체(conjugates)을 제공한다.
[일반식 1]
Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
상기 식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것일 수 있다.
상기 식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1일 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
상기 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 전구약물 나노입자 형태로 제조되는 것일 수 있다.
상기 전구약물 나노입자는 평균 직경이 130 내지 170 nm일 수 있다.
상기 전구약물 나노입자는 전체 분자적 표면적 중에서 소수성 표면 비율이 55 내지 60%일 수 있다.
상기 항암제는 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위하여, 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 접합체는 암세포 내에 존재하는 카텝신 B에 의해 분해되어 활성화되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 신장 조직 또는 간 조직보다 암 조직에 2배 이상 축적되는 것일 수 있다.
상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두 선암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 암 표적 펩티드는 항암제와의 접합을 통해, 담체없는 전구약물 나노입자를 제조함으로써 암 치료에 대한 새로운 접근방식을 제공할 수 있으며, 암 표적화 및 항암제의 치료 효능을 현저히 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 암 표적 펩티드를 포함하는 전구약물 나노입자는 액상에서 자가조립을 통해 나노입자 형태로 존재하므로 합성 및 제조가 용이하고, 수율 및 순도가 높아 대량생산에 유리하다.
또한, 본 발명의 암 표적 펩티드를 포함하는 전구약물 나노입자는 장기간 보관하여도 형태를 유지하는 구조적 안정성이 있으며, 생체 내에서도 종래 전구약물보다 2 내지 16배 이상의 암 특이적 축적 효과를 갖고, 다른 정상 조직에 대해서는 낮은 축적 효과를 나타내므로 우수한 생체 적합성을 갖는다.
또한, 본 발명의 암 표적 펩티드를 포함하는 전구약물 나노입자는 고용량으로 반복 투여되어도 생체 내 정상 조직보다 암 조직에 더 많이 축적될 뿐만 아니라, 설사 정상조직에 과량 축적되었다고 하더라도 비활성 상태로 존재하므로, 생체내 부작용을 야기하지 않으므로, 암 예방 또는 치료용 조성물에 매우 적합하다.
도 1은 본 발명에 따른 암 표적 펩티드, 이를 포함하는 접합체 및 상기 접합체가 자가조립되어 나노입자로 형성된 전구약물 나노입자에 대한 구조와 생체 내 거동을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 암 표적 펩티드, 이를 포함하는 접합체 및 상기 접합체 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 접합체와 비교예 4로부터 제조된 접합체(b~e) 및 비교예 3으로부터 제조된 접합체(a)에 대한 RP-HPLC 그래프이다.
도 4는 실시예 4 내지 6로부터 제조된 접합체와 비교예 3 및 비교예 4로부터 제조된 접합체의 MALDI-TOF 분석결과로, 이때 CHCA(cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 사용하여 분석하였다(molecular weight range = 500 - 2,000 Da).
도 5는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3 및 4의 전구약물 나노입자에 대한 DLS 분석결과이다.
도 6은 식염수 조건에서 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3 및 4의 전구약물 나노입자의 크기와 크기분포도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 식염수 조건에서 실시예 4 내지 6로부터 제조된 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4로부터 제조된 전구약물 나노입자의 콜로이드 안정성을 평가한 결과 그래프(평균값±S.D)이다.
도 8은 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자의 표면 소수성 비율을 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자를 형성함에 있어서, 두 분자의 분자간 역학 시물레이션을 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자의 TEM 이미지이다.
도 11은 1 mM 카텝신 B 용액 조건 하에서, 시간별 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자에 대한 RP-HPLC 그래프이다.
도 12는 도 11에 대한 RP-HPLC 그래프를 시간별로 정량화하여, 펩티드 분해율(%)을 계산하여 도시한 것이다.
도 13a는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 공초점 현미경 이미지이다.
도 13b는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 공초점 형광 이미지(48 h)로부터 핵에서의 항암제(DOX) 형광세기와 세포질에서의 항암제(DOX) 형광세기를 비교하여 나타낸 그래프이다(평균 ± S.D, n=3).
도 13c는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 여과액으로부터 항암제(DOX)를 MALDI-TOF로 분석한 결과 그래프이다.
도 14a는 HT29 세포와 H9C2 세포에서의 카텝신 B 발현수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과(상)와 밴드 강도를 정량화하여 나타낸 그래프(하)이다.
도 14b는 H9C2 세포와 HT29-Inh 세포에 대한 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 14c는 도 14b의 이미지로부터 측정된 항암제(DOX)의 형광강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 14d는 HT29 세포에 대한 농도별 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 14e는 H9C2 세포에 대한 농도별 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 15a는 암 동물모델에 항암제(DOX)(4 mg/kg), 실시예 4 또는 비교예 3의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 mg/kg)를 꼬리 정맥으로 주입하고 9시간이 지난 실험군 1, 2, 4를 디지털 형광 현미경으로 촬영한 사진이다. 도 15b는 도 15a의 이미지로부터 정량화한 암 조직의 형광강도 그래프이다.
도 15c는 실험군 1, 2, 4로부터 암 조직을 분리하고, 이에 대한 형광강도를 분석한 그래프이다.
도 15d는 실험군 1 내지 5로부터 주요 장기들의 조직(간, 폐 비장, 신장, 심장, 종양)을 분리하고, 이를 형광 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 15e는 실험군 1 내지 5로부터 주요 장기들의 조직(간, 폐 비장, 신장, 심장, 종양)을 분리하고, 이에 대한 형광강도를 분석한 그래프이다.
도 15f는 실험군 1, 2 및 4로부터 분리한 암 조직을 DAPI로 염색하고, 공초점 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 15g는 실험군 1, 2 및 4로부터 분리한 암 조직에서 항암제(DOX)의 형광세기를 측정하여 정량화한 그래프이다.
도 16a는 시간에 따른 실험군 6 내지 실험군 8에서의 암 부피를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16b는 시간에 따른 실험군 6 내지 실험군 8에 대한 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 16c는 실험군 6 내지 실험군 8로부터 분리한 암 조직의 TUNEL 분석 및 조직병리학적 분석 결과이다.
도 17은 정상군과 실험군 9 내지 12에 대한 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 정상군과 실험군 9 내지 12의 간, 폐, 비장, 신장 및 심장 조직을 H&E로 염색한 조직분석 결과이다.
도 19는 정상군과 실험군 13 내지 16에 대한 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20은 정상군과 실험군 13 내지 16의 간, 폐, 비장, 신장 및 심장 조직을 H&E로 염색한 조직분석 결과이다.
도 21은 정상군과 실험군 9 내지 12에서의 혈액 적합성(Hemocompatibility)을 평가한 그래프이다.
도 22는 정상군과 실험군 13 내지 16에서의 혈액 적합성(Hemocompatibility)을 평가한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
전구약물(prodrug)이란 기존의 의약품과는 화학구조나 본질적인 구성 자체가 다른 것으로 체내의 대사과정을 거치면서 효과가 나타나는 약물을 의미한다. 전구약물은 약물의 바람직하지 않은 약리작용을 억제하여 비활성상태를 효율적으로 유지할 수 있다는 장점이 있으나, 생체이용율이 낮고 약효를 나타내기 전에 혈액순환에서 빠르게 제거되어 충분한 효과를 얻을 수 없다는 한계점이 있다.
전구약물의 순환시간을 연정하기 위하여 다양한 담체를 접합시킨 나노입자들이 연구되었다. 이는 증가된 순환시간으로 인해 표적 조직(예컨대 암 조직)으로 약물의 축적농도가 증가될 것이라 기대하였으나, 세포내 전달 효율이 5% 미만으로 낮고, 담체로 인하여 약물 용량이 10% 이하로 제한되며, 나노입자를 구성하는 물질에 의한 고유독성과 면역원성으로 인하여, 예기치 못한 부작용이 발생하는 등의 문제가 발생했다.
이에 본 발명자는 담체가 없는 저분자 물질임에도, 암에 대한 표적 특성은 우수하면서 부작용은 최소화하는 새로운 접합체에 대한 개발을 위하여 예의 노력한 결과, 새로운 암 표적 펩티드를 규명하였고, 이를 포함하는 전구약물 나노입자는 항암제의 부작용은 최소화하면서도 암 치료 효율은 높이는 현저한 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 측면은 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드로, 암세포의 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 암 표적 펩티드에 관한 것이다.
[일반식 1]
Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
본 발명에서 제시하는 상기 암 표적 펩티드는 암 조직 및 암 세포에 대한 표적화 능력이 우수하므로, 암 진단을 위한 용도로도 사용할 수 있다.
본 발명에서 제시하는 상기 암 표적 펩티드는 약물과의 접합을 통해, 약물의 약리효과에 부정적 영향을 미치지 않으면서도, 약물과의 π-π staking, 양친매성 특성으로 인한 소수성 상호작용으로 인해 구형의 나노입자로 자가조립되는 특성을 부여할 수 있으며, 약물의 비활성화 상태를 안정적으로 유지함으로써 정상조직에 대한 독성을 현저히 억제하며, 암 세포/암 조직으로의 전달 및 표적화를 통해 암 세포/암 조직에 약물 축적을 향상시키는 등의 효과를 나타낸다.
본 발명에서 펩티드란 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)일 수 있다.
본 발명의 일반식 1로 표시되는 펩티드는 길이가 4 내지 5개 아미노산일 수 있다. 이는 일반식 1로 표시되는 일반식으로 제시되며, 일반식 중에서 xaa1, xaa2 및 Gly의 아미노산 잔기가 알려지거나 표지되지 않을 수 있는 "Gap"을 포함하고 있으므로, 세계지식재산기구(WIPO)의 국제표준 ST.26의 37번 항목에 따라 구체적으로 정의되지 갭을 포함하는 경우에는 서열 작성을 금하고 있어 별도 표기하지 않았으나, 상기 일반식 1로 표시되는 서열은 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있다.
즉, 해당 일반식 1로 표시되는 펩티드는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 해당할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 일반식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것이 바람직하고, 이러한 펩티드의 예는 서열번호 1~3, 8~12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 일반식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1인 것이 바람직하고, 이러한 펩티드의 예는 서열번호 1~3, 8~10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 암 표적 펩티드의 설계에 있어서, 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되면서 항암제와 접합체를 형성하였을 때, 용액 상에서 자가조립되어 구형의 나노입자가 형성되는지 여부였다. 이를 위해 본 발명의 암 표적 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 암 표적 펩티드는 가장 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 펩티드일 수 있는데, 이 경우 후술하는 실험예에서와 같이 항암제와의 접함을 통해 생체 내에서 정상 조직에 대한 부작용 감소효과가 가장 우수하고, 암에 대한 표적능이 우수하기 때문이다.
본 발명의 다른 측면은 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드와 항암제가 결합된 형태의 접합체(conjugates)에 관한 것이다. 도 1에 구체적인 구조와 생체 내 암 조직/암 세포에 작용하는 기전을 개략적으로 도시하였으며, 이를 참고하여 설명하기로 한다.
[일반식 1]
Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
종래 항암 약물복합체는 펩티드와 항암제 사이에 별도의 링커를 포함하여 항암제와 펩티드 간의 유연성(flexible)을 제공하였으나, 본 발명에 따른 접합체는 일반식 1에 표시되는 펩티드에 의해 항암제와의 분자간 유연성을 충분히 제공할 수 있으므로, 별도의 링커를 포함하지 않으므로 합성 과정이 단순하여 대량 생산에 매우 용이하다. 게다가 상기 접합체는 단순한 구조에도 불과하고 순도와 수율이 높으며, 용액 상에서 구조적 안정성과 생체 내에서의 우수한 약리 효과를 갖는다.
본 발명의 일반식 1로 표시되는 펩티드는 길이가 4 내지 5개 아미노산일 수 있다. 이는 일반식 1로 표시되는 일반식으로 제시되며, 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 일반식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것이 바람직하고, 이러한 펩티드의 예는 서열번호 1~3, 8~12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 일반식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1인 것이 바람직하고, 이러한 펩티드의 예는 서열번호 1~3, 8~10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 암 표적 펩티드와 항암제의 접합체 설계에 있어서, 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되면서, 용액 상에서 자가조립되어 구형의 나노입자가 형성되는지를 가장 먼저 고려하였다. 그 결과 본 발명의 암 표적 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 접합체에서, 상기 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 펩티드인 것이 가장 바람직한데, 이 경우 후술하는 실험예에서와 같이 항암제와의 접함을 통해 생체 내에서 정상 조직에 대한 부작용 감소효과가 가장 우수하고, 암에 대한 표적능이 우수하기 때문이다.
상기 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 전구약물 나노입자는 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는데, 상기 나노입자는 증류수 조건에서는 평균 직경이 140 내지 160 nm 이고, 생리식염수 조건에서는 평균 직경이 130 내지 170 nm인 것을 특징으로 한다.
상기 전구약물 나노입자가 생리식염수 조건에서 평균 직경이 130 nm 미만이면 암 조직 외에 정상 조직에 대한 축적효율이 증가하는 문제가 발생할 수 있고, 170 nm를 초과하면 세포내 흡수가 제대로 이뤄지지 않아 약리효과가 2배 이상 감소하는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 접합체와 이로부터 형성된 상기 전구약물 나노입자는 모두 카텝신 B 효소 존재하에서, 펩티드가 절단되어 항암제가 분리되어 활성화된다. 분리된 항암제는 암 세포 내에 존재하는 리소좀에 의해 완전히 유리되어 암세포의 핵으로 흡수 및 전달되어 암 세포의 사멸을 유도한다. 절단된 펩티드 단편은 그 자체로도 독성이 없고 안정하나, 생체 내에서 완전히 분해되어 체내의 대사 과정에 참여하거나, 신장을 통해 체외로 배출된다.
카텝신 B 효소는 암 세포가 아닌 다른 세포에서는 거의 분비되지 않는 암 세포 특이적 발현 효소이므로, 이를 표적으로 하는 본 발명의 접합체는 암 세포가 아닌 세포에서는 비활성화된 상태로 존재하여 정상세포에 대한 독성을 야기하지 않는 안정성을 갖는다.
또한, 본 발명의 접합체와 이로부터 형성된 상기 전구약물 나노입자는 카텝신 B 효소가 아닌 다른 효소, 프로테이즈(protease)에 대해서는 반응하지 않는다. 또한 본 발명의 접합체와 이로부터 형성된 상기 전구약물 나노입자는 암 유전자가 아닌 미세환경을 대상으로 하므로 특정 암뿐만 아니라 내성암, 전이암 및 돌연변이 암 등 광범위하게 적용이 가능하다.
상기 전구약물 나노입자는 전체 분자적 표면적 중에서 소수성 표면 비율이 60% 미만인 것이 바람직하고, 55% 내지 60%인 것이 가장 바람직하다. 상기 소수성 표면 비율이 60%를 초과하는 경우에는 생리학적 조건(예컨대 식염수)에서 구형의 나노입자 구조를 유지하지 못하고 붕괴되거나 입자의 평균 직경이 1000 nm를 초과하여 약리효과가 현저히 저하되는 등의 문제가 발생할 수 있고, 55% 미만인 경우에는 생리학적 조건(예컨대 식염수)에서 분산안전성이 감소하고 순환시간이 감소되어 암 표적 효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
상술한 소수성 표면 비율은 다음 매개변수를 갖는 슈레딩거 슈트(Schrㆆdinger Suites)의 Desmond 모듈로 분석한 것일 수 있다:OPLS4; solvent model: TIP5P; ion placement: chloride; boundary conditions: orthorhombic box shape, box size calculation method (buffer); simulation time: 100 ns; approximate number of frames: 100; ensemble class: NPT; temperature: 300K; pressure: 1.01325 bar; thermostat method: Nose-Hoover chain; coulombic interaction cutoff radius: 9.0 Å
상기 항암제는 당업계에서 사용되는 암 예방, 치료 또는 사멸 효과를 갖는 분자라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 '암 또는 종양'은 cancer 또는 tumor와 동일한 의미를 가지며, 구체적으로 조직 내에서 질서를 무시하고 무제한 증식하는 미분화 세포로 구성된 종괴(腫塊) 또는 종양을 형성하는 병을 의미하며, 궁극적으로는 주위의 정상조직이나 기관을 침윤하여 파괴시키고 원발병소(原發病巢)에서 개체의 어떤 기관이로든 전이하여 새로운 성장 장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환군을 총칭한다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 원발성암 또는 전이암일 수 있으며, 특정 유전자가 돌연변이된 암일 수도 있다. 돌연변이 암은 KRAS 돌연변이 암일 수 있다.
상기 암은 뇌암, 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 항문암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두암, 갑상선암, 골암, 담낭암, 임파종, 골육종, 구강암, 기관지암, 후두암, 피부암, 편평상피세포암, 부갑상선암, 요관암, 신장암, 전립선암 및 요로상피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1928, 2208, 2906, 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1828, 2906, 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3)이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O3),아황산나트륨(Na2SO3),질소가스(N2),에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물 내의 유효성분의 함량은 약학적 조성물의 사용 목적, 제형의 형태 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 약학적 조성물의 전체 중량 기준으로 0.001 내지 99중 량%, 0.001 내지 90중량%, 0.001 내지 50중량%, 0.01 내지 50중량%, 0.1 내지 50중량%, 또는 1 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명의 약학적 조성물은 사용되는 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 0.01 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 보다 더 바람직하게는 0.1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 가장 바람직하게는 5 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 종래 항암제와 달리 반복투여하여도 부작용이 거의 나타나지 않는 장점이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있으며, 바람직하게는 피하 주사, 복강 투여, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 정맥 주사를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 '개체'란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 '투여'란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 '예방'이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, '치료'란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, '개선'이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험재료
독소루비신 염산염 (DOX; > 99%), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(EDC; ≥ 98%), N-하이드로숙시이미드(N-hydroxysuccinimide)(NHS; 98%), N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine)(DIPEA; ≥ 99%), N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide) (DMF; anhydrous, 99.8%), 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(DMSO; anhydrous, ≥ 99.9%)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
서열번호 1 내지 5로 표시되는 5종의 펩티드를 Peptron Co(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 상기 펩티드는 N말단 아실화 형태인 것을 구입하였다: 서열번호 1;Phe-Arg-Arg-Leu(FRRL), 서열번호 2;Phe-Arg-Arg-Leu-Gly(FRRLG), 서열번호 3;Phe-Leu-Arg-Arg-Gly(FLRRG), 서열번호 13;Phe-Arg-Arg-Gly(FRRG) 및 서열번호 14;Phe-Arg-Arg-Leu-Leu(FRRLL).
카텝신 B는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)로부터 구입한 것을 사용하였고, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI 1640 배지, FBS(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 WELGENE Inc(Daegu, Korea) 으로부터 구입한 것을 사용하였다.
카텝신 B 단일클론항체와 Z-Phe-Ala-FMK(benzyloxycarbonyl-Phe-Ala-fluoromethylketone)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc(Dallas, TX, USA)로부터 구입한 것을 사용하였고, RIPA(Radio-immunoprecipitation assay) 완충액, BCA(bicinchoninic acid) 단백질 정량키트 및 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-horseradish peroxidase)은 Thermo Fisher Scientific Inc(Rockford, IL, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 5주령 수컷 BALB/c과 BALB/c nu/nu 마우스는 NaraBio, Inc (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 모든 화학물질은 추가 정제없이 사용하였다.
본 발명에 사용된 HT29(Human colon adenocarcinoma)와 H9C2(rat BDIX heart myoblast) 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분양받아 사용하였고, 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum; GenDEPOT, barker, TX, USA)이 함유된 RPMI-1640 또는 1%(v/v) 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린이 함유된 DMEM 배지로 배양하였다.
실험장비
접합체 또는 전구약물 나노입자의 합성결과와 분해 유무는 RP-HPLC(1200 series Agilent Technologies, USA)를 사용하였다. 전구약물 나노입자의 몰질량은 CHCA 매트릭스를 포함하는 MALDI-TOF(Voyager DE-STR, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 전구약물 나노입자의 크기, 모양 및 다분산성은 DLS(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Malvern, UK)와 TEM(Tecnai F20 G2, Field Electron and Ion Company, Hillsboro, OR, USA)를 사용하여 분석하였다.
시험관 내(in vitro)에서는 CLSM(a confocal laser scanning microscope ; Leica TCS SP8, Leica Microsystems GmbH; Wetzlar, Germany), 유세포분석기(flow cytometer; BD FACSVerse, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 및 마이크로플레이트 리더기(VERSAmaxTM; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)가 사용되었다. 생체 내 및 생체 외(In vivo and ex vivo) 실험에서는 Living Image software(PerkinElmer)가 구비된 IVIS Lumina Series Ⅲ system(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)가 사용되었다. 상기 실험장비들은 상기 실험에만 국한되지 않으며, 실험예에 따라 적절히 선택하여 사용하였다.
실시예 및 비교예
실시예 1 내지 3. 암 표적 펩티드 제조
전구약물 나노입자의 형성에 있어서 가장 적합한 카텝신 B-절단성 펩티드 서열을 확인하기 위하여 3가지 서로 다른 서열(FRRL(서열 1), FRRLG(서열 2), FLRRG(서열 3))을 준비하였다. 상기 펩티드는 Peptron Co에 의뢰하여 Fmoc 고체상방법을 통해 N-말단 아실화된 형태로 합성하였다.
도 2a는 암 표적 펩티드의 구조를 나타낸 것으로, 항암제와의 접합과정에서 원치않은 반응을 방지하기 위하여 각각의 암 표적 펩티드의 N-말단은 아세테이트 그룹으로 보호되었다.
상기 암 표적 펩티드에 대한 다양한 설계를 시도하였으나, 카텝신 B-특이적 절단 특성과 자가조립 통해 나노입자가 형성되도록 하기 위해서는 Phe와 Arg-Arg 서열이 포함되는 것이 바람직하다는 것을 확인하였다. 상기 서열이 포함되지 않는 경우에는 카텝신 B에 의해 절단되지 않거나 용액 상에서 나노입자 형태를 형성하지 못하여 실험자체가 불가능한 문제가 있었다. 이에 상술한 과정을 통해 최종 선정된 암 표작 펩티드는 Gly 및/또는 Leu 스페이서가 삽입 또는 치환된 총 3종이다.
실시예 4 내지 6. 접합체(conjugates) 제조
본 발명에 따른 펩티드와 항암제의 접합체는 EDC와 NHS를 사용한 아미드 결합을 통해 펩티드의 C-말단에 화학적으로 항암제를 접합시켜 제조된다(도 2b 참조).
구체적으로 EDC(950 mg, 4.96 mmol), NHS(350.0 mg, 3.04 mmol), DOX(640.0 mg, 1.10 mmol)를 250 ml 용량의 2목 둥근바닥 플라스크(2-neck round-bottom flask)에 넣고, 100 ml 무수 DMF를 첨가하여 용해하였다. 상기 실시예 1 내지 3으로부터 합성된 펩티드(1.56 mmol) 각각을 무수 DMF(100 ml)에 용해한 다음, 상기 플라스크에 첨가하였다. 여기에 DIPEA(29.6 ㅅL, 0.02 mmol)을 첨가하고 혼합하였다. 상기 혼합물은 0 ℃에서 12시간동안 반응한 다음, 결과물을 차가운 디에틸에테르에 침전시키고, 5 ㅅm semi-preparative C18 column(150 mm x 20 mm; YMC, Dinslaken, Germany)으로 여과하고, C18 역상 컬럼과 H2O/acetonitrile gradient eluent이 구비된 HPLC를 사용하여 순수한 접합체 분자만을 분리 및 정제하였다. 마지막으로 정제된 실시예 4 내지 6의 접합체를 동결건조하여 적색 분말 형태로 얻었다. 합성 여부를 확인하기 위하여 RP-HPLC, MALDI-TOF로 분석하였다.
동결건조된 분말형태의 상기 접합체를 1 mg/ml 농도로 증류수(distilled H2O) 또는 식염수(saline)에 분산하여 전구약물 나노입자 용액을 제조하였다. 전구약물 나노입자 분산액은 탐침형 초음파 분쇄기로 1분간 균질화한 후, DLS로 측정하였다.
상기 접합체는 용액상에서 나노입자형태로 자가조립되어 존재하므로, 액상으로 이용될 경우 '전구약물 나노입자'라 칭하였으나, 특별한 제한없이 액상이라면 접합체가 자동적으로 나노입자로 형성되므로 별도의 언급이 없는 한, 상기 접합체와 전구약물 나노입자는 혼용되어 사용될 수 있다.
비교예 1 및 2. 암 표적 펩티드 제조
실시예와의 비교를 위해 카텝신 B에 의해 절단되는 암 표적능을 갖는 펩티드 서열을 준비하였다. 종래 알려진 카텝신 B 절단 펩티드인 FRRG(서열 13)와 본 발명의 암 표적 펩티드 선정과정에서 제외된 FRRLL(서열 14)을 준비하였다. 따라서 서열번호 13 및 14의 펩티드는 실시예 1과 동일하게 Peptron Co에 의뢰하여 Fmoc 고체상방법을 통해 N-말단 아실화된 형태로 합성하였다.
비교예 3 및 4. 접합체(conjugates) 제조
서열번호 1의 암 표적 펩티드 대신 서열번호 13 또는 14의 암 표적 펩티드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 모두 동일하게 제조하였다.
실험
실험예 1. 접합체의 합성 여부 및 수율 분석
실시예 4 내지 6의 접합체와 비교예 3 및 4의 접합체에 대한 수율과 순도를 HPLC와 MALDI-TOF로 분석하여 표 1, 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3은 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 접합체와 비교예 4로부터 제조된 접합체(b~e) 및 비교예 3으로부터 제조된 접합체(a)에 대한 RP-HPLC 그래프로, 이때 C18 컬럼(Eclipse XDB-C18, 4.6 × 150 mm, particle size = 5 μm, Agilent Technologies)을 사용한 농도구배방법(gradient elution method)(acetonitrile/H2O = 20:80 to 80:20, 25 min)방법으로 분석을 수행하였다.
비교예 3
(FRRG)		 실시예 4
(FRRL)		 비교예 4
(FRRLL)		 실시예 5
(FRRLG)		 실시예 6
(FLRRG)
Molar Mass
(m/z)		 1102.273 1158.466 1271.769 1215.686 1215.626
Yield(%) 78.0 83.9 82.9 94.9 92.9
Purity(%) 97.8 95.5 95.4 95.6 95.6
표 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 4 내지 6 및 비교예 4로부터 제조된 접합체는 82.9% 내지 94.9%의 높은 수율과 95.4% 내지 97.8%의 순도로 합성 되었으나, 비교예 3의 접합체는 수율이 80% 미만(78%)의 낮은 수율로 확인되었다.
도 4는 실시예 4 내지 6로부터 제조된 접합체와 비교예 3 및 비교예 4로부터 제조된 접합체의 MALDI-TOF 분석결과로, 이때 CHCA(cyano-4-hydroxycinnamic acid)를 사용하여 분석하였다(molecular weight range = 500 - 2,000 Da).
표 1 및 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 4 내지 6로부터 제조된 접합체와 비교예 3 및 비교예 4로부터 제조된 접합체의 분자량은 이론값과 정확히 일치하였다. 구체적으로, FRRG-DOX(비교예 3)은 1102.273 m/z [M], FRRL-DOX(실시예 4)는 1158.466 m/z [M], FRRLL-DOX(비교예 4)는 1271.769 m/z [M], FRRLG-DOX(실시예 5)은 1215.686 m/z [M], FLRRG-DOX(실시예 6)은 1215.626 m/z [M])로 측정되었다.
실험결과를 종합하면 실시예 4 내지 6의 접합체는 합성과정이 쉬울뿐만아니라 수율과 순도가 우수하고 분자량의 크기변화도 없으므로, 대량 생산에 매우 유리하다는 장점이 있다.
실험예 2. 전구약물 나노입자의 크기 및 분산도 분석
실시예 4 내지 6의 접합체와 비교예 3 및 4의 접합체를 증류수 또는 식염수에 1 mg/mL 농도가 되도록 분산하여, 전구약물 나노입자 형태로 제조한 후, DLS로 분석하였다. 이하 전구약물 나노입자라고 한다.
도 5는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3 및 4의 전구약물 나노입자에 대한 DLS 분석결과이다. 이에 따르면, 비교예 3의 전구약물 나노입자는 210 nm 이상의 평균직경을 가졌으나, 실시예 4 내지 6 및 비교예 4의 전구약물 나노입자는 항암제(DOX)와 펩티드간의 상호작용(분자간 π-π staking, 양친매성 특성으로 인한 소수성 상호작용)으로 인해, 평균 직경이 150 - 180 nm인 구형의 나노입자로 자가조립된다는 것을 확인하였다. 즉 접합체가 전구약물 나노입자로 자가조립될 때, 형태와 크기는 접합체의 분자구조에 따른 양친매성과 유연성에 영향을 받는다.
도 6은 식염수 조건에서 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3 및 4의 전구약물 나노입자의 크기와 크기분포도를 나타낸 그래프로, 이에 따르면 비교예 4의 전구약물 나노입자(FRRLL-DOX)를 제외하고는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자의 크기는 130 내지 170 nm를 유지하는 것을 확인하였다. 비교예 3의 전구약물 나노입자는 125 nm로, 59% 크기가 감소하는 것을 확인하였다.
비교예 4의 전구약물 나노입자는 식염수 조건에서 3,745 ± 642 nm로 존재하는 것을 확인하였다. 이는 이온성 액체 조건에서 형태를 유지하지 못하고 응집된 것으로 여겨진다.
실험예 3. 전구약물 나노입자의 장기 보관성
실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자에 대한 보관 안정성을 확인하기 위하여, 식염수에 75 시간동안 보관하였다. 보관시간(0, 3, 6, 24, 48 및 72 시간)에 따른 전구약물 나노입자의 평균 직경 변화를 DLS로 분석하였다.
도 7은 식염수 조건에서 실시예 4 내지 6로부터 제조된 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4로부터 제조된 전구약물 나노입자의 콜로이드 안정성을 평가한 결과 그래프(평균값±S.D)로, 이에 따르면 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자는 비교예 3의 전구약물 나노입자와 같이 최대 72 시간까지 분산성을 안정적으로 확보할 수 있다는 것을 확인하였다.
반면 비교예 3의 전구약물 나노입자는 48 시간부터 입자 평균 직경이 감소하기 시작했으나 72시간까지 응집은 관찰되지 않아, 분산성이 유지된다는 것을 확인하였다.
비교예 4의 전구약물 나노입자는 식염수에서 빠르게 수 마이크론으로 응집되었으며, 3 시간 후에는 완전히 침강되어 직경의 측정 자체가 불가능하였다.
실험예 4. 인 실리코에서 전구약물 나노입자의 표면 소수성 비율(Surface hydrophobic ratio)
인실리코(in silico)에서, 실시예 4 내지 6로부터 제조된 전구약물 나노입자 및 비교예 3로부터 제조된 전구약물 나노입자의 표면 소수성 비율을 분석하였다. 상기 전구약물 나노입자를 구성하는 접합체간 역학 시물레이션 및 소수성 평가는 다음 매개변수를 갖는 슈레딩거 슈트(Schrㆆdinger Suites)의 Desmond 모듈로 분석하였다:OPLS4; solvent model: TIP5P; ion placement: chloride; boundary conditions: orthorhombic box shape, box size calculation method(buffer); simulation time: 100 ns; approximate number of frames: 100; ensemble class: NPT; temperature: 300K; pressure: 1.01325 bar; thermostat method: Nose-Hoover chain; coulombic interaction cutoff radius: 9.0 ㅕ.
도 8은 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자의 표면 소수성 비율을 측정한 결과로, 이에 따르면 비교예 4의 전구약물 나노입자(FRRLL-DOX)외에 다른 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자는 소수성 분자 표면적의 평균 비율이 60%를 초과하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자는 용매에 접근할 수 있는 소수성 표면적의 비율도 40% 미만으로 확인되었다. 상술한 결과로 인해 실시예 4 내지 6과 비교예 3의 전구약물 나노입자는 용액 상에서 약 100 - 200 nm의 적절한 크기를 갖는 것을 알 수 있다.
비교예 3의 전구약물 나노입자는 가장 낮은 소수성을 가지면서 증류수에서 가장 작은 평균 직경을 가지는 것으로 확인된 바, 비교예 4의 전구약물 나노입자는 가장 높은 소수성을 가지므로 식염수 조건에서 수 마이크론의 가장 큰 평균 직경을 갖게되는 것으로 여겨진다(분자 소수성 표면 비율 = 62.5%, 용매 접근 가능한 소수성 표면 비율 = 42.6%).
실험예 5. 인 실리코에서 전구약물 나노입자 형성에 있어서 분자간 유연성이 미치는 영향 분석
인실리코(in silico)에서, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자의 표면 소수성 비율을 분석하였다. 상기 전구약물 나노입자를 구성하는 접합체간 역학 시물레이션 및 소수성 평가는 다음 매개변수를 갖는 슈레딩거 슈트(Schrㆆdinger Suites)의 Desmond 모듈로 분석하였다:OPLS4; solvent model: TIP5P; ion placement: chloride; boundary conditions: orthorhombic box shape, box size calculation method (buffer); simulation time: 100 ns; approximate number of frames: 100; ensemble class: NPT; temperature: 300K; pressure: 1.01325 bar; thermostat method: Nose-Hoover chain; coulombic interaction cutoff radius: 9.0 ㅕ.
도 9는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자 및 비교예 3 내지 4의 전구약물 나노입자를 형성함에 있어서, 두 분자의 분자간 역학 시물레이션을 나타낸 도면이다.
도 9에 나타난 바와 같이 비교예 4의 전구약물 나노입자는 Leu-Leu 스페이서의 강성으로 인해 분자의 형태변화가 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자에 비해 최소화되는 것을 확인하였다. 이로 인해 비교예 4의 전구약물 나노입자의 분자는 낮은 접힘성을 가지게 되므로 1000 nm 이상의 큰 평균 직경을 형성한 것이라 여겨진다.
비교예 4의 전구약물 나노입자는 생리식염수나 PBS와 같은 완충액에서 분산성이 낮아, 생체 내 및 시험관 내에서의 실험에 적합하지 않으므로 후보물질에서 제외되었다.
실험예 6. 전구약물 나노입자의 구조
실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자 형태와 크기를 확인하기 위하여 TEM으로 분석하였다. 우선 TEM 분석을 위해, 각각의 전구약물 나노입자 용액을 구리 그리드 상에 올리고 건조한 후, 1.5 분 동안 2% 우라실 아세테이트로 음성 염색한 다음 측정하였다.
도 10은 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자의 TEM 이미지(스케일 바=200 nm)로, 모든 전구약물 나노입자는 용액상에서 구형의 형태로 자가조립된다는 것을 다시금 확인하였다. 본 발명에 따른 전구약물 나노입자는 담체 물질 없이 분자간 상호작용을 통해 용액 조건에서 안정한 나노입자 구조로 존재한다.
실험예 7. 전구약물 나노입자의 카텝신 B 특이적 분해활성
카텝신 B 효소 조건 하에서, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자의 분해여부를 확인하고자 하였다. 우선 MES 완충액(100 mM, pH 5.5)에서 100 μM 전구약물 나노입자를 100 mM 카텝신 B 용액과 혼합하고, 반응 시간(0, 1, 3, 6, 9 및 24 시간)에 따라 시료를 채취하여 RP-HPLC를 통해 관찰하였다. 구체적으로 때 C18 컬럼(Eclipse XDB-C18, 4.6 × 150 mm, particle size = 5 μm, Agilent Technologies)을 사용한 농도구배방법(gradient elution method)(acetonitrile/H2O = 20:80 to 80:20, 25 min)방법으로 분석을 수행하였다.
도 11은 1 mM 카텝신 B 용액 조건 하에서, 시간별 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자에 대한 RP-HPLC 그래프이고, 도 12는 도 11에 대한 RP-HPLC 그래프를 시간별로 정량화하여, 펩티드 분해율(%)을 계산하여 도시한 것이다.
도 11에 나타난 바와 같이, 반응시간이 지남에 따라 전구약물 나노입자(FRRG-DOX, FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX)에 해당하는 피크가 감소하고, 새로운 피크가 생성되는 것을 확인하였다. 새롭게 나타난 피크는 천연 DOX의 피크와 일치하지 않을뿐더러, 각각의 실시예 4-6 및 비교예 3끼리도 서로 다른 것으로 확인되었다.
이는 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자, 비교예 3의 전구약물 나노입자에 카텝신 B 효소가 처리될 때, 펩티드 서열에 따라 분해되어 생성되는 결과물이 서로 다르다(G-DOX, L-DOX 및 LG-DOX)는 것을 의미한다.
구체적으로 실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRL-DOX)를 살펴보면, FRRL-DOX 접합체는 15.5분부터 새로운 피크가 용출되었고, L-DOX에 해당하는 14.7분의 피크가 반응 3시간부터 관찰되기 시작하였다. 이때 FRRL-DOX 접합체의 피크는 감소하기 시작하여 반응 24시간부터는 완전히 분해되어 전혀 검출되지 않는다. 상기 L-DOX는 세포 내에서 재차 분해되어 유리된 형태의 DOX로 활성화되는 것이다.
도 11로부터 펩티드 분해율(%)을 계산하여 도 12에 나타내었고, 그 결과를 살펴보면, 비교예 3의 전구약물 나노입자가 가장 빠르게 분해되었으며, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자도 빠른속도로 분해되어 24시간 후에는 잔류 분자없이 완전히 분해되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 전구약물 나노입자는 식염수 조건 하에서도 카텝신 B 효소에 의해 효과적으로 분해된다는 것을 확인하였다. 또한 카텝신 B 외의 리소좀 효소에 의해서는 분해되지 않고 유지(실시예 4 내지 6의 분해율(%)은 0~5% 미만임)된다는 것을 추가적으로 확인하였다.
실험예 8. 전구약물 나노입자의 세포흡수율
HT29 결장암 세포를 사용하여 전구약물 나노입자(5 μM)의 세포 흡수 및 핵내 국소화를 분석하였다. 전구약물 나노입자의 세포내 거동과 세포내 상호작용을 조사하기 위하여, 2 × 105 HT29 세포를 유리 바닥 공초점 접시에 각각 분주하였다. 각각의 세포를 24 시간 배양하여 안정화한 후, 실시예 4-6 및 비교예 3의 전구약물 나노입자(5 μM)를 각각 처리하고, 37 ℃에서 0, 24 및 48 시간동안 배양하여 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)을 제조하였다. 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 15 분 동안 고정한 뒤, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 13분 동안 염색하였다. 각 군을 CLSM로 촬영하여 형광 이미지를 얻었고, 해당 형광 이미지로부터 전구약물 나노입자의 분포를 확인하기 위해 Image-Pro software(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)를 사용하여 형광세기를 정량화하였다.
전구약물 나노입자가 세포 내에 흡수된 후, 분해되는지 여부를 추가적으로 분석하기 위하여 1 × 106 HT29 세포를 100 mm 세포 배양 접시에 분주하고 24 시간 배양하여 안정화시켰다. 상기 세포 각각에 실시예 4-6 및 비교예 3의 전구약물 나노입자(100 μM)를 투여하고, 37 ℃ 조건하에서 48 시간 배양하여 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)를 제조하였다. 각 군을 PBS로 세척하고 증류수(distilled H2O)로 분산시켰다. 상기 분산액을 0.45 ㅅm 주사기 필터로 여과하여 여과액을 회수한 후, MALDI-TOF로 여과액의 내용물에 대한 질량을 분석하였다.
도 13a는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 공초점 현미경 이미지이다.
도 13a에 나타난 바와 같이, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 암세포에 처리하고 24 시간이 지나면, 항암제(DOX)에 의한 적색 형광이 암세포로부터 관찰되기 시작하였다. 이를 통해 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자는 모두 항암제의 세포 흡수율이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 및 실시예 6의 전구약물 나노입자(FRRLG-DOX 및 FLRRG-DOX)는 핵이 아닌 영역에서 주로 적색(DOX)이 관찰되었고, 실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRL-DOX)와 비교예 3의 전구약물 나노입자(FRRG-DOX)는 핵(DAPI로 염색된 청색영역)의 위치에서 적색(DOX)이 관찰되었다.
도 13b는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 공초점 형광 이미지(48 h)로부터 핵에서의 항암제(DOX) 형광세기와 세포질에서의 항암제(DOX) 형광세기를 비교하여 나타낸 그래프이다(평균 ± S.D, n=3).
도 13b에 나타난 바와 같이, 실시예 5 및 실시예 6의 전구약물 나노입자(FRRLG-DOX와 FLRRG-DOX)는 각각 27%와 21%의 항암제(DOX)만이 핵으로 전달되는 것으로 확인되었다. 이는 실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRG-DOX)보다 1.9~3.1배 더 낮은 수치이다.
실시예 4의 전구약물 나노입자는 비교예 3의 전구약물 나노입자와 같이 세포질에서 세포내로 이입된 후, 암세포에 존재하는 카텝신 B에 의해 펩티드와 항암제(DOX)가 분해되고, 분해된 항암제(DOX)는 핵으로 성공적으로 전달되는 것을 확인할 수 있다.
만약 전구약물 나노입자가 분해되지 않고 세포 내에 잔류할 경우에는 핵 내부에 위치하지 못하므로, 실시예 5 및 6의 전구약물 나노입자는 세포내이입(endocytic)된 후에 카텝신 B에 의해 분해되는 비율이 낮을 것으로 추정된다.
시험관 내에서 실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRL-DOX)는 비교예 3의 전구약물 나노입자보다 카텝신 B에 의해 분해속도가 느렸으나, 세포 내에서는 실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRL-DOX)가 비교예 3의 전구약물 나노입자(FRRG-DOX)보다 핵 축적율이 63%로 1.25배 더 우수하였다. 핵 축적율의 5% 이상 증가는 동량의 항암제를 사용하였을 때보다 약리효과가 현저히 우수하다는 것을 의미하며, 수치적으로 나타내면 10% 더 적은 항암제 용량으로 동일한 효과를 얻을 수 있는 것이다.
항암제는 필연적으로 부작용을 수반하고 있기 때문에 적은 용량으로 동등한 효과를 나타내는 것은 해당업계에서 괄목할만한 효과라 할 수 있으며, 나노입자에 존재하는 항암제 중에서 60% 이상의 항암제를 성공적으로 핵으로 전달했다는 것만으로 유의미한 현저한 효과라 할 것이다.
즉 본 발명에 따른 전구약물 나노입자는 종래 종양 특이적 펩티드로 알려진 FRRG가 갖고 있는 문제점(생체내에서 충분하지 않은 약리효과와 암 조직외의 정상조직에 대한 높은 축적율)을 해결하기 위해, 새로운 펩티드를 개발하고자 하였고, 1 내지 2 아미노산 잔기의 변이, 삽입 및 결실을 통해 항암제와의 결합력을 높이고, 분자간 유연성과 상호작용을 개선을 예상하였다. 이를 위해, 우선 자가조립 나노입자 형성유무, 카텝신 B 분해능 등을 기준으로 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자를 1차 선정하였고, 인 실리코의 실험결과를 바탕으로 실시예 4의 펩티드 보다 실시예 5, 6의 펩티드가 효과가 우수할 것이라 확인하였다. 그러나 시험관 내 세포실험(in vitro)에서 실시예 4의 전구약물 나노입자가 실시예 5, 6의 전구약물 나노입자보다 더욱 우수한 약리효과를 나타내었고, 이는 당업자가 유추할 수 없는 유의미한 현저한 효과이다.
도 13c는 HT29 세포에 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자를 처리하고 얻은 약물투여군 1, 2, 3(FRRL-DOX, FRRLG-DOX, FLRRG-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)의 여과액으로부터 항암제(DOX)를 MALDI-TOF로 분석한 결과 그래프이다.
도 13c에 나타난 바와 같이, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자가 암 세포 내에서 항암제(DOX)가 성공적으로 분리되어 존재한다는 것을 확인하였다.
약물투여군 2, 3(FRRLG-DOX, FLRRG-DOX)는 실시예 5 내지 6의 전구약물 나노입자가 암세포 내에서 확인되었으나, 약물투여군 1(FRRL-DOX) 및 비교군(FRRG-DOX)에서는 실시예 4의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자가 관찰되지 않았고, 항암제(DOX) 만이 관찰되었다. 즉 실시예 4의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자는 암세포 내에서 완전히 분해된다는 것을 알 수 있다. 그러나 실시예 5 및 6의 전구약물 나노입자는 암세포의 카텝신 B에 대한 민감도가 다소 낮은 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자가 암세포와 반응시, 카텝신 B 효소에 의해 분해되어 단편-DOX(G-DOX, L-DOX 및 LG-DOX)가 생성될 것으로 예상하였으나, 실제 분석결과에 다르면 단편-DOX의 질량 피크는 세포내에서 관찰되지 않았다. 이를 통해 실시예 4 내지 6의 전구약물 나노입자와 비교예 3의 전구약물 나노입자는 카텝신 B 효소와 반응하여 단편-DOX를 생성하더라도, 세포의 리소좀 효소에 의해 즉시 분해되어 DOX를 최종적으로 생성하고, 상기 DOX가 핵 내에 침투하여, 항암효과를 효과적으로 발휘한다는 것을 알 수 있다.
실험예 9. 전구약물 나노입자의 암세포 특이성 및 세포독성
본 발명에 따른 전구약물 나노입자의 암세포 특이적 효과와 세포 독성을 분석하고자 하였다. 항암제(DOX)의 부작용이 주로 심장에서 발생하므로, 정상세포는 심장근세포인 H9C2 세포를 사용하였다.
HT29 세포와 H9C2 세포에서 카텝신 B 발현 수준을 비교하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하여 도 14a에 나타내었다. 구체적으로 1 × 106 HT29 세포와 1 × 106 H9C2 세포를 100 mm 세포 배양 접시에 각각 분주하고, 24 시간동안 안정화한 후, PBS로 세포를 세척한 다음 1% 프로테아제 억제제(protease inhibitors)를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)으로 분산시켰다. 생성된 용해물을 12,000 rpm으로 25분 동안 원심분리하여 세포파편(cell debris)을 제거하고, 상등액을 회수한 후, BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 상기 상등액은 10% 겔에서 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분리한 다음, PVDF(polyvinylidenedifluoride) 분리막으로 옮긴 후, IgG(non-specific immunoglobulin G) 결합을 차단하기 위하여 5% BSA(bovine serum albumin) 함유 TBS-T(Tween 20-including tris-buffered saline)로 2시간동안 배양하였다. 다음 goat anti-mouse cathepsin B primary antibody(500:1)로 4 ℃에서 24 시간 동안 처리하고, TBS-T로 3차례 세척한 후, HRP-conjugated mouse anti-goat IgG antibody를 첨가하여 2시간동안 배양하고, 면역반응성 밴드를 ECL(enhanced chemiluminescence) system을 사용하여 검출하였다.
다음 세포에 대한 특이적 활성을 분석하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다. 우선 2 × 105 HT29 세포와 2 × 105 H9C2 세포를 유리 바닥 공초점 접시에 각각 분주하였다. 카텝신 B-억제 세포(HT29-Inh)는 HT29 세포에 Z-Phe-Ala-FMK(20 μM)로 24 시간동안 전처리하여 준비하였다. 각각의 세포를 24 시간 배양하여 안정화한 후, 항암제(DOX)를 단독으로 투여하거나(5 μM), 실시예 4 및 비교예 3의 전구약물 나노입자(5 μM)를 각각 처리하고, 37 ℃에서 48 시간동안 배양하여 단독투여군, 약물투여군 및 비교군을 제조하였다. 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 15 분 동안 고정한 뒤, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 13분 동안 염색하였다. 각 군을 CLSM로 촬영하여 형광 이미지를 얻었고, 해당 형광 이미지로부터 전구약물 나노입자의 분포를 확인하기 위해 Image-Pro software (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)를 사용하여 형광세기를 정량화하였다.
또한, 세포 독성은 CCK-8(cell counting kit-8)을 사용하여 수행하였다. 구체적으로 1 × 104 HT29 및 0.5 × 104 H9C2 세포를 각각 96 웰 플레이트에 분주하고, 24 시간동안 배양하여 안정화하였다. 각 웰에 다양한 농도의 항암제(DOX)를 단독으로 투여하거나(0.01~100 μM), 실시예 4 및 비교예 3의 전구약물 나노입자(0.01~100 μM)로 처리하여 37 ℃에서 48 시간동안 배양하여 단독투여군, 약물투여군 및 비교군을 제조하였다. 배양이 완료되면 10% CCK-8 용액이 함유된 배양배지를 첨가하여 20분 동안 반응시킨 후, 450 nm 파장의 마이크로플레이트 리더기로 분석하였다. 농도 의존적 세포 생존율을 프롯팅하고, GraphPad Prism 8 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 단독투여군, 약물투여군 및 비교군에 대한 IC50(half-maximal inhibitory concentration) 수치를 얻었다.
통계분석
실험의 통계분석을 위하여 Student's t-test를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 두 개 이상의 실험 그룹의 비교는 다중 비교를 위한 Tukey-Kramer 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 0.0001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ****로 표기하였고, 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다.
도 14a는 HT29 세포와 H9C2 세포에서의 카텝신 B 발현수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과(상)와 밴드 강도를 정량화하여 나타낸 그래프(하)이다.
도 14a에 나타난 바와 같이, HT29 세포는 H9C2 세포보다 3.5배 더 많은 카텝신 B를 발현하는 것으로 확인되었다. 따라서 카텝신 B 효소는 암 세포 표적을 위한 대상으로 충분하다는 것을 알 수 있다.
도 14b는 H9C2 세포와 HT29-Inh 세포에 대한 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 14b에 나타난 바와 같이, H9C2 세포와 HT29-Inh 세포에 대한 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX)(5 μM)과 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)은 세포질에서만 항암제(DOX)의 형광이 관찰되었다. 즉 실시예 4 및 비교예 의 전구약물 나노입자는 카텝신 B 효소를 발현하지 않는 H9C2 세포와 HT29-Inh 세포에서는 분해되지 않은 비활성화 상태로 존재하므로, 핵 내로 침투하지 못하고 세포질에서만 관찰된 것이다. 반면 단독투여군(DOX)은 카텝신 B 효소 유무에 상관없이 모두 세포의 핵내로 침입하여 세포 사멸을 유도하였다.
도 14c는 도 14b의 이미지로부터 측정된 항암제(DOX)의 형광강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이에 따르면, 본 발명에 따른 전구약물 나노입자(실시예 4)는 악성 종양 표적 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 반면 일반 항암제(DOX)는 종양 특이성 없이 정상세포의 핵에도 침입하여 독성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 4의 전구약물 나노입자(FRRL-DOX)는 H9C2 및 HT29-Inh 세포에 대한 핵축적율이 각각 5% 및 19%로 측정되어, 정상세포에 대해서는 거의 독성을 야기하지 않는다는 것을 확인하였다.
도 14d는 HT29 세포에 대한 농도별 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 세포 생존율을 측정한 그래프이다. 도 14e는 H9C2 세포에 대한 농도별 단독투여군(DOX), 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX) 및 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)의 세포 생존율을 측정한 그래프이다. 도 14는 평균 ± S.D.로 데이터를 나타내었고(n = 3), 유의차는 *** p < 0.001, **** p < 0.0001로 표기하였다. 또한, 도 14d와 도 14e의 결과와 이로부터 얻은 IC50을 표 2에 나타내었다.
DOX 실시예 4
(FRRL-DOX)		 비교예 3
(FRRG-DOX)
IC50
(HT29)		 0.12 6.13 14.07
IC50
(H9C2)		 0.12 182.4 158.2
도 14d, 도 14e 및 표 2에 따르면, 약물투여군(실시예 4;FRRL-DOX)은1~100 μM에서 암세포에 대한 우수한 세포 사멸이 확인되었고(생존율 : 0%), 정상세포는 낮은 세포사멸이 확인된 바(생존율 : 80%), 높은 항암효과와 낮은 정상세포 부작용을 갖는다는 것을 알 수 있다.
반면 비교군(비교예 3;FRRG-DOX)은 1 μM에서 암세포에 대한 낮은 세포 사멸이 확인된 바, 실시예 4의 전구약물 나노입자가 비교예 3의 전구약물 나노입자보다 더 높은 항암효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
단독투여군(DOX)은 종양세포와 정상세포의 생존율에 차이가 없는 바, 암세포를 사멸시키는 농도에서 정상세포도 동일하게 사멸시키므로 높은 부작용을 갖는다는 것을 알 수 있다.
표 2에 따르면, 실시예 4의 전구약물 나노입자의 HT29에 대한 IC50 값이 6.13 μM였고, H9C2에 대한 IC50 값은 182.4 μM로 확인되었다. 즉 실시예 4의 전구약물 나노입자가 비교예 3의 전구약물 나노입자에 비해 암세포에 대한 독성도 더 높고, 정상세포에 대한 독성은 더 낮은 것으로 입증되었다. 즉 비교예 3의 전구약물 나노입자보다 본 발명에 따른 전구약물 나노입자가 현저히 우수한 약리효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
반면, 항암제 단독(DOX)의 경우, HT29 및 H9C2 세포 모두에서 IC50 값이 0.12 μM로 평가되어 심각한 부작용을 나타내는 것으로 확인된다.
실험예 10. 전구약물 나노입자의 생체내 분포
본 발명에 따른 전구약물 나노입자를 생체내 투여할 경우, 생체 내 거동을 평가하고자 하였다.
암 동물모델(tumor-bearing mice)
실험쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고, 12시간의 명/암 주기로 한국과학기술연구원(KIST)의 무균시설에서 사육하였다. 5주령 수컷 BALB/c nu/nu 마우스는 NaraBio로부터 구입한 후 일주일간 적응기간을 거친 후, 실험에 사용하였다.
1 × 107 세포(cell) 농도의 HT29 세포를 5주령 수컷 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 허벅다리의 피하 주사하였다. 암 크기가 약 100 내지 200 mm3 만큼 성장할 때까지 사육하여 암 동물모델을 제조하였다
약물 투여
암 동물모델에 항암제(DOX)(4 mg/kg), 실시예 4 또는 비교예 3의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 또는 10 mg/kg)을 꼬리 정맥을 통해 주사하여 실험군 1 내지 5를 제조하였다(n = 2 for each test group).
상기 실험군은 약물을 주입하고 3, 6, 9 시간이 지나면 IVIS Lumina Series III system을 사용한 NIRF 이미징으로 측정하고, 안락사한 후 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 종양조직을 회수하였다.
상기 과정을 통해 얻은 각각의 조직은 10-μm 두께의 절편으로 절단하고, 절편을 슬라이드 유리에 개별적으로 장착하고 DPBS로 두 번 세척한 후, 절편을 20분 동안 DAPI로 염색하여, 형광 신호를 CLSM을 통해 관찰하였다. 동물에 대한 모든 실험은 KIST 기관동물관리위원회(IACUC, 승인번호 2021-143)의 관계법령 및 기관지침에 따라 수행하였다.
처리
실험군 1
(DOX)		 암 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 4 mg/kg 정맥 투여
실험군 2
(FRRG-DOX)(4mg/kg)		 암 동물모델 -> 비교예 3의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 4 mg/kg) 정맥 투여
실험군 3
(FRRG-DOX)(10mg/kg)		 암 동물모델 -> 비교예 3의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 10 mg/kg) 정맥 투여
실험군 4
(FRRL-DOX)(4mg/kg)		 암 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 4 mg/kg) 정맥 투여
실험군 5
(FRRL-DOX)(10mg/kg)		 암 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 10 mg/kg) 정맥 투여
통계분석
실험의 통계분석을 위하여 Student's t-test를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 두 개 이상의 실험 그룹의 비교는 다중 비교를 위한 Tukey-Kramer 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행하였다. 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 0.0001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ****로 표기하였고, 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다.
도 15a는 암 동물모델에 항암제(DOX)(4 mg/kg), 실시예 4 또는 비교예 3의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 mg/kg)를 꼬리 정맥으로 주입하고 9시간이 지난 실험군 1, 2, 4를 디지털 형광 현미경으로 촬영한 사진이다. 도 15b는 도 15a의 이미지로부터 정량화한 암 조직의 형광강도 그래프이다.
도 15a와 도 15b에 따르면, 실시예 4의 전구약물 나노입자는 항암제 단독(DOX), 비교예 3의 전구약물 나노입자에 비해, 암 조직에 대한 유의적으로 높은 축적 효율을 나타낸다. 실시예 4의 전구약물 나노입자는 종래 전구약물 나노입자(비교예 3)보다 암 표적 특성이 유의적으로 우수할 뿐만 아니라 암 축적 효율도 현저히 우수하다.
도 15c는 실험군 1, 2, 4로부터 암 조직을 분리하고, 이에 대한 형광강도를 분석한 그래프로, 이에 따르면 실시예 4의 전구약물 나노입자는 항암제(DOX)와 비교예 3의 전구약물 나노입자에 비해 각각 2.3배, 1.4배 유의적으로 현저한 암 표적 능력을 가졌다.
앞선 실험에서, 비교예 3의 전구약물 나노입자가 실시예 4의 전구약물 나노입자에 비해 식염수에서 장기 분산 안정성이 더 낮았다. 실시예 4와 비교예 3의 전구약물 나노입자는 펩티드 서열 하나 차이지만, 확인된 상술한 특성 외에도 전구약물 나노입자의 형태와 나노입자를 구성하는 분자간 상호작용 등 미세한 구성들에 영향을 미치므로, 예상과 달리 종래 전구약물 나노입자(비교예 3)보다 실시예 4의 전구약물 나노입자가 현저히 우수한 약리효과를 나타내는 것이다.
도 15d는 실험군 1 내지 5로부터 주요 장기들의 조직(간, 폐 비장, 신장, 심장, 종양)을 분리하고, 이를 형광 현미경으로 촬영한 사진이고, 도 15e는 실험군 1 내지 5로부터 주요 장기들의 조직(간, 폐 비장, 신장, 심장, 종양)을 분리하고, 이에 대한 형광강도를 분석한 그래프이다.
도 15d, 도 15e를 통해, 생체 내에서 주요 장기에 대한 전구약물 나노입자의 분포를 확인하였다. 항암제가 단독으로 투여된 실험군 1(DOX)은 신장에 대부분의 항암제가 축적되어 있었다. 신장 조직에서의 형광강도는 암 조직에서보다 8.8배 더 높은 것으로 확인되었다.
반면 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 4, 5에서는 신장보다 암 조직에서의 양이 2배 이상 많이 축적된 것을 확인할 수 있었다.
비교예 3의 전구약물 나노입자이 투여된 실험군 2, 3은 암 조직보다 간 조직에 유의적으로 높은 항암제가 축적되었다(2.4배 및 6.7배). 비교예 3의 전구약물 나노입자는 암 조직이 아닌 간의 정상세포에 과도하게 축적되므로 급성 간 독성이 유발되는 등 부작용 우려가 있다.
또한, 비교예 3의 전구약물 나노입자는 혈액 내에서 불안정하게 존재하고, 옵소닌화(opsonization) 및 간 흡수를 촉진시킨다. 따라서 생체 내에서 안정성이 우수하고, 여타 정상조직에 비해 암 조직에 대한 표적 효율이 유의적으로 높으며, 간 조직에 대한 축적 효율이 비교예 3의 전구약물 나노입자에 비해 2.4배 및 4.8배 낮은 실시예 4의 전구약물 나노입자는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 가장 적합하다.
도 15f는 실험군 1, 2 및 4로부터 분리한 암 조직을 DAPI로 염색하고, 공초점 현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 15g는 실험군 1, 2 및 4로부터 분리한 암 조직에서 항암제(DOX)의 형광세기를 측정하여 정량화한 그래프이다.
도 15f, 도 15g에 따르면, 항암제가 단독으로 투여된 실험군 1(DOX)의 암 조직에서는 적색 형광(DOX)이 거의 확인되지 않았다. 그러나, 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 4의 암 조직에서는 실험군 1 및 실험군 3의 암 조직보다 각각 6.7배 및 2.6배 유의적으로 현저히 강한 적색 형광이 관찰되었다.
실험예 11. 전구약물 나노입자의 항암효과 분석
암 동물모델(tumor-bearing mice)
실험쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고, 12시간의 명/암 주기로 한국과학기술연구원(KIST)의 무균시설에서 사육하였다. 5주령 수컷 BALB/c nu/nu 마우스는 NaraBio로부터 구입한 후 일주일간 적응기간을 거친 후, 실험에 사용하였다.
1 × 107 세포(cell) 농도의 HT29 세포를 5주령 수컷 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 허벅다리의 피하 주사하였다. 암 크기가 약 60 내지 80 mm3 만큼 성장할 때까지 사육하여 암 동물모델을 제조하였다.
약물 투여
암 동물모델에 3일에 1번 동일한 시간마다 항암제(DOX)(3 mg/kg), 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 또는 10 mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 주사하여 실험군 6 내지 8을 제조하였다(n = 5 for each test group). 총 치료기간은 26일이였고, 전체 약물 투여 횟수는 8회였다.
치료기간이 완료된 각 실험군은 2일마다 암 부피, 체중 및 생존율을 측정하였고, 안락사한 후 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 암 조직을 회수하여, 조직학 및 TUNEL 분석을 수행하였다.
처리
암 동물모델
(control)		 암 동물모델 -> 식염수 4 mg/kg를 3일 마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 6
(DOX)		 암 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 4 mg/kg를 3일 마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 7
(FRRL-DOX)(4mg/kg)		 암 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 4 mg/kg)를 3일 마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 8
(FRRL-DOX)(10mg/kg)		 암 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 10 mg/kg)를 3일 마다 1회 정맥 투여(총 8회)
암 부피는 암 조직의 가장 긴 지름 × (가장 짧은 지름)2 × 0.53으로 계산하였으며, 암 부피가 1,000 mm3보다 크면 사망으로 판정하였다.
조직학적 분석을 위해, 회수한 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 암 조직을각각 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 왁스로 포매한 후, 10 μm 두께로 슬라이스하였다. 그런 다음 조직의 H&E 염색을 수행하여 광학 현미경으로 촬영하여, 조직의 형태학적 파괴를 분석하였다.
TUNEL(deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석을 통해 암 조직을 염색하여 세포자멸사 영역을 시각화하였다.
도 16a는 시간에 따른 실험군 6 내지 실험군 8에서의 암 부피를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 16b는 시간에 따른 실험군 6 내지 실험군 8에 대한 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 16c는 실험군 6 내지 실험군 8로부터 분리한 암 조직의 TUNEL 분석 및 조직병리학적 분석 결과이다.
도 16에 따르면, 항암제를 단독으로 투여한 실험군 6(DOX)은 생체 내 심각한 전신 독성이 야기되어 5일 이내에 사망이 발생하기 시작해서 20일 이내에 모두 사망하였다. 암 동물모델(control)은 80% 이상 사망하였다. 반면 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 7 및 8은 26일이 지난후에도 생존율 100%였다.
실험군 7 및 8의 암 부피는 실험군 6의 암 부피보다 1.9배 내지 6.3배 더 유의적으로 암 성장이 억제되고, 암 조직 외에 정상 조직에 대한 심각한 전신 독성을 전혀 야기하지 않으므로, 암 예방 또는 치료용 조성물로 매우 유용하다.
도 16c에 따르면 실시예 4의 전구약물 나노입자를 투여한 실험군 7 및 실험군 8에서의 암 조직은 형태가 완전히 파괴되어, 현저한 항종양 활성이 확인되었으나, 항암제를 단독으로 투여한 실험군 6(DOX)은 암 조직은 상대적으로 낮은 손상만이 확인되었다.
TUNEL은 DNA의 세포자멸사를 녹색 형광으로 가시화한다. TUNEL 분석 결과, 암 동물모델(control)의 암 조직에서는 녹색 형광이 관찰되지 않았고, 항암제를 단독으로 투여한 실험군 6(DOX)의 암 조직에서는 일부분에서만 녹색 형광이 미세하게 확인되었다. 실시예 4의 전구약물 나노입자를 투여한 실험군 7 및 실험군 8의 암 조직에서는 강한 녹색 형광이 관찰되었다. 즉 실시예 4의 전구약물 나노입자는 항암제를 단독으로 사용했을 때보다 실질적인 암 세포 사멸을 유발한다는 것을 알 수 있다.
실험예 12. 전구약물 나노입자의 투여방법에 따른 생체 내 독성 비교
투여 방법에 따른 생체 내 부작용 문제를 검증하고자 하였다.
단일 투여
종양이 없는 BALB/c 마우스(5주령)에 항암제(DOX)(3 또는 4 mg/kg), 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 또는 10 mg/kg)을 꼬리 정맥을 통해 1회 주사하여 실험군 9 내지 12를 제조하였다(n = 5 for each test group).
처리
정상군(control) 정상 동물모델
실험군 9
(DOX 3 mg/kg)		 정상 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 3 mg/kg 1회 정맥 투여
실험군 10
(DOX, 4 mg/kg)		 정상 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 4 mg/k g1회 정맥 투여
실험군 11
(FRRL-DOX)(4mg/kg)		 정상 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 4 mg/kg) 1회 정맥 투여
실험군 12
(FRRL-DOX)(10mg/kg)		 정상 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 10 mg/kg) 1회 정맥 투여
다회 투여
종양이 없는 BALB/c 마우스(5주령)에 항암제(DOX)(3 또는 4 mg/kg), 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도 기준 4 또는 10 mg/kg)을 꼬리 정맥을 통해 전체 26일동안 총 8회(3일마다 1회) 주사하여 실험군 13 내지 16을 제조하였다(n = 5 for each test group).
처리
정상군(control) 정상 동물모델
실험군 13
(DOX 3 mg/kg)		 정상 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 3 mg/kg 3일마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 14
(DOX, 4 mg/kg)		 정상 동물모델 -> 항암제 단독(DOX) 4 mg/kg 3일마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 15
(FRRL-DOX)(4mg/kg)		 정상 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 4 mg/kg) 3일마다 1회 정맥 투여(총 8회)
실험군 16
(FRRL-DOX)(10mg/kg)		 정상 동물모델 -> 실시예 4의 전구약물 나노입자(DOX 농도를 기준으로 10 mg/kg) 3일마다 1회 정맥 투여(총 8회)
분석방법
상기 실험군은 약물을 주입하고 매일마다 암 부피, 체중 및 생존율을 측정하였고, 8일 후 안락사하고 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 암 조직을 회수하였다. 회수한 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 암 조직을각각 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 왁스로 포매한 후, 10 μm 두께로 슬라이스하였다. 그런 다음 조직의 H&E 염색을 수행하여 광학 현미경으로 촬영하여, 조직의 형태학적 파괴를 분석하였다. 동물에 대한 모든 실험은 KIST 기관동물관리위원회(IACUC, 승인번호 2021-143)의 관계법령 및 기관지침에 따라 수행하였다.
혈액독성을 평가하기 위해, 각 실험군에서 1 mL의 혈액을 채취하고, 4,500rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. KNOTUS Co., Ltd.(Incheon, Korea)의 지시에 따라 혈액 분석을 수행하였다.
도 17은 정상군과 실험군 9 내지 12에 대한 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 18은 정상군과 실험군 9 내지 12의 간, 폐, 비장, 신장 및 심장 조직을 H&E로 염색한 조직분석 결과이다.
도 17에 따르면, 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 11, 12는 유의미한 체중변화가 관찰되지 않았고, 항암제 단독 투여된 실험군 9 및 10은 9% 이상의 유의미한 체중 감소가 확인되었다.
도 18에 따르면, 항암제(DOX)를 단독으로 투여한 실험군 9, 10의 심장 조직은 크게 손상되었고, 신장 등의 조직도 유의미한 손상이 확인되었다. 구체적으로 실험군 9, 10의 장기 조직들은 미세 형태가 실질적으로 완전히 파괴되어, 세포가 파멸되어 생체 기능에 이상을 유발하였다. 반면, 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 11, 12에서는 손상된 장기 조직이 확인되지 않았다. 즉 실시예 4의 전구약물 나노입자는 정상 조직에 대해 매우 안정적이여서 생체 내 부작용을 야기하지 않는다는 것을 알 수 있다.
도 19는 정상군과 실험군 13 내지 16에 대한 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 20은 정상군과 실험군 13 내지 16의 간, 폐, 비장, 신장 및 심장 조직을 H&E로 염색한 조직분석 결과이다.
도 19에 따르면, 항암제(DOX)를 단독으로 투여한 실험군 9, 10은 5일째부터 급격한 체중 감소가 유도되어 20일 이내에 모두 사망하였다. 종래 항암제의 경우에는 다회 투여시 부작용 가능성이 유의미하게 높아지고 정상군의 사망을 유도한다는 것을 알 수 있다. 즉 암의 완전한 예방, 치료를 위해 항암제의 약효를 얻기 위해 반복하여 투여할 경우 사망까지 유발할 수 있다.
반면 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 11, 12에서는 체중변화가 관찰되지 않았으며, 26일 이상에서도 모두 건강하게 생존하는 것을 확인하였다. 실험군 12는 항암제 농도가 3배 더 많은 10 mg/kg이 포함된 전구약물 나노입자(실시예 4)를 처리하였음에도(과량의 항암제) 안정적이라는 것을 확인하였다.
도 20에 따르면, 항암제(DOX)를 단독으로 투여한 실험군 9, 10은 정상 조직들이 모두 완전히 손상되었으나, 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 11, 12에서는 장기 조직들의 유의미한 손상이 관찰되지 않았다. 즉 실시예 4의 전구약물 나노입자는 생체 내에 반복적으로 투여되더라도 정상 조직에 대해서는 비활성을 안정적으로 유지하면서 암 조직에 대해서만 특이적으로 표적 및 활성화된다는 것을 알 수 있다.
도 21은 정상군과 실험군 9 내지 12에서의 혈액 적합성(Hemocompatibility)을 평가한 그래프이고, 도 22는 정상군과 실험군 13 내지 16에서의 혈액 적합성(Hemocompatibility)을 평가한 그래프이다.
도 21에 나타난 바와 같이, 단일 투여방법이 적용된 실험군 9 내지 12에서는 어떠한 혈액독성도 관찰되지 않았다.
도 22에 나타난 바와 같이, 다회 투여방법이 적용된 실험군 13, 14에서는 유의미한 혈액 독성이 확인되었다. 구체적으로 항암제(DOX)를 단독으로 투여한 실험군 13, 14에서는 적혈구를 손상시켜 적혈구, 헤모글로빈 및 헤마토크릿 수치가 정상 범위를 벗어나는 것으로 확인되었다. 반면 실시예 4의 전구약물 나노입자가 투여된 실험군 15, 16은 투여 방법에 상관없이 혈액독성이 유발되지 않는 혈액 적합성을 갖는다.
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Claims (18)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드로, 암세포의 카텝신 B에 의해 절단될 수 있는 암 표적 펩티드:
    [일반식 1]
    Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
    상기 식 1에서,
    Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
    n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
    상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것을 특징으로 하는 암 표적 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1인 것을 특징으로 하는 암 표적 펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 표적 펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 표적 펩티드.
  6. 하기 일반식 1로 표시되는 펩티드와 항암제가 결합된 형태의 접합체(conjugates):
    [일반식 1]
    Phe-[Xaa1]n-Arg-Arg-[Xaa2]m-[Gly]o
    상기 식 1에서,
    Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 Leu 또는 Gly이고,
    n 내지 o는 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    단, 상기 n, m, o가 동시에 0이 되는 일은 없으며,
    상기 n이 0인 경우에는, m이 1이고, Xaa2는 Leu이다.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식 1에서 n+m+o는 2 이하인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 식 1에서 n이 1인 경우에는 m 또는 o 중에서 어느 하나는 반드시 1인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 전구약물 나노입자 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 전구약물 나노입자는 평균 직경이 130 내지 170 nm인 것을 특징으로 하는 접합체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 전구약물 나노입자는 전체 분자적 표면적 중에서 소수성 표면 비율이 55 내지 60%인 것을 특징으로 하는 접합체.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 항암제는 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 접합체.
  15. 제6항에 따른 접합체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 접합체는 암세포 내에 존재하는 카텝신 B에 의해 분해되어 활성화되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 신장 조직 또는 간 조직보다 암 조직에 2배 이상 축적되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두 선암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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