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KR20240067052A - 항-ccr8 항체 - Google Patents

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KR20240067052A
KR20240067052A KR1020237041895A KR20237041895A KR20240067052A KR 20240067052 A KR20240067052 A KR 20240067052A KR 1020237041895 A KR1020237041895 A KR 1020237041895A KR 20237041895 A KR20237041895 A KR 20237041895A KR 20240067052 A KR20240067052 A KR 20240067052A
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KR
South Korea
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antibody
ccr8
seq
cdr
antibodies
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020237041895A
Other languages
English (en)
Inventor
앤드류 제이. 맥클루스키
파우스티안 아만다 엠. 슈미트
제인 시걸
줄리 엘. 윌스바커
Original Assignee
애브비 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 애브비 인코포레이티드 filed Critical 애브비 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 이러한 항체를 사용하는 조성물 및 방법을 포함하는, 항-CCR8 항체를 제공한다.

Description

항-CCR8 항체
서열목록에 대한 언급
본 출원은 17 킬로바이트의 크기로, 2022년 7월 25일자로 생성된, SL-ANTI-CCR8ANTIBODIES로 명명된 xml 파일로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록은 본 명세서에 참고로 포함된다.
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2021년 07월 27일 자로 출원된 미국 가출원 번호 제63/226,118호의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 출원은 특히 신규한 항-CCR8 항체 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
종양 내에서, 조절 T 세포(Treg)는 항-종양 면역 반응을 방지하는 것으로 알려진 핵심 억제 집단이다. 종양내 Treg의 존재의 증가는 몇몇 암에서 더 불량한 환자 결과와 연관되어 왔다(Shang et al, nature Sci. Reports, 2015; Fridman et al., Nat Rev Clin Oncol. 2017; Bruni et al., Nat Rev Cancer. 2020). 케모카인 수용체 8(CCR8)은 몇몇 인간 암에서 종양내 Treg에 의해 고유하게 발현되는 세포 표면 단백질이다(Plitas et al, immunity 2016; De Simone et al, Immunity 2016). 이는 CCR8이 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 통해 선택적 종양내 Treg 고갈을 매개하기 위한 매력적인 표적이 되게 하여 항-종양 면역을 향상시킨다.
Treg 고갈이 오랫동안 연구되었지만, 이들 치료의 대부분은 종양-침윤 효과기 T 세포 집단 및/또는 종양 환경 외부의 Treg에서의 표적 발현으로 인해 제한된 효능을 갖는다. 종양 미세환경에서 다른 핵심 효과기 T 세포 집단 또는 말초 Treg을 고갈시키지 않으면서 종양내 면역억제 Treg의 사멸을 촉발하는 단일클론 항체 치료에 대한 필요성이 당업계에 남아 있다.
항-CCR8 단일클론 항체는 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 통해 선택적 종양내 Treg 고갈을 매개하는 것으로 나타났다. CCR8은 종양 침윤 Treg에 의해 우선적으로 발현되고 말초 혈액 Treg에서 또는 유익한 효과기 T 세포 군집에 의해 고도로 발현되지 않기 때문에, 항-CCR8 항체는 종양내 Treg를 고갈시키고 항-종양 면역을 향상시킬 것이다. 항-CCR8 항체 단일요법은 독립적으로 효과적이지만, 종양 내에서 Treg의 특이적 제거는 항종양 면역 반응을 동시에 자극하는 것을 목표로 하는 적절한 조합 요법 접근법에 대해 적합한 환경을 제공한다. 예를 들어, Treg 고갈 시 강력한 항-종양 면역을 완전히 유도하는 데 항-PD-1과 같은 관문 억제제와의 조합이 필요할 수 있다.
따라서, CCR8에 특이적으로 결합하고 Treg를 발현하는 CCR8의 ADCC를 매개하는 단일클론, 인간화 항체에 대한 아미노산 서열이 제공된다. 항체는 구조적으로 CCR8에 특이적으로 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 이루어진다. 항체는 또한 단편 결정화 가능 영역(Fc: fragment crystallizable region)을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 항체의 아미노산 서열에 의해 암호화된 바와 같이, 이러한 구조적 요소는 단일요법으로서 또는 다른 치료제와 조합하여 환자에서 고형 종양을 치료하는 데 효과적인 약학적 조성물을 포함한다.
도 1은 인간 또는 시노몰구스 CCR8을 발현하는 Jurkat 세포에 대한 키메라 랫트/hIgG1 인간 CCR8 특이적 키메라 mAb의 결합을 도시한다.
도 2는 에피토프 결합 실험의 결과를 도시한다.
도 3은 ABBV-514의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸다.
도 4a는 내인성 CCR8을 발현하는 TALL-1 세포 또는 TALL-1 CCR8 녹아웃 세포 및 Jurkat 부모 세포 또는 인간 또는 시노 CCR8을 과발현하는 세포에 대한 비푸코실화 ABBV-514의 결합 용량-반응 곡선을 도시한다. 도 4b는 푸코실화(WT PR-1925514) 대 비푸코실화 ABBV-514의 TALL-1 세포에 대한 결합을 도시한다.
도 5a 내지 도 5d는 푸코실화(WT PR-1925514) 대 비푸코실화 ABBV-514에 대한 ADCC 리포터 생물검정 데이터를 도시한다.
도 6은 정제된 NK 효과기 세포 및 TALL-1 표적 세포를 사용한 ADCC 검정의 결과를 도시한다.
도 7은 CCR8에 결합하는 CCL1에 대한 ABBV-514의 효과를 보여주는 CCR8 베타-어레스틴 리포터 검정의 결과를 도시한다.
Treg는 종양내 면역억제 효과를 갖는 CD4+ T 세포의 서브세트이다. Treg는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 활성화, 증식 및 사이토카인 생성을 억제하여, 유해한 자가면역 반응을 방지한다. 그러나, Treg는 또한 종양 면역을 억제하고, 높은 종양내 Treg 수준은 일부 암에서 부정적인 결과와 관련이 있었다.
CCR8은 피부에 대한 제2형 T-헬퍼(Th2) 림프구 면역 반응 및 피부로의 T 세포 추적의 맥락에서 화학주성 및 세포/세포 상호작용을 매개하는 7개의 통과 막관통 단백질로 이루어진 C-C 모티프 케모카인 수용체이다. CCR8-결핍 마우스는 이들이 특정 Th2-연관 전임상 모델에서 강력한 Th2 반응을 일으킬 수 없다는 점을 제외하고는 생존가능하고, 생식력이 있으며, 대체로 정상이다(Chensue et al., J Exp Med 5, 2001). 주로 CCR8과 관련된 리간드는 CCL1이지만, CCL18(인간) 및 CCL8(쥣과) 또한 이 수용체에 대한 리간드이다.
종양에 침윤하는 CCR8-발현 Treg는 고도로 활성화되고 면역억제 표현형을 나타낸다. CCR8 녹아웃 마우스에서의 종양 연구는 CCR8 발현의 손실이 종양 미세환경으로 Treg 동원, 활성화 상태, 또는 억제 용량에 영향을 미치지 않음을 나타낸다(Van Damme et al., J Immunother Cancer. 9(2), 2021). 오히려, CCR8 발현은 고도로 억제된 Treg의 마커이다. 따라서, CCR8-발현 Treg의 고갈은 항-종양 이점을 제공한다.
CCR8-특이적 대리 항체는 ADCC를 통해 선택적 종양내 Treg 고갈을 매개한다. 또한, 항-CCR8 대리 항체는 순환 종양 특이적 CD8+ 효과기 T 림프구의 빈도를 유의하게 향상시킨다. 이러한 효과는 마우스 동계 종양 모델에서 효능과 상관관계가 있다. (Campbell et al., Cancer Research 81, 2021).
본 발명자들은 세포 표면, 예를 들어 종양내 Treg에서 발현된 CCR8에 특이적으로 결합하는 치료적 단일클론 항체를 개발하였다. 일부 구현예에서, 항체는 2개의 가변 사슬을 포함하는데 하나는 중쇄이고 하나는 경쇄이다. 각각의 가변 사슬 상에는, 항체가 CCR8에 결합하게 하는 3개의 CDR이 존재한다. 가변 사슬 둘 다에는, 총 6개의 상이한 CDR이 존재한다. 부가적으로, 항체는 면역글로불린 클래스 G1(IgG1)의 인간 Fc를 포함하는 인간 중쇄 불변 영역을 함유한다. 본원에 기술된 항-CCR8 항체는 푸코실화 또는 비푸코실화될 수 있고, 시험관 내 기능성, 면역안전성, 및 약물-유사 특성을 실증한다.
일부 구현예에서, 항체는 비푸코실화된 IgG Fc 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 비푸코실화된 Fc 불변 영역은 IgG1이다. 비푸코실화는 당업계에 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mol Cancer Ther (2020) 19 (5): 1102-1109)] 및 문헌[PNAS (2013)110(14) 5404-5409]을 참조한다. 예를 들어, 예를 들어 GDP-만노스 4,6-탈수효소의 결핍으로 인해 GDP-푸코스 형성에 결함이 있는 세포주에서 항체의 생성; 푸코실트랜스퍼라아제의 수준이 감소된 세포에서 항체의 생성; GDP-푸코스 수송체의 수준이 감소된 세포에서 항체의 생성; β-1,4-만노실-당단백질 4-β-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(GnT-III)를 과발현하는 세포에서 항체의 생성; 또는 박테리아 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 환원효소(RMD)를 발현하는 세포에서 항체의 생성. 일 구현예에서, 본 발명의 비푸코실화 항-CCR8 항체를 생산하는 데 사용되는 세포는 슈도모나스 RMD를 발현하도록 조작된 CHO 세포이다. 항체의 비푸코실화의 정도는 당업계에 공지된 기술을 통해 결정될 수 있다.
인간 및 시노몰구스 CCR8과 교차 반응하는 항-CCR8 항체를 얻기 위해, 인간 또는 시노몰구스 CCR8을 과발현하는 Jurkat 세포에 결합하는 마우스-인간(랫트/hIgG1) 키메라 항체의 능력을 평가하였다. 결과를 당업계에 공지된 기술에 의해 수행된 바와 같이 유세포분석을 통해 분석하였다. 그 결과, 최종 항-CCR8 항체는 인간 및 시노몰구스 CCR8과 교차 반응하고 두 종에서 ADCC를 매개하지만, 마우스, 랫트 또는 토끼 CCR8에는 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 비푸코실화 항체는, 그 항체의 푸코실화 형태와 비교하여 정제된 자연 살해 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) ADCC 검정에서 향상된 활성뿐만 아니라 IgG에 대한 활성화 수용체에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 항-CCR8 항체의 ADCC 활성은 당업계에 알려진 ADCC 생물검정 기술을 사용하여 입증될 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 시노몰구스 CCR8-발현 Jurkat 세포와 공동배양된 인간 FcγRIIIa V158 또는 F158 대립유전자 변이체 리포터 주에서, 항-CCR8 항체는 당업계에 알려진 기술을 사용한 발광 유도를 통해 측정할 때 ADCC를 촉발시켰다.
또한, 본원에 기재된 항체는 결합에 대해 실질적으로 더 높은 EC50에서만 CCR8에도 결합하는 CCL1과 같은 다른 자연 발생 리간드의 효능 또는 ADCC 활성을 방해한다. 이 시험은 당업계에 알려진 기술에 의해, 예를 들어 베타-어레스틴 리포터 검정을 통해 수행되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"(Ab)는 특정 항원, 예를 들어, CCR8에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본 개시의 항-CCR8 항체는 Treg 상의 인간 CCR8에 결합하여 면역 체계를 조절한다. 본 개시의 항-CCR8 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에 초가변 영역으로도 알려진 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR)로 불린다. 당업계에 알려진 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 묘사하는 아미노산 위치/경계는 문맥 및 당업계에 알려진 다양한 정의에 따라 다양할 수 있다. 가변 도메인 내 일부 위치는 이러한 위치가 한 세트의 기준 하에서는 초가변 영역 내에 있는 것으로 간주될 수 있는 한편, 상이한 세트의 기준 하에서는 초가변 영역 외부에 있는 것으로 간주될 수 있는 하이브리드 초가변 위치로 볼 수 있다. 이러한 위치 중 하나 이상은 또한 연장된 초가변 영역에서 발견될 수 있다. 본 개시내용은 이러한 하이브리드 초가변 위치에서 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 각각, 주로 β-시트 구조를 채택함으로써, 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR로 연결된 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 내 CDR은 FR 영역에 의해 함께 근접하게 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 표적 결합 부위의 형성에 기여한다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)]을 참조한다.
본 개시의 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다클론, 단일클론, 유전자 조작 및/또는 달리 자연적으로 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 항체의 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 IgA(예를 들어 IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 및 IgM으로부터 선택되는 이소형이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CCR8 항체는 IgG1을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-CCR8 항체는 IgG2를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CCR8 항체는 IgG4를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 천연 불변 영역, 동종이형 또는 변이체를 포함한다.
항-CCR8 항체의 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 경쇄 영역 또는 람다(λ) 영역일 수 있다. λ 경쇄 영역은 기지의 하위유형, 예를 들어, λ1, λ 2, λ3 또는 λ4 중 임의의 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CCR8 항체는 카파(κ) 경쇄 영역을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "단일클론 항체"는, 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 제한되지 않는다. 단일클론 항체는 당업계에 알려져 있거나 이용 가능한 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된다. 본 개시에 유용한 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "키메라" 항체는 래트 또는 마우스 항체와 같은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 가변 서열 및 전형적으로 인간 면역글로불린 주형으로부터 선택되는 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
비인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 "인간화" 형태는 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 공통 서열의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질전환되고 내인성 기능성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 개시의 항-CCR8 항체는 전장(온전한) 항체 분자를 포함한다.
항-CCR8 항체는 적어도 하나의 불변 영역-매개 생물학적 효과기 기능을 변경하기 위해 서열이 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항-CCR8 항체는, 예를 들어, 변형되지 않은 항체에 비해 FcγR 상호작용을 향상시키거나 항체의 ADCC 매개능을 향상시키기 위해, 적어도 하나의 불변 영역-매개 생물학적 효과기 기능을 획득하거나 개선하도록 변형된 항체를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 출원 제2006/0134709호 참조). 예를 들어, 본 개시의 항-CCR8 항체는 상응하는 비변형 불면 영역보다 더 큰 친화도로 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIIB에 결합하는 불변 영역을 가질 수 있다. 본 개시의 항-CCR8 항체는 변형된 Fc 영역을 갖고 향상된 ADCC 반응을 매개하는 것일 수 있으며, 여기서 ADCC 반응은 동일한 가변 영역(즉, VH 및 VL) 및 야생형 IgG1 Fc 영역(즉, 야생형 CL, CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는 항체에 비해 향상된다. 아미노산 서열 돌연변이와 같은 ADCC를 향상시킬 수 있는 Fc 변형은 당업계에 알려져 있으며, 다음의 돌연변이 세트를 포함할 수 있다: S239D/I332E; F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L; S239D/I332E/A330L; 및 S298A/E333A/K334A.
인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 항-CCR8 항체는 Fab 아암 교환을 방지하는 것으로 보고된 S228P 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Silva, JP et al. Journal of Biological Chemistry, 290(9), 5462-5469 (2015)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 항-CCR8 항체는, 예를 들어, FcRn 상호작용에 관여하는 특정한 영역에서 면역글로불린 불변 영역 분절을 돌연변이시킴으로써, 태아 Fc 수용체인 FcRn에 대한 이의 결합 친화도를 증가 또는 감소시키는 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, IgG 클래스의 항-CCR8 항체는 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔기 250, 314 및 428 중 적어도 하나가 단독으로 또는 이들의 조합이 치환되도록 돌연변이된다. 위치 250의 경우, 치환 아미노산 잔기는 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 발린, 트립토판 또는 티로신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 위치 314의 경우, 치환 아미노산 잔기는 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 위치 428의 경우, 치환 아미노산 잔기는 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 티로신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 메티오닌 이외의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. Fc 효과기 기능을 변형하는 것으로 알려진 예시적인 치환은 Fc 치환 T250Q와 함께 발생할 수 있는 Fc 치환 M428L이다. 적합한 아미노산 치환의 추가적인 구체적인 조합은 미국 특허 제7,217,797호의 표 1에서 확인된다. 이러한 돌연변이는 항체가 분해되는 것을 보호하고 이의 반감기를 증가시키는 FcRn에 대한 결합을 증가시킨다.
인간 CCR8에 대해 높은 친화도를 갖는 항-CCR8 항체는 치료 및 진단 용도에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시는 인간 CCR8에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CCR8 항체는 적어도 약 100 nM의 친화도로 인간 CCR8에 결합하지만, 예를 들어, 적어도 약 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 또는 심지어 그 이상의 더 높은 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1 pM 내지 약 10 nM, 약 100 pM 내지 약 10 nM, 약 100 pM 내지 약 1 nM의 범위의 친화도 또는 전술한 값 사이의 임의의 범위의 친화도로 인간 CCR8에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 2세트의 6개의 상이한 상보성 결정 영역(CDR), 2세트의 2개의 상이한 가변 영역, 2개의 완전 중쇄, 2개의 완전 경쇄 및 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는 단일클론 항-CCR8 항체를 제공한다.
일부 구현예에서, 항체는 케모카인 수용체 8에 결합하는 재조합, 비푸코실화, 인간화, IgG1 카파 단일클론 항체이다.
일 구현예에서, 항체는 하기 서열을 포함하는 6개의 CDR을 포함한다:
CDR-H1: GFIFSNAVMY(서열번호 1)
CDR-H2: RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)
CDR-H3: GDRNKPFAY(서열번호 3)
CDR-L1: RASTSVITLLH(서열번호 4)
CDR-L2: GASNLES(서열번호 5)
CDR-L3: QQSWNDPYT(서열번호 6)
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 서열 번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2; 서열 번호 3으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 번호 5로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2; 및 서열 번호 6으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 서열번호 7
EVQLVESGGGLVQPGGSLKL SCAASGFIFSNAVMYWVRQA SGKGLEWVARIKTKFNNYAT YYADAVKGRFTISRDDSKNM VYLQMNSLKTEDTAVYYCTA GDRNKPFAYWGQGTLVTVSS (서열번호 7)로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8: ETVVTQSPATLSLSPGERAT LSCRASTSVITLLHWFQQKP GQAPRLLIHGASNLESRVPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFATYFCQQSWNDPYTFGQ GTKLEIK(서열번호 8)로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 서열 번호 9로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(불변 영역은 볼드체임; 가변 중쇄 도메인은 밑줄표시됨; CDR은 밑줄 표시된 볼드 이탤릭체임 (나타나는 순서로, 각각 서열 번호 1 내지 3으로 개시됨)):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFIFSNAVMY WVRQASGKGLEWVA RIKTKFNNYATYYADAVKG RFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTA GDRNKPFAY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호 9로 개시된 전장 서열) 및 서열 번호 10으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(불변 영역은 볼드체임; 가변 중쇄 도메인은 밑줄 표시됨; CDR은 밑줄 표시된 볼드 이탤릭체 (나타난 순서로 각각 서열번호 4 내지 6으로 개시된 CDR 서열)):
ETVVTQSPATLSLSPGERATLSC RASTSVITLLH WFQQKPGQAPRLLIH GASNLES RVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFC QQSWNDPYT FGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 10으로 개시된 전장 서열)를 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시의 항체는 서열 번호 10에 따른 경쇄, 및 C-말단 리신이 절단된 중쇄, 예를 들어, C-말단 리신이 절단된 서열 번호 9에 따른 중쇄를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFIFSNAVMY WVRQASGKGLEWVA RIKTKFNNYATYYADAVKG RFTISRDDSKNMVYLQMNSLKTEDTAVYYCTA GDRNKPFAY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 11로 개시된 말단 리신 절단 서열).
일 구현예에서, 본 개시의 항체의 중쇄는 하기 뉴클레오티드 서열(서열 번호 12로 개시된 전장 서열)에 의해 암호화된다:
ATGGAATTCGGCCTGAGCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCGAAGTCCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAAGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCATCTTCAGCAACGCCGTGATGTACTGGGTCCGACAGGCCTCTGGCAAAGGCCTGGAATGGGTCGCCAGAATCAAGACCAAGTTCAACAACTACGCCACCTACTACGCCGACGCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGCAAGAACATGGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACAGCCGGCGACAGAAACAAGCCCTTTGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA
분비 신호 펩티드는 이탤릭체임; 최종 중지 코돈(TGA)을 포함함; 불변 영역은 볼드체임; CDR은 밑줄 표시됨.
일 구현예에서, 본 개시의 항체의 경쇄는 하기 뉴클레오티드 서열(서열번호 13으로 개시된 전장 서열) 에 의해 암호화된다:
ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGACTTCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCAGCAGATGCGAGACAGTGGTCACACAGTCTCCCGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCACCAGCGTGATCACACTGCTGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGACAGGCTCCCAGACTGCTGATTCACGGCGCCAGCAACCTGGAAAGCAGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATAAGCAGCCTGGAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGAGCTGGAACGACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT TAG
분비 신호 펩티드는 이탤릭체임; 최종 중지 코돈(TAG)을 포함함; 불변 영역은 볼드체임; CDR은 밑줄 표시됨.
일부 구현예에서, 항체는 인간 CH1, 인간 힌지, 인간 CH2 및 인간 CH3 도메인을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 중쇄 불변 영역은 Fc 부분을 포함하며, 여기서 Fc 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 이소형이다. 일 구현예에서, Fc는 IgG1이고, 동종이형은 z 비 a이다. 일 구현예에서, 경쇄는 카파 경쇄이다.
일부 구현예에서, 항체는 비푸코실화된 IgG1 Fc 불변 영역을 포함한다. 비푸코실화는 당업계에 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 GDP-만노스 4,6-탈수효소의 결핍으로 인해 GDP-푸코스 형성에 결함이 있는 세포주에서 항체의 생성; 푸코실트랜스퍼라아제의 수준이 감소된 세포에서 항체의 생성; GDP-푸코스 수송체의 수준이 감소된 세포에서 항체의 생성; β-1,4-만노실-당단백질 4-β-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(GnT-III)를 과발현하는 세포에서 항체의 생성; 또는 박테리아 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로스 환원효소(RMD)를 발현하는 세포에서 항체의 생성. 본 발명의 비푸코실화 항-CCR8 항체를 생성하는 데 사용된 세포는 슈도모나스 RMD를 발현하도록 조작된 CHO 세포이다. 항체의 비푸코실화의 정도는 당업계에 공지된 기술을 통해 결정될 수 있다. 통상적으로, 항체는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 약 99%, 또는 약 100% 비푸코실화된다. 바람직하게는, 비푸코실화의 정도는 80% 이상이다. 일부 구현예에서, 항체는 위치 ASN-300(EU: ASN-297)에서 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 약 100% 비푸코실화된다. 비푸코실화는 비푸코실화의 정도가 단편화된 항체의 극성-의존적 분리에 의해 결정되는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC) 검정 기술을 통해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 총 비푸코실화 글리칸 종은 형광 검출을 이용한 HILIC에 의한 방출된 N-연결 글리칸의 분석에 의해 결정된다. 글리칸은 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGaseF)를 사용하여 방출되고, 이어서 형광 태그로 표지된다. 형광 표지된 N-연결된 글리칸은 형광 검출을 이용한 HILIC에 의해 분석된다. 비푸코실화 글리칸 종의 백분율은 크로마토그램에서 모든 글리칸 피크의 총 피크 면적에 대한 모든 비푸코실화 글리칸 피크의 피크 면적의 합에 기초하여 결정된다. 비푸코실화 글리칸 종의 백분율의 결정에 0.5% 이상의 상대 존재비를 갖는 모든 피크가 포함된다.
7.1. 항-CCR8 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 발현 시스템 및 항체의 제조 방법
본 개시는 항-CCR8 항체에 대한 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 본 개시의 항-CCR8 항체를 생산할 수 있는 숙주 세포를 포함한다.
본 개시의 항-CCR8 항체는 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포는, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되고 선택적으로 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되며 이러한 배지로부터 항체가 회수될 수 있도록, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염(transfect)된다.
이러한 항-CCR8 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해, 먼저 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA 단편을 얻는다. 이들 DNA는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 암호화하는 생식계열 DNA 또는 cDNA의 증폭 및 변형, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 얻을 수 있다.
일단 항-CCR8 항체-관련 VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이러한 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작될 수 있으며, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL-암호화 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 또 다른 단백질을 암호화하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임 내에 남아 있도록 2개의 DNA 단편이 결합된다는 것을 의미하도록 의도된다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 중쇄 불변 영역(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 VH-암호화 DNA를 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 특정 실시형태에서 IgG1 또는 IgG4이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역, CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-암호화 DNA를 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Kabat, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있지만, 특정 구현예에서 카파 불변 영역이다.
본 개시의 항-CCR8 항체를 발현시키기 위해, 전술된 바와 같이 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 맥락에서, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터에 라이게이션되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로는 유전자 둘 다 동일한 발현 벡터에 삽입된다.
항체 유전자는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 단부(blunt end) 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 항-CCR8 항체-관련 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들어, 항-CCR8 단일클론 항체-관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키는 하나의 접근법은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하는 발현 벡터에 각각 삽입하여 VH 분절이 벡터 내의 CH 분절(들)에 작동 가능하게 연결되고 VL 분절이 벡터 내의 CL 분절에 작동 가능하게 연결되도록 하는 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내에 연결되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 개시내용의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 운반한다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시의 재조합 발현 벡터는 부가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어 복제 원점) 및 선택성 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다. 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포에 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하기 위해 보편적으로 사용되는 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공법, 리포펙션, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하도록 의도된다.
원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 개시내용의 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 특정 구현예에서, 적절하게 접히고 면역학적으로 활성인 항체의 최적 분비인 항체의 발현은 진핵 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 수행된다. 본 개시의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시적인 포유류 숙주 세포는, 예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 선택성 마커와 함께 사용되는, 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(문헌[Urlaub and Chasin, 1980, proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 DHFR-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 숙주 세포는 또한 Fab 단편 또는 scFv 분자와 같은 무손상 항체의 일부를 생산하는 데 사용될 수 있다. 위 절차에 대한 변형은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 개시의 항-CCR8 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 다는 아님)를 암호화하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다.
재조합 DNA 기술은 또한 인간 CCR8에 결합하는 데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는 데 사용될 수 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자 또한 개시내용의 항체에 의해 포괄된다.
본 개시의 항-CCR8 항체의 재조합 발현을 위해, 숙주 세포에는 본 개시의 2개의 발현 벡터가 공동 형질감염될 수 있으며, 제1 벡터는 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하고 제2 벡터는 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화한다. 2개의 벡터는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있거나, 이들 벡터는 각각 별도의 선택성 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드를 둘 다 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다.
항-CCR8 항체의 하나 이상의 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 예를 들어, 상이한 CDR 서열을 갖는 항체, Fc 수용체에 대한 친화도가 감소된 항체 또는 상이한 서브클래스의 항체를 생성하기 위해, 코팅 서열에 추가 변경 또는 돌연변이가 도입될 수 있다.
본 개시의 항-CCR8 항체는 화학적 합성에 의해서 또는 무세포 플랫폼을 사용하여 생산될 수도 있다.
7.2. 항-CCR8 항체의 정제
일단 본 개시의 폴리펩티드가 재조합 발현에 의해 생산되면, 이는 단백질 정제를 위해 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 일단 단리되면, 항-CCR8 항체를 추가로 정제할 수 있다.
7.3. 조성물
본 개시내용의 항체는 대상체에게 투여하기에 적합한 조성물로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 조성물은 본 개시의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
일 구현예에서, 복수의 항-CCR8 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 복수의 항-CCR8 항체는 비푸코실화된다. 통상적으로, 복수의 항체는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 약 99%, 또는 약 100% 비푸코실화된다. 바람직하게는, 비푸코실화의 정도는 90% 이상이다. 일부 구현예에서, 복수의 항체는 위치 ASN-300(EU: ASN-297)에서 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 약 100% 비푸코실화된다. 항체의 비푸코실화의 정도는 당업계에 공지된 기술을 통해 결정될 수 있다. 비푸코실화는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC) 검정 기술을 통해 결정될 수 있으며, 여기서 비푸코실화의 정도는 단편화된 항체의 극성-의존적 분리에 의해 결정된다. 일 구현예에서, 총 비푸코실화 글리칸 종은 형광 검출을 이용한 HILIC에 의한 방출된 N-연결 글리칸의 분석에 의해 결정된다. 글리칸은 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGaseF)를 사용하여 방출되고, 이어서 형광 태그로 표지된다. 형광 표지된 N-연결된 글리칸은 형광 검출을 이용한 HILIC에 의해 분석된다. 비푸코실화 글리칸 종의 백분율은 크로마토그램에서 모든 글리칸 피크의 총 피크 면적에 대한 모든 비푸코실화 글리칸 피크의 피크 면적의 합에 기초하여 결정된다. 비푸코실화 글리칸 종의 백분율의 결정에 0.5% 이상의 상대 존재비를 갖는 모든 피크가 포함된다.
7.4. 대상 항체의 특성의 요약
이에 제한되지는 않으나, ABBV-514에 의해 예시되는 대상 항체의 특성은 하기를 포함한다:
CCR8에 대한 고친화도 결합, 예를 들어, 2 μg/mL 이하, 1 μg/mL 이하, 0.3 내지 0.7 μg/mL, 0.4 내지 0.6 μg/mL, 약 0.5 μg/mL, 또는 0.55 μg/mL의 FACS 결합 평균 EC50, TALL-1 세포 상에서 내인성으로 발현된 CCR8로 결정됨(인간 성인 T-ALL; RRID: CVCL 1736); 또는 2 μg/mL 이하, 1 μg/mL 이하, 0.3 내지 0.8 μg/mL, 0.4 내지 0.7 μg/mL, 약 0.5 μg/mL, 또는 0.6 μg/mL의 Jurkat 세포 상에 과발현된 인간 CCR8에 대한 FACS 결합 평균 EC50; 또는 2 μg/mL 이하, 1 μg/mL 이하, 0.2 내지 0.6 μg/mL, 0.3 내지 0.5 μg/mL, 약 0.5 μg/mL, 또는 0.48 μg/mL의 인간 혈액 내 CD45RA 저 Treg 상에서 발현된 CCR8에 대한 FACS 결합 평균 EC50.
인간 CCR8에 대한 높은 특이적 결합, 예를 들어, TALL-1 CCR8 녹아웃 세포 또는 부모 Jurkat 세포에 대한 특이적 FACS 결합이 없음.
시노몰구스 CCR8과의 교차 반응성, 예를 들어, 5 μg/mL 이하, 3 μg/mL 이하, 2 μg/mL 이하, 대략 1.5 μg/mL, 또는 1.82 μg/mL의 Jurkat 세포 상에서 과발현된 시노 CCR8에 대한 FACS 결합 평균 EC50; 또는 시노 혈액 내 CD45RA 저 Treg 상에서 발현되는 CCR8에 대해 5 μg/mL 이하, 3 μg/mL 이하, 2 μg/mL 이하, 대략 1.5 μg/mL, 또는 1.62 μg/mL.
CCL1/CCR8 상호작용을 차단하는 불량한 능력, 예를 들어, 인간 CCR8에 대한 EC50보다 적어도 30 x 더 높거나, 적어도 40 x 더 높거나, 30 x 내지 70 x 사이이거나, 적어도 50 x 더 높거나, 적어도 약 50 x 더 높은 CCL1/CCR8 차단 활성의 EC50.
동일한 가변 영역 및 야생형, 푸코실화 IgG1을 갖는 항체에 대해 ADCC를 유도하는 능력의 향상.
동일한 가변 영역 및 야생형, 푸코실화 IgG1을 갖는 항체에 대한 Fcγ 수용체에 대한 결합의 향상.
사이토카인 방출 검정에 의해 결정되는 양호한 면역안전성.
7.5. 사용 방법
구현예에서, 본원에 기술된 방법은 고형 종양을 갖는 환자를 본 발명의 항-CCR8 항체로 치료하는 단계를 수반한다. 구현예에서, 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물이 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
PD-1 불응성 Pan02 마우스 모델에서, CCR8과 PD-1 표적화 항체의 조합은 항체 중 하나를 사용한 단일요법에 비해 개선된 생체내 효능을 나타냈다. 면역억제 CCR8+Treg를 고갈시키는 것은 PD-1/PD 리간드 1(PD-L1) 차단과 상승 작용하여 더 강한 CD8+ 효과기 T-세포 반응을 촉진하고 항종양 면역을 향상시킬 수 있다. 일 구현예에서, 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물은 PD-1 또는 PD-L1 표적화 항체의 투여를 포함하는 병용 요법의 일부로서 투여된다. 일 구현예에서, 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물은 펨브롤리주맙, 부디갈리맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 또는 도스타리맙에 의한 병용 요법으로서 투여된다. 일 구현예에서, 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물은 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙과의 병용 요법으로서 투여된다.
8 실시예
본원에 기술된 항체 및 결합 단편의 예시적인 구현예의 특정 특징 및 특성을 강조하는 하기 실시예는 예시의 목적으로 제공된다.
청구항 8.1. 실시예 1: 랫트 하이브리도마의 생성
랫트를 2개의 상이한 전장 인간 CCR8 cDNA 벡터(각각의 벡터에 대해 6 마리 랫트)로 면역화하였다. 림프절 세포를 단리하고 NS0에 융합하여 하이브리도마를 생성하였다. 확장 후에, 하이브리도마 상청액을 HEK293 세포에서 과발현된 인간 또는 시노몰구스("시노" 또는 "cy") CCR8에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 46 랫트/hIgG1 키메라 mAb를 고처리량 항체 생성을 통해 발현시켰고, 21개가 인간 CCR8에 결합하는 것으로 확인되었다(도 1). Jurkat CCR8 과발현 주에서 가장 높은 시노 교차-반응성에 기초하여 4개의 키메라 mAb AC-254290, AC-254532, AC-254546, 및 AC-254259를 완전 인간화를 위해 선택하였다.
8.2. 실시예 2: huCCR8에 대한 경쟁 결합에 의한 에피토프 맵핑
선택된 키메라 항체를 BD Biosciences(클론 433H) 및 Biolegend(클론 L263G8)로부터의 인간 CCR8 항체와 함께 세포 에피토프 맵핑 검정을 통해 Jurkat 세포 상에서 인간 CCR8에 대한 결합에 대해 시험하였다. 두 시판 항체 모두 인간 CCR8-형질감염체로 마우스를 면역화함으로써 생성된 것으로 보고되었고, 시노 CCR8과 교차 반응하지 않는다. 항체는 항체 1의 포화 농도로 염색하고, 세척하고, 이어서 항체 2로 염색하거나, 그 반대인, 세포로 쌍으로 시험하였다.
mAb AC-254290 및 AC-254532는 어느 순서로든 결합을 방해하며, 이는 이들이 동일한 에피토프(에피토프 A)에 결합한다는 것을 시사한다(도 2). AC-254546은 AC-254290 및 AC-254532의 에피토프 결합을 보통 정도로 방해하는 것으로 나타났지만, 동일한 에피토프에 대한 결합의 증거는 없었다; 따라서 AC-254546은 고유하지만 에피토프 A에 가까운 에피토프 B에 결합한다. AC-254259는 어떠한 다른 항체와 결합 간섭을 갖지 않았으므로, 고유한 에피토프(에피토프 C)일 가능성이 있다. BD Biosciences 클론 433H는 AC-254290과 동일한 에피토프 결합 및 AC-254532, AC-254546 및 Biolegend 클론 L263G8의 결합을 일부 방배하고, 따라서 에피토프 A와 결합한다. BD Biosciences 클론 433H 및 다른 항체와의 간섭 데이터에 기초하여 Biolegend 클론 L263G8은 에피토프 A에 가깝지만 에피토프 B와는 가깝지 않은 고유한 에피토프 D에 결합한다.
8.3. 실시예 3: 랫트 가변 도메인/인간 IgG1 Fc 키메라의 인간화
(i) 설치류 항체 서열을 식별하는 단계; (ii) CDR 및 항체 프레임워크를 식별하는 단계; (iii) VH-VL 구조 모델을 생성하는 단계; (iv) 설치류 항체의 기능을 유지하기 위해, 역돌연변이에 대한 프레임워크 잔기를 식별하는 단계; (v) 높은 식별도, 가장 유사한 CDR 표준 구조, 및 가장 적은 역돌연변이 필요성을 갖는 인간 생식계열을 선택하는 단계; 및 (iv) CDR 이식에 의해 VH/VL 서열을 생성하고 선택된 역돌연변이를 혼입시키는 단계에 의해 4종의 키메라 항체인 AC-254290, AC-254532, AC-254546, 및 AC-254259가 인간화되었다.
각각의 선택된 항체에 대해 4개의 인간화 항체를 생성하였다. AC-254290은 인간화를 위한 서열 기반 및 구조-기반 접근법 둘 모두를 필요로 하였다. 곧바로 CDR 이식은 인간 CCR8 발현 Jurkat 세포에 대한 불량한 결합을 갖는 항체를 생성하였다. 예측된 설치류 VH/VL 구조/계면에 기초한 역돌연변이를 시험하였다. HCDR3 전의 잔기 트리플렛은 CTA였으며, 이는 비정형이다. 위치 94(CTA 중 A)는 거의 항상 아르기닌(R)이다. CTR을 갖는 2개의 인간화 버전은 인간 CCR8 발현 Jurkat 세포에 대한 불량한 결합을 나타내었는데, 3.96 및 5.61 μg/mL의 EC50을 가졌다. 대조적으로, HCDR3 전에 CTA를 갖는 2개의 인간화 버전(CTAGDRNKPFAY(서열번호 14)) 중 하나인 AC-264700은 강한 결합을 입증하였는데, AC-254290 부모 항체(0.4538 μg/mL의 EC50)와 유리하게 비교하여 0.2559 및 0.2302 μg/mL의 EC50을 가졌다.
인간화 항체를 인간 또는 시노몰구스 CCR8에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. EC50은 인간 또는 시노몰구스 CCR8 과발현 Jurkat 세포에 대한 결합에 대하여 30 μg/mL에서 시작하여 5 x 희석물로 8가지 농도의 항체를 시험함으로써 결정하였다. 시험 CCR8 항체와 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 플루오로크롬 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 유세포분석을 통해 분석하였다.
AC-254259 및 AC-254532는 각각 시노CCR8에 대한 결합 감소 및 HEK293 세포에 대한 높은 비특이적 결합을 나타냈다. 그의 우수한 표적 결합, 비특이적 결합의 부재, 및 신뢰성 공학에 대한 제한된 요건으로 인해 AC-264711(인간화 AC-254546) 및 AC-264700(인간화 AC-254290)을 발전시켰다.
8.4. 실시예 4: AC-264700의 신뢰성 공학
AC-264700은 각각 HCDR2 내 및 LCDR1 내 아미노산 61~62 및 27~28(kabat)에서 이성질화에 대한 위험이 있는 DS 모티프 및 LCDR3 내 아미노산 위치 94~95(kabat)에서 잠재적인 단편화 대상이 되도록 하는 DP 모티프를 가졌다. HCDR2 DS 신뢰성은 이전 항체와의 경험에 기초하여 DA로 돌연변이되었다. DP 모티프의 제거는 결합을 파괴하지만 DP 모티프를 보유하는 항체의 단편화는 응력 시험 하에서 나타나지 않았다. 22개의 LCDR1 DS 변이체 항체를 생성하였고, 이들의 결합 특성을 과발현된 huCCR8 또는 cyCCR8 Jurkat 세포에 대한 유세포분석을 사용하여 평가하였다. Jurkat 부모 세포에 대한 비특이적 결합을 유세포분석을 통해 평가하였다. 변이체 항체 중 10개를 유리한 기능적 및 약물-유사 특성에 기초하여 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 결합, 감소된 자가-상호작용, 비특이성의 결여, 시노 교차 반응성, 및 hFcγRIIIa V 변이체 ADCC 리포터 생물검정(Promega)에서 활성을 포함하는 특성들의 전체 조합에 기초하여 발전을 위해 2종을 선택하였다.
후보 분자를 Jurkat 세포의 표면 상 과발현된 huCCR8 또는 cyCCR8에 대한 공지된 방법을 통해 유세포분석을 사용하여 결합 용량에 대해 평가하였다. 예시적인 항체를 자가-상호작용하고, huCCR8 및 cyCCR8에 결합하는 능력, 리포터 생물검정을 이용하여 ADCC에 대한 용량,및 HEK293 세포에 대한 비특이적 결합을 시험하였다. AC-277357은 부모 및 다른 후보 항체와 비교할 때 huCCR8 및 cyCCR8 Jurkat 세포 둘 모두에 대해 우수한 결합 능력을 가졌다(표 1). 각각의 후보에 대한 AC-SINS 자가-상호작용 점수는 1보다 작았다. 100 μg/mL에서, 비특이적 결합 최대값은 97 내지 144 GMFI 범위였다. 10 μg/mL에서, 비특이적 결합 최대값은 94~111 GFMI 범위였다. 1 μg/mL에서, 비특이적 결합 최대값은 87~102 GMFI 범위였다. AC-277357은 ADCC 리포터 생물검정에서 100 μg/mL에서 HEK293 세포에 대해 최저 비특이적 결합 최대, 가장 강한 huCCR8 및 cyCCR8 Jurkat 세포에 대한 결합, 및 huCCR8 및 cyCCR8 Jurkat 표적 세포 둘 모두에 의한 신호의 가장 큰 배수 유도를 가졌다. 또한, AC-277357은 부모 항체와 비교할 때 최저 자가-상호작용 점수 중 하나를 가졌다.
[표 1]
8.5. 실시예 5: AC-264711의 신뢰성 공학
AC-264711은 HCDR2 영역 내 아미노산 60~61(kabat)에서 탈아미노화에 대한 위험을 제시하는 NS 모티프를 가졌다. 또한, HCDR3 내 잔기 M100c는 응력 시험 중 높은 수준의 산화를 나타냈다.
책임을 제거하기 위한 NS 돌연변이를 갖는 후보 AC-264711 변이체를 자가-상호작용, HEK293에 대한 비특이적 결합, huCCR8 및 cyCCR8 Jurkat 세포에 대한 결합, 표적으로서 huCCR8를 발현하는 Jurkat 세포를 이용한 ADDC 리포터 생물검정에서 신호를 유도하는 능력에 대해 시험하였다. NS 모티프를 제거하는 것이 허용되었다. 29개의 NS 변이체를 생성하고, Jurkat 부모 세포와 huCCR8 또는 cyCCR8 과발현 Jurkat 세포에 대한 유세포 분석을 사용하여 이들의 결합 특성을 평가하였다. 최상의 결합 및 약물-유사 특성 프로파일을 갖는 5개의 항체를 ADCC 리포터 생물검정에서 시험하였고, 산화를 방지하기 위해, 특성의 최상의 조합을 갖는 3개의 항체 AC-275889, AC-275896 및 AC-275898에서 M100c 돌연변이를 진행시켰다.
M100c 돌연변이를 갖는 AC-275889, AC-275896 및 AC-275898의 변이체를 생성하고 NS 돌연변이체와 동일한 검정으로 시험하였다. 이들 검정으로부터의 데이터를 사용하여 약물-유사 특성 시험을 위한 8개의 항체를 우선순위화하였다. AC-291774 및 AC-291790은 각각 8.38 및 6.75에서 가장 높은 자가-상호작용 AC-SINS 점수를 가졌다. 나머지 후보는 1.73 내지 2.79 범위의 비슷한 AC-SINS 점수를 가졌다. AC-275896 및 AC-275898은 각각 1780 및 1065, GFMI에서 HEK293 세포에 대해 가장 큰 비특이적 결합을 가졌다. AC-291790, AC-275889, 및 AC-275898은 각각 335, 148, 및 141의 비특이적 결합 최대값을 가졌다. 10 μg/mL 및 1 μg/mL에서, 모든 후보 분자는 각각 61 내지 67 및 57 내지 60의 범위의 비교가능한 비특이적 결합 최대값을 가졌다. AC-291774 및 AC-291790은 Jurkat 부모 세포에 대한 결합 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 나타낸 바와 같이 가장 낮은 비특이적 결합을 가진 반면, huCCR8 및 cyCCR8 발현 Jurkat 세포에 대한 강력한 결합을 유지하고, AC-275889, AC-275896 및 AC-275898과 비교할 때 유사한 huCCR8 및 cyCCR8 발현 Jurkat 세포 둘 다를 이용한 ADCC 리포터 검정의 배수 유도 및 EC50을 유지하였다(표 2).
[표 2]
8.6. 실시예 6: 최종 후보 항체 선택
AC-277357, AC-277371, AC-291774 및 AC-291790을 선택하여 추가의 약물-유사 특성 및 시험관내 면역안전성 실험에서 추가로 평가하였다. 특성화를 위한 비푸코실화 변이체를 생성하기 위해, 푸코스의 신생 합성에서 중간체를 최종 산물로 전환하여 비푸코실화 AC-277357의 생성을 초래하는, 슈도모나스 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥스룰로스 환원효소(RMD)의 발현을 위한 플라스미드로 AC-277357을 발현하는 세포를 형질감염시켰다.
후보 분자는 Jurkat huCCR8, Jurkat cyCCR8 및 TALL-1 결합 활성, TALL-1을 표적으로 사용한 hPBMC ADCC 활성, 표적으로 huCCR8를 과발현하는 Jurkat 세포를 이용한 F158 효과기 세포 및 표적으로 huCCR8 과발현 Jurkat 세포를 이용한 V158 효과기 세포에서의 ADCC 활성을 평가하였다. AC-277357(PR-1925514로도 지칭됨)은 TALL-1 세포 상에서 내인성 수준의 CCR8 발현에 대해 결합의 개선을 나타내었고, 비푸코실화 버전은 1차 세포 ADCC 검정에서 더 활성이었다(데이터 미도시). AC-277357/PR-1925514는 인간 Treg에서 CCR8에 더 강력하게 결합하고, 사이토카인 방출 검정에서 AC-291774(PR-1928444로도 지칭됨)보다 더 양호한 프로파일을 갖는다(데이터 미도시). 비푸코실화 인간 IgG1 Fc를 갖는 AC-277357/PR-1925514를 리드 항체로서 선택하였는데, 이는 최상의 시험관내 기능성 및 시험관내 면역안전성(IVIS) 프로파일뿐만 아니라 탁월한 약물 유사 특성을 갖기 때문이다.
8.7. 실시예 7: 결합 및 기능적 효력 검정
항체를 단일 점 유세포분석을 통해 스크리닝하여 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CCR8을 과발현하는 Jurkat 세포주에 대한 결합을 평가하였다. 유세포분석을 통해 Jurkat 인간 CCR8, Jurkat 시노 CCR8 및 부모 Jurkat 세포에 대한 결합을 대해 5 x 희석물로 30 μg/mL에서 시작하는 8가지 농도의 항체를 시험함으로써 EC50을 결정하였다. 시험 CCR8 항체와 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 플루오로크롬 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 유세포분석을 통해 분석하였다.
인간 FcγRIIIa V 변이체 코어 키트 또는 인간 FcγRIIIa F 변이체 세포 증식 모델을 Promega로부터 구입하고 지시된 바와 같이 사용하였다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CCR8을 과발현하는 Jurkat 표적 세포주 또는 부모 Jurkat 대조군 세포를 ADCC 검정 완충액에서 1회 세척하고, ADCC 검정 완충액에 mL당 6 x106 세포로 희석하고, 백색 벽 96-웰 검정 플레이트(Costar)에 웰당 25 μL로 도말하였다. 항체를 웰 당 25 μL로 첨가하기 위해 ADCC 검정 완충액에 3 x 최종 농도로 희석하였다(1 μg/mL 내지 0.000064 μg/mL 범위의 1:5 배수 7점 희석을 시험하였다). 효과기 세포(인간 FcγRIIIa V158 변이체, 인간 FcγRIIIa F158 변이체, 또는 마우스 FcγRIV 및 반딧불이 루시퍼라아제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 안정적으로 발현함)를 해동하고 1:2.5의 최종 효과기 대 표적비로 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 인큐베이션 후, BioGlo 시약(Promega)을 지시된 대로 혼합하고 첨가한 후, 발광 신호를 측정하였다.
8.8. 실시예 8: ABBV-514에 대한 용량 반응 곡선
푸코실화 및 비푸코실화(재명명된 ABBV-514) 버전의 AC-277357/PR-1925514를 인간 또는 시노 CCR8을 과발현하는 Jurkat 세포주 및 내인성 수준의 CCR8을 발현하는 TALL-1 세포에 대한 세포 결합을 평가하였다. 위에서 논의된 유사한 방법을 사용하여 유세포분석을 통해 세포 결합을 평가하였다. 추가적으로, 부모 Jurkat(CCR8 발현 없음) 및 CCR8 녹아웃(KO) TALL-1 조절 주에 대해 결합을 평가하였다. ABBV-514는 Jurkat 세포에서 과발현된 인간 및 시노 CCR8 둘 모두에 결합을 나타냈지만, 부모 Jurkat 또는 CCR8 KO TALL-1 세포에는 결합하지 않았다(도 4a). ABBV-514는 또한 푸코실화(WT) AC-277357/PR-1925514의 것과 유사한 TALL-1 세포 상의 내인성 CCR8에 결합하였다(도 4b).
푸코실화 WT PR-1925514 및 ABBV-514 둘 모두는 인간(도 5a, 5b) 또는 시노(도 5c, 5d) CCR8 과발현 Jurkat 세포와 공동배양된 FcγRIIIa V158(도 5a, 5c) 또는 F158(도 5b, 5d) 대립유전자 변이체 리포터 주를 사용하여 인간 FcγRIIIa 리포터 세포-기반 생물검정법에서 발광 유도에 의해 측정된 바와 같이 ADCC를 매개한다. 미처리 공동배양에 비해 발광의 배수 변화를 2 내지 5개의 독립적인 실험의 평균 ±SEM으로서 제시한다. ABBV-514는 푸코실화 WT PR-1925514와 비교하여 ADCC 리포터 생물검정에 의해 나타낸 바와 같이 증가된 ADCC 활성을 나타냈다. μg/mL로 표시된 농도와 비교하기 위해, 1 μg/mL의 항체의 농도는 6.76 nM과 같다.
8.9. 실시예 9: ABBV-514에 대한 1차 세포 ADCC 검정 데이터
ABBV-514의 활성을 TALL-1 세포를 표적으로서 사용하고 인간 1차 NK 세포를 효과기로서 사용하여 세포 세포독성-기반 ADCC 검정에서 추가로 평가하였다. NK 세포의 6개의 공여자 공급원을 표적 세포로서 사용하였고, 위에서 논의된 유사한 방법을 사용하여 유세포분석을 통해 TALL-1 표적 세포의 세포 사멸을 평가하였다. ABBV-514는 6개의 공여자 NK 세포 시편 모두에 의해 CCR8을 발현하는 TALL-1 세포의 ADCC를 매개하였다(도 6). 인간 전혈 배양물에서의 ADCC 활성을 위에 기재된 적응된 절차를 사용하여 유세포분석을 통해 평가하였다. 48시간 후, ABBV-514를 사용한 인간 전혈 배양물을 분석하여, 총 CD45+ 조혈 세포 중 CD45RA 저 Treg의 분율을 평가하였다. CD45RA 저 Treg는 CCR8 발현이 풍부한 것으로 알려진, 살아있는 CD45+, CD3+, CD4+, CD25+, CD127 저, Foxp3+, CD45RA 저 세포를 포함한다. 11명의 건강한 공여자로부터의 인간 전혈 세포 데이터를 평가하였다. 각각의 공여자에서, ABBV-514는 살아있는 CD45+ 세포 중 CD45RA 저 Treg의 양의 백분율을 감소시켰다(데이터 미도시).
8.10. 실시예 10: ABBV-514에 의한 CCL1 리간드 차단의 평가
CCR8 베타-어레스틴 리포터 검정을 사용하여 ABBV-514가 CCR8과 그의 리간드인 CCL1과의 상호작용을 차단하는지 여부를 결정하였다(도 7). 결합하거나 ADCC 활성이 관찰된 것보다 실질적으로 더 높은 농도의 항체에서만 ABBV-514의 존재 하에 CCL1-매개 리포터 활성화의 억제가 관찰되었는데, 23.1 μg/mL에서 CCL1 차단의 EC50이 관찰되었다.
9. 예시적인 구현예
다양한 특정 구현예가 예시 및 기재되었고, 일부가 하기에 제시되지만, 본 발명(들)의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 이해될 것이다.
1. (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하는 항-CCR8 항체로서,
VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
VL CDR#3은 QQSWNDPYT(서열번호 6)인, 항-CCR8 항체.
2. 구현예 1에 있어서, 항체는 VH CDR#3 직전에 아미노산 서열 CTA를 포함하며, 이에 의해 항체는 아미노산 서열 CTAGDRNKPFAY(서열 번호 14)를 포함하는, 항-CCR8 항체.
3. 구현예 1에 있어서, 항체는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CCR8 항체.
4. 구현예 1에 있어서, 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-CCR8 항체.
5. 구현예 3에 있어서, 항체는 비푸코실화된, 항-CCR8 항체.
6. 구현예 1의 복수의 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물.
7. 구현예 6에 있어서, 조성물 중의 항-CCR8 항체의 80% 초과가 비푸코실화되는, 조성물.
8. 구현예 1에 있어서, IgG인, 항-CCR8 항체.
9. 구현예 1에 있어서, 항체는 Fc 부분을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역을 포함하되, Fc 부분이 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 이소형인, 항-CCR8 항체.
10. 구현예 9에 있어서, 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-CCR8 항체.
11. 구현예 4에 있어서, 중쇄의 C-말단 리신이 절단된, 항-CCR8 항체.
12. 구현예 1에 있어서, 항체는 인간화 항체인, 항-CCR8 항체.
13. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 구현예 6의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 항-CCR8 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 항체는 (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하되:
VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
VL CDR#3은 QQSWNDPYT(서열번호 6)인, 폴리뉴클레오티드.
15. 구현예 14의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
16. 구현예 15의 벡터로 형질감염된 진핵 숙주 세포.
17. 구현예 16에 있어서, 포유류 숙주 세포인, 진핵 숙주 세포.
18. 항-CCR8 항체의 생산 방법으로서, (a) 제15항의 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 항-CCR8 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
19. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 구현예 6에 따른 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
20. 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 항-CCR8 항체:
(a) 시노몰구스 CCR8과의 교차 반응성;
(b) CCL1/CCR8 상호작용을 차단하는 불량한 능력;
(c) ADCC를 유도하는 향상된 능력
(d) Fcγ 수용체에 대한 향상된 결합; 및
(e) 사이토카인 방출 검정에 의해 결정된 양호한 면역안전성.
21. 하기 특성을 갖는 항-CCR8 항체:
(a) 시노몰구스 CCR8과의 교차 반응성;
(b) CCL1/CCR8 상호작용을 차단하는 불량한 능력;
(c) ADCC를 유도하는 향상된 능력
(d) Fcγ 수용체에 대한 향상된 결합; 및
(e) 사이토카인 방출 검정에 의해 결정된 양호한 면역안전성.
22. 하기 특성을 갖는 항-CCR8 항체:
(a) 시노몰구스 CCR8과의 교차 반응성;
(b) CCL1/CCR8 상호작용을 차단하는 불량한 능력;
(c) ADCC를 유도하는 향상된 능력.
23. 구현예 19 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하되,
VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
VL CDR#3은 QQSWNDPYT(서열번호 6)인, 항-CCR8 항체.
24. 구현예 20 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CCR8 항체.
25. 구현예 20 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-CCR8 항체.
26. 구현예 20 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, 항체는 비푸코실화된, 항-CCR8 항체.
27. 구현예 20 내지 구현예 22 중 어느 하나에 있어서, (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하되,
VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
VL CDR#3은 VQYAQFPWT(서열번호 6)이고,
항체가 비푸코실화되는, 항-CCR8 항체.
28. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 구현예 6의 조성물과 항-PD-1 항체를 포함하는 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 항-PD-1 항체는 부디갈리맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 및 도스타리맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
30. 구현예 29에 있어서, 항-PD-1 항체는 부디갈리맙인, 방법.
31. 구현예 29에 있어서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙인, 방법.
32. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 구현예 6의 조성물과 항-PD-L1 항체를 포함하는 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 구현예 32에 있어서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
34. 구현예 33에 있어서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙인, 방법.
35. 구현예 6에 있어서, 조성물 중의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상의 항-CCR8 항체가 비푸코실화된, 조성물.
36. 구현예 2 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 항체는 비푸코실화된, 항-CCR8 항체.
37. 구현예 36의 복수의 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물.
38. 구현예 37에 있어서, 조성물 내의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상의 항-CCR8 항체가 비푸코실화된, 조성물.
39. 각각 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄 및 각각 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 항-CCR8 항체로서 항체는 비푸코실화된, 항-CCR8 항체.
40. 구현예 39의 복수의 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물.
41. 구현예 40에 있어서, 조성물 내의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 100% 이상의 항-CCR8 항체가 비푸코실화된, 조성물.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하는 항-CCR8 항체로서,
    VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
    VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
    VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
    VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
    VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
    VL CDR#3은 QQSWNDPYT(서열번호 6)인, 항-CCR8 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-CCR8 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-CCR8 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 비푸코실화된, 항-CCR8 항체.
  5. 제1항의 복수의 항-CCR8 항체를 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물 중 80% 초과의 항-CCR8 항체가 비푸코실화된, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, IgG인, 항-CCR8 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 Fc 부분을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역을 포함하되, 상기 Fc 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 이소형인, 항-CCR8 항체.
  9. 제8항에 있어서, 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-CCR8 항체.
  10. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 제4항의 항체를 고형 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 항-CCR8 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 항체는 (i) 3개의 CDR을 포함하는 VH 사슬; 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 VL 사슬을 포함하되:
    VH CDR#1은 GFIFSNAVMY(서열번호 1)이고;
    VH CDR#2는 RIKTKFNNYATYYADAVKG(서열번호 2)이고;
    VH CDR#3은 GDRNKPFAY(서열번호 3)이고;
    VL CDR#1은 RASTSVITLLH(서열번호 4)이고;
    VL CDR#2는 GASNLES(서열번호 5)이고; 및
    VL CDR#3은 QQSWNDPYT(서열번호 6)인, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항의 벡터로 형질감염된 진핵 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 포유류 숙주 세포인, 진핵 숙주 세포.
  15. 항-CCR8 항체의 생산 방법으로서, (a) 제14항의 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 항-CCR8 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 고형 종양을 치료하는 방법으로서, 제5항의 조성물을 고형 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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