KR20240023653A

KR20240023653A - 항-cd3 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20240023653A
Application number: KR1020247002630A
Authority: KR
Inventors: 추이 우; 용주안 가오; 리 저우; 지아셩 디아오; 신루 마; 자오 동; 치앙 리
Original assignee: 앰프소스 바이오파마 상하이 인코포레이티드
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2024-02-22
Also published as: CN117616047A; EP4365198A1; US20240317857A1; AU2022301381A1; WO2023273914A1; JP2024529281A; CA3224398A1; CN115558023A

Abstract

본 발명은 인간 CD3에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 항체를 발현하는 발현 벡터와 숙주세포, 및 상기 항체의 생산 방법을 더 제공하였다. 이외에, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 약물 제조에서의 이의 용도, 여러 가지 질환(종양, 장기 이식 및 자가면역성질환을 포함)을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물에서의 상기 약물의 용도를 더 제공한다.

Description

항-CD3 항체 및 그의 용도

본 발명은 치료성 단클론항체 기술분야에 속하며, 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 CD3에 대한 항체 또는 그 항원 결합 단편에 관한 것이며; 항종양, 장기 이식 및 자가면역질환 등 방면에서의 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

면역세포, 특히 T세포는 면역반응의 전체 과정에서 핵심적인 지위를 가지고 있고, T세포 표면에는 수많은 CD분자, 예를 들어 CD3, CD4, CD8 및 CD28 등이 존재하며, 이러한 CD분자는 T세포의 항원인식, 활성화 증식 또는 무능력, 사멸 및 동종항원 제거 또는 자체내성 등 면역 효과 전체 과정에 광범위하게 참여한다. 이러한 CD분자에서, CD3가 특히 중요하다. CD3분자는 T세포막의 중요한 분화항원이고, 성숙한 T세포의 특징적 마커이며, 네개의 상이한 폴리펩티드 사슬인 ε, γ, δ 및 ζ 사슬로 구성되고, 비공유결합으로 T세포 항원 수용체(TCR)와 TCR-CD3 복합체를 구성함으로써, TCR-CD3 복합체의 세포질 내 조립에 참여할 뿐만 아니라, 각 폴리펩티드 세포질 부위의 면역수용체 티로신 기반 활성 모티프를 통해 항원 자극 신호를 전달한다. CD3분자의 주요 기능은 TCR구조를 안정화시키고, T세포 활성화 신호를 전달하는 것으로, TCR이 항원을 특이적으로 인식하고 결합하면, CD3은 신호를 T세포 세포질로 전달하는 데 참여하여 T세포 활성화를 유도하는 제1 신호로 함으로써, T세포 항원 인식 및 면역반응 생성 과정에서 아주 중요한 역할을 한다.

기존의 연구에 따르면, 항 인간 CD3 항체는 T세포를 활성화시키고 억제시키는 양방향 기능을 구비한다. 따라서, 단클론항체를 CD3분자와 특이적으로 결합시켜, T세포 활성화 신호의 전달을 활성화시키거나 차단시킬 수 있고, 이의 치료 효과는 급성 항거부반응 충격요법, 이식편대숙주반응(graft-versus-host responses)의 치료 및 장기 이식 전의 예방성 탈감작에서 이미 충분히 증명되었고; 항종양, 다양한 장기 이식 거부 반응 억제 및 자가면역성질환 등의 치료에서 넓은 응용전망을 보여주었다. 항 CD3 단클론항체의 단독 치료 또는 IL-1수용체 길항제와의 연합사용은, NOD 마우스 자가면역성 당뇨병을 예방 및 역전시키고 면역 조절 작용을 강화시킬 수 있다는 것이 이미 증명되었다(Belghith M 등, Nat　Med, 2003, 9(9): 1202-1208; Ablamunits V 등, Diabetes, 2012, 61(1): 145-154). 1형 당뇨병을 앓고 있는 피험자를 치료하는 임상 실험에서도, CD3 항체는 인슐린 생산과 대사 제어를 효과적으로 개선하였고, 1형 당뇨병 환자가 항 CD3 단클론항체 테플리주맙(Teplizumab) 치료를 받은 후, 인슐린 수준과 대사 이상 증상이 현저하게 개선되었다(Herold KC 등, N　Engl　J　Med, 2002,　346(22): 1692-1698; Herold KC 등, Diabetes, 2005, 54(6): 1763-1769). 항 CD3 항체는 Lewis랫트의 실험적 알레르기성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis)도 역전시킴으로써, T헬퍼 1형(Th1)으로 매개되는 면역성에 대해 억제 효과를 구비한다(Tran G T 등, Intl　Immunol, 2001, 13(9): 1109-1120). 이외에, CD3 항체는 세포 기능형 이중 특이성 항체를 매개하는 데에도 광범위하게 응용된다. CD3을 표적으로 하는 이중 특이성 항체는 각각 T세포 표면 CD3 및 종양세포 표면 항원과 결합하여, 세포독성 T세포(cytotoxic T cell, CTL)와 종양세포의 거리를 줄일 수 있고, T세포를 직접 활성화시켜, T세포가 암세포를 직접 사멸하도록 유도함으로써, 더 이상 기존의 T세포의 이중 활성화 신호에 의존하지 않는다(Hipp S 등, Leukemia, 2017, 31(8): 1743-1751; Benonisson H 등, Molecular cancer therapeutics, 2019, 18(2): 312-322.).

최초로 시판된 OKT3은 미국 Ortho 약품 회사에서 생산된 뮤린 항 인간 CD3의 단클론항체이고, 이는 장기 이식 면역거부반응의 예방 및 치료에 양호한 효과가 있으며, 신장, 간 및 심장 이식에서 동종 이식 거부반응을 치료하는 데 사용됨이 승인되었다. 하지만, OKT3은 뮤린 단클론항체로서, 그의 면역원성으로 인해 50% 이상의 환자가 항 OKT3 항체를 생성하게 되는데, 이러한 항체는 주로, 항 개체형 및 항 동종형 두 가지가 있다. 전자는 항원 결합 부위를 중화시킴으로써 OKT3과 CD3의 결합을 차단하고, 후자는 단클론항체의 제거를 가속화하는 것 외에 심각한 부작용도 일으킬 수 있다. OKT3은 T세포의 과도한 활성화를 촉진하여, 인터루킨-2(IL-2), TNF-α, IFN-γ 및 인터루킨-6(IL-6)과 같은 염증인자를 대량으로 방출하여, 발열, 오한오심, 구토와 두통을 포함하는 여러 가지 부작용을 일으킬 수 있고, "인플루엔자 유사", "사이토카인 방출" 또는 "초회 투여 증후군(first-dose syndrome)"으로 개괄된다. 소수의 환자에서는 심폐 장애, 뇌전증 발작, 뇌병증, 뇌수막염, 신기능부전 및 이식편 혈전 형성 등과 같은 더욱 심각한 부작용이 발생할 수 있다.

현재 오텔릭시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab) 및 비실리주맙(visilizumab) 등을 포함하는 신세대의 인간화 항 CD3 단클론항체는 Fc 수용체에 대한 친화도를 크게 감소시키고, 부작용을 현저히 감소시켰지만, T세포의 과도한 활성화 및 사이토카인 분비 등 문제가 여전히 존재한다. 따라서, CD3을 표적으로 하는 항체를 개발함에 있어서, 과도한 사이토카인 폭풍을 어떻게 약화시키거나 방지하는가는 최초로 고려해야 할 문제이고, 더욱 높은 특이성, 더욱 우수한 임상 약효를 구비하는 CD3 항체를 개발하는 것이 시급하고 필수적인 것이며, 이는 종양, 장기 이식 및 자가면역질환 환자에게 더욱 많은 약물 옵션을 제공할 것이다.

본 발명에서는 높은 친화력으로 CD3ε 사슬과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개시한다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 그리고 항체를 제조하기 위한 방법을 더 제공한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이성 항체, 멀티 이중 특이성 항체 및 약학적 조성물을 더 제공한다. 또한, 여러 가지 질환(종양, 장기 이식 및 자가면역성질환 등을 포함)을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 본 발명에서 개시된 항 CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편(단독으로 또는 기타 활성제 또는 치료방식과 조합)의 용도를 제공한다.

본 발명의 제1 측면에서, 본 발명은 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서,

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄 가변 영역(VH)은 하기 군에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 두 개 또는 적어도 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다:

(i) 서열번호 7, 13, 18, 24, 29, 35, 85, 86, 87 또는 88로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;

(ii) 서열번호 8, 14, 19, 25, 30, 36, 51, 55 또는 57로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및

(iii) 서열번호 9, 15, 20, 26, 31, 37, 52, 56, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 또는 105로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3;

및/또는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함된 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 군에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 두 개 또는 적어도 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다:

(iv) 서열번호 10, 16, 21, 27, 32, 38, 50, 53, 93 또는 94로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;

(v) 서열번호 11, 17, 22, 28, 33, 39, 54, 58, 89, 90, 91, 92 또는 95로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및

(vi) 서열번호 12, 23 또는 34로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3.

일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 어느 하나에 따른 치환은 보존적 치환(conservative substitutions)이다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 중쇄 가변 영역에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 및/또는 상기 경쇄 가변 영역에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 Kabat 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 실시예 5의 표 4에서는 Kabat 또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 뮤린 항체의 CDR 아미노산 서열을 제공하였다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 3개의 VH 가변 영역의 CDR과 3개의 VL 가변 영역의 CDR을 포함하고, 이는 하기 33군에서 선택된다:

(1) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(2) 서열번호 7, 51, 52, 53, 54, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(3) 서열번호 7, 51, 52, 10, 11, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(4) 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(5) 서열번호 13, 55, 56, 16, 17, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(6) 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(7) 서열번호 18, 57, 20, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(8) 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(9) 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(10) 서열번호 29, 30, 31, 50, 33, 34으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(11) 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 34으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(12) 서열번호 87, 57, 20, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(13) 서열번호 18, 57, 20, 21, 89, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(14) 서열번호 18, 57, 20, 21, 91, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(15) 서열번호 18, 57, 20, 93, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(16) 서열번호 18, 57, 20, 21, 95, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(17) 서열번호 18, 57, 96, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(18) 서열번호 18, 57, 98, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(19) 서열번호 18, 57, 100, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(20) 서열번호 18, 57, 102, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(21) 서열번호 18, 57, 104, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(22) 서열번호 85, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(23) 서열번호 86, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(24) 서열번호 88, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(25) 서열번호 24, 25, 26, 27, 90, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(26) 서열번호 24, 25, 26, 27, 92, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(27) 서열번호 86, 25, 26, 27, 92, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(28) 서열번호 24, 25, 26, 94, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(29) 서열번호 24, 25, 97, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(30) 서열번호 24, 25, 99, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(31) 서열번호 24, 25, 101, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(32) 서열번호 24, 25, 103, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;

(33) 서열번호 24, 25, 105, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3.

일부 실시 방안에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 뮤린(murine) 또는 키메라(chimeric)이고, 이의 중쇄 가변 영역은 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 FR 영역을 포함하며; 및 이의 경쇄 가변 영역은 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 FR 영역을 포함한다. 실시예 5에서는 바람직한 뮤린 항체의 가변 영역 아미노산 서열번호를 제공하였다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 뮤린 항체 또는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 3군의 VH 서열과 VL 서열을 포함한다:

(i) 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(ii) 서열번호 3로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(iii) 서열번호 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 6로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인.

일부 실시 방안에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화된 것이다. 실시예 6에서는 인간화 책략의 기본적 흐름을 제공하였고, 표 3에서는 바람직한 인간화 항체의 가변 영역 아미노산 서열번호를 제공하였다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다:

(1) 서열번호 40로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 41로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(2) 서열번호 42로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 43로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(3) 서열번호 44로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 45로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(4) 서열번호 46로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(5) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(6) 서열번호 106로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(7) 서열번호 107로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(8) 서열번호 108로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(9) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 109로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(10) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 110로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(11) 서열번호 111로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 112로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(12) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 113로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(13) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 114로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(14) 서열번호 115로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(15) 서열번호 116로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(16) 서열번호 117로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(17) 서열번호 118로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;

(18) 서열번호 119로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인.

일부 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 포유동물(예를 들어 뮤린 또는 인간)로부터 유래된 면역 글로불린의 불변 영역 서열 또는 그의 변이체를 더 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 치환, 결실 또는 부가를 구비한다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 보존적 치환을 구비한다. 일부 실시 방안에서, 항 CD3 항체 분자는 중쇄 불변 영역(Fc)을 구비하고, 이는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며; 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 더 특히 IgG1, IgG2 또는 IgG4(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4)의 중쇄 불변 영역으로부터 선택된다. 일부 실시 방안에서, 항 CD3 항체 분자는 경쇄 불변 영역을 구비하고, 이는 예를 들어, κ 또는 λ의 경쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 바람직하게는 κ 경쇄 불변 영역(예를 들면, 인간 κ 경쇄)으로부터 선택된다.

일부 실시 방안에서, 항 CD3 항체 분자의 특성을 변형(예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글루코실화, 시스테인 잔기의 수, 효과기세포 기능 또는 보체 기능 중 하나 이상의 특성을 변경)하기 위해 불변 영역이 변경되고, 예를 들면, 돌연변이 된다. 항체 불변 영역 중의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 대체함으로써 기능 변경이 생성되고, 예를 들면, 이펙터 리간드에 대한 항체의 친화도를 변경하여 이펙터 기능을 변경시킨다(예를 들면, 향상, 감소 또는 제거). 이의 이펙터 기능을 변경하기 위해 항체의 Fc 영역 중의 아미노산 잔기를 대체하는 방법은 본 분야에 이미 공지된 것이다(예를 들어, EP388151A1, US5648260, US5624821을 참조). 항체의 Fc영역은 여러 가지 중요한 이펙터 기능, 예를 들면 ADCC, 식세포작용, CDC 등을 매개한다. 일부 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 치료적 항체에 대해 필요하지만, 다른 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 불필요한 것일 수 있거나 심지어 해로울 수 있으며, 이는 의도된 목적에 따라 달라진다. 따라서, 일부 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 감소되거나 심지어 제거된 이펙터 기능(예를 들면, ADCC 및/또는 CDC 활성)을 구비한다. S228P(EU 명명법, Kabat 명명법에서는 S241P임)와 같이, 인간 IgG4에서 항체 구조를 안정화시키는 아미노산의 돌연변이도 고려하고 있다.

이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환 중의 적어도 하나를 구비한다: Ser228Pro, Leu234Ala, Leu235Ala, Gly237Ala, Asp265Ala, Asn297Ala, Pro329Ala, Asp356Glu 및 Leu358Met이다(상기에서 언급된 아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치이다. Edelman GM 등, Proc Natl Acad USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969).

일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Leu234Ala, Leu235Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 감소된 ADCC 및 CDC 활성을 구비한다.

일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Asn297Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 제거된 ADCC 활성을 구비한다.

일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Asp265Ala, Pro329Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 제거된 ADCC 활성을 구비한다.

일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Ser228Pro(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 구조는 안정적이며, Fab-arm 교환을 감소시킬 수 있음으로써, 불완전 항체의 형성이 용이하지 않게 된다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 65로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비하며, 및/또는, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 66로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비한다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 69로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비하며, 및/또는, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 70로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비한다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 73로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비하며, 및/또는, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 74로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비한다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 77로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비하며, 및/또는, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 78로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비한다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 81로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비하며, 및/또는, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 82로 나타낸 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열;을 구비한다.

일부 비교적 바람직한 실시 방안에서, 상기 치환은 보존적 치환이다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 단편, 디아바디(diabody), 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체로부터 선택된다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD3(특히 인간 CD3)에 대해 고특이성 및 고친화도를 구비한다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1nM 이하의 KD로 CD3(특히 인간 CD3)에 결합된다.

본 발명의 제2 측면에서는, 본 발명의 상기 항 CD3 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 개시하였다. 일부 실시 방안에서, 상기 항 CD3 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈이 최적화된 것이다. 예를 들면, 본 발명의 특징은 항 CD3 항체 분자의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 제1 및 제2 핵산을 각각 코딩하는 것이며, 상기 항체 분자는 AP191, AP591, AP831, AB610, AB611, AB612, AB613, AB614; 또는 이와 기본적으로 동일한 서열로부터 선택되는 임의의 1종이다. 예를 들면, 핵산은 표 6에 표시된 AB610, AB611, AB612, AB613, AB614 뉴클레오티드 서열 또는 이와 기본적으로 동일한 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 더욱 유사한 서열 또는 하나 혹은 여러 개의 뉴클레오티드 치환(예를 들면, 보존적 치환)을 구비하는 서열, 또는 표 6에 표시된 서열과 3, 6, 15, 30 또는 45개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 서열)을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 항체 중쇄를 코딩하는 DNA분자는 서열번호 67, 71, 75, 79 또는 83에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 구비하며, 및 상기 항체 경쇄를 코딩하는 DNA분자는 서열번호 68, 72, 76, 80 또는 84에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 구비한다.

본 발명의 제3 측면에서, 본 발명은 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공하고, 이는 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함한다. 일부 바람직한 실시 방안에서 본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다. 일부 바람직한 실시 방안에서 상기 벡터는 피험자(예를 들어 포유동물, 예를 들면 인간) 체내에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현할 수 있다.

본 발명의 제4 측면에서, 본 발명은 숙주세포를 제공하고, 이는 본 발명의 분리된 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 진핵 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포) 또는 원핵 세포(예를 들면, 대장균)일 수 있다. 적합한 진핵 세포는 NS0 세포, Vero 세포, Hela 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 숙주 세포는 포유동물 세포인바, 예를 들어 CHO(예를 들면, CHO-K1, CHO-S, CHO DXB11, CHO DG44)이다.

본 발명의 제5 측면에서 약학적 조성물을 개시하였고, 이는 본 발명에 따른 항 CD3 항체 분자, 및 약학적으로 허용가능한 벡터 및/또는 부형제 및/또는 안정제를 포함한다.

일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 약학적 조성물은 별도의 약학적 활성제를 더 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 항 종양 활성을 갖는 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 장기 이식 거부 반응을 치료하기 위한 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 자가면역질환을 치료하기 위한 약물이다.

일부 실시 방안에서, 상기 약학적 조성물에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 상기 별도의 약학적 활성제는 분리된 조성분 또는 동일한 조성물의 조성분으로서 제공된다. 따라서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 별도의 약학적 활성제와 동시에 투여되거나, 개별적으로 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 제6 측면에서는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 더 제공하였고, 이는 (a) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유전자를 획득하여, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현 벡터를 구축하는 단계; (b) 유전자 공정 방법으로 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질감염시키는 단계; (c) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성을 허용하는 조건에서, 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (d) 생성된 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리시키고, 정제하는 단계;를 포함한다.

여기서, 단계 (a)에서 상기 발현 벡터는 플라스미드, 세균 및 바이러스 중의 1종 이상으로부터 선택되고, 바람직하게, 상기 발현 벡터는 pcDNA3.1이며;

여기서, 유전자 공정 방법으로, 구축된 벡터를 숙주세포에 형질감염시키는 단계 (b)에서, 상기 숙주세포는 원핵 세포, 효모 또는 포유동물 세포를 포함하되, 상기 포유동물 세포는 예를 들어 CHO 세포, NS0 세포 또는 기타 포유동물 세포이며, 바람직하게는 CHO 세포이다.

여기서, 단계 (d)에서는 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 이온 교환, 소수성 크로마토그래피 또는 분자체 방법을 포함하는 상규적인 면역 글로불린 정제 방법으로, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리시키고 정제한다.

본 발명의 제7 측면에서, 본 발명은 약물 제조 과정에서의 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이고, 상기 약물은,

(1) 체외 또는 피험자(예를 들면 인간) 체내에서 T세포 활성을 활성화시키거나 억제시키는 데 사용되고;

(2) 피험자(예를 들면 인간)의 종양을 치료하는 데 사용되며;

(3) 피험자(예를 들면 인간)의 장기 이식 거부 반응을 치료하는 데 사용되고; 또는

(4) 피험자(예를 들면 인간)의 자가면역성질환을 치료하는 데 사용된다.

일부 실시 방안에서, 상기 종양은 고형 종양, 혈액 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들면 다발성 골수종) 및 전이성 병소로부터 선택되며; 상기 암의 더욱 많은 특수한 실예는 폐암(예를 들면, 폐선암 또는 비소세포폐암, NSCLC)(예를 들면, 편평 및/또는 비편평 병력이 있는 NSCLC, 또는 NSCLC 선암), 흑색종(예를 들면, 진행성 흑색종), 신장암(예를 들면, 신세포암), 간암(예를 들면, 간세포암), 골수종(예를 들면, 다발성 골수종), 전립선암, 유방암(예를 들면, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중의 1종, 2종 또는 전부를 발현하지 않는 유방암; 예를 들면, 삼중음성유방암), 난소암, 결장직장암, 췌장암, 두경부암(예를 들면, 두경부편평세포암(HNSCC)), 항문암, 위-식도암(예를 들면, 식도편평세포암), 중피종, 비인두암, 갑상선암, 자궁경부암, 림프증식성질환(예를 들면, 이식후 림프증식성질환) 또는 혈액암(예를 들면, 미만성거대B세포림프종, T세포림프종, B세포림프종, 또는 비호지킨림프종), 또는 백혈병(예를 들면, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병)을 포함하되, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시 방안에서, 상기 장기 이식 거부 반응은 세포, 조직 또는 예를 들어 신장, 간 및 심장 이식과 관련된 비정상 또는 원하지 않는 면역반응, 예를 들어 이식편대숙주질환(GVHD), 또는 동종 이식 거부 위험을 줄이는 것에서 선택된다.

일부 실시 방안에서, 상기 자가면역성질환은 류마티스 관절염, 청소년 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 용혈성빈혈, 재생불량성빈혈, 자가면역성 혈소판감소성자반증, 특발성 혈소판감소성자반증, 당뇨병, 뇌척수염, 그레이브스병, 중증근무력증, 베게너병, 자가면역성 간염 및 다발성 경화증으로부터 선택된다.

본 발명의 제8 측면에서는, 본 발명에 따른 항체의 임의의 1종을 포함하는 이중특이성 분자를 제공하였다. 예를 들어, 상기 CD3 항체를 다른 항원 결합 특성을 구비하는 항체 또는 항체 단편과 기능적으로 연결시켜 이중 특이성 항체를 구성할 수 있다. 예를 들어, 상기 이중 특이성 항체는 아래와 같은 분자: CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD39, CD40, CD47, CD52, CD73, CD74, CD123, CD133, CD138, BCMA, CA125, CEA, CS1, DLL3, DLL4, EGFR, EpCAM, FLT3, gpA33, GPC-3, Her2, MEGE-A3, NYESO1, PSMA, TAG-72, CIX, 엽산염 결합단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR2, VEGFR3, 카드헤린(Cadherin), 인테그린(Integrin), 메소텔린(Mesothelin), Claudin18, αVβ3, α5β1, ERBB3, c-MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, B7단백질계열, 뮤신계열(Mucin), FAP 및 테나신(Tenascin)에 대한 항체를 포함하되 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제9 측면에서, 피험자의 종양, 장기 이식 거부 반응 또는 자가면역성질환을 치료(예를 들어, 억제 및/또는 진행 지연)하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 본 문에 따른 항 CD3 항체 분자(예를 들면 치료학적 유효량의 항 CD3 항체 분자)를 단독적으로 또는 1종 이상의 활성제 또는 절차와 조합하여 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 제10 측면에서, 진단성 또는 치료성 키트를 제공하고, 이는 본 발명에서 설명된 항 CD3 항체 분자 및 사용 명세서를 포함한다.

본 발명에서 제조된 항 CD3 인간화 항체는 CD3과의 결합 친화도가 높으며, 아주 강한 특이성을 구비한다. 생체외 생물학 연구 데이터에 따르면, 본 발명에서 제공하는 인간화 항체는 T세포 증식을 현저하게 촉진하고 T세포를 활성화시킴으로써, 과도한 사이토카인 폭풍을 약화시키거나 방지할 수 있다. 이외에, 본 발명에 따른 상기 항체는 CHO 세포로 발현되며, 생산량이 높고 활성이 높으며, 정제 공정이 간단하고 생산 단가가 낮은 우세가 있다.

약어 및 용어 정의

본 문에서는 다음과 같은 약어를 사용한다:

본 발명에서, 별도의 설명이 없는 한, 본 문에서 사용된 과학적 및 기술적 명사는 본 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 구비한다. 또한, 본 문에서 사용된 세포 배양, 생화학, 핵산 화학, 면역학 연구실 등 조작 단계는 모두 상응한 분야 내에서 광범위하게 사용되는 상규적인 단계이다. 또한, 본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해, 아래에서는 관련 용어의 정의 및 해석을 제공한다.

용어 "EU 넘버링 시스템"(EU Numbering System or Scheme): Eu는 지난 세기 60년대 말(1968-1969), Gerald M Edelman 등이 분리 정제하여 최초의 인간 IgG1 면역 글로불린을 얻었고, Eu로 명명하였으며, 이의 아미노산 서열을 측정하여 넘버링(Edelman GM et al, 1969, Proc Natl Acad USA, 63:78-85)하는 것을 의미한다. 기타 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역을 Eu와 아미노산 서열을 정렬하고, 대응되는 아미노산 위치가 바로 Eu 넘버이다. EU 넘버링 시스템은 주로 면역 글로불린 중쇄 불변 영역을 대상으로 하며, CH1, CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함한다.

용어 "Kabat 넘버링 시스템"(Kabat Numbering System or Scheme): 1979년, Kabat 등이 처음으로 표준화된 인간 면역 글로불린 가변 영역의 넘버링 방안(Kabat EA, Wu TT, Bilofsky H, Sequences of Immunoglobulin Chains: Tabulation and Analysis of Amino Acid Sequences of Precursors, V-regions, C-regions, J-Chain and β₂-Microglobulins. 1979. Department of Health, Education, and Welfare, Public Health Service, National Institutes of Health)을 제출하였다. "면역학 관련 단백질 서열" 책(Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Bethesda, MD: US Department of Health and Human Services, National Institutes for Health)에서, Kabat 등은 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열에 대해 정렬하고 넘버링하였다. 이들은, 이러한 분석된 서열이 가변적인 길이를 나타내고, 결실 및 삽입된 아미노산 또는 아미노산 단편이 특정된 위치에만 나타나는 것을 발견하였다. 흥미로운 것은, 삽입 포인트는 대부분이 CDR 내부에 위치해 있지만, 프레임워크 영역의 임의의 위치에 나타날 수도 있다. Kabat 넘버링 방안에서, 경쇄 가변 영역은 109번 위치까지 넘버링되고, 중쇄 가변 영역은 113번 위치까지 넘버링되며, 경쇄/중쇄의 삽입된 아미노산은 자모에 의해 식별되고 주석된다(예를 들어, 27a, 27b ...). 모든 Lambda 경쇄는 위치 10의 잔기를 포함하지 않지만, Lambda 및 Kappa 경쇄는 두 개의 상이한 유전자에 의해 코딩되며, 상이한 염색체에 위치한다. Lambda 및 Kappa 경쇄는 이들의 불변 영역 아미노산 서열의 상이함에 의해 구분될 수 있다. 중쇄 불변 영역만 대상으로 하는 EU 넘버링 시스템과 달리, Kabat 넘버링 시스템의 넘버링 범위는 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 전장 면역 글로불린 서열을 포함한다.

용어"결합"은, 항원의 특정 에피토프와 이와 대응되는 항체 사이의 친화성 상호작용으로 정의되고, 일반적으로 "특이적 인식"으로도 이해된다. "특이적 인식"은, 본 발명의 항체가 타겟 항원 이외의 임의의 폴리펩티드와 교차 반응하지 않거나 기본적으로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 이의 특이적인 정도는 면역학 기술을 통해 판단할 수 있고, 상기 면역학 기술은 면역블러팅법, 면역친화성 크로마토그래피, 유세포 분석 등을 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, 특이적 인식은 바람직하게 유세포 기술에 의해 결정되고, 구체적인 상황에서 특이적 인식의 표준은 본 분야의 당업자가 이에 따라 장악한 본 분야의 상식에 의해 판단될 수 있다.

용어"항원"은 생물 자체 또는 인간이 항체를 생성하도록 유도할 수 있는 외래 물질이고, 면역반응을 유발할 수 있는 임의의 물질, 예를 들어 세균, 바이러스 등이다. 외래 항원 분자는 B세포 또는 항원제시세포(예를 들어 대식세포, 수지상세포, 내피세포 및 B세포 등)에 의해 인식 및 가공 처리되고, 주조직적합성 복합체(예를 들어 MHC II 분자)와 결합하여 복합물을 형성한 다음 T세포를 활성화하여, 연속적인 면역반응을 유발한다.

용어"항체"는 일반적으로 면역 글로불린 타입 기능을 구비하는 단백질 결합 분자를 의미한다. 항체의 전형적인 실예는, 수요되는 결합 특이성을 나타내기만 하면 되는 면역 글로불린, 및 이의 유도체 또는 기능 단편이다. 항체를 제조하는 기술은 본 분야에 잘 알려져 있다. "항체"는 상이한 유형의 천연 면역 글로불린(예를 들어 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE)과 아형(예를 들어 IgG1, lgG2, IgA1, IgA2 등)을 포함한다. "항체"는 비천연 면역 글로불린, 예를 들어 단일 사슬 항체, 키메라 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체)와 이종 결합 항체(heterologous conjugated antibody)(예를 들어, 이중 특이성 항체), 및 그의 항원 결합 단편(예를 들어 Fab', F(ab')₂, Fab, Fv 및 rIgG)을 포함한다. 예를 들어, Pierce　Catalog　and　Handbook,　1994-1995 (Pierce Chemical Co, Rockford, Ill); Kuby J,　Immunology,　3rd　Ed, WH Freeman & Co, New York, 1997을 더 참조할 수 있다. 항체는 하나의 항원과 결합할 수 있는데, 이를 "단일 특이성"이라 칭하고; 또는 두 가지 상이한 항원과 결합할 수 있는데, 이를 "이중 특이성"이라 칭하며; 또는 1종 이상의 상이한 항원과 결합할 수 있는데, 이를 "다중 특이성"이라 칭한다. 항체는 일가, 이가 또는 다가일 수 있고, 즉 항체는 일차적으로 하나, 두 개 또는 복수 개의 항원 분자와 결합할 수 있다. 항체가 "일가로" 임의의 특정 단백질에 결합한다는 것은, 즉 일분자의 항체가 일분자의 단백질에만 결합하지만, 상기 항체가 상이한 단백질에 결합할 수도 있다는 것이다. 항체가 두 가지 상이한 단백질 중 각각의 분자에만 결합할 경우, 상기 항체는 "일가로" 각 단백질에 결합하고, 상기 항체는 "이중특이성"을 구비하며 "일가로" 두 가지 상이한 단백질 중 각각에 결합하는 것이다. 항체는 "단량체"일 수 있고, 즉 이는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 복수 개의 폴리펩티드 사슬("다량체")을 포함할 수 있거나, 두 개("이량체"), 세 개("삼량체") 또는 네 개("사량체")의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 항체가 다량체인 경우, 상기 항체는 동종 다량체(homomulitmer)일 수 있고, 즉 항체가 일분자를 초과하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것으로, 동종 이량체, 동종 삼량체 또는 동종 사량체를 포함한다. 선택적으로, 다량체 항체는 이종 다량체일 수 있고, 즉 항체가 2종 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것으로, 이종이량체, 이종삼량체 또는 이종사량체를 포함하는 것일 수 있다.

용어 "단클론항체(mAb)"는 기본적으로 균일한 항체 군체로부터 획득하는 항체를 의미하고, 예를 들어, 천연적으로 발생하는 돌연변이와 같은 돌연변이가 소량으로 존재하는 것 외에, 군체에 포함된 단독 항체는 동일하다. 따라서, 수식어인 "단클론"은 상기 항체의 특징이 별개의 항체의 혼합물이 아님을 나타낸다. 단클론항체는 본 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 생성되고, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포를 융합시켜 이형접합된 항체생성세포를 제조하는 것이다. 하이브리도마 배양에 의해 합성됨으로써, 기타 면역 글로불린에 의해 오염되지 않는다. 단클론항체는 예를 들어 재조합 기술, 파지 전시 기술, 합성 기술, 또는 기타 기존 기술로 얻을 수도 있다.

용어 "완전 항체"는 두 개의 항체 중쇄와 두 개의 항체 경쇄로 구성된 항체를 의미한다. "완전 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단으로의 방향에서 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)으로 구성되고, 약어로 VH-CH1-HR-CH2-CH3이며; IgE 아형의 항체인 경우, 선택적으로 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)를 더 포함한다. 바람직하게 "완전 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단으로의 방향에서 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성된 폴리펩티드이다. "완전 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단으로의 방향에서 항체 경쇄 가변 도메인(VL)과 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된 폴리펩티드이며, 약어로 VL-CL이다. 상기 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(kappa) 또는 λ(lambda)일 수 있다. 완전 항체 사슬은, CL 도메인과 CH1 도메인 사이(즉 경쇄과 중쇄 사이)의 폴리펩티드 간의 디설파이드 결합 및 완전 항체 중쇄의 힌지 영역 사이의 폴리펩티드 간의 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된다. 전형적인 완전 항체의 실예는 천연 항체, 예를 들어 IgG(예를 들어 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE이다.

용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항원과의 특이적 결합 능력을 보유하는 항체의 항원 결합 단편 및 항체 유사체를 지칭하며, 이는 일반적으로 적어도 일부분의 모체 항체(parental antibody)의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편은 모체 항체의 적어도 일부 결합 특이성을 보유한다. 일반적으로, 몰 단위(K_D)로 활성을 나타낼 경우, 항체 단편은 적어도 10%의 모체 결합 활성을 보유한다. 바람직하게, 항체 단편은 표적에 대한 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%의 모체 항체의 결합 친화도를 보유한다. 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, Fd 단편, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 디설파이드-안정화된 가변 단편(dsFv) 등; 선형 항체(Linear Antibody), 단일 사슬 항체(예를 들어 scFv 단일 항체), 단일 항체(Unibody, 기술은 Genmab에서 유래됨), 이가 단일 사슬 항체, 단일 사슬 파지 항체, 단일 도메인 항체(Single Domain Antibody)(예를 들어 VH 도메인 항체), 도메인 항체(Domantis, 기술은 Domantis에서 유래됨), 나노 항체(nanobodies, 기술은 Ablynx에서 유래됨); 항체 단편으로 형성된 다중 특이성 항체(예를 들어 삼중 사슬 항체, 사중 사슬 항체 등); 및 키메라 항체(Chimeric Antibody)(예를 들어 인간화 뮤린 항체), 이종 결합 항체(Heteroconjugate Antibody) 등과 같은 조작된 항체;를 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 이러한 항체 단편은 본 분야의 당업자에게 공지된 상규적인 기술로 획득하며, 완전 항체와 동일한 방법으로 이러한 단편의 실용성에 대해 선별한다.

용어 "단일 사슬 Fv 항체"(또는 "scFv 항체")는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하고, 링커(linker)에 의해 연결된 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)의 재조합 단백질이며, 링커는 이러한 두 개의 도메인을 가교시킴으로써 항원 결합 부위를 형성하고, 링커 서열은 일반적으로 플렉시블 펩티드로 구성되고, 예를 들어 G₂(GGGGS)₃이되, 이에 한정되지 않는다. scFv의 크기는 일반적으로 하나의 완전 항체의 1/6이다. 단일 사슬 항체는 바람직하게 하나의 뉴클레오티드 사슬에 의해 코딩된 하나의 아미노산 사슬 서열이다. scFv에 관한 종합적인 설명은, Pluckthun A, 1994. Antibodies from Escherichia coli, in The Pharmacology of　Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenberg M and Moore GP (EDs.), Springer-Verlag, New　York, pp 269-315을 참조할 수 있다. 국제 특허 출원 공개번호 WO　88/01649 및 미국 특허 제4946778호 및 제5260203호를 더 참조할 수 있다.

용어 "VL 도메인"은 면역 글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 영역 도메인을 의미한다.

용어 "VH 도메인"은 면역 글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 영역 도메인을 의미한다.

용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 중쇄분자의 일부분을 포함한다. 상기 힌지 영역은 약 25개의 잔기를 포함하며 플렉시블한 것으로, N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이도록 한다. 힌지 영역은 세 개의 상이한 도메인, 즉 상부, 중부 및 하부 힌지 도메인(Roux KH et al, 1998, J Immunol, 161:4083-4090)으로 나뉠 수 있다.

용어 "Fab 단편"은 하나의 중쇄의 가변 영역 및 CH1 영역과 하나의 경쇄로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 항체"의 크기는 완전 항체의 1/3이고, 이는 하나의 항원 결합 부위만 포함한다.

용어 "Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 하나의 중쇄의 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역 부분을 포함한다.

용어 "F(ab')₂ 단편"은 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄의 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역 부분을 포함하며, 이로써 두 개의 중쇄 사이에 사슬 간 디설파이드 결합을 형성한다. 따라서, F(ab')₂ 단편은 두 개의 중쇄 사이의 이황화 결합을 통해 함께 유지되는 두 개의 Fab' 단편으로 구성된다.

용어 "Fd 단편"은 하나의 중쇄의 가변 영역과 CH1로 구성되며, Fab 단편에서 경쇄를 제거한 후 남아있는 중쇄 부분이다.

용어 "Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 양자로부터 유래된 가변 영역을 포함하되, 불변 영역이 결핍하며, 완전 항원 인식과 결합 부위를 포함하는 가장 작은 단편이다.

용어 "디설파이드-안정화된 가변 단편(dsFv)"은 VH와 VL 영역에 각각 하나의 시스테인 돌연변이 부위를 도입함으로써, VH와 VL 사이에 디설파이드 결합이 형성되어 구조 안정성을 구현한다. 용어 "디설파이드 결합"은 두 개의 황원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 메르캅토기를 포함하며, 상기 메르캅토기는 두 번째 메르캅토기와 디설파이드 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있다. 천연적으로 존재하는 대다수 IgG 분자에서, CH1과 CK 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결되고 두 개의 중쇄는 두 개의 디설파이드 결합에 의해 연결되며, Kabat 넘버링 시스템에 따른 239번 위치와 242번 위치(226번 위치 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)에 대응되게 연결된다.

용어 "중쇄 불변 영역"은 면역 글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지(예를 들어 상부 힌지 영역, 중부 힌지 영역 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3도메인 또는 이의 변이체거나 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 출원에서 사용된 항원 결합 폴리펩티드는, CH1 도메인을 구비하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 일부분의 힌지 도메인 및 CH2 도메인을 구비하는 폴리펩티드; CH1 도메인과 CH3 도메인을 구비하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 일부분의 힌지 도메인과 CH3 도메인을 구비하는 폴리펩티드 사슬; 또는 CH1 도메인, 적어도 일부분의 힌지 구조, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 구비하는 폴리펩티드 사슬;을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 본 출원의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 구비하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 출원에서 사용된 항체는 적어도 일부분의 CH2 도메인(예를 들어, 전부 또는 일부분의 CH2 도메인)이 결핍할 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이, 본 기술분야의 당업자에 있어서, 아미노산 서열 상에서 천연적으로 존재하는 면역 글로불린 분자와 상이하도록 중쇄 불변 영역이 변경될 수 있음을 이해해야 한다.

용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 경쇄 불변 영역은 kappa 불변 도메인 및 lambda 불변 도메인 중의 적어도 하나를 포함한다.

용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 단편"은 면역 글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 의미하고, 이는 힌지 영역의 적어도 일부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 이는 면역 글로불린과 숙주조직 또는 인자의 결합을 매개하고, 상기 결합은 면역 계통의 각종 세포(예를 들어, 효과기세포) 상의 Fc 수용체와의 결합 또는 고존적 보체 계통의 제1 조성분(C1q)과의 결합을 포함한다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 변이된 Fc 영역을 포함한다.

일반적으로, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 이의 Cys 226번 위치 또는 Pro 230번 위치의 아미노산 잔기로부터 카르복실 말단까지의 세그먼트이지만, 이의 경계는 변화될 수 있다. Fc 영역의 C 말단 라이신(잔기 447, EU 넘버링 시스템에 따름)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수도 있다. Fc는 또한 독립적으로 존재하거나, Fc의 단백질 폴리펩티드를 포함하는 경우의 이러한 영역을 의미하고, 예를 들어 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"이며, "Fc 융합 단백질"(예를 들어, 항체 또는 면역접합체)로 칭하기도 한다. 본 발명의 항체에서 천연 서열 Fc 영역은 포유동물(예를 들어 인간)을 포함하는 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4로부터 유래된다. 일부 실시 방안에서, 포유동물 Fc 폴리펩티드 아미노산 서열에 비해, 두 개의 Fc 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열 중 아미노산 100개마다 10개 정도 아미노산의 단일 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실을 구비한다. 일부 실시 방안에서, 상기 Fc 영역 아미노산의 차이는, 반감기를 연장하는 Fc 변화, FcRn 결합을 증가시키는 변화, Fcγ수용체(FcγR)의 결합을 증강시키는 변화 및/또는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 증강시키는 변화일 수 있다.

IgG, IgA 및 IgD 항체 이소타입에서, Fc 영역은 항체의 두 중쇄 중의 각각의 CH2와 CH3 불변 도메인을 포함하고; IgM 및 IgE의 Fc 영역은 각 폴리펩티드 사슬 중의 세 개의 중쇄 불변 도메인(CH2-CH4 도메인)을 포함한다.

용어"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정된 종으로부터 유래되거나 특정 항체 유형 또는 아형에 속하는 항체 중의 상응한 서열과 동일하거나 동종이고, 사슬의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 유형 또는 아형에 속하는 항체 중의 상응한 서열과 동일하거나 동종인 항체, 및 이러한 유형의 항체의 단편을 말하고, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 하면 된다(미국 특허 US4816567; Morrison SL et al, 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81:6851-6855). 예를 들어, 용어 "키메라 항체 "는, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 제1 항체(예를 들어 뮤린 항체)로부터 유래되고, 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 제2 항체(예를 들어 인간 항체)로부터 유래되는 이러한 항체(예를 들어 인간-뮤린 키메라 항체)를 포함할 수 있다.

용어 "인간화 항체"는 유전자 공정을 거쳐 조작된 비인간화 항체를 의미하며, 이의 아미노산 서열은 변형을 거쳐 인간화 항체의 서열과의 상동성을 향상시키도록 한다. 비인간 항체, 예를 들어 마우스 항체의 CDR 도메인 외부의 대부분 또는 전부 아미노산은 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 상응한 아미노산에 의해 치환되지만, 하나 또는 복수 개의 CDR 영역 내의 대부분 또는 전부 아미노산은 변화가 없다. 항체가 특정된 항원과 결합하는 능력을 제거하지 않는 한, 아미노산의 부가, 삭제, 삽입, 대체 또는 변형은 허용된다. "인간화" 항체는 고유 항체와 유사한 항원 특이성을 보류한다. CDR의 유래에 대해 특별히 한정하지 않고, 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 또는 비인간 영장류 동물(예를 들어, 게잡이 원숭이) 항체로부터 유래되는 CDR 영역을 사용할 수 있다. 프레임워크 영역의 경우, IMGT antibody germline database(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)를 검색하여 인간 항체 생식계열 서열을 획득할 수 있으며, 일반적으로 변형된 비인간화 항체와 상동성이 높은 인간 생식계열 항체 서열을 선택하여 인간화 항체의 프레임워크 영역으로 한다.

용어 "초가변영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "상보성 결정 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체 아미노산 잔기를 의미하고, 비연속적인 아미노산 서열이다. CDR 영역 서열은, Kabat, Chothia, IMGT(Lefranc et al, 2003, Dev Comparat Immunol, 27:55-77) 및 AbM (Martin ACR et al, 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:9268-9272) 방법으로 정의되거나 본 분야에서 익숙히 알고 있는 임의의 CDR 영역 서열 확정 방법에 의해 식별되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기일 수 있다. 예를 들어, 초가변영역은 아래와 같은 아미노산 잔기를 포함한다: 서열 비교에서 정의된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기(Kabat 넘버링 시스템), 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) 및 89-97 (CDR-L3) 위치 잔기와 중쇄 가변 도메인의 31-35 (CDR-H1), 50-65(CDR-H2) 및 95-102 (CDR-H3) 위치 잔기이고, Kabat et al, 1991, Sequences　of　Proteins　of Immunological　Interest, 5th Edition, Public Health　Service, National　Institutes　of　Health, Bethesda, Md.을 참조; 및/또는 구조에 따라 정의된 "초가변루프(hypervariable loop)"(HVL)로부터 유래된 잔기(Chothia 넘버링 시스템), 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 26-32 (CDR-L1), 50-52(CDR-L2) 및 91-96 (CDR-L3) 위치 잔기와 중쇄 가변 도메인의 26-32 (CDR-H1), 53-55(CDR-H2) 및 96-101 (CDR-H3) 위치 잔기이며, Chothia C and Lesk AM, 1987, J Mol Biol, 196:901-917; Chothia C et al, 1989, Nature, 342:878-883을 참조한다. "프레임워크" 잔기 또는 "FR" 잔기는 본 문에서 정의된 초가변영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 일부 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함된 CDR은 바람직하게 Kabat, IMGT 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 확정된다. 본 분야의 당업자는 서열 자체 이외를 초과하는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 각종 넘버링 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 부여할 수 있다. 예를 들어, 주어진 항체의 Kabat 잔기 넘버링 방식은 항체 서열을 각종 "표준" 넘버링 서열과 상동 영역을 비교함으로써 결정된다. 본 문에서 제공한 서열 넘버링 방안에 기반하여, 서열표 중 임의의 가변 영역 서열의 번호를 확정하는 것은 완전히 본 분야의 당업자의 상규적인 기술 범위 내에 있다.

용어 "재조합"은, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 언급할 경우, 자연 상태에서 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 형태를 의미하고, 여기서 하나의 비한정적인 예로, 일반적으로 함께 나타나지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 조합하여 구현할 수 있다.

용어 "벡터"는 이와 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 그 중에 또 다른 DNA 세그먼트를 연결할 수 있는 고리형 이중쇄 DNA 고리를 의미한다. 다른 한 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 그 중 별도의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주세포에서 자가 복제(예를 들어, 세균복제원점과 에피소말 포유동물 벡터를 구비하는 세균 벡터)될 수 있다. 기타 벡터(예를 들어 비부가형 포유동물 벡터)는 숙주세포에 도입된 후, 숙주세포의 게놈에 통합되고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 이외에, 일부 벡터는 효과적으로 연결되는 그들의 유자자의 발현을 지도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 문에서 "재조합 발현 벡터"(또는 "발현 벡터"로 약침함)로 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드의 형태로 존재한다. 하지만, 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터(예를 들어, 복제-결핍형 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노수반 바이러스)도 포함하며, 이는 동일한 기능을 구비한다.

용어 "분리된 항체 분자"는 이의 자연 환경의 조성분으로부터 이미 인식, 분리 및/또는 회수된 항체 분자를 의미한다. 이의 자연 환경의 오염 조성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 간섭하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질 또는 비단백질의 용질을 포함할 수 있다.

본 문에서 사용된 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)에 관한 용어 "분리된"은, 기타 천연적 유래의 대분자에 존재하는 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자인 것을 의미한다. 본 문에서 사용된 용어 "분리된"은, 재조합 DNA 기술로 생산할 때 세포 재료, 바이러스 재료 또는 배지를 기본적으로 포함하지 않는 핵산 또는 폴리펩티드, 혹은 화학 합성을 통해 제조할 때 화학 전구체 또는 기타 화학품을 기본적으로 포함하지 않는 것을 의미하기도 한다. 이외에, "분리된 핵산"은 천연적으로 존재하지 않는 단편, 그리고 천연 상태로 발견되지 않은 핵산 단편을 포함하는 것임을 의미한다. 본 문에서 용어 "분리된"은, 기타 세포 단백질 또는 조직으로부터 분리된 세포 또는 폴리펩티드를 의미하는 데 사용되기도 한다. 분리된 폴리펩티드는 정제된 폴리펩티드 및 재조합된 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다.

용어 "교차 반응"은, 본 문에 따른 항체가 상이한 종으로부터 유래되는 항원에 결합하는 능력을 의미한다. 교차 반응성은, 결합 측정법(예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특정 반응성을 검출하거나, 항원을 생리적으로 발현하는 세포와의 결합 또는 항원을 생리적으로 발현하는 세포와의 기타 방식의 기능적 상호 작용을 통해 측정될 수 있다. 본 분야에서 공지된 결합 친화도를 측정하고 분석하는 실예는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(예를 들어, Biacore) 또는 유사한 기술(예를 들어, Kinexa 또는 Octet)을 포함한다.

용어"면역 결합" 및 "면역 결합 성질"은 면역 글로불린분자와 항원(상기 항원에 대해 말하자면 면역 글로불린은 특이성을 구비함) 사이에 발생하는 비공유결합성 상호작용을 의미한다. 면역 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호 작용하는 평형해리상수(K_D)로 표시할 수 있고, 여기서 K_D값이 작을수록 친화도가 더 높다는 것을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역 결합 성질은 본 분야에서 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 한 가지 측정 방법은 항원/항체 복합체가 형성 및 해리되는 속도를 측정하는 것이다. "결합속도상수"(K_a 또는 K_on)와 "해리속도상수"(K_d 또는 K_off) 양자는 모두 농도 및 결합과 해리의 실제 속도를 통해 계산하여 얻을 수 있다(Malmqvist M, 1993, Nature, 361: 186-187을 참조). k_d/k_a 비율은 해리상수 K_D와 같다(Davies DR et al, 1990, Annual Rev Biochem, 59:439-473을 참조). 임의의 효과적인 방법으로 K_D, k_a 및 k_d 값을 측정할 수 있다.

용어 "면역원성"은 특정된 물질이 면역반응을 일으키는 능력을 의미한다.

용어 "숙주세포"는 그 중 벡터가 증식될 수 있고 이의 DNA가 발현될 수 있는 세포를 의미하며, 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 용어는 피험 숙주세포의 임의의 후손을 더 포함한다. 이해해야 할 것은, 모든 후손이 친세포와 동일한 것은 아니고, 복제 과정에서 돌연변이가 발생할 수 있기 때문에, 이러한 유형의 후손도 포함된다. 숙주세포는 원핵 세포, 효모 또는 포유동물 세포를 포함하되, 상기 포유동물 세포는 예를 들어 CHO 세포, NS0 세포 또는 기타 포유동물 세포이다.

용어"동일성"은 두 개의 폴리펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 사이 서열의 매칭 상황을 의미하기 위한 것이다. 비교하는 두 서열 중의 임의의 위치가 모두 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때(예를 들어, 두 개의 DNA 분자의 각각 중의 임의의 위치가 아데닌에 의해 점유되거나, 두 개의 폴리펩티드의 각각 중의 임의의 위치가 라이신에 의해 점유되는 것), 각 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 사이의 "백분율 동일성"은 두 서열이 공유하는 매칭 위치 수를 비교하는 위치 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 만약 두 서열의 10개의 위치 중 6개가 매칭되면, 이러한 두 서열은 60%의 동일성을 구비한다. 예를 들어, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT은 총 50%의 동일성(총 6개 위치에서 3개의 위치가 매칭됨)을 구비한다. 일반적으로, 최대 동일성을 생성하도록 두 서열을 정렬할 때 비교를 진행한다. 이러한 비교는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Align 프로그램(DNAstar, Inc.)을 통해 편리하게 수행할 수 있고, Needleman 및 Wunsch의 방법(Needleman SB and Wunsch CD, 1970, J Mol Biol, 48:443-453)을 사용하여 구현할 수 있다.

용어 "돌연변이된", "돌연변이체" 및 "돌연변이"는 각각 천연핵산 또는 폴리펩티드에 비해(즉 야생형을 정의하는 데 사용될 수 있는 참조 서열), 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되는 것임을 의미한다.

용어 "보존적 변형"은 아미노산 변형이 상기 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 현저한 영향을 미치거나 변화시키지 않는 것을 의미한다. 이러한 유형의 보존적 변형은 아미노산의 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 분야에 공지된 표준화 기술, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 및 PCR로 매개된 돌연변이를 통해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 대체하는 것을 의미한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열에 대해, 본 분야에서는 이미 상세한 설명이 있다. 이러한 계열은, 염기성 측쇄(예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 동일한 측쇄 계열로부터 유래된 기타 아미노산 잔기로 본 발명의 항체 CDR 영역 중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 본 출원의 항체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 약학적 조성물 또는 무균성 조성물을 제조하는 데 응용될 수 있고, 예를 들어, 항체를 약학적으로 허용가능한 벡터, 부형제 또는 안정제와 혼합하는 것이다. 약학적 조성물은 1종 또는 조합된(예를 들어 2종 이상의 상이한 것) 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 구비하는 항체 또는 항체 단편(또는 면역 접합제)의 조합을 포함할 수 있다. 치료제 및 진단제의 제제는, 예를 들어 동결 건조 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로 약학적으로 허용가능한 벡터, 부형제 또는 안정제와 혼합하여 제조될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한"은, 분자 본체, 분자 단편 또는 조성물을 동물 또는 인간에게 적당히 투여하였을 때, 불리하거나, 알레르기 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 벡터 또는 이의 조성분으로서의 일부 물질의 구체적인 예시는 당류(예를 들어 락토스), 전분, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 식물유, 젤라틴, 폴리올(예를 들어 프로필렌글리콜), 알긴산 등을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 본 출원의 항체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 단독적으로 사용할 수 있거나, 1종 이상의 기타 치료제와 함께 사용할 수 있으며, 상기 치료제는 예를 들어 백신이다.

용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제 및/또는 안정제"는 약리학 및/또는 생리학에서 피험자 및 활성성분과 양립되는 담체 및/또는 부형제 및/또는 안정제를 의미하며, 이들은 사용된 사용량 및 농도에 노출된 세포 또는 포유동물에 대해 독성이 없다. pH조절제, 계면활성제, 보조제, 이온 강도 증진제, 희석제, 삼투압을 유지시키는 시약, 흡수를 지연시키는 시약, 방부제를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, pH조절제는 인산염 완충액을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 계면활성제는 양이온, 음이온 또는 Tween-80과 같은 비이온형 계면활성제를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 이온 강도 증진제는 염화나트륨을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 방부제는 예를 들어 p-하이드록시벤조에이트, 2-트리클로로메틸-2-프로판올(2-Trichloromethyl-2-propanol), 페놀, 소르빈산(sorbic acid) 등 각종 항세균 시약 및 항진균 시약을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 삼투압을 유지시키는 시약은 당, NaCl 및 이의 유사체를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 흡수를 지연시키는 시약은 모노스테아린산염 및 젤라틴을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 희석제는 물, 수성완충액(예를 들어 완충식염수), 알코올 및 폴리올(예를 들어 글리세롤) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 방부제는 예를 들어 티메로살(thimerosal), 2-페녹시에탄올, p-하이드록시벤조에이트, 2-트리클로로메틸-2-프로판올(2-Trichloromethyl-2-propanol), 페놀, 소르빈산(sorbic acid) 등 각종 항세균 시약 및 항진균 시약을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 안정제는 본 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 구비하며, 약물 중의 활성성분의 원하는 활성을 안정화시킬 수 있으며, 글루타민산나트륨, 젤라틴, SPGA, 당류(예를 들어 소르비톨, 만니톨, 전분, 자당, 락토스, 텍스트란, 또는 글루코스), 아미노산(예를 들어 글루탐산, 글리신), 단백질(예를 들어 건조한 유청, 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 생성물(예를 들어 락트알부민 가수분해물) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다.

본 문에서 사용한 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 충분히 획득하거나 적어도 일부분을 획득하는 양을 의미한다. 예를 들어, 질환(예를 들어, 종양, 감염 또는 자가면역성질환) 예방 유효량은, 질환(예를 들어, 종양, 감염 또는 자가면역성질환)의 발생을 충분히 예방, 저지, 또는 지연시키는 양을 의미하며; 질환 치료 유효량은, 이미 질환을 앓고 있는 환자의 질환 및 이의 합병증을 충분히 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하는 양을 의미한다. 이러한 유효량을 측정하는 것은 완전히 본 분야의 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 치료 용도에 유효한 양은 치료하려는 질환의 중증도; 환자 자체의 면역 계통의 전체적인 상태; 연령, 체중 및 성별과 같은 환자의 일반적인 상황; 약물의 투여방식, 및 동시에 투여되는 기타 치료 등에 따라 결정된다.

본 문에서 사용된 바와 같은, 용어 "면역세포"는 조혈 유래를 구비하고 면역반응에서 역할을 하는 세포, 예를 들면 림프구, 예를 들어 B세포와 T세포; 자연살해세포; 골수성 세포, 예를 들어 단핵세포, 대식세포, 호산구, 비만세포, 호염기구 및 과립구;를 포함한다.

본 문에서 사용된 바와 같은, 용어 "면역반응"은, 면역세포(예를 들어 림프구, 항원제시세포, 대식세포 또는 과립구) 및 면역세포 또는 간에서 생성된 가용성 대분자(항체, 사이토카인 및 보체)의 역할을 의미하고, 해당 역할은 침입성 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역성 또는 병리 염증 상황에서 정상적 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 파괴 또는 이들을 인체에서 제거한다. 본 발명에서, 용어 "항원 특이성 T세포 반응"은 T세포에 의해 발생하는 면역반응을 의미하며, 상기 면역반응은 상기 T세포에 특이적인 항원이 상기 T세포를 자극할 때 발생한다. 항원 특이성 자극 시 T세포에 의해 발생하는 반응의 비한정적인 실예는 T세포의 증식 및 사이토카인(예를 들어 IL-2)의 생성을 포함한다.

본 문에서 사용된 바와 같은, 용어 "효과기 기능(effector function)"은, 항체 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미하며, 이는 항체 이소타입에 따라 변화할 수 있다. 항체 효과기 기능의 예로는, Fc 수용체결합 친화도, 항체 의존성 세포로 매개된 세포독성(ADCC), 보체 의존 세포독성(CDC), 항체 의존성 식세포작용(ADCP), 세포 표면 수용체(예를 들어 B세포 수용체)의 하향 조절, B세포 활성화, 사이토카인 분비, 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/제거율 등을 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 항체의 효과기 기능을 변화시키는 방법은 본 분야에서 공지된 것인바, 예를 들어 Fc 영역에 돌연변이를 도입함으로서 완성된다.

본 문에서 사용된 바와 같은, 용어 "항체 의존성 세포로 매개된 세포독성(ADCC)"은, 세포독성 형태를 의미하고, Ig는 세포독성 세포(예를 들어 자연살해(NK)세포, 호중구 또는 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)와 결합됨으로써, 이러한 세포독성 효과기 세포가 특이적으로 항원이 부착된 표적 세포에 결합된 후, 세포독소를 분비하여 표적 세포를 사멸한다. 항체의 ADCC활성을 검출하는 방법은 본 분야에서 공지된 것인바, 예를 들어 검출 대기 항체와 Fc 수용체(예를 들어 CD16a) 사이의 결합 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 문에서 사용된 바와 같은, 용어 "보체 의존 세포독성(CDC)"은, 보체 성분 C1q과 항체 Fc의 결합을 통해 보체 캐스케이드를 활성화시키는 세포독성 형태를 의미한다. 항체의 CDC활성을 검출하는 방법은 본 분야에서 공지된 것이고, 예를 들어 검출 대기 항체와 Fc 수용체(예를 들어 C1q) 사이의 결합 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

하기 실시예를 통해 본 발명의 실시방안을 추가로 설명하되, 본 분야의 당업자에 있어서, 하기 첨부도면과 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명에 대한 추가적인 한정이 아니라는 것으로 이해해야 한다.

기존의 기술에 비해, 본 발명의 기술방안은 아래와 같은 유익한 효과를 구비한다:

(1) 본 발명의 항체는 CD3을 특이적으로 인식/결합할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 표면 발현 수준의 변화(예를 들어 감소) 혹은, CD3 또는 TCR 활성의 변화를 포함하는 항원 조절을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 종양, 장기 이식 거부 반응 또는 자가면역성질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 잠재력을 구비한다.

(2) 본 발명의 항체(특히 인간화 항체)는 친 뮤린 항체의 기능과 성질을 보류하였을 뿐만 아니라, 종양, 감염 또는 자가면역성질환을 예방 및 치료하기 위한 잠재력을 구비하며; 아주 높은 인간화 정도를 구비함으로써, 인간 피험자에게 안전하게 투여될 수 있고, 면역원성 반응을 일으키지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체(특히 인간화 항체)는 엄청난 임상적 가치를 구비한다.

(3) 본 발명의 항체는 T세포의 증식을 현저하게 촉진시키고 T세포를 활성화시킬 수 있으며, 세포 활성화 정도(IL-2 등 사이토카인의 방출)를 안전하고, 효과적인 범위 내로 제어하며, 사이토카인의 과도한 방출을 일으키지 않으므로, 더욱 높은 안전성을 구비하고, 임상 치료에서의 독성 부작용을 감소시킨다.

도 1은 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831와 인간 CD3 항원의 결합 능력의 측정을 예시한 도면이다.
도 2는 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831와 인간 1차 T세포의 결합 활성의 측정을 예시한 도면이다.
도 3은 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831가 PBMC 세포 증식을 촉진시키는 능력의 검출을 예시한 도면이다.
도 4는 인간화 항체 AB611 및 AB614와 인간 및 게잡이 원숭이 CD3 항원의 결합 능력의 측정을 예시한 도면이다.
도 5는 인간화 항체 AB611 및 AB614와 인간 1차 T세포의 결합 활성의 측정을 예시한 도면이다.
도 6은 인간화 항체 AB610, AB611 및 AB614가 PBMC 세포 증식을 촉진시키는 능력의 검출을 예시한 도면이다.
도 7은 인간화 항체 AB614가 T세포를 활성화시키는 능력의 평가를 예시한 도면이다.

아래, 예를 들어 설명하는 본 발명(본 발명을 한정하지 않음)의 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다.

특별히 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 분자생물학 실험 방법과 면역 검출법은 기본적으로 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; 및 F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995;에 따른 방법을 참조하여 수행되고; 제한 효소의 사용은 제품 제조업체에서 추천하는 조건에 따라 진행된다. 본 분야의 당업자에 있어서 알 수 있다시피, 실시예는 예를 드는 방식으로 본 발명을 설명하는 것으로 본 발명에서 청구하는 범위를 한정하려는 것은 아니다.

실시예 1. 항 인간 CD3 뮤린 단클론항체의 제조

인간 CD3E 항원(단백질 서열: Uniprot entry 넘버 P07766)을 50μg/마리를 완전프로인트보조제로 충분히 유화시킨 후, 멀티 사이트 면역 방식(multi-site immunization method)을 적용하여 수컷 Balb/C 마우스에 대해 면역화시키되, 면역 주기는 3주에 1번이다. 제3차 면역 후 10일째, 꼬리정맥을 통해 채혈하고, ELISA로 혈장 항 인간 CD3 항체 역가(titer)를 측정하여 마우스 면역 반응 정도를 모니터링한다. 그리고 융합 3일 전, 생성된 항 인간 CD3 항체의 역가가 가장 높은 마우스에 대하여 면역을 1번 보강시킨다. 3일 후, 마우스를 희생시키고 해당 마우스의 비장을 마우스 골수종 Sp2/0 세포주와 융합시킨다. 2×10⁸개의 Sp2/0 세포와 2×10⁸개 비장 세포를 50%의 폴리 에틸렌 글리콜(분자량이 1450임)과 5%의 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액에 혼합하여 융합시킨다. Iscove 배지(10%의 우태아혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신, 0.1mM의 히포크산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μg의 티미딘을 포함)로 비장 세포 수를 5×10⁵/mL로 조정하고, 0.3mL를 96웰 플레이트 홀 내에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에 배치한다. 10일 동안 배양 후, 고 처리량의 ELISA법을 사용하여 상등액 중 항체가 고친화도로 CD3E에 결합된 클론을 각각 검출한다. 그리고 상기 단클론항체의 홀 내 융합 세포를 서브클로닝하고, 추가적으로 선별하여 하이브리도마 세포주 #191, #591 및 #831을 획득한다.

특이성 항체를 생성한 클론을 10% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양한다. 세포밀도가 약 5×10⁵세포/mL로 되었을 때, 무혈청 배지로 상기 배지를 대체한다. 2일 내지 4일 후, 배양 후의 배지를 원심 분리하여 배양물 상등액을 수집한다. 단백질 G 칼럼을 항체의 정제에 사용한다. 150mM NaCl로 단클론항체 용출액을 투석한다. 0.2μm의 필터로 투석된 용액을 여과하여 멸균함으로써, 테스트될 정제된 단클론항체 AP191, AP591 및 AP831을 획득한다.

실시예 2. ELISA 방법으로 뮤린 항체와 인간 CD3 항원의 결합 기능을 측정

100μL 0.1μg/mL 인간 CD3E(Acro Biosystems로부터 구매함)으로 미량정량판(microtiter plate) 코팅한 후, 실온에서 밤새 놔둔다. 코팅 용액을 버리고 인산완충식염수(PBS)에 용해된 탈지유로 각 웰을 0.5시간 동안 블로킹하고, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 함유된 PBS (PBST)로 웰을 세척한다. 그리고, 각 웰에 정제된 항 인간 CD3 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831을 각각 50μL씩 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.05% PBST로 웰을 세척한 다음, 각 웰에 HRP로 표지된 염소 항 마우스 IgG 폴리클론항체(Jackson Laboratory로부터 구매함) 50μL를 추가하여 검출 항체로 사용하고, 37℃에서 1h 동안 배양한다. 0.05% PBST로 3번 세척하고, TMB을 100μL/웰로 추가한 다음, 실온에서 5 min 동안 발색시킨다. 0.2M H₂SO₄을 50μL/웰로 추가하여 반응을 종료시킨다. 마이크로플레이트리더로 두 파장 450nm/620nm에서 흡수값을 판독한다. OD 450nm/620nm을 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6으로 그래프를 작성한다.

결과 도 1에 나타난 바와 같이, 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831과 인간 CD3E은 모두 비교적 높은 친화도를 구비하며, AP191, AP591 및 AP831가 인간 CD3E 분자에 결합하는 EC₅₀값은 각각 0.01491nM, 0.02826nM 및 0.04038nM이다.

실시예 3. CD3 뮤린 항체의 친화도 측정 및 동역학 연구

생물층 간섭계 기술(BLI)을 사용하여, 정제된 뮤린 단클론항체와 항원 CD3E의 결합 친화도 상수를 측정하고, 기기는 PALL회사의 ForteBio Octet RED&QK시스템이다. 멀티채널 동시 정량적 분석의 농도 구배를 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100nM로 설정하고, His-표지된 인간 CD3E을 10μg/mL으로 Ni-NTA 센서에 커플링시킨다. 친화도 측정 결과는 표 1과 같고, 결과에 나타난 바와 같이, 뮤린 단클론항체는 인간 CD3에 대해 아주 높은 결합 친화도를 구비하고, 10^-10M 수량급에 달할 수 있다.

표 1, 뮤린 단클론항체의 친화도 측정 결과

실시예4. CD3 뮤린 항체의 체외 생물학 기능 평가

4.1. CD3 뮤린 항체와 인간 1차 T세포의 결합 활성

인간 1차 T세포를 배양하되, 원심분리하여 세포를 수집하고 1% BSA의 PBS 용액(PBSB)으로 재현탁하여, 세포밀도를 1×10⁶개/mL로 조절한 다음, 96웰 U 형 플레이트에 100μL/웰로 첨가한 후, 4℃에서 30min 동안 블로킹시킨다. 세포를 1% PBSB로 1번 세척한다. 그리고, 배양된 일련의 농도의 CD3 뮤린 항체 AP591, AP191, AP831을 100μL/웰로 추가한 다음, 4^oC에서 1h 동안 배양한다. 상등액을 원심분리하여 제거한 다음, 1% PBSB로 2번 세척한 후, 희석된 AF647염소 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Jackson Immuno Research Inc., 1:250로 희석함)를 100μL/웰로 추가하고, 4^oC에서 1h 동안 차광하여 배양한다. 상등액을 원심분리하여 제거한 다음, 1% PBSB로 플레이트를 2번 세척한 후, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 200μL/웰로 추가하여 세포를 재현탁시키고, 유세포분석기로 신호 강도를 검출한다. 평균 형광 강도를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6을 통해 분석함으로써, CD3 뮤린 항체가 인간 1차 T세포에 결합하는 EC₅₀값을 계산한다.

도 2와 같이, 세포 수준에서, CD3 뮤린 항체는 인간 1차 T세포와 결합하고, 이의 신호 강도는 항체 농도와 정비례되며, 결합 효과는 AP831>AP191>AP591이고, AP591, AP191 및 AP831이 인간 1차 T세포와 결합하는 EC₅₀값은 각각 8.907nM, 2.743nM 및 0.825nM이다.

4.2. CD3 뮤린 항체가 PBMC 세포 증식 능력을 촉진하는 것에 관한 검출

CellTiter-Glo^®루미네선스(luminescence) 세포 활성 검출 키트는, ATP에 대해 정량적 측정을 진행함으로써, 배양물 중 생존 세포 수를 검출하는 검출 방법이다.

밀도구배 원심분리법을 사용하여 인간 말초혈로부터 신선한 PBMC을 획득하고, 동결 저장 방식으로 액체 질소에 저장한 후, 대기 사용한다. 동결 저장된 PBMC을 소생시킨 후, 10% FBS가 함유된 1640 배지로 세포밀도를 5×10⁵개/mL로 조절하고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가한다. 배지로 CD3 뮤린 항체 AP591, AP191, AP831을 10μg/mL로 희석하고, 10배로 희석하여 7구배로 만든 후, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하고, 두 개의 중복 웰을 설치한 다음, 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 20h 동안 배양한다. 1000IU/mL로 IL-2을 추가하되, 50μL/웰로 상기 96웰 플레이트에 추가한 후, 37℃, 5% CO₂에서 계속하여 48h 동안 배양하고, 또한 항체 및 IL-2을 추가하지 않고 처리한 대조군(Blank), 및 항체를 추가하지 않고 IL-2만 추가한 대조군(Blank(IL-2))을 설치한다. 96웰 플레이트 중의 세포를 균일하게 블로잉한 후, 100μL 세포 현탁액을 피펫팅하여 96웰 화이트 플레이트에 넣고, 100μL CellTiter-Glo^®루미네선스 세포 활성 검출 시약(Promega, G7571)을 추가한 다음, 쉐이커(shaker)에서 10min 동안 진탕시켜 배양한다. 마이크로플레이트리더로 저온발광 값(Cold luminescence values)을 검출한다. 루시퍼라제 강도를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6을 통해 그래프를 작성하여 분석한다.

도 3과 같이, CD3 뮤린 항체 AP591, AP191, AP831은 모두 T세포 증식을 촉진할 수 있고, 증식 효과는 AP591이 가장 우수하며, 그 다음으로 AP191과 AP831이다.

실시예 5. 항 인간 CD3 뮤린 항체의 항체 아형 식별 및 가변 영역의 증폭

하이브리도마 세포를 취하여 상등액을 배양하고, IsoStrip^TM 뮤린 단클론항체 아형 식별 키트(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 항체 아형을 식별한다. 뮤린 항체 AP591의 아형은 IgG1(Lambda)로 식별되었고, AP191의 아형은 IgG1(Kappa)로 식별되었으며, AP831의 아형은 IgG1(Kappa)로 식별되었다.

항체 가변 영역의 증폭: 후보 하이브리도마 세포주를 총 10⁷개 세포로 배양하고, 1000rpm인 조건에서 10분 동안 원심 분리하여 세포를 수집하고, Trizol 키트(Invitrogen)로 전체 RNA를 추출하며, 역전사 키트 SMARTer RACE로 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하고, 첫 번째 가닥 cDNA를 후속 주형으로 하여, 하이브리도마 세포에 대응되는 항체 가변 영역 DNA 서열을 증폭시킨다. 아형 식별 결과에 따라, 상기 항체 아형의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열을 획득하고, 특이적인 네스티드(nested) PCR 프라이머를 설계하되, 상기 증폭 반응에 사용된 프라이머 서열은 항체 가변 영역의 제1 프레임워크 영역 및 불변 영역과 상보적인 서열이다. 상규적인 PCR 방법을 사용하여 표적 유전자를 증폭시키고, 증폭 생성물에 대해 시퀀싱한 후, 하이브리도마 세포주 #191에 의해 분비되는 항체 AP191의 중쇄 가변 영역 서열인 서열번호 1과 경쇄 가변 영역 서열인 서열번호 2; 하이브리도마 세포주 #591에 의해 분비되는 항체 AP591의 중쇄 가변 영역 서열인 서열번호 3과 경쇄 가변 영역 서열인 서열번호 4; 하이브리도마 세포주 #831에 의해 분비되는 항체 AP831의 중쇄 가변 영역 서열인 서열번호 5와 경쇄 가변 영역 서열인 서열번호 6을 얻는다. 상기 항체의 중쇄 CDR(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)과 경쇄 CDR(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)의 아미노산 서열은 각각 아래 표 2-1 내지 표 2-3에 나타난 바와 같다.

표 2-1 뮤린 항체 AP191의 중쇄 및 경쇄 CDR

표 2-2 뮤린 항체 AP591의 중쇄 및 경쇄 CDR

표 2-3 뮤린 항체 AP831의 중쇄 및 경쇄 CDR

상기 CDR 영역 서열은 각각 Kabat 및 IMGT 방법으로 정의되고, 임의의 기타 본 분야에서 공지된 CDR 영역 서열의 확정 방법으로 가변 영역 내의 CDR 영역의 아미노산 잔기를 식별할 수도 있다.

실시예 6. 항 인간 CD3 뮤린 항체의 인간화 변형

CDR 이식 방법(CDR grafting)으로 뮤린 항체에 대해 인간화 변형을 진행한다. CDR 이식의 기본적 원리는, 뮤린 항체의 CDR 영역을 인간화 항체 주형에 이식하면서, CDR 구조를 안정화시키고 항원-항체 결합에 중요한 몇 개 또는 일부 핵심적인 뮤린 항체 FR 영역 잔기도 함께 인간화 항체 주형(backmutations)에 도입함으로써, 뮤린 항체의 면역원성을 낮추면서도 뮤린 항체의 친화도를 유지시키는 목적에 도달하는 것이다. 상기 CDR grafting 조작 외에, CDR grafting 후의 인간화 항체의 등전점(PI), 소수성 응집(aggregation), 번역 후 변형(PTM, 예를 들어 글리코실화, 분열, 이성화 부위 등) 및 면역원성(immunogenicity)의 네 개 측면에 대해 추가적으로 계산하고, 임상 사용시 인간화 항체가 충분히 약효를 발휘하도록 이러한 네 개의 측면의 문제를 초래하는 아미노산에 대해 돌연변이를 일으킨다.

항체 인간화의 구체적인 흐름은 다음과 같다. IMGT 웹사이트의 인간 항체 생식계열 데이터베이스(IMGT human antibody germline database, http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)를 검색하여, 뮤린 항체와 유사도가 높은 인간화 항체 주형을 획득한다. Discovery Studio로 뮤린 항체와 인간화 항체 주형에 대해 CDR 영역을 주석(annotated)하고, Kabat 또는 IMGT 방안에 따라 CDR 영역을 정의해낸다. 뮤린 항체의 여섯 개의 CDR 영역으로 각각 인간화 항체 주형의 여섯 개의 CDR 영역을 대체한다. 이식된 6개의 CDR 영역 중의 단독적인 각 CDR 영역은, Kabat에 따라 정의된 아미노산 영역일 수 있거나, IMGT에 따라 정의된 아미노산 영역일 수 있다. CDR 이식 후, 뮤린 항체로부터 인간화 주형 FR 영역으로의 복귀 돌연변이를 진행한다. 항체 CDR 영역 구조를 안정화시키고 항원-항체 결합에 중요한 핵심적인 뮤린 항체 FR 영역의 아미노산은 네 가지 아미노산 잔기: 1) CDR 영역 6Å 이내의, 항체 표면 아래에 숨겨진 아미노산; 2) CDR 영역 6Å 이내의, 항체 표면에 노출된 아미노산; 3) 항체 경쇄와 중쇄 도메인 사이의 계면 아미노산; 및 4) 항체 CDR 영역 구조를 안정화시키는 vernier zone residues(Foote J and Winter G, 1992, J Mol Biol, 224:487-499)을 포함한다. 상기 네 가지 핵심 뮤린 항체 FR 영역 잔기는, 뮤린 항체 삼차원 구조 모델을 구축함으로써 확정된다. 뮤린 항체 서열과 일치하지 않는 인간화 주형의 이러한 네 가지 아미노산의 경우, 삼차원 구조 분석을 통해, CDR 구조의 유지 및 항원-항체 결합에 중요한 아미노산을 선택하여, 뮤린 항체으로부터 인간화 주형으로의 아미노산 이식 또는 대체를 진행한다. 그리고, 네 가지 아미노산이 이식 후 생성된 인간화 항체에 대해 추가적으로 등전점, 소수성 응집, 번역 후 변형 및 면역원성을 계산하고, 문제가 있는 아미노산을 돌연변이 시킴으로써, 최종적인 인간화 항체 서열을 얻는다.　

상기 방법에 따라, 뮤린 항체 AP191, AP591 및 AP831의 CDR의 기초상, 총 18개의 인간화 항체를 구축하였고, 각각 AB610 내지 AB627로 명명하며, 상기 인간화 항체의 가변 영역 아미노산 서열은 표 3과 같다.

표 3 인간화 항체 가변 영역 아미노산 서열

예시적으로, 본 발명에서 제조된 인간화 항체 AB610, AB611, AB612, AB613 및 AB614의 가변 영역에 포함된 CDR 영역의 아미노산 서열은 표 4와 같으며, 각각 Kabat 및 IMGT 방법으로 정의된다.

표 4 예시적인 항 CD3 인간화 항체의 CDR 영역 서열

두 개의 중쇄 및 경쇄로 구성된 전장 항체 서열을 획득하기 위해, 일반적인 기술을 사용하여 표 3에 나타낸 바와 같은 VH와 VL 서열을 항체 중쇄 불변 영역(바람직하게 인간 IgG1 또는 IgG4로부터 선택됨) 및 경쇄 불변 영역(바람직하게 인간 κ 경쇄로부터 선택됨)과 스플라이싱 또는 조립된다. 예를 들면, 일 실시 방안에서, 항 CD3 항체 분자는 표 5에 나타낸 바와 같은 야생형 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역과 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또는 변형된 인간 IgG4 불변 영역 서열을 사용하고, 예를 들면, 일 실시 방안에서, 표 5에 나타낸 바와 같이, 항 CD3 항체 분자는 EU 넘버링에 따른 위치 228에서 돌연변이(예를 들어 S가 P로 변이됨)된 인간 IgG4를 포함한다. 다른 한 실시 방안에서, 항 CD3 항체 분자는 야생형 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역과 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또는 변형된 인간 IgG1 불변 영역 서열을 사용하고, 예를 들면, 표 5에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따른 297번 위치에서 치환(예를 들어 Asn가 Ala로 치환됨)을 포함된다. 또 하나의 실시 방안에서, 표 5에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따른 234번 위치에서 치환을 포함하거나, EU 넘버링에 따른 235번 위치에서 치환을 포함하거나, 이러한 2종의 치환(예를 들어 234번 위치에서 Leu가 Ala로 치환되고, 및/또는 235번 위치에서 Leu가 Ala로 치환됨)을 포함한다.

표 5 인간 IgG 중쇄 및 인간 κ 경쇄 불변 영역 아미노산 서열

예시적인 실시방안에서, 본 발명의 인간화 항체는 EU 넘버링에 따른 위치 228에서 돌연변이(S가 P로 변이됨)된 인간 IgG4와 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 예시적인 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 대응되는 뉴클레오티드 서열은 표 6과 같다.

표 6 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 대응되는 뉴클레오티드 서열

실시예 7. 항 인간 CD3 항체 발현 벡터의 구축, 발현, 제조

상기 실시예에서 획득한 중쇄 및 경쇄 서열에 따라, 코딩 cDNA을 pCMAB2M 진핵 발현 벡터에 삽입하여, 인간화 발현 벡터를 구축하도록 설계된다. 상기 발현 벡터 플라스미드는 포유동물 세포에서 고수준 발현에 필요한 거대세포 바이러스 초기 유전자 프로모터-인핸서를 포함한다. 또한, 벡터 플라스미드에는 선발 표지 유전자(selectable marker gene)가 포함되어, 세균에서는 암피실린(ampicillin) 내성이 부여되고, 포유동물 세포에서는 G418 내성이 부여된다. 또한, 벡터 플라스미드에는 이수소 엽산 환원효소(DHFR) 유전자가 함유되어 있고, 적합한 숙주세포에서, 메토트렉세이트(Methotrexate, MTX)로 항체 유전자와 DHFR 유전자를 공동 증폭시킬 수 있다.

상기 구축된 재조합 발현 벡터 플라스미드를 포유동물 숙주세포계에 형질감염시킴으로써, 인간화 항체를 발현하도록 한다. 고수준의 발현을 안정화시키기 위해, 바람직한 숙주세포계는 DHFR 결핍형의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다(미국 특허 No.4,818,679을 참조). 바람직한 형질감염 방법은 전기천공법이되, 칼슘포스페이트 공침법, 리포펙션(lipofection) 및 원형질체 융합 등을 포함하는 기타 방법을 사용할 수도 있다. 전기천공법에서, 300V 전기장 및 1050μFd 커패시터로 설정된 GenePulser(Bio-Rad Laboratories)을 사용하고, 큐벳 내에 2×10⁷개 세포를 추가한 후, 20μg의 발현 벡터 플라스미드가 함유된 0.8mL의 PBS에 현탁시킨다. 형질감염 2일 후, 0.2mg/mL G418 및 200nM MTX(Sigma)을 추가한다. 고수준의 발현을 구현하기 위해, MTX 약물에 의해 억제된 DHFR 유전자로 형질감염된 항체 유전자를 공동 증폭시킨다. 한계희석법으로 형질감염체를 서브클로닝 및 ELISA 방법으로 각 세포계의 분비율을 측정하고, 항체를 고수준으로 발현시키는 세포주를 선택한다. 항체의 조건 배지를 수집하여, 이의 생체외 및 생체내 생물학적 활성을 측정하는 데 사용한다.

실시예 8. CD3 인간화 후보 항체의 체외 생물학 기능의 평가

8.1. CD3 인간화 항체와 CD3 항원의 결합 능력

0.1μg/mL His-태그의 인간 또는 게잡이 원숭이 CD3E(Acro Biosystems로부터 구매함)을 100μL/웰로 미량정량판을 코팅하고, 4℃에서 밤새 코팅한다. 코팅 용액을 버리고, 1% PBSB을 200μL/웰로 블로킹하고, 37℃에서 1h 동안 배양한 다음, 0.05% Tween-20이 함유된 PBS로 플레이트를 세척한다. 그리고 희석된 일련의 농도의 CD3 인간화 항체 AB611, AB614을 100μL/웰로 추가하고, 37℃에서 1h 동안 배양한 다음, 0.05% PBST로 플레이트를 세척한 후, HRP로 표지된 염소 항 인간 IgG(H+L)(Jackson Laboratory)를 검출 항체로 추가하여, 37℃에서 1h 동안 배양한다. 0.05% PBST로 3번 세척하고, TMB을 100μL/웰로 추가한 다음, 실온에서 5min 동안 발색시킨다. 0.2M H₂SO₄을 50μL/웰로 추가하여 반응을 종료시킨다. 마이크로플레이트리더로 두 파장 450nm/620nm에서 흡수값을 판독한다. OD450nm/620nm를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축을 한 후, 소프트웨어 GraphPad Prism 6을 통해 그래프를 작성한다.

도 4 및 표 7과 같이, 분자수준에서, 인간화 항체 AB611 및 AB614는 인간 또는 게잡이 원숭이의 CD3E 항원에 아주 우수하게 결합할 수 있으므로, 결합 효과가 상당하다.

표 7 CD3 인간화 항체와 인간 또는 게잡이 원숭이 CD3의 결합 활성의 측정 결과

8.2. CD3 인간화 항체와 인간의 1차 T세포의 결합 활성

인간 1차 T세포를 배양하되, 원심분리하여 세포를 수집하고 1% PBSB로 재현탁하여, 세포밀도를 1×10⁶개/mL로 조절한 다음, 96웰 U 형 플레이트에 100μL/웰로 첨가한 후, 4℃에서 30min 동안 블로킹시킨다. 1% PBSB로 세포를 1번 세척한다. 그리고, 희석된 일련의 농도의 CD3 뮤린 항체 AB611 및 AB614을 100μL/웰로 추가한 다음, 4℃에서 1h 동안 배양한다. 상등액을 원심분리하여 제거한 다음, 1% PBSB로 2번 세척한 후, 희석된 AF647 염소 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Jackson Immuno Research Inc., 1:250로 희석함)를 100μL/웰로 추가하고, 4℃에서 1h 동안 차광하여 배양한다. 상등액을 원심분리하여 제거한 다음, 1% PBSB로 플레이트를 2번 세척한 후, 4% PFA를 200μL/웰로 추가하여 세포를 재현탁시키고, 유세포분석기로 신호 강도를 검출한다. 그리고 평균 형광 강도를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6을 통해 분석함으로써, 상기 CD3 뮤린 항체 AB611 및 AB614가 인간 1차 T세포에 결합하는 EC₅₀값을 계산한다.

도 5와 같이, 세포수준에서, 상이한 CD3 인간화 항체는 아주 우수하게 인간 1차 T세포와 결합할 수 있고, AB611이 결합하는 신호 값은 AB614보다 낮다. 인간의 1차 T세포와 결합하는 AB611 및 AB614의 EC₅₀값은 각각 0.174nM 및 1.180nM이다.

8.3. CD3 인간화 항체가 PBMC 세포 증식을 촉진하는 능력의 검출

동결 저장된 PBMC을 소생시킨 후, 10% FBS가 함유된 1640 배지로 세포밀도를 5×10⁵개/mL로 조절하고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 첨가한다. 배지로 CD3 인간화 항체 AB610, AB611, AB614을 1μg/mL로 희석하고, 10배로 희석하여 6구배로 만든 후, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하고, 두 개의 중복 웰을 설치한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20h 동안 배양한다. 1000IU/mL로 IL-2을 추가하되, 50μL/웰로 상기 96웰 플레이트에 추가한 후, 37℃, 5% CO₂에서 계속하여 48h 동안 배양하고, 또한 항체 및 IL-2을 추가하지 않고 처리한 대조군(Blank), 및 항체를 추가하지 않고 IL-2만 추가한 대조군(Blank(IL-2))을 설치한다. 96웰 플레이트 중의 세포를 균일하게 블로잉한 후, 100μL 세포 현탁액을 피펫팅하여 96웰 화이트 플레이트에 넣고, 100μL CellTiter-Glo^®루미네선스 세포 활성 검출 시약(Promega, G7571)을 추가한 다음, 쉐이커(shaker)에서 10min 동안 진탕시켜 배양한다. 마이크로플레이트리더로 저온발광 값(Cold luminescence values)을 검출한다. 루시퍼라제 강도를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6을 통해 그래프를 작성한다.

도 6과 같이, CD3 인간화 항체 AB610, AB611 및 AB614는 모두 T세포 증식을 촉진할 수 있고, 여기서 AB614의 효과가 가장 우수하고, 그 다음으로 AB611, AB610이다.

8.4. CD3 인간화 후보 항체의 T세포 활성화 능력의 평가

NFAT RE 보고 유전자가 함유된 Jurkat T세포(BPS Bioscience로부터 구매함)는, CD3 단클론항체가 존재하는 상황에서, 루시퍼라제를 과발현할 수 있고, 루시퍼라제의 활성을 검출함으로써 Jurkat T세포의 활성화 정도를 정량화한다. 구체적으로, NFAT-JurkaT세포의 세포밀도를 2×10⁶개/mL까지 조절하고, 50μL/웰로 조절한다. 일련의 농도의 CD3 인간화 항체 AB614을 50μL/웰로 추가하고, 두 개의 중복 웰을 설치한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4h 동안 배양한다. Steady-Glo^® 루시퍼라제(Luciferase)(Promega로부터 구매함)를 100μL/웰로 추가하고, 5min 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트리더로 저온발광 값(Cold luminescence values)을 검출한다. 루시퍼라제 강도를 Y축으로 하고, 항체 농도를 X축으로 한 다음, 소프트웨어 GraphPad Prism 6통해 분석함으로써, T세포를 활성화시키는 CD3 인간화 항체 AB614의 EC₅₀을 계산한다.

도 7에 도시된 활성화 실험 평가에서, CD3 인간화 항체 AB614는 T세포에 대해 양호한 활성화 효과를 구비하며, EC₅₀은 0.142nM이다.

8.5. 생물층 간섭계 기술로 항 CD3 인간화 항체의 동역학 상수 및 친화도를 측정

예시적으로, 인간화 항체 동역학 상수 및 친화도 평형해리상수를 측정하는 실험 방법은 실시예 3을 참조한다. 인간화 항체 친화도 결과는 표 8을 참조한다.

표 8 인간화 항체의 친화도 측정 결과

비록 본 발명의 바람직한 예를 설명하였지만, 본 분야의 당업자는 본 문의 교시에 따라 각종 변화을 진행할 수 있음으로 이해해야 하며, 이러한 변화는 본 발명의 범위에 위배되지 않는다.

본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 참조로서 단독적으로 인용되는 것처럼, 모두 참조로서 본 출원에 인용된다. 이외에, 본 발명의 상기 설명한 내용을 읽은 후, 본 분야의 당업자는 본 발명에 대해 각종 변형 또는 수정할 수 있고, 이러한 등가 형태는 본 출원에 첨부된 청구항에 한정된 범위내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> AMPSOURCE BIOPHARMA SHANGHAI INC. <120> ANTI-CD3 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> 202105 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> AP191 heavy chain variable region <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Thr Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Glu Phe Trp Gly His Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> AP191 light chain variable region <400> 2 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val 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acacactgcc accctctcag 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg acatgcctgg tgaagggctt ctatccttcc 1140 gatatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagccagaga acaattacaa gaccacacct 1200 ccagtgctgg attctgacgg ctccttcttt ctgtattccc ggctgaccgt ggacaagagc 1260 agatggcagg agggcaacgt gtttagctgt tctgtgatgc atgaggctct gcacaatcat 1320 tacacacaga agtccctgag cctgtctctg ggcaag 1356 <210> 84 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AB614 light chain nucleotide sequence <400> 84 gagctggtgg tgacccagga gccatctctg acagtgtccc ccggcggcac agtgaccctg 60 acatgtagat ccagcaccgg cgtggtgacc acatccaact acgctaattg ggtgcaggag 120 aagccagatc acctgttcac aggactgatc ggagctacca actacagggc tcctggaaca 180 ccagctcggt ttagcggatc tctgctggga ggcaaggctg ccctgaccct gtccggagtg 240 cagccagagg atgaggccat ctacttctgc gtgctgtggt atagcaatca ttgggtgttc 300 ggaggaggaa ccaagctgac agtgctgagg accgtggctg ccccctccgt gttcatcttt 360 cccccttccg atgagcagct gaagtccggc acagccagcg tggtgtgcct gctgaacaat 420 ttctacccta gagaggctaa ggtgcagtgg aaggtggaca acgccctgca gagcggcaat 480 tctcaggagt ccgtgaccga gcaggatagc aaggactcta catattccct gtccagcaca 540 ctgaccctga gcaaggctga ttacgagaag cacaaggtgt atgcctgtga ggtgacccat 600 cagggcctgt cttcccctgt gacaaagtct ttcaaccggg gcgagtgc 648 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 85 Gly Phe Asp Phe Asn Thr Tyr Ala 1 5 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 86 Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr Ala 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 87 Asp Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 88 Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 89 Asp Thr Asn Tyr Arg Ala Pro 1 5 <210> 90 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 90 Asp Thr Asn 1 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 91 Ala Thr Asp Tyr Arg 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Claims

CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함된 중쇄 가변 영역(VH)은 하기 군에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 두 개 또는 적어도 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고,
(i) 서열번호 7, 13, 18, 24, 29, 35, 85, 86, 87 또는 88로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;
(ii) 서열번호 8, 14, 19, 25, 30, 36, 51, 55 또는 57로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 9, 15, 20, 26, 31, 37, 52, 56, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 또는 105로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3;
및/또는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함된 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 군에서 선택되는 적어도 하나, 적어도 두 개 또는 적어도 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고,
(iv) 서열번호 10, 16, 21, 27, 32, 38, 50, 53, 93 또는 94로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;
(v) 서열번호 11, 17, 22, 28, 33, 39, 54, 58, 89, 90, 91, 92 또는 95로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 12, 23 또는 34로 나타낸 서열을 구비하거나, 상기 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3,
바람직하게, (i)-(vi) 중 어느 하나에 따른 치환은 보존적 치환인, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 3개의 VH 가변 영역의 CDR과 3개의 VL 가변 영역의 CDR을 포함하고, 이는 하기 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(1) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(2) 서열번호 7, 51, 52, 53, 54, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(3) 서열번호 7, 51, 52, 10, 11, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(4) 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(5) 서열번호 13, 55, 56, 16, 17, 12로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(6) 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(7) 서열번호 18, 57, 20, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(8) 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(9) 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(10) 서열번호 29, 30, 31, 50, 33, 34로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(11) 서열번호 35, 36, 37, 38, 39, 34로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(12) 서열번호 87, 57, 20, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(13) 서열번호 18, 57, 20, 21, 89, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(14) 서열번호 18, 57, 20, 21, 91, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(15) 서열번호 18, 57, 20, 93, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(16) 서열번호 18, 57, 20, 21, 95, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(17) 서열번호 18, 57, 96, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(18) 서열번호 18, 57, 98, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(19) 서열번호 18, 57, 100, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(20) 서열번호 18, 57, 102, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(21) 서열번호 18, 57, 104, 21, 58, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(22) 서열번호 85, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(23) 서열번호 86, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(24) 서열번호 88, 25, 26, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(25) 서열번호 24, 25, 26, 27, 90, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(26) 서열번호 24, 25, 26, 27, 92, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(27) 서열번호 86, 25, 26, 27, 92, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(28) 서열번호 24, 25, 26, 94, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(29) 서열번호 24, 25, 97, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(30) 서열번호 24, 25, 99, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(31) 서열번호 24, 25, 101, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(32) 서열번호 24, 25, 103, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3;
(33) 서열번호 24, 25, 105, 27, 28, 23으로 나타낸 서열을 각각 구비하거나, 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개 또는 3 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3.
제 2 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 뮤린 또는 키메라이고, 이의 중쇄 가변 영역은 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 FR 영역을 포함하며; 및 이의 경쇄 가변 영역은 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 FR 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 3 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 군에서 선택되는 VH 및 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(i) 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(ii) 서열번호 3로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(iii) 서열번호 5로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 6로 나타낸 아미노산 서열, 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인.
제 2 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화된 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 5 항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 군에서 선택되는 VH 및 VL 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(1) 서열번호 40로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 41로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(2) 서열번호 42로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 43로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(3) 서열번호 44로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 45로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(4) 서열번호 46로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 47로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(5) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(6) 서열번호 106로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(7) 서열번호 107로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(8) 서열번호 108로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(9) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 109로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(10) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 110로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(11) 서열번호 111로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 112로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(12) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 113로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(13) 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 114로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(14) 서열번호 115로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(15) 서열번호 116로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(16) 서열번호 117로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(17) 서열번호 118로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인;
(18) 서열번호 119로 나타낸 아미노산 서열, 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 서열번호 49로 나타낸 아미노산 서열, 상기 서열과 기본적으로 동일한(예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 높은 동일성을 가지거나, 하나 혹은 여러 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 갖는) 서열을 포함하는 VL 도메인.
제 6 항에 있어서,
상기 항체는 인간면역 글로불린으로부터 유래된 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 포함하고; 비교적 바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며; 더욱 바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고; 상기 중쇄 불변 영역은 천연 서열 또는 이가 유래된 서열에 비해 하나 혹은 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 서열을 구비하며; 및 상기 경쇄 불변 영역은 바람직하게 서열번호 59로 나타내는 인간 κappa 사슬의 불변 영역인 항체.
제 7 항에 있어서,
상기 항체에 포함된 중쇄 불변 영역은, 아래와 같은 그룹:
(i) 서열번호 60으로 나타낸 야생형 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역;
(ii) 서열번호 61로 나타낸 Asn297Ala 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역;
(iii) 서열번호 62로 나타낸 Leu234Ala, Leu235Ala 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역;
(iv) 서열번호 63로 나타낸 야생형 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역;
(v) 서열번호 64로 나타낸 S228P 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역; 으로부터 선택되는 항체.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 항체는 하기 서열로부터 선택되는 전장 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:
(i) 이의 중쇄는 서열번호 65로 나타낸 아미노산 서열을 구비하고, 및 이의 경쇄는 서열번호 66로 나타낸 아미노산 서열을 구비하며; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하고; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열; 을 구비하며;
(ii) 이의 중쇄는 서열번호 69로 나타낸 아미노산 서열을 구비하고, 및 이의 경쇄는 서열번호 70로 나타낸 아미노산 서열을 구비하며; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하고; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열; 을 구비하며;
(iii) 이의 중쇄는 서열번호 73로 나타낸 아미노산 서열을 구비하고, 및 이의 경쇄는 서열번호 74로 나타낸 아미노산 서열을 구비하며; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하고; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열; 을 구비하며;
(iv) 이의 중쇄는 서열번호 77로 나타낸 아미노산 서열을 구비하고, 및 이의 경쇄는 서열번호 78로 나타낸 아미노산 서열을 구비하며; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하고; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열; 을 구비하며;
(v) 이의 중쇄는 서열번호 81로 나타낸 아미노산 서열을 구비하고, 및 이의 경쇄는 서열번호 82로 나타낸 아미노산 서열을 구비하며; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열에 비해 하나 혹은 여러 개가 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하고; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 더욱 높은 동일성을 구비하는 서열; 을 구비한다.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA분자.
제 10 항에 있어서,
상기 항체의 중쇄를 코딩하는 DNA분자는 서열번호 67, 71, 75, 79 또는 83과 같은 뉴클레오티드 서열을 구비하며, 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA분자는 서열번호 68, 72, 76, 80 또는 84에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA분자.
제 10 항 또는 제 11 항에 따른 DNA분자를 포함하는 벡터.
제 12 항에 따른 벡터를 포함하고; 원핵 세포, 효모 도는 포유동물 세포를 포함하는 숙주세포.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 벡터 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 있어서,
(a) 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유전자를 획득하여, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현 벡터를 구축하는 단계; (b) 유전자 공정 방법으로 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질감염시키는 단계; (c) 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생성을 허용하는 조건에서, 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (d) 생성된 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리시키고, 정제하는 단계;를 포함하고,
여기서, 단계 (a)에서 상기 발현 벡터는 플라스미드, 세균 및 바이러스 중의 1종 이상으로부터 선택되고, 바람직하게, 상기 발현 벡터는 pcDNA3.1이며;
여기서, 유전자 공정 방법으로, 구축된 벡터를 숙주세포에 형질감염시키는 단계 (b)에서, 상기 숙주세포는 원핵 세포, 효모 또는 포유동물 세포를 포함하되, 상기 포유동물 세포는 예를 들어 CHO 세포, NS0 세포 또는 기타 포유동물 세포이고;
여기서, 단계 (d)에서는 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 이온 교환, 소수성 크로마토그래피 또는 분자체 방법을 포함하는 상규적인 면역 글로불린 정제 방법으로, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리시키고 정제하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법.
약물 제조에서의 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도에 있어서,
상기 약물은 종양, 장기 이식 거부 반응 또는 자가면역성질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물 또는 제제를 제조하는 데 사용되는, 약물 제조에서의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
제 16 항에 있어서,
상기 암은 고형 종양; 혈액 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들면 다발성 골수종); 및 전이성 병소로부터 선택되고, 예를 들어 폐암, 흑색종, 신장암, 간암, 골수종, 유방암, 결장직장암, 백혈병 또는 암의 전이성 병소를 포함하되 이에 한정되지 않고; 상기 장기 이식 거부 반응은 세포, 조직 또는 예를 들어 신장, 간 및 심장 이식과 관련된 비정상적인 면역반응으로부터 선택되고, 이식편대숙주질환 및 동종 이식 거부반응을 포함하되 이에 한정되지 않으며; 상기 자가면역성질환은 류마티스 관절염, 청소년 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 용혈성빈혈, 재생불량성빈혈, 자가면역성 혈소판감소성자반증, 특발성 혈소판감소성자반증, 당뇨병, 뇌척수염, 그레이브스병, 중증근무력증, 베게너병, 자가면역성 간염 및 다발성 경화증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이성분자에 있어서,
바람직하게 상기 이중 특이성 항체는 아래와 같은 분자: CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD39, CD40, CD47, CD52, CD73, CD74, CD123, CD133, CD138, BCMA, CA125, CEA, CS1, DLL3, DLL4, EGFR, EpCAM, FLT3, gpA33, GPC-3, Her2, MEGE-A3, NYESO1, PSMA, TAG-72, CIX, 엽산염 결합단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR2, VEGFR3, 카드헤린(Cadherin), 인테그린(Integrin), 메소텔린(Mesothelin), Claudin18, αVβ3, α5β1, ERBB3, c-MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, B7단백질계열, 뮤신계열(Mucin), FAP 및 테나신(Tenascin); 에 대한 항체를 포함하되 이에 한정되지 않는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이성 분자.
유효량의 제 1 항 내지 제 9 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 혹은 제 14 항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자(예를 들어 인간)에서 종양, 장기 이식 거부반응 또는 자가면역질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 사용 명세서를 포함하는 진단성 또는 치료성 키트.