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KR20240006721A - 막 형질 전환 네오 안티젠 펩타이드 - Google Patents

막 형질 전환 네오 안티젠 펩타이드

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Publication number
KR20240006721A
KR20240006721A KR1020237034705A KR20237034705A KR20240006721A KR 20240006721 A KR20240006721 A KR 20240006721A KR 1020237034705 A KR1020237034705 A KR 1020237034705A KR 20237034705 A KR20237034705 A KR 20237034705A KR 20240006721 A KR20240006721 A KR 20240006721A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
sequence
tumor
cell
peptide
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020237034705A
Other languages
English (en)
Inventor
세바스챤 아미고레나
마리안 버비지
알렉산드르 후이
조슈아 워터폴
마크-앙리 스턴
벤자민 사다카
안토넬라 메를로티 이폴리토
크리스텔 구도
실비아 로페즈 라스트라
야고 아리바스 드 산도발
Original Assignee
엥스띠뛰 퀴리
므네모 테라퓨틱스
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엥스띠뛰 퀴리, 므네모 테라퓨틱스, 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) filed Critical 엥스띠뛰 퀴리
Publication of KR20240006721A publication Critical patent/KR20240006721A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본 개시내용은 전이성 인자(TE)-엑손 융합 전사체로부터 유래된 막관통 키메라 단백질 및 암 요법에 사용될 수 있는 이러한 키메라 단백질을 표적으로 하는 핵산, 항체, CAR, 비-HLA 제한 TCR 및 면역 세포를 제공한다.

Description

막관통 신생항원성 펩티드
본 개시내용은 암 요법에 사용될 수 있는 전이성 인자(TE)-엑손 융합 전사체, 핵산, 백신, 항체 및 면역 세포에 의해 암호화된 막관통 키메라 단백질 및 종양 신생항원성 펩티드를 제공한다.
고정밀 종양 표적화는 활성화된, 유전자 조작된 T 세포 및 다른 면역 세포의 주입을 사용하는 T 세포-기반 면역요법의 출현에 의해, 또는 단일 또는 이중 특이적 항체(예컨대 BiTE)의 전달에 의해 혁신되었다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 및 BiTE는 표적 세포 사멸을 유도하기 위해 종양을 표적으로 하는 단쇄 가변 단편(scFv)을 이용하는 T 세포 재유도 면역요법의 주요 형태이다. 면역 세포-표적화를 재유도하기 위해 이러한 접근법을 사용함으로써, 이전에는 면역 시스템에서 '보이지 않던' 악성 세포를 제거하는 것이 가능해졌으며, 특정 재발성 또는 난치성 종양 환자에게서 우수한 치료 결과를 제공하였다. 이는 특히, CD3과 같은 T 세포 신호 전달 단백질에 대한 항체 결합 도메인의 융합이 항원에 대한 T 세포 특이성을 재유도하는 능력을 가진 CAR T 세포의 경우에 효율적으로 발생한다. CAR의 주요 장점은, T 세포가 활성화되고, CAR이 세포 표면 분자와 직접적으로 상호작용함으로써 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의한 펩티드 제시를 인식하지 않으며 세포독성 과립 및 사이토카인의 방출과 같은 효과기 기능을 발휘할 수 있다는 것이다.
세포 기능 및 상호작용을 조작, 재유도하고 이에 영향을 미치는 능력에도 불구하고, 종양 세포에서 발현된 단백질을 표적화하는 것과 관련된 어려움이 있다. 실제 종양-특이적 항원(TSA)의 결여 및 종양 내 항원 탈출의 발생은 효과적인 표적 요법에 대한 주요 도전 과제로 남아 있으며, 이중 항원 표적화와 같은 접근법은 유망한 초기 결과를 보여주었다. 이러한 어려움은 혈액학적 악성 종양 및 고형 악성 종양에 대한 바이오마커를 발견하기 위한 끈질긴 노력을 초래하였다.
TSA는 악성 종양에서만 배타적으로 발현되며, 일반적으로 MHC를 통해 세포 표면에 제시된 단백질에서의 돌연변이의 맥락에서 고려된다. 그러나, TSA의 카테고리는 종양-특이적 융합 전사체, 종양 특이적 당질화, 세포 표면 단백질에서의 종양 특이적 돌연변이 및 소포체 내에서의 재접힘을 회피하는 오접힘 단백질로부터 유래된 단백질을 포함하도록 확장될 수 있다.
종양 연관 항원(TAA)의 치료적 표적화가 일부 경우에 성공적이었지만, 요법과 연관될 수 있는 잠재적인 종양 외 효과에 대한 경고로서도 기능하였다. 이러한 부류의 표적은 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)와 같은 매칭된 건강한 조직에 비해 악성 조직에서 더 높은 수준의 발현을 갖거나, CD19와 같은 것들의 발현이 제한된 계통으로 광범위하게 정의된다. TSA와 달리, TAA는 종종 표적 내 부작용을 갖는데, 이는 표적 내/종양 외 독성을 갖는 직접적인 치료 관련 부작용을 구분하는 것을 더 어렵게 할 것이다. CD19-발현 종양에서의 CD19 표적화 CAR T 세포 요법은 CAR T 세포가 임상적으로 효과적일 수 있음을 보여주는 획기적인 요법이었다. 따라서, TAA에 특이적인 계통의 표적화가 가능하지만, 건강한 조직이 불필요한 것으로 간주되거나 독성이 허용 가능한 수준인 경우에만 정당화된다.
(조직에는 없는) 공유된 실제 TSA 또는 최소 표적 내/종양 외 위험을 갖는 TAA를 식별하는 것이 면역-종양학 분야의 주요 도전 과제이다.
종양의 전이성 인자(TE)에 관한 몇몇 이전 보고서는 다음을 포함한다(Helman, E. 등(2014). Genome Res.)(Schiavetti, F. 등(2002). Cancer Res., Takahashi, Y. 등(2008). J. Clin. Invest). (Chiappinelli, K.B. 등(2015). Cell, Roulois, D. 등(2015). Cell). 그러나, 종양 세포에 의해 발현되는 항원성 환경과 TE의 관계는 심도 있게 조사되지 않았다.
새로운 종양 신생항원은 관심 대상일 것이며, 특히 입양 세포 요법, 항원 결합 도메인을 사용하는 표적 요법 및 백신접종 전략의 경우에 암 요법의 비용을 개선하거나 감소시킬 수 있다.
본 개시내용은, 키메라 폴리펩티드 (또는 단백질) 및 이러한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, T 세포 수용체(TCR), 특히 비-HLA 제한 TCR, 또는 이러한 키메라 폴리펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR); 이러한 항체, TCR 또는 CAR을 생성하는 방법; 이러한 신생항원성 펩티드, 항체, 이종 조절 제어 서열에 선택적으로 결합된, CAR 또는 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 이러한 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 면역 세포; 및 방법, 특히 이러한 생성물을 사용하는 치료 방법을 제공한다.
본 개시내용은 서열번호 1 내지 21542 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어지고, 신생항원 서열을 함유하는 종양 키메라 폴리펩티드(또는 단백질)를 제공하되, 상기 단백질은 세포막에 위치한다.
가장 구체적으로, 본 개시내용은 단리된 종양 신생항원 서열(통상적으로 에피토프)을 추가로 제공하되, 여기서 서열은 이의 단편을 포함하는 서열번호 1~8202의 키메라 단백질 중 어느 하나로부터 유래하고, TE-유래 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하거나, 서열번호 1424~8202, 8203~10163, 및 12831~21542 중 어느 하나로부터 유래하며, 특히 공여체가 TE인 키메라 융합 전사 서열로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 종양 신생항원 서열은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 중단점과 중첩된다. 다른 구현예에서, 종양 신생항원 서열은 순수 TE 서열로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 종양 신생항원 서열은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 접합부의 하류에 있는 비정규 ORF에 의해 암호화된다. 통상적으로, 종양 신생항원 서열은 종양 신생항원 서열이 속하는 키메라 단백질의 세포외 부분으로부터 유래한다.
통상적으로, 막관통 키메라 단백질은 종양 샘플의 1% 초과, 특히 5% 초과에서 발현되고, 통상적으로 10% 초과에서 발현된다.
통상적으로, 막관통 키메라 단백질은 정상 샘플과 비교하여 종양 샘플에서 더 높은 수준으로 발현된다.
통상적으로, 키메라 단백질은 정상 샘플의 20% 미만, 특히 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만에서 발현된다.
특정 구현예에서, TE 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 키메라 단백질의 서열 중 일부는 세포 표면에서 노출된다.
본 개시내용은 본원에서 정의된 바와 같은 막관통 키메라 단백질에 결합하고, 특히 서열번호 1~8202의 키메라 단백질 중 어느 하나로부터의 종양 신생항원 서열(통상적으로 에피토프)에 약 10~7M 미만의 Kd 결합 친화도로 결합하는 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 항체, 본원에 개시된 막관통 키메라 폴리펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 TCR 또는 CAR은 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개 아미노산의 종양 신생항원성 펩티드 서열에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 TE-유래 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하거나, 서열번호 1424~8202, 8203~10163, 및 12831~21542 중 어느 하나로부터 유래한, 특히 공여체가 TE인 키메라 융합 전사 서열로부터 유래한, 본원에 개시된 키메라 단백질 중 어느 하나로부터의 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 키메라 단백질의 서열 또는 단편은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 중단점과 중첩된다. 다른 구현예에서, 신생항원 펩티드는 순수 TE 서열로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 키메라 단백질의 서열 또는 단편은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 접합부의 하류에 있는 비정규 ORF에 의해 암호화된다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 하나 이상, 통상적으로는 하나 또는 두 개의 면역글로불린 영역(들)을 포함한다.
특히, 항원 결합 도메인은 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
또한 본 개시내용은 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함하되, 여기서 항체는 전체 IgG, scFv, BiTE, 또는 다중특이적 항체로부터 선택된다. 항체는 인간 쥣과 또는 낙타류 기원일 수 있다.
본 개시내용은 또한 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 비-HLA 제한 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다.
통상적으로, 본 개시내용의 비-HLA 제한 재조합 TCR은 제2 세포외 항원 결합 도메인과 이량체화될 수 있는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 세포외 항원 결합 도메인은 종양 항원에 결합하되, 바람직하게는, 종양 항원은 pHER95, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL1, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, Erb-B2, Erb-B3, Erb-B4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 엽산 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, κ-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MAGEA3, p53, MART1, GP100, 단백질분해효소3(PR1), 티로시나아제, 서바이빈, hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, BCMA, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, LILRB4, PRAME, 및 ERBB로부터 선택된다.
본 개시내용은 CAR을 추가로 포함하며, CAR은:
a) 이 중 적어도 하나는 본원에 기술된 것과 같은 항원 결합 도메인으로부터 선택되는, 하나 이상의 항원 결합 도메인(들)을 포함하는 세포외 도메인,
b) 막관통 도메인,
c) 선택적으로, 예를 들어 CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10, 및 GITR(AITR)로부터 선택된, 하나 이상의 공자극 도메인
d) 하나 이상의 ITAM을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인(들)으로서, 예를 들어: CD3-제타, 또는 하나 또는 두 개의 ITAM(예: ITAM3 및/또는 ITAM2, 또한 전술한 내용과 참고 문헌을 참조함)이 결여된 이의 변이체, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및/또는 CD66d로부터의 세포내 신호 전달 도메인 또는 이의 일부, 특히 ITAM2 및 ITAM3이 비활성화된 변형 CD3제타 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다,
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 CAR은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 CAR은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 공자극 도메인을 포함한다: CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10, 및 GITR(AITR).
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 CAR은 CD3-제타 폴리펩티드의 세포내 신호 전달 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하되, 선택적으로 CD3-제타 폴리펩티드는 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 2(ITAM2) 및 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 3(ITAM3)이 비활성화된다.
본 개시내용은 또한 다음을 포함한다:
- 예를 들어 적어도 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 길이인, 이의 일부를 포함하는 서열번호 1~21542 중 어느 하나로부터 유래한 키메라 단백질에 대한 결합 친화도에 대해 선택된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, T 세포 수용체(TCR), 또는 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 이러한 항체, 이의 항원 결합 단편, TCR 또는 CAR을 포함하는 조성물.
- 본원에 정의된 바와 같은, 통상적으로 이종 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 신생항원성 펩티드, 항체, CAR 또는 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 벡터;
- 면역 세포, 또는 이의 집단 또는 예를 들어 적어도 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 길이인, 이의 일부를 포함하는 서열번호 1~21542 중 어느 하나로부터 유래한 하나 이상의 키메라 단백질을 표적으로 하는 면역 세포로서, 면역 세포의 집단은 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 복수의 상이한 키메라 단백질 또는 이의 단편(들)을 표적으로 하는, 면역 세포 또는 생리학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한 완충제, 캐리어, 부형제, 면역자극제 및/또는 보조제와 선택적으로 조합된 이러한 면역 세포 또는 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물.
통상적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TCR 또는 CAR은 약 10-6M 이하의 Kd 친화도로 세포의 표면 상에서 발현된 키메라 단백질 또는 이의 단편에 결합한다.
본 개시내용은 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항체, 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR을 생성하는 방법을 추가로 제공하며, 본 방법은 본 개시내용의 키메라 단백질, 또는 이의 단편, 통상적으로 서열번호 1~21542의 막관통 키메라 폴리펩티드 서열 중 어느 하나에 약 10-7M 이하의 Kd 친화도 상수로 결합하는 항체, 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR을 선택하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 이러한 방법에 의해 생산된 항체, CAR 및 TCR을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 정의된 바와 같은, 이종 조절 제어 서열 및 이를 포함하는 벡터에 선택적으로 결합된, 키메라 단백질 또는 폴리펩티드, 항체, CAR 및/또는 비-HLA 제한 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 또한 CAR 및/또는 TCR, 특히 본원에 정의된 바와 같은 비-HLA 제한 TCR을 포함하는 면역 세포를 포함한다. 상기 면역 세포는 동종 또는 자가일 수 있다. 이는 통상적으로 T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, TIL/종양 유래 CD8 T 세포, 중앙 기억 CD8+ T 세포, Treg, MAIT, Υδ T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프구 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 Suv39h1에 대해 결함이 있으며, 특히 상기 면역 세포에서 Suv39h1 유전자는 전체 유전자, 엑손 또는 영역의 결실, 외인성 서열로의 치환, 및/또는 유전자 suv39h1 유전자 내의 프레임시프트 또는 미스센스 돌연변이에 의한 돌연변이에 의해 파괴된다. Suv39h1 유전자는 일반적으로 UniProt의 O43463을 참조하는 인간 Suv39h1 단백질을 암호화하는 인간 Suv39h1 유전자이다. 이러한 면역 세포를 제조하는 방법이, 예를 들어, 본원에 기술된 항체, TCR, 또는 CAR 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 생체 내 또는 생체 외 세포에 전달함으로써 또한 고려된다.
본 개시내용은 본원에 정의된 바와 같은 면역 세포의 유효량 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 치료적 용도, 특히 암 세포 증식을 억제하거나 본원에 정의된 바와 같은 키메라 단백질 또는 폴리펩티드, 항체 비-HLA 제한 TCR, CAR, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 면역 세포의 암 치료 또는 이를 포함하는 조성물의 암 치료를 이를 필요로 하는 대상체에서 하기 위한 치료적 용도를 포함한다. 통상적으로, 조성물은 약제학적 부형제를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 치료는 예방학적 및 치료학적 치료 둘 다를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 정의된 바와 같은 키메라 단백질 또는 폴리펩티드, 항체 비-HLA 제한 TCR, CAR, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 면역 세포의 암 세포 요법, 또는 이를 포함하는 조성물의 암 세포 요법에 있어서 이를 필요로 하는 대상체에서의 용도를 포함한다. 통상적으로, 조성물은 약제학적 부형제를 추가로 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나를 포함하고, 멸균된 약제학적으로 허용 가능한 부형제(들), 캐리어, 및/또는 완충제를 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물뿐만 아니라 이를 사용하는 방법 또한 고려된다.
본원에 기술된 구현예 중 어느 하나에서, 상기 정의된 바와 같은 암 치료제(Cancer Therapeutic Products)(즉, 본원에 정의된 바와 같은 막관통 키메라 단백질 또는 폴리펩티드, 항체 비-HLA 제한 TCR, CAR, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 면역 세포 또는 이를 포함하는 조성물)은 적어도 하나의 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 추가 치료제는 통상적으로 화학요법제, 또는 면역치료제, 선택적으로 체크포인트 억제제일 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용에 따르면, 암 치료제 중 임의의 것은 항-면역억제제/면역자극제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체에게는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, Lag-3 억제제, Tim-3 억제제, TIGIT 억제제, BTLA 억제제, T-세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA) 억제제 및 CTLA-4 억제제, 또는 IDO 억제제로부터 일반적으로 선택되는 하나 이상의 체크포인트 억제제와 추가로 투여된다.
상기 방법, 키메라 단백질 또는 폴리펩티드 및 암 치료제의 다양한 구현예가 아래에서 상세히 기술된다. 명확하게 언급된 대안을 제외하고, 이러한 구현예의 조합이 본 출원에 포함된다.
도 1:종양 마우스 계통 B16F10-OVA 세포(A) 및 MCA101-OVA 세포(B)에서 본 개시내용에 따른 인 실리코 방법에 의해 식별되고, 2개의 계통(C) 모두에서 식별된, 500nM 미만의 MHC 대립유전자에 대한 예측된 친화도를 갖는 종양 신생항원성 펩티드(또는 TE 유래 에피토프).
도 2: (A) 종양 마우스 계통 B16F10-OVA 및 MCA101-OVA의 cDNA에서, 신생항원성 펩티드 N25를 암호화하는 융합 전사 서열의 증폭의 RT-PCR 겔. (B) 종양 마우스 계통 B16F10, B16F10-OVA 및 MCA101-OVA의 cDNA에서, 신생항원성 펩티드 N26을 암호화하는 융합 전사 서열의 증폭의 RT-PCR 겔.
도 3: (A) DMSO(음성 대조군), OVA(난알부민)(양성 대조군), 펩티드 N25 또는 펩티드 N26으로 면역화된 동물의 서혜부 림프절에서 ELISPOT에 의한 펩티드-반응성 IFNg-분비 세포의 검출. (B) DMSO(음성 대조군), SIINFEKL(양성 대조군), N25 또는 N26 펩티드로 면역화된 동물의 10^5세포에 대한 IFNg 스폿.
도 4: (A) 상기 면역화된 마우스에게 종양 세포 B16F10-OVA를 주사한 후 다음 날, DMSO, OVA 또는 N25L 펩티드로 사전에 면역화된 마우스에서 종양 부피(mm3)의 진화. (B) 상기 면역화된 마우스에게 종양 세포 B16F10-OVA를 주사한 후 다음 날, DMSO, OVA 또는 N26L 펩티드로 사전에 면역화된 마우스에서 종양 부피(mm3)의 진화.
도 5: 784 내강, 100 HER2+, 197 TNBC, 112 정상 유방 조직, 516개의 원발성 폐 선암종(원발성 종양) 및 59개의 정상 폐 조직(고형 조직 정상)에 대한 TCGA 데이터 세트를 기술된 융합 전사 서열 암호화된 종양 신생항원성 펩티드를 식별하기 위한 방법에 의해 분석하였다. (A) 유방암의 상이한 아형(HER2+, TNBC, 정상 유방 조직 및 내강)에서의 융합 전사 서열(TE-엑손 융합)의 수. (B) 폐암의 상이한 아형(원발성 폐 선암종, 정상 폐 조직)에서의 융합 전사 서열(TE-엑손 융합)의 수.
도 6: 각 샘플로부터의 TE-유전자 융합 산물로부터 예측된 8 내지 9개의 아미노산-길이 펩티드를 동일한 샘플에서 발현된 예측된 HLA 대립유전자에 대한 결합에 대해 인 실리코로 시험하였다. 각 샘플로부터의 적어도 하나의 HLA-A, -B, 또는 -C 대립유전자에 대해 500nM 미만의 예측된 친화도를 갖는 펩티드가 도시되어 있다. (A) 유방암의 상이한 아형(HER2+, TNBC, 정상 유방 조직 및 내강)의 샘플. (B) 폐암의 상이한 아형(비소세포 폐암, 정상 폐 조직)의 샘플.
도 7:유방 종양 아형에 걸친 환자 당 종양 특이적 펩티드의 분포. (A) 유방암 환자의 아형 당 종양 특이적 HLA 결합 펩티드의 수가 도시되어 있다. (B) 내강 아형 샘플에 걸쳐 공유된 예측된 종양 신생항원성 펩티드의 수(n=784)(절제). (C) HER2+ 아형 샘플에 걸쳐 공유된 예측된 종양 신생항원성 펩티드의 수(n=100)(절제). (D) TNBC 아형 샘플에 걸쳐 공유된 예측된 종양 신생항원성 펩티드의 수(n=197) (절제).
도 8: (A) 원발성 폐 선암종(LUAD) 샘플(폐암) 당 종양 특이적 HLA 결합 펩티드의 수. (B) 폐 선암종에 걸친 환자 당 종양 특이적 펩티드의 분포. 일차 종양 아형 샘플에 걸쳐 공유된 예측된 종양 신생항원성 펩티드의 수(n=516)(절제).
도 9: 공여체가 엑손(A)일 때 및 공여체가 TE(B)일 때 융합 뉴클레오티드 서열의 재구성.
도 10: HLA-A2에 대한 키메라 전사체-유래 펩티드의 결합. 가장 빈번한 키메라 융합으로부터 예측된 펩티드의 HLA-A2 대립유전자에 대한 결합을 사량체 형성 검정을 사용하여 유세포 계측법으로 검증하였다. 결과는 양성 대조군 대비 결합 백분율로서 도시되어 있다. 점선은 이러한 대립유전자에 대한 결합을 확인하는 것으로 간주되는 임계값을 나타낸다.
도 11. HLA-A2 분자에 대한 ER 유래 펩티드의 결합. 합성된 키메라 전사체-유래 펩티드에 대한 펩티드-HLA-A*02:01 복합체 형성. 양성 대조군(CMV pp65 495-503) 대비 복합체 형성 백분율이 표시된다. 멜란(Melan)-A의 돌연변이된(MelA Mut) 및 비돌연변이된(MelA) 서열을 각각 강한 결합제 펩티드 대조군 및 약한 결합제 펩티드 대조군으로서 사용하였다. '음성'은 염색 배경을 나타낸다. 파선은 펩티드를 HLA-A*0201에 대한 양호한 결합제로서 간주하는 데 필요한 최소 복합체 형성 값(양성 대조군의 50%)을 나타낸다.
도 12. 융합 전사체-유래 펩티드 및 반응성 CD8+ T 세포 생성의 면역원성. (A) 6개의 상이한 건강한 공여체를 사용하는 시험관 내 면역원성 분석에서 6개의 상이한 건강한 공여체로부터 증식된 pJET(융합 전사체-유래 펩티드) 특이적 사량체-양성 CD8+ T 세포의 빈도. (B) 상이한 농도의 특이적 펩티드로 자극한 후 CTL-클론의 사이토카인 분비. 오른쪽에는 생성된 CTL-클론 및 이들의 펩티드 특이성이 열거되어 있다. (C) 항-MHC-I 항체 또는 이소형 대조군(좌측 패널)과 조합하여 2개의 상이한 펩티드 농도로 로딩된 표적 세포, 또는 상이한 비율의 로딩되지 않은 표적 세포(우측 패널)와 공동 배양한 CTL-클론 9에 대한 사멸 검정. (D) 항-MHCI-I 항체 또는 이소형 대조군과 조합하여 펩티드 미로딩 표적 세포와 공동 배양할 때 CTL-클론 9, 80 및 64에 대한 사멸 검정. 효과기:표적 비율은 각각의 개별 플롯에 표시되어 있다. H1650을 이 도면의 각 플롯에 대한 표적 세포로서 사용하였다.
도 13. 융합 유래 펩티드를 인식하는 TCR의 발현. 표적 세포와 단독으로 공동 배양하거나, 2개의 상이한 펩티드 농도로 로딩한 CTL-클론 9로부터 유래된 TCR 서열로 Jurkat-리포터 세포를 형질도입하였다. 플롯은 H1650 세포주를 표적 세포(상부 플롯)로 또는 H1395 세포주를 표적 세포(하부 플롯)로 사용하여, 유세포 계측법으로 평가된 3개의 리포터 유전자에 대한 양성 Jurkat 세포의 백분율을 보여준다. 음성 대조군: 형질도입되지 않은 Jurkat 세포. 펩티드 없음: 펩티드 미로딩 표적 세포와 공동 배양된 형질도입된 Jurkat 세포. 양성 대조군: PMA/이오노마이신으로 자극된 형질도입된 Jurkat 세포.
도 14. A. 관련/특이적 또는 비관련/비관련(irrelevant/unrelated) 펩티드(멜란-A)가 로딩된 표적 세포와 공동 배양한 후 키메라 전사체-유래 펩티드를 인식하는 CTL-클론-유래 TCR로 형질도입된 Jurkat 세포의 활성화. B. 항-MHC-I 차단 항체(W6/32) 또는 이소형 대조군의 존재 또는 부재 하에, 관련 펩티드 또는 비관련 펩티드(멜란-A)가 로딩된 표적 세포와 공동 배양한 후 키메라 전사체-유래 펩티드를 인식하는 CTL-클론-유래 TCR로 형질도입된 Jurkat 세포의 활성화. PMA/이오노마이신을 활성화의 양성 대조군으로서 사용하였고, 펩티드를 로딩하지 않은 표적 세포를 활성화의 음성 대조군으로서 사용하였다. H1395 LUAD 세포주를 표적 세포로서 사용하였다. 각각의 TCR이 유래되는 CTL-클론은 상단에 표시되고 괄호 사이에 펩티드 특이성에 표시되어, 이들 TCR 각각에 의해 인식되는 키메라 전사체-유래 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 펩티드 서열은 표적 세포를 로딩하기 위해 각각의 경우에 사용되는 특이적/관련 펩티드이다. 멜란-A 및 MelA Mut는 둘 다 관련이 없는 펩티드(ELAGIGILTV)를 지칭한다.
도 15. 융합 전사체-유래 펩티드를 인식하는 종양 침윤 림프구. 융합 전사체-유래 펩티드의 혼합물 + IL2(A)의 존재 하에 또는 IL-2(B)와 함께 증식된 종양 침윤 림프구(TIL)에서 발견되는 표시된 융합 전사체-유래 펩티드에 대한 사량체 양성 CD8 T 세포의 백분율.
도 16. LUAD 환자 유래 샘플에서 융합 전사체-유래 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포의 표현형. LUAD 환자 2(A, 상부 패널) 및 환자 3(B, 상부 패널)으로부터 유래된 종양, 병치 종양, 림프절 및 혈액 샘플에 존재하는 융합 전사체-유래 펩티드를 인식하는 사량체 양성 CD8 T 세포의 백분율. 도 (a) 및 (b)의 하부 패널에는 사량체 양성 부모 세포 집단의 미처리(CCR7+CD45+), 중앙 기억(CM, CCR7+CD45-), 효과기 기억(EM, CCR7-CD45-) 및 말단 효과기(TE, CCR7-CD45+) 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 17: A. T 세포 증식 없이 생체 외에서 발견되는 키메라 전사체-유래 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포의 빈도를 요약하는 히트맵. 적어도 하나의 조직에서 발견되는 펩티드 특이성만이 도시되어 있다(총 평가된 환자 = 4). B. 환자 2 및 환자 5에 대한 생체 외 염색 후 A에 요약된 사량체 양성 세포에서의 CCR7 및 CD45RA 백분율. (환자 1에 대해 이용 가능한 데이터 없음). C. 분석된 5명의 환자에서 종양, 병치 종양 또는 종양-배출 LN 샘플로부터의 CD8+ T 세포에 대해 20일차에 시험관내 증식 후 키메라 전사체-유래 펩티드를 인식하는 특이적 사량체 양성 세포를 요약하는 히트맵. 적어도 하나의 조직에서 발견되는 펩티드 특이성만이 도시되어 있다. 검은색 사각형은 동일한 조직 및 환자에서 생체 외에서도 발견되는 펩티드 특이성을 강조한다.
도 18. 폐 종양 샘플의 면역펩티도믹스 분석. 융합 전사체-유래 펩티드 서열을 공개 MHC-I 면역펩티돔 데이터세트에서 검색하였다. 각 열은 상이한 샘플을 나타낸다. 각각의 행은 상이한 펩티드 서열을 나타낸다(우측에 명시함). 착색된 정사각형은 어느 샘플이 각각의 융합 전사체 유래-펩티드에서 발견되는지를 나타낸다. 각각의 샘플 데이터 세트를 설명하는 간행물은 상단에 주석이 달린다.
도 19:형질감염되지 않은 음성 대조군(좌측) 및 ABHD1-JET 형질감염된 조건(우측)을 보여주는 FACS 히스토그램. 적색 히스토그램은 항-Myc 염색에 상응하고, 회색 선은 비-항체(완충액) 상태를 나타낸다.
정상 조직에서의 전이성 인자(TE) 발현은 배아 발달 초기에 확립된 DNA 메틸화에 의해 침묵된다. 히스톤 변형에 의해 추가적인 억제층이 제공된다. TE는 종양 세포에서 재활성화될 수 있다. 본 발명자들은 엑손과 TE 사이의 비정규적인 대안적 스플라이싱 이벤트가 종양 항원, 특히 종양-특이적 항원의 공급원일 수 있다는 명확한 증거를 발견하여 제공하였다.
본 발명자들은 종양 항원, 및 특히 종양 특이적 항원을 식별하기 위한 방법을 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 TE와 엑손 사이의 접합부(JET)로부터 유래된 종양 항원을 식별하기 위한 방법을 밝혀내었다. 일부 구현예에서, 본 발명은 따라서 TE 서열의 일부 및 엑손 서열의 일부를 포함하는 융합(즉, 본원에서 접합 엑손 TE - JET로도 명명되는 키메라) 전사 서열에 의해 암호화된 종양 신생항원 펩티드를 식별하고 선택하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 또한 본원에서 우수한 세포 표면 종양 신생항원 표적 후보를 나타내는 막관통 종양 키메라 단백질 또는 폴리펩티드 세트를 제공한다.
본 개시내용에 따른 방법에 의해 식별된 신생항원성 종양 특이적 펩티드는 면역원성이 높다. 실제로, 이들은 부재하거나 낮은 수준으로 발현되는 정상 세포로부터의 융합 전사체(이식 가능한 요소 - TE- 및 엑손 서열로 구성됨)로부터 유래되기 때문에, 본 개시내용의 펩티드는 매우 낮은 면역학적 내성을 나타낼 것으로 예상된다.
본 개시내용은 또한 환자 집단 사이에서 공유된 종양 네오에피토프를 갖는 펩티드를 선택하는 것을 허용한다. 이러한 공유된 종양 펩티드는 대규모 환자 집단을 위한 면역요법에 사용될 수 있기 때문에 치료학적 관심이 높다.
정의
본 개시내용에 따르면, 용어 "질환"은 암 질환, 특히 본원에 기술된 암 질환의 형태를 포함하는 임의의 병리학적 상태를 지칭한다.
용어 "정상"은 건강한 대상체 또는 조직에서의 건강한 상태 또는 병태, 즉 비병리학적 병태를 지칭하며, 여기서 "건강한"은 바람직하게는 비암성을 의미한다.
암(의학적 용어: 악성 신생물)은 세포군이 조절되지 않는 성장(정상 한계를 넘어서는 분열), 침투(인접한 조직에 대한 침입 및 파괴), 및 때때로 전이(림프 또는 혈액을 통한 신체의 다른 위치로의 확산)를 나타내는 질환의 부류이다. 암의 이러한 세 가지 악성 특성은 자가 제한적이며, 침투하거나 전이하지 않는 양성 종양과 이들을 구별한다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 백혈병과 같은 일부는 그렇지 않다.
악성 종양은 본질적으로 암과 동의어이다. 악성 종양(malignancy), 악성 신생물, 및 악성 종양(malignant tumor)은 본질적으로 암과 동의어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 바람직하게는 팽창 또는 병변을 형성하는 세포(신생물 세포, 종양성 세포 또는 종양 세포라고 함)의 비정상적인 성장을 지칭한다. "종양 세포"는 신속하고 조절되지 않는 세포 증식에 의해 성장하며 새로운 성장을 개시한 자극이 중단된 후 계속 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 조직 및 기능적 조정의 부분적 또는 완전한 결여를 나타내며, 일반적으로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다.
양성 종양은 암의 세 가지 악성 특성 모두가 결여된 종양이다. 따라서, 정의에 의하면, 양성 종양은 무제한적이며 공격적인 방식으로 성장하지 않고, 주변 조직에 침투하지 않으며, 인접하지 않은 조직으로 확산(전이)되지 않는다.
신생물은 신생물 형성의 결과로서 비정상적인 조직 덩어리이다. 신생물(그리스어로 새로운 성장)은 세포의 비정상적인 증식이다. 세포의 성장은 그 주위의 정상 조직의 성장을 초과하고, 이와 조정되지 않는다. 성장은 자극의 중단 후에도 동일한 과도한 방식으로 지속된다. 이는 일반적으로 덩어리 또는 종양을 야기한다. 신생물은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다.
본 개시내용에 따른 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"은 크기를 증가시키는 종양의 경향 및/또는 증식하는 종양 세포의 경향에 관한 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "암" 및 "암 질환"은 용어 "종양" 및 "종양 질환"과 상호교환적으로 사용된다.
암은 종양과 유사한 세포, 즉 종양의 기원으로 추정되는 조직의 유형에 의해 분류된다. 이들은 각각 조직학 및 위치이다.
본 출원에 따르면, 암은 다음 조직 또는 기관 중 어느 하나에 영향을 미칠 수 있다: 유방; 간; 신장; 심장, 종격, 흉막; 입바닥; 입술; 침샘; 혀; 잇몸; 구강; 입천장; 편도선; 후두; 기관; 기관지, 폐; 인두, 하인두, 구인두, 비인두; 식도; 위, 간내 담관, 담도, 췌장, 소장, 결장과 같은 소화 기관; 직장; 방광, 담낭, 요관과 같은 비뇨기 기관; 직장 S상 결장 접합부; 항문, 항문관; 피부; 뼈; 관절, 사지의 관절 연골; 눈 및 부속기; 뇌; 말초 신경, 자율신경계; 척수, 뇌신경, 수막; 및 중추신경계의 다양한 부분; 결합성, 피하 및 다른 연조직; 후복막, 복막; 부신; 갑상선; 내분비샘 및 관련 구조; 난소, 자궁, 자궁경부; 자궁체, 질, 외음부와 같은 여성 생식기; 음경, 고환 및 전립선과 같은 남성 생식기; 조혈계 및 망상내피계; 혈액; 림프절; 흉선.
따라서, 본 개시내용에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이의 전이를 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장 세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암 유형 또는 종양의 전이가 있다. 본 개시내용에 따른 용어 암은 또한 암 전이 및 암의 재발을 포함한다.
폐암의 주요 유형은 소세포 폐암종(SCLC) 및 비소세포 폐암종(NSCLC)이다. 비소세포 폐암종에는 세 가지 주요 하위 유형이 있다: 편평 세포 폐암종, 폐 선암종(LUAD), 및 대세포 폐암종. 선암종은 폐암의 약 10%를 차지한다. 일반적으로 이 암은, 둘 다 보다 중심에 위치하는 경향이 있는 소세포 폐암 및 편평 세포 폐암과는 대조적으로 폐의 말초에서 관찰된다.
"전이"란 원래 부위에서 신체의 다른 부위로 암세포가 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 원발성 종양으로부터 악성 세포의 분리, 세포외 기질의 침투, 체강 및 혈관으로 들어가기 위한 내피 기저막의 침투, 이어서 혈액에 의해 운반된 후 표적 기관의 침윤에 좌우된다. 마지막으로, 표적 부위에서 새로운 종양, 즉 이차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관형성에 좌우된다. 종양 세포 또는 성분이 잔존하여 전이 가능성을 발생시킬 수 있기 때문에, 종양 전이는 종종 원발성 종양을 제거한 후에도 발생한다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 "원격 전이"에 관한 것이다.
이차 또는 전이성 종양의 세포는 원래 종양의 세포와 유사하다. 이는, 예를 들어, 난소암이 간으로 전이되는 경우, 이차 종양은 비정상적인 간 세포가 아닌 비정상적인 난소 세포로 이루어진다는 것을 의미한다. 그렇다면, 간의 종양은 간암이 아닌 전이성 난소암이라고 한다.
재발(relapse) 또는 재현(recurrence)은 과거 개인에게 영향을 미쳤던 조건에 의해 다시 영향을 받을 때 발생한다. 예를 들어, 환자가 종양 질환을 앓은 적이 있고, 상기 질환에 대하여 성공적인 치료를 받았으며, 상기 질환을 다시 발생시키는 경우, 상기 새롭게 발생된 질환은 재발 또는 재현으로 간주될 수 있다. 그러나, 본 개시내용에 따르면, 종양 질환의 재발 또는 재현은 원래의 종양 질환의 부위에서 발생할 수는 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 환자가 난소 종양을 앓은 적이 있고 성공적인 치료를 받은 경우, 재발 또는 재현은 난소 종양의 발생 또는 난소와 상이한 부위에서의 종양의 발생일 수 있다. 종양의 재발 또는 재현은 또한 종양이 원래의 종양 부위와 상이한 부위뿐만 아니라 원래의 종양 부위에서 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래의 종양은 원발성 종양이고, 원래의 종양 부위와 상이한 부위의 종양은 이차 또는 전이성 종양이다.
"치료"는, 대상체에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 대상체에서 질환을 억제(arrest)하거나 늦추는 것; 대상체에서 새로운 질환의 발생을 억제(inhibit)하거나 늦추는 것; 현재 질환이 있거나 이전에 질환이 있었던 대상체에서 증상 및/또는 재발의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것; 및/또는 대상체의 수명을 연장, 즉, 증가시키는 것을 포함하여, 질환을 예방하거나 제거하기 위하여, 본원에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 특히, 용어 "질환의 치료"는 질환 또는 이의 증상의 치유, 지속기간 단축, 개선, 예방, 진행 또는 악화를 늦추거나 억제, 또는 발병을 예방하거나 지연시키는 것을 포함한다.
"위험에 처한"이란, 질환, 특히 암의 발생 가능성이 일반적인 모집단과 비교하여 정상보다 높은 것으로 식별된 대상체, 즉 환자를 의미한다. 또한, 질환, 특히 암을 앓은 적이 있거나 현재 앓고 있는 대상체는 질환 발생 위험이 증가된 대상체이며, 이는 이러한 대상체가 질환을 계속 발생시킬 수 있기 때문이다. 현재 암을 앓고 있거나 앓은 적이 있는 대상체는 또한 암 전이의 위험이 증가한다.
본원에 기술된 치료적 활성제, 백신 및 조성물은 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하여, 임의의 종래의 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에 기술된 제제는 유효량으로 투여된다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 또는 추가 치료제와 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 그리고 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에 있어서 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태 발병의 지연 또는 발병의 예방일 수 있다.
본원에 기술된 제제의 유효량은 치료될 병태, 질환의 중증도, 연령, 생리학적 조건, 크기 및 체중을 포함하는 환자의 개별 파라미터, 치료 지속 기간, 수반되는 요법의 유형(존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 유사한 인자에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기술된 제제의 투여량은 다양한 이러한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분한 경우, 더 높은 투여량(또는 상이한, 더 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이고, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 생성하기 위한 치료적 활성 물질의 유효량을 함유한다.
본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물은 일반적으로 약제학적으로 양립 가능한 양 및 약제학적으로 양립 가능한 제제로 투여된다. 용어 "약제학적으로 양립 가능한"은 약제학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. 이러한 종류의 제제는 일반적으로 염, 완충 물질, 보존제, 캐리어, 보조제와 같은 면역 강화 물질, 예를 들어 CpG 올리고뉴클레오티드, 사이토카인, 케모카인, 사포닌, GM-CSF 및/또는 RNA, 그리고 적절한 경우 다른 치료적 활성 화합물을 보충하는 면역 강화 물질을 함유할 수 있다. 의약에 사용될 때, 염은 약제학적으로 양립 가능해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 관심 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 상동성이거나 동일할 필요는 없지만, 실질적인 동일성을 나타낼 수 있다. 내인성 서열에 대해 "실질적 동일성" 또는 "실질적 상동성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 가닥과 혼성화될 수 있다. "혼성화"란 다양한 엄격한 조건 하에서, 상보성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기술된 유전자) 또는 이의 부분 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위한 쌍을 의미한다. (예를 들어, Wahl, G. M. 및 S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R.(1987) Methods Enzymol. 152:507 참조). 예를 들어, 엄격한 염 농도는 일반적으로 약 750mM NaCl 및 75mM 구연산삼나트륨 미만, 예를 들어 약 500mM NaCl 및 50mM 구연산삼나트륨 미만, 또는 약 250mM NaCl 및 25mM 구연산삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 예를 들어, 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30°C, 적어도 약 37°C, 또는 적어도 약 42°C의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 세제의 농도, 예를 들어 도데실 황산나트륨(SDS), 및 캐리어 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가 파라미터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이러한 다양한 조건을 조합함으로써 달성된다. 특정 구현예에서, 혼성화는 30°C에서, 750mM NaCl, 75mM 구연산삼나트륨, 및 1% SDS에서 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 혼성화는 37°C에서, 500mM NaCl, 50mM 구연산삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드, 및 100pg/ml 변성 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 혼성화는 42°C에서, 250mM NaCl, 25mM 구연산삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드, 및 200pg/ml ssDNA에서 발생할 것이다. 이들 조건에 대한 다양한 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 대부분의 응용 분야에서, 혼성화 이후의 세척 단계 또한 엄격성이 다양할 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 전술한 바와 같이, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 약 30mM NaCl 및 3mM 구연산삼나트륨 미만, 예를 들어 약 15mM NaCl 및 1.5mM 구연산삼나트륨 미만일 수 있다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 25°C, 적어도 약 42°C, 또는 적어도 약 68°C의 온도를 포함할 것이다. 특정 구현예에서, 세척 단계는 25°C에서, 30mM NaCl, 3mM 구연산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 세척 단계는 42°C에서, 15mM NaCl, 1.5mM 구연산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 세척 단계는 68°C에서, 15mM NaCl, 1.5mM 구연산삼나트륨, 및 0.1% SDS에서 발생할 것이다. 이들 조건에 대한 추가적인 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Benton 및 Davis(Science 196: 180, 1977); Grunstein 및 Rogness(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger 및 Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.]에 기술되어 있다.
"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동성"이란 기준 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기술된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 약 50% 상동성 또는 동일한 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 특정 구현예에서, 이러한 서열은 비교에 사용된 아미노산 또는 핵산의 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 상동성이거나 동일하다.
서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 위스콘신 매디슨 1710 유니버시티 애비뉴, 위스콘신대학교 생명공학센터, 53705 소재 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지(Sequence Analysis Software Package), BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭한다. 보존적 치환은 일반적으로 다음 기 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, e-3과 e-l00 사이의 확률 점수는 밀접하게 관련된 서열을 나타낸다.
"아날로그"는 기준 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 기능을 갖는 구조적으로 관련된 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다.
문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 당업계에서 정상 허용 오차의 범위 이내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로 이해되어야 한다. 약은 언급된 값의 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값은 약이라는 용어에 의해 수정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전이성 인자"는 역전사효소(클래스 I TE, 역트랜스포존)에 의해 생성된 RNA 카피를 통해, 또는 원래 위치(클래스 II TE, 또는 DNA 트랜스포존)로부터 스스로를 절제함으로써 게놈 내의 하나의 위치로부터 다른 위치로 이동할 수 있는 반복된 DNA 서열 DNA 서열이다. 따라서, 이는 클래스 I(LTR, LINE 및 SINE를 함유하는 것을 포함하는 역트랜스포존) 및 게놈의 내인성 부분(즉, 감염으로부터 유래되지 않음)인 클래스 II(DNA 트랜스포존) 둘 다를 포함한다. 이는 두 클래스의 자율 및 비-자율 요소 모두를 포함한다. 본 개시내용에 따르면, TE 서열은, 예를 들어, 내인성 레트로바이러스(ERV: Endogenous RetroVirus), 장산재 핵 요소(LINE: long interspersed nuclear element) 및 단산재 핵 요소(SINE: short interspersed nuclear element), 및 포유류 장 말단 반복 트랜스포존(MaLR: mammalian long terminal repeat transposon)을 포함하는 역트랜스포존과 같은 클래스 I의 TE, 및 게놈의 내인성 부분인 DNA 트랜스포존과 같은 클래스 II의 TE로부터 선택될 수 있다.
역트랜스포존은 훨씬 더 풍부하며, 이들의 특성은 HIV와 같은 레트로바이러스와 유사하다. 역트랜스포존은 RNA 중간체 복제 메커니즘의 역전사를 통해 기능한다. 이들은 일반적으로 세 가지 주요 종류로 그룹화된다: 레토르바이러스와 유사하게 역전사효소를 암호화하는, 역방향 본체의 측면에 위치하는 장 말단 반복(LTR)을 갖는 역트랜스포존; 역전사효소를 암호화하지만 LTR이 결여되어 있고, RNA 중합효소 II에 의해 전사되는, 장산재 핵 요소(LINE, LINE-1, 또는 L1)를 갖는 역포존; 및 역전사효소를 암호화지 않고 RNA 중합효소 III에 의해 전사되는 단산재 핵 요소(SINE)를 갖는 역트랜스포존. DNA 트랜스포존은 RNA 중간체를 포함하지 않는 전위 메커니즘을 갖는다. 전위는 여러 가지 전위효소 효소에 의해 촉매된다. LTR은 내인성 레트로바이러스(ERV)를 포함하는 반면, 비-LTR TE는 LINE 통합 기계에 의해 동원된 비-자율 트랜스포존인 장산재(LINE) 및 단산재 요소(SINE)로 세분화된다. 이들 계통은 계통발생학적으로 관련된 패밀리로 구성되며, 각각 하나의 전구체 카피로부터 기원하는 다수의 서브패밀리로 추가적으로 분기된다. 시간이 지남에 따라, 돌연변이의 축적으로 인해 각 서브패밀리의 구성원 내 공통 서열에 차이가 발생하였다. TE 역트랜스포존에 대한 검토는 문헌[Richardson, Sandra R 등, "The Influence of LINE-1 and SINE Retrotransposons on Mammalian Genomes." Microbiology spectrum vol. 3,2(2015): MDNA3-0061-2014]을 참조한다.
통상적인 L1 요소는 대략 6,000개의 염기쌍(bp) 길이이고, 미번역 영역(UTR) 및 표적 부위 복제가 측면에 위치하는 두 개의 비중첩 개방 해독 프레임(ORF)으로 구성된다. LINE-1 역트랜스포존은 포유류 게놈에서 1억 6천만년 이상 증폭되어 왔다. 인간의 경우, 대부분의 LINE-1 서열은 약 6500만~7500만년 전의 조상 마우스 및 인간 혈통의 분기 이후 증폭되어 왔다. 개별 게놈 LINE-1 서열과 현대의 활성 LINE-1s로부터 유래된 공통 서열 간의 서열 비교는 게놈 LINE-1s의 연령을 추정하는 데 사용될 수 있다(Khan H, Smit A, Boissinot S; Genome Res. 2006 Jan; 16(1):78~87). L1 서브패밀리는 일반적으로 오래된(L1M, AluJ), 중간(L1P, L1PB, AluS), 어린(L1HS, L1PA, AluY) 및 관련(HAL, FAM) 서브패밀리로 분류된다. 인간에서, 유일한 자율 활성 계열은 장산재 핵 요소-1(LINE-1 또는 L1)이지만, 몇 개의 L1 카피는 여전히 역전달 능력이 있으며, 이들 모두는 가장 어린 인간 특이적 L1HS 서브패밀리에 속한다.
SVA 요소는 약 2,500만년 전 영장류 계통에서 발생한, 진화적으로 젊은 비자율적 역트랜스포존 패밀리를 포함한다(Hancks DC, Kazazian HH Jr, Semin Cancer Biol. 2010 Aug; 20(4):234~45). 통상적인 SVA 요소는 대략 2,000개의 bp이고, 다음으로 이루어진 복합체 구조를 갖는다: 1) 육량체 CCCTCT 반복체; 2) 역위 Alu-유사 요소 반복체; 3) GC-풍부 가변 뉴클레오티드 탠덤 반복체(VNTR) 세트; 4) HERVK-10과 상동성을 공유하는 SINE-R 서열, 비활성 LTR 역트랜스포존; 및 5) 폴리(A) 관이 이어지는 정규 절단 폴리아데닐화 특이성 인자(CPSF) 결합 부위. 가장 어린 SVA 서브패밀리는 SVA-D, SVA-E, SVA-F, 및 SVA-F1 서브패밀리를 포함한다.
"전령 RNA(mRNA)"는 유전자의 유전자 서열에 상응하고 단백질을 생성하는 과정에서 리보솜에 의해 판독되는 단일-가닥 RNA 분자이다. mRNA는 전사 과정 동안 생성되며, 효소 RNA 중합효소는 유전자를 일차 전사 mRNA(전(pre)-mRNA로도 알려짐)로 변환한다. 이러한 전-mRNA는 일반적으로 최종 아미노산 서열을 코딩하지 않는 영역인 인트론을 여전히 함유한다. 이들은 RNA 스플라이싱 과정에서 제거되어, 단백질을 암호화할 영역인 엑손만을 남긴다. 이러한 엑손 서열은 성숙한 mRNA를 구성한다. 그런 다음, 성숙한 mRNA를 리보솜에 의해 판독하고, 전달 RNA(tRNA)에 의해 운반되는 아미노산을 사용하여, 리보솜은 번역이라고 불리는 과정을 통해 펩티드 서열을 생성한다.
본원에서 의도되는 바와 같은 "전사체(transcript)"는, 특히 특정 조직 또는 심지어 특정 조직에서 유기체에 의해 발현되는 전령 RNA(또는 mRNA) 또는 mRNA의 일부이다. 전사체의 발현은 많은 인자에 따라 달라진다. 전사체의 발현은 정상적인 건강한 세포와 비교하여 암세포에서 변형될 수 있다.
본원에서 의도되는 바와 같은 "전사체(transcriptome)"는 세포의 유전자에 의해 발현되거나 전사되는 분자인, 전령 RNA, 또는 mRNA의 전체 세트이다. 일부 구현예에서, 용어 "전사체(transcriptome)"는 특정 세포(또는 조직 유형)에서 생산된 mRNA 전사체(transcript)의 어레이를 설명하는 데에도 사용될 수 있다. 안정성을 특징으로 하는 게놈과 대조적으로, 전사체는 능동적으로 변한다. 실제로, 유기체의 전사체는 발달 단계, 환경 및 생리학적 조건을 포함하는 많은 인자에 따라 달라진다. 통상적으로, 전사체는 또한 상응하는 정상적인 건강한 세포와 비교하여 암세포에서 변형된다. 통상적으로, 본원에서 의도하는 전사체는 인간 전사체이다. 용어 "전사체 패턴" 및 "전사체"는 본원에서 동의어로서 사용된다.
해독 프레임은 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 내의 뉴클레오티드 서열을 연속하는 중첩되지 않는 트리플릿(triplet) 세트로 나누는 방법이다.
개방 해독 프레임(ORF)은 펩티드로 번역될 수 있는 해독 프레임의 일부이다. ORF는 전사 시작 부위(TSS)에 시작 코돈(예를 들어, AUG) 및 정지 코돈(예를 들어, UAA, UAG 또는 UGA)을 함유하는 코돈의 연속 신장이다. ORF 내의 ATG 코돈(반드시 첫 번째는 아님)은 번역이 시작되는 곳을 나타낼 수 있다. 전사 종결 부위는 번역 정지 코돈을 지나 ORF 뒤에 위치한다. 다수의 엑손을 갖는 진핵 유전자에서, ORF는 인트론/엑손 영역에 걸쳐 있으며, 이는 ORF의 전사 후에 함께 스플라이싱되어 단백질 번역을 위한 최종 mRNA를 수득할 수 있다.
본원에서 의도되는 "정규 ORF"는 예를 들어 Ensembl 게놈/전사체/단백질 데이터베이스 수집(통상적으로 HG19)과 같은 데이터베이스에서 기술되거나 주석이 달리는 mRNA 서열 내에 특정 해독 프레임을 갖는 단백질 코딩 서열이다. 일반적으로, 정규 ORF는 정상적인 건강한 세포의 엑손 중 하나와 동일하다.
본원에서 의도되는 "비정규 ORF"는 예를 들어 Ensembl 게놈/전사체/단백질 데이터베이스와 같은 게놈 데이터베이스에서 기술되지 않은(즉, 주석을 달지 않은) mRNA 서열 내에 특정 해독 프레임을 갖는 단백질 코딩 서열이다. 일반적으로, 비정규 ORF는 따라서 해독 프레임이 정상적인 건강한 세포에서 엑손의 일반적인 해독 프레임과 비교하여 이동됨을 의미한다. 그러나, 일부 구현예에서, 비정규는 게놈 데이터베이스(예컨대, Ensembl 데이터베이스)에서 기술될 수 있지만, mRNA 서열은 정상 세포에서의 작은 종을 나타낸다. 작은 종에 의해, 이는 일반적으로 정상 세포에서 5% 미만, 특히 2% 미만, 또는 우선적으로 1% 미만의 종으로 의도된다.
엑손은 인트론이 RNA 스플라이싱에 의해 제거된 후에 해당 유전자에 의해 생산된 최종 성숙한 RNA의 일부를 암호화할 유전자의 임의의 부분이다. 용어 엑손은 유전자 내의 DNA 서열 및 RNA 전사체의 상응하는 서열 둘 다를 지칭한다. RNA 스플라이싱에서, 성숙한 전령 RNA를 생성하는 것의 일부로서 인트론이 제거되고 엑손이 서로 공유 결합된다. 본 출원인에 따른 엑손 서열은 하나 이상의 엑손의 적어도 일부를 포함한다. 일반적으로, 엑손 서열은 하나 또는 2개 엑손의 적어도 일부를 포함한다.
스플라이싱 후 성숙한 RNA에 존재하는 3' 말단 및 5' 말단(3'UTR 및 5'UTR)에서의 미번역 서열은 엑손 서열이지만, 이들 서열이 번역을 위한 시작 코돈의 상류(5'UTR) 또는 번역을 종료하는 정지 코돈의 하류(3'UTR)에 위치하기 때문에 비암호화 서열이다.
본 출원에서, 용어 "융합 전사체", "키메라 전사체", "TE-엑손 전사체", 또는 "접합 엑손-TE"(JET)는 동의어로서 무관하게 사용된다. 본 개시내용에 따른, "융합 또는 키메라" "전사체 또는 서열"은 엑손 서열과 부분적으로 정렬되고 전이성 인자(TE) 서열과 부분적으로 정렬되는 전사체로서 정의된다. 융합 또는 키메라 전사체는 또한 본원에서 JET(엑손과 TE 사이의 접합부)로 곧 명명된다. 일반적으로, 본 설명에 따른 융합 전사체는 2.10-6를 초과하는 정규화된 판독 횟수를 갖는다. 정규화된 판독 횟수는 융합을 포함하는 판독 횟수를 샘플의 라이브러리 크기로 나눈 것으로 정의된다.
용어 "폴리펩티드"는 본 명세서에서, 일반적으로 α-아미노와 인접한 아미노산의 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 잔기인, 통상적으로 L-아미노산을 지정하기 위해 사용된다. 폴리펩티드 또는 펩티드는 이들의 중성(비하전) 형태 또는 염인 형태에서 다양한 길이일 수 있으며, 당질화, 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 변형이 본원에 기술된 바와 같이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건에 따라 이들 변형을 함유할 수 있다. 용어 "폴리펩티드"를 표현적으로 언급하는 것을 제외하고, 펩티드 및 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 JET 유래 신생항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, pJET는 키메라/융합 전사체 또는 JET로부터 유래된(즉, 이에 의해 암호화된) 펩티드 또는 폴리펩티드이다. pJET는 또한 본원에서 번역된 JET로 명명된다.
"기준 게놈", 또는 "대표 게놈"은 과학자들이 종의 유전자 세트의 대표적인 예로서 정립한 디지털 핵산 서열 데이터베이스이다. 이들은 종종 다수의 공여체들의 DNA 시퀀싱으로부터 정립되기 때문에, 기준 게놈은 임의의 단일 개체(동물 또는 사람)의 유전자 세트를 정확하게 나타내지 않는다. 대신에, 기준은 각 공여체로부터 상이한 DNA 서열의 일배체(haploid) 모자이크를 제공한다.
RNA-Seq(RNA 시퀀싱의 약어로 지칭됨)는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 생물학적 샘플에서 RNA(일반적으로 전령 RNA, mRNA)의 존재 및 양을 밝혀내고 엄청난 수의 원시 시퀀싱 해독(일반적으로 적어도 수천만 개)를 생성하는 시퀀싱 기술이다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq)은 개별 세포의 발현 프로파일을 제공한다. 해독은 생물학적 샘플 또는 단일 세포의 하나의 RNA 단편으로부터의 RNA 서열을 지칭한다. 시퀀싱된 RNA 샘플을 RNA 라이브러리라고 한다. 따라서, RNA 시퀀싱 데이터는 일반적으로 RNA 해독으로 불린다.
본 출원에서, "MHC 분자" 또는 "HLA 분자"는 적어도 하나의 MHC/HLA 클래스 I 분자 또는 적어도 하나의 MHC/HLA 클래스 II 분자를 지칭한다. MHC 클래스 I 단백질은 신체 대부분의 핵형성된 세포에 기능적 수용체를 형성한다. HLA에는 3개의 주요 MHC 클래스 I 유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 세 개의 보조 유전자인 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G가 존재한다. 32-마이크로글로불린은 주요 및 보조 유전자 서브유닛과 결합하여 이종이량체를 생산한다. 클래스 I의 MHC 분자는 중쇄 및 경쇄로 구성되며, 해당 펩티드가 적절한 결합 모티프를 갖고 이를 세포독성 T-림프구에 제시하는 경우, 약 8 내지 11개의 아미노산, 그러나 일반적으로는 8개 또는 9개의 아미노산의 펩티드에 결합할 수 있다. 펩티드의 결합은 펩티드의 주쇄에 있는 원자와 모든 MHC 클래스 I 분자의 펩티드-결합 홈에 있는 불변 부위 사이의 접촉에 의해 그의 2개의 말단에서 안정화된다. 펩티드의 아미노 및 카르복시 말단에 결합하는 홈의 양 말단에 불변 부위가 있다. 펩티드 길이의 변화는 펩티드 백본에서의 꼬임에 의해, 종종 요구되는 유연성을 허용하는 프롤린 또는 글리신 잔기에서 수용된다. 클래스 I의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 일반적으로 내인성 단백질 항원으로부터 유래한다. 예로서, 클래스 I의 MHC 분자의 중쇄는 일반적으로 인간에서 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 단량체이고, 경쇄는 β-2-마이크로글로불린이다. HLA에 의해 암호화된 3개의 주요 MHC 클래스 II 단백질 및 2개의 보조 MHC 클래스 II 단백질이 존재한다. 클래스 II의 유전자는 결합하여 항원 제시 세포의 표면에서 일반적으로 발현되는 이종이량체(αβ) 단백질 수용체를 형성한다. 클래스 II의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 일반적으로 세포외 또는 외인성 단백질 항원으로부터 유래한다. 예로서, α-사슬 및 β-사슬은 인간에서 특히 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 단량체이다. MHC 클래스 II 분자는 해당 펩티드가 적절한 결합 모티프를 갖는 경우 약 8 내지 20개 아미노산, 특히 10 내지 25개 아미노산 또는 13 내지 25 개 아미노산의 펩티드에 결합할 수 있고, 이를 T-헬퍼 세포에 제시할 수 있다. 펩티드는 (MHC 클래스 I 펩티드 결합 홈과 달리) 양 말단에서 개방되는 MHC II 펩티드 결합 홈을 따라 연장된 형태에 놓인다. 이는 주로, 펩티드 결합 홈을 따라 늘어선 보존된 잔기와의 주쇄 원자 접촉에 의해 제자리에 유지된다.
용어 "펩티돔"은 특정 게놈에 의해 발현되거나, 특정 유기체 또는 세포 유형(예컨대 암 세포) 내에 존재하는 펩티드의 완전한 세트를 지칭한다. 따라서, 단백질체 분석(단백질체학)은 특정 시점에서 게놈, 세포, 또는 조직에 의해 발현된 펩티드 또는 단백질의 전체 세트의 분리, 식별, 및 정량화를 지칭한다.
단백질체학 분석은 일반적으로 2개의 주요 기술, 즉, 둘 다 단백질의 복합 혼합물의 분석을 위한 강력한 방법인 이차원 겔 전기영동(2-DGE)(Harper S 등, In: Coligan JE, Dunn BM, Speicher DW, Wing-field PT, editors. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons; Hoboken, N.J.: 1998. pp. 10.4.1~10.4.36.) 및 질량 분광분석(MS)(Aebersold & Mann, 2003)에 기초한다. HPLC는 특히 저분자량 단백질 및 펩티드의 분리 및 식별에 있어서의 단백질체학 연구를 위한 대안적인 분리 기술이다(Garbis 등, 2005). MS는 기상 이온의 질량 대 전하 비율(m/z)에 기초하여 단백질 또는 펩티드의 분자량을 결정할 수 있게 한다. 용어 "겔계" 또는 "겔-무함유" 단백질체학은 적용된 분리 기술, 2-DGE 또는 HPLC와 관련하여 사용되며; 단백질체학 접근법은 또한 "상향식" 또는 "하향식"일 수 있으며, 이는 기본적으로 이들의 프로테아제(예를 들어, 트립신) 분해물로부터 단백질을 식별하거나 전체적으로 질량 분광계를 통해 각각 식별한다.
상향식 단백질체학은 생물학적 샘플(조직(들) 또는 세포)로부터 단백질을 식별하고, 질량 분광분석에 의한 분석 전에 단백질의 단백질분해 분해에 의해 이들의 아미노산 서열 및 번역 후 변형을 특성화하는 일반적인 방법이다. 미정제 단백질 추출물을 효소적으로 분해한 다음, 일반적으로 샷건 단백질체학으로 알려진 기술인 질량 분광분석에 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 펩티드를 하나 이상의 치수로 분리한다. 단백질분해 펩티드의 질량 또는 이의 탠덤 질량 스펙트럼을 펩티드 스펙트럼 라이브러리 내의 서열 데이터베이스 또는 주석이 달린 펩티드 스펙트럼으로부터 예측된 것과 비교함으로써, 펩티드를 식별할 수 있고, 다수의 펩티드 식별을 단백질 식별로 조합할 수 있다.
하향식 단백질체학에서, 온전한 단백질은 질량 분광계 내에서 또는 2D 전기영동에 의해 분해 및/또는 단편화 전에 정제된다. 하향식 단백질체학은 이온 포획 질량 분광계를 사용하여 질량 측정 및 탠덤 질량 분광분석(MS/MS) 분석을 위한 분리된 단백질 이온을 저장하거나 MS/MS와 함께 이차원 겔 전기영동과 같은 다른 단백질 정제 방법을 사용한다.
MS에 의해 생성된 데이터로부터, 단백질은 스펙트럼의 수동 질량 분석에 의해 새롭게 시퀀싱되거나 SEQUEST, Mascot, Phenyx, X!Tandem, 및 OMSSA와 같은 서열 검색 엔진을 통해 자동으로 처리된다. 이들 알고리즘은 실험적 MS/MS 데이터와 이론적 MS/MS 데이터 간의 상관관계에 기초하여 개발되며; 후자는 UniProt/Swiss-Prot(Deutsch, Lam, & Aebersold, 2008)와 같은 단백질 데이터베이스의 인 실리코(in silico) 분해로부터 생성된다.
일반적으로 "면역펩티도믹 패턴", "pMHC 레퍼토리", 또는 "MHC-리간돔" 또는 "HLA 리간돔"으로도 명명된 용어 "면역펩티돔"은 세포 표면에서 적어도 하나의 MHC/HLA 분자에 결합되는 특정 세포 유형 내의 완전한 펩티드 세트를 지칭한다. 이에 상응하여, "면역펩티도믹스"는 MHC/HLA-리간돔의 분석을 설명하는 용어로서 출현하였다. 가장 흔한 면역펩티도믹스 방법은 질량 분광분석(MS)에 의존한다. 면역펩티도믹스 샘플은 일반적으로, 예를 들어 용해된 세포 또는 조직으로부터 대립유전자-특이적 항체, 범-특이적 항체, 또는 조작된 친화도 태그 시스템을 사용하여 MHC를 분리함으로써 제조된다. 분리된 복합체는 산 용리되고, 펩티드는 분자량 컷오프 여과(MWCO), 고상 추출 또는 다른 기술을 사용하여 MHC 분자로부터 정제되고, 이어서 MS에 의해 분석된다(예를 들어, L.E. Stopfer 등, Immuno-Oncology and Technology, Volume 11, 2021,100042 리뷰 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라, 면역원 결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편도 의미한다. 이러한 단편은 또한 당업계에 잘 알려져 있고 시험관 내 및 생체 내 모두에서 정기적으로 사용된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 잘 알려진 활성 단편 F(ab')2, 및 Fab를 의미한다.
F(ab')2, 및 온전한 항체의 Fc 단편이 결여된 Fab 단편은 순환으로부터 더 신속하게 제거되고, 온전한 항체의 덜 비특이적인 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl 등, J. Nucl. Med. 24:316~325(1983)).
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체는 전체 천연 항체, 이중특이적 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단쇄 V 영역 단편(scFv), 융합 폴리펩티드, 및 비통상적인 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변(CH) 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변(CL) 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노 말단에서부터 카르복시 말단으로 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1 q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다(예를 들어, Rabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health(1987) 참조). 일반적으로, 항체는 가변 영역에 세 개의 중쇄 및 세 개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역을 포함한다. CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 특정 구현예에서, CDR 영역은 Rabat 시스템(Rabat, E. A., 등(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, ET.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91~3242)을 사용하여 묘사된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH: :VL 이종이량체를 형성하도록 공유 결합된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. VH 및 VL은 직접 연결되거나, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, VH의 C-말단을 VL의 N-말단과 연결하는 펩티드 암호화 링커(예를 들어, 10, 15, 20, 25개 아미노산)에 의해 연결된다. 링커는 일반적으로 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단쇄 Fv 폴리펩티드 항체는 Huston 등(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879~5883, 1988)에 의해 기술된 바와 같이 VH 및 VL 암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호; 및 미국 특허 공개 제20050196754호 및 제20050196754호를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 결합 강도의 척도를 의미한다. 친화도는 항체 결합 부위와 항원 결정 인자 간의 입체화학적 적합성의 근접도, 이들 사이의 접촉 면적의 크기, 및/또는 하전된 소수성 기의 분포에 따라 달라질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 또한 가역적 복합체의 형성 후 항원-항체 결합의 강도를 지칭하는 "결합력"을 포함한다. 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 다양한 항원 결합 실험, 예를 들어, 기능적 검정(예: 유세포 계측 분석), BIACORE 검정과 같은 표면 플라스몬 공명 검정, 및 KINEXA 검정과 같은 동역학 배제 검정을 포함하지만 이에 한정되지 않는다
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 반응성 세포를 활성화시키거나 자극할 수 있는 세포내 신호 전달 도메인에 융합되는 세포외 항원 결합 도메인, 및 막관통 도메인을 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. scFv는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 융합함으로써 유래될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, scFv는 (예를 들어, Fab 라이브러리로부터 수득된 항체 대신에) Fab로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, scFv는 막관통 도메인에 융합된 다음 세포내 신호 전달 도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, CAR은 항원에 대해 높은 결합 친화도 또는 결합력을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 특정 항원 결정 인자 또는 세포 상에 존재하는 항원 결정 인자 세트에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다.
본원에서 의도되는 용어 "면역 세포"는 통상적으로 T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, TIL/종양 유래 CD8 T 세포, 중앙 기억 CD8+ T 세포, Treg, MAIT, Υδ T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프구 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함한다.
"분리된 세포"는 세포를 자연적으로 동반하는 분자 및/또는 세포 성분으로부터 분리되는 세포를 의미한다.
용어 "분리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 자연 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 수반하는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 지칭한다. "분리"는 원래의 공급원 또는 주변으로부터 일정 정도의 분리를 나타낸다. "정제"는 분리보다 높은 정도의 분리를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 단백질의 생물학적 특성에 실질적으로 영향을 미치거나 다른 부정적인 결과를 야기하지 않도록 다른 물질이 충분히 부재한다. 즉, 핵산 또는 펩티드가 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 경우, 핵산 또는 펩티드가 정제된다. 순도 및 균질성은 일반적으로 분석 화학 기술, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드(band)를 생성함을 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들어 인산화 또는 당질화를 거칠 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 상이한 분리된 단백질을 생성할 수 있으며, 이는 별도로 정제될 수 있다.
종양 신생항원성 펩티드를 선택하는 방법
본 개시내용에 따른 종양 신생항원성 펩티드를 선택하는 방법은:
- 대상체의 암 세포 샘플로부터의 mRNA 서열 중에서, 전이성 인자(TE) 서열 및 엑손 서열을 포함하고 개방 해독 프레임(ORF)을 포함하는 융합 전사체(또는 JET) 서열을 식별하는 단계, 및
- 융합 전사 서열의 상기 ORF의 일부에 의해 암호화된, 적어도 8개의 아미노산의 종양 신생항원성 펩티드를 선택하는 단계를 포함하되,
상기 ORF는 TE와 엑손 서열 사이의 접합부와 중첩되고, 순수 TE이고/이거나 비정규성이고,
상기 종양 신생항원성 펩티드는 상기 대상체의 적어도 하나의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합한다.
일반적으로, 엑손 서열의 비정규 ORF의 일부로부터 번역된 펩티드는 면역 시스템에 의해 비자기로서 인식된다.
일부 구현예에서, 엑손 서열은 종양유전자 및/또는 종양 억제 유전자로부터 유래하고/하거나 이들의 돌연변이된 변이체 중 하나로부터 유래한다.
개념적으로, 암은 연속적인 체세포 돌연변이 축적의 결과이다. 많은 연구는 종양유전자에서의 기능 획득 및 종양 억제 유전자에서의 기능 상실 둘 모두가 정상 세포로부터 암이 발생하는 데 필요하다는 것을 증명하였다. 이배체 유기체의 경우, 기능 획득 돌연변이는 종종 우성 또는 반우성인 반면, 기능 상실 돌연변이는 일반적으로 열성이다. 종양발생에 대한 이타 가설은 암의 발생이 종양 억제 유전자의 두 대립유전자 모두의 상실에 의해 개시된다는 것을 시사한다.
종양유전자(암 유전자라고도 함)는 세포 증식 또는 성장을 긍정적으로 촉진하는 작용을 하는 유전자이다. 정상적인 비돌연변이체 버전은 원종양유전자로서 알려져 있다. 돌연변이체 버전은 과도하거나 부적절하게 활성으로, 종양 성장을 초래한다. 암 유전자 마커 데이터베이스(CGMD)에서 종양유전자를 식별할 수 있다(Pradeepkiran, J., Sainath, S., Kramthi Kumar, K. 등, CGMD:. Sci Rep 5, 12035(2015) "An integrated database of cancer genes and markers"). 종양유전자(ONC)는 또한 암 유전자 데이터베이스의 네트워크(NCG 5.0)로부터 다운로드할 수 있다(An O, Dall'Olio GM, Mourikis TP, Ciccarelli FD, Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4; 44(D1):D992~9; "NCG 5.0: updates of a manually curated repository of cancer genes and associated properties from cancer mutational screenings"). 종양 유전자의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: L-MYC, LYL-1, LYT-10, LYT-10/Cα1, MAS, MDM-2, MLL, MOS, MTG8/AML1, MYB, MYH11/CBFB, NEU, N-MYC, OST, PAX-5, PBX1/E2A, PIM-1, PRAD-1, RAF, RAR/PML, RAS-H, RAS-K, RAS-N, REL/NRG, RET, RHOM1, RHOM2, ROS, SKI, SIS, SET/CAN, SRC, TAL1, TAL2, TAN-1, TIAM1, TSC2, 및 TRK.
종양 억제 유전자(항-종양유전자로도 명명됨)는 일반적으로 세포 증식 및 종양 발생을 억제하는 역할을 하는 세포 성장 제어의 반대 측면을 나타낸다. 따라서 , 종양 억제 유전자는 일반적으로 세포 분열 또는 성장을 억제하는 유전자이다. TSG 기능의 상실은 제어되지 않은 세포 분열 및 종양 성장을 촉진한다. Rb는, 전사 불능 조절 단백질(atranscriptional regulatory protein)을 암호화하는 망막아세포종의 유전자 분석에 의해 식별된 종양 억제 유전자로서, 많은 상이한 인간 암의 발생에 기여하는 추가적인 종양 억제 유전자를 식별하기 위한 프로토타입으로서 기능하였다. 특히 종양 억제 유전자는 "Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. Tumor Suppressor Genes"에 기술되어 있다. 종양 억제 유전자(TSG)는 또한 종양 억제 유전자 데이터베이스(TSGene 2.0)로부터 다운로드 받을 수 있다(참고를 위해, Zhao M, Kim P, Mitra R, Zhao J, Zhao Z; Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4; 44(D1):D1023~31; "TSGene 2.0: an updated literature-based knowledgebase for tumor suppressor genes"를 참조). 이러한 맥락에서, 종양 억제 유전자의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: APC, BRCA1, BRCA2, DPC4, INK4, MADR2, NF1, NF2, p53, PTC, PTEN, Rb, RB1, VHL, WT1, BUB1, BUBR1, TGF-βRII, Axin, DPC4, p300, PPARγ, p16, DPC4, PTEN, 및 hSNF5.
종양유전자, 종양 억제 유전자 또는 "이중 제제" 유전자(종양원성 및 종양 억제 기능 둘 다 포함)는 데이터베이스 검색 및 텍스트 마이닝을 통해 체계적으로 식별될 수 있다. 실제로, 종양유전자 또는 종양 억제 유전자에 대한 정보를 일반적으로 Ensembl 데이터베이스에서 확인할 수 있다(그러나 또한, Shen L, Shi Q, Wang W. Double agents: genes with both oncogenic and tumor-suppressor functions. Oncogenesis. 2018;7(3):25(2018년 3월 13일에 출판) 참조). 이중 제제 유전자는 전술한 2개의 데이터베이스 사이에 중첩된 유전자로서 식별될 수 있다(또한 상기 Shen 등, Oncogenesis 2018 참조).
임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 아래의 이유로 엑손 서열이 종양유전자 및/또는 종양 억제 유전자로부터 유래하는 융합의 선택이 높은 관련성을 갖는다고 믿는다:
종양유전자에 TE를 삽입하면 종양원성 활성을 변경할 수 있다. 따라서, 종양유전자 활성 도메인에 TE 서열을 삽입하면 유발(driver) 돌연변이와 유사하게 종양유전자의 구성적 활성을 초래할 수 있다. 따라서, 키메라 종양유전자를 제공하는 이들 융합은 종양원성 단백질의 새로운 군(family)을 나타낼 수 있다. 이러한 경우, 소분자 길항제를 이용한 이러한 새로운 "융합 종양유전자"의 활성을 표적으로 하는 것은 이들 키메라 종양유전자가 발현되는 암에 대한 잠재적 치료 접근법을 나타낼 수 있다.
종양 억제자에 TE를 삽입하면 이들의 억제 기능을 불활성화시켜, 일반적으로 (예를 들어, 정지 코돈의 도입, ORF의 변화 또는 파괴적 아미노산 신장을 통한) 기능 상실을 초래하여 종양원성 과정에 기여할 수 있다.　　
암 유발 유전자와 관련된 융합은 입양 세포 요법, 항체, ADC, T 세포 결합자 등에 대한 우수한 표적이 될 것이다. 이들이 종양발생에 관여하는 경우, 융합 종양유전자는 암세포에 대해 더 특이적일 것으로 예상되므로, (표적의 종양원성 활성으로 인해) 내성의 발생을 감소시킬 것으로 예상된다.
일부 구현예에서, TE 서열은 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치하고(TE 서열이 공여체 서열인 것으로도 지칭됨), 엑손 서열은 접합부에 대해 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치한다(엑손 서열은 따라서 수용체 서열로 지칭됨). "융합 전사 서열의 5' 말단에 위치한다"는 표현은 요소가 융합 전사 서열에서 접합부의 상류에 위치한다는 것을 의미한다. "융합 전사 서열의 3' 말단에 위치한다"는 표현은 요소가 융합 전사 서열에서 접합부의 하류에 위치한다는 것을 의미한다.
보다 특정한 구현예에서, TE 서열은 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치하고, 엑손 서열은 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 상기 융합 전사 서열의 ORF의 일부는 접합부와 중첩된다. 이 경우, ORF는 정규 또는 비정규일 수 있다. ORF는 접합부를 포함할 수 있지만, 신생항원성 펩티드 서열은 접합부로부터 유래되지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 신생항원성 펩티드 서열이 접합부로부터 유래된 서열을 포함하는 일부 구현예에서, 수득된 펩티드는 TE 서열 및 엑손 서열 둘 모두에 의해 암호화된다.
"ORF의 일부는 TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부와 중첩하거나 중첩된다"라는 표현은, 상기 접합부가 상기 신생항원성 펩티드를 암호화하는 융합 전사 서열의 ORF의 일부에 함유됨을 의미한다.
(i) 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부가 TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부와 중첩하고, (ii) TE 서열 및 엑손 서열이 각각 융합 전사 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 있는 구현예에서, ORF의 상기 일부는 일반적으로, TE 서열로부터 적어도 1 내지 6개의 아미노산, 특히 2 내지 6개 및 엑손 서열로부터 적어도 1 내지 6개, 특히 2 내지 6개의 아미노산을 포함하여 적어도 8개의 아미노산의 신생항원성 펩티드를 암호화한다.
TE 서열이 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치하고 엑손 서열이 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하는 또 다른 구현예에서, 상기 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부는 접합부의 하류에 있고, 따라서 ORF는 비정규형이다.
"ORF의 일부는 접합부의 하류에 있다"라는 표현은, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부가 접합부와 중첩되지 않지만, 접합부에 대해 상기 융합 전사 서열의 3' 말단 부분에 함유된다는 것을 의미한다. 본 구현예에서, 접합부에 대한 3' 말단 부분이 엑손 서열이기 때문에, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부는 따라서 엑손 서열에 포함된다. 따라서, ORF의 일부가 엑손 서열에만 위치하므로, 따라서 수득된 펩티드는 비정규 ORF에서 엑손 서열에 의해 암호화된다. 따라서, 엑손 서열이 접합부에 대해 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부가 비정규 해독 프레임과의 접합부의 하류에 있는 특정 구현예에서, 융합 전사 서열의 ORF의 일부는 TE 서열로부터 0개의 아미노산, 및 엑손 서열로부터 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 신생항원성 펩티드를 암호화한다.
또 다른 구현예에서, TE 서열은 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고 엑손 서열은 접합부에 대해 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치한다.
일부 구현예에서, TE 서열은 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고 엑손 서열은 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치하고, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 상기 융합 전사 서열의 ORF의 일부는 TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부와 중첩된다. 이 경우, ORF는 또한 정규 또는 비정규일 수 있다. 수득된 펩티드는 TE 서열 및 엑손 서열 둘 모두에 의해 암호화된다.
신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부가 엑손 서열과 TE 서열 사이의 접합부와 중첩되고, 엑손 서열 및 TE 서열은 각각 융합 전사 서열의 5' 말단 및 3' 말단에 있는 특정 구현예에서, ORF의 상기 일부는 TE 서열로부터 적어도 1 내지 6개, 특히 2 내지 6개의 아미노산 및 엑손 서열로부터 적어도 1 내지 6개, 특히 2 내지 6개의 아미노산을 포함하는 적어도 8개의 아미노산의 신생항원성 펩티드를 암호화한다.
또 다른 구현예에서, TE 서열은 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고 엑손 서열은 융합 전사 서열의 5' 말단에 위치하고, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부는 엑손 서열과 TE 서열 사이의 접합부의 하류에 있다. 선택적으로, 따라서 순수 TE 서열에 의해 암호화되는 펩티드 서열은 비정규형이다.
본 구현예에서, 접합부에 대한 3' 말단 부분이 TE 서열이기 때문에, 따라서 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부는 TE 서열에 의해 암호화된다. 따라서, ORF의 일부는 엑손 서열로부터의 아미노산이 없고 TE 서열로부터 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 신생항원성 펩티드를 암호화한다. TE 서열이 접합부에 대해 융합 전사 서열의 3' 말단에 위치하고, 신생항원성 펩티드를 암호화하는 ORF의 일부가 접합부의 하류에 있는 특정 구현예에서, 융합 전사 서열의 ORF의 일부는 엑손 서열로부터 0개의 아미노산, 및 TE 서열로부터 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 신생항원성 펩티드를 암호화한다.
종양 신생항원성 펩티드는 체세포 변경(DNA 서열에서의 고전적인 돌연변이)으로부터 발생하는 펩티드이고, 자신과 상이한 것으로 인식되고, 수지상 세포(DC) 및 종양 세포 자체와 같은 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시된다. 교차 제시는, APC가 프로테아좀에 의한 주요 조직적합성 복합체 I(MHC I) 에피토프로의 단백질분해 절단을 위해 파고좀으로부터 시토졸로 외인성 항원을 전위시킬 수 있기 때문에 중요한 역할을 한다.
본 개시내용에서, 변경은 전이성 인자(TE) 서열 및 엑손 서열을 포함하는 융합 mRNA 서열의 전사에 상응한다. 이는 체세포(즉, 특이적으로 종양 클론에서) 전위로부터 발생할 수 있다. 이는 또한 새로운(de novo) 형질변환이 아니라 종양 특이적 전사 탈억제로부터 발생할 수 있어, TE 및 인근 유전자가 공동 전사된다.
본 개시내용에 따른 신생항원성 펩티드는 정상적인 건강한 샘플에는 전혀 없을 수 있고(즉, 정상적인 건강한 샘플에서 발현되지 않을 수 있음), 따라서 종양 샘플에 특이적일 수 있다. 대안적으로, 이는 정상(건강한) 샘플과 비교하여 정상 세포에서 낮은 수준으로 발현될 수 있고/있거나 종양 샘플에서 불균형하게 발현될 수 있다.
이는 또한 암이 진화한 세포 계통에 의해 선택적으로 발현될 수 있다.
본 개시내용에 따른 암 또는 종양 샘플은 이전에 정의된 바와 같은 조직 또는 기관 중 어느 하나의 임의의 고형 종양 또는 비-고형 종양, 예를 들어 유방암, 폐암 및/또는 흑색종으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 샘플은 급성골수성백혈병, 부신피질암종, 방광요로상피암종, 유방관암종, 유방소엽암종, 자궁경부암종, 담관암종, 대장 선암종, 식도암종, 위선암종, 다형성 교모세포종, 두경부 편평 세포암종, 간세포암종, 신장 크로모포브 암종, 신장 투명 세포 암종, 신장 유두 세포 암종, 저등급 신경교종, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 중피종, 난소 장액 선암종, 췌장관 선암종, 신경절종 및 크롬친화세포종, 전립선 선암종, 육종, 피부 흑색종, 고환생식세포암, 흉선종, 갑상선 유두 암종, 자궁암육종, 자궁체 자궁내막암종 또는 포도막 흑색종 샘플로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 암 샘플은 폐암 샘플, 특히 LUAD 샘플로부터 유래한다.
통상적으로 본 개시내용에 따르면, 상기 융합 전사 서열을 식별하는 단계는 암 샘플로부터의 mRNA 서열을 기준 게놈에 맵핑한 다음, 정상 및 비정상적인(데이터베이스 정보에 기초하여 주석이 달리지 않은 또는 비정규) 접합부를 구별함으로써 수행된다.
본 개시내용에 따르면, 정상 접합부는 일반적으로 접합부에 상응하며, 여기서 공여체 및 수용체는 동일한 가닥 상에 있고 너무 멀리 떨어져 있지 않다(예를 들어, 상이한 염색체 상에 있지 않음).
본 개시내용에 따르면, 비정상적인 접합부는 일반적으로 상이한 염색체, 또는 시스(cis)(동일한 염색체)이지만 (순서 및 5'-3' 의미에 관계없이) 상이한 가닥 상의 공여체 서열과 수용체 서열 사이의 접합부에 대응한다.
본 개시내용에 따라 일반적으로 사용할 수 있는 mRNA 서열은 RNA 서열 데이터이다(본원의 결과에 예시된 바와 같음). RNA 서열 데이터는 일반적으로 cDNA로 단편화되고 역전사된 세포 또는 조직 샘플로부터 수득된 정제된 RNA로부터 수득된다. 그런 다음, 수득된 cDNA를 증폭시키고 (예를 들어, Illumina GA/HiSeq - http://www.illumina.com 참조 -, SOLiD 또는 Roche 454와 같은) 고처리량 플랫폼에서 시퀀싱한다(차세대 시퀀싱 - NGS). 이러한 공정은 cDNA 단편의 일 말단으로부터 취한 수백만 개의 짧은 해독을 생성한다. 이러한 공정에서의 일반적인 변형은 각각의 cDNA 단편의 양 말단으로부터 해독을 생성하는 것이며, 이는 "쌍-말단" 해독으로 알려져 있다.
일부 구현예에서, mRNA 서열은, 예를 들어: Spliced Transcripts Alignment to a Reference(즉, STAR - Dobin, Alexander 등, "STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner." Bioinformatics(Oxford, England) vol. 29,1(2013): 15~21), TopHat2(Kim, Daehwan 등, "TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions." Genome biology vol. 14,4 R36. 25 Apr. 2013, doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36) 또는 HISAT(Kim, Daehwan 등, "HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements." Nature methods vol. 12,4(2015): 357~60. doi:10.1038/nmeth.3317 참조)와 같은 적용된 소프트웨어를 사용하여, 상응하는 기준 게놈 또는 전사체(예컨대, 인간 기준 게놈 Hg19 ENSEMBL(RNA 서열, GRCh37))에 대해 맵핑될 수 있다. STAR는 순차적인 최대 맵핑 가능한 씨드 검색에 이어서 씨드 클러스터링 및 스티칭을 사용하여 RNA-서열 해독을 정렬하는 독립형 소프트웨어이다. 이는 정규 접합부, 비정규 스플라이싱, 및 융합/키메라 전사체를 검출할 수 있다. 통상적으로, 접합부의 검출은 UCSC 게놈 브라우저로부터 다운로드된 ENSEMBL 및 RepeatMasker 데이터베이스 각각의 정의에 기초한 결과에 상세히 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 정상 및 비정상적인 접합부는, 예를 들어 Ensembl 및 Repeatmasker 데이터베이스와 같은 전용 데이터베이스를 사용하여 인 실리코(in silico)에서 결정되고, TE와 엑손 서열 사이의 접합부를 갖는 융합 전사체는 인 실리코(in silico) 에서 추출된다.
보다 구체적으로, 일부 구현예에서, 관심 샘플(또는 세포)로부터의 RNAseq 해독은 일반적으로 STAR 2-패스 모드27을 사용하여 기준 게놈(예컨대, 통상적으로 hg19 게놈)에 정렬되어 주석이 없는 접합부를 식별한다. 이전에 표시된 바와 같이, JET는 엑손(가장 구체적으로는 코딩 DNA 서열 - CDS - 엑손)과 TE(또는 반복 요소, RE) 사이의 접합부로서 식별된다. 본 개시내용에 따라, TE(또는 RE)는 ENSEMBL(GRCh37) 및 RepeatMasker와 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 데이터베이스의 정의에 따라 식별(즉, 필터링)될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, mRNA 서열은 모든 유형의 암 세포 또는 종양 세포 샘플(들)로부터 유래될 수 있다. 종양은 고형 또는 비-고형 종양일 수 있다. 특히, mRNA 서열은 이전에 정의된 바와 같이 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 임의의 조직 또는 기관, 예를 들어 유방암, 폐암 및/또는 흑색종으로부터 유래한다. 특정 구현예에서, mRNA 서열은 LUAD 샘플로부터 유래한다.
종양 샘플은, 예를 들어 암 게놈 아틀라스(TCGA)로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 서열은, 예를 들어 암 세포주 백과사전(CCLE)의 종양 세포주와 같은 세포주로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 스플라이싱 해독 수는 고유한 맵핑 해독 수에 의해 정규화될 수 있다. 통상적으로, 2.10-7을 초과하는 발현 수준의 JET가 선택된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 융합 전사 서열은 암 샘플(통상적으로 다양한 환자로부터, 예를 들어 TCGA에서 주어진 암 유형에 대해 수집된 암 샘플로부터 수득됨) 및/또는 세포주의 1% 초과; 특히 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 또는 심지어 25%를 초과하여 공유된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 융합 전사 서열은 암을 앓고 있는 대상체의 1% 초과; 특히 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 또는 심지어 25%를 초과하는 암 샘플에서 공유된다. 따라서, 융합 전사 서열은 여러 암 사이에서 공유되는 암 유형에 특이적일 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 융합 전사 서열은 정상적인 건강한 세포와 비교하여 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, 융합 전사 서열은 암세포(하나 이상의 암 샘플 또는 하나 이상의 세포주로부터 수득됨)에서 발현되고 건강한 세포(하나 이상의 조직 샘플 또는 하나 이상의 세포주로부터 수득됨)에서는 발현되지 않으며, 특히 건강한 흉선 세포에서는 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, JET는 발현 수준이 2.10-7 미만, 특히 2.10-8 미만이고 일반적으로 검출 가능하지 않을 때, 세포에서 발현되지 않는 것으로 간주된다. 이러한 융합 전사체는 본 개시내용에 따라 종양 특이적 융합으로 지칭될 수 있다. 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 더 높은 수준(들)으로 발현되고, 일반적으로 위에서 정의된 바와 같이 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 불균형적으로 발현되는 융합 전사체는 본 개시내용에 따라 종양 관련 융합 전사체(TAF)로 지칭될 수 있다. 종양 관련 융합 전사체가 1% 초과, 특히 2% 초과, 5% 초과, 그리고 특히 10%를 초과하는 종양 샘플(바람직하게는 동일한 암 유형에 대해 동일하거나 상이한 종양 유형으로부터, 특히 TCGA 데이터베이스로부터 수득됨) 및 20% 미만의 정상 샘플에 존재하는 경우, 종양 관련 융합 전사체가 본 출원에 따라 선택될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 융합 전사 서열은 적어도 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20개의 세포주에서 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 선택적으로 인 실리코(in silico)로 또는 시험관 내 기술(특히 예시를 위한 예를 참조)을 사용하여 암을 앓고 있는 상기 대상체의 적어도 하나의 MHC 분자와 종양 신생항원성 펩티드의 결합 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 방법이 인간 샘플에 대해 수행되는 경우, 본 방법은 환자의 클래스 I 또는 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC, 인간 백혈구 항원(HLA) 대립유전자로도 알려짐)를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 실험실 마우스에 대한 MHC 대립유전자는 일반적으로 이 단계가 특정 맥락에서 필요하지 않을 수 있다고 알려져 있음을 주의해야 한다. 본 출원에서, "MHC 분자"는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 분자를 지칭한다.
MHC 대립유전자 데이터베이스는 MHC I 및 MHC II의 공지된 서열을 분석하고 각 도메인에 대한 대립유전자 변동성을 결정함으로써 수행된다. 이는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 적절한 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 인 실리코로 결정될 수 있다. OptiType, Polysolver, PHLAT, HLAreporter, HLAforest, HLAminer, 및 seq2HLA를 포함하여, 다양한 도구들이 게놈-와이드 시퀀싱 데이터(전장-엑솜, 전장-게놈, 및 RNA 시퀀싱 데이터)로부터 HLA 대립유전자 정보를 수득하기 위해 개발되어 왔다(Kiyotani K 등, Immunopharmacogenomics towards personalized cancer immunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542~549 참조). 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하도록 잘 설계된 seq2hla 툴(Boegel S, Lower M, Schafer M, 등, HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 2012;4:102 참조)은 파이썬 및 R로 작성된 인 실리코 방법으로, 입력값으로 패스트큐(fastq) 포맷의 표준 RNA-Seq 서열 해독을 취하고, 모든 HLA 대립유전자를 포함하는 보타이 지수를 사용하며(Langmead B, 등, Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009, 10: R25-10.1186/gb-2009-10-3-r25), 가장 가능성이 높은 HLA 클래스 I 및 클래스 II 유전자형(4자리 분해능), 각 호출에 대한 p-값 및 각 클래스의 발현을 출력한다.
일반적으로, TE와 엑손 서열 사이의 접합부를 갖는 서열은 인 실리코로 추출된다. 환자(또는 마우스)로부터의 각각의 MHC 대립유전자에 대해 각각의 서열에 의해 암호화된 모든 가능한 펩티드의 친화도는, 예를 들어 HLA 분자에 대한 펩티드 결합 친화도를 예측하기 위한 연산 방법을 사용하여 인 실리코로 결정될 수 있다. 실제로, 정확한 예측 접근법은 IC50이 예측된 인공 신경망에 기초한다. 예를 들어, 리간드가 보고되지 않은 대립유전자에 대한 펩티드 결합을 예측하기 위해 NetMHC로부터 변형된 NetMHCpan 소프트웨어는 본원에 개시된 바와 같은 방법을 구현하는 데 매우 적합하다(Lundegaard C 등, NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11; Nucleic Acids Res. 2008;36:W509-W512; Nielsen M 등, NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence. PLoS One. 2007;2:e796을 참조하지만 또한 Kiyotani K 등, Immunopharmacogenomics towards personalized cancerimmunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542~549 및 Yarchoan M 등, Nat rev. cancer 2017; 17(4):209~222를 참조). NetMHCpan 소프트웨어는 인공 신경망(ANN)을 사용하여 알려진 서열의 임의의 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합을 예측한다. 본 방법은 180,000개를 초과하는 정량적 결합 데이터 및 MS 유래 MHC 용리 리간드의 조합에 대해 훈련된다. 결합 친화도 데이터는 인간(HLA-A, B, C, E), 마우스(H-2), 소(BoLA), 영장류(Patr, Mamu, Gogo) 및 돼지(SLA)로부터의 172개의 MHC 분자를 포함한다. MS 용리 리간드 데이터는 55개의 HLA 및 마우스 대립유전자를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 전술한 바와 같은 융합 전사체에 의해 암호화되고 MHC 대립유전자에 대해 10-4, 10-5, 10-6, 10-7M 미만 또는 500nM 미만의, 특히 50nM 미만의 Kd 친화도를 갖는 신생항원성 펩티드가 종양 신생항원성 펩티드로서 선택된다.
전술한 바와 같이, MHC 대립유전자에 대한 선택된 펩티드의 친화도는 netMHCpan과 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 인 실리코로 결정될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 신생항원성 펩티드는 NetMHCpan 4.0에 의해 예측된 2% 미만의 백분위 순위 점수의 결합 친화도로 MHC 클래스 I에 결합한다. 다른 구현예에서, 신생항원성 펩티드는 NetMHCpanII 3.2에 의해 예측된 10% 미만의 백분위 순위 점수의 결합 친화도로 MHC 클래스 II에 결합한다.
(대안적으로 또는 추가적으로) 친화도는 또한, 예를 들어 여기에 포함된 결과(실시예 2, 항목2.1 및 2.2.2 참조)에 기술된 바와 같은 MHC 사량체 형성 검정을 사용하여, 시험관 내에서 추정될 수 있다. 예를 들어, ImmunAware®의 상업적 검정은 통상적으로 당업자에 의해 사용될 수 있다(EasYmers® 키트는 ImmunAware®의 제품임, 특히 이들의 교육 가이드에 따라 사용됨). 일반적으로, 결합 친화도는 양성 대조군에 대한 결합 백분율로서 결정된다. 일반적으로, 양성 대조군의 적어도 30%, 특히 적어도 40% 또는 심지어 적어도 50%의 결합 백분율을 나타내는 펩티드가 선택된다. 일반적으로, 본 개시내용에 따른, 그리고 일반적으로 본 방법에 따라 수득될 수 있는, 신생항원성 펩티드는, 펩티드가 항원으로서 세포의 표면 상에 제시되기에 충분한 친화도로 적어도 하나의 HLA/MHC 분자에 결합한다. 일반적으로, 신생항원성 펩티드는 적어도 하나의 HLA/MHC 분자에 대해 10-4, 또는 10-5, 또는 10-6, 또는 10-7 이하 또는 500nM 이하, 적어도 250nM 이하, 적어도 200nM 이하, 적어도 150nM 이하, 적어도 100nM 이하, 적어도 50nM 이하의 IC50 친화도를 갖고(더 작은 수는 더 큰 결합 친화도를 나타냄), 일반적으로 상기 대상체의 분자는 암을 앓고 있다.
따라서, 본 방법에 따른 추가의 선택적인 단계는 독립적으로 다음을 포함할 수 있다:
- 건강한 세포에서 높은 수준 또는 높은 빈도로 발현된 융합 전사체 또는 예측된 펩티드를 배제하는 단계. 건강한 세포의 RNAseq 데이터에 대한 융합 전사 서열의 정렬은 일반적으로 건강한 세포에 존재하는 융합 전사 서열(들)의 상대량을 결정할 수 있게 하며; 일 구현예에서, 건강한 세포에서 발현된 융합 전사체 또는 예측된 펩티드는 폐기된다.
- 종양 신생항원성 펩티드가 대상체의 건강한 세포에서 발현되지 않음을 확인하는 단계. 이 단계는 일반적으로 기본 국소 정렬 검색 도구(BLAST)를 사용하여 수행될 수 있고 건강한 세포의 단백질체에 대한 신생항원성 펩티드의 서열의 정렬을 수행할 수 있으며; 바람직하게는, (예를 들어, BLAST를 사용하여) 정상적인 건강한 세포의 단백질체에 대해 정렬되는 펩티드는 폐기된다.
- 융합 전사체 또는 예측된 펩티드가 대상체의 암세포에서 발현됨을 확인하는 단계. 암세포에서 선택된 융합 전사 서열의 존재는 일반적으로 암세포 샘플로부터 추출된 mRNA에서 RT-PCR에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 또한 식별된 융합(JET) 전사체가 인 실리코로 번역되어 JET-유래 단백질 데이터베이스(JET-db)를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 통상적으로, 공여체로서 유전자를 함유하는 가닥-인덱스된(Strand-indexed) JET는 중단점 이후의 첫 번째 정지 코돈까지 연루된 유전자로부터 정규 ORF를 사용하여 번역될 수 있다. TE가 공여체인 JET에서, 3개의 가능한 ORF가 번역될 수 있고, 중단점에 더 근접하여 그리고 두 개의 정지 코돈 사이에서 발견되는 서열만이 일반적으로 유지된다. 그런 다음, (일반적으로 인간 단백질체에도 연결된) 이러한 JET db는 일반적으로 종양 샘플 및/또는 종양 세포주로부터 수득된 단백질체 데이터로 이루어지는 종양 샘플 및/또는 종양 세포주로부터 수득된 질량 분광분석 기반 단백질체 데이터세트에서 조사될 수 있다. 일부 구현예에서, 공개 질량 분광분석 데이터세트가 사용될 수 있다. 본 실시예는 본 출원에 제공된 결과에서 특히 잘 설명된다. 이러한 분석은 또한 JET-유래 펩티드 또는 단백질을 식별하기 위한 것이다.
보다 구체적인 구현예에서, (일반적으로 인간 단백질체에 연결된) JETdb는 본원에 포함된 실시예에서도 상세히 기술된 바와 같이 면역 펩티드체 질량 분광분석 기반 데이터세트에 대해 조사될 수 있다. 본 구현예는 MHC 분자에 제시되는 JET-유래 펩티드 또는 단백질(pJET)을 식별할 수 있게 한다.
JET-유래 펩티드가 정상 샘플에서 발견되는 JET로부터 유래된 정규 단백질 또는 펩티드와 일치하지 않도록 보장하기 위해, 식별된 펩티드는, 예를 들어 UniProt/TrEMBL 데이터베이스 및/또는 정상(예를 들어, 병타-종양 포함) 샘플(들) 또는 (예를 들어, TCGA 및/또는 CCLE와 같은 공개 데이터베이스의) 세포(들)로부터 인 실리코 번역된 JET로 여과될 수 있다.
신생항원성 펩티드
본 개시내용은 또한, 전이성 인자(TE) 서열 및 엑손 서열을 포함하는 인간 mRNA 서열인 융합 전사체로부터 개방 해독 프레임(ORF)의 일부에 의해 암호화된, 적어도 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산을 포함하는 분리된 종양 신생항원성 펩티드에 관한 것이다. 펩티드는 길이가 8~9개, 8~10개, 8~11개, 12~25개, 13~25개, 12~20개, 또는 13~20개 아미노산일 수 있다. ORF가 TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부와 중첩되지만, 종양 신생항원성 펩티드 자체는 접합부를 포함하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
보다 구체적으로 본 개시내용은 또한 암세포로부터의 인간 융합 mRNA 서열의 일부에 의해 암호화된 분리된 종양 신생항원성 펩티드를 포함하며, 상기 융합 mRNA는 TE 서열 및 엑손 서열을 포함한다.
펩티드는 길이가 8~9개, 8~10개, 8~11개, 12~25개, 13~25개, 12~20개, 또는 13~20개 아미노산일 수 있고, 전술한 신생항원성 펩티드 특성 중 하나 이상을 충족한다. 적어도 8개의 아미노산의 펩티드의 N-말단은 뉴클레오티드 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 및 그 이상 중 어느 하나에서 시작하는 트리플릿 코돈에 의해 암호화될 수 있다(본 개시내용은 1 내지 8000 사이의 모든 번호를 열거할 필요 없이 1 내지 8000 사이의 정수 중 어느 하나의 시작 위치를 고려한다는 것을 이해함).
상기 정의된 바와 같은 펩티드는 일반적으로 본 개시내용의 방법에 따라 수득될 수 있고, 따라서 전술한 바와 같은 특성 중 하나 이상을 포함한다. 특히, 본 개시내용에 따른 신생항원성 펩티드는 다음의 추가 특성 중 하나 또는 이의 조합을 나타낼 수 있다:
- 이는 대상체의 MHC 클래스 I에 결합하거나 특이적으로 결합하며, 8 내지 11개의 아미노산, 특히 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산이다. 일반적으로, 신생항원성 펩티드는 8 또는 9개 아미노산 길이이고, 대상체의 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자에 결합하거나; 대안적으로, 상기 대상체의 적어도 하나의 MHC 클래스 II 분자에 결합하고, 12 내지 25개 아미노산, 특히 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산 길이를 함유한다.
- 이는 펩티드가 항원으로서 세포의 표면에 제시되기에 충분한 친화도로 암을 앓고 있는 상기 대상체의 적어도 하나의 HLA/MHC 분자에 결합한다. 일반적으로 신생항원성 펩티드는 10-4, 또는 10-5, 또는 10-6, 또는 10-7 이하 또는 500nM 이하, 적어도 250nM 이하, 적어도 200nM 이하, 적어도 150nM 이하, 적어도 100nM 이하, 적어도 50nM 이하의 IC50을 갖는다(더 작은 수는 더 큰 결합 친화도를 나타냄).
- 이는 대상체에게 투여될 때 유의미한 자가면역 반응을 유도하지 않고/않거나 면역학적 내성을 유발하지 않는다.
- 이는 정상적인 건강한 샘플과 비교해 종양 샘플에서 더 높은 수준으로 발현된다. 일반적으로, 본 개시내용에 따르면, 융합 전사체가 1% 초과, 특히 2% 초과, 5% 초과 또는 10%를 초과하여 (동일하거나 상이한 종양 유형, 일반적으로 TCGA 종양 샘플의 하나 이상의 대상체로부터의)종양 샘플에 존재하고, 20% 미만으로 정상 샘플에 존재하는 경우, 융합 전사체가 선택될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전사체는 하나 이상(예를 들어 CCLE로부터와 같은, 적어도 2, 5, 10, 20, 50, 100개의 세포주)에서 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, 신생항원성은 보다 구체적으로 종양 특이적 항원(TSA)으로, 즉, 이는 암 샘플에서만 발현되고 정상 샘플에서는 발현되지 않거나, 정상 샘플에서는 비교적 낮은 수준으로 발현된다(예를 들어, 발현된 mRNA 서열은 정상 샘플의 정상 세포에서 작은 종을 나타냄).
- 이는 TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부를 포함하며, 즉, 이는 TE 서열의 일부 및 엑손 서열의 일부에 의해 암호화되며, ORF는 정규 또는 비정규이거나
- 이는 엑손 서열의 비정규 ORF에 의해 암호화되거나
- 이는 TE 서열에 의해, 선택적으로 비정규 ORF로 암호화된다
종양 신생항원성 펩티드는 먼저 대상체로부터의 종양 세포에서 융합 전사 서열의 RT 전사 분석에 의해 검증될 수 있다. 또한 일반적으로, 본 개시내용에 따른 종양 신생항원성 펩티드로 면역화하는 것은 T 세포 반응을 유도한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 서열번호 1~117 중 어느 하나의 적어도 8개의 아미노산을 포함하는 NSCLC 신생항원성 펩티드를 포함한다. 통상적으로, 서열번호 1~117의 상기 신생항원성 펩티드는 펩티드가 항원으로서 세포의 표면에 제시되기에 충분한 친화도로 HLA-A02에 결합한다. MHC 대립유전자에 대한 친화도는 당업계에 알려진 기술에 의해 그리고 특히 위에서 예시된 바와 같이 인 실리코 또는 시험관 내로 결정될 수 있다;
특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 종양 신생항원성 펩티드는 대상체의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 이상에 존재하는 MHC 분자에 결합한다. 특히, 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드는 암을 앓고 있는 대상체 집단의 대상체의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%에서 발현된다.
보다 구체적으로, 본 개시내용의 종양 신생항원성 펩티드는 암을 앓고 있는 대상체 집단에서 대상체의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%에 존재하는 종양에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
이전에 정의된 바와 같이, 암은 다음 조직 또는 기관 중 어느 하나에 영향을 미칠 수 있다: 유방; 간; 신장; 심장, 종격, 흉막; 입바닥; 입술; 침샘; 혀; 잇몸; 구강; 입천장; 편도선; 후두; 기관; 기관지, 폐; 인두, 하인두, 구인두, 비인두; 식도; 위, 간내 담관, 담도, 췌장, 소장, 결장과 같은 소화 기관; 직장; 방광, 담낭, 요관과 같은 비뇨기 기관; 직장 S상 결장 접합부; 항문, 항문관; 피부; 뼈; 관절, 사지의 관절 연골; 눈 및 부속기; 뇌; 말초 신경, 자율신경계; 척수, 뇌신경, 수막; 및 중추신경계의 다양한 부분; 결합성, 피하 및 다른 연조직; 후복막, 복막; 부신; 갑상선; 내분비샘 및 관련 구조; 난소, 자궁, 자궁경부; 자궁체, 질, 외음부와 같은 여성 생식기; 음경, 고환 및 전립선과 같은 남성 생식기; 조혈계 및 망상내피계; 혈액; 림프절; 흉선. 예를 들어, 본 출원에 따른 종양 또는 암은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이의 전이를 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장 세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암 유형 또는 종양의 전이가 있다. 본 개시내용에 따른 용어 암은 또한 암 전이 및 암의 재발을 포함한다.
통상적으로, 본 개시내용에 따른 신생항원성 펩티드는 대상체에게 투여될 때 유의미한 자가면역 반응을 유도하지 않고/않거나 면역학적 내성을 유발하지 않는다. 내성 메커니즘은 높은 친화도 자가 반응성 T 세포 수의 감소와 함께 숙주에서의 클론 결실, 무지, 무력 또는 억제를 포함한다.
신생항원성 펩티드는 또한 화합물의 아미노산 서열을 연장시키거나 감소시킴으로써, 예를 들어 아미노산의 첨가 또는 결실에 의해 변형될 수 있다. 펩티드는 또한 특정 잔기의 순서 또는 조성을 변경함으로써 변형될 수 있으며, 생물학적 활성에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예를 들어, 중요한 접촉 부위 또는 보존된 잔기에서의 아미노산 잔기는 일반적으로 생물학적 활성에 대한 부작용 없이 변경되지 않을 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 비-임계 아미노산은 L-α-아미노산과 같은 단백질, 또는 이들의 D-이성질체에서 자연적으로 발생하는 것들에 한정되지 않을 필요가 있지만, β-γ-δ-아미노산과 같은 비-천연 아미노산뿐만 아니라 L-α-아미노산의 많은 유도체를 포함할 수도 있다.
통상적으로, 단일 아미노산 치환을 갖는 일련의 펩티드가 정전기 전하, 소수성 등이 결합에 미치는 효과를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일련의 양으로 하전된(예를 들어, Lys 또는 Arg) 또는 음으로 하전된(예를 들어, Glu) 아미노산 치환은 펩티드의 길이를 따라 이루어져 다양한 MHC 분자 및 T 세포 수용체에 대한 상이한 민감도 패턴을 나타낸다. 또한, Ala, Gly, Pro, 또는 유사한 잔기와 같은 작고 비교적 중성인 모이어티를 사용하는 다수의 치환이 사용될 수 있다. 치환은 동종-올리고머 또는 헤테로-올리고머일 수 있다. 치환되거나 첨가되는 잔기의 수 및 유형은 필수 접촉 지점과 요구되는 특정 기능적 속성 사이에 필요한 간격(예를 들어, 소수성 대 친수성)에 따라 달라진다. MHC 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 증가된 결합 친화도는 부모 펩티드의 친화도와 비교하여 이러한 치환에 의해 달성될 수도 있다. 어떤 경우에도, 이러한 치환은, 예를 들어 결합을 방해할 수 있는 입체 및 전하 간섭을 회피하도록 선택된 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용해야 한다.
아미노산 치환은 일반적으로 단일 잔기로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합이 조합되어 최종 펩티드에 도달할 수 있다. 치환 변이체는 펩티드의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 이러한 치환은 일반적으로 펩티드의 특성을 미세하게 조절하는 것이 바람직한 경우 다음 표 1에 따라 이루어진다.
[표 1]
기능(예를 들어, MHC 분자 또는 T 세포 수용체에 대한 친화도)의 실질적인 변화는 상기 표의 것보다 덜 보존적인 치환을 선택하는 것, 즉 (a) 치환 영역에서 펩티드 백본의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선형 형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 데 미치는 효과에 있어서 보다 유의미하게 상이한 잔기를 선택하는 것에 의해 이루어진다. 일반적으로 펩티드 특성의 가장 큰 변화를 생산할 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어, 세릴이 소수성 잔기, 예를 들어, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐에 대해 (또는 이에 의해) 치환되고; (b) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 리슬(lysl), 아르기닐, 또는 히스티딜이 전기음성 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파르틸에 대해 (또는 이에 의해) 치환되고; 또는 (c) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들어, 글리신에 대해 (또는 이에 의해) 치환되는 것이 될 수 있다.
펩티드 및 폴리펩티드는 또한 신생항원성 펩티드 또는 폴리펩티드에 두 개 이상의 잔기의 이소체를 포함할 수 있다. 본원에서 정의되는 바와 같은 이소체는, 제1 서열의 입체 형태가 제2 서열에 특이적인 결합 부위에 피팅되기 때문에 제2 서열로 치환될 수 있는 두 개 이상의 잔기의 서열이다. 해당 용어는 구체적으로 당업자에게 잘 알려진 펩티드 백본 변형을 포함한다. 이러한 변형은 아미드 질소, α-탄소, 아미드 카르보닐의 변형, 아미드 결합의 완전한 대체, 연장, 결실 또는 골격 가교 결합을 포함한다. 일반적으로, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. VII(Weinstein ed., 1983)을 참조한다.
또한, 신생항원성 펩티드는 캐리어 단백질, 리간드, 또는 항체에 접합될 수 있다. 펩티드의 반감기는 페길화, 당질화, 폴리시알릴화, 헤실화, 재조합 PEG 모방체, Fc 융합, 알부민 융합, 나노입자 부착, 나노미립자 캡슐화, 콜레스테롤 융합, 철 융합, 또는 아실화에 의해 개선될 수 있다.
다양한 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산을 갖는 펩티드 및 폴리펩티드의 변형은 생체 내에서 펩티드 및 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 데 특히 유용하다. 안정성은 다수의 방식으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티다아제 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지가 안정성을 시험하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, Verhoef 등, Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291~302(1986)를 참조한다. 본 개시내용의 펩티드의 반감기는 25% 인간 혈청(v/v) 검정을 사용하여 편리하게 결정된다. 프로토콜은 일반적으로 다음과 같다. 풀링된 인간 혈청(AB형, 열 비활성화 되지 않음)을 사용 전 원심분리에 의해 탈지한다. 그런 다음, RPMI 조직 배양 배지로 혈청을 25%로 희석하고 펩티드 안정성을 시험하는 데 사용한다. 소정의 시간 간격으로, 소량의 반응 용액을 제거하고 6% 수성 트리클로르아세트산 또는 에탄올에 첨가한다. 혼탁한 반응 샘플을 15분 동안 냉각시킨 다음(4°C), 회전시켜 침전된 혈청 단백질을 펠릿화한다. 그런 다음, 안정성 특이적 크로마토그래피 조건을 사용하는 역상 HPLC에 의해 펩티드의 존재를 결정한다.
펩티드 및 폴리펩티드는 개선된 혈청 반감기 이외의 바람직한 속성을 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CTL 활성을 유도하는 펩티드의 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 서열에 대한 결합에 의해 향상될 수 있다. 특히 바람직한 면역원성 펩티드/T 헬퍼 접합체는 스페이서 분자에 의해 결합된다. 스페이서는 일반적으로 비교적 작은 중성 분자, 예컨대 생리학적 조건 하에서 실질적으로 하전되지 않은 아미노산 또는 아미노산 모방체로 구성된다. 스페이서는 일반적으로, 예를 들어 Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 다른 중성 스페이서로부터 선택된다. 선택적으로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 구성될 필요는 없으며, 따라서 헤테로- 또는 동종-올리고머일 수 있음을 이해할 것이다. 존재하는 경우, 스페이서는 일반적으로 적어도 하나 또는 두 개의 잔기, 보다 일반적으로는 세 개 내지 여섯 개의 잔기일 것이다. 대안적으로, 펩티드는 스페이서 없이 T 헬퍼 펩티드에 결합될 수 있다.
신생항원성 펩티드는 직접 또는 스페이서를 통해 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 T 헬퍼 펩티드에 결합될 수 있다. 신생항원성 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드 중 어느 하나의 아미노 말단은 아실화될 수 있다. 예시적인 T 헬퍼 펩티드는 파상풍 독소 830~843, 인플루엔자 307~319, 말라리아 포자소체 382~398 및 378~389를 포함한다.
본원에 기술된 다수의 신생항원성 펩티드는 또한 선택적으로 스페이서에 의해 함께 결합될 수 있다.
막관통 키메라 폴리펩티드(또는 단백질) 및 이의 항원 결합 도메인 결합
본 개시내용은 우수한 세포외 신생항원 후보물질을 제공하는 막관통 키메라 폴리펩티드 세트(본원에서 pJET 또는 융합 전사체-유래 펩티드로도 명명됨)를 제공한다. 상기 키메라 단백질은 위에서 정의된 바와 같이 게놈-와이드 비정규 스플라이싱 영역을 식별하기 위해 개발된 생물정보학 파이프라인으로부터 예측된 융합 전사체로부터 유래된다. TCGA(암 게놈 아틀라스) 및 CCLE(광범위한 연구소 암 세포주 백과사전)(실시예 섹션에 기술됨)에서 공개적으로 이용 가능한 RNA-Seq 데이터를 사용하였다.
본 발명에 따른 융합 전사체(본원에서 키메라 전사체 또는 JET로도 명명됨)의 식별 및 특징화는 본 출원의 상기 섹션(또한 실시예 참조)에 상세히 설명되어 있다.
전술한 바와 같이, 융합 전사체는 기능적 다양성을 생성하는 데 필수적인 것으로 알려진 대안적인 스플라이싱 메커니즘으로부터 기인한다. 실제로 스플라이싱 메커니즘은 기존의 엑손 및 인트론 서열의 재배열을 통해, 개별 유전자로부터 다수의 단백질을 암호화하는 다수의 mRNA(즉, 전사체 또는 스플라이싱 변이체)의 발현을 가능하게 한다. 본원에서 관찰된 스플라이싱 변경의 유형은 엑손 건너뛰기, 인트론 보유 및 대안적인 스플라이싱 공여체 또는 수용체 부위의 사용을 포함한다. 본 발명에 따른 융합 전사체에서, TE는 공여체(5' 위치에서) 또는 수용체(3' 수용체에서)로서 작용할 수 있고, 이에 따라 엑손은 수용체 또는 공여체일 수 있다. 따라서, TE-엑손 스플라이싱은 "비-코딩" 게놈의 부분을 코딩 게놈에 혼입시켜, 비-코딩 게놈 서열을 번역 기계에 노출시킨다. JET(접합부 엑손 TE, Junction Exon TE)로도 명명된 이들 융합(또는 키메라) 전사체는 ORF(개방 해독 프레임)를 포함하고, 즉, 이들은 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 능력을 갖는 해독 프레임의 일부이다. TE가 수용체인 경우, 융합 전사체의 ORF는 정규(즉, 정규 전사체와 동일)인 반면, TE가 공여체인 경우 ORF는 정규(일반적으로 ORF1)이거나 ORF1과 비교하여 1개 또는 2개의 뉴클레오티드(일반적으로 각각 ORF 2 및 3)만큼 이동될 수 있다. 융합 전사체는 융합된 TE 및 엑손 서열(JET에 상응함)을 포함할 뿐만 아니라, 엑손이 공여체인 경우 융합 중단점(엑손과 TE 사이)의 상류에 있거나 TE가 공여체인 경우 융합 중단점의 하류에 있는 엑손(들)을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 다양한 전사 이소형에 상응한다.
보다 구체적으로, 본 개시내용은 표 9~15 및 19~20에 언급된 서열번호 1 내지 21542의 막관통 키메라 폴리펩티드(또는 단백질)를 제공한다. 표 14 및 19는 엑손이 공여체인 융합 전사체(JET)로부터 번역된 아미노산 서열을 제공한다. 표 15 및 20은 엑손이 공여체인 융합 전사체(JET)로부터 번역된 아미노산 서열을 제공한다.
이러한 (막관통) 키메라 단백질 세트는, 막관통 단백질을 위한 전사체 코딩에 속하는 것으로서 정상 단백질체 데이터베이스(예컨대, 통상적으로 UniProt)에 주석이 달린 엑손 서열을 갖는 융합 전사체를 추가로 선택함으로써 수득되었다. 그런 다음, 선택된 융합 전사체의 서열을 융합(또는 키메라) 폴리펩티드 서열(번역된 접합부 또는 pJET 또는 번역된 JET로도 명명됨)로 (인 실리코로) 번역하였다.
엑손이 공여체인 융합 전사체는 전사체의 시작으로부터 엑손과 TE 사이의 중단점 이후의 첫 번째 정지 코돈까지 전사체의 정규 ORF에 따라 번역된다.
TE가 공여체인 융합 전사체는 TE의 시작으로부터 또는 TE와 엑손 사이의 중단점 이전의 마지막 정지 코돈 이후로부터 상기 중단점 이후의 첫 번째 정지 코돈까지 3개의 ORF(1 내지 3)를 따라 번역된다.
TE 서열로부터 유래된 적어도 3개의 아미노산을 함유하는 번역된 폴리펩티드 서열만이 유지되었다.
일부 구현예에서, UniProt에서 임의의 참조되거나 주석이 달린 단백질 서열과 일치하는 번역된 접합부로부터 유래된 펩티드 서열은 폐기되고, 따라서 주석이 달리지 않은 키메라 펩티드에 초점을 맞춘다(결과에서 예시됨).
표 9~13은 전술한 단백질유전체학 접근법으로부터 식별된 펩티드(일반적으로 이들의 크기를 고려한 폴리펩티드) 서열을 제공한다. 일반적으로, (다양한 공개 RNA 서열 데이터세트를 사용하여) 본 출원의 파이프라인으로 생성된 융합 전사체(즉, JET) 라이브러리를 총 단백질체학(모든 펩티드), 또는 표면 단백질체학(표면체)의 MS 원 데이터에서 검색하였다.
따라서, 본 개시내용은 특히 세포막에서 발현되는 키메라 폴리펩티드(또는 단백질)를 지칭한다. 막관통 구획에 인 실리코로 할당된 폴리펩티드의 세포막 발현(전술한 바와 같음)은 여러 시험관 내 접근법에 의해 상이한 분자 수준에서 실험적으로 검증될 수 있다:
a) 선택된 번역된 접합부를 함유하는 단백질 또는 펩티드는 숙주 세포, 예를 들어 종양 세포주(예컨대, Hela, CHO 등)에서 이소적으로 발현되어 형질막 내에서의 안정성 및 적절한 통합을 확인할 수 있다. 발현 벡터는 번역된 접합부 및 태그 서열(예컨대 FLAG 또는 HA)을 함유하여 태그된 융합 키메라 단백질을 생성하도록 설계될 수 있다. 융합-함유 단백질 또는 펩티드는 또한 에피토프-태그를 함유하므로, 상업적으로 이용 가능한 항-태그 항체를 사용하는 유세포 계측법 또는 현미경에 의해 검출될 수 있다. 벡터 내로 클로닝된 서열은 태그 서열이 TE 서열 직전 또는 직후에 위치하는 방식으로 우선적으로 설계될 수 있다. 이러한 접근법은 세포막에서 발현되고 일반적으로 TE 서열을 세포외 공간에 노출시키는 안정적인 단백질을 생성하는 번역된 접합부 펩티드 또는 단백질을 선택할 수 있게 한다.
b) 표적화된 시퀀싱 실험은 또한 추가적인 종양 시료 또는 세포주에서 융합 전사체를 증폭시키고 검출하기 위해 수행될 수 있다. 이는 종래의 PCR, 정량적 실시간 PCT 또는 SMRT 전장 전사체 시퀀싱(PACBIO 기술)을 통해 수행될 수 있다.
c) 번역된 서열은 또한 리보솜 프로파일링 또는 리보-Seq에 의해 "번역체(translatome)"(세포 내에서 mRNA를 번역하는 전체를 나타냄) 내에서 검출될 수 있다. 따라서, 리보솜 프로파일링 분석은 접합부 전사 번역 프로세스의 모니터링 및 키메라(번역된 접합부 펩티드 또는 단백질)의 풍부도를 예측하는 것을 가능하게 한다. 번역되는 JET-유래 전사체(mRNA)의 이러한 기술 영역을 통해 식별될 수 있으므로, 융합 폴리펩티드의 번역 시작 및 정지 부위를 정의할 수 있다. JET 서열의 유전체학 및 단백질체학 검증을 가교하는 이러한 접근법을 사용하여, 융합 전사체의 번역된 영역을 완전히 정의할 수 있다.
d) 단백질 발현의 추가 실험 검증은 종양 시료 및 세포주에서 표적화된 질량 분광분석 접근법을 통해 수행될 수 있다. 표적화된 단백질체학 실험을 수행하여 매우 높은 정밀도, 민감도, 특이성 및 처리량으로 (번역된 접합부를 함유하는) 몇 개의 키메라 단백질을 각각의 시점에 정량화할 수 있다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 개시내용은 본원에서 정의되는 바와 같은 키메라 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 TE 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열의 일부는 세포 표면에서 노출된다. TE-유래 서열의 세포 표면 노출은 상기 TE-유래 서열의 예측된 토폴로지(topology)에 기초하여 인 실리코로 예측될 수 있다.
단백질이 세포 표면에 존재하는 것을 예측하는 것은 일반적으로 (i) TM 도메인 또는 지질 앵커를 검출하는 것; (ii) 세포외 노출 도메인의 식별을 포함하여 막 내 단백질 배향을 정의하는 것; 및/또는 (iii) 세포하(subcellualr) 위치를 예측하는 것을 포함한다. TM 도메인, 신호 펩티드, 및 GPI-결합 단백질을 예측하기 위한 생물정보학적 도구가 이용 가능하다(Kδll L, Krogh A, Sonnhammer ELL(2004) A combined transmembrane topology and signal peptide prediction method. J Mol Biol 338:1027~1036; Jones DT(2007) Improving the accuracy of transmembrane protein topology prediction using evolutionary information. Bioinformatics 23:538~544; Reeb J, Kloppmann E, Bernhofer M, Rost B(2015) Evaluation of transmembrane helix predictions in 2014. Proteins 83:473~484; Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer ELL(2001) Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes. J Mol Biol 305:567~580; Viklund H, Elofsson A(2008) OCTOPUS: Improving topology prediction by two-track ANN-based preference scores and an extended topological grammar. Bioinformatics 24:1662~1668; Fankhauser N, Mδser P(2005) Identification of GPI anchor attachment signals by a Kohonen self-organizing map. Bioinformatics 21:1846~1852 참조).
주어진 번역된 접합부에 대한 TE-유래 서열의 세포 표면 발현의 실험 검증은 또한 전술한 바와 같이 수행될 수 있다(지점 a 참조).
또한 전술한 바와 같이, 세포 표면에서 발현되는 펩티드의 식별은 JET 라이브러리를 표면체(surfaceome)(세포외 공간에 노출된 적어도 1개, 특히 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 아미노산 잔기를 갖는 모든 형질막 단백질)의 MS 원시 데이터로 검색함으로써 단백질유전체학 접근법에 기초하여 달성될 수 있다. 이와 같이, 표면체는 모든 막 단백질의 전체인 막 단백질체의 하위집합인, 형질막 단백질체의 하위집합이다. [예를 들어, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커를 통해] 세포외 지질 리플릿에 부착되는 일체형 모노토프 막 단백질은 인간 표면체의 일부이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 보다 구체적으로 TE-유래 서열과 엑손-유래 서열 사이의 접합부의 하류에 있는 비정규 ORF로부터 기인하는 키메라 폴리펩티드에 관한 것이다. 세포외일 것으로 예측된 토폴로지를 갖는 비정규 ORF 번역 서열의 세포 표면 발현의 실험적 확인은 또한 비정규 ORF 서열 전후에 태그를 위치시킴으로써 전술한 바와 같이 수행될 수 있다(또한 지점 a 참조).
일부 구현예에서, 번역된 접합부는 융합 유형(TE 공여체 또는 수용체) 및 막 단백질의 아형에 기초하여 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다음과 같이 달성될 수 있다:
- 일체형 막 단백질
o I형 단일 통과 단백질(카르복실 말단이 시토졸을 향하도록 위치됨): 선택된 전사체는 TE가 공여체로서 작용하는 융합(융합 TE->엑손)으로부터 유래된 것이며, 일부 경우에, 이러한 융합은 TE가 수용체인 제2 융합(융합 엑손-TE)에 선행한다. 후자의 시나리오에서, 전사체는 이중 융합 "엑손-TE-엑손" 또는 "메타융합"에 의해 생성되며, 생성된 전사체는 두 개의 정규 엑손이 측면에 위치한 TE 엑손화 서열을 포함한다.
o II형 단일 통과 단백질(시토졸을 향해 아미노 말단을 가짐): 선택된 전사체는 TE가 수용체로서 작용하는 융합(융합 엑손->TE)로부터 유래된 것이며, 일부 경우에, 이러한 융합에 이어서 TE가 공여체인 제2 융합(융합 TE->엑손)가 이어진다. 후자의 시나리오에서, 전사체는 이중 융합 "엑손-TE-엑손" 또는 "메타융합"에 의해 생성되며, 생성된 전사체는 두 개의 정규 엑손이 측면에 위치한 TE 엑손화 서열을 포함한다.
o 다중 통과 또는 다중 막관통 단백질(폴리펩티드 사슬은 막을 여러 번 통과함): TE 서열은 공여체 또는 수용체로서 작용할 수 있고/있거나 메타융합의 일부일 수 있다. 중단점(또는 메타융합의 경우 두 개의 중단점 중 하나)은 두 개의 막관통 나선 사이 막의 세포외 측에 위치한다.
o 일체형 모노토프 단백질(막의 한쪽에만 부착되고 전체에 걸쳐 걸쳐 있지 않은 일체형 막 단백질): 선택된 전사체는 TE가 수용체(융합 엑손->TE), 공여체(융합 TE->엑손) 또는 둘 다(메타융합)로서 작용하는 융합으로부터 유래된 것들이다
- 말초 막 단백질(세포막에 부착되거나 결합됨): 선택된 전사체는 TE가 수용체(융합 엑손->TE), 공여체(융합 TE->엑손) 또는 둘 다(메타융합)로서 작용하는 융합으로부터 유래된 것들이다
통상적으로, 본 개시내용에 따른 키메라 단백질은 1% 초과, 특히 5% 초과, 및 통상적으로 10%를 초과하는 (하나 이상의 대상체 및/또는 하나 이상의 종양 유형으로부터의) 종양 샘플에서 발현되며, 여기서 종양 샘플은 TCGA로부터 수득될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 키메라 단백질(또는 pJET)은 하나 이상의 세포주(통상적으로 CCLE로부터 유래)에서, 특히 적어도 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 20; 50; 100개의 세포주에서 발현될 수 있다.
통상적으로, 본 개시내용에 따른 키메라 단백질은 정상 샘플(병타-종양 샘플 포함) 및/또는 세포주와 비교하여 종양 샘플에서 더 높은 수준으로 발현된다. 보다 구체적으로, 키메라 단백질은 바람직하게는 정상 샘플 또는 세포주의 20% 미만, 특히 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만에서 발현된다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 정상 샘플(병타-종양 샘플 포함)에서 검출 가능하게 발현되지 않는다.
본 개시내용은 또한 서열번호 1~8202의 키메라 폴리펩티드(또는 단백질) 중 어느 하나와 적어도 50%, 특히 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 키메라 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 상기 변이체 키메라 폴리펩티드는 세포 표면 막에서 발현된다. 통상적으로 상기 변이체에서, TE 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열은 변이체가 유도하는 펩티드의 TE-유래 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖도록 보존된다. 가장 바람직하게는, 상기 변이체 키메라 단백질은 UniProt와 같은 정상 단백질체 데이터베이스의 임의의 주석이 달린 폴리펩티드 또는 단백질과 일치하지 않는다.
본원에 개시된 (막관통) 키메라 단백질은 또한 화합물의 아미노산 서열을 연장시키거나 감소시킴으로써, 예를 들어 아미노산의 첨가 또는 결실에 의해 변형될 수 있다. 키메라 단백질은 또한 특정 잔기의 순서 또는 조성을 변경함으로써 변형될 수 있으며, 생물학적 활성에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예를 들어, 중요한 접촉 부위 또는 보존된 잔기에서의 아미노산 잔기는 일반적으로 생물학적 활성에 대한 부작용 없이 변경되지 않을 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 비-임계 아미노산은 L-α-아미노산과 같은 단백질, 또는 이들의 D-이성질체에서 자연적으로 발생하는 것들에 한정되지 않을 필요가 있지만, β-γ-δ-아미노산과 같은 비-천연 아미노산뿐만 아니라 L-α-아미노산의 많은 유도체를 포함할 수도 있다.
통상적으로, 단일 아미노산 치환을 갖는 일련의 펩티드가 정전기 전하, 소수성 등이 결합에 미치는 효과를 결정하기 위해 사용된다. 치환은 동종-올리고머 또는 헤테로-올리고머일 수 있다. 치환되거나 첨가되는 잔기의 수 및 유형은 필수 접촉 지점과 요구되는 특정 기능적 속성 사이에 필요한 간격(예를 들어, 소수성 대 친수성)에 따라 달라진다. 어떤 경우에도, 이러한 치환은, 예를 들어 결합을 방해할 수 있는 입체 및 전하 간섭을 회피하도록 선택된 아미노산 잔기 또는 다른 분자 단편을 사용해야 한다.
아미노산 치환은 일반적으로 단일 잔기로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합이 조합되어 최종 펩티드에 도달할 수 있다. 치환 변이체는 펩티드의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 이러한 치환은 일반적으로 펩티드의 특성을 미세하게 조절하는 것이 바람직할 때 이전에 도시된 표 1에 따라 이루어진다.
본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 프로테아좀 기계에 의해 가공될 수 있고, 전술한 바와 같이 상기 대상체의 적어도 하나의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하는 일반적으로 적어도 8개의 아미노산(및 특히 8~25개의 아미노산)의 신생항원성 펩티드를 생산할 수 있음을 언급해야 한다.
본 개시내용은 또한, 상기 정의된 바와 같은 키메라 단백질 또는 이의 단편, 특히 적어도 4, 5, 6 7, 또는 8개 아미노산 길이의 이의 신생항원성 종양 서열(또는 에피토프)에 약 2x10-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 결합하는 본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Kd는 약 2x10-7M 이하, 약 1x10-7M 이하, 약 9x10-8M 이하, 약 1x10-8M 이하, 약 9x10-9M 이하, 약 5x10-9M 이하, 약 4x10-9M 이하, 약 3x10-9 이하, 약 2x10-9M 이하, 또는 약 1x10-9M 이하 , 또는 약 1x10-10M 이하, 또는 약 1x10-12M 이하이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 3x10-9M 이하이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1x10-9M 내지 약 3x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-9M 내지 약 3x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-9M 내지 약 2.7x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-10M 내지 약 2.7x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-12M 내지 약 2.7x10-7M이다.
항원 결합 도메인(예를 들어, Fv 또는 이의 유사체)의 결합은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), FACS 분석, 생물분석(예를 들어, 성장 억제), 웨스턴 블롯 분석 또는 형광 현미경에 의해 확인될 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체 또는 Fv)을 사용함으로써 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, Fv는 방사성 표지되고 방사성 면역분석(RIA)에 사용될 수 있다(예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, 이는 본원에 참조로서 통합됨). 방사성 동위원소는 g 계수기 또는 섬광 계수기의 사용과 같은 수단에 의해 또는 자가방사선에 의해 검출될 수 있다.
현미경의 경우, 표지된 시약(예를 들어, 항체 또는 Fv)은 형광단에 직접 접합되거나 표지된 시약에 대해 유도된 형광단-접합된 이차 항체에 의해 인식될 수 있다. 형광 염료로도 불리는 형광단의 비제한적인 예는 시아닌(예를 들어, Cy3) 또는 로다민(예를 들어, TRITC) 또는 플루오레세인(예를 들어, FITC)의 유도체를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 형광 마커로 표지된다. 형광 마커의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, 아주라이트, 및 mKalamal), 시안 형광 단백질(예를 들어, ECFP, 세룰리안, 및 CyPet), 및 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, 시트린, 비누스, 및 YPet)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 키메라 단백질의 아미노산 서열(또는 에피토프)의 단편(또는 종양 신생항원성 펩티드 서열)에 결합하며, 이는 적어도 TE 유래 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1424~8202; 8203~10163, 및 12831~21542 중 어느 하나로부터 유래한다(통상적으로 TE가 공여체인 융합 전사체에 의해 암호화됨). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 단백질로부터의 펩티드 서열은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 중단점과 중첩된다. 다른 구현예에서, 펩티드 서열은 순수 TE 서열로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 서열은 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 접합부의 하류에 있는 비정규 ORF에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 항원 결합 도메인은 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드 신생항원성 펩티드 또는 이의 단편 중 어느 하나로부터의 신생항원성 펩티드 서열에 결합하되, 상기 신생항원성 펩티드 서열은:
a) 서열번호 1~21542 또는 이의 단편 중 어느 하나로부터 유래되고, TE-유래 아미노산 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 적어도 하나의 서열을 포함하고,
선택적으로 (i) TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 중단점과 중첩되는 단편이거나,
선택적으로 (ii) 순수 TE 서열이거나; 또는
b) 서열번호 1~1423; 8203~10163, 및 10164~12830(통상적으로 엑손이 공여체인 융합 전사체에 의해 암호화됨) 또는 이의 단편 중 어느 하나로부터 유래되고, TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 접합부의 하류에 있는 비정규 ORF에 의해 암호화된다.
일반적으로, 펩티드 서열은 키메라 단백질의 세포외 부분으로부터 유래한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 TCR의 항원 결합 부분을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편의 항원 결합 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 중쇄 단독 항체(VHH) 또는 이의 변이체 및/또는 VL 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 임의로 가교 결합된 Fab를 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 F(ab)2를 포함한다. 　 특정 구현예에서, 전술한 분자 중 어느 하나는 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 이종 서열과 융합 단백질에 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 쥣과, 인간 또는 낙타류(예를 들어, 라마) 기원의 scFv, Fab, 또는 항체로부터 유래된다.
펩티드 생산, 폴리뉴클레오티드 및 벡터
단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터 단백질 또는 펩티드의 분리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 이전에 개시되었고, 당업자에게 알려진 컴퓨터화된 데이터베이스에서 확인할 수 있다. 이러한 데이터베이스 중 하나는 국립보건원(National Institutes of Health) 웹사이트에 위치한 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Infornation)의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스이다. 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 사용하여 또는 당업자에게 알려진 바와 같이 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 다양한 상업적 제제가 당업자에게 알려져 있다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드를 암호화하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥, 또는 천연 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 인산 골격을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있고, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 자연 발생 펩티드 결합에 의해 결합된 자연 발생 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 추가 양태는 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터는 당업계에 잘 알려져 있고 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, DNA는 발현 벡터, 예컨대 플라스미드 내에 발현을 위한 적절한 배향 및 정확한 해독 프레임으로 삽입된다. 발현 벡터는 바람직한 숙주에 의해 인식된 적절한 이종 전사 및/또는 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 종양 신생항원성 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 이종 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 결합될 수 있거나, 인접하지 않지만 이러한 이종 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 그런 다음, 벡터는 표준 기술을 통해 숙주 내로 도입된다. 지침은 예를 들어 Sambrook 등(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y에서 확인할 수 있다.
항원 제시 세포(APC)
본 개시내용은 또한 이전에 정의된 바와 같고/같거나 전술된 바와 같은 방법으로 수득 가능한 펩티드 중 하나 이상으로 펄스된 항원 제시 세포의 집단을 포함한다. 바람직하게는, 항원 제시 세포는 수지상 세포(DC) 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)이다(Neal, Lillian R 등, "The Basics of Artificial Antigen Presenting Cells in T Cell-Based Cancer Immunotherapies." Journal of immunology research and therapy vol. 2,1(2017): 68~79 참조). 수지상 세포(DC)는 미처리 T 세포를 자극하고 병원균에 대한 일차 면역 반응을 개시하는 탁월한 능력을 갖는 전문 항원 제시 세포(APC)이다. 실제로, 성숙한 DC의 주요 역할은 항원을 감지하고 다른 면역 세포, 특히 T 세포를 활성화시키는 매개체를 생산하는 것이다. DC는 림프구 활성화를 위한 강력한 자극체인데, 이는 이들이 T 세포에서 TCR(신호 1) 및 공자극 분자(신호 2)를 촉발하는 MHC 분자를 발현하기 때문이다. 추가적으로, DC는 또한 T 세포 증식을 지원하는 사이토카인을 분비한다. T 세포는 외래 병원균 또는 종양을 인식하기 위해 가공된 펩티드 형태의 제시된 항원을 필요로 한다. 병원균/종양 단백질로부터 유래된 펩티드 에피토프의 제시는 MHC 분자를 통해 달성된다. MHC 클래스 I(MHC-I) 및 MHC 클래스 II(MHC-II) 분자는 가공된 펩티드를 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포에 각각 제시한다. 중요하게는, DC는 면역 반응을 촉진하기 위해 풍부한 T 세포 집단을 함유하는 염증 부위가 있는 곳이다. 따라서, DC는 적응 면역 반응의 활성화에 밀접하게 관여하기 있기 때문에, 임의의 면역 요법 접근법의 중요한 구성 요소일 수 있다. 백신의 맥락에서, DC 요법은 건강한 자원자 또는 감염성 질환 또는 암을 가진 환자에서 바람직한 표적에 대한 T 세포 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일 구현예에서, APCS는 바람직한 T 세포 공자극 분자, 인간 HLA 대립유전자 및/또는 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 변형된 인공 APC이다. 이러한 인공 항원 제시 세포(aAPC)는 적절한 T 세포 결합, 공자극, 및 제어되는 T 세포 증식을 허용하는 사이토카인의 서방출에 대한 요건을 제공할 수 있다. 이들 세포는 시간 제약 및 제한된 가용성의 적용을 받지 않으며, 상이한 공여체로부터 T 세포주를 생성하는 데 후속 사용하기 위한 작은 분취액에 저장될 수 있으므로, 면역요법 응용을 위한 기성 시약을 나타낸다. 이들 aAPC에서의 강력한 공자극 신호의 발현은 이러한 시스템에 더 높은 효율을 부여하여 입양 면역요법의 효능을 증가시킨다. 또한, aAPC는 특정 사이토카인의 방출을 유도하는 유전자를 발현하도록 조작되어 입양 전달을 위한 바람직한 T 세포 하위집합의 우선적 확장을 용이하게 할 수 있는데; 이는 예컨대, 장기 생존 기억 T 세포이다(검토를 위해, AH 등, . Artificial Antigen Presenting Cells: An Off the Shelf Approach for Generation of Desirable T-Cell Populations for Broad Application of Adoptive Immunotherapy; Adv Genet Eng. 2015; 4(3): 130, Kim JV, Latouche JB, Riviere I, Sadelain M. The ABCs of artificial antigen presentation. Nat Biotechnol. 2004;22:403~410 또는 Wang C, Sun W, Ye Y, Bomba HN, Gu Z. Bioengineering of Artificial Antigen Presenting Cells and Lymphoid Organs. Theranostics 2017; 7(14):3504~3516 참조).
통상적으로, 수지상 세포는 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드로 펄스되는 자가 수지상 세포이다. 펩티드는 적절한 T 세포 반응을 유발하는 임의의 적절한 펩티드일 수 있다. 항원 제시 세포(또는 자극 세포)는 일반적으로 그 표면 상에 MHC 클래스 I 또는 II 분자를 가지며, 일 구현예에서, 선택된 항원으로 MHC 클래스 I 또는 II 분자를 로딩하는 것 자체는 실질적으로 불가능하다. MHC 클래스 I 또는 II 분자는 시험관 내에서 선택된 항원으로 쉽게 로딩될 수 있다.
대안으로서, 항원 제시 세포는 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드를 암호화하는 발현 작제물을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 이전에 정의된 바와 같은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 수지상 세포를 형질도입할 수 있고, 이에 따라 펩티드의 제시 및 면역의 유도를 초래할 수 있는 것이 바람직하다.
따라서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드로 펄스 또는 로딩될 수 있거나, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 발현하도록 (DNA 또는 RNA 전달을 통해) 유전적으로 변형되거나, 본 개시내용의 종양 신생항원성 펩티드를 암호화하는 발현 작제물을 포함하는 APC의 집단을 포함한다. 통상적으로, APC의 집단은 펄스 또는 로딩되거나, 이를 발현하도록 변형되거나, 이를 암호화하는 적어도 하나, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 또는 적어도 20개의 상이한 신생항원성 펩티드 또는 발현 작제물을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 APC를 포함하는 조성물을 포함한다. APC는 생리학적으로 허용 가능한 수성 약제학적 조성물을 형성하기 위해, 세포 배양 배지, 생리학적 식염수, 인산염 완충 식염수, 세포 배양 배지 등과 같은 임의의 공지된 생리학적으로 적합한 약제학적 캐리어에 현탁될 수 있다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거를 포함한다. 항균제와 같은 다른 물질이 원하는 대로 첨가될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "캐리어"는 APC를 적절한 시험관 내 또는 생체 내 작용 부위에 전달하기 위한 비히클로서 적합한 임의의 물질을 지칭한다. 이와 같이, 캐리어는 APC를 함유하는 치료 시약 또는 실험 시약의 제형화를 위한 부형제로서 작용할 수 있다. 바람직한 캐리어는 T 세포와 상호작용할 수 있는 형태로 APC를 유지할 수 있다. 이러한 캐리어의 예는 물, 인산염 완충 식염수, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 행크 용액 및 다른 수성 생리학적으로 균형잡힌 용액 또는 세포 배양 배지를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 수성 캐리어는 또한 수용자의 생리학적 조건, 예를 들어 화학적 안정성 및 등장성의 향상에 근접하는 데 필요한 적절한 보조 물질을 함유할 수 있다. 적절한 보조 물질은, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 젖산나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 인산염 완충액, 트리스 완충액, 및 중탄산염 완충액을 생산하는 데 사용되는 다른 물질을 포함한다.
백신 조성물
본 개시내용은 특이적 T 세포 반응을 증가시킬 수 있는 백신 또는 면역원성 조성물을 더 포함하며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 다음을 포함한다:
- 본원에 정의된 하나 이상의 신생항원성 펩티드,
- 본원에 정의된 바와 같은 신생항원성 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및/또는
- 전술한 바와 같은 항원 제시 세포(예를 들어, 자가 수지상 세포 또는 인공 APC)의 집단.
바람직하게는, 이전에 정의된 바와 같은 종양 특이적 융합에 의해 암호화되는 신생항원성 펩티드가 본 개시내용에 따른 백신 조성물에 사용된다. 상기 신생항원성 펩티드는 종양 특이적 펩티드로도 명명될 수 있다. 바람직하게는, 종양 특이적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 개시내용에 따라 사용된다.
적합한 백신 또는 면역원성 조성물은 바람직하게는 1 내지 20개의 신생항원성 펩티드, 더 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개의 상이한 신생항원성 펩티드, 더 바람직하게는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 상이한 신생항원성 펩티드, 가장 바람직하게는 12, 13 또는 14개의 상이한 신생항원성 펩티드를 함유할 것이다.
신생항원성 펩티드(들)는 캐리어 단백질에 결합될 수 있다. 조성물이 두 개 이상의 신생항원성 펩티드를 함유하는 경우, 두 개 이상의(예를 들어, 2~25개) 펩티드는 전술한 바와 같은 스페이서 분자, 예를 들어 2~6개의 비극성 또는 중성 아미노산을 포함하는 스페이서에 의해 선형으로 결합될 수 있다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 APC를 암호화하는 상이한 신생항원성 펩티드는 하나의 백신 또는 면역원성 조성물이 상이한 MHC 클래스 I 분자와 같은 상이한 MHC 분자와 연관될 수 있는 신생항원성 펩티드를 포함하도록 선택된다. 바람직하게는, 이러한 신생항원성 펩티드는 가장 빈번하게 발생하는 MHC 클래스 I 분자와 연관될 수 있는데, 예를 들어 적어도 2개의 바람직한, 더 바람직하게는 적어도 3개의 바람직한, 보다 더 바람직하게는 적어도 4개의 바람직한 MHC 클래스 I 분자와 연관될 수 있는 상이한 단편과 연관될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 MHC 클래스 II 분자와 연관될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 APC를 암호화하는 펩티드를 포함한다. MHC는 선택적으로 HLA -A, -B, -C, -DP, -DQ, 또는 -DR이다.
백신 또는 면역원성 조성물은 특이적 세포독성 T 세포 반응 및/또는 특이적 헬퍼 T 세포 반응을 증가시킬 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한 전술한 바와 같은 신생항원성 펩티드에 관한 것으로, 여기서 신생항원성 펩티드는 종양 특이적 네오에피토프를 갖고 백신 또는 면역원성 조성물에 포함된다. 백신 조성물은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역을 생성하기 위한 조성물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 백신은 항원을 포함하거나 생성하는 약물이며, 백신접종에 의해 특이적 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에 사용되도록 의도된다. "면역원성 조성물"은 항원(들)을 포함하거나 생성하며 항원 특이적 체액성 또는 세포성 면역 반응, 예를 들어 T 세포 반응을 유도할 수 있는 조성물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 신생항원성 펩티드는 8개 또는 9개의 잔기 길이, 또는 13개 내지 25개의 잔기 길이이다. 펩티드가 20개 미만의 잔기인 경우, 생체 내 면역화에 더 적합한 펩티드를 갖기 위해, 상기 신생항원성 펩티드는 선택적으로 추가 아미노산이 측면에 위치하여 더 많은 아미노산, 일반적으로 20개 초과의 면역화 펩티드를 수득한다.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물(즉, 백신 또는 면역원성 조성물)은 이미 암을 앓고 있는 개체에게 투여될 수 있다. 치료적 용도에서, 조성물은 종양 항원에 대한 효과적인 CTL 반응을 유도하고 증상 및/또는 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료 유효 투여량"으로 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은, 예를 들어, 펩티드 조성물, 투여 방식, 치료 중인 질환의 단계 및 중증도, 환자의 체중 및 전반적인 건강 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라지지만, 일반적으로 초기 면역화(즉, 치료적 또는 예방적 투여)를 위한 범위는 70kg 환자의 경우 약 1.0μg 내지 약 50,000μg의 펩티드 후에 추가 투여 용량이 이어지거나, 환자의 혈액에서 특이적 CTL 활성을 측정함으로써 환자의 반응 및 상태에 따라 수주 내지 수개월에 걸쳐 추가 투여 요법에 따라 약 1.0μg 내지 약 10,000μg의 펩티드에 걸칠 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 조성물은 일반적으로 심각한 질환 상태, 즉, 특히 암이 전이되었을 때 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용될 수 있음을 명심해야 한다. 이러한 경우, 외인성 물질의 최소화 및 펩티드의 상대적인 비독성 성질을 고려하여, 치료 의사가 이들 펩티드 조성물의 상당한 과량의 투여를 하는 것이 가능하고 바람직한 것으로 느낄 수 있다.
치료적 사용을 위해, 투여는 종양의 검출 또는 수술적 제거 시에 시작되어야 한다. 이어서, 적어도 증상이 실질적으로 완화될 때까지 그리고 그 후 일정 기간 동안 투여량이 증가된다.
치료적 치료를 위한 백신 또는 면역원성 조성물은 비경구, 국소, 비강, 경구 또는 국소 투여용으로 의도된다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 또는 근육내 투여된다. 조성물은 종양에 대한 국소 면역 반응을 유도하기 위해 수술적 절제 부위에 투여될 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 보조제, 면역자극제, 안정화제, 캐리어, 희석제, 부형제 및/또는 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 물질을 추가로 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 캐리어는 바람직하게는 수성 캐리어이지만 캐리어 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 다양한 수성 캐리어, 예를 들어, 물, 완충된 물, 0.9% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 사용될 수 있다. 이들 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등과 같은 생리학적 조건을 근사하는 데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 추가로 함유할 수 있다. 암 백신에 대한 논의는 예를 들어 Butterfield, BMJ. 2015 22;350을 참조한다.
항원성 화합물에 대한 숙주의 면역 반응을 증가시키거나 확장시키는 예시적인 보조제는 유화제, 뮤라밀 디펩티드, 아브리딘, 수산화알루미늄과 같은 수성 보조제, 키토산계 보조제, 사포닌, 오일, 암피겐, LPS, 박테리아 세포 벽 추출물, 박테리아 DNA, CpG 서열, 합성 올리고뉴클레오티드, 사이토카인 및 이들의 조합을 포함한다. 유화제는, 예를 들어 라우르산 및 올레산의 칼륨, 나트륨 및 암모늄 염, 지방산의 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염, 유기 설포네이트, 예컨대 라우릴 설페이트 나트륨, 세틸트레에틸암몬 브로마이드, 글리세린에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 에스테르 및 에테르, 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 이들의 폴리옥시에틸렌, 아카시아, 젤라틴, 레시틴 및/또는 콜레스테롤을 포함한다. 오일 성분을 포함하는 보조제는 광유, 식물성 오일, 또는 동물성 오일을 포함한다. 다른 보조제는 프로인트 완전 보조제(FCA) 또는 프로인트 불완전 보조제(FIA)를 포함한다. 추가 면역자극제로서 유용한 사이토카인은 인터페론 알파, 인터류킨-2(IL-2), 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 이들의 조합을 포함한다.
백신 또는 면역원성 제형에서 기술된 바와 같은 펩티드의 농도는 광범위하게, 즉, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 약 0.1 중량% 미만, 일반적으로 약 2 중량% 이하 내지 약 20 중량% 내지 50 중량% 이상까지 다양할 수 있고, 주로 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드는 펩티드를 림프 조직과 같은 특정 세포 조직에 표적화하는 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 리포좀은 펩티드의 반감기를 증가시키는 데에도 유용하다. 리포좀은 유화액, 발포체, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함한다. 이들 제제에서, 전달될 펩티드는 리포좀의 일부로서, 단독으로 또는 림프 세포들 사이에서 우세한 수용체, 예컨대 CD45 항원에 결합하는 단클론 항체에 결합하는 분자와 함께, 또는 다른 치료적 또는 면역원성 조성물과 함께 혼입된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 펩티드로 채워진 리포좀은 림프 세포의 부위로 유도될 수 있으며, 여기서 리포좀은 이어서 선택된 치료/면역원성 펩티드 조성물을 전달한다. 본 발명에 사용하기 위한 리포좀은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포 형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로, 예를 들어, 리포좀의 크기, 혈류에서의 리포좀의 산 불안정성 및 안정성을 고려하여 안내된다. 예를 들어, Szoka 등, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9;467(1980), 미국 특허 제4,235,871호, 제4501728호, 미국 특허 제4,501,728호, 제4,837,028호, 및 제5,019,369호에 기술된 바와 같은 다양한 방법이 리포좀을 제조하는 데 이용 가능하다.
면역 세포를 표적화하기 위해, 리포좀에 혼입될 리간드는, 예를 들어, 바람직한 면역 시스템 세포의 세포 표면 결정인자에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 펩티드를 함유하는 리포좀 현탁액은, 특히 투여 방식, 전달되는 펩티드, 및 치료 중인 질환의 단계에 따라 달라지는 투여량으로 정맥내, 국소(locally), 국소(topically) 등으로 투여될 수 있다.
고형 조성물의 경우, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 탈쿰, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 탄산 마그네슘 등을 포함하는 종래의 또는 나노입자 비독성 고형 캐리어가 사용될 수 있다. 경구 투여의 경우, 약제학적으로 허용 가능한 비독성 조성물은 이전에 열거된 캐리어, 및 일반적으로 10~95%의 활성 성분, 즉 본 발명의 하나 이상의 펩티드, 보다 바람직하게는 25%~75%의 농도로 정상적으로 사용되는 부형제 중 어느 하나를 혼입함으로써 형성된다.
에어로졸 투여를 위해, 면역원성 펩티드는 바람직하게는 계면활성제 및 추진제와 함께 미세하게 분할된 형태로 공급된다. 펩티드의 통상적인 백분율은 0.01 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 10 중량%이다. 계면활성제는 물론, 비독성이어야 하고, 바람직하게는 추진제에 가용성이어야 한다. 이러한 제제의 대표적인 것은 지방족 다가 알코올 또는 이의 환형 무수물을 갖는 카프로익산, 옥탄산산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테산 및 올레산과 같은, 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르이다. 혼합된 에스테르, 예컨대 혼합된 또는 천연 글리세라이드가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.25 내지 5 중량%를 구성할 수 있다. 조성물의 균형(balance)은 보통 추진제이다. 캐리어는 또한, 예를 들어 비강내 전달을 위한 레시틴과 같이, 원하는 대로 포함될 수 있다.
세포독성 T 세포(CTL)는 온전한 외래 항원 자체보다는 MHC 분자에 결합된 펩티드 형태의 항원을 인식한다. MHC 분자 자체는 항원 제시 세포의 세포 표면에 위치한다. 따라서, CTL의 활성화는 펩티드 항원, MHC 분자, 및 항원 제시 세포(APC)의 삼량체 복합체가 존재하는 경우에만 가능하다. 이에 상응하여, 펩티드가 CTL의 활성화에 사용될 뿐만 아니라, 추가적으로 각각의 MHC 분자를 갖는 APC가 첨가되는 경우, 이는 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 백신 또는 면역원성 조성물은 적어도 하나의 항원 제시 세포, 바람직하게는 APC의 집단을 대안적으로 또는 추가적으로 함유한다.
따라서, 백신 또는 면역원성 조성물은 항원 제시 세포와 같은 세포의 형태로, 예를 들어 수지상 세포 백신으로서 전달될 수 있다. 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포는 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드로 펄스 또는 로딩될 수 있거나, 본원에 개시된 바와 같은 신생항원성 펩티드를 암호화하는 발현 작제물을 포함할 수 있거나, 본원에 개시된 신생항원성 펩티드 중 하나, 둘 이상, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 신생항원성 펩티드를 발현하도록 (DNA 또는 RNA 전달을 통해) 유전적으로 변형될 수 있다.
적절한 백신 또는 면역원성 조성물은 또한 본원에 기술된 바와 같은 신생항원성 펩티드와 관련된 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 신생항원성 펩티드 또는 이로부터 유래된 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA는, 예를 들어 대상체에게 직접 주사함으로써 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 신생항원성 펩티드 또는 이로부터 유래된 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA.
핵산을 환자에게 전달하기 위해 다수의 방법이 편리하게 사용된다. 예를 들어, 핵산은 "네이키드(naked) DNA"로서 직접 전달될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어, Wolff 등, Science 247: 1465~1468(1990) 및 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호에 기술되어 있다. 핵산은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,204,253호에 기술된 바와 같은 탄도 전달을 사용하여 투여될 수 있다. DNA로만 구성된 입자가 투여될 수 있다. 대안적으로, DNA는 금 입자와 같은 입자에 부착될 수 있다.
핵산은 또한 양이온성 지질과 같은 양이온성 화합물에 복합체로 전달될 수 있다. 지질 매개 유전자 전달 방법은, 예를 들어, 9618372WOAWO 96/18372; 9324640WOAWO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682~691(1988); 5279833USARose 미국 특허 제5,279,833호; 9106309WOAWO 91/06309; 및 Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413~7414(1987)에 기술되어 있다.
전달 시스템은 선택적으로 세포 투과 펩티드, 나노미립자 캡슐화, 바이러스 유사 입자, 리포좀, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 투과 펩티드는 TAT 펩티드, 단순 포진 바이러스 VP22, 트랜스포탄, Antp를 포함한다. 리포좀은 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 리스테리아 백신 또는 전기천공이 또한 사용될 수 있다.
하나 이상의 신생항원성 펩티드는 또한 하나 이상의 신생항원성 펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 박테리아 또는 바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다. DNA 또는 RNA는 벡터 자체로서 또는 약독화된 박테리아 바이러스 또는 생약독화된 바이러스, 예컨대 우두 또는 계두 내로 전달될 수 있다. 이러한 접근법은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 벡터로서 우두 바이러스의 사용을 포함한다. 급성 또는 만성 감염 숙주 내로 또는 비감염 숙주 내로 도입 시, 재조합 우두 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하여 숙주 CTL 반응을 유도한다. 면역화 프로토콜에 유용한 우두 벡터 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제4,722,848호에 기술되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover 등의 (Nature 351:456~460(1991))에 기술되어 있다. 본 발명의 펩티드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 매우 다양한 다른 벡터, 예를 들어 살모넬라 타이피 벡터 등이 본원의 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드를 암호화하는 핵산을 투여하는 적절한 수단은 다수의 에피토프를 암호화하는 미니유전자 작제물의 사용을 포함한다. 인간 세포에서의 발현을 위해 선택된 CTL 에피토프(미니유전자)를 암호화하는 DNA 서열을 생성하기 위해, 에피토프의 아미노산 서열을 역번역한다. 인간 코돈 사용 테이블은 각각의 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내하는 데 사용된다. 이들 에피토프-암호화 DNA 서열은 직접적으로 인접하여 연속 폴리펩티드 서열을 생성한다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화하기 위해, 추가 요소가 미니유전자 설계에 통합될 수 있다. 역번역될 수 있고 미니유전자 서열에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예는: 헬퍼 T 림프구, 에피토프, 리더(신호) 서열, 및 소포체 보유 신호를 포함한다. 또한, CTL 에피토프의 MHC 제시는 CTL 에피토프에 인접한 합성(예를 들어, 폴리-알라닌) 또는 자연 발생 측부 서열을 포함함으로써 개선될 수 있다.
미니유전자 서열은 미니유전자의 ± 가닥을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 조립함으로써 DNA로 변환된다. 중첩 올리고뉴클레오티드(30~100개 염기 길이)는 잘 알려진 기술을 사용하여 적절한 조건 하에서 합성, 인산화, 정제 및 어닐링된다. 올리고뉴클레오티드의 말단은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 결합된다. 그런 다음, CTL 에피토프 폴리펩티드를 암호화하는 이러한 합성 미니유전자는 바람직한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 표준 조절 서열은 표적 세포에서의 발현을 보장하기 위해 벡터에 포함된다. 따라서, 신생항원성 펩티드(들)를 암호화하는 DNA 또는 RNA는 통상적으로 다음 중 하나 이상에 작동 가능하게 결합될 수 있다:
- 핵산 분자 발현을 유도하는 데 사용될 수 있는 프로모터. AAV ITR은 프로모터로서 작용할 수 있고, 추가 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하는 데 유리하다. 유비쿼터스 발현을 위해, 다음의 프로모터가 사용될 수 있다: CMV(특히 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 즉각적인 초기 프로모터(hCMV-IE)), CAG, CBh, PGK, SV40, RSV, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등. 뇌 발현을 위해, 다음의 프로모터가 사용될 수 있다: 모든 뉴런에 대한 시냅신, 흥분성 뉴런에 대한 CaMKII알파, GAD67 또는 GAD65, 또는 가바에르성 뉴런에 대한 VGAT 등. RNA 합성을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: U6 또는 HI와 같은 Pol III 프로모터. Pol II 프로모터 및 인트론 카세트의 사용은 가이드 RNA(gRNA)를 발현하는 데 사용될 수 있다. 통상적으로, 프로모터는 미니유전자 삽입을 위한 하류 클로닝 부위를 포함한다. 적합한 프로모터 서열의 예는 특히 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호를 참조한다.
- 전사 활성을 증가시킬 수도 있는 전사 전달활성제 또는 다른 인핸서 요소, 예를 들어 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형(HTLV-1)의 5' 장 말단 반복(LTR)으로부터의 조절 R 영역(CMV 프로모터와 조합될 때 더 높은 세포 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났음).
- mRNA 내의 AUG 개시자 코돈(ACCAUGG)의 측면에 위치하는 코작(Kozak) 서열과 같은 서열을 최적화하는 번역, 및 코돈 최적화.
미니유전자 발현 및 면역원성을 최적화하기 위해 추가 벡터 변형이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 효율적인 유전자 발현을 위해 인트론이 필요하고, 하나 이상의 합성 또는 자연 발생 인트론이 미니유전자의 전사 영역에 혼입될 수 있다. mRNA 안정화 서열을 포함시키는 것은 또한 미니유전자 발현을 증가시키기 위해 고려될 수 있다. 최근에 면역자극 서열(ISS 또는 CpG)이 DNA 백신의 면역원성에서 역할을 하는 것으로 제안되었다. 이들 서열은 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀지는 경우, 미니유전자 코딩 서열 외부의 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역원성을 향상시키거나 감소시키기 위해 포함된 미니유전자-암호화 에피토프 및 제2 단백질의 생성을 허용하는, 바이시스트론 발현 벡터가 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 DNA 백신 또는 면역원성 조성물은 IL-2, IL-12, IL-18, GM-CSF 및 IFNγ와 같은 세포 매개 면역 반응을 촉진하는 사이토카인을 공동 전달함으로써 향상될 수 있다. IL-8과 같은 CXC 케모카인, 및 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α, MIP-3α, MIP-3β, 및 RANTES와 같은 CC 케모카인은 면역 반응의 효능을 증가시킬 수 있다. 또한 DNA 백신 면역원성은 플라스미드-암호화 사이토카인-유도 분자(예를 들어, LeIF), 공동-자극 및 부착 분자, 예를 들어, B7-1(CD80) 및/또는 B7-2(CD86)를 공동 전달함으로써 향상될 수 있다. 헬퍼(HTL) 에피토프는 세포내 표적화 신호에 결합될 수 있고 CTL 에피토프와 별도로 발현될 수 있다. 이는 CTL 에피토프와 상이한 세포 구획으로의 HTL 에피토프의 방향을 허용할 것이다. 필요한 경우, 이는 MHC 클래스 II 경로 내로 HTL 에피토프의 보다 효율적인 진입을 용이하게 하여, CTL 유도를 개선할 수 있다. CTL 유도와 대조적으로, 면역억제 분자(예를 들어, TGF-β)의 공동 발현에 의해 면역 반응을 특이적으로 감소시키는 것은 특정 질환에 유익할 수 있다.
발현 벡터가 선택되면, 미니유전자는 프로모터의 하류에 있는 폴리링커 영역 내로 클로닝된다. 이 플라스미드는 적절한 대장균 균주로 형질전환되고, DNA는 표준 기술을 사용하여 제조된다. 벡터에 포함된 모든 다른 요소뿐만 아니라 미니유전자의 배향 및 DNA 서열은 제한 맵핑 및 DNA 서열 분석을 사용하여 확인된다. 정확한 플라스미드를 보유하는 박테리아 세포는 마스터 세포 은행 및 작업 세포 은행으로서 저장될 수 있다.
정제된 플라스미드 DNA는 주사를 위해 다양한 제형을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 중 가장 간단한 것은 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 동결건조된 DNA를 재구성하는 것이다. 다양한 방법이 설명되었고, 새로운 기술이 이용 가능할 수 있다. 전술한 바와 같이, 핵산은 양이온성 지질과 함께 편리하게 제형화된다. 또한, 보호형, 상호작용형, 비응축(PINC)형으로서 집합적으로 지칭되는 당지질, 융합원성 리포좀, 펩티드 및 화합물은 또한 정제된 플라스미드 DNA에 복합체화되어 안정성, 근육내 분산, 또는 특정 기관 또는 세포 유형으로의 수송과 같은 변수에 영향을 미칠 수 있다.
펩티드를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물은 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 백신 및 DNA 백신의 투여는 프라임-부스트 프로토콜에서 교번될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 면역원성 조성물로 프라이밍하고 DNA 면역원성 조성물로 부스팅하는 것은 DNA 면역원성 조성물로 프라이밍하고 펩티드 면역원성 조성물로 부스팅하는 것과 같이 고려된다.
본 개시내용은 또한 백신 조성물을 생성하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은:
a) 선택적으로, 전술한 바와 같은 방법에 따라 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 식별하는 단계;
b) 상기 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 신생항원성 펩티드(들)를 암호화하는 적어도 하나의 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 바와 같은 상기 폴리펩티드(들)를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 생성하는 단계; 및
c) 선택적으로 생리학적으로 허용 가능한 완충액, 부형제 및/또는 보조제를 첨가하고 상기 적어도 하나의 신생항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 벡터로 백신을 생성하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 DC 백신을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 DC는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 신생항원성 펩티드를 제시한다.
항체 TCR, CAR 및 이의 유도체
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드(또는 단백질), 가장 바람직하게는 서열번호 1~8202의 키메라 단백질, 또는 일반적으로 MHC 또는 HLA 분자와 결합된 신생항원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인(키메라 단백질에 결합)을 포함하거나 이로 이루어진다.
일반적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이전에 정의된 바와 같이 일반적으로 MHC 또는 HLA 분자 또는 (막관통) 키메라 단백질과 결합된 신생항원성 펩티드에 약 2x10-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 결합한다. 특정 구현예에서, Kd는 약 2x10-7M 이하, 약 1x10-7M 이하, 약 9x10-8M 이하, 약 1x10-8M 이하, 약 9x10-9M 이하, 약 5x10-9M 이하, 약 4x10-9M 이하, 약 3x10-9 이하, 약 2x10-9M 이하, 또는 약 1x10-9M 이하이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 3x10-9M 이하이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1x10-9M 내지 약 3x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-9M 내지 약 3x10-7M이다. 특정 비제한적인 구현예에서, Kd는 약 1.5x10-9M 내지 약 2.7x10-7M이다.
림프구 T(LT)에 의한 종양 세포의 침윤 및 인식을 촉진하기 위해, 또 다른 전략은 하나 초과의 항원성 표적을 동시에, 보다 구체적으로는 두 개의 항원성 표적을 동시에 인식할 수 있는 항체를 사용하는 것으로 이루어진다. 이중특이적 항체의 많은 포맷이 존재한다. BiTE(이중특이적 T 세포 결합자)가 최초로 개발되었다. 이들은 결합 펩티드에 의해 결합된 두 개의 항체로부터의 두 개의 scFv(가변 도메인 중쇄 VH 및 경쇄 VL)로 이루어진 융합 단백질이다: 하나는 LT 마커(CD3+)를 인식하고 다른 하나는 종양 항원을 인식한다. 목표는 종양과 접촉하는 LT의 동원 및 활성화를 촉진하여 세포 용해 종양을 유도하는 것이다(검토를 위해 Patrick A. Baeuerle 및 Carsten Reinhardt; Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy; Cancer Res 2009; 69: (12). June 15, 2009; 및 Galaine 등, Innovations & Thιrapeutiques en Oncologie, vol. 3-n 3~7, mai-aout 2017 참조).
따라서, 특정 구현예에서, 상기 항체는 본원에 정의된 바와 같은 키메라 단백질을 표적으로 하고, 특히 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 이중 특이적 T 세포 결합자이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 다클론 및 단클론 항체를 포함하고, 온전한 항체 및 기능적 (항원 결합) 항체 단편을 포함하고, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rlgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄(VH) 영역, 단쇄 항체 단편을 포함하고, 단쇄 가변 단편(scFv), 및 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 항체, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한다. 이 용어는 유전자 조작되고/되거나 달리 변이체 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화 항체, 및 이종접합체 항체, 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 기능적 항체 및 이의 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을, 예를 들어 scFv 포맷으로 포함한다.
항체는 항체가 그의 특이적 결합 기능을 유지하거나 실질적으로 보유하는 경우, 천연 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 변이체 폴리펩티드 종을 포함한다. 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있으며 전술한 바와 같다.
본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 일반적으로 MHC 또는 HLA 분자와 결합된 본원에 정의된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드에 결합하거나, 본원에 정의된 바와 같은 키메라 단백질에 약 2x10-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 결합하는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, Kd는 약 2x10-7M 이하, 약 1x10-7M 이하, 약 9x10-8M 이하, 약 1x10-8M 이하, 약 9x10-9M 이하, 약 5x10-9M 이하, 약 4x10-9M 이하, 약 3x10-9 이하, 약 2x10-9M 이하, 또는 약 1x10-9M 이하, 또는 약 1x10-10M 이하, 또는 약 1x10-12M 이하이다.
특정 구현예에서, 항체는 쥣과, 인간 또는 낙타류(예를 들어, 라마) 기원이다.
일부 구현예에서, 항체는 인간 항체 서열의 라이브러리로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체는 이전에 정의된 바와 같이, 서열번호 1~8202 중 어느 하나의 키메라 단백질 또는 이의 일부(특히 세포외 부분)로 동물을 면역화한 다음, 선택 단계에 의해 생성된다.
키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 항체는 전술한 바와 같이 추가로 친화도 성숙되고 선택될 수 있다. 인간화 항체는 설치류-서열 유래 CDR 영역을 함유하며; 일반적으로 설치류 CDR은 인간 프레임워크에 생착되고, 인간 프레임워크 잔기 중 일부는 친화도를 보존하기 위해 원래의 설치류 프레임워크 잔기로 역돌연변이될 수 있고/있거나, CDR 잔기 중 하나 또는 일부는 친화도를 증가시키도록 돌연변이될 수 있다. 완전한 인간 항체는 쥣과 서열을 갖지 않으며, 일반적으로 인간 항체 라이브러리의 파지 디스플레이 기술, 또는 천연 면역글로빈 유전자좌가 인간 면역글로불린 유전자좌의 분절로 대체된 유전자이식 마우스의 면역화를 통해 생산된다.
상기 방법에 의해 생산된 항체뿐만 아니라 이러한 항체 또는 이의 단편을 발현하는 면역 세포도 본 개시내용에 포함된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 항체를 단독으로 또는 안정화 화합물과 같은 적어도 하나의 다른 제제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 포함하며, 이는 임의의 멸균된 생체적합적 약제학적 캐리어로 투여될 수 있고 선택적으로 멸균된 약제학적으로 허용 가능한 완충액(들), 희석제(들), 및/또는 부형제(들)와 함께 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 캐리어는 통상적으로 조성물을 향상시키거나 안정화시키고/시키거나, 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 캐리어는 생리학적으로 상용 가능하고 일부 구현예에서 약제학적으로 불활성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 경구 또는 비경구로 달성될 수 있다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내(종양에 직접), 근육내, 척추, 피하, 골수내, 경막내, 뇌실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여를 포함한다.
따라서, 활성 성분에 더하여, 이들 약제학적 조성물은 활성 화합물이 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공되는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 함유할 수 있다. 제형화 및 투여 기술에 대한 추가적인 세부 사항은 Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)의 최신판에서 확인할 수 있다.
투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 물질로 코팅되어 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호할 수 있다.
조성물은 일반적으로 멸균 상태이고 바람직하게는 유체이다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 다가알코올, 및 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 주사 가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
경구 투여용 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합한 투여량의 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 사용하여 제형화될 수 있다. 이러한 캐리어는 약제학적 조성물이 정제, 알약, 드라제(dragee), 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화되어 환자가 섭취할 수 있게 한다.
경구 사용을 위한 약제학적 제제는 활성 화합물과 고형 부형제의 조합, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하는 단계, 및 적절한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 원하는 경우 정제 또는 드라제 코어를 수득함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 필러, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당류; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 다른 식물로부터의 전분; 메틸, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 또는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스; 및 아라비아 및 트라가칸스를 포함하는 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질이다. 바람직한 경우, 가교 결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 이의 염, 예컨대 알긴산 나트륨과 같은 붕해제 또는 가용화제가 첨가될 수 있다.
드라제 코어는 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수도 있는 농축 당 용액과 같은 적절한 코팅을 구비한다. 제품 식별을 위해 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특성화하기 위해 침지 또는 안료가 정제 또는 드라제 코팅에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 캡슐뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅으로 만들어진 연질의, 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스 또는 전분과 같은 필러 또는 결합제, 탈크 또는 스테아린산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예컨대 안정화제가 있거나 없는 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다.
비경구 투여용 약제학적 제형은 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 수용액으로, 바람직하게는 생리학적으로 상용 가능한 완충액, 예컨대 행크(Hank) 용액, 링거 용액, 또는 생리학적으로 완충된 식염수로 제형화될 수 있다. 수성 주입 현탁액은 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주입 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.
국소 또는 비강 투여의 경우, 투과될 특정 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 알려져 있고 일상적으로 사용되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조된다.
본 개시내용은 또한 MHC 또는 HLA 분자와 관련하여 본원에 정의된 바와 같은 신생항원성 펩티드를 표적으로 하는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다.
본 개시내용은 TCR 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 선택적으로 MHC 또는 HLA 분자와 관련하여 본원에 정의된 바와 같은 종양 신생항원 펩티드에 약 2x10-7M 이하의 해리 상수(Kd)로 결합하는 TCR을 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, Kd는 약 2x10-7M 이하, 약 1x10-7M 이하, 약 9x10-8M 이하, 약 1x10-8M 이하, 약 9x10-9M 이하, 약 5x10-9M 이하, 약 4x10-9M 이하, 약 3x10-9 이하, 약 2x10-9M 이하, 또는 약 1x10-9M 이하, 또는 약 1x10-10M 이하, 또는 약 1x10-12M 이하이다.
TCR을 암호화하는 핵산은 다양한 공급원으로부터, 예컨대 자연 발생 TCR DNA 서열의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 후에 항체 가변 영역의 발현에 이어서 전술한 선택 단계에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 환자로부터 분리된 T 세포, 또는 배양된 T 세포 하이브리도마로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역 시스템 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원 시스템, 또는 HLA)로 조작된 유전자이식 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, Parkhurst 등(2009) Clin Cancer Res. 15:169~180 및 Cohen 등(2005) J Immunol. 175:5799~5808 참조)을 참조한다. 일부 구현예에서, 파지 디스플레이는 표적 항원에 대해 TCR을 분리하는 데 사용된다(예를 들어, Varela-Rohena 등(2008) Nat Med. 14:1390~1395 및 Li(2005) Nat Biotechnol. 23:349~354 참조).
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRa 및 TCRb로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRg 및 TCRd로도 알려짐)을 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 일반적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로는 구조적으로 유사하지만, 이를 발현하는 T 세포는 구별되는 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 세포외 결합 도메인을 통해 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것을 일반적으로 담당하는 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다. 일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, Janeway 등, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참조). 예를 들어, 일부 양태에서, TCR의 각각의 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-말단 말단에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달을 매개하는 데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 이의 기능적 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본원의 목적을 위해, TCR에 대한 언급은 MHC 분자, 즉 MHC-펩티드 복합체에 결합된 특이적 항원성 펩티드에 결합하는 TCR의 항원 결합 부분과 같은 임의의 TCR 또는 기능적 단편을 포함한다. 상호 교환적으로 사용될 수 있는, TCR의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은 TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만, 전체 TCR이 결합하는 항원(예를 들어, MHC-펩티드 복합체)에 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은, 일반적으로 각각의 사슬이 세 개의 상보성 결정 영역을 함유하는 곳과 같이, 특이적 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 사슬 및 가변 β 사슬을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬의 가변 도메인은, 항원 인식을 부여하고 TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 펩티드 특이성을 결정하고 펩티드 특이성을 결정하는 면역글로불린과 유사한 루프, 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 형성하는 데 결합한다. 통상적으로, 면역글로불린과 마찬가지로, CDR은 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다{예를 들어, Jores 등, Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 처리된 항원을 인식하는 주요 CDR이지만, 알파 사슬의 CDR1은 또한 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용하는 것으로 나타난 반면, 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가 초가변성(HV4) 영역을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린과 마찬가지로, TCR 사슬의 세포외 부분{예를 들어, α-사슬, β-사슬)은 2개의 면역글로불린 도메인, N-말단에 가변 도메인{예를 들어, Va 또는 Vp; 통상적으로 카밧(Kabat) 넘버링에 기초한 아미노산 1 내지 116 - Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed. 참조), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인{예를 들어, 사슬 불변 도메인 또는 Ca, 통상적으로 카밧에 기초한 아미노산 117 내지 259, β-사슬 불변 도메인 또는 Cp, 통상적으로 카밧에 기초한 아미노산 117 내지 295)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인, 및 CDR을 함유하는 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 두 개의 사슬 사이에 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 TCR이 불변 도메인에 두 개의 이황화 결합을 함유하도록 α 및 β 사슬 각각에 추가적인 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 결합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 단백질을 세포막에 고정하고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 결합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유동물에서 세 개의 구별되는 사슬(γ, δ, 및 ε) 및 ζ-사슬을 가질 수 있는 다중 단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유동물에서, 복합체는 CD3y 사슬, CD35 사슬, 두 개의 CD3 사슬, 및 CD3ζ 사슬의 동종이량체를 함유할 수 있다. CD3y, CD35, 및 CD3 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리와의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3y, CD35, 및 CD3 사슬의 막관통 영역은 음으로 하전되며, 이는 이들 사슬이 양으로 하전된 T 세포 수용체 사슬과 결합할 수 있게 하는 특성이다. CD3y, CD35, 및 CD3 사슬의 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 단일 보존 모티프를 각각 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 사슬은 세 개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여한다. 이들 부속 분자는 음으로 하전된 막관통 영역을 가지며 TCR로부터 세포 내로 신호를 전파하는 역할을 한다. CD3-사슬 및 ζ-사슬은 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로 알려진 것을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 두 개의 사슬인 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나, 단쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 결합된 두 개의 별도의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 이종이량체이다.
T 세포 수용체(TCR)는 막관통 단백질이고 자연적으로 가용성 형태로 존재하지 않지만, 항체는 분비될 뿐만 아니라 막에 결합될 수 있다. 중요하게는, TCR은 MHC 분자의 맥락에서 제시될 때, 항체에 비해 원칙적으로 분해된 모든 세포 단백질로부터 생성된 펩티드를 세포내 및 세포외 모두에서 인식할 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, TCR은 중요한 치료 가능성을 갖는다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원 펩티드에 대해 유도된 항원 인식 부분을 함유하는 가용성 T 세포 수용체(sTCR)에 관한 것이다(특히 Walseng E, Wδlchli S, Fallang L-E, Yang W, Vefferstad A, Areffard A, 등(2015) Soluble T-Cell Receptors Produced in Human Cells for Targeted Delivery. PLoS ONE 10(4): e0119559 참조). 특정 구현예에서, 가용성 TCR은 T 세포 항원에 대해 유도된 항체 단편에 융합될 수 있으며, 선택적으로 여기서 표적화된 항원은 CD3 또는 CD16이다(예를 들어, Boudousquie, Caroline 등, "Polyfunctional response by ImmTAC (IMCgp100) redirected CD8+ and CD4+ T cells." Immunology vol. 152,3 (2017): 425~438. doi:10.1111/imm.12779 참조).
특정 구현예에서, 본 개시내용은 HLA-독립적 방식으로 본원에 정의된 (막관통) 키메라 단백질(특히 이전에 정의된 바와 같은 서열번호 1 내지 8202 중 어느 하나의 신생항원성 펩티드)에 결합하는 재조합 HLA-독립적(또는 비-HLA 제한) T 세포 수용체("HI-TCR "로 지칭됨)를 포함한다. 본원에서 의도되고 본 발명에 매우 적합한 "HI-TCR"은 국제 출원 번호 WO 2019/157454에 기술되어 있다. 따라서, 일반적으로 본 개시내용에 따른 HI-TCR은 다음을 포함하는 항원 결합 사슬을 포함한다: (a) HLA-독립적 방식으로 항원에 결합하는 항원 결합 도메인(이전에 정의된 바와 같음)으로, 예를 들어 면역글로불린 가변 영역의 항원 결합 단편; 및 (b) CD3ζ 폴리펩티드와 결합(및 결과적으로 활성화)할 수 있는 불변 도메인. 통상적으로 TCR은 HLA-의존적 방식으로 항원에 결합하기 때문에, HLA-독립적 방식으로 결합하는 항원 결합 도메인은 이종이다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인 또는 이의 단편은: (i) 항체의 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나 이로 이루어진 항원 결합 도메인 및/또는 (ii) 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. TCR의 불변 도메인은, 예를 들어, 천연 또는 변형 TRAC 폴리펩티드, 또는 천연 또는 변형 TRBC 폴리펩티드이다. TCR의 불변 도메인은, 예를 들어, 천연 TCR 불변 도메인(알파 또는 베타) 또는 이의 단편이다. 일반적으로 그 자체가 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체와 달리, HI-TCR은 활성화 신호를 직접 생산하지 않으며; 대신에, 항원 결합 사슬은 CD3ζ 폴리펩티드와 결합하여 결과적으로 이를 활성화시킨다. 재조합 TCR을 포함하는 면역 세포는 항원이 세포 표면에서 세포 당 약 10,000 분자 미만의 낮은 밀도를 가질 때 우수한 활성을 제공한다.
CD3ζ 폴리펩티드는, 예를 들어, 천연 CD3ζ 폴리펩티드 또는 변형 CD3ζ 폴리펩티드이다. CD3ζ 폴리펩티드는 공자극 분자 또는 이의 단편의 세포내 도메인에 선택적으로 융합된다. 대안적으로, 항원 결합 도메인은 항원 결합 사슬이 항원에 결합할 때 면역 반응성 세포를 자극할 수 있는 공자극 영역, 예를 들어 세포내 도메인을 선택적으로 포함한다. 예시적인 공자극 분자는 CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, DAP-10, 이의 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 HI-TCR은 면역 반응성 세포의 내인성 유전자좌, 예를 들어, CD3δ 유전자좌, CD3ε 유전자좌, CD247 유전자좌, B2M 유전자좌, TRAC 유전자좌, TRBC 유전자좌, TRDC 유전자좌 및/또는 TRGC 유전자좌에 통합된 이식유전자에 의해 발현된다. 대부분의 구현예에서, 재조합 HI-TCR의 발현은 내인성 TRAC 또는 TRBC 유전자좌로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 재조합 HI-TCR의 일부분을 암호화하는 이식유전자는 천연 TCR α 사슬 및/또는 천연 TCR β 사슬을 포함하는 TCR의 내인성 발현을 파괴하거나 제거하는 방식으로 내인성 TRAC 및/또는 TRBC 유전자좌에 통합된다. 이러한 파괴는 면역 반응성 세포에서 재조합 TCR과 천연 TCR α 사슬 및/또는 천연 TCR β 사슬 사이의 페어링 오류를 방지하거나 제거한다. 내인성 유전자좌는 변형 전사 종결자 영역, 예를 들어, TK 전사 종결자, GCSF 전사 종결자, TCRA 전사 종결자, HBB 전사 종결자, 소 성장 호르몬 전사 종결자, SV40 전사 종결자, 및 P2A 요소를 포함할 수도 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 재조합 TCR 및 통상적으로 HI-TCR은 제2 세포외 항원 결합 도메인과 이량체화할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 통상적으로, 제2 세포외 항원 결합 도메인은 종양 항원에 결합하되, 바람직하게는, 종양 항원은 pHER95, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL1, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, Erb-B2, Erb-B3, Erb-B4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 엽산 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, κ-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MAGEA3, p53, MART1, GP100, 단백질분해효소3(PR1), 티로시나아제, 서바이빈, hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, BCMA, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, LILRB4, PRAME, 및 ERBB로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 키메라 폴리펩티드(또는 단백질) 및 특히 본원에 정의된 바와 같은 서열번호 1 내지 8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 대해 유도되는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, CAR은 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인을 포함한다. CAR은 TCR 복합체의 신호 전달 도메인에 결합된 항체로부터 일반적으로 유래되는 항원 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. CAR은 선택된 적절한 항원 결합 도메인으로 이전에 정의된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드에 대해 T 세포 또는 NK T 세포와 같은 면역 세포를 유도하는 데 사용될 수 있다.
CAR의 항원 결합 도메인은 일반적으로 항체로부터 유래된 scFv(단쇄 가변 단편)에 기초한다. N-말단, 세포외 항체 결합 도메인 이외에, CAR은 일반적으로 항원 결합 도메인을 발현되는 면역 효과기 세포의 형질막으로부터 멀리 연장시키기 위한 스페이서로서 기능하는 힌지 도메인, 막관통(TM) 도메인, 세포내 신호 전달 도메인(예를 들어, TCR 복합체의 CD3 분자의 제타 사슬(CD3ζ)로부터의 신호 전달 도메인, 또는 등가물) 및 선택적으로 CAR을 발현하는 세포의 신호 전달 또는 기능을 도울 수 있는 하나 이상의 공자극 도메인을 포함할 수 있다. CD28, OX-40(CD134), 및 4-1BB(CD137)를 포함하는 공자극 분자로부터의 신호 전달 도메인은 단독으로(2세대) 또는 조합하여(3세대) 첨가되어 CAR 변형된 T 세포의 생존을 향상시키고 증식을 증가시킬 수 있다. 잠재적 공자극 도메인은 또한 ICOS-1, CD27, GITR, 및 DAP10을 포함한다.
따라서, CAR은 다음을 포함할 수 있다
(1) 그의 세포외 부분에, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 항체의 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자, 및 통상적으로 이전에 정의된 하나 이상의 항원 결합 도메인.
(2) 이의 막관통 부분에, 인간 T 세포 수용체-알파 사슬 또는 수용체-베타 사슬, CD3 제타 사슬, CD28, CD3-엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR로부터 유래된 막관통 도메인. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 유래된다.
(3) 인간 CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10, 및 GITR(AITR)로부터 유래된 공자극 도메인과 같은 하나 이상의 공자극 도메인. 일부 구현예에서, CAR은 CD28 및 4-1BB 둘 모두의 공자극 도메인을 포함한다.
(4) 이의 세포내 신호 전달 도메인에, 하나 이상의 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인, 예를 들어, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타, 또는 하나 또는 두 개의 ITAM(예를 들어, ITAM3 및 ITAM2)이 결여된 이의 변이체이거나, 세포내 신호 전달 도메인은 FcεRIγ로부터 유래된다.
CAR은 종양 신생항원성 펩티드를 단독으로 또는 HLA 또는 MHC 분자와 관련되어 인식하도록 설계될 수 있다.
항원에 결합하는 데 사용되는 모이어티는 세 개의 일반적인 카테고리, 즉 항체로부터 유래된 단쇄 항체 단편(scFv), 라이브러리로부터 선택된 Fab, 또는 (1세대 CAR에 대해) 동족 수용체와 결합하는 천연 리간드를 포함한다. 이들 카테고리 각각의 성공적인 예는 특히 Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor(CAR) design. Cancer discovery. 2013; 3(4):388~398(특히 표 1 참조)에 보고되어 있으며 본 출원에 포함된다.
항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하고, 추가로 친화도 성숙되고 전술한 바와 같이 선택될 수 있다. 설치류 면역글로불린(예를 들어, 마우스, 랫트)으로부터 유래된 키메라 또는 인간화 scFv는 잘 특성화된 단클론 항체로부터 쉽게 유래되기 때문에 일반적으로 사용된다. 인간화 항체는 설치류-서열 유래 CDR 영역을 함유하며; 일반적으로 설치류 CDR은 인간 프레임워크에 생착되고, 인간 프레임워크 잔기 중 일부는 친화도를 보존하기 위해 원래의 설치류 프레임워크 잔기로 역돌연변이될 수 있고/있거나, CDR 잔기 중 하나 또는 일부는 친화도를 증가시키도록 돌연변이될 수 있다. 완전한 인간 항체는 쥣과 서열을 갖지 않으며, 일반적으로 인간 항체 라이브러리의 파지 디스플레이 기술, 또는 천연 면역글로빈 유전자좌가 인간 면역글로불린 유전자좌의 분절로 대체된 유전자이식 마우스의 면역화를 통해 생산된다. 고유 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 항체의 변이체가 생산될 수 있으며, 여기서 항체는 그의 특이적 결합 기능을 유지하거나 실질적으로 보유한다. 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있으며 전술한 바와 같다. 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 추가 변이체가 또한 생산될 수 있다.
일반적으로, CAR은 항체 분자로부터 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인, 예컨대 단클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다.
일부 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호 전달 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 회피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형되어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS 또는 GITR의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된 것들을 포함한다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함함). 막관통 도메인은 또한 합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 존재하고, CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 결합을 형성한다.
CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 1세대 CAR은 일반적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 일차 송신기인 CD3 ζ-사슬로부터의 세포내 도메인을 가졌다. 2세대 CAR은 일반적으로 다양한 공자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB(CD28), ICOS)에서 CAR의 세포질 꼬리까지 세포내 신호 전달 도메인을 추가로 포함하여 T 세포에 추가 신호를 제공한다. 공자극 도메인은 인간 CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10, 및 GITR(AITR)로부터 유래된 도메인을 포함한다. 두 개의 공자극 도메인, 예를 들어 CD28 및 4-1BB, 또는 CD28 및 OX40의 조합이 고려된다. 3세대 CAR은 CD3z-CD28-4-1BB 또는 CD3z-CD28-OX40과 같은 다수의 신호 전달 도메인을 결합하여 효능을 증가시킨다.
세포내 신호 전달 도메인은 T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3+ 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분으로부터 유래될 수 있다. 대안적인 세포내 신호 전달 도메인은 FcεRIγ를 포함한다. 세포내 신호 전달 도메인은 이의 세 개의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 중 하나 또는 두 개가 결여된 변형된 CD3 제타 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 ITAM은 ITAM1, ITAM2 및 ITAM3이다(N-말단에서 C-말단으로 번호가 매겨짐). CD3-제타의 세포내 신호 전달 영역은 서열번호 4의 잔기 22~164이다. ITAM1은 아미노산 잔기 61~89 주위, ITAM2는 아미노산 잔기 100~128 주위, 그리고 ITAM3은 잔기 131~159 주위에 위치한다. 따라서, 변형된 CD3 제타 폴리펩티드는 불활성화된 ITAM1, ITAM2, 또는 ITAM3 중 어느 하나를 가질 수 있다. 대안적으로, 변형된 CD3 제타 폴리펩티드는 불활성화된 임의의 두 개의 ITAM, 예를 들어 ITAM2 및 ITAM3, 또는 ITAM1 및 ITAM2를 가질 수 있다. 바람직하게는, ITAM3은 불활성화, 예를 들어 결실된다. 보다 바람직하게는, ITAM2 및 ITAM3은 불활성화, 예를 들어 결실되어 ITAM1을 남긴다. 예를 들어, 하나의 변형된 CD3 제타 폴리펩티드는 ITAM1만을 보유하고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90~164). 또 다른 예로서, ITAM1은 ITAM3의 아미노산 서열로 치환되고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90~164). 예를 들어, Bridgeman 등, Clin. Exp. Immunol. 175(2): 258~67(2014); Zhao 등, J. Immunol. 183(9): 5563~74(2009); Maus 등, WO 2018/132506; Sadelain 등, WO/2019/133969, Feucht 등, Nat Med. 25(1):82~88(2019)을 참조한다.
따라서, 일부 양태에서, 항원 결합 도메인은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인, 및/또는 다른 CD 막관통 도메인을 포함한다. CAR은 또한 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 연결 시, CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 전달 도메인은 상응하는 조작되지 않은 면역 세포(통상적으로 T 세포)의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, CAR은 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 사이토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은 T 세포의 기능을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인(들)은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열, 및 일부 양태에서, 항원 특이적 수용체 결합 후 신호 변환을 개시하기 위해 자연적 맥락에서 이러한 수용체와 함께 작용하는 공동 수용체의 세포질 서열, 및/또는 이러한 분자의 변이체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
T 세포 활성화는 두 가지 부류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개되는 것으로 기술된 일부 양태에서: TCR을 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 서열(일차 세포질 신호 전달 서열), 및 이차 또는 공자극 신호(이차 세포질 신호 전달 서열)를 제공하기 위해 항원-비의존적 방식으로 작용하는 서열이다. 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 자극 방식 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내의 세포질 신호 전달 분자(들)는 세포질 신호 전달 도메인, 이의 일부, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
CAR은 또한 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS와 같은 공자극 수용체의 신호 전달 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 성분 및 공자극 성분 둘 다를 포함하며; 대안적으로, 활성화 도메인은 하나의 CAR에 의해 제공되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, CAR은 다음을 포함할 수 있다:
(1) 이의 세포외 부분에, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 항체의 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 일부, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인(중쇄 및/또는 경쇄), 및/또는 항체 분자.
(2) 이의 막관통 부분에, 인간 T 세포 수용체-알파 사슬 또는 수용체-베타 사슬, CD3 제타 사슬, CD28, CD3-엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR로부터 유래된 막관통 도메인. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 유래된다.
(3) 인간 CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10, 및 GITR(AITR)로부터 유래된 공자극 도메인과 같은 하나 이상의 공자극 도메인. 일부 구현예에서, CAR은 CD28 및 4-1BB 둘 모두의 공자극 도메인을 포함한다.
(4) 이의 세포내 신호 전달 도메인에, 하나 이상의 ITAM을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인(들), 예를 들어: CD3-제타, 또는 하나 또는 두 개의 ITAM(예를 들어: ITAM3 및/또는 ITAM2, 또한 상기 상술한 것과 같이 참조하고 문헌을 참조)이 결여된 이의 변이체, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및/또는 CD66d으로부터의 세포내 신호 전달 도메인 또는 이의 부분, 특히 CD3-제타, 또는 하나 또는 두 개의 ITAM(예를 들어: ITAM3 및/또는 ITAM2)이 결여된 이의 변이체의 세포내 도메인, 또는 FcεRIγ 또는 이의 변이체의 세포내 신호 전달로부터 선택된 세포내 신호 전달 도메인 또는 이의 부분.
CAR 또는 다른 항원 특이적 수용체는 또한 억제 CAR(예를 들어, iCAR)일 수 있고, 면역 반응과 같은 반응을 약화시키거나 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 이러한 세포내 신호 전달 성분의 예는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함하는 EP2/4 아데노신 수용체를 포함하는 면역 체크포인트 분자에서 발견되는 것들이다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 세포의 반응을 약화시키는 역할을 하도록, 이러한 억제 분자의 신호 전달 도메인을 포함하거나 이로부터 유래된 억제 CAR을 포함한다. 이러한 CAR은, 예를 들어, 활성화 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 항원이 정상 세포의 표면에서 발현되거나 발현될 수 있을 때 표적 외 효과의 가능성을 감소시키기 위해 사용된다.
CAR 및 재조합 TCR을 포함하는 예시적인 항원 수용체뿐만 아니라 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, WO2019157454, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 제6,451,995호, 제7,446,190호, 제8,252,592호, 제8,339,645호, 제8,398,282호, 제7,446,179호, 제6,410,319호, 제7,070,995호, 제7,265,209호, 제7,354,762호, 제7,446,191호, 제8,324,353호 및 제8,479,118호, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에 기술된 것들 및/또는 Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388~398; Davila 등(2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633~39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160~75에 의해 기술된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 유전적으로 조작된 항원 수용체는 미국 특허 제7,446,190호에 기술된 것과 같은 CAR, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 Al에 기술된 것들을 포함한다.
본 개시내용은 또한 전술한 바와 같은 항체, 항원 결합 단편 또는 이의 유도체, TCR 및 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 상기 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 벡터를 포함한다.
면역 세포
본 개시내용은 면역 세포, 특히 전술한 바와 같은 하나 이상의 종양 신생항원성 펩티드를 표적으로 하는 분리된 면역 세포를 추가로 포함한다. 보다 구체적인 구현예에서, 본 개시내용은 면역 세포, 특히 이전에 정의된 바와 같은 재조합 CAR 또는 TCR을 발현하는 분리된 면역 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 조혈 기원이고 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 포함한다. 면역 세포는 B 세포 및 T 세포와 같은 림프구, 자연 살해 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염구 및 과립구와 같은 골수 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "T 세포"는 T 세포 수용체(TCR), 특히 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드에 대해 유도된 TCR을 갖는 세포를 포함한다. 본 개시내용에 따른 T 세포는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 점막 관련 불변 T 세포(MAIT), Υδ T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 1형 및 2형 헬퍼 T 세포가 둘 다 포함된 헬퍼 T 림프구 및 Th17 헬퍼 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 상기 면역 세포는 건강한 공여자 또는 암을 앓고 있는 대상체로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 동종 또는 자가 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, TIL/종양 유래 CD8 T 세포, 중앙 기억 CD8+ T 세포, Treg, MAIT, Υδ T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로부터 선택된다.
면역 세포는 혈액으로부터 추출되거나 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로는 비인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적인 인간 세포는 CD34+ 세포이다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 FICOLL™ 분리와 같은 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 채취한 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 대상체의 순환하는 혈액 유래의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, T 세포는 PBMC로부터 분리된다. PBMC는 전혈의 밀도 구배 원심분리, 예를 들어 LYMPHOPREP™ 구배, PERCOLL™ 구배 또는 FICOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 수득된 버피 코트(buffy coat)로부터 분리될 수 있다. T 세포는 단핵구의 고갈에 의해, 예를 들어 CD14 DYNABEADS®를 사용하여 PBMC로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구는 밀도 구배 원심분리 전에 용해될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 대상체로부터 유래될 수 있다. 세포는 자가 또는 동종일 수 있다.
동종 면역 세포 요법에서, 면역 세포는 환자보다는 건강한 공여자로부터 수집된다. 일반적으로 이들은 HLA 일치되어 이식편 대 숙주 질환의 가능성을 감소시킨다. 대안적으로, HLA 매칭을 필요로 하지 않을 수 있는 보편적인 '기성품' 제품은 TCRαβ 수용체의 파괴 또는 제거와 같은 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 설계된 변형을 포함한다. 검토를 위해 Graham 등, Cells. 2018 Oct; 7(10): 155을 참조한다. 단일 유전자가 베타 사슬을 암호화하는 두 개의 유전자보다는 알파 사슬(TRAC)을 암호화하기 때문에, TRAC 유전자좌는 TCRαβ 수용체 발현을 제거하거나 파괴하기 위한 전형적인 표적이다. 대안적으로, TCRαβ 신호 전달의 억제제가 발현될 수 있는데, 예를 들어, CD3ζ의 절단된 형태는 TCR 억제 분자로서 작용할 수 있다. HLA 클래스 I 분자의 파괴 또는 제거가 또한 사용되어 왔다. 예를 들어, Torikai 등(Blood. 2013;122:1341~1349)은 ZFN을 사용하여 HLA-A 유전자좌를 녹아웃한 반면, Ren 등(Clin. Cancer Res. 2017;23:2255~2266)은 HLA 클래스 I 발현에 필요한 베타-2 마이크로글로불린(B2M)을 녹아웃하였다. Ren 등은 TCRαβ, B2M 및 면역-체크포인트 PD1을 동시에 녹아웃하였다. 일반적으로, 면역 세포는 입양 세포 요법에 이용되도록 활성화되고 증식된다. 본원에 개시된 바와 같은 면역 세포는 생체 내 또는 생체 외에서 증식될 수 있다. 면역 세포, 특히 T 세포는 일반적으로 당업계에 알려진 방법을 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다. 일반적으로 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면의 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과 접촉함으로써 증식된다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역 세포는 이전에 정의된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드에 유도되도록 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 면역 세포는 상기 신생항원성 펩티드의 세포 표면에 유도된 재조합 항원 수용체를 발현할 수 있다. "재조합"은 자연 상태에서 세포에 의해 암호화되지 않는 항원 수용체, 즉 이종, 비-내인성인 항원 수용체를 의미한다. 따라서, 재조합 항원 수용체의 발현은 면역 세포에 새로운 항원 특이성을 도입하여, 세포가 이전에 기술된 펩티드를 인식하고 결합하게 하는 것으로 볼 수 있다. 항원 수용체는 임의의 유용한 공급원으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 암호화하는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하되, 항원은 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 종양 신생항원성 펩티드를 포함한다.
본 개시내용에 따른 항원 수용체 중에는 유전적으로 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 성분뿐만 아니라 전술한 바와 같은 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원 수용체가 있다.
면역 세포가 재조합 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자는, 예를 들어 벡터, 또는 임의의 다른 적합한 핵산 작제물의 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 및 이의 필요한 성분은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 PCR을 사용하는 분자 클로닝을 사용하여 생성될 수 있다. 항원 수용체 서열은 부위 지향 돌연변이 유발과 같은 일반적으로 사용되는 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 면역 세포는 (a) SUV39H1 유전자가 불활성화되고, (b) 항원 특이적 수용체는 이전에 정의된 바와 같은 이종(또는 재조합) 항원 결합 도메인 및 천연 TCR 불변 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 TCR이고, 항원 특이적 수용체는 CD3 제타 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있는 세포이다. 예를 들어, 면역 세포는, 예를 들어 이전에 정의된 바와 같이, 적어도 하나의 키메라 공자극 수용체(CCR) 및/또는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체를 추가로 포함할 수 있다.
관련 양태에서, 면역 세포는, 특히 동종이계인 경우, 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 설계될 수 있어서, 세포는 불활성화된(예를 들어, 파괴되거나 결실된) TCRαβ 수용체를 포함한다. 이러한 경우, (일반적으로 이전에 정의된 바와 같은) HI-TCR의 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산은 면역 세포의 내인성 TRAC 유전자좌 및/또는 TRBC 유전자좌 내에 편리하게 삽입된다. HI-TCR 핵산 서열의 삽입 또는 다른 더 작은 돌연변이는 천연 TCR 알파 사슬 및/또는 천연 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR의 내인성 발현을 파괴하거나 제거할 수 있다. 삽입 또는 돌연변이는 내인성 TCR 발현을 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 감소시킬 수 있다. 단일 유전자가 베타 사슬을 암호화하는 두 개의 유전자보다는 알파 사슬(TRAC)을 암호화하기 때문에, TRAC 유전자좌는 TCRαβ 수용체 발현을 감소시키기 위한 전형적인 표적이다. 따라서, 항원 특이적 수용체(예를 들어, CAR 또는 TCR)를 암호화하는 핵산은 바람직하게는 제1 엑손의 5' 영역(서열번호 3)의 위치에서 TRAC 유전자좌에 통합될 수 있으며, 이는 기능적 TCR 알파 사슬의 발현을 상당히 감소시킨다. 예를 들어, Jantz 등, WO 2017/062451; Sadelain 등, WO 2017/180989; Torikai 등, Blood, 119(2): 5697~705(2012); Eyquem 등, Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113~117을 참조한다. 내인성 TCR 알파의 발현은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 감소될 수 있다. 이러한 구현예에서, 항원 특이적 수용체를 암호화하는 핵산의 발현은 선택적으로 내인성 TCR-알파 또는 내인성 TCR-베타 프로모터의 제어 하에 있다.
선택적으로, 면역 세포는 또한 단일 활성 ITAM 도메인을 갖는 변형된 CD3을 포함하고, 선택적으로 CD3은 하나 이상의 또는 둘 이상의 공자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CD3은 2개의 공자극 도메인, 선택적으로 CD28 및 4-1BB를 포함한다. 단일 활성 ITAM 도메인을 갖는 변형된 CD3은, 예를 들어, ITAM2 및 ITAM3이 불활성화되었거나, ITAM1 및 ITAM2가 불활성화된 변형된 CD3 제타 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 CD3 제타 폴리펩티드는 ITAM1만을 보유하고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90~164). 또 다른 예로서, ITAM1은 ITAM3의 아미노산 서열로 치환되고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90~164).
본원에 개시된 변형된 면역 세포는 전술한 양태 중 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 변형된 면역 세포는 (a) 항원 특이적 수용체가 (일반적으로 이전에 정의된 바와 같은) 이종(또는 재조합) 항원 결합 도메인 및 천연 TCR 불변 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 TCR이고, 항원 특이적 수용체는 CD3 제타 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있고/있거나, 항원 특이적 수용체는 CAR이고, 선택적으로 (b) SUV39H1 유전자가 불활성화되고, 선택적으로 (c) 면역 세포가, 예를 들어, ITAM2 및 ITAM3이 불활성화된 단일 활성 ITAM 도메인을 갖는 변형된 CD3을 포함하고, 선택적으로 (d) TCR은 내인성 TRAC 및/또는 TRBC 프로모터의 제어 하에 있고, 선택적으로 (e) 천연 TCR-알파 사슬 및/또는 천연 TCR-베타 사슬의 발현이 파괴되거나 제거된 면역 세포이다. 추가 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 키메라 공자극 수용체(CCR)를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 면역 세포, 및 특히 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드를 표적으로 하는 T 세포 집단, 특히 면역 세포 및 특히 TCR, 특히 이전에 정의된 바와 같은 HLA 독립 TCR(HI TCR) 또는 CAR을 발현하는 T 세포 집단을 제공하는 방법에 관한 것이다.
T 세포 집단은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따라 생산된 면역 세포 집단은 본 개시내용의 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질, 특히 서열번호 1 내지 8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 특이적인, 즉 이를 표적으로 하는 면역 세포로 농축될 수 있다. 즉, 본 개시내용에 따라 생산되는 면역 세포 집단은 하나 이상의 종양 신생항원성 펩티드(즉, 신생항원성 펩티드를 표적으로 하는 클론형이 풍부함) 또는 하나 이상의 키메라 단백질을 표적으로 하는 면역 세포의 수가 증가할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 면역 세포 집단은 대상체로부터 분리된 샘플의 면역 세포와 비교하여 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질을 표적으로 하는 면역 세포의 수가 증가할 것이다. 즉, 면역 세포 집단의 조성은 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질을 표적으로 하는 면역 세포의 백분율 또는 비율이 증가될 것이라는 점에서 "천연" 면역 세포 집단(즉, 본원에서 논의된 식별 및 증식 단계를 거치지 않은 집단)의 조성과 상이할 것이다.
본 개시내용에 따른 면역 세포 집단은 본원에 개시된 바와 같은 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질을 표적으로 하는, 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%의 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, 면역 세포 집단은 본 개시내용의 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질을 표적으로 하는, 약 0.2%~5%, 5%~10%, 10~20%, 20~30%, 30~40%, 40~50%, 50~70% 또는 70~100%의 면역 세포를 가질 수 있다.
종양 신생항원성 펩티드/또는 키메라 단백질-반응성 면역 세포의 확장된 집단은, 예를 들어, 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질에 이들 세포를 노출시킬 때, 증식되지 않은 면역 세포의 집단보다 더 높은 활성을 가질 수 있다. "활성"에 대한 언급은 종양 신생항원성 펩티드(예를 들어, 확장에 사용된 펩티드에 상응하는 펩티드) 또는 종양 신생항원성 펩티드의 혼합물 또는 본원에 정의된 바와 같은 키메라 단백질(또는 이의 단편, 일반적으로는 이의 세포외 단편) 또는 키메라 단백질(또는 이의 단편, 일반적으로는 이의 세포외 단편)의 혼합물로 재자극하는 것에 대한 면역 세포 집단의 반응을 나타낼 수 있다. 반응을 분석하기 위한 적절한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 사이토카인 생성이 측정될 수 있다(예를 들어, IL2 또는 IFNy 생성이 측정될 수 있음). "더 높은 활성"에 대한 언급은, 예를 들어, 활성의 1~5배, 5~10배, 10~20배, 20~50배, 50~100배, 100~500배, 500-1000배 증가를 포함한다. 일 양태에서, 활성은 1000배 보다 높을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용은 면역 세포의 복수 또는 집단, 즉 하나 초과의 면역 세포를 제공하며, 여기서 복수의 면역 세포는 면역 세포, 특히 클론 종양 신생항원성 펩티드를 인식하는 T 세포 및 상이한 클론 종양 신생항원성 펩티드를 인식하는 T 세포를 포함한다. 이와 같이, 본 개시내용은 상이한 클론 종양 신생항원성 펩티드를 인식하는 복수의 면역 세포, 특히 T 세포를 제공한다. 복수 또는 집단에서 상이한 면역 세포, 특히 T 세포는 대안적으로 동일한 종양 신생항원성 펩티드 및 키메라 단백질의 상이한 에피토프를 인식하는 상이한 TCR을 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 복수의 T 세포에 의해 인식되는 하나 이상의 키메라 단백질(들)의 클론 종양 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질 또는 에피토프의 수는 2 내지 1000이다. 예를 들어, 인식되는 클론 신생항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000, 바람직하게는 2 내지 100일 수 있다. 상이한 TCR을 갖지만 동일한 클론 신생항원을 인식하는 복수의 면역 세포, 특히 T 세포가 있을 수 있다.
면역 세포 및 특히 T 세포 집단은 CD8+ T 세포로 전부 또는 주로 구성되거나, CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 혼합물로 전부 또는 주로 구성되거나, CD4+ T 세포로 전부 또는 주로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, T 세포 집단은 암 환자 또는 건강한 공여자로부터 분리된 T 세포로부터 생성된다. 예를 들어, T 세포 집단은 종양 보유 환자로부터 분리된 샘플의 T 세포로부터 생성될 수 있다. 샘플은 종양 샘플, 말초 혈액 샘플 또는 대상체의 다른 조직으로부터의 샘플일 수 있다.
특정 구현예에서, 면역 세포 집단은 종양 신생항원성 펩티드가 식별된 종양으로부터 유래한 샘플로부터 생성된다. 즉, 면역 세포 및 특히 T 세포 집단은 암 환자의 종양으로부터 유래된 생물학적 시편으로부터 분리된다. 이러한 T 세포는 본원에서 '종양 침윤 림프구'(TIL)로서 지칭된다.
T 세포는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3, CD4 또는 CD8의 발현에 기초하여 샘플로부터 생성된 단일 세포 현탁액으로부터 정제될 수 있다. T 세포는 피콜-불투과성(Ficoll-paque) 구배를 통과시킴으로써 샘플로부터 농축될 수 있다.
암 치료 방법
구현예 중 어느 하나에서, 본원에 기술된 암 치료제는 암세포의 증식을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 암 치료제는 암을 앓고 있는 환자에서 암의 치료, 또는 암의 위험이 있는 환자에서 암의 예방적 치료에 사용될 수도 있다.
본원에 기술된 요법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 이전에 정의된 바와 같은 임의의 고형 또는 비-고형 종양을 포함한다. 본 개시내용에 따른 특정 관심 대상은 유방암, 흑색종 및 폐암이다.
암은 또한 다른 화학요법제 치료에 불응성인 암을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불응성"은 다른 화학요법제로 치료한 후 항증식 반응을 보이지 않거나 약한 항증식 반응만을 보인(예를 들어, 종양 성장의 억제가 없거나 약함) 암(및/또는 이의 전이)을 지칭한다. 이들은 다른 화학요법제로 만족스럽게 치료될 수 없는 암이다. 불응성 암은 (i) 하나 이상의 화학요법제가 환자의 치료 중에 이미 실패한 암뿐만 아니라, (ii) 다른 수단, 예를 들어 화학요법제의 존재 하에 생검 및 배양에 의해 불응성인 것으로 나타날 수 있는 암을 포함한다.
본원에 기술된 요법은 또한 이전에 치료받은 적이 없는, 이를 필요로 하는 환자의 치료에도 적용 가능하다.
본 개시내용에 따른 대상체는 일반적으로 암으로 진단되었거나 암 발생 위험이 있는, 이를 필요로 하는 환자이다. 대상체는 일반적으로 인간, 개, 고양이, 말 또는 종양 특이적 면역 반응이 요구되는 임의의 동물이다.
본 개시내용은 또한 신생항원성 펩티드, APC 집단, 백신 또는 면역원성 조성물, 대상체의 암 예방접종 요법에 사용하기 위해 또는 대상체에서 암을 치료하기 위해 이전에 정의된 바와 같은 신생항원성 펩디드 또는 벡터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 펩티드(들)는 상기 대상체의 적어도 하나의 MHC 분자에 결합한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체를 치료하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 백신 또는 면역원성 조성물을 치료적 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법은 암을 가진 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계, 및 암을 가진 대상체에게 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 면역 세포를 상기 대상체를 치료하기 위한 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체의 암 치료에 사용하기 위한 항체(이의 변이체 및 유도체 포함), T 세포 수용체(TCR)(이의 변이체 및 유도체 포함), 본원에 기술된 막관통 키메라 단백질에 대해 유도되는 비-HLA 제한 TCR(HI TCR), 또는 CAR(이의 변이체 및 유도체 포함), 또는 일반적으로 MHC 또는 HLA 분자와 결합된 신생항원성 펩티드에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 항체, TCR(특히 비-HLA 제한 TCR) 또는 CAR은 본원에 정의된 막관통 키메라 단백질 및 특히 서열번호 1~8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 결합한다. 일반적으로, 상기 항체, TCR(특히 비-HLA 제한 TCR) 또는 CAR은 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인(서열번호 1~8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 결합함)을 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 입양 세포 또는 CAR-T 세포 요법에 사용하기 위한 항체(이의 변이체 및 유도체 포함), 본원에 기술된 바와 같은, 종양 신생항원성 펩티드(일반적으로 MHC 또는 HLA 분자와 결합함)에 대해 유도된 또는 키메라 단백질에 대해 유도된 T 세포 수용체(TCR)(이의 변이체 및 유도체 포함) 또는 CAR(이의 변이체 및 유도체 포함), 또는 이전에 정의된 바와 같은 신생항원성 펩티드 또는 키메라 단백질을 표적으로 하는 면역 세포에 관한 것으로서, 여기서 종양 신생항원성 펩티드는 상기 대상체의 적어도 하나의 MHC 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항체, TCR(특히 비-HLA 제한 TCR) 또는 CAR은 본원에 정의된 막관통 키메라 단백질 및 특히 서열번호 1~8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 결합한다. 일반적으로, 상기 항체, TCR(특히 비-HLA 제한 TCR) 또는 CAR 결합은 이전에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인(서열번호 1~8202 중 어느 하나의 막관통 키메라 단백질에 결합함)을 포함한다. 따라서 일반적으로 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 정의된 바와 같은 막관통 키메라를 표적으로 한다. 일반적으로, 당업자는 암 세포 요법에 사용하기 위해 사용될 면역 세포를 재유도하기 위해 이전에 정의된 바와 같이 종양 신생항원성 펩티드에 결합하여 이를 인식하는 적절한 항원 수용체를 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 면역 세포는 재유도된 T 세포, 예를 들어 재유도된 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 전술한 바와 같은 암 치료, 백신접종 요법 및/또는 입양 세포 암 요법은 추가적인 암 요법과 조합하여 투여된다. 특히, 본 개시내용에 따른 T 세포 조성물은 체크포인트 차단 요법, 공자극 항체, 화학요법 및/또는 방사선요법, 표적 요법 또는 단클론 항체 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
체크포인트 억제제는 예를 들어 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, Lag-3 억제제, Tim-3 억제제, TIGIT 억제제, BTLA 억제제, T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA) 억제제 및 CTLA-4 억제제, IDO 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 공자극 항체는 ICOS, CD137, CD27 OX-40 및 GITR을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역 조절 수용체를 통해 양성 신호를 전달한다. 바람직한 구현예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 화학요법 엔티티는 세포에 파괴적인 엔티티, 즉 엔티티가 세포의 생존력을 감소시키는 엔티티를 지칭한다. 화학요법 엔티티는 세포독성 약물일 수 있다. 고려되는 화학요법제는, 제한 없이, 알킬화제, 안트라사이클린, 에포틸론, 니트로소우레아, 에틸레니민/메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 알킬화제, 항대사물, 피리미딘 유사체, 에피포도필로독소, L-아스파라기나제와 같은 효소; IFNa, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF와 같은 생물학적 반응 조절제; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 배위 복합체, 안트라센디온, 하이드록시우레아와 같은 치환된 우레아, N-메틸히드라진(MIH) 및 프로카바진을 포함하는 메틸히드라진 유도체, 미토탄(ο,ρ'-DDD)과 같은 부신피질 억제제 및 아미노글루테티미드; 프레드니손 및 등가물과 같은 부신코르티코스테로이드 길항제를 포함하는 호르몬 및 길항제, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드; 프로게스틴, 예컨대 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물과 같은 에스트로겐; 타목시펜과 같은 항에스트로겐; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐; 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 성선 자극 호르몬-방출 호르몬 유사체 및 루프롤라이드; 및 플루타미드와 같은 비스테로이드성 항안드로겐을 포함한다.
'병용으로'는 본 개시내용에 따른 T 세포 조성물의 투여 전, 동시에 또는 후에 추가 요법의 투여를 지칭할 수 있다.
체크포인트 차단과의 조합에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 T 세포 조성물은 또한 TALEN 및 Crispr/Cas를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전자 편집 기술을 사용하여 면역 체크포인트에 내성을 갖도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 US20140120622를 참조한다. 유전자 편집 기술은 PD-1, Lag-3, Tim-3, TIGIT, BTLA CTLA-4 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포에 의해 발현되는 면역 체크포인트의 발현을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같은 T 세포는 이들 방법 중 어느 하나에 의해 변형될 수 있다.
본 개시내용에 따른 T 세포는 또한 종양 내로 귀소를 증가시키는 분자를 발현하고/하거나 사이토카인, 가용성 면역 조절 수용체 및/또는 리간드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 종양 미세환경 내로 염증 매개체를 전달하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
실시예
1. 실시예 1: 융합 전사 서열 암호화된 종양 신생항원성 펩티드의 식별
1.1 마우스에서의 개념 증명
융합 전사 서열로부터 발행된 개별 및 공유 종양 신생항원성 펩티드를 검출하기 위해, 생물정보학 파이프라인이 개발되었다. 이 파이프라인은 부분적으로는 TE 서열 및 부분적으로는 엑손 서열로 구성된 종양 특이적 mRNA 서열을 식별하도록 설계된다. 이러한 파이프라인은 MHC 대립유전자를 결정하는 것을 의미한다. 각각의 인간 샘플에 대해, 클래스 I 및 클래스 II MHC 대립유전자는 seq2hla(v2.2) 툴(bitbucket.org/sebastian_boegel/seq2hla)을 사용하여 결정될 수 있다. 마우스 모델의 경우, 쥣과 H-2 대립유전자가 일반적으로 공지되어 있다. 생물정보학 방법은 기준 게놈에 대한 RNA-시퀀싱으로부터의 전사체를 맵핑하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 개념 증명 분석을 위해, mm10을 마우스에게 사용하고 hg19를 인간에게 사용하였다. 조립된 게놈의 상이한 버전, 예를 들어 hg19, hg38, mm9 또는 mm10이 사용될 수 있다. 이 맵핑은 STAR(v2.5.3a)(github.com/alexdobin/STAR)로 수행되며, 다음 설정을 갖는다:
- 최대 유전자좌 수를 설정하는 파라미터 outFilterMultimapNmax를 맵핑하는 다중 히트를 허용하기 위해, 해독은 맵핑되도록 허용되며, 1000으로 설정되고,
- 비정상적인 접합부(융합)를 검출하기 위해, 융합 세그먼트의 최소 길이를 설정하는 파라미터 chimSegmentMin은 10으로 설정되고, 융합 접합부에 대한 최소 오버행을 설정하는 파라미터 chimJunctionOverhangMin은 10으로 설정된다.　
정상(SJ.out.tab 출력 파일) 및 비정상( Chimeric.out.junction 출력 파일) 접합부는 Ensembl 및 repeatmasker 데이터베이스를 사용하여 주석이 달린다. 정상 접합부는 맵핑에 사용된 파라미터와 일치하는 모든 접합부(최대 인트론 길이 <= 1 000 000 bp(--alignIntronMax에 의해 설정됨), 동일한 염색체 및 잘 배향됨)를 정의하고, 비정상적인 접합부는 이전 기준 중 적어도 하나와 일치하지 않는 접합부이다. 이는 TE/엑손 접합부가 두 접합부 유형에 속할 수 있지만 엑손/엑손 접합부는 정상 파일(SJ.out.tab)에 속해야 한다는 것을 의미한다. TE 서열과 엑손 서열 사이의 접합부를 포함하는 전사 서열은 인 실리코로 추출된다. 프레임을 벗어나는 경우(해독 프레임 비정규) 접합부와 중첩되는 전사 서열의 영역 또는 접합부의 하류로부터, 소프트웨어는 모든 해독 프레임에서 8 또는 9량체의 모든 가능한 펩티드를 예측한다. 그런 다음, 매칭된 샘플에 대해 이전에 정의된 MHC 대립유전자에 대한 이들 가능한 모든 펩티드의 결합 친화도를 netMHCpan(v3.4)(cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)으로 결정한다. 현재 펩티드의 결합 친화도를 예측하기 위한 수십 개 이상의 다양한 예측 알고리즘이 있으며, NetMHC는 신생항원 예측 파이프라인에 대해 가장 널리 사용되고 검증된 알고리즘이다.
500nM 미만 또는 2% 미만의 백분위 수를 갖는 펩티드는 잠재적 신생항원으로서 간주된다. 각각의 스플라이싱 부위(공여체 또는 수용체)는 TE 또는 엑손으로서 고유하게 주석 처리된다. 5' 말단의 부분은 적격 "공여체"이고, 3'의 부분은 적격 "수용체"이다.
암과 정상 조직 간에 공유된 예측된 HLA 결합 펩티드는 추가 분석에서 제외된다.
이 방법은 7개의 잘 특성화된 쥣과 종양 세포주(B16F10, B16F10-OVA, MCA101, MCA101-OVA, MC38, MC38-GFP, MC38-GFP-OVA)로부터 수득된 RNAseq 데이터에 적용되었다. 연장-OVA를 갖는 세포주는 동일한 모델에 상응하지만 난알부민을 추가로 발현한다. 본 연구에서, 이 세포주는 유사한 모델로서 간주되는데, 즉, 예를 들어 B16F10-OVA로부터 유래한 세포주에 대해 수행된 검정은 B16F10으로부터 유래한 세포주에 대해 수행된 검정의 반복으로서 간주된다.
후보 펩티드의 목록은 이들 파라미터(도 1a, 1b 및 1c)로 수득되었고, 일부는 특정 세포주(도 1a 및 1b)에 특이적이었고, 일부는 2개의 종양 세포주(도 1c) 간에 공유되었다.
검증을 위해, 본 발명자들은 B16F10-OVA 또는 MCA101-OVA에서 발현된 다양한 펩티드를 선택하였으며, 예측 친화도는 500nM 미만이었다. 해독 수와 MHC-I에 대해 예측된 친화도 사이의 비율을 최적화하도록 노력하며 펩티드를 선택하였다.
4개의 예측된 종양 신생항원성 펩티드를 선택하고 TE 및 엑손 서열을 식별함으로써 특성화하였다(표 2).
[표 2] 상기 방법에 의해 선택된 4개의 예측된 종양 신생항원성 펩티드의 특성 분석
1.2 융합 전사 서열의 RT-PCR에 의한 검증
먼저, 하나의 프라이머를 TE 서열에 그리고 다른 하나를 엑손 서열에 갖는 프라이머 쌍을 사용하여, 정규 RT-PCR에 의한 검증을 수행하였다.
RNA 추출 및 역전사를 위해, 3~5.106개의 세포를 500μL 트리졸에서 용해시키고, 100μL 페놀-클로로포름을 용해물에 첨가한 후 원심분리하였다. 수성상을 수집하고, 100% EtOH와 1:1 비율로 혼합하고, RNAeasy 미니키트 컬럼으로 옮겼다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 RNA를 수집하였다(컬럼 DNAse 처리 포함). RNA 용리 후, 제조사의 지침에 따라, Turbo DNAse(Fisher scientific)로 처리하여 DNA 오염물을 추가로 제거하였다. RNA 농도가 나노드롭을 사용하여 측정되었고, 1μg의 RNA는 역전사에 사용되었다. 제조사의 지침에 따라, 제1 가닥 합성이 oligodT(15)를 프라이머로서 사용하여 Superscript III(Life technologies)로 수행되었다. 프라이머는 Eurogentec로부터 주문하였다. Taq 중합효소를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각 반응에 대한 최적의 조건을 식별한 후, PCR 산물을 아가로오스 겔로부터 추출하고, GATC 라이트런(lightrun)을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. APE 소프트웨어로 서열 정렬을 확인하였다.
이러한 접근법을 사용하여, 표 2에서 식별된 세포주에서 N25, N26, N90 및 N94에 대한 예측된 크기와 일치하는 밴드를 각각 검출하였다(N25에 대해서는 도 2a 참조). 흥미롭게도, N26이 전술한 바와 같은 RNAseq에 의해 파이프라인에서 인 실리코로 MCA 및 MC38 세포에서만 검출되었지만, RT-PCR을 사용하여 본 발명자들은 B16F10-OVA 세포에서 N26에 상응하는 밴드를 검출하였는데(도 2b), 이는 이 서열이 3개의 독립적인 종양 세포주(MCA, MC38 및 B16F10) 사이에서 공유됨을 나타낸다. RNAseq 데이터를 재분석함으로써, 본 발명자들은 N26 접합부가 B16F10-OVA 세포에 존재하지만, 알고리즘의 검출 임계값 미만인 것을 발견하였다. 또한, RT-PCR 산물의 시퀀싱은 알고리즘에 의해 예측된 서열과 정확하게 일치하는 것으로 나타났다.
1.3 마우스의 생체 내 면역화
생체 내에서 이들 후보물질을 검증하기 위해, MHC 클래스 I 서열에 결합하는 신생항원성 펩티드에 상응하는 짧은(9량체) 펩티드를 합성하였다. 생체 내 검정을 위해, 9량체의 예측된 MHC 결합 짧은 펩티드에 대한 측부 영역을 포함하는 긴(27량체) 펩티드를 합성하였는데, 이는 이 길이가 생체 내 면역화에 더 적합하기 때문이다. B16F10 OVA 및 MCA101-OVA를 RPMI, Glutamax, 10%FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신에서 유지시키고 TrypLE을 사용하여 계대배양하였다. 세포를 최대 1개월 동안 배양에 유지시키고, 각각의 생체 내 실험을 위해 새로운 바이알을 해동하였다. C57BL6J 수용자 마우스를 100μg 길이의 펩티드(N25L 또는 N26L), SIINFEKL 펩티드(짧은 OVA 펩티드), OVA(Sigma) 또는 DMSO로 면역화하고, 각각 50μg의 polyI:C를 옆구리에 피하 주사하였다. 일차 면역화 후 7일차에 면역화를 반복하였다. 3일 후(일차 면역화 후 10일차), 동물을 희생시키고, 서혜부 림프절에서 펩티드-특이적 IFNg-분비 CD8 T 세포의 수를 ELISPOT에 의해 검출하였다(도 3a). 10μg.mL-1에서의 짧은 펩티드(N25, N26, 또는 SIINFEKL) 또는 DMSO를 사용하여 T 세포를 재자극하였다. 대안적으로, 이차 면역화 후 7일차에, PBS 중 2.5.105 B16F10-OVA 또는 5.105 MCA-OVA 세포를 동물에게 피하 주사하였다. 본 발명자들은 N25, 및 보다 적은 정도로 N26이 면역 반응을 유도할 수 있음을 발견하였다(도 3b).
1.4 종양을 가진 마우스의 생체 내 치료
이들 펩티드가 종양 세포에 대해 보호되는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 C57BL6 마우스를 0일차(d0) 및 7일차(d7)에 PBS 중 100mg 펩티드 N25L 또는 N26L, 또는 OVA(대조군 펩티드) 및 50μg polyI:C로 면역화하였고, 14일차(d14)에 본 발명자들은 2.5.105 B16F10-OVA 세포를 OVA, N25L 및 N26L로 면역화된 마우스에게 주사하였다. B16F10 OVA 및 MCA101-OVA를 RPMI, Glutamax, 10%FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신에서 유지시키고 TrypLE을 사용하여 계대배양하였다. 세포를 최대 1개월 동안 배양에 유지시키고, 각각의 생체 내 실험을 위해 새로운 바이알을 해동하였다. C57BL6J 수용자 마우스를 100μg의 긴 펩티드(N25L 또는 N26L), OVA(Sigma) 또는 DMSO로 면역화하고, 각각 50μg의 polyI:C를 옆구리에 피하 주사하였다. 일차 면역화 후 7일차에 면역화를 반복하였다.
10μg.mL-1에서의 짧은 펩티드(N25, N26, 또는 SIINFEKL) 또는 DMSO를 사용하여 T 세포를 재자극하였다. 대안적으로, 이차 면역화 후 7일차에, PBS 중 2.5.105 B16F10-OVA 또는 5.105 MCA-OVA 세포를 동물에게 피하 주사하였다. 수동 캘리퍼를 사용하여 주 2회 종양 크기를 측정하고, 실험 기간 전체에 걸쳐 동물 건강 상태를 모니터링하였다(도 4a 및 도 4b). 종양 부피가 1 mm3에 도달했을 때 동물을 희생시켰다. 놀랍게도, 본 발명자들은 N25L이 OVA보다 더 효율적인 방식으로 B16OVA 종양의 형성을 상당히 지연시키는 것을 관찰하였다. 또한, 본 발명자들은 N26L 면역화 시 유사한 결과를 얻었다.
2 실시예 2: TE 요소 및 엑손 서열로 이루어진 융합 전사체로부터 유래된 인간 폐 선암종(LUAD) 신생항원성 펩티드의 식별
2.1 재료 및 방법
RNA 추출. 종양 및 병치 샘플을 #1mm3 조각으로 절단하고, 1% β-메르캅토에탄올이 보충된 700μl RTL 용해 완충액(Quiagen)에 재현탁하고, Perecellys 24 조직 균질화기(Bertin Technoogies)를 사용하여 균질화시켰다. 제조사 지침에 따라 RNeasy 마이크로 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA 단리를 수행하였다. 종양 세포주로부터의 총 RNA를 동일한 절차를 사용하여 5.106개의 종양 세포주로부터 추출하였다.
PCR 및 시퀀싱. 프라이머는 APE 소프트웨어를 사용하여 설계되었다. 각 샘플에 대해, 제공자에 의해 표시된 바와 같이, SuperScript III 역전사효소(ThermoFisher)를 사용하여 1μg의 RNA를 cDNA 내로 역전사하였다. GoTaq G2 핫 스타트 폴리마라아제(Hot Start Polymarase)(Promega)를 사용하여 PCR 반응이 수행되었다. 모든 프라이머는 0.5μM의 농도로 사용되었다. 반응은 VeritiTM 96-웰 열 순환기(ThermoFisher)에서 수행되었다. PCR 산물을 LabChip GX(Caliper LifeSciences)에 로딩하고 LabChip GX 소프트웨어(v4.2)로 분석하였다.
PCR 반응을 예상 크기의 증폭 산물을 갖는 샘플에 대해 반복하였다. 그런 다음, PCR 산물을 2% 아가로오스 겔 SYBR 유리 염료(1/10000)(Invitrogen)에서 실행하였다. 특이적 밴드를 절단하고, 제조사 지침에 따라 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 DNA 생성물을 정제하였다. 마지막으로, 이들 생성물은 EuroFins Scientific에 의해 시퀀싱되었다. 생성된 서열을 시리얼 클로너 소프트웨어(Serial Cloner software)를 사용하여 예상 서열과 비교하였다.
사량체 형성. HLA-A2 단량체를 ImmunAware®로부터 구매하고, 제조사 지침에 따라 합성 ER-유래 펩티드로 사량체의 형성을 평가하였다. 간략하게, 합성 HLA-A2 단량체를 18°C에서 48시간 동안 합성 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 단량체를 비오티닐화 세파로오스와 함께 추가로 인큐베이션함으로써 사량체화를 수행하였다. 마지막으로, PE-접합 항-β2-마이크로글로불린 항체를 사용하여 유세포 계측법으로 사량체 형성을 측정하였다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 제조사가 제공한 CMV로부터 유래된 펩티드를 사용하였다.
특이적 CD8+ T 세포의 존재를 평가하기 위해 처리된 실험에서, 형광 스트렙타비딘(PE, APC, PE-Cy5, PE-CF594, BV421, BV711 및 FITC)의 상이한 조합으로 단량체를 인큐베이션함으로써 사량체화 단계를 수행하였다.
미처리 CTL의 프라이밍. PBMC는 HLA-A2+ 건강한 혈액 공여자로부터 피콜 구배 분리에 의해 수득되었다. CD14+, CD4+ 및 CD8+ 세포를 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 선택에 의해 정제하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 실험일까지 동결 보존하는 동안, CD14+ 분획을 IL-4(50ng/mL) 및 GM-CSF(10ng/mL)의 존재 하에 5일 동안 106 세포/mL로 배양하여 moDC를 수득하였다. 이 기간 후, moDC를 LPS로 성숙시키고 합성 ER-유래 펩티드와 함께 1μg/mL의 최종 농도로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 펩티드 로딩된 moDC를 IL-2(10U/ml) 및 IL-7(100ng/ml)이 보충된 배양 배지에서 자가 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 공동 배양하였다. 특이적 CD8+ CTL 집단의 ER-유래 펩티드 자극을 각 펩티드에 대한 2색 사량체의 조합을 사용하여 유세포 계측법에 의한 MHC-I 사량체 염색에 의해 평가하였다.
사량체 염색. 세포를 PBS에 재현탁하고, Live/Dead Aqua-405nm(ThermoFisher)로 20분 동안 4°C에서 염색하고, 1회 세척하였다. 그 후, 세포를 SA-결합된 사량체의 혼합물을 함유하는 PBS-1%BSA에 재현탁하고, 20분 동안 실온에서 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 추가 세척 없이, 표면 항체를 PBS-1%BSA에 첨가하고, 세포를 4°C에서 어두운 곳에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 표면 항체는 필요 시 항-CCR7-AF700 + 항-CD45RA-BUV395와 조합된 항-CD3-BV650 + 항-CD8-PECy7의 조합이었다. 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 유세포 계측 분석을 위해 FACS 완충액에 재현탁하였다.
CTL-클론 생성. 사량체 양성 세포는 U 하단 96-웰 플레이트에서 분류된(ARIA-분류기, BD) 단일 세포 FACS였다. 분류된 세포를 150.000 공급기 세포를 함유하는 100ml의 RPMI 10% 인간 혈청 AB(Sigma-Aldrich)에서 수집하였다. 마지막으로, IL-2(3000 IU/ml) 및 항-CD3(100mg/ml, Miltenyi의 OKT3 클론)을 함유하는 100ml의 AIM 배지를 첨가하고, 최대 15~20일 동안 세포를 배양하였다. 웰에서 명백한 세포 성장이 관찰되었을 때, 본 발명자들은 최대 15일의 추가 기간 동안 새로운 공급기 세포로 2차 증식을 수행한다. 세포를 공급하고, 이 기간 동안 동일한 배양 배지(AIM-RPMI 50/50 + 5% 인간 혈청)로 필요에 따라 분할하였지만, 500 IU/ml의 IL-2만을 함유하였다. 마지막으로, 증식된 클론이 그들의 특이성에 대하여 FAC-사량체 염색으로 확인되었고, >85%의 사량체 양성 클론을 갖는 클론만을 추가 분석에 사용하였다.
사멸 검정. 사멸 검정을 수행하기 위해, xCELLigence RTCA S16 실시간 세포 분석기를 사용하였다. H1650 세포주를 사전 코팅된 16 웰 플레이트에 0.5x106 세포/ml로 플레이팅하였다. 1일 후, 세포를 상이한 농도의 상응하는 합성 펩티드로 1시간 동안 인큐베이션하거나 인큐베이션하지 않았다. 그 후, 세포를 배양 배지로 2회 세척하고, 동일한 농도의 항-MHC-I 항체(클론 W6/32, 50mg/웰) 또는 이소형 대조군과 추가 30분 동안 인큐베이션하거나 인큐베이션하지 않았다. 추가 세척 없이, CTL-클론을 해당 비율로 첨가하였다. 완전 검정은 37°C에서 200의 최종 부피로 xCELLigence 시스템에 연결된 유리-혈청 배양 배지에서 수행되었다. 임피던스 변동(세포-지수)을 40시간 동안 실시간으로 측정하였다. 각각의 조건을 중복하여 수행하였다.
사이토카인 분비 및 Jurkat 세포 활성화. 50.000개의 H1650 세포를 5%의 소태아 혈청이 보충된 배양 배지 중 96-웰 플레이트에 플레이트하였다. 다음 날, 세포를 상이한 최종 농도의 합성 펩티드와 함께 1~2시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 2회 세척하고, CTL-클론을 1:1 비율로 첨가하고, 펩티드 로딩된 표적 세포와 18시간 동안 공동 배양하였다. 배양 상청액을 수집하고, 제조사의 지침에 따라 사이토카인 비드 어레이(CBA, BD Biosciences)에 의해 사이토카인 농도를 분석하였다.
CTL-클론 및 2개의 상이한 유형의 표적 세포 - H1650 및 H1395 세포주 - 대신에 형질도입된 Jurkat 세포를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 이 검정에서, 펩티드 로딩된 표적 세포와 공동 배양한 후, Jurkat 세포를 유세포 계측법으로 평가하여 리포터 마커의 발현을 분석하였다. PMA/이오노마이신을 양성 대조군으로서 사용하여 Jurkat 세포를 활성화시켰다.
조직 및 혈액 샘플. 폐 종양, 병치 종양 및 림프절 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 37°C에서 40분 동안 2ml 배양 배지(CO2 독립 배지 + 5)의 최종 부피에서 콜라겐분해효소-I(2mg/ml), 히알루로니다아제(2mg/ml) 및 DNasa(25mg/ml)의 혼합물을 사용하여 분해하였다. 분해 후, 단일 세포 현탁액을 세포 여과기를 통해 수집하고 세척하였다. 종양 및 병치 종양 현탁액을 피콜 구배에 의해 림프구 분획 상에서 농축시켰다. 그 후, 전술한 바와 같이 FAC에 의한 사량체 분석을 위해 세포를 염색하였다.
피콜 구배에 혈액 샘플을 시딩하고 PBMC를 분리하였다. 그 후, EasyStep 인간 CD8+ T 세포 농축 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 CD8+ T 세포에 대해 PBMC를 농축시켰다. 마지막으로, 농축된 세포를 전술한 바와 같이 사량체 분석을 위해 염색하였다.
종양 침윤 림프구(TIL) 배양물. 종양 조직을 작은 조각(1~3 mm3 크기, 최대 6~12 조각)으로 절단하였다. 각각의 종양 단편을 24-웰 플레이트로부터 개별 웰로 옮기고, 2ml RPMI 10% 인간 혈청 + IL-2 6000 IU/ml의 최종 부피에서 배양하였다. 세포를 15~20일 동안 필요에 따라 공급/분할하고, 사량체 염색을 위해 동결 보존하거나 분석하였다.
TCR 클로닝. 총 RNA를 CTL-클론으로부터 추출하고 SuperScript III(ThermoFisher)을 사용하여 cDNA 내로 역전사하였다. TCRα 및 β는 Li 등 2019에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 증폭되었다. DNA 생성물을 2% 아가로오스 겔에서 실행하고 겔 밴드 추출(Qiagen) 후에 시퀀싱하였다. TCR V 영역(α 및 β)을 쥣과 TCR 불변 사슬과 연결시키고 PEW-pEF1A-inactEGFP 벡터에 클로닝하고 형질전환된 박테리아에서 증폭시켰다.
Jurkat 형질도입. 인밸롭(pVSVG) 및 패키징(psPAX2) 플라스미드와 함께 TCR-발현 플라스미드로 형질감염된 HEK-293FT 세포주에 의해 렌티바이러스 입자가 생산되었다. 64시간 후, 상청액을 수집하고, 100kDa 원심 필터(Sigma-Aldrich)를 사용하여 렌티바이러스 입자를 농축시켰다. 렌티바이러스 현탁액을 리포터 유전자(NFAT-GPF, NF-KB-CFP 및 AP-1-mCherry)를 발현하는 TCR-음성 Jurkat 세포 내로 원심 접종하여(spinoculation) 옮겼다. 5일 후, 항-쥣과 TCR-β 항체(클론 H57-597)를 사용하여 FACS에 의해 형질도입 효율을 평가하였다. 이러한 Jurkat 세포는 Rosskopf S. 등, 2018에 기술되어 있다.
질량 분광분석 데이터 분석. MHC-용리된 펩티드로부터 유래된 공개 면역펩티도믹스 원 데이터를 다음 파라미터 - 무효소, 펩티드 길이 8~15 aa, 전구체 질량 내성 20ppm 및 단편 질량 내성 0.02 Da - 로 ProteomeDiscoverer 1.4(ThermoFisher)를 사용하여 분석하였다. 메티오닌이 변수 변형으로서 이용 가능하였고, 거짓 발견률(FDR: false discovery rate) 1%를 적용하였다. 폐 TCGA 프로젝트의 모든 융합 전사체-유래 단백질의 목록과 연결된 Uniprot/SwissProt(업데이트 06.03.2020)의 인간 단백질에 대해 MS/MS 스펙트럼을 검색하였다. 마지막으로, Uniprot 데이터베이스 또는 폐 정상 샘플에 존재하는 번역된 융합 전사체와 일치하는 펩티드를 폐기하였다.
2.2 결과: 인간 대상체의 종양 신생항원성 펩티드를 암호화하는 융합 전사 서열의 식별
2.2.1 신생항원의 특성 분석
먼저, TE-엑손 융합 전사체 환경을 TCGA 공개 데이터베이스의 정상 샘플에서 특성화하였다. 19개의 상이한 조직(담관, 방광, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 두경부, 신장, 간, 췌장, PCPG, 전립선, 직장, 육종, 피부, 흉선, 갑상선, 자궁)으로부터의 679개의 정상 샘플에서 총 8876개의 고유 융합이 식별되었다. 각 조직 유형에 대한 특이적 융합은 매우 작은 부분의 범-조직 융합 전사체로 발견되었다. 이들 결과는 전용 조직 특이적 조절 메커니즘이 이들 융합 전사체와 연관되어 있음을 시사한다.
그런 다음, TCGA로부터의 514개의 LUAD 샘플에서 식별된 융합 수를 TCGA에 존재하는 59개의 정상 연관 폐 샘플과 비교하였다. 평균적으로, NSCLC 샘플에서 235개의 융합이 식별되었고, 이에 비해 건강한 폐 샘플에서 200개가 식별되었다(윌콕슨(Wilcoxon) p 값 = 9x10.-10). 총 8269개의 고유 융합이 NSCLC 종양에서 식별되었다.
TSF(종양 특이적 융합)라는 융합의 제1 카테고리는 종양 샘플의 적어도 1%에서 발견되고 정상 샘플에서는 발견되지 않는 것으로 수득되었다. 따라서, 210개의 융합을 TSF로서 정의하였다.
종양에서의 일부 고주파 융합 전사체 및 정상 세포에서의 낮은 빈도는 신생항원에 대한 좋은 후보물질일 수도 있다. 따라서, TAF(종양 관련 융합)라는 제2 카테고리는 특히, 정상 조직의 4% 미만, 특히 종양의 2% 미만 내지 10% 초과에 존재하고 정상 조직 샘플과 비교하여 종양에서 과발현되는 융합으로서 정의되었다.
융합 서열:
- 융합 뉴클레오티드 서열을 재구성하기 위해, Ensembl HG19 인간 조립 데이터베이스로부터 가닥 "Donor_strand_X"의 "Donor_start_X"에서 "Donor_Breakpoint_X"까지의 염색체 "Donor_Chromosome_X" 상의 공여체 서열 및 가닥 "Acceptor_strand_X"의 "Acceptor_Breakpoint_X"에서 시작하여 "Acceptor_end_X"까지의 염색체 "Acceptor_Chromosome_X" 상의 수용체 서열을 추출하였다. Ensembl HG19 인간 데이터베이스의 사용은 제한적이지 않으며, 임의의 다른 조정된 데이터베이스, 예컨대 NCBI 참조 서열 데이터베이스(RefSeq)가 사용될 수 있음을 주목해야 한다.
- 융합이 마이너스 가닥 상에 존재하는 경우 서열의 역상보체를 취하도록 주의를 기울여야 한다.
- "융합 서열"은 공여체 서열에 이어서 수용체 서열로 이루어진다.
융합 전사체의 뉴클레오티드 서열:
엑손이 관여하는 공지된 정규 전사체에 기초하여, 모든 "융합 전사체"를 재구성하였다.
공여체가 엑손인 경우(도 9a 참조)
≫ 이는 공여체 엑손에 대한 정규 전사체의 시작으로 시작하여 완전한 정규 엑손 서열을 융합 서열로 치환한다. 이 경우, 융합 전사체는 수용체의 TE 서열 후에 정지한다.
공여체가 TE인 경우(도 9b)
≫ 서열은 전사체 내의 수용체 엑손의 정규 위치에서 시작하여 상류의 모든 엑손을 잊어버린다. 수용체 엑손의 정규 서열을 융합 서열로 대체하고, 전사체를 종료 시까지 재구성하였다.
그런 다음, 융합 전사체의 크기 k(즉, 24 내지 75개의 뉴클레오티드)의 각각의 뉴클레오티드 서열(제1 k-량체의 번역은 융합 전사체의 제1 뉴클레오티드에서 시작되고, 제2 k-량체의 번역은 융합 전사체의 제2 뉴클레오티드에서 시작됨, 등)을 펩티드 서열로 번역하였다.
그런 다음, 수득된 펩티드를 MHC 결합 예측을 위해 NetMHCpan으로 추가로 분석한다. 따라서, 알려진 인간 대립유전자 중 적어도 하나에 결합하기 위한 친화도를 서열에 존재하는 각각의 k-량체에 대해 예측하였다(추가 예시는 실시예 1도 참조).
그런 다음, 펩티드를 일반적으로 Uniprot에 존재하는 모든 서열(인간 엑솜에 암호화된 모든 서열을 나타냄)에 대해 인간 대상체에 대한 기준 단백질에 대해 추가로 스크리닝하였다. 펩티드가 동일한 아미노산 서열을 가졌거나 제1 또는 마지막 위치에서만 아미노산이 상이할 경우, 펩티드는 Uniprot의 펩티드와 동일한 것으로 간주되었다. 그런 다음, 이러한 모든 동일한 서열을 후보 목록으로부터 폐기하였다. 이러한 230개의 융합 전사체로부터 유래된 117개의 펩티드 서열을 HLA-A2:01에 결합할 것으로 예측하였다(하기 표 3 참조).
[표 3] 펩티드 LUAD
2.2.2 HLA-A2 관련 펩티드에 대한 검증
HLA-A2 대립유전자가 백인 인구의 거의 50%에서 발현된다는 점과 상이한 기술 도구의 존재를 고려하여, 검증을 HLA-A2-관련 펩티드에 초점을 맞추었다.
다음 단락에서, TE-엑손 유래 전사체는 "융합 전사체"와 상호 교환적으로 사용되고, 용어 "TE-유래 펩티드"는 "융합 전사체-유래 펩티드"와 상호 교환적으로 사용된다.
폐 선암종 샘플에서 TE-엑손 유래 전사체의 발현
예측된 TE-엑손 전사체를 실험적으로 검증하기 위해, LUAD 종양 샘플 및 종양 세포주에서 PCR에 의한 발현을 먼저 검증하였다. 따라서, 이들 중 하나가 융합의 TE 부분에 결합하고 다른 하나가 융합의 엑손 부분에 결합하도록 각각의 키메라 융합을 위한 특정 프라이머를 설계하였다. PCR 산물의 시퀀싱에 의해 결과가 추가로 확인되었다.
특히, 특정 프라이머는 정방향 프라이머가 재구성된 융합 서열의 "공여체" 서열에서 결합하고 역방향 프라이머가 "수용체" 서열에서 결합하도록 설계되었다. PCR 반응은 폐 종양 샘플 및 인간 종양 세포주로부터 유래된 RNA 상에서 실행되었다. 증폭 생성물을 아가로오스 겔에 시딩하고, 예상 크기에서 발견되는 밴드를 절단하고 시퀀싱하였다. 마지막으로, 시퀀싱된 PCR 산물을 재구성된 융합 서열과 비교하였다.
이러한 접근법을 사용하여, LUAD 종양 샘플 및 종양 세포주 모두에서 예측된 융합 전사체의 존재를 확인할 수 있었다. 아래 표 4는 HLA-A2 대립유전자에 높은 친화도로 결합하는 것과 연관된 예측 펩티드와의 가장 빈번한 키메라 융합 중 8개에 대해 발견된 결과를 요약한 것이다.
[표 4] 가장 빈번한 융합 전사체 검증. 가장 빈번한 융합 펩티드는 15개의 LUAD 종양 샘플 및 6개의 LUAD 종양 세포주에서 PCR에 의해 검증되었다. 아래 표의 상태 '예' 또는 '아니요'는 예상 크기에 대한 PCR 산물의 유무를 나타낸다. PCR 산물을 시퀀싱에 의해 추가로 검증했을 때는 '예'로 표시된다.
HLA-A2 분자에 대한 ER-유래 펩티드의 결합
키메라 전사체의 발현이 확인되면, 유래된 펩티드를 합성하고 HLA-A2에 대한 이들의 결합을 확인하였다. 단량체 안정화 및 사량체 형성은 높은 친화도 결합 펩티드의 존재 하에서만 가능하기 때문에, HLA-A2 사량체의 형성은 합성된 펩티드의 존재 하에서 유세포 계측법에 의해 추정되었다. 모든 예측된 펩티드는 사량체 형성을 안정화시킬 수 있었으며, 양성 대조군에 비해 50%를 초과하는 형광 백분율을 나타냈다. 양성 대조군으로서, 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된 HLA-A2에 대해 공지된 높은 친화도 결합 펩티드를 사용하였다. 이 결과는 HLA-A2 대립유전자에 대해 예측된 높은 친화도 결합을 확인하였다. 도 10은 가장 빈번한 융합 펩티드로부터 유래된 10개의 펩티드에 대한 결과를 보여준다.
도 11은 동일한 펩티드-MHC-I 복합체 형성 검정을 사용하여 HLA-A2에 대한 결합이 확인된, 빈번한 키메라 전사체로부터도 유래된 새로운 펩티드 세트를 보여준다. 복합체 형성의 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 CMV pp65 495-503(NLVPMVATV) 및 멜란-A의 돌연변이 서열(MelA mut, ELAGIGILTV) 둘 다를 사용하였으며, 둘 다 HLA-A2에 대한 양호한 결합제로 알려져 있다. 멜란-A(MelA)의 비-돌연변이 서열을 저 결합제 펩티드의 대조군으로서 사용하였다. 음성은 임의의 펩티드가 없는 재조합 HLA-A2 분자이다.
ER-유래 펩티드의 면역원성
HLA-A2 대립유전자에 대한 결합 검증 후 다음 단계는 예측된 펩티드의 면역원성을 시험하는 것이었다. 따라서, 프라이밍 검정을 수행하여 식별된 펩티드가 특이적 세포독성 T 세포를 증식시키는 능력을 시험하였다. HLA-A2+ 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 단핵구 유래 DC(moDC)를 생성하였다. 합성 펩티드와 혼합하여 moDC를 로딩한 후, CD4+ 및 CD8+ T 세포로 자가 공동 배양을 수행하였다. 마지막으로, 특이적 CD8+ T 세포의 증식을 2색 사량체 염색을 사용하여 유세포 계측법으로 분석하였다. 특이적 증식의 대조군로서, 펩티드가 없는 공동 배양을 수행하였다. 하나의 공여체에서 이러한 접근법을 사용함으로써, 가장 빈번한 키메라 융합 유래-펩티드(RLLHLESFL, LLGETKVYV, AILPKANTV, RLADHLSFC, FLIVAEILI, YLWTTFFPL) 중 6개를 인식하는 특이적 CD8+ T 세포를 식별하고 확장하는 것이 가능하였다. 이 결과는 총 CD8+ T 세포 중 대조군 시험과 비교하여 사량체 양성 세포 백분율의 적어도 한 자릿수의 증가에 의해 입증된다.
추가적인 5명의 공여체에서의 반응을 평가하기 위해 동일한 실험을 수행하였다. 도 12a는 본 발명자들이 29개의 가장 빈번한 융합 전사체-유래 펩티드 중 23개(YLWTTFFPL, FLGTRVTRV, RLADHLSFC, LLGETKVYV, MLVTWELAL, MLMKTVWQA, SLMQSGSPV, AILPKANTV, AMDGKELSL, LLDRFGYHV, GLLNISHTA, ILTASITSI, ILSGYGPCV, RQAPGFHHA, GLPSHVELA, ILHSLVTGV, LLHLESFLV, VLLTNTIWL, LLTSWHLYL, RLLHLESFL, YLPYFLKSL, VLMWTMAHL, YLQGLPLPL)에 대한 특이적 CD8+ T 확장을 발견한 분석된 총 6개의 공여체에 대해 수득된 결과를 요약한 것이다. 확장의 양성으로, 돌연변이된 멜란-A 펩티드(ELAGIGILTV)를 사용하였다. 이들 실험은 이들 펩티드가 면역 반응을 유도할 수 있고 ER-유래 펩티드의 면역원성을 확인할 수 있음을 보여준다.
ER-유래 펩티드를 인식하는 세포독성 T 림프구 클론의 생성
세포독성 T 림프구(CTL) 클론을 생성하기 위해 면역원성 분석(도 12a)으로부터 확장된 CD8+ 사량체 양성 T 세포를 단일 세포 FACS로 분류하였다. 5개의 상이한 ER-유래 펩티드 - YLWTTFFPL, LLGETKVYV, MLVTWELAL, MLMKTVWQA, RLADHLSF - 를 인식하는 10개의 클론을 생성하였다. 이들 펩티드는 각각 펩티드 9, 86, 53, 80 및 64로 표 3에 열거되어 있다. 생성된 각각의 CTL-클론의 특이성을 나타내기 위해 이 숫자들을 언급할 것이다. 예를 들어, CTL-클론 9는 ER-유래 펩티드 9를 인식한다. 제2 실험 세트에서, 펩티드 17(LLDRFGYHV)을 인식하는 새로운 CTL-클론 17을 생성하였다.
생성된 CTL-클론의 세포독성 능력을 평가하기 위해, H1650 세포주를 표적 세포로서 사용하여 2개의 상이한 기능적 검정을 수행하였다. 이는 HLA-A2 대립유전자를 발현하는 LUAD-유래 종양 세포주이다.
먼저, ER-유래 펩티드에 노출된 후 사이토카인을 분비하는 CTL-클론의 능력을 측정하였다. CTL-클론을 특이적 ER-유래 펩티드가 로딩된 표적 세포와 18시간 동안 공동 배양한 후, 배양 상청액에서 INF-g, TNF 및 그랜자임-B(Gr-B)의 분비를 측정하였다. 모든 CTL-클론은 특이적 ER-유래 펩티드에 노출된 후에 활성화되어, 사이토카인을 투여량 의존적 방식으로 분비하였다(도 12b).
제2 실험 세트에서, CTL 클론 사멸 능력을 평가하였다. CTL-클론을 ER-유래 펩티드가 로딩되거나 로딩되지 않은 표적 세포와 상이한 조건에서 공동 배양하였다. xCELLigence 시스템을 사용하여 표적 세포 단층에서의 실시간 임피던스 변동을 측정하였다. 이들 검정에서, 세포 지수의 감소는 세포 생존력을 반영하는 단층 내 세포 수의 감소와 관련이 있다.
CTL-클론 9를 ER-유래 펩티드 9가 로딩된 표적 세포와 1:1 비율로 공동 배양했을 때, 대조군 세포(표적 세포 단독)와 비교하여 시간 경과에 따른 세포 지수의 감소가 관찰되었다. 이러한 세포 지수 감소는 차단 항-MHC-I 항체(+ 항-MHC-I)의 존재 하에 공동 배양을 수행했을 때 억제되었다. 동일한 농도의 이소형 대조군(+ 이소형)을 사용하여 공동 배양을 수행하면 세포 지수의 감소를 억제하지 않았다. 또한, 표적 세포에 더 높은 농도의 펩티드(1uM 대비 1pM)를 로딩했을 때 감소량이 증가하였다(도 12c, 좌측 패널). 이들 결과는 세포독성 T 세포가 본원에 기술된 융합 전사체에 의해 암호화된 펩티드를 인식하고 이러한 펩티드를 발현하는 표적 종양 세포를 사멸시킬 수 있음을 보여준다.
그 다음, ER-유래 펩티드가 표적 세포에 의해 자연적으로 발현되고 제시되며, 따라서 이러한 표적 세포는 펩티드의 외부 첨가 없이 CTL-클론과 공동 배양함으로써 사멸될 수 있음을 입증하였다. 이러한 목적을 위해, 상이한 비율로 CTL-클론 9를 H1650 표적 세포와 공동 배양하였다. 도 12c의 우측 패널은, CTL-9가 대조군 세포(표적 세포 단독)와 비교하여 4:1의 효과기-표적 비율로 표적 세포를 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 사멸 효능은 더 높은 비율(8:1)로 증가한다. 표적 세포의 사멸은 더 낮은 비율(2:1)로는 입증되지 않았다.
마지막으로, CTL-클론 9, CTL-클론 64, 및 CTL-클론 80을 사용해 유사한 실험을 수행하였으며, 항-MCH-I 항체의 존재 하에 공동 배양을 수행할 때에도 억제될 수 있는 표적 세포의 특이적 사멸을 나타냈다(도 12d).
종합하면, 이들 결과는 본원에 기술된 융합 전사체에 의해 암호화된 여러 상이한 펩티드를 인식하는 세포독성 T 세포가 상기 특이적 융합 전사체-유래 펩티드를 발현하는 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있고, 이러한 효과가 MHC-I 분자의 맥락에서 펩티드의 특이적 인식에서 기인함을 입증한다. 또한, CTL-클론이 외부 펩티드의 첨가 없이 표적 세포를 사멸시킬 수 있다는 사실은 융합 전사체-유래 펩티드가 LUAD 종양 세포주에 의해 자연적으로 발현되고 제시된다는 명확한 증거를 제공한다.
융합-유래 펩티드를 인식하는 조작된 T 세포의 생성
CTL-9 TCR 서열을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포를 2개의 상이한 표적 세포 H1650 및 H1395와 공동 배양하였다. 둘 다 HLA-A2 대립유전자를 발현하는 LUAD-유래 세포주이다. Jurkat 세포의 TCR 매개 활성화를 유세포 계측법에 의해 리포터 유전자(NFAT-GPF, NF-KB-CFP 및 AP-1-mCherry)의 형광의 증가로서 평가하였다. 예비 결과는 음성 대조군(형질도입되지 않은 Jurkat 세포)과 비교하여 두 표적 세포와 공동 배양할 때 Jurkat 세포가 활성화됨을 보여주었다. 또한, 이러한 활성화는 특이적 펩티드가 로딩된 표적 세포로 공동 배양을 수행했을 때 투여량 의존적 방식으로 증가하였다. PMA/이오노마이신을 양성 대조군으로서 사용하였다(도 13).
이들 결과를 다른 실험 세트에서 반복하였고, CTL-86 및 CTL-53 및 CTL-17의 TCR 서열을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Jurkat 세포에서 유사한 결과를 수득하였다. 형질도입된 Jurkat 세포를 상응하는 ER-유래 펩티드(특이적/관련 펩티드)는 로딩되었지만 대조군 멜란-A 펩티드(비관련/비관련 펩티드, ELAGIGILTV)는 로딩되지 않은 표적 종양 세포주와 공동 배양함으로써 활성화하였다(도 14a). 예상대로, 활성화는 항-HLA-I 항체로 차단함으로써 억제된다(도 14b). 따라서, 생성된 CTL-클론에 의해 발현된 TCR은 상응하는 HLA-A2 제시 ER-유래 펩티드에 특이적이다.
이들 결과는 도 12c 및 도 12d에 도시된 결과와 일치하며, 이는 LUAD-유래 종양 세포가 TE-유래 펩티드를 발현함을 보여준다. 또한, 이들 결과는 조작된 T 세포의 개발에서 CTL-클론 TCR 서열의 기술적 관련성 또한 강조한다.
LUAD 환자에서 융합-유래 펩티드를 인식하는 CD8+ 세포의 존재
그 다음, LUAD 종양 샘플에서 융합-유래 펩티드를 인식하는 CTL 세포의 존재를 식별하는 것을 목표로 하였다.
제1 실험 세트에서, TE-유래 펩티드와 II-2의 혼합으로, 또는 II-2로만 증식된 종양 침윤 림프구(TIL)를 사량체 염색에 의해 분석하였다. 도 15a 및 도 15b에 도시된 바와 같이, 융합-유래 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포가 LUAD 환자로부터 유래된 TIL에서 발견되었다.
그 다음, 사량체 양성 세포가 검출될 수 있고, 신선한 종양 샘플로부터 유래된 미증식 CD8+ T 세포에서 이들의 표현형이 추가로 평가되었음을 보여준다. 그런 다음 이러한 전략을 사용하여, 종양, 병치 종양, 침윤된 림프절 및 LUAD 환자 샘플로부터 유래된 혈액에 존재하는 CD8+ T 세포를 분석하였다. 세포 표현형은 미처리(CCR7+CD45+), 중앙 기억(CM, CCR7+CD45RA-) 효과기 기억(EM, CCR7-CD45-) 및 말단 효과기(TE, CCR7-CD45+) T 세포에 대한 표면 마커 CCR7 및 CD45RA의 발현에 기초하여 결정하였다. 흥미롭게도, 종양 조직에서 발견되는 사량체 양성 세포는 우선적으로 기억 표현형을 공유한 반면, 미처리 세포(CCR7+CD45+)는 주로 림프절로부터 유래된 세포에서 발견된다(도 16a 및 도 16b). 환자 2 및 3은 도 14 및 도 15에서 동일하다.
시험된 모든 샘플은 HLA-A2+ 환자로부터 유래하였다.
종양 조직에 기억 표현형을 갖는 사량체 양성 세포의 존재는 TIL의 사량체 양성 세포의 존재와 함께, 이들 환자에서 TE-유래 펩티드에 대한 면역 반응이 생성된다는 증거를 제공한다. 또한, 림프절의 미처리 사량체 양성 세포의 존재는 특히 이들 TE-유래 펩티드에 대한 면역 반응이 생성될 수 있음을 보여준다.
5명의 원발성, 미치료의, LUAD 종양, 병치 종양, 종양-배출 림프절 및 LUAD 암 HLA-A2+ 환자로부터의 혈액 샘플로 이루어진 제2 코호트에서 분석되었다. 각각의 샘플의 절반을 시험관내 증식 없이 CD8+ T 세포를 분리함으로써 생체외에서 직접 분석하고, 다른 절반을 IL-2와 혼합된 키메라 전사체-유래 펩티드(환자 1 및 2) 또는 IL-2 단독(환자 3, 4, 5)과 함께 20일 동안 시험관내에서 배양하여, 샘플에서 키메라 전사체-유래 펩티드를 인식하는 특이적 T 세포의 집단을 증폭시키는 것을 목표로 하였다. 2색 사량체 염색을 사용하여 T 세포를 식별하였다. CCR7 및 CD45RA를 유도한 항체를 미처리 세포와 기억 세포를 구별하기 위해 미증식 세포에도 첨가하였다. 증식은 5개 이상의 이중 사량체 표지 세포로 고려되었다.
도 17a는 생체 외에서 직접 분석된 4명의 환자에서 발견되는 7개의 "키메라 전사체-유래 펩티드 특이적" 사량체-양성 T 세포 집단을 요약한 것을 보여준다(환자 샘플 중 하나는 기술적 이유로 분석할 수 없었음). CCR7/CD45RA 표지는 종양 샘플에서 검출된 모든 사량체-양성 T 세포가 명확한 효과기/기억 표현형을 갖는 반면, 혈액 및 림프절에서 "키메라 전사체-유래 펩티드 특이적" 사량체-양성 T 세포는 덜 분화된 CCR7+ 미처리 및/또는 중앙 기억 표현형의 다양한 비율을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 이들 결과는 일차 인간 NSCLC 종양이 키메라 전사체-유래 펩티드 특이적 기억 T 세포를 함유함을 입증한다(도 17b).
증식된 사량체+ CD8+ T 세포를 요약한 것이 도 17c에 도시되어 있다. 대부분의 펩티드 특이성의 경우, 2명의 환자에서만 분석된 종양 및 일치하는 침윤 림프절(LN) 모두로부터 T 세포가 증식되었고, 일부 경우에는 일치하는 병치-종양 샘플(Jt)로부터 증식되었다(도 17c). 또한 7개의 특이적 사량체 양성 집단 중 5개가 동일한 환자에서 20일차에 발견되었고, 조직은 T 세포 증식 없이 생체 외에서 발견되었다(도 17a 및 도 17c의 굵은 선의 사각형).
따라서, 이들 결과는 키메라 전사체-유래 펩티드 특이적 T 세포가 시험관내 증식 전후에 LUAD 환자의 종양, 종양-배출 림프절 및 때때로 병치-종양 조직 및 혈액에 존재한다는 증거를 제공하며, 이는 LUAD 환자의 키메라 전사체-유래 펩티드 특이적 면역 반응의 존재와 일치한다.
LUAD 생검에서 질량 분광분석에 의한 펩티드 식별.
세포독성 T 세포에 의해 인식되기 위해서는 ER-유래 펩티드에는 종양 세포 표면 상의 MHC 클래스 I 분자에 의한 제시가 요구된다. 예측된 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 상에서 발현되는 것을 확인하기 위해, 3개의 LUAD 생검으로부터 유래된 MHC I 면역펩티돔의 공개 데이터(Laumont CM 등, "Noncoding region is the main source of targetable tumor-specific antigens" Sci Transl Med. 2018 10(470))를 사용하였다. OpenMS 소프트웨어를 사용하여 3개의 LUAD 종양(PXD009752, PXD009754 및 PXD009755)의 MHC-I 면역 정제로부터 PRIDE 데이터베이스에 업로드된 원 데이터를 분석하였다. 단백질체학에서 데이터 의존적 획득은 표적 데이터베이스(일반적으로 전체 인간 단백질체)에 함유된 서열의 식별만을 허용한다는 것을 염두에 두고; 본 출원에 따른 펩티드는 비-코딩 서열로부터 유래되기 때문에 이전에 식별되지 않았다. 표적 데이터베이스에 본원의 예측된 펩티드의 서열을 포함시키는 MS/MS 식별을 재분석하였다. 3개의 샘플 생검 중 5개의 펩티드(펩티드 ID: 3304, 269, 757, 1810, 3953)가 발견되었다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 임의의 MHC I 대립유전자에 결합하는 TCGA에서 적어도 5개의 샘플에 존재하는 키메라 융합으로부터 유래된 모든 예측된 펩티드가 고려되었다. 이 결과는 LUAD 종양에서 키메라 융합-유래 펩티드가 MHC 클래스 I 분자 상에 발현함을 확인시켜준다.
나중에, 본 발명자들은 새로운 폐 면역펩티도믹스 데이터세트로 분석을 확장하였다(Bulik-Sullivan 등, Nat. Biotec 2018, Chong 등, Nat. Comm. 2020 및 Javitt 등, Front Immunol 2019). 참고로, LUAD 종양 세포주를 함유하는 Javitt 등의 Front Immunol 2019를 제외하고, 모든 데이터세트는 신선한 폐 종양 샘플로 생성되었다. 이러한 두 번째 분석을 위해, ProteomeDiscoverer 1.4 소프트웨어를 사용하여 ER-유래 펩티드를 식별하였다. 4개의 데이터세트를 고려하면, 23개의 고유한 ER-유래 펩티드가 총 19개의 면역펩티도믹 샘플 중 적어도 하나에 존재하였다. 도 18에서, 각각의 MHC 샘플(컬럼)에서 식별된 ER-유래 펩티드(행)는 회색 사각형으로 표시되어 있다. 우측에, 발견된 펩티드 서열이 표시되어 있다. 흥미롭게도, 이들 중 일부는 1개 초과의 MHC 샘플에서 관찰되었는데, 이는 이들이 샘플에 걸쳐 공유됨을 나타낸다. 이들 결과는 융합 전사체-유래 펩티드가 종양 세포 표면 상에서 HLA-I 분자에 의해 처리되고 제시됨을 확인시켜준다.
융합의 유전자 부분이 종양 억제 유전자인 융합 전사체(융합 ID: chr22:29117506:->chr22:29115473:- /관련 유전자: CHEK2)로부터 유래된 펩티드 RLADHLSFC 및 유전자 부분이 종양유전자인 융합 전사체(융합 ID: chr6:117763597:->chr6:117739669:- /관련 유전자: ROS1)로부터 유래된 펩티드 GLPSHVELA. 흥미롭게도, 두 펩티드는 면역원성인 것으로 밝혀졌으며(도 12a), 특히 펩티드 RLADHLSFC의 경우, 도 12d에서 보여지는 결과는 H1650 세포주에 의해 발현될 수 있음을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 펩티드 GLPSHVELA를 인식하는 TIL을 발견하였는데(도 13a), 이는 이러한 융합 전사체-유래 펩티드가 LUAD 종양 샘플에서 발현될 수 있음을 나타낸다.
3 실시예 3: 다양한 암 샘플로부터의 TE 요소 및 엑손 서열로 이루어진 융합 전사체로부터 유래된 신생항원성 펩티드 식별.
[표 5] (TCGA로부터의) 32개의 상이한 암 유형으로부터 유래한 9184개의 샘플:
전술한 암 샘플로부터의 RNA 데이터세트를 전술한 바와 같은 방법에 따라 분석하였다.
16580개의 융합 전사체를 식별하였다.
4 막관통 키메라 단백질
4.1 막관통 키메라 단백질의 식별
본 개시내용은 TCGA(암 게놈 아틀라스) 및 CCLE(광범위한 연구소 암 세포주 백과사전)(실시예 섹션에 기술됨)에서 공개적으로 이용 가능한 RNA-Seq 데이터를 사용하여, 게놈-와이드 비정규 스플라이싱 영역을 식별하기 위해 개발된 생물정보학 파이프라인으로부터 예측된 융합 전사체로부터 수득된 막관통 키메라 단백질 후보물질의 제1 선택을 제공한다.
이러한 막관통 키메라 단백질 후보물질을 아래에서 상세히 기술한 바와 같이 식별하고 선택하였다.
TE와 엑손 서열 사이의 스플라이싱 이벤트로부터 유래된 모든 전사체를 TCGA 및 CCLE 데이터베이스의 전사체 mRNA 데이터 내에서 먼저 식별하였다.
이 단계는 본 출원의 상기 섹션(상세한 설명 및 이전 실시예)에서 상세히 설명되었다.
이 단계는 본 출원의 상기 섹션(상세한 설명 및 이전 실시예)에서 상세히 설명되었다. 전술한 바와 같이, 융합 전사체는, 개별 유전자가 기존의 엑손 및 인트론 서열의 재배열을 통해 다수의 mRNA를 발현하고 다수의 단백질을 암호화할 수 있게 하기 때문에, 기능적 다양성을 생성하는 데 필수적인 것으로 알려진 대안적인 스플라이싱 메커니즘으로부터 기인한다. 관찰된 스플라이싱 변경 유형은 엑손 스키핑, 인트론 보유 및 대안적인 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위의 사용을 포함한다. 이들 융합 전사체에서, TE는 공여체(5' 위치에서) 또는 수용체(3' 수용체에서)로서 작용할 수 있고, 이에 따라 엑손은 수용체 또는 공여체일 수 있다. 따라서, TE-엑손 스플라이싱은 "비-코딩" 게놈의 부분을 코딩 게놈에 혼입시켜, 비-코딩 게놈 서열을 번역 기계에 노출시킨다. JET(접합부 엑손 TE, Junction Exon TE)로도 명명된 이들 융합(또는 키메라) 전사체는 ORF(개방 해독 프레임)를 포함하고, 즉, 이들은 폴리펩티드로 번역될 수 있는 능력을 갖는 해독 프레임의 일부이다. TE가 수용체인 경우, 융합 전사체의 ORF는 정규(즉, 정규 전사체와 동일)인 반면, TE가 공여체인 경우 ORF는 정규이거나 1개 또는 2개의 뉴클레오티드만큼 이동될 수 있다.
융합 전사체는 융합된 TE 및 엑손 서열(JET에 상응함)을 포함할 뿐만 아니라, 엑손이 공여체인 경우 융합 중단점(엑손과 TE 사이)의 상류에 있거나 TE가 공여체인 경우 융합 중단점의 하류에 있는 엑손(들)을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 다양한 전사 이소형에 상응한다.
본원에 개시된 막관통 신생항원성 펩티드의 식별은, 막 단백질을 코딩하는 전사체에 속하는, 단백질체 데이터베이스(예컨대, UniProt)에 주석이 달린 번역된 엑손 서열을 갖는 융합 전사체를 선택하는 단계를 추가로 포함하였다.
그런 다음, 선택된 융합 전사체의 서열을 융합 펩티드(번역 접합부로도 명명됨) 서열로 (인 실리코로) 번역하였다.
각 융합 전사체의 전체 서열은 다음 규칙에 따라 번역된다:
- 엑손이 스플라이싱 공여체로서 작용하는 융합 전사체는 전사체의 시작부터 엑손과 TE 사이의 중단점 이후의 제1 정지 코돈까지 전사체의 정규 ORF에 따라 번역된다.
- TE가 스플라이싱 공여체로서 작용하는 융합 전사체는 TE의 시작으로부터 또는 TE와 엑손 사이의 중단점 이전의 마지막 정지 코돈을 따르는 뉴클레오티드에서 시작하여 상기 중단점 이후의 제1 정지 코돈까지 3개의 가능한 ORF(1 내지 3)를 따라 번역된다.
- TE 서열로부터 유래된 적어도 3개의 아미노산을 함유하는 번역된 펩티드 서열만이 유지된다.
일반적으로, UniProt의 임의의 참조되거나 주석이 달린 단백질 서열과 일치하는 번역 접합부로부터 유래된 펩티드 서열은 폐기되며, 따라서 주석이 달리지 않은 키메라 펩티드에 초점을 맞춘다(표 9 내지 12에 예시됨).
이소성 발현에 의한 히트의 검증
상기 열거된 규칙을 적용함으로써, 일체형 막관통 키메라 단백질의 짧은 목록을 선택하였다. 이들 키메라 단백질은 TE-수용체 융합에 의해 또는 메타유합에 의해 생성될 것으로 예측된다. 상응하는 유전자 및 연관된 키메라 ID는 다음과 같다:
[표 6]
[표 7]
상기 표 6 및 7로부터, c-Myc 서열을 첨가한 27개의 TE-수용체 융합 및 17개의 메타융합 전사체를 합성하고 pCDNA 3 플라스미드(상업적으로 이용 가능함)에 클로닝하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포주에서 c-Myc Tag를 포함하는 예측된 키메라 단백질을 이소적으로 발현하였다. 세포 형질감염 및 단백질 발현 후, 항-Myc Alexa Fluor 647 2233S 클론 9B11 항체를 사용하여 세포외 영역으로부터 c-Myc를 검출하고 정량화하였다.
다음의 19개의 JET 유래 전사체를 이러한 접근법을 통해 양성적으로 검증하였으며, 이는 따라서 상응하는 키메라 단백질이 전술한 실험 환경에서 안정적으로 번역되고 막 내로 삽입됨을 입증하였다.
[표 8]
도 19는 유세포 계측법 결과(하기 작제물의 형질감염: ABHD1; ENST00000316470; chr2:27346930:+>chr2:27347727:+)의 예를 보여준다.
4.2 총 단백질체학
질량 분광분석 기반 단백질체학은 주어진 세포 제제의 실제 단백질 함량을 조사하기 위한 강력한 도구로서 출현하였다. JET가 실제로 단백질로 번역되는 것을 확인하기 위해, 세포주 및 신선한 종양으로부터 생성된 질량 분광분석 출력 파일(원 파일이라고 함)을 분석하여 JET 유래 펩티드의 상이한 모집단을 식별하였다. 본 연구는 2개의 상이한 분석으로 그룹화되었으며, 각각은 JET 유래 단백질이 종양 샘플 또는 종양 세포주에서 신뢰성 있게 검출될 수 있음을 입증하는, 상이하고 상보적인 유형의 정보를 제공한다.
먼저, JET로부터 유래된 단백질은 CCLE 데이터세트에서 매우 재발성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, CCLE 코호트의 7개 초과의 상이한 세포주에서 예측된 모든 이들 JET mRNA 서열로부터의 인실리코 번역 접합부가 사용되었고, CCLE의 375개 세포주의 단백질체학 분석으로 이루어진 Nusinow 등 2020의 질량 분광분석 원 파일에 대해 조사되었다. 이들 세포주를 TMT6plex로 그룹화하여, 총 29개의 MS/MS 출력 파일을 생성하였다. 이러한 MS-기반 단백질체학 분석은 스플라이싱 접합부와 중첩하는 적어도 1개의 펩티드를 함유하고 스플라이싱 이벤트에 관여하는 유전자가 Uniprot에 따라 형질막에 위치하도록 주석이 달리는 57개의 JET 유래 단백질의 식별을 유도하였다(표 9).
[표 9]:
아래 표에서 열의 숫자는 다음 항목을 나타낸다.
채널들 간에 상당한 라벨 혼선을 유발하는 TMT와 같은 등압 태깅 방법에 내재된 한계에도 불구하고, JET는 1개 초과의 TMT 군에서 식별되었고, 결과적으로 1개 초과의 종양 샘플에서 식별되었음을 확인하였다.
표면 단백질 농축:
막관통 단백질은 용해 프로토콜이 사용되기 때문에 총 단백질체학 실험에서 덜 대표되는 것으로 설명되었다. 따라서, 제2 접근법은 H1650 폐 세포주에서의 비오틴 표지화를 통해 세포외 노출 단백질을 농축시키는 데 사용되었다. 이 실험으로부터 수득된 질량 분광분석 원 파일을 사용해 2개의 상이한 분석을 수행하였다. 먼저, 융합-유래 단백질(키메라 단백질)이 일반적인 관점에서 형질막 상에서 발현되는지 여부를 이해하기 위해, CCLE 코호트(종양 특이적이고 그렇지 않음)의 7개 초과 세포주에서 발현된 모든 접합부를 본 실험의 질량 분광분석 파일에서 분석하였다. 단, 10개의 키메라 펩티드를 식별하였는데, 이 중 6개는 TE 및 엑손 둘 모두의 아미노산이 발견되는 접합부를 포함하였다. 접합부 서열로부터, 이들 중 4개는 막 구획에 주석이 달린 단백질과 관련이 있었다. 막관통 나선의 예측은 TMHMM 알고리즘((http://www.cbs.dtu.dk/)을 이용해 수행되었고, 번역된 서열의 토폴로지를 연구하였다. 서열의 예측된 토폴로지에 기초하여, TE가 세포외 구획에 노출될 것으로 예측된 후보물질만이 보유되었다. 총 10개의 융합-유래 펩티드의 양을 식별하였는데, 이들 중 6개는 스플라이싱 부위와 중첩된다(표 10).
[표 10]:
또한, 세포외 구획에 노출될 것으로 예측된 TE를 운반하는, 정규 유전자 산물 RHOT2를 포함하는 하나의 펩티드가 발견되었다. 이러한 분석 후, 종양 특이적 융합 유래 단백질도 이러한 접근법을 사용하여 식별될 수 있음이 추가로 나타났다. 따라서, 폐 TCGA 및 CCLE 코호트로부터의 폐 종양 특이적 JET(전술한 바와 같음)를 사용하여 MS 파일에 대해 조사하였다. 식별된 16개의 서열 중, 이들 중 8개는 접합부를 포함하였고, 식별된 아미노산은 TE 및 정규 유전자 산물 둘 다로부터 유래되었다. 관련된 정규 단백질의 주석이 달린 세포하 국소화에 따르면, 16개의 키메라 펩티드 중 5개가 형질막 내에 위치할 수 있는 반면, 나머지(11)는 다른 막 구획 또는 오염 시토졸에 속할 것이다(표 11).
[표 11]:
막관통 나선 도메인/들의 존재는 TMHMM 알고리즘을 사용하여 번역된 접합부의 예측 서열에 따라 계산되었다. 이는 ATP11A 및 PARM1 유전자 산물을 포함하는 2개의 관심 후보물질을 생성하였다.
이러한 예비 결과는 표면 내의 키메라 펩티드의 존재 및 세포 표면에 노출된 번역된 후생유전 산물을 조사할 수 있는 본 발명자들의 방법론의 능력을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명자들의 파이프라인의 입증된 적용 가능성은 상이한 세포 모델에 대한 추가 분석을 위한 길을 열어주며, 본 발명자들의 연구의 범위를 확장하고, 더 많은 JET 집단(엑손-전이성 인자의 접합부)의 식별을 가능하게 한다.
데이터세트 식별자 PXD016582를 사용하여 PRIDE 파트너 저장소를 통한 ProteomeXchange 컨소시엄에 증착된 원 데이터세트의 분석. 이들 분석은 이종성을 보유하고 결장 암종의 특징을 재현하는 단일 종양 세포로부터의 환자 유래 오르가노이드 클론에 해당한다. 동일한 환자로부터 생검한 종양이 없는 결장 점막 조직으로부터 생성된 정상 결장 오르가노이드 라인과 함께, 동일한 환자로부터 4개의 종양 클론을 분리하고 오르가노이드 배양물에서 유지하였다. 종양 클론 T1, T3, T4, 및 T5는 동일한 환자의 정상 오르가노이드와 형태학적으로 구별된다. 추가 세부 사항은 Demmers, L.C., Kretzschmar, K., Van Hoeck, A. 등, Single-cell derived tumor organoids display diversity in HLA class I peptide presentation을 참조한다(Nat Commun 11, 5338 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-19142-9 참조).
전술한 것과 동일한 파이프라인에 따라, JET 전사체로부터 유래된 펩티드의 다음의 목록이 식별되었다:
제2 결과 세트는 TMT 10-플렉스 시약 및 SPS-MS3 획득물을 사용하여 수집된 암 세포주 백과사전(CCLE)의 375개 세포주에 대한 단백질체 프로파일로부터 유래한다. 샘플의 기원 및 특성에 대한 추가 정보는 다음 간행물에서 확인할 수 있다: Nusinow DP, Szpyt J, Ghandi M, Rose CM, McDonald ER, Kalocsay M, Janι-Valbuena J, Gelfand E, Schweppe DK, Jedrychowski M, Golji J, Porter DA, Rejtar T, Wang YK, Kryukov GV, Stegmeier F, Erickson BK, Garraway LA, Sellers WR, Gygi SP. Quantitative Proteomics of the Cancer Cell Line Encyclopedia.Cell. 2020 Jan 23;180(2):387-402.e16. 원 파일은 모두 UCSD의 MassIVE 저장소에 업로드되어 있다.
4.3 방법
총 단백질체학:
단백질 수준에서 융합 또는 JET(접합부 엑손-TE)를 발견하기 위해, Stewart 등의 Cell(2019)에 공개된 폐 원발성 종양으로부터 공개적으로 이용 가능한 데이터가 사용되었다(PRIDE 데이터베이스에서 원 파일을 다운로드 받음 - 수탁 코드 PXD010357).
간략하게, 총 단백질 추출물을 세포주 또는 종양으로부터 수득한 다음, 트립신으로 분해하였다. 생성된 펩티드를 TMT를 사용하여 등압 태그로 화학적으로 표지하였고, 여기서 상이한 샘플을 내부 참조 표준과 함께 동일한 실험에서 분석하였다. 펩티드를 HPLC를 통해 오프라인으로 분획화하고, 각 실험과 상이한 분획을 질량 분광계(Thermo-Fisher의 Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Fusion Lumos) 상에서 별도로 실행하였다. 실험 절차 및 분석에 관한 추가 세부 사항은 해당 간행물에서 확인할 수 있다.
질량 분광분석 실행의 원 출력 파일을 검색 엔진으로서의 Sequest-HT와 함께 Proteome Discoverer 2.4(Thermo-Fisher)를 사용하여 조사하였다. 맞춤형 데이터베이스를 사용하여 Swissprot 및 TrEMBL 정규 서열뿐만 아니라 상이한 데이터세트(폐 TCGA 및 CCLE)로부터 예측된 폐 종양 특이적 JET 서열의 인실리코 번역을 포함하는 질량 분광분석 피크를 쿼리하였다. 단백질 절단은 최대 2개의 절단 실패를 허용하는 트립신으로 지정하였다. 본 발명자들의 검색을 펩티드 조사로 초점을 맞추기 위해 펩티드 FDR은 1%로 설정되었고, 단백질 FDR은 100%로 허용되었다. 펩티드에 대한 질량 내성은 4.5ppm이었고 단편 내성은 0.02Da였다. 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 변형으로 설정하였다. 정량화를 위해, 펩티드 식별을 위해 MS2 스캔과 페어링된 MS2 또는 MS3 단편화를 사용하여 TMT 리포터로부터의 신호를 수득하였다. 식별된 펩티드 중첩 접합부를 함유하고 Uniprot 주석에 따라 형질막 내에 위치한 유전자를 포함하는 접합부만을 유지하였다.
표면 농축 단백질체학
폐 선암종 세포주 H1650(ATCC)을 RPMI 배지에서 성장시키고, 소태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO2 분위기에서 보충하였다. 약 85% 융합성의 1천만 개의 세포를 피어스 세포 표면 단백질 바이오티닐화 및 분리 키트(Pierce Cell Surface Protein Biotinylation and Isolation kit)(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 A44390)를 사용한 표면 단백질체의 농축을 위해 사용하였다.
배지를 부착 세포로부터 제거하고, 이를 PBS로 세척하고, 키트 중 제공된 설포-NHS-SS-비오틴을 사용하여 비오티닐화하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 표지 용액을 제거하고 세포를 얼음처럼 차가운 TBS로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 얼음처럼 차가운 TBS에서 긁어내고, 4°C에서 500g으로 3분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 프로테아제 억제제가 보충된 키트에 제공된 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 세포의 완전한 파괴를 위해, 완충액이 있는 상태에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 추출물을 4°C에서 15000g으로 5분 동안 원심분리하여 제거하였다.
표지된 단백질을 포획하기 위해, 추출물을 키트의 제공된 컬럼 상의 NeutrAvidin 아가로오스 비드와 함께, 말단 회전자 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 미결합 물질을 컬럼을 원심분리하여 폐기하였다. 비드를 공급된 세척 완충액을 사용하여 세척하고, 잠시 동안 원심분리하여 관류를 폐기하였다. 세척 완충액으로 총 4회 세척한 다음, 20mM 트리스-HCl(pH 8)로 3회 더 세척하였다. 100ul의 용리 완충액(10mM 트리스-HCl(pH 8) 10mM DTT)을 사용하여 비오티닐화된 단백질의 용리를 수행하여, 말단 회전자에서 45분 동안 실온으로 비드와 함께 인큐베이션할 수 있게 하였다. 농축된 단백질을 컬럼을 1000g에서 2분 동안 원심분리하여 최종적으로 회수하였다.
용리물을 다음 분석에 사용하였다. 5.5mM CAA를 사용하여 어두운 곳에서 실온으로 30분 동안 단백질을 알킬화하였다. pH(7 내지 9)를 확인한 후, 실온에서 밤새 1:100 비율(단백질:효소)의 트립신을 사용하여 단백질의 용액 내 분해를 수행하였다. TFA로 샘플을 산성화시켜 트립신화를 중단시켰다.
생성된 펩티드를 C18 물질의 자체 충진된 마이크로컬럼을 사용하여 탈염시켰다. 컬럼을 70%ACN 0.1%TFA로 세척하고 0.1%TFA로 평형화시켰다. 샘플을 로딩하고 0.1%TFA로 추가 세척한 다음, 펩티드를 40%ACN 0.1%TFA로 용리하였다. 그런 다음, Orbitrap Fusion(Thermo Scientific)에서 LC-MS/MS 분석하기 전에 세척된 펩티드를 완전히 건조시켰다.
다음의 표 14 및 15는 각각 엑손이 공여체인 융합 전사체로부터 번역된 서열번호 1 내지 1423의 단백질(또는 본원에서 동의어로서 사용되는 용어로서의 펩티드) 및 TE가 공여체인 융합 전사체로부터 번역된 서열번호 1424 내지 8202의 키메라 단백질의 상세한 식별을 지칭한다. 이러한 (막관통) 신생항원성 펩티드 세트는 막관통 단백질에 대한 전사체 코딩에 속하는 것으로서 정상 단백질체 데이터베이스(예컨대, 본원의 UNIPROT)에서 주석이 달린 엑손 서열을 갖는 융합 전사체를 선택함으로써 수득되었다. 중단점 열은 엑손-유래 aa 서열과 TE-유래 aa 서열 사이의 중단점의 위치를 제공한다. 각 표의 마지막 열은 동일한 JET(또는 융합)의 스플라이스 변이체로부터 유래된 다양한 키메라 단백질(그들의 서열번호에 의해 식별됨)을 지칭한다.
표 16~18은 메타융합에 관한 것이다. 메타융합은 2개 융합의 조합이다.
예를 들어, 아래 표에서, metaFusion_id : chr1:154709520:->chr1:154705620:- | chr1:154744451:->chr1:154709564:-는 메타융합의 일부인 2개의 키메라 id로 만들어진다. 열 번호는 다음 항목을 나타낸다:
표 18은 서열번호 9166 내지 10163의 메타융합_id, 전사체, ORF 및 메타융합 펩티드(또는 동의어로서 본원에서 사용되는 단백질)에 대한 명칭을 제공한다.
표 19 및 20은 각각 엑손이 공여체인 융합 전사체로부터 번역된 서열번호 10164 내지 12830의 번역된 융합 펩티드 및 TE가 공여체인 융합 전사체로부터 번역된 서열번호 12331 내지 21452의 번역된 융합 펩티드의 상세한 식별을 지칭한다. 열 번호는 다음을 나타낸다:
열 11(위치)은 상응하는 전사체(열에 tx로 본원에서 언급됨)로부터 번역되고 각각의 융합 id와 연관된 펩티드의 서열번호에 대한 참조를 제공한다. 서열번호는 표 19의 경우 열 11의 숫자에 10163을 더하고 표 20의 경우 열 11의 숫자에 12330을 더함으로써 수득될 수 있다. 열 12는 열 11의 번역된 펩티드 각각에 대한 중단점의 위치를 제공한다.
표 19bis 및 20bis는 표 19 및 20으로부터의 엑손 또는 TE 공여체 융합으로부터 수득된 상응하는 펩티드를 지칭하며, 이들 표에 언급되어 있다. 표는 융합 id, ORF, 전사체의 명칭 및 융합에 관여하는 TE의 명칭을 제공한다.
[표 20]

Claims (30)

  1. 서열번호 1 내지 21542 중 어느 하나, 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 선택적으로는 적어도 4, 5, 6, 7 또는 9개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진, 키메라 폴리펩티드로서, 상기 키메라 폴리펩티드는 세포막에서 발현되는, 키메라 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 종양 샘플의 1% 초과, 특히 5% 초과, 및 통상적으로 10% 초과로 발현되는, 키메라 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 샘플과 비교하여 종양 샘플에서 더 높은 수준으로 발현되는, 키메라 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 샘플의 20% 미만, 특히 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만으로 발현되는, 키메라 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TE 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열의 일부가 세포 표면에서 노출되는, 키메라 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 키메라 폴리펩티드 또는 이의 단편에 약 10-5M 미만의 Kd 결합 친화도로 결합하는 항원 결합 도메인.
  7. 제6항에 있어서, 제1항 내지 제5항의 키메라 폴리펩티드 중 어느 하나로부터의 신생항원성 펩티드 서열에 결합하되, 신생항원성 펩티드 서열은 a) 서열번호 1~21542 중 어느 하나 또는 이의 단편으로부터 유래하고 TE-유래 아미노산 서열로부터 유래된 적어도 하나의 서열을 포함하고, 선택적으로 (i) TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 중단점과 중첩되는 단편 또는, 선택적으로 (ii) 순수 TE 서열을 포함하거나; b) 서열번호 1~1423, 8203~12830 중 어느 하나 또는 이의 단편으로부터 유래하고 TE-유래 아미노산 서열과 엑손-유래 아미노산 서열 사이의 접합부의 하류에 존재하는 비정규 ORF에 의해 암호화되는, 항원 결합 도메인.
  8. 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상, 통상적으로는 하나 또는 2개의 면역글로불린 영역(들)을 포함하는, 항원 결합 도메인.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 선택적으로 VH의 3개의 CDR을 포함하는, 항원 결합 도메인.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄 가변 영역(VL), 또는 선택적으로 VL의 3개의 CDR을 포함하는, 항원 결합 도메인.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 도메인을 포함하는 항체로서, 선택적으로 항체는 온전한 IgG, scFv, BiTE, 또는 다중특이적 항체로부터 선택되는, 항체.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 비-HLA 제한 T 세포 수용체(TCR).
  13. 제12항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인은 제2 세포외 항원 결합 도메인과 이량체화할 수 있는, 재조합 비-HLA 제한 TCR.
  14. 제13항에 있어서, 제2 세포외 항원 결합 도메인은 종양 항원에 결합하되, 바람직하게는, 종양 항원은 pHER95, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD70, CLL1, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, Erb-B2, Erb-B3, Erb-B4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 엽산 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, κ-경쇄, KDR, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MAGEA3, p53, MART1, GP100, 단백질분해효소3(PR1), 티로시나아제, 서바이빈, hTERT, EphA2, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 종양태아성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, BCMA, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, CD99, CD70, ADGRE2, CCR1, LILRB2, LILRB4, PRAME, 및 ERBB로부터 선택되는, 재조합 비-HLA 제한 TCR.
  15. 제12항에 따른 CAR로서, 상기 CAR은:
    a) 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인,
    b) 막관통 도메인,
    c) 선택적으로 하나 이상의 공자극 도메인
    d) ITAM2 및 ITAM3가 비활성화된 변형 CD3제타 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, CAR.
  16. 제15항에 있어서, 막관통 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 유래하는, CAR.
  17. 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공자극 도메인은 다음: 4-1BB, CD28, ICOS, OX40 및 DAP10으로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타 폴리펩티드의 세포내 신호 전달 도메인, 또는 이의 단편을 포함하되, 선택적으로 CD3-제타 폴리펩티드는 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 2(ITAM2) 및 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 3(ITAM3)이 비활성화되는, CAR.
  19. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 항원 결합 도메인을 포함하는, 제11항 내지 제18항에 정의된 것과 같은 항체, 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 신생항원성 펩티드, 또는 신생항원성 펩티드를 발현하는 세포에 약 10-6M 이하의 Kd 결합 친화도로 결합하는 항체, 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항의 방법에 의해 생산된 항체, TCR 또는 CAR로서, 선택적으로 TCR은 비-HLA 제한 TCR인, 항체, TCR 또는 CAR.
  21. 선택적으로 이종 조절 제어 서열에 결합되는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 신생항원성 펩티드, 또는 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 항체, CAR 또는 비-HLA 제한 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  23. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 CAR 또는 비-HLA 제한 TCR을 포함하는 면역 세포.
  24. 제23항에 있어서, T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+/CD8+ T 세포, TIL/종양 유래 CD8 T 세포, 중앙 기억 CD8+ T 세포, Treg, MAIT, Υδ T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로부터 선택된 동종 또는 자가 세포인, 면역 세포.
  25. 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Suv39h1에 결함이 있는, 면역 세포.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 면역 세포의 유효량 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키메라 폴리펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인, 제11항의 항체, 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR, 제21항의 폴리뉴클레오티드, 제22항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 세포, 또는 암 세포 증식을 억제하는 데 사용하기 위한, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료에 사용하기 위한, 앞의 것을 포함하는 조성물로서, 선택적으로 조성물은 약제학적 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키메라 폴리펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인, 제11항의 항체, 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR, 제21항의 폴리뉴클레오티드, 제22항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 세포, 또는 암의 세포 요법에 사용하기 위한 약제학적 부형제와 선택적으로 조합된, 앞의 것을 포함하는 조성물.
  29. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키메라 폴리펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인, 제11항의 항체, 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR, 제21항의 폴리뉴클레오티드, 제22항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 세포, 또는 적어도 하나의 추가 치료제와 조합되어 투여되는, 제27항 또는 제28항에 따라 사용하기 위한 약제학적 부형제와 선택적으로 조합된, 앞의 것을 포함하는 조성물.
  30. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 신생항원성 펩티드, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항원 결합 도메인, 제11항의 항체, 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 비-HLA 제한 TCR 또는 CAR, 제21항의 폴리뉴클레오티드, 제22항의 벡터, 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 세포, 또는 제29항에 따라 사용하기 위한 약제학적 부형제와 선택적으로 조합된, 앞의 것을 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 하나의 추가 치료제는 화학요법제, 또는 면역치료제이거나, 선택적으로 체크포인트 억제제인, 조성물.
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