KR20230164436A

KR20230164436A - 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법

Info

Publication number: KR20230164436A
Application number: KR1020220064181A
Authority: KR
Inventors: 박진희; 조창희; 장혜린; 김선기; 이현재
Original assignee: 한화솔루션 주식회사; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2023-12-04
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: KR102804540B1

Abstract

본 발명은 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고 이를 특정 배지 조성물과 배양 조건을 이용하여 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킨 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전적 변형없이 안전성이 입증된 식품 공정에 이미 사용되고 있는 야생형 효모 균주를 이용하여 헴을 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하는 경우 헴을 저렴한 비용으로 산업적 규모로 대량생산이 가능한 장점이 있다.

Description

야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법 {Method for high-yield production of heme using wild-type S. cerevisiae}

본 발명은 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고 이를 특정 배지 조성물과 배양 조건을 이용하여 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킨 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법에 관한 것이다.

지구온난화, 식량부족, 동물복지 등의 문제를 해결하기 위한 해결책으로 대체 단백질 소재에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한, 세계적으로 소비자들의 건강에 대한 관심과 함께 채식 인구가 증가하면서 대체육에 대한 관심도 더불어 증가하고 있다. 이러한 사회적 흐름에 부합하여 다양한 대체육 제품의 개발 및 출시가 활발하게 이루어지고 있으며 동물성 육류를 영향학적으로 대체할 수 있는 식물성 대체육 시장이 지속적으로 성장하고 있다.

초기 식물성 대체육 제조 기술은 조직 식물 단백질 (TVP)을 주원료로 시작되었으며, 원료 다변화와 원료별 특성 연구, 고수분 성형 기술을 이용한 고기의 식감구현, 고기 맛의 핵심 요소인 헴 (heme)의 생명공학기술을 이용한 생산 및 첨가의 순으로 발전해왔다.

대체육 시장에서 기술적으로 가장 앞서 있다고 평가받는 푸드테크 기업인 임파서블 푸드 (Impossible Foods)는 육류에 풍미를 내는데 중요한 역할을 하는 헴을 GMO (genetically modified organism) 효모를 이용하여 생산하여 첨가하고 있다 (대한민국 등록특허 10-2229968). 그러나, GMO 유래 식품을 반대하는 소비자들은 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴의 소비에 부정적인 인식을 가지고 있다. 한편, 국내에서도 미국, 유럽과 마찬가지로 대체육에 대한 관심이 증가하고, 관련 식품 소비도 증가하고 있으나, 현재 생산되는 대체육은 주요 원료를 대부분 수입에 의존하고 있어 이를 국내산 자원으로 대체하는 연구가 필요한 실정이다. 특히, 국내에서는 GMO 유래 식품에 대한 규제가 강화되는 추세에 있어 GMO 효모를 이용하여 생산된 헴을 대체육에 첨가하는데 제약이 있다.

한편, 헴은 일반적으로 유기용매나 효소적 가수분해에 의해 동물의 혈액에서 추출되기도 하지만, 도축 혈액으로부터 분리, 정제된 헴은 광우병 등과 같이 동물에서 유발될 수 있는 질병의 위험 때문에 안전성이 문제되고, 혈액 내 함량이 낮아 많은 혈액이 필요하며, 이 방법을 이용하는 경우 동물 도축이 반드시 요구되기 때문에 채식을 추구하는 소비자들은 동물을 도축하여 추출된 헴이 함유된 대체육 소비를 선호하지 않는다.

효모 (Saccahromyces cerevisiae)는 단세포 진핵생물로 오랜 기간 식품공정에서 주정 및 제빵 용도로 사용되고 있는 GRAS (Generally Recognized as Safe) 균주이다. 본 발명에서는 유전적 변형 없이 안전성이 입증된 야생형 효모를 사용하여 유전적 변형 없이 헴의 생산량을 현저히 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하였으며, 식품 산업에 이미 사용되고 있는 다양한 효모 균주를 대상으로 헴 생산 효율이 높은 균주를 일차적으로 선별하고, 헴 생산 균주의 헴 생산 효율을 극대화시킬 수 있는 배지 조성 및 배양 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 10-2229968

본 발명에서는 유전자 변형없이 식품으로서 안전성이 입증된 야생형 효모 균주를 이용한 헴 고생산 방법 및 이를 위한 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 헴 생산방법을 제공한다:

(a) S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 배양하는 단계: 및

(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 질소원으로 2 내지 6 %(w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3 % (w/v) 펩톤을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 20 내지 35 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 40 내지 120시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 50 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 100 내지 1500 rpm의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 (i) 탄소원; (ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 헴을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 유전적 변형없이 안전성이 입증된 식품 공정에 이미 사용되고 있는 야생형 효모 균주를 이용하여 헴을 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 본 발명에서 제공하는 헴 생산방법 및 배지 조성물을 이용하는 경우 헴을 저렴한 비용으로 산업적 규모로 대량생산이 가능한 장점이 있다.

도 1은 효모 균주 세포 내 존재하는 헴을 추출하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 다양한 야생형 효모 균주를 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 3은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 교반속도(80, 250, 350 rpm)에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 4는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 탄소원에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 5는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 다양한 질소원에서 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 6은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 질소원 비율의 달리하여 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 7은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 배양하는 기본 배지를 달리하여 회분식 배양한 후 세포 내 존재하는 헴을 추출하여 헴 농도 (mg/L)를 비교한 결과이다.
도 8은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 3.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 9는 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 10은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. Feeding solution으로는 800 g/L의 포도당을 사용하였다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 11은 S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 pH 4.5 조건에서 40YP20D 배지를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. 공기주입 속도는 1 vvm, 교반속도는 300 rpm 또는 500 rpm으로 유지하였다. (A)는 세포, 대사체, 헴 농도, (B)는 용존 산소량(DO%), (C)는 Feeding solution 주입속도를 나타낸다.
도 12는 배지 내 첨가한 헴 농도에 따른 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 성장 곡선(A) 및 세포 내 헴 농도(B)를 비교한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 특징부의 크기, 양 및 물리적 특성을 표현하는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 개시된 수치 파라미터는 본 명세서에 개시된 교시 내용을 이용하여 당업자가 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.

본 발명에서는 유전자 변형을 유도하지 않고 야생형 효모 균주로부터 헴을 대량생산하는 방법을 제공하고자, 제빵, 양조 등 다양한 식품 산업에 이미 활용되고 있는 다양한 야생형 효모 균주로부터 헴 생산성이 높은 효모 균주를 선별하고, 상기 효모 균주를 다양한 배지 조성 및 배양 조건에서 배양함으로써 헴 생산성을 극대화시킬 수 있는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 다음 단계를 포함하는 헴 생산방법에 관한 것이다:

(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계..

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 배지 총 부피에 대하여, 3 내지 7% (w/v), 구체적으로 4 내지 6% (w/v), 가장 구체적으로 약 5% (w/v)로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 질소원으로 효모 추출물 및 펩톤을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 질소원은 배지 총 부피에 대하여, 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3 % (w/v) 펩톤, 구체적으로 3 내지 5 % (w/v) 효모 추출물 및 1 내지 2.5 % (w/v) 펩톤, 가장 구체적으로 약 4 % (w/v) 효모 추출물 및 약 2 (w/v) 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 펩톤은구체적으로 박토 펩톤일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 배양 배지의 산도를 pH 3 내지 6를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 pH 3.5 내지 5.5, 더 구체적으로 pH 4 내지 5, 가장 구체적으로 약 pH 4.5로 배양 배지의 산도를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 배양 배지의 온도를 20 내지 35 ℃로 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 25 내지 33 ℃, 더 구체적으로 26 내지 30 ℃, 더욱 구체적으로 27 내지 29 ℃, 가장 구체적으로 약 28 ℃로 배양 배지의 온도를 유지시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 40 내지 120 시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 42 내지 80시간, 더 구체적으로 44 내지 60 시간, 가장 구체적으로 46 내지 50 시간 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 배양 시간은 원하는 헴의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 50 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며,구체적으로 250 내지 400 rpm, 더 구체적으로 350 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 100 내지 1500 rpm 의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 300 내지 1300 rpm, 더 구체적으로 700 내지 1200 rpm의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 1 내지 8 vvm, 예컨대, 2 내지 5 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 배양은 상기 균주를 배양한 전배양액을 그대로 사용하거나, 분리된 균주를 사용하거나 또는 동결 보관된 균주 또는 이의 배양물을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양"은 상기 균주를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에 따른　배양　방법에는 회분식　배양(batch culture), 연속식　배양(cintinuous culture) 및 유가식　배양(fed-batch culture)이 포함되며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로　배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 배양은 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대 액상 배양 탱크, 회전 드럼식 발효기(rotary drum fermentor) 또는 트레이 발효기 (tray fermentor)를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 회전 드럼식 또는 트레이 발효기 이외에도 균주의 발효에 유용한 것이라면 그 형식에 제한 없이 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 생산 규모에 따라 적절한 장치를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서는 배양　중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을　배양물에 적절한 방식으로 첨가하여,　배양물의 pH를 조정할 수 있다.　배양　중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한　배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여,　배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 효모 균주를 파쇄하여 헴을 회수하는 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

일 양태로서, 본 발명에 있어서 상기 (b) 단계는 도 1에 기재된 일련의 과정에 의해 수행될 수 있다.

상기 과정을 간략히 서술하면, 상기 (a) 단계의 배양 과정을 거친 효모 균주는 원심 분리한 후 OD₆₀₀*mL=60 당 0.4 ml의 효모 용해 버퍼 (예컨대 Y-PER^™ Yeast Protein Extraction Reagent)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하고, 파쇄된 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취한다. 회수된 침전물에 8 : 2의 부피비율로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산(HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시키고, 추가로 상온에서 포화된 농도의 MgSO₄와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후, 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴 층을 분리하고, 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴 층을 회수한다.

본 발명에 있어서 헴을 회수하는 방법에는, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하기 전 균주를 수확(harvest)하여 헴을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하면 효모 생장이 저해되어 헴 생산량이 감소하기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 배지 내 헴 농도가 0.25 내지 0.45 mM일 때 균주를 수확하여 헴을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 균주 배양액에서 햄을 추가로 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 또한, 효모를 이용하여 헴을 생산하는데 적합한 배지 조성물을 개발하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (i) 탄소원; (ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 탄소원은 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 구체적으로는 4 내지 6% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스, 가장 구체적으로는 약 5% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 구체적으로 (i) 4 내지 6% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; (ii) 3 내지 5 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 1 내지 2.5 % (w/v) 펩톤;을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 가장 구체적으로 (i) 약 5 % (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스; (ii) 약 4 % (w/v) 효모 추출물; 및 (iii) 약 2 % (w/v) 펩톤;을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물를 사용하는 경우 효모의 헴 생산량을 극대화 할 수 있는바, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 생산방법에 의해 생산된 헴에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 헴을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 인공육 또는 육류 대체 식품은 육류와 비슷한 식감, 질감, 풍미 및/또는 향미를 가지도록 모사한 고기 모조물을 의미한다.

상기 식품 조성물은 음용할 수 있는 식품이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 식품의 비제한적인 예로는, 핫도그, 버거, 세절육, 소시지, 스테이크, 필렛, 구운 고기, 가슴살, 넓적다리살, 날개살, 미트볼, 미트로프, 베이컨, 스트립, 핑거, 너겟, 커틀렛 또는 큐브 형태의 동물 기반 또는 비-동물 기반 (예를 들어, 식물 기반) 식제품, 또는 동물 기반 또는 비-동물 기반 식제품의 조합을 포함한다.

상기 식품은 또 다른 양태로서, 스프 또는 스튜 베이스, 부용, 예를 들어, 분말 또는 큐브, 풍미제 패킷, 또는 조미 패킷 또는 쉐이커와 같은 식품 첨가제 형태로 제공될 수 있다.

실시예

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 헴 고생산 효모 균주 선별

1-1. 헴 고생산 효모 균주 후보군

식품산업에 바로 적용 가능한 헴 고함량 효모 균주를 선별하기 위하여, 제빵, 양조 등 다양한 식품 산업에 활용되고 있는 야생형 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 및 근연종 32종을 농업유전자원정보센터와 한국미생물보존센터로부터 분양받았다 (표 1 참조).

No.	균주	특성	No.	균주	특성
1	S. coreanus KCCM 11215	포도액 유래	17	S. cerevisiae KCCM 50549	에탄올 고내성
2	S. cerevisiae KCCM 11306	사케 제조	18	S. cerevisiae Y993 KCCM 51288	울산광역시 막걸리 제조
3	S. ellipsodieus KCCM 11352	독일 화이트 와인 제조	19	S. cerevisiae Rey36-3 KCCM 51299	경기도 누룩 유래
4	S. cerevisiae KCCM 11695	영국 맥주 제조	20	S. cerevisiae KACC 48234	공주시 누룩 유래
5	S. ellipsodieus KCCM 12224	미국 캘리포니아 와인 제조	21	S. cerevisiae KACC 48330	단양군 막걸리 제조
6	S. anamensis KCCM 12233	당밀 발효	22	S. cerevisiae KACC 48331	영암군 막걸리 제조
7	S. cerevisiae KCCM 12249	라게 제조	23	S. cerevisiae KACC 48332	고흥군 막걸리 제조
8	S. capensis KCCM 12485	포도액 유래	24	S. cerevisiae KACC 48333	당진시 막걸리 제조
9	S. cerevisiae KCCM 12488	제빵	25	S. cerevisiae KACC 48334	의령군 막걸리 제조
10	S. formosensis KCCM 12634	증류주 제조	26	S. cerevisiae KACC 48335	의령군 막걸리 제조
11	S. cerevisiae KCCM 12638	아메리칸 위스키 제조	27	S. cerevisiae KACC 48336	칠곡군 막걸리 제조
12	S. cerevisiae KCCM 12651	헝가리 토카이 와인 제조	28	S. cerevisiae KACC 48337	전주시 막걸리 제조
13	S. cerevisiae KCCM 34709	당밀 발효	29	S. cerevisiae KACC 48338	아산시 막걸리 제조
14	S. diastaticus KCCM 35222	부패된 맥주 유래	30	S. boulardii ATCC MYA-796	비오플 (정장제) 유래
15	S. cerevisiae JP KCCM 43339	전라북도 누룩 유래	31	S. cerevisiae N4	제빵
16	S. cerevisiae KCCM 50518	사케 제조	32	S. cerevisiae KCCM 12648	사케 제조

1-2. 전배양

초저온 냉동고 (deep freezer)에 보관 중인 효모 글리세롤 (glycerol) 스탁 (stock) 50 ul을 5 mL YP20D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L glucose) 배지가 포함되어 있는 시험관에 접종하여 25 ℃, 250 rpm에서 48시간 전배양하였다.

1-3. 본배양 및 효모 세포 파쇄

전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 100 mL YP50D (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 50 g/L glucose) 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하였다. 25 ℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양한 효모 균주 세포를 OD₆₀₀×mL=60이 되도록 (예를 들어 OD₆₀₀=1이라면 60 mL의 배양액) 원심분리로 회수한 후, 0.4 ml의 Y-PER^™ Yeast Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)를 첨가하여 효모 세포를 파쇄하였다.

1-4. 헴 농도 측정

효모 세포 파쇄 용액, 즉, 효모 추출물에 존재하는 헴 농도를 측정하기 위한 전처리 방법은 도 1에 기재된 바와 같다. 간단히 설명하면, 0.4 ml의 효모 추출물에 1.2 ml의 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액은 제거하고 침전물만 취한다. 회수된 침전물에 8 : 2의 부피비율로 섞어 제조한 아세토나이트릴 : 1.7 M 염산(HCl) 용액 1.6 ml을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 추가로 상온에서 포화된 농도의 MgSO₄와 100 μg/L의 NaCl을 포함하는 용액 0.4 ml를 첨가하여 5분 동안 교반시킨 후 원심분리하여 수용액층과 아세토나이트릴층을 분리하였다. 헴이 포함되어 있는 아세토나이트릴층을 취한 후 HPLC 분석을 진행하였다.

헴의 농도는 YMC-Pack ODS-A, 12 nm, 5 um, 150 x 4.6 mm column (YMC, Japan) 및 UV 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 상세한 분석 조건은 표 2 및 표 3과 같다. 헴 표준물질로는 Hemin (Sigma, USA)을 사용하였다.

HPLC condition
Mobile phase A	ACN/H₂O (5:95 v/v) + 0.1% Formic acid
Mobile phase B	ACN/H₂O (95:5 v/v) + 0.1% Formic acid
Flow rate	0.4 mL/min
Injection volume	20 uL
Autosampler temperature	5^oC
Colum temperature	50^oC
Detector	UV-Vis at 400 nm

Gradient	Time [min]	A (%)	B (%)
	0	80	20
	10	0	100
	11	0	100
	11.1	0	100
	12	80	20
	25	80	20

실험용 효모 균주인 S. cerevisiae D452-2를 대조군으로 하여 표 1에 기재된 32종의 식용 효모 균주를 플라스크 수준에서 배양한 후 헴 농도를 측정한 결과, 도 2에서와 같이 헴 함량이 높은 야생형 효모 균주를 선별할 수 있었으며, 이중에서도 특히, 아메리칸 위스키 제조용 효모 균주인 S. cerevisiae KCCM 12638의 헴 농도 (mg/L)가 8.6 mg/L로 가장 높은 수치를 나타내었다. 따라서, 이후의 모든 실험은 S. cerevisiae KCCM 12638를 이용해 진행하였다.

실시예 2. 헴 고생산을 위한 회분식 발효 공정 교반속도의 결정

효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 교반속도를 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 100 mL YP50D 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃에서 각각 80, 250, 혹은 350 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

교반속도에 따른 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산 효과를 비교하기 위하여 80, 250, 350 rpm 조건에서 회분식 배양을 수행한 결과, 교반속도가 증가함에 따라 헴 생산량도 증가하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 350 rpm의 교반속도는 250 rpm의 교반속도 대비 헴 생산량이 32% 높게 나타났다 (도 3). 결론적으로 호기적 (aerobic) 조건이 헴 생산에 유리함을 알 수 있었다.

실시예 3. 헴 고생산을 위한 탄소원 결정

효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 탄소원을 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 접종하였다. 이 때, YP (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone) 배지에 포도당 (glucose), 과당 (fructose), 갈락토오스 (galactose), 유당 (lactose). 엿당 (maltose), 혹은 서당 (sucrose)이 각각 50 g/L의 농도로 첨가된 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하였으며, 접종 후에는 25 ℃, 250 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산을 증가시키기 위하여 최적의 탄소원을 확인한 결과, 과당과 갈락토오스를 탄소원으로 이용하는 경우 포도당을 이용하는 경우보다 헴 생산량이 각각 10%, 13% 증가하는 것으로 나타났다 (도 4). 그러나, 과당과 갈락토오스의 가격이 포도당 보다 현저히 높고, 헴 생산량이 증가되는 정도가 비교적 낮아, 경제성을 고려하여 포도당을 헴 생산을 위한 탄소원으로 사용하였다.

실시예 4. 헴 고생산을 위한 질소원 결정

효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 질소원을 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃, 250 rpm 조건으로 48시간 진탕배양하였다. 이 때, 이용된 배지의 탄소원은 5% (w/v) 포도당으로 고정하였고, 질소원은 YP 배지에 포함되어 있는 1% (w/v) 효모 추출물(yeast extract)와 2% (w/v) 박토 펩톤 (bacto peptone)의 75%를 다른 질소원으로 대체하며 헴 생산량을 비교하였다 (표 4).

No.	Yeast extract	Peptone	Glucose (Carbon source)	Additional nitrogen source (2.25%)
Control	1%	2%	5%	X
1	0.25%	0.5%		Peptone
2				Tryptone
3				Yeast extract
4				Malt extract
5				Beef extract
6				Casein
7				Soytone
8				NaNO₃
9				NH₄Cl
10				(NH₄)₂SO₄

예를 들어 표 4의 1번 조건의 경우 효모 추출물, 박토 펩톤의 농도가 각각 0.25% (w/v), 2.75% (w/v)이며, 2번 조건의 경우 효모 추출물, 박토 펩톤, 트립톤의 농도가 각각 0.25% (w/v), 0.5% (w/v), 2.25% (w/v)이다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산을 증가시키기 위하여 최적의 질소원을 확인한 결과, 대조군인 YP50D 배지 대비 YP50D 배지의 질소원 75%를 효모 추출물로 대체하였을 때 (즉, 최종 효모 추출물과 박토 펩톤의 농도는 각각 2.5% (w/v)와 0.5% (w/v)인 경우) 헴 농도가 21% 증대되는 것으로 나타났다 (도 5).

실시예 5. 헴 고생산을 위한 질소원 비율의 조정

헴은 화합물 내부에 질소를 함유하고 있어, 실시예 4에서 결정된 질소원 비율을 조절함으로써 햄 생산량을 현저히 향상시킬 수 있을 것으로 판단하였다. 이를 위하여 실시예 4에서 확인된 효모 추출물(yeast extract)과 박토 펩톤(bacto peptone)의 농도비를 조절하는 실험을 진행하였다.

전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양하였다. 이 때, 이용된 배지의 탄소원은 5% (w/v) 포도당으로 고정하였고, 표 5와 같이 다양한 비율의 효모 추출물과 펩톤을 첨가하여 그 효과를 검증하였다. 대조군으로는 1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 박토 펩톤, 5% (w/v) 포도당 농도를 갖는 YP50D 배지를 사용하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

No.	Yeast extract	Peptone	Glucose (Carbon source)
Control	1%	2%	5%
1	2.5%	0.5%
2	3.5%	0.5%
3	4.5%	0.5%
4	3%	0%
5	4%	0%
6	2%	2%
7	4%	2%

S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산량을 증대시키고자 효모 추출물 및 박토 펩톤의 첨가 비율을 변화시켜 본 결과, 4% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 박토 펩톤을 질소원으로 사용하는 경우, 헴 농도를 15.4 mg/L까지 향상시켜 대조군에 비해 2배 이상 헴 생산량을 증진시킬 수 있었다 (도 6).

실시예 6. 헴 고생산을 위한 기본 배지 결정

효모 균주의 회분식 발효에서 헴 고생산을 위한 최적의 배지를 결정하고자, 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 100 mL 액체배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25 ℃, 250 rpm 조건에서 48시간 진탕배양하였다. 사용된 배지는 SC 배지(표 6), M/CSL 배지(표 7), BPM 배지 (표 8)로, SC 배지는 2X, BPM 배지는 3X로 농축한 실험군도 추가로 비교하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

Synthetic complete (SC) medium - 1X
Yeast nitrogen base without amino acid	6.7 g/L
Synthetic complete supplement mixture	2.0 g/L
Glucose	50 g/L

Molasses / Corn steep liquor (M/CSL)
Molasses	10% (v/v)
Corn steep liquor	20% (v/v)

Batch production medium (BPM) - 1X
Yeast extract	3 g/L
Glucose	50 g/L
(NH₄)₂SO₄	2.2 g/L
KH₂PO₄	1.5 g/L
Na₂HPO₄	1.8 g/L
MgSO₄·7H₂O	0.2 g/L
CaCl₂·2H₂O	10 mg/L
(NH₄)₅[Fe(C₆H₄O₇)₂]	6 mg/L
CoCl₂·6H₂O	0.2 mg/L
H₃BO₃	0.3 mg/L
ZnSO₄·7H₂O	0.1 mg/L
MnCl₂·4H₂O	0.03 mg/L
Na₂MoO₄·2H₂O	0.03 mg/L
NiSO₄·7H₂O	0.02 mg/L
CuSO₄·5H₂O	0.01 mg/L

다양한 배지를 이용하여, S. cerevisiae KCCM 12638 균주를 배양한 결과, SC, M/CSL, BPM 배지와 비교하여, 본 발명 상기 실시예들을 통해 도출된 변형된 YPD 배지에서 가장 높은 헴 농도인 13.8 mg/L가 생산되었다 (도 7). 구체적으로, 본 발명에서 개발한 변형된 YPD 배지는 각각 종래 YPD 배지에 비하여 210%, 1X SC 배지에 비하여 2600%, 2X SC 배지에 비하여 1300%, 1X BPM 배지에 비하여 3300%, 3X BPM 배지에 비하여 400%, M/CSL 배지에 비하여 2800% 헴 생산량이 증가하였다.

그 밖에도 당밀(molasses), 옥수수 침지액(corn steep liquor)을 5 내지 20% 농도로 5% 포도당과 다양하게 조합하여 탄소원으로 사용해보았으나, 유의하게 헴 생산을 증가시키지는 않는 것으로 확인되었다 (데이터 미도시).

실시예 7. 유가식 배양을 통한 헴 생산 농도의 추가 증대

유가식 배양은 회분식 배양과 다르게 미생물의 생장에 필요한 탄소원 및 질소원을 계속적으로 공급하여 균체량을 현저하게 증대시킬 수 있으며, 이에 따라 목적하는 물질의 생성량을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서는 최종적으로 유가식 배양을 통해 S. cerevisiae KCCM 12638 균주의 헴 생산량을 증대시키고자 하였다.

유가식 배양은 2.5 L 규모의 생물배양기에서 working volume을 1 L로 하여 진행하였다. 전배양은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 진행하였다. 전배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이되도록 100 mL YP20D 배지가 포함되어 있는 baffled 플라스크에 접종하여 25℃, 250 rpm에서 48시간 계대배양을 진행하였다. 계대배양된 효모 균주를 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 1.0이 되도록 1 L의 40YP20D (40 g/L yeast extract, 20 g/L bacto peptone, 20 g/L glucose) 배지에 접종하였다. 배양조건은 pH를 3.5 또는 4.5로 유지하여 25℃, 700 rpm, 2 vvm 조건에서 진행하였다. 초기 포도당을 모두 소모한 시점에서 추가로 feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose)을 4-24 mL/hr의 유속으로 주입하였다. Feeding solution의 주입속도는 효모 배양액의 포도당 농도가 0 g/L에 가깝고 에탄올의 농도가 10 g/L를 초과하지 않는 범위 내에서 결정하였다. 교반속도 및 공기주입 속도를 각각 최소 700 rpm 및 2 vvm에서 최대 1200 rpm 및 5 vvm까지 증가시켜 용존산소량 (DO)을 높은 수치로 유지하였다. 포도당 (glucose), 글리세롤 (glycerol), 초산 (acetate) 및 에탄올 (ethyl alcohol)의 배지 중 농도는 Rezex ROA-organic acid H⁺ column (Phenomenex, Torrance, CA) 및 RI (Refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 통해 측정하였다. 컬럼 온도는 70 ℃로 유지하였으며 이동상으로는 5 mM의 황산 (H₂SO₄) 용액을 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주어 검출하였다. 헴 농도는 실시예 1-4에 기재된 방법으로 측정하였다.

pH 3.5와 pH 4.5 조건에서 상기와 같은 방법으로 유가식 배양을 수행해본 결과 pH 3.5 조건에서는 최대 37.3 mg/L 헴이 생산되었고(도 8), pH 4.5 조건에서는 최대 48.5 mg/L 헴이 생산되어(도 9), pH 4.5 조건이 헴 생산에 바람직한 것으로 확인되었다.

Feeding solution에 포함되어 있는 질소원인 효모 추출물과 박토 펩톤 의 가격이 탄소원인 포도당과 비교하여 현저히 높기 때문에 도 10의 실험에서는 가격이 저렴한 탄소원만을 첨가하였을 때 헴 생산량이 어느 정도까지 도달하는지 확인하고자 하였다. 또한, 산업용 규모의 발효기 운용 시에 효모에 공급되는 산소주입 속도와 교반속도가 실험실용 발효기 조건에 비해 현저히 떨어지기 때문에 산업용 규모 발효기 환경을 모방하여 헴 생산량이 어느 정도까지 도달하는지 확인하고자 하였다. 이에 따라, 도 11의 실험에서는 공기주입 속도는 1 vvm으로 낮추어 고정하고 교반속도는 발효 초기에는 300 rpm, 발효 후기에는 500 rpm으로 낮추어 고정하였다. 그 결과, 기존의 feeding solution (280 g/L yeast extract, 140 g/L bacto peptone, 350 g/L glucose)과 교반속도 및 공기주입 속도를 유지하는 경우 가장 높은 헴 생산량을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 9 참조). 그러나 공기주입 속도와 교반속도를 현저하게 낮춘 경우에도 상당히 높은 농도 (30.0 mg/L)의 헴을 생산할 수 있었다.

실시예 8. S. cerevisiae KCCM 12638 균주에 대한 헴 독성 시험

효모 균주를 이용하여 최대 헴 생산 농도에 도달하기 위해서는 효모 균주의 성장 저해를 일으키지 않는 배지 내 혹은 세포 내 최대 헴 농도를 알아야 한다. 먼저, 효모 배양을 통해 최대로 도달할 수 있는 배지 내 헴 농도를 알아보기 위해, 배지에 0 내지 4 mM의 헴을 첨가하고 균주의 성장이 저해되는지 70시간 동안 확인하였다.

그 결과, 배지 내 헴 농도가 0.5 mM (308 mg/L) 이상일 때, 헴이 고농도로 효모 세포 내로 유입되면서 독성을 나타내어 효모 세포의 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다 (도 12 참조). 따라서, 배지 내 분획에서 헴을 생산하고자 하는 경우에는 배지 내 헴 농도가 0.5 mM에 도달하기 전 효모로부터 헴을 회수하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

한편, 0.2 mM의 헴을 배지 중에 첨가한 경우 효모 세포의 성장 저해 효과는 관찰되지 않았으며, 세포 내 헴 농도가 대략 25 mg 헴/g cell까지 증가되었다 (도 12 참조). 유가식 배양에서 일반적으로 효모 세포의 균체 농도가 100 g cell/L까지 도달하는 것을 고려하였을 때, 헴을 효모의 세포 내 분획에서 생산한다면 2.5 g/L 이상의 고농도로 생산 가능함을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 헴 생산방법:
(a) S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 균주를 배양하는 단계: 및
(b) 상기 균주로부터 헴을 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 탄소원으로 포도당, 과당 또는 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 질소원으로 2 내지 6 %(w/v) 효모 추출물 및 0.1 내지 3 % (w/v) 펩톤을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 pH 3 내지 6에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 20 내지 35 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 균주는 40 내지 120시간 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 50 내지 400 rpm의 교반속도로 회분식 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 100 내지 1500 rpm의 교반속도로 유가식 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 0.5 내지 10 vvm의 속도로 공기를 주입하며 유가식 배양하는 것을 특징으로 하는, 헴 생산방법.
(i) 탄소원;
(ii) 2 내지 6 % (w/v) 효모 추출물; 및
(iii) 0.1 내지 3% (w/v) 펩톤;를 포함하는 S. cerevisiae KCCM 12638, S. cerevisiae KACC 48338, S. cerevisiae Y993 KCCM 51288, S. cerevisiae JP KCCM 43339 및 S. cerevisiae KCCM 12651로 구성된 군에서 선택되는 균주 배양용 배지 조성물.
제10항에 있어서, 상기 배지 조성물은 헴 생산용 배지 조성물인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제10항에 있어서, 상기 탄소원은 3 내지 7% (w/v)의 포도당, 과당 또는 갈락토오스인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의해 생산된 헴을 포함하는 식품 조성물.
제13항에 있어서, 상기 식품은 인공육 또는 육류 대체 식품인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.