KR20230157732A

KR20230157732A - 지충이 효소 가수분해물 또는 이의 다당 분획물을 포함하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230157732A
Application number: KR1020220057312A
Authority: KR
Inventors: 강민철; 전유진; 송경모; 류아름; 김세라; 이효근
Original assignee: 한국식품연구원; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2042-05-10
Also published as: KR102815968B1

Abstract

본 발명은 비만의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지충이 효소 가수분해 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 포함함으로써, 비만에 의해 유발될 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있으므로, 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

지충이 효소 가수분해물 또는 이의 다당 분획물을 포함하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating of obesity comprising sargassum thunbergii fraction}

본 발명은 가수분해 효소로 처리된 지충이의 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

우리나라는 물론 세계적으로 경제발전 및 의료기술의 발달로 인하여 인간의 평균수명이 길어지고 삶의 질이 빠른 속도로 향상되고 있어 이에 부합하는 적극적인 웰빙시대의 대응전략이 시급히 요청되고 있다. 특히, 가속화되고 있는 노령화, 성인병의 발생에 따른 국민건강의 보호 및 정부와 개인의 의료비 절감의 차원에서도 효과적이고 안전한 의약품 및 건강기능식품의 개발이 필요하다.

심장마비, 고혈압, 동맥경화, 뇌졸중 등의 심혈관질환은 세계적으로 전체 사망률의 30%를 차지하고 있다. 특히 비만, 당뇨병, 고혈압, 동맥경화증, 심장 질환, 뇌졸중 등은 각기 다른 질병으로 보이지만 체지방 증가로 인한 인슐린 저항성이라는 공통 병인을 갖는 하나의 증후군으로 이해되고 있다.

비만은 전 세계적으로 가장 흔한 영양장애 중의 하나로서 WHO 통계자료에 의하면 현재 2억 5천여만명이 비만 환자로 분류되며 20년 후에는 약 3억명이 비만으로 고통받을 것으로 예측된다.

상기 비만은 과량의 에너지 섭취 또는 에너지 소비 저하로 인해 열량 대사가 불균형하여 체지방이 과도하게 축적된 상태를 지칭하며, 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 대사질환의 발명으로 이어질 수 있다. 최근에는 현대인들의 서구적인 식생활 패턴과 운동 부족으로 인해 비만의 발병율이 급격히 증가하는 추세이며, 수치상의 개념으로는 BMI(body mass index, 체질량지수) 측정 시 25 이상일 경우를 비만으로 정의하고, BMI 측정법은 체중(kg)을 키의 제곱(㎡)으로 나눈 값을 통해 체지방의 양을 추정하는 비만측정법이다.

비만치료제 중에서 식욕억제제에는 휴터민정, 펜터민 및 로카세린이라는 성분이 있고 부작용으로는 불안감, 현기증과 불면증 등이 있으며 지방분해효소 억제제에는 오르리스타트, 로카세린과 마진돌 등이 있고 부작용으로는 기름변, 복통과 변실금 등이 있는데, 상기 상업화된 약물들의 부작용이 보고됨에 따라 효과가 뛰어나면서 부작용이 적은 천연물 유래의 비만치료제가 요구되는 실정이다.

비만은 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 정상적인 지방세포의 이상발달이 발생하는데 지방세포로의 과잉분화와 지방세포 내 지방의 축적은 지방세포의 수나 크기를 증가시키고 그에 따라 비만 증상이 더욱 심해지는 것으로 알려져 있다. 지방전구세포가 confluence 상태가 되면 세포 주기가 정지되어 세포의 증식이 중단되고 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX), dexamethasone (DEX) 및 insulin 등의 호르몬에 의해 지방세포로 분화(adipogenisis)가 유도되고 비만은 조직 내 지방세포가 비대(hypertrophy)와 과형성(hyperplasia)으로 초래된다. 지방전구세포의 초기분화 과정은 DEX에 의해 cAMP의 농도가 증가되면서 sterol regulatory element binding proteins-1c (SREBP-1c) 발현이 유도된 후 IBMX에 의해 peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPAR-γ)가 발현되어 분화를 촉진한다.

따라서 지방전구세포 분화에 핵심적인 전사인자의 발현 조절을 통해 지방세포 분화를 억제하는 것은 비만을 예방하는 효과적인 전략이며, 이에 천연물로부터 독성 및 부작용이 없는 천연물질을 이용한 비만치료제가 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 제2021-0119622호 대한민국 공개특허 제2011-0068923호

본 발명의 목적은 가수분해 효소로 처리된 지충이의 가수분해 추출물 (STAC) 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 가수분해 효소로 처리된 지충이의 가수 분해 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 비만을 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물은 지충이(sargassum thunbergii) 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

상기 지충이 조다당 추출물은 지충이를 가수분해 효소로 처리한 것일 수 있다.

상기 가수분해 효소는 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테아제(Endo protease) 및 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테아제(Exo protease)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase)는 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase; AMG)일 수 있다.

상기 지충이 다당 분획물의 평균 분자량은 6.0X10⁵ 내지 7.0X10⁶ g/mol, 바람직하게는 1.0X10⁶내지 3.0X10⁶ g/mol일 수 있다.

상기 지충이 다당 분획물의 중성당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose) 및 푸코스(fucose)로 이루어질 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물은 지충이(sargassum thunbergii) 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 지충이 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 지방전구세포 분화 관련인자인 PPAR-γ, FABP4 및 SREBP-1의 발현을 감소시키므로 지방축적을 억제시킬 수 있어 비만에 의해 유발될 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있고 이에 따라 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로도 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 체중 및 지방 중량을 감소시킬 수 있으며, 인슐린, 트리글리세리드(TG) 및 총 콜레스테롤(TG) 수치를 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 비만에 의한 고지혈증 및 이상지질혈증을 완화시키는 데 사용될 수 있다.

도 1A는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2 STAF3을 FTIR로 측정한 그래프이며; 도 1B는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2 STAF3을 SEM으로 측정한 사진이고; 도 1C는 본 발명의 실시예 2 STAF3을 NMR로 측정한 그래프이다.
도 2A는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2로 처리된 3T3-L1 세포 내 지질 억제 효과를 확인하기 위하여 ORO 염색을 수행한 사진이며, 도 2B는 상기 도 2A에서 측정한 ORO 면적을 정량화한 그래프이며, 도 2C는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2로 처리된 3T3-L1 세포의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 3A는 본 발명의 실시예 2 STAF3에 대한 PPAR-γ, FABP4 및 SREBP-1의 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블럿이며, 상기 도 3B는 상기 도 3A에서 측정한 발현량을 정량화한 그래프이다.
도 4A는 각 군 마우스의 체중을 측정한 그래프이며, 도 4B는 각 군 마우스의 백색 지방 조직 중량을 측정한 그래프이고, 도 4C는 각 군 마우스(STAF 3군 포함)의 체중을 측정한 그래프이고, 도 4D는 각 군 마우스의 혈청 내 지질 함량을 나타낸 것이다.
도 5A는 각 군 마우스의 간 조직을 H&E 염색한 시진이며, 도 5B는 각 군 마우스의 간 조직에서 세포내 지질 축적을 정량화한 그래프이고, 도 5C는 각 군 마우스의 백색 지방 조직을 H&E 염색한 시진이며, 도 5D는 각 군 마우스의 백색 지방 세포 면적의 측정한 그래프이다.
도 6A는 각 군 마우스의 백색 지방 조직에서 PPAR-γ의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 6B는 각 군 마우스의 백색 지방 조직에서 SREBP-1의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 비만을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 가수분해 효소로 처리된 지충이(sargassum thunbergii)의 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유한다.

상기 지충이(sargassum thunbergii)는 모자반과의 갈조류로서, 방석 모양의 뿌리에서 원기둥모양의 짧은 줄기가 나오고 그 줄기는 여러 개의 가지로 나누어지며 그 가지의 끝에서 끈 모양의 중심가지를 낸다. 지충이는 예로부터 구충제로 사용되어 왔으며 식용하거나 퇴비로도 사용된다.

본 발명의 지충이 조다당 추출물은 가수분해 효소로 처리된 지충이를 이용하여 수득한 것이며, 본 발명의 지충이 다당 분획물은 상기 지충이 조다당 추출물을 분획한 것으로서 4개의 분획물이 수득되었다.

일예로, 본 발명의 지충이 조다당 추출물은 지충이를 가수분해 효소로 처리한 후 상기 효소 처리된 지충이에서 다당을 수득한다.

상기 가수분해 효소로는 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테아제(Endo protease) 및 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테아제(Exo protease)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase)를 사용하는 것이 우수한 항비만 효과를 가질 수 있다. 상기 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase)는 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase; AMG)이다.

상기 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테아제(Endo protease)는 알칼라아제(Alcalase), 프로타맥스(Protamax) 또는 이들의 혼합효소일 수 있으며; 상기 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테아제(Exo protease)는 플라보자임(Flavourzyme)일 수 있다.

상기 가수분해 효소는 지충이 100 중량부에 대하여 0.00001 내지 0.1의 중량부로 첨가되고, 바람직하게는 0.00001 내지 0.01, 더욱 바람직하게는 0.00001 내지 0.0001의 중량부의 중량부로 첨가될 수 있다. 가수분해효소의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 효소 처리가 수행되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 항비만 효과가 발휘되지 않을 수 있다.

본 발명에서 지충이는 건조되지 않은 것 또는 건조된 것을 사용할 수 있으며, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다. 또한 바람직하게 가수분해 효소를 처리하는 상기 지충이는 증류수로 10배 내지 30배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 지충이와 가수분해 효소를 혼합하여 40 내지 60 ℃ 및 pH 4.0 내지 5.0 하에서 20 내지 30시간 동안 진탕기에서 효소처리를 수행할 수 있다. 효소처리 시 온도, pH 및 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 원하는 효과를 얻을 수 없다.

상기 효소로 처리된 지충이는 효소를 불활성화시킨 후 가열로 인해 가용성 다당 성분의 용출을 증가시키거나, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성 및 침전시킴으로써 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시켜 본 발명의 지충이 조다당 추출물을 수득할 수 있다.

바람직하게는 가수분해 효소로 처리된 지충이를 용매에 침지시켜 다당을 침전시킬 후 원심분리하여 다당을 추출하는 것이다. 이때 사용되는 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있으며, 상기 저급알코올로는 20 내지 99.8 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액을 들 수 있다. 용매로는 보다 더 우수한 항비만 효과를 위하여 에탄올 또는 에탄올 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 지충이 다당 분획물은 상기 지충이 조다당 추출물을 용매분획 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 수득될 수 있다.

상기 분획물을 수득하는 방법은 분자량을 기준으로 정제하는 방법이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 한외여과, 용매분획 또는 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 이온교환 크로마토그래피를 들 수 있다. 또한, 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물 또는 분말일 수 있다.

이와 같이 수득된 지충이 다당 분획물의 평균 분자량은 6.0X10⁵ 내지 7.0X10⁶ g/mol이며, 바람직하게는 1.0X10⁶내지 3.0X10⁶ g/mol일 수 있다.

한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 함유하는’이란 지충이 조다당 추출물 또는 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 지충이 조다당의 추출물 또는 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 지충이 조다당 추출물 또는 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 지충이 조다당 추출물 또는 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 명세서에서 지충이를 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’ 또는 ‘분획물’은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물 또는 분획물뿐만 아니라 다당 추출물 또는 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 지충이 조다당 추출물 또는 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명은 지충이 조다당 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 ‘식품 조성물’은 유효성분으로 지충이 조다당 추출물 또는 분획물 이외에, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격(‘식품공전’)에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다.

특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 지충이 조다당 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 식품 조성물을 제조하는 경우에 지충이 조다당 추출물 또는 분획물은 비만 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.

상기 식품 조성물에서 유효성분인 지충이 조다당 추출물 또는 분획물은 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.

또한 일반 식품에 비만의 예방 또는 개선의 기능성을 부여하기 위하여 상기 지충이 조다당 추출물 또는 분획물을 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격(‘식품공전’)에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격(‘축산물공전’)에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.

한편, 상기 지충이 조다당 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 “비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품”으로 이용될 수 있다.

상기 ‘건강기능식품’은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 ‘건강기능식품’은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 ‘식이 보충제(Dietary Supplement)’, 유럽의 ‘식품 보충제(Food Supplemnet)’, 일본의 ‘보건기능식품’ 또는 ‘특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)’, 중국의 ‘보건식품’ 등에 해당할 수 있다.

상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 ‘식품첨가물공전’의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.

또한 상기 건강기능식품에는 상기 지충이 조다당 추출물 또는 분획물과 함께 “비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품”에 사용되는 ‘기능성 원료’로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, Lactobacillus gasseri BNR17, L-카르니틴타르트 레이트, 가르시니아캄보지아껍질추출물, 공액리놀렌산(유리지방산), 공액리놀렌산(트리글리세라이드), 그린마떼추출물, 그린커피빈추출물, 깻잎추출물, 녹차추출물, 대두배아추출물 등 복합물, 돌외잎주정추출분말, 락토페린(우유정제단백질), 레몬 밤 추출물 혼합분말, 마테열수추출물, 미역 등 복합추출물(잔티젠), 발효식초석류복합물, 보이차추출물, 서목태(쥐눈이콩) 펩타이드 복합물, 식물성유지 디글리세라이드, 와일드망고 종자추출물, 중쇄지방산(MCFA)함유 유지, 콜레우스포스콜리추출물, 키토산, 키토올리고당, 풋사과추출폴리페놀, 핑거루트추출분말, 히비스커스 복합추출물 등의 체지방감소와 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 상기 조성물을 투여하는 비만의 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은 비만의 예방 또는 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 지충이 조다당 추출물 또는 분획물의 신규 용도를 제공한다.

상기 ‘약학 조성물’또는 ‘의약’은 유효성분으로 지충이 조다당 추출물 또는 분획물 이외에, 약학 조성물 등의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 ‘담체’는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물이다. 상기 ‘희석제’는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물이다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어, 유당, 포도당, 설탕, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 사용량은 환자 또는 치료대상 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일 0.1 내지 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 내지 500 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 250 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 약학조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 설탕 또는 유당, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비만의 치료방법은 인간, 또는 인간을 제외한 동물, 특히 포유동물에게 상기 조성물을 투여 하는 것으로, 예를 들어 비만인 치료대상 개체에게 상기 조성물을 투여하는 것이다.

상기 치료를 위한 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수는 상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수를 참고할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 지충이 가수분해 추출물(STAC)

제주도 해안에서 채집한 지충이를 건조시킨 후 건조된 지충이 100 g, 증류수 1000 g 및 아밀로글루코시다제(AMG) 100 ug을 혼합한 후 진탕기로 50 ℃ 및 pH 4.5 상태에서 24시간 동안 효소처리한 다음 효소를 불활성화시키고 pH 값을 7.0으로 조정하였다. 그 후 상기 혼합물을 원심분리기(12,000 rpm, 10분, 4 ℃)로 처리하여 잔류물을 제거하고 상층액을 hatman No. 4 여과지로 여과한 다음 99.5% 에탄올에 상기 혼합물을 투입하여 4 ℃에서 12시간 동안 정치하면서 조다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물을 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 회수한 후 동결건조함으로써 가수분해 효소로 처리된 지충이 조다당 추출물(STAC)을 수득하였다.

실시예 2. 지충이 다당 분획물(STAF1 내지 STAF4)

상기 실시예 1에서 제조된 지충이 조다당 추출물(STAC)을 증류수에 용해시키고 0.45 μm 공극 크기의 주사기 필터에 통과시킨 후 상기 여과액을 DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피에 적용하였다. 상기 DEAE 분리는 2 mL/min의 유속으로 NaCl 용액의 기울기 용리(gradient elution)로 수행되었으며, DEAE 컬럼은 50 mM 아세트산나트륨을 사용하여 평형화되었고, 시료 로딩 후 최대 2.0 M NaCl(0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 2000 mM)까지 선형 구배로 분리를 수행하였다.

상기 DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 4개의 다당 분획물(STAF1, STAF2, STAF13, STAF4)을 수득하였다.

<시험예>

통계 분석

모든 측정값은 평균 ± SD로 표시되며 세 가지 독립적인 실험을 수행하였다. 통계 분석은 Graph Prism(Version 6.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)에 대한 통계 패키지로 수행되었으며, 유의미한 차이는 Graph Prism 6.0 소프트웨어에서 일원 분산 분석 및 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었다. 유의한 차이는 다음과 같이 표현하였다: p-values (대조군과 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, and **** p < 0.0001; 대조군과 비교하여 #p < 0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, ####p<0.0001) <0.05는 유의한 것으로 간주하였다.

시험예 1. 화학성분 및 중성당 분석

1-1. 화학성분 분석: 실시예 2의 화학적 조성은 AOAC 방법에 따라 분석하였다. 총 다당류 함량은 Nielsen(Nielsen, 2010)에 의해 기술된 페놀-황산 방법을 통해 결정되었으며, 단백질 함량은 Lowry 방법(Waterborg, 2009)을 사용하여 분석되었다. 또한, 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 결정되었다(Lopez-Froilan, Hernandez-Ledesma, Camara, & Perez-Rodriguez, 2018).

1-2. 단당류 분석: 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 시스템과 CarboPacTM PA1 컬럼(4.5mm X 50mm)이 장착된 Dionex Bio-LC 시스템(Dionex, USA) 및 정제된 다당류를 사용하여 수행되었다.

중성당(neutral sugar) 함량을 분석하기 위해 시료를 트리플루오로아세트산으로 가수분해한 후 최적 조건(용리액: 18 mM NaOH/200 mM NaOH, 유속: 1 mL/min, 주입 부피: 20 μL)에서 수행하였다.

구분	실시예 2 (STAF1)	실시예 2 (STAF2)	실시예 2 (STAF3)	실시예 2 (STAF4)
화학성분(%)
다당류	38.71±1.49	26.58±1.42	25.07±2.39	38.98±1.36
황산염	31.72±1.47	13.66±0.06	15.15±0.00	31.22±0.38
단백질	13.23±0.82	23.82±3.49	23.10±2.87	16.28±1.44
폴리페놀	0.20±0.00	0.24±0.02	0.21±0.01	0.24±0.08
중성당(%)
아라비오스(Arabinose)	-	0.27	0.76	0.05
람노오스(Rhamnose)	0.63	1.34	1.85	4.04
갈락토오스(Galactose)	20.44	35.39	20.92	31.68
자일로스(Xylose)	6.18	12.24	31.59	9.06
글루코스(Glucose)	28.88	3.64	8.95	3.49
푸코스(Fucose)	40.78	41.13	24.2	37.54

위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 지충이 다당 분획물 중에서 STAF1 및 STAF4는 다른 군에 비하여 다당류 및 황산염의 함량이 높았으며, STAF2 및 STAF3은 다른 군에 비하여 단백질의 함량이 높은 것을 확인하였다.

또한, 중성당에서 STAF1은 아라비오스가 검출되지 않았고 다른 군에 비하여 글루코스 및 푸코스의 함량이 높으며, STAF2는 다른 군에 비하여 갈락토오스 및 푸코스의 함량이 높았고, STAF3은 다른 군에 비하여 자일로스의 함량이 높았으며, STAF4는 다른 군에 비하여 람노오스 및 갈락토오스의 함량이 높은 것을 확인하였다.

시험예 2. 평균 분자량 측정

MALS 기술을 이용하여 실시예 2의 평균 분자량을 측정하였다. 상기 MALS 분석은 PL aquagel-OH MIXED-H 컬럼(Agilent Technologies, USA)이 장착된 Shimadzu HPLC 시스템과 함께 DAWN Heleos II(Wyatt Technology, CA, USA) 다중 각도 광산란 검출기를 사용하여 수행되었다. 시료를 500 mM NaCl 용액에 용해시키고 시린지 여과한 후 용리액 0.5 mol/L NaCl을 0.5 mL/분의 유속으로 사용하였다. MALS 결과는 ASTRA 6 소프트웨어(Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA, USA)로 분석되었다.

구분	실시예 2 (STAF1)	실시예 2 (STAF2)	실시예 2 (STAF3)	실시예 2 (STAF4)
평균 분자량(g/mol)	4.751X10⁶	1.895X10⁶	2.905X10⁶	6.224X10⁶

위 표 2에 나타낸 바와 같이, 평균 분자량은 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 지충이 다당 분획물 중에서 STAF4가 다른 군에 비하여 높은 것을 확인하였다.

특히, STAF4의 평균 분자량은 STAF2 및 STAF3에 비하여 2-4배 더 큰 것을 확인하였다.

시험예 3. 구조적 특성 측정

3-1. FTIR 분광법: 실시예 1(STAC) 및 실시예 2 STAF3의 구조적 특성은 FTIR 분광계(Thermo Scientific, Nicolet TM 6700, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석하고자 하는 분석 시료를 브롬화칼륨(KBr)과 혼합하여 분쇄한 후 혼합물을 눌러 FTIR 분광계에 적용된 디스크 모양의 FTIR 펠릿을 형성하였다. FTIR 스펙트럼은 500-2000 cm-1의 파수에서 관찰되었다.

3-2. SEM 측정: 실시예 1(STAC) 및 실시예 2 STAF3의 표면 형태는 에너지 분산 X선 분광법(EDS)이 장착된 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM; MIRA 3 TESCAN, Czech)을 통해 결정되었다. 시료를 탄소 테이프로 코팅하기 위해 3-5분 동안 원형 알루미늄 스터브에 장착시킨 후 상기 스터브를 FE-SEM 소자로 옮기고 최적 조건(배율: 160x, 가속 전압: 3.0 kV)에서 표면 형태 및 구조를 관찰하였다.

3-3. NMR 측정: 실시예 2 STAF3의 1H NMR 스펙트럼은 400 MHz에서 작동되는 JEOL JNM-ECX400 NMR 분광계(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 얻었다. STAF3를 중수소 산화물에 용해시키고 중수소 교환을 위해 여러 번 건조시킨 후 상기 건조된 STAF3를 NMR 분석을 위해 중수소 메탄올에 재용해하였다. 64번의 스캔으로 proton NMR 스펙트럼을 얻었다.

도 1A는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2 STAF3을 FTIR로 측정한 그래프이며; 도 1B는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2 STAF3을 SEM으로 측정한 사진이고; 도 1C는 본 발명의 실시예 2 STAF3을 NMR로 측정한 그래프이다.

도 1A에 도시된 바와 같이, STAC 및 STAF3의 IR 스펙트럼은 1035 cm^-1(다당류 글리코시드 C-O-C 브리지 결합), 1,135 cm^-1(다당류 글리코시드 C-O 결합) 및 1616 cm^-1(카르복실레이트 O-C 결합)에서 강렬한 FTIR 피크를 보여주었다. 또한 -1,120-1220 cm^-1(황산염기 S=O)에서 비교적 넓고 낮은 강도의 FTIR 피크가 관찰되었다.

또한 도 1B에 도시된 바와 같이, STAC 및 STAF3의 표면 형태를 FE-SEM으로 조사하였으며, STAC은 입자 크기가 일정하지 않으며 표면이 거칠고 큰 크기의 납작한 입자를 주로 보이는 것을 확인하였다. 그러나 STAF3의 SEM 이미지는 STAC보다 작으며 실과 같은 구조를 형성하여 STAC와 입자 크기 및 모양에서 상당한 차이를 보이는 것을 확인하였다.

또한 도 1C에 도시된 바와 같이, STAF3의 1H NMR 스펙트럼은 갈조류의 후코이단에 해당하는 피크를 나타내었다. 1.0-1.2 ppm의 피크는 푸코스 단위의 메틸기를 나타내며, 1.7-2.0 ppm의 피크는 알코올 양성자에 기인한다. 또한, 3.5-4.0 ppm 범위의 강한 신호는 D-갈락토스의 O-6과 같은 당 잔류물의 양성자에 기인하며, 약 4.6 ppm의 피크는 NMR 용매 및 중수소 산화물을 나타낸다.

시험예 4. 3T3-L1 지방세포에서 지질 억제 효능 측정_ORO 염색

세포 배양 및 세포 분화

3T3-L1 세포와 지방전구세포는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173, Rockville, MD, USA)에서 얻었고 최적의 세포 배양 조건(37 ℃, 5% CO2, 가습)에서 10% BS 및 1% P/S가 보충된 DMEM에서 배양했다. 지방세포 분화를 유도하기 위해 3T3-L1 세포를 1X10⁵ cells/well의 농도로 12-well plate에 접종하고 세포 배양액을 10% FBS, 1% P/S 및 MDI 용액[인슐린(5μg/mL), IBMX(0.5mM) 및 덱사메타손(0.25μM)]이 첨가된 DMEM으로 교체하였다. 2일 후, 3T3-L1 세포를 인슐린(5 ug/mL)이 보충된 DMEM에서 유지하고 추가 세포 분화를 위해 추가로 2일 동안 인큐베이션하였다. 2일 간격으로 지방세포 배양액을 신선한 DMEM으로 교체하고, 시험 시료도 2일 간격으로 처리하였다.

오일 레드 O(ORO) 염색에 의한 지질 축적 정량화

잠재적인 지질 억제 효과를 결정하기 위해 ORO 염색을 사용하였다.

3T3-L1 세포를 48시간 동안 12웰 플레이트에 1X10⁵ cells/well의 농도로 시딩하고, 이전에 설명한 방법(Lee et al., 2021)에 따라 분화시키고, 1-2시간 동안 10% 포르말린으로 고정한 후 60% 이소프로판올 용액으로 두 번 세척하였다. 그 후 플레이트를 25 ℃에서 건조시킨 다음 세포를 1-2시간 동안 ORO 용액으로 염색하였다. 그 후, ORO 용액을 제거하고 세포를 증류수로 여러 번 세척한 다음 얼룩진 지질 방울의 이미지는 Lionheart™ FX 자동 현미경(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)으로 관찰하였다.

세포독성 측정

세포독성 효과는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 사용하여 결정되었다.

3T3-L1 세포를 1X10⁵ cells/well의 농도로 96-well plate에 접종하고 48시간 동안 다양한 농도의 샘플로 처리하고 배양한 후 MTT 용액(2 mg/mL)을 세포 배양 배지에 첨가하여 추가로 2-3시간 동안 배양하였다. 생존 세포에 의해 생성되는 Formazan 결정을 DMSO에 용해시키고 Synergy HT Multi-Detection 마이크로플레이트 판독기(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 검출하였다. 세포 생존율은 상대적인 포르마잔 결정 함량을 측정하여 계산되었으며, 크리스탈 바이올렛 함량은 540 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다.

도 2A는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2로 처리된 3T3-L1 세포 내 지질 억제 효과를 확인하기 위하여 ORO 염색을 수행한 사진이며, 도 2B는 상기 도 2A에서 측정한 ORO 면적을 정량화한 그래프이고, 도 2C는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2로 처리된 3T3-L1 세포의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.

3T3-L1 세포에서 STAC(실시예 1)및 STAF(실시예 2)의 잠재적인 지질 억제 효과를 조사하기 위해 ORO 염색을 사용하였다. 대조군으로는 무처리한 3T3-L1 세포를 이용하였다.

도 2A 및 도 2B에 도시된 바와 같이, 대조군에서 높은 수준의 지질 축적을 확인하였으며, STAC 및 STAF1 내지 STAF4 처리에 의해 지질 축적이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다.

또한 도 2C에 도시된 바와 같이, 세포 생존율은 STAC 및 STAF1 내지 STAF4가 3T3-L1 세포에 독성 효과를 나타내지 않은 것을 확인하였다.

특히, 상기 STAC 및 STAF1 내지 STAF4 중에서 STAF3은 3T3-L1 세포에서 가장 우수한 지질 억제 활성을 보였으며, 50 ug/mL(0.50 ± 0.02배), 100 ug/mL(0.34 ± 0.01배) 및 200 ug/mL 농도에서 ORO 면적이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 모든 군에서 3T3-L1 세포에 대해 지질 억제 효과가 발휘되지만, 그 중에서 STAF3가 3T3-L1 세포에 대해 가장 우수한 지질 억제 효과를 발휘함을 의미한다. 지방 생성으로 이어지는 지방 세포 분화는 지방 생성 및 지방 생성 단백질을 포함한 지방 특이적 단백질에 의해 조절된다.

시험예 5. 웨스턴 블럿 측정(Western blot analysis)

3T3-L1 세포는 10 mg/mL 아프로티닌, 10 mg/mL 류펩틴, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM 페닐메틸설포닐 트리플루오라이드(PMSF), 20 mM Tris, 2 mM Na3VO4, 및 1% NP-40를 포함하는 용해 완충액을 사용하여 용해되었다. 그 다음 세포 파편을 제거하기 위해 원심분리기(4 ℃, 12000 xg, 20분)를 통해 용해물을 정제한 후 상기 용해물의 단백질 함량을 BCA^TM 단백질 분석 키트를 사용하여 결정하였다. 로딩 샘플을 준비하기 위해, 용해물의 단백질 수준을 30 ㎍/mL로 표준화하고 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 함유하는 로딩 완충액과 혼합하였다. 준비된 로딩 샘플을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 하고 전기영동된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 이러한 멤브레인은 이후 2-3시간 동안 5% 차단 완충액으로 차단되었다. 차단된 막을 PPAR, FABP4 및 SREBP1 1차 항체(Cell Signaling Technology, 1:1000, 4 ℃)와 함께 밤새 배양한 다음 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 전체 항체(산타 크루즈, 1:3000)와 함께 2시간 동안 배양하였다. 다음으로, 막을 1 x TBST로 부드럽게 세번 세척하고 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 기질과 함께 배양한 후 Fusion Solo 이미징 시스템(Vilber Lourmat, France)을 사용하여 단백질 밴드의 형광 이미지를 검출하였다.

도 3A는 본 발명의 실시예 2 STAF3에 대한 PPAR-γ, FABP4 및 SREBP-1의 단백질 발현을 나타낸 웨스턴 블럿이며, 상기 도 3B는 상기 도 3A에서 측정한 발현량을 정량화한 그래프이다.

도 3A 및 도 3B에 도시된 바와 같이, PPAR-γ, FABP4 및 SREBP-1의 단백질 발현이 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 높은 농도의 STAF3(200 ug/mL)는 처리하지 않은 대조군에 비하여 PPAR-γ(0.22 ± 0.01-배), FABP4(0.41 ± 0.01-배) 및 SREBP-1(0.11 ± 0.00-배) 단백질의 발현 수준을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 STAF3가 3T3-L1 지방 세포에서 지방 생성 및 지방 생성 단백질을 하향 조절함으로써 지질 축적을 조절한다는 것을 의미한다.

시험예 6. 동물실험

실험동물

무게가 20 ± 2g인 40마리의 수컷 C57BL/6J 마우스를 중앙연구소 동물사(서울, 한국)에서 입수하였으며, 모든 마우스는 통제된 환경 조건(온도: 20-22 ℃, 습도: 55%, 12시간 명/12시간 암주기)에서 수용되고 적응되었다. 1주일 후, 마우스를 5개의 실험 그룹(그룹당 n=10)으로 나누었다: 다이어트 그룹(CD); 고지방식이군(HFD); 고지방식이 유도 STAC(250 mg/kg) 처리군(STAC); 고지방식이 유도 가르시니아 캄보지아 추출물(125 mg/kg) 처리군(GCE); 및 고지방식이 유도 오르리스타트(10 mg/kg) 처리군(ORL).

실험기간 동안 CD군에는 일반식(D12450 J, Research Diets Inc.)을 급여하고 식염수를 투여하였으며, HFD군에는 60% kcal의 고지방 식이(D12492, Research Diet Inc.)를 급여하고 식염수를 투여하였다.

체중은 매주 측정하였으며, 6주 후 모든 마우스는 제주대학교 동물동물보호이용위원회(승인번호 2018-0048)의 윤리 원칙에 따라 희생시켰다. 추가 실험을 위해 마우스 혈청 및 조직 샘플(지방 조직, 근육, 간, 뇌)을 수집했다.

모든 실험은 제주대학교 동물센터의 실험동물 가이드라인에 따라 수행되었으며 제주특별자치도 제주대학교 기관동물관리이용위원회(IACUC)의 승인을 받았다(승인번호: 2018~ 0048).

-5개 군의 마우스-

CD군: 일반식이 급여 + 식염수 투여

HFD군: 고지방식이 급여 + 식염수 투여

STAC군: 고지방식이 급여 + 실시예 1의 지충이 가수분해물 STAC 250 mg/kg 투여

GCE군: 고지방식이 급여 + 가르시니아 캄보지아 추출물 125 mg/kg 투여

ORL군: 고지방식이 급여 + 올리스타트 10 mg/kg 투여

시험예 6-1. 체중, 체지방 및 혈청 내 지질 함량 측정

도 4A는 각 군 마우스의 체중을 측정한 그래프이며, 도 4B는 각 군 마우스의 백색 지방 조직 중량을 측정한 그래프이고, 도 4C는 각 군 마우스(STAF 3군 포함)의 체중을 측정한 그래프이고, 도 4D는 각 군 마우스의 혈청 내 지질 함량을 나타낸 것이다.

도 4A에 도시된 바와 같이, 마우스의 체중은 HFD군이 6주 동안 꾸준히 증가하였으며, STAC를 투여 시 유의하게 감소되는 것을 확인하였으며, 6주차에 STAC군의 체중은 33.35±2.31 g인 것을 확인하였다.

또한 도 4B에 도시된 바와 같이, 지충이 다당류 분획물 STAC 투여로 인한 체중 감소가 HFD를 섭취한 비만 마우스의 지방 조직 중량 감소에서 비롯되었는지 여부를 명확히 하기 위해 총 지방 중량을 측정한 결과, 6주차에 HFD군(1.66±0.14 g)에 비해 STAC군(1.05±0.02 g)에서 현저히 낮은 것을 확인하였다.

이러한 결과는 STAC가 비만 마우스에서 체중과 지방 중량을 효과적으로 감소시켰음을 시사한다.

고지방식이는 이상지질혈증을 유발할 수 있으며, 이는 혈청 트리글리세리드 수치 상승을 포함하여 LDL 콜레스테롤을 감소시키고 HDL 콜레스테롤 수치를 증가시킨다. 혈청 지질 프로필에 대한 STAC의 효과를 조사하기 위해 상용 키트를 사용하여 마우스 혈청을 분석하였다.

도 4D에 도시된 바와 같이, 혈청 인슐린, 트리글리세리드(TG) 및 총 콜레스테롤(TG) 수치는 HFD군이 CD군에 비하여 유의하게 증가하였으며, STAC군은 혈청 내 인슐린, 트리글리세리드(TG) 및 총 콜레스테롤(TG) 수치가 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

이는 STAC가 HFD 유도 비만 마우스에서 고지혈증과 인슐린 저항성을 조절할 수 있음을 의미한다.

또한 도 4C에 도시된 바와 같이, 마우스의 체중은 HFD군이 6주 동안 꾸준히 증가하였으며, STAF 3을 투여 시 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 상기 STAF 3을 투여한 STAF 3은 상기 STAC군과 동일한 방법으로 사육하되 시료만 STAF 3을 사용한 것이다.

시험예 6-2. 조직학적 분석

Hematoxylin & eosin(H&E) 염색은 마우스의 간 및 백색 지방 조직의 조직학적 분석에 사용되었다(Lee et al., 2020).

수집된 조직을 4% 포름알데히드 용액에 24시간 동안 고정한 후 고정된 조직을 저융점 파라핀 왁스에 포매하고 4 um 두께의 절편으로 슬라이스하였다. 상기 슬라이스된 파라핀이 포함된 섹션을 H&E로 염색하고 LionheartTM FX 자동화 현미경(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)으로 마우스 조직의 조직학적 외관을 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직학적 이미지를 처리했다.

도 5A는 각 군 마우스의 간 조직을 H&E 염색한 시진이며, 도 5B는 각 군 마우스의 간 조직에서 세포내 지질 축적을 정량화한 그래프이고, 도 5C는 각 군 마우스의 백색 지방 조직을 H&E 염색한 시진이며, 도 5D는 각 군 마우스의 백색 지방 세포 면적의 측정한 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 HFD군과 비교 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 , ####p<0.00001 CD군과 비교

보조 소화 기관인 간은 지질 대사에 중요한 역할을 하여 체내 지질 합성 및 순환을 유도한다. 그러나 고지방식이나 고칼로리식이의 섭취로 인해 간 기능이 저하되어 비알코올성 지방간 질환 및 비알코올성 지방간염과 같은 심각한 간 기능 장애를 일으키고 장애로 발전할 수 있다.

도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, CD군에서는 조밀하고 질서정연하게 배열된 간세포가 관찰되었으며, HFD군에서는 불규칙한 모양과 높은 수준의 지질 축적을 보이는 간세포가 관찰되었다.

그러나, STAC군에서는 HFD군에 비하여 간에서의 지질 축적이 현저히 개선된 것을 확인하였다.

또한 백색 지방 조직의 주요 기능은 음식 대사에서 파생된 과도한 에너지를 저장하는 것으로서, 조직은 고농축 TG 형태로 세포질에 과도한 에너지를 저장한다. 따라서 과도한 음식 섭취는 지방 조직에 높은 수준의 TG 축적을 초래하여 차례로 지방 비대를 유발한다.

도 5C 및 5D에 도시된 바와 같이, 백색 지방 조직의 조직학적 외관은 고지방식이가 지질 축적을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였으나, STAC를 투여한 군에서는 세포내 지질 축적이 현저히 감소된 것을 확인하였다.

이러한 결과는 STAC가 간 지방증 및 지방세포 비대의 위험을 감소시킬 수 있다는 것을 의미한다.

시험예 6-3. 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 지방생성 유전자 발현 분석

지방 생성 및 지방 생성 유전자 발현은 RT-PCR(Thermal Cycler Dice Real Time System, Takara, Japan)을 사용하여 결정되었다. mRNA를 얻기 위해 30-40 mg의 백색 지방 조직과 1 mL의 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 비드 튜브에 첨가하고 TacoTM preb bead beater(Taco, Taichung, Taiwan)를 사용하여 mRNA를 추출하였다. 그 후, 추출된 1 ㎍의 mRNA, DEPC water 및 cDNA 역전사 키트(Takara, Shiga, Japan)로부터 cDNA를 합성하였다. 정량적 중합효소연쇄반응은 최적의 조건(효소 활성화: 95 ℃, 10초, 변성: 40주기, 95 ℃, 5초, 어닐링/신장: 58 ℃, 10초, 용융 곡선: 72 ℃, 10초)에서 cDNA 3 uL, SYBR green(SYBR) 5 uL, target primer 0.4 uL, RNase-free water 1.2 uL를 포함하는 PCR 혼합물 10 uL를 사용하여 수행하였다.

PCR 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같다.

GAPDH, 정방향: 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3' 및 역방향: 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'; PPAR, 정방향: 5'-GTCACGGAACACGTGCAGC-3' 및 역방향: 5'-ACTCAGAAGTGGGCGAGGAC-3'; SREBP-1, 정방향: 5'-GCAGCCACCATCTAGCCTG-3' 및 역방향: 5'-CAGCAGTGAGTCTGCCTTGAT-3'.

도 6A는 각 군 마우스의 백색 지방 조직에서 PPAR-γ의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 6B는 각 군 마우스의 백색 지방 조직에서 SREBP-1의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 HFD군과 비교 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 , ####p<0.00001 CD군과 비교.

RT-Qpcr은 HFD 유도 비만 마우스의 백색 지방 조직에서 지방 생성 PPAR-γ 및 SREBP-1 유전자 발현을 결정하기 위해 채택되었다.

도 6A 및 6B에 도시된 바와 같이, PPAR-γ 및 SREBP-1 발현은 CD군에 비해 HFD군에서 유의하게 증가하였으나, HFD에 STAC를 투여한 STAC군에서는 PPAR-γ 및 SREBP-1 발현이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 STAC가 HFD 유도 비만 마우스에서 지방 생성 유전자 단백질인 PPAR-γ 및 SREBP-1을 조절하여 지방 생성을 효과적으로 감소시켰음을 의미한다.

본 발명은 지충이에서 추출한 다당류의 항비만 효과를 조사하였다. FTIR 분광기를 통해 분석한 다당 추출물 및 다당 분획물의 구조적 특성은 모든 정제된 다당 추출물 및 다당 분획물에서 유사한 작용기를 보였으며, 일반적으로 -1,120-1220 cm-1 파장에서 황산염기(S=O)가 검출됨을 보여주었다. 이는 갈조류에서 파생된 다당류를 탐색하기 위해 수행된 이전 연구에서 보고된 것과 유사하다. 이 결과는 DEAE 분리 단계에서 STAF3의 물리적 특성이 변경되었음을 나타낸다. 또한, STAF3의 1H NMR 분석은 NMR 피크가 후코이단의 구조적 특성을 나타내는 피크와 일치함을 나타낸다.

지방 생성은 지방 세포에서 발생하는 세포 분화 과정이며, 지방 생성 과정에서 지방전구세포(preadipocytes)의 형태학적 특성이 변형되어 최종적으로 지질을 저장하는 성숙한 지방세포로 된다. 지방 생성 과정은 지방 생성 및 지방 생성 단백질 발현에 의해 조절된다.

따라서 지방 생성은 PPAR-γ 및 FABP4를 포함한 지방 생성 단백질에 의해 현저하게 영향을 받으며, 지방 생성 단백질인 SREBP-1은 지방 세포에서 지질 축적에 중요한 역할을 한다. 또한, PPAR-γ와 SREBP-1에 의해 조절되는 지질 수송 단백질인 FABP4가 높은 PPARγ 발현을 유도하여 지방 세포가 분화하는 동안 지질 생합성을 촉진하는 것으로 나타났다. 이들 단백질은 서로 상호작용하여 지방세포에서 지질 저장 및 합성을 조절한다.

이에, 지방 생성 단백질의 이중 표적화는 비만의 원인이 되는 지질 축적을 줄이는 데 사용할 수 있는 효과적인 전략이다.

본 발명에서는 다당 추출물 및 다당 분획물이 지방 생성 단백질의 발현을 조절함으로써 지질 억제 및 항비만 활성을 나타냄을 입증하였다.

특히, 다당 추출물에서 분획된 4개의 다당 분획물은 화학적 조성과 단당류 조성이 서로 상이하였다. STAF1 및 STAF4는 다당류 및 황산염의 함량이 높았으며, STAF2 및 STAF3은 다당류 및 황산염 함량이 상대적으로 낮으며 단백질 함량이 상대적으로 높은 것을 확인하였다. 4개의 모든 분획물에서 폴리페놀 함량은 낮았다. 단당류 분석은 4개의 분획물이 6개의 단당류(fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose)로 구성되어 있음을 확인하였다. 모든 분획물은 푸코오스와 갈락토오스의 함량이 높은 것을 확인하였다.

더욱이, STAF3은 다른 분획물에 비하여 자일로스의 함량이 높은 것을 확인하였다.

또한, 다당 추출물 및 다당 분획물의 지질 억제 효과는 ORO 분석을 사용하여 평가하였다. ORO 결과는 다당 추출물 및 다당 분획물 처리군에서 지질 축적이 유의하게 감소되었으며, 다당 추출물에 비하여 다당 분획물의 지질 억제 활성이 더 높음을 확인하였다.

특히, 실험군 중에서 STAF3 처리군이 가장 높은 지질 억제 활성을 보였다.

또한, 웨스턴 블럿 분석은 PPAR-γ, FABP4 및 SREBP1 단백질의 발현이 STAF3의 존재 하에서 극적으로 감소되었음을 보여주었다. 이러한 결과는 3T3-L1 세포에서 지질 억제 효과와 지방 특이적 단백질 간의 상관관계를 조사한 결과와 일치하였다.

또한, 생체 내에서 지충이 가수분해물의 STAC 항비만 효과를 조사하기 위해 HFD 유발 비만 마우스에 대한 지충이 가수분해물의 STAC의 효과를 분석하였다. HFD로 유발된 비만이 있는 마우스는 비만인 사람에게서 관찰되는 것과 유사한 증상을 보인다.

실험 기간 6주 동안 HFD 식이로 인하여 체중과 혈청 지질 수치가 유의하게 증가하였는데, HFD가 다양한 생물학적 메커니즘을 통해 체중 증가와 비만 진행에 현저한 영향을 미친다고 밝혔다.

그러나 지충이 가수분해물의 STAC를 6주간 투여하면 HFD 유발 비만 마우스에서 체중, 지방량, 혈청 TG, 콜레스테롤 및 인슐린 함량이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 더욱이, 조직학적 분석은 지충이 가수분해물의 STAC가 백색 지방 및 간 조직에서 지질 축적을 유의하게 감소시켰다는 것을 나타내었다. 이전 연구에 따르면 HFD는 지방 생성 및 지방 생성 단백질의 발현 증가를 통해 백색 지방 및 간 조직의 지질 축적을 증가시킨다.

이에, 백색 지방 조직에서 지질 축적을 담당하는 분자 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 지방 생성 mRNA 수준을 RT-PCR로 분석하였다. 결과는 지충이 가수분해물의 STAC가 백색 지방 조직에서 지방 생성 mRNA 발현을 상당히 억제시킨다는 것을 확인하였다.

따라서 지충이 가수분해물의 STAC가 백색 지방 조직에서 지방 생성 단백질 발현을 조절함으로써 체중, 지방 중량 및 혈청 지질 프로파일에 영향을 미칠 수 있다고 판단된다.

하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

실시예 2에서 STAF3 분획물 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실시예 2에서 지충이 가수분해물의 STAC 추출물 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

지충이(sargassum thunbergii) 효소 가수분해 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지충이 효소 가수분해 추출물은 지충이를 가수분해 효소로 처리한 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제2항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래 엔도 프로테아제(Endo protease) 및 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 엑소 프로테아제(Exo protease)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 디삭카리다제-타입α-글루코시다제(disaccharidase-type α-glucosidase)는 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase; AMG)인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지충이 다당 분획물의 평균 분자량은 6.0X10⁵ 내지 7.0X10⁶ g/mol인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지충이 다당 분획물의 평균 분자량은 1.0X10⁶내지 3.0X10⁶ g/mol인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지충이 다당 분획물의 중성당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose) 및 푸코스(fucose)로 이루어진 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
지충이(sargassum thunbergii) 조다당 추출물 또는 이의 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.