KR20230151796A - 단백질응집 기반 프리온 질환 치료를 위한 아출 유래 퓨라노다이에논을 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아출 추출물을 포함하는, 프리온 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 프리온 질환 예방 또는 완화용 건강기능식품 및 사료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아출 추출물은 프리온 단백질의 변형을 억제하고, 스크래피 프리온 단백질이 증가하는 것을 저해한다.

Description

단백질응집 기반 프리온 질환 치료를 위한 아출 유래 퓨라노다이에논을 포함하는 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising furanodienone derived from Curcuma phaeocaulis Valeton (Zingiberaceae) for prion disease caused by protein aggregation}

본 발명은 단백질응집 기반 프리온 질환 치료를 위한 아출 유래 퓨라노다이에논을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

전염성 해면상 뇌병증 (transmissible spongiform encephalopathies; TSE)으로도 알려진 프리온 질환은 프리온으로 불리는 비-핵산 단백질 관련 병원체에 의해 야기되는 전염성 질환이다. 이 질환은 인간을 포함한 다양한 포유동물에서 발병된다. 가장 유명한 동물 프리온 질환은 소에서 발병되는 소 해면상 뇌증 (bovine spongiform encephalopathy)이다. 인간 프리온 질환으로는 특발성, 유전성, 및 후천성의 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disease; CJD), 치명적 가족성 불면증, 및 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군이 있다.

또한 최근 연구에 따르면, 프리온 질환은 알츠하이머병을 유발하는 것으로 보고되었다 (Tomas Tousseyn, et al., Prion Disease Induces Alzheimer Disease-Like Neuropathologic Changes, Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 74, Issue 9, September 2015, Pages 873-888). 이 연구에서는 인간 뇌 응집체를 산발성 크로이펠트-야곱병 환자로부터 추출한 뇌 균질 현탁액에 접종하면 뇌 응집체가 많은 양의 β아밀로이드(Aβ) 포함체를 생산하는 반면, 접종되지 않은 대조군의 경우에는 그렇지 않았던 것으로 보고하였고, 프리온 질환 환자의 해마를 분석한 결과, APOE-4와 PrP^Sc가 함께 프리온 질환에서의 뉴런 손실을 야기하는 것을 확인하였다. 또한, 대조군에 비하여 고인산화된 타우 단백질, 및 고인산화된 타우 단백질 양성 신경망실의 수준이 프리온 질병 및 알츠하이머병 군에서 더 높게 나타남을 확인한 바 있다.

질환을 유발하는 물질은 스크래피 프리온 (scrapie PrP; PrP^Sc)으로 호칭되고, 세포성 PrP (PrP^C)의 구조적 변화를 통해 잘못 접힌(misfolding) 아이소폼 PrP의 아이소폼이다. PrP^Sc는 소수성이기 때문에, 올리고머나 아밀로이드와 같은 다양한 응집체를 형성한다. 신경병리학적으로, PrP^Sc 응집체는 뇌의 상처에서 아밀로이드 신경반 (amyloid plaque)으로 종종 발견된다. PrP^Sc 응집체는 뉴런의 사멸을 유발하여 공포를 형성함으로써 결과적으로는 해면상 퇴화로 이어지고, 이들은 뇌에서 아교 세포를 활성화시킨다.

프리온 질환은 예외 없이 치명적인 것으로 알려져 있지만, 치료 방법은 없는 실정이다. 프리온 질환의 치료법을 개발하는 것은 인간 임상에서 적용되는 약품의 무효능 또는 독성으로 인하여 아직까지는 실험실 수준에 머물러 있다. 예를 들어, 퀴나크린은 실험관 내에서는 PrP^Sc 수준을 효과적으로 감소시키지만 CJD 환자에서는 효과가 없었고, 결과적으로는 간부전을 일으켰다. 인간 임상 실험에서 사용된 폴리펜토산 설페이트는 제한된 경우에만 효과를 보였기 때문에, 치료에 부적합한 것으로 결론이 났다.

한편 아출 (Curcuma phaeocaulis Valeton (Zingiberaceae); CpV)은 어혈 때문에 발생되는 정신 장애, 월경통 및 관절통과 같은 울혈 증후군을 치료하기 위한 전통 의학으로서 동아시아 지역에서 사용되었다. 최근 아출 내 화학물질을 조사한 결과, CpV의 주요 구성 성분 중 하나인 세스퀴테르페노이드가 항염증, 항종양 및 항 혈소판 응집 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한 퓨라노다이에논은 아출에 존재하는 화합물로 알려져 있으나 아출 추출물이나 퓨라노다이에논의 뇌에서의 효능은 아직 밝혀진 바 없다.

CN102091063B

Xiaoqin Wang et al., Antiproliferative activity of Curcuma phaeocaulis Valeton extract using ultrasonic assistance and response surface methodology, Prep Biochem Biotechnol. 2017 Jan 2; 47)1:19-31

본 발명은 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료하기 위한 약학 조성물, 및 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 퓨라노다이에논을 포함하는, 프리온 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 프리온 질환 예방 또는 완화용 건강기능식품, 및 프리온 질환 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 퓨라노다이에논이 세포 내 스크래피 프리온 단백질(PrP^Sc)의 수준을 감소시키고/거나 세포 내 프리온 단백질의 응집을 억제하고, 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 프리온 질환은 소의 해면상 뇌병증 (BSE); 양 및 염소의 전진병; 사슴, 엘크사슴, 무스, 및 순록의 만성 소모성 질병; 인간의 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병이다.

본 발명에 따른 퓨라노다이에논을 포함하는 조성물을 투여함으로써 소에서 소 해면상 뇌병증 (BSE), 양 및 염소에서 전진병, 사슴, 엘크사슴, 무스, 순록 등에서의 만성 소모성 질병, 인간에서 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병을 치료하거나 예방하거나 완화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, ScN2a 세포에서 아출 추출물의 항-프리온 활성을 나타낸 것이다: (A) 웨스턴 블롯 및 4반복된 웨스턴 블롯에서의 농도 계측 분석으로, ScN2a 세포에서 아출 추출물에 의한 PK-저항성 PrP^Sc 수준의 감소를 나타냄; (B) ScN2a 세포에서 PK-저항성 PrP^Sc의 아출 추출물 농도 의존적 감소; (C) 아출 추출물의 HPLC 크로마토그램.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 아출 추출물의 in vivo에서의 프리온 질환의 억제 효능을 나타낸 것이다: (A) 일주일에 2회, 4주간 아출 추출물을 0, 100, 또는 200 mg/kg 투여 받은, 프리온에 감염된 마우스 군(n=9/군)에 대한 질환 발병 곡선; (b) 각각의 마우스의 종료 시점에서 상이한 군에서 수집된 마우스 뇌에서 PK-저항성 PrP^Sc에 대한 웨스턴 블롯.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 아출 추출물의 용매 분획을 나타낸 것이다: (A) 아출 추출물의 분획 개략도; (B) 추출물의 HPLC 프로필 (HX, EA, ED, 및 DW).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 아출 추출물에 의한 프리온의 감염성을 저하시키는 효능을 확인한 결과이다: 프리온 감염 후 4 및 10 계대에서의 표준 스크래피 세포 분석; NBH: 프리온 감염시키지 않은 정상 마우스의 뇌 균질 현탁액; SBH: 프리온 감염으로 인한 질환이 발병된 마우스를 안락사시킨 후의 뇌 균질 현탁액.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 아출 조추출물 및 용매별 분획물과 함께 배양된 세포에서 PK-저항성 PrP^Sc에 대한 웨스턴 블롯 및 농도 계측 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 n-헥세인 추출물의 분취 HPLC 크로마토그램이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 분취 HPLC를 통하여 획득한 헥세인 분획(HX)의 HX1 내지 HX12 소분획의 HPLC 프로필이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 아출 조추출물, HX-분획물 및 HX1 내지 HX12의 소분획물로 배양한 ScN2a 세포에서 PK-저항성 PrP^Sc의 웨스턴 블롯 및 농도 계측 분석 결과이다.
도 9는 쿠르제레논 (1) 및 퓨라노다이에논 (2)의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 쿠르제레논의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 11은 쿠르제레논의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 12는 쿠르제레논의 ESI-MS 스펙트럼이다.
도 13은 퓨라노다이에논의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 14는 퓨라노다이에논의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 15는 퓨라노다이에논의 ESI-MS 스펙트럼이다.
도 16은 ScN2a 세포에서 PrP^Sc 수준이 퓨라노다이에논의 농도 의존적으로 감소함을 확인한 것이다: PK-저항성 PrP^Sc는 4회 웨스턴 블롯 후 이를 농도 계측하여 측정함.
도 17은 RT-QuIC에서 PrP 변형에 대한 퓨라노다이에논의 농도 의존적 저해 효능을 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

“아출”은 Curcuma phaeocaulis Valeton로서, 봉아출, 광출, 봉출로 불리기도 한다. 파혈하고 어혈을 제거하고, 통증을 제거하는 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 전통적으로 경폐, 곽란, 기종, 기통, 분돈, 소장기, 수종, 심복통, 음식불소, 적취, 중악, 천급, 타박상, 토산, 하혈, 및 현벽을 치료하는 데에 사용되었다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 용매를 이용하여 추출한 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 아출 추출물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 예를 들어, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 해당 분야의 숙련자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 그 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 3 또는 3 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다.

본 발명은 퓨라노다이에논을 포함하는 프리온 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 프리온 질환은 전염성 해면상 뇌병증으로 불리기도 한다. 프리온 질환은 프리온이라는 전염성 단백질에 의하여 야기되는데, 전염성 프리온 단백질은 내인성 프리온 단백질이 오접힘으로 인해 생성된다. 프리온 질환으로는 소에서 소 해면상 뇌병증 (BSE), 양 및 염소에서 전진병, 사슴, 엘크사슴, 무스, 순록 등에서의 만성 소모성 질병, 인간에서 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병을 포함한다.

본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 퓨라노다이에논을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다.

본원에 기술된 퓨라노다이에논은 치료학적 또는 예방학적 치료를 위한 약학 조성물 또는 약제로 투여될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 포함할 수 있는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 치료학적 또는 예방학적 치료, 예를 들어 본원에 기술된 것들과 같은 프리온 질환, 예를 들어, 소에서 소 해면상 뇌병증 (BSE), 양 및 염소에서 전진병, 사슴, 엘크사슴, 무스, 순록 등에서의 만성 소모성 질병, 인간에서 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병을 치료, 완화 또는 예방하는 데에 사용하기 위한 것이다.

용어 "약학 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께, 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 예방하거나 또는 치료하는 데에 유용하다. 약학 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 명세서의 약학 조성물은 하나 이상의 보강제를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 보강제와 함께 투여될 수 있다. 용어 "보강제"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화하는 화합물을 지칭한다. 보강제는 오일 에멀젼 (예, 프로인드 보강제), 미네랄 화합물 (예, 알럼), 박테리아 생산물 (예, 백일해균 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 이종적인 화합물 군을 포함한다.

본 명세서에 따른 약학 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.

용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 의미한다.

용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진척 속도를 늦추는 것을 포함하며, 특히 질환의 진척을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본원에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중을 포함하는 환자의 개별 특성, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본원에 기술된 조성믈의 투여 용량은 이러한 다양한 특성에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이 보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.

본 명세서의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.

본 명세서의 약학 조성물에 사용하기 적합한 보존제는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 본 명세서의 약학 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제를 포함한다.

용어 "희석제"는 희석 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.

용어 "담체"는 약학 조성물의 투여를 쉽게 만들거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 담체는, 개체에 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 소듐 클로라이드 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 및, 특히, 생체적합성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머를 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서의 약학 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.

치료학적 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.

약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약학 실무에 따라 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구 투여"는 정맥내 주사와 같이, 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 정맥내 투여용으로 제형화 된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여"는 여러가지 화합물 또는 조성물을 동일한 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 여러가지 화합물 또는 조성물은 동시에, 본질적으로 동시에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 질환, 예를 들어, 프리온 질환을 가진 개체를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 질환은 크로이펠트-야콥병 또는 알츠하이머병이다.

용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 신호와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 보다 넒은 의미에서 개체와 접촉 시 질병이 병을 앓고 있는 개체에게 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 보다 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 단독 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구별할 수 있는 범주로 간주될 수 있다. 질환은, 여러가지 질환에 걸려 생활하면 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 감정적으로 영향을 미친다.

본 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하고/거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연하고/거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하고/거나, 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 제거하는 것뿐 아니라 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 약학 조성물의 투여와 같이, 개체가 고통받는 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질환, 병태 또는 장애를 퇴치하기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해될 것이고, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 성분의 투여를 포함한다.

용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하고/거나 개체의 수명을 연장(증가)하는 임의의 치료를 의미한다. 상기 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 예전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.

용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환이 발생되는 것을 방지하기 위해 의도되는 임의의 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "개인" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 크로이펠트-야콥병, 알츠하이머병)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말, 사슴 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수 구현예들에서, 개체는 인간 또는 가축이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 의미하지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 명세서의 구현예에서, "개체" 또는 "개인"은 "환자"이다.

용어 "환자"는 치료가 필요한 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.

본 발명은 퓨라노다이에논을 포함하는 프리온 질환 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 프리온 질환의 예방 또는 완화를 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명의 용어 “건강기능식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 퓨라노다이에논을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 퓨라노다이에논 분말을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 퓨라노다이에논을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 퓨라노다이에논을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 상기 퓨라노다이에논과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 상기 퓨라노다이에논과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 퓨라노다이에논을 포함하는 프리온 질환 예방 또는 완화용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "사료 조성물"은 모든 사료, 다이어트, 사료 보충제, 또는 단백질, 탄수화물 및/또는 조 지방을 함유할 수 있는 물질을 포함한다. 사료에는, 미네랄, 비타민 및 조미료와 같은 보충 물질 또는 첨가제가 포함될 수도 있다. 이러한 사료 조성물은 영양학적으로 완전할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 동물 사료 조성물은 영양학적으로 완전한 사료 조성물이다.

본 명세서에 사용된 "영양적으로 완전한"은, 조성물이 동물에게 완전하고 균형 잡힌 영양 요건을 제공함을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이러한 동물은 가축이다. 따라서, 영양학적으로 적절한 사료는, 상기 동물, 예를 들어, 상기 가축에게 유일한 배급량(ration)으로 공급될 수 있고 추가 사료(물 제외) 없이도 생명을 유지할 수 있는 사료이다. 사료 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 의도된 용도에 따라, 담체, 희석제 또는 부형제를 동물용으로 적합하도록 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 동물은 가축이고, 예를 들어, 소, 양, 염소, 사슴, 엘크사슴, 무스, 순록일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 영양학적으로 완전한 조성물은 단백질 추출물과 같은 단백질의 하나 이상의 공급원, 비타민의 공급원, 미네랄, 미량 원소 및 지방을 포함한다.

본 명세서에 사용된 "사료 보충제"는, 비타민 및 미네랄, 영양학적 또는 생리학적 목적을 위한 물질, 또는 동물의 규칙적인 다이어트의 결핍을 보충하기 위한 식물 및 식물 제제와 같은(이에 국한되지 않음) 영양소의 농축된 공급원을 의미한다. 특정 실시양태에서, 사료 보충제는 캡슐, 로젠지, 정제, 환제, 분말 패킷 또는 액체 형태(앰플, 점적기가 있는 바이알)의 형태로 판매된다.

예시적으로, 본 명세서에 기재된 사료 조성물은, 단백질, 조 지방, 회분, 조 섬유질, 전분, 칼슘, 인, 나트륨, 염화물, 칼륨, 마그네슘, 철, 물, 구리, 망간, 아연, 셀레늄, 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B7, 비타민 B9, 염화콜린, 아라키돈산, W3 지방산 또는 W6 지방산을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "동물" 또는 "동물들"은, 반추동물, 가금류, 돼지, 포유동물, 말, 마우스, 쥐, 토끼, 기니피그, 햄스터, 소, 고양이 또는 캐닌을 지칭한다. 동물이라는 용어는 비-인간 동물을 보다 구체적으로 지칭할 수 있다. 가축 또는 야생 동물을 가리킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-인간 동물은 가축일 수 있다.

본원에 참조된 문헌 및 연구에 대한 언급은 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있다는 인정으로서 의도되진 않는다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원인에게 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.

후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 만들고 이용할 수 있게 하기 위해 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본원에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본원에 기술되고 보여진 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합되는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1. 재료 및 방법

1.1 아출 추출물의 제조

아출의 뿌리줄기를 구입(경동 시장)하여 시료 600g씩을 2시간 동안 메탄올로 3회 환류 추출하였다. 여과액을 감압 조건에서 회전 증발 농축기를 사용하여 증발시켜 31.1g의 조추출물을 수득하였다. 조추출물은 -80℃에서 저장하고 분석 시에는 DMSO에 용해시켜 사용하였다.

1.2 세포 기반 PrP ^Sc 분석

아출 추출물, 추출물의 분획, 및 추출물 유래 화합물(퓨라노다이에논 및 쿠르제레논 (curzerenone))의 항-프리온 활성을 단백 분해효소 K(proteinase K; PK)-저항성 PrP^Sc의 수준을 측정하였다(Waqas M, Trinh HT, Lee S, Kim DH, Lee SY, Choe KK, et al. Decrease of protease-resistant PrP^Sc level in ScN2a cells by polyornithine and polyhistidine. J Microbiol Biotechnol 2018;28:2141-4).

ScN2a 세포를 배양하고 아출 추출물을 접종하였다. 용해 완충액(20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40 및 0.5% sodium deoxycholate)에서 세포를 파쇄하고 세포 용해물을 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. Pierce BCA 단백질 분석 키트 (ThermoFisher Scientific, USA)로 단백질 정량 분석을 수행하고, 동일 용량 (0.2 mg)의 세포 용해물을 37℃에서 1시간 동안 20 μg/ml PK (Roche, Switzerland)와 함께 배양하였다. 2시간 후 2 mM 페닐메틸설포닐 플루라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride; PMSF, Merck Millipore, Germany)를 이용하여 반응을 종료시키고 1 시간 동안 4℃에서 16,000 x g로 원심분리하였다. 펠렛을 0.25 M Tris (pH 6.8, Sigma, USA) 용매 내 8% SDS (sodium dodecyl sulfate, Sigma, USA), 30% 글리세롤 (Sigma, USA), 0.02% 브로모페놀 블루 (Sigma, USA), 및 8% β머캅토에탄올 (Sigma, USA)을 함유하는 4X 시료 로딩 완충액에 용해시킨 후, 95℃에서 5분간 가열하고 SDS-PAGE를 수행하였다. 겔에서 분리된 시료를 Immobilon-P 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 (Merck Millipore, Germany)에 옮기고 0.1% Tween 20 (Sigma, USA)가 첨가된 TBS 완충액에서 5% Difco 탈지유 (BD, USA)로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 마우스 단일클론 항-PrP 항체 6D11(1:30,000배 희석, Biolegend, USA)로 밤새 인큐베이션한 후, HRP-융합된 염소 항-마우스 IgG (1:10000배 희석, Invitrogen, USA) 항체를 사용하여 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 인큐베이션하였다. PK-저항성 PrP^Sc 밴드를 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (Cytiva, USA)로 검출하고, Gbox Chemi XR5 이미지 분석 시스템 (Syngene, UK)으로 시각화 하였다. 이와 별도로, PK 분해 없이 동량(20 μg)의 세포 용해물에 대하여 β액틴 수준의 면역 검출을 수행하였다. 실험 방법은 상기와 동일하고, 마우스 단일클론 항- β액틴(Santa Cruz Biotechnology, USA)을 1:5000으로 희석하여 1차 항원으로 사용하였다. 신호 강도는 GeneTools 소프트웨어 (Syngene, UK)를 사용하여 농도 계측으로 정량하였다.

1.3 사육 기간 분석

질환 경과에서 아출 추출물의 효능을 평가하기 위하여, 질환 발병 기간을 프리온 질환 마우스 모델에서 측정하였다. 동물 실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 이루어졌다.

적응 1주 후, 5주령 암컷 CD-1 마우스 (Samtaco, Korea)에 마우스 적응형 스크래피 RML 프리온 (이하 “SBH”라 함)을 사용하여 최종적으로 프리온 질환이 유발된 마우스로부터 제조된 1% (w/v) 뇌 균질 현탁액 50 μl를 복강 내 주입하였다. 아출 추출물 100 mg/kg 내지 200 mg/kg을 프리온 접종한 다음날부터 1주일에 3회, 4주 동안 섭식 제공하였다. 체중 감소, 굽은 자세, 이동 감소, 꼬리 경직과 같은 명백한 프리온-관련 신경병리학적 징후들을 나타낼 때 까지 12:12 낮:밤 조건으로 사육하였다. 마우스가 2가지 이상의 임상적 징후를 나타내면, 이산화탄소를 이용해 인도적으로 안락사시키고 각각의 마우스에 대하여 사육 기간을 측정하고, 각각의 군에 대한 평균 사육 기간 및 표준 평균 오차를 계산하여 비교하였다.

아출 추출물을 투여 받은, 이러한 징후가 없는 마우스 군은 감염 후 452일 (days post-inoculation; dpi)까지 관찰하고 안락사시켰다. 담체(10% PBS 내 DMSO)만을 투여한 프리온 감염된 마우스를 대조군으로 사용하였다.

1.4 뇌 조직을 이용한 PrP ^Sc 분석

뇌에 축적된 PrP^Sc 수준을 Ryou C, Titlow WB, Mays CE, Bae Y, Kim S. The suppression of prion propagation using poly-L-lysine by targeting plasminogen that stimulates prion protein conversion. Biomaterials 2011;32:3141-9.에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

PBS 내 뇌 균질 현탁액 (10%, w/v)를 OMNI Bead Ruptor 24 (PerkinElmer, USA)와 실리콘 비드를 사용하여 준비하였다. 실온에서 1000 x g로 5분간 원심분리한 후, 분리된 상층액을 정량 분석하고 0.2 mg의 뇌 균질 현탁액을 2% Sarkosyl PBS와 혼합하였다. PK 분해 및 웨스턴 블롯을 상기와 동일한 방식으로 수행하였다.

1.5 혈청 화학검사

담체 및 아출 추출물이 투여된 군의 마우스 전혈을 수집하고, 혈청을 분리하여 자동화된 화학 분석기 Fuji DRI-CHEM 4000i (Fujifilm, Japan) 및 제안된 비색계 슬라이드 (Fujifilm, Japan)을 사용하여 분석하였다.

1.6 조직 구조 및 면역 조직 화학

추출된 마우스 뇌를 PBS 내 4% 파라포름알데하이드(Sigma, USA)로 4℃에서 밤새 고정하고, 파라핀 블록을 조직 처리기 Citadel 2000 (ThermoFisher Scientific, UK)로 제조하였다. 파라핀에 고정된 조직을 6 μm 두께로 자르고, H&E 염색을 수행하였다. 마우스 뇌 조직을 광학 현미경으로 관찰하고, 조직학적 이미지를 Axioscan Z1 slide scanner (Zeiss, Germany)로 수득하였다. 공포 형성 정도를 Zen2 소프트웨어 (Zeiss, Germany)를 이용하여 단위 면적 당 공포의 수로 측정하였다. GFAP (glial fibrillary acidic protein)의 면역조직화학을 M.O.M. 면역검출 키트(Vector Laboratories, USA)로 제조자의 지시에 따라 수행하였다.

구체적으로, 파라핀이 제거된 뇌 조직을 10 mM 소듐 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 10분간 끓이고 ??칭 용액 (0.3% H₂O₂)에서 5분간 배양하였다. M.O.M. 블로킹 시약으로 1시간동안 블로킹한 후, 마우스 단일클론 항-GFAP 항체 (M.O.M. 희석제로 1:500 배로 희석, Sigma, USA) 및 비오틴화된 항-마우스 IgG (1:250배로 희석, Vector Laboratories, USA)를 뇌 조직의 배양에 각각 1시간씩 순차적으로 사용하였다. 각 단계마다 PBS로 세척하였다. VECTASTAIN®Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Vector Laboratories, USA)를 사용하여 비오틴화된 분자를 검출하였다. 특정 염색에 대한 검출은 Vector DAB Substrate (Vector Laboratories, USA)를 사용하여 수행하였다. 공포 형성 및 GFAP 신호는 피질, 해마, 시상하부, 선조체 및 시상의 동일 영역에서 독립적으로 3차례 분석하였다.

1.7 In vitro 프리온 감염 분석

프리온 감염에 대한 아출 추출물의 효능을 평가하기 위하여, 표준 스크래피 세포 분석 (SSCA)를 조금 수정하여 수행하였다. N2a 세포(2.4 × 10⁴개)를 최종 농도 0.9% RML-SBH 존재 하에 50 μg/ml의 아출 추출물을 첨가하거나 첨가하지 않고 24-웰 디쉬에서 4일간 배양하였다. 프리온을 감염시키지 않은 N2a 세포를 대조군으로 배양하였다. 세포는 수 계대까지 유지하였다. 4, 및 10 계대 배양에서 2.5 × 10⁴ 개의 세포를 접종하고 0.45 μm 소수성 고 단백 결합 Immobilon-P 멤브레인 (Merck Millipore, Germany)으로 활성화된 불투명 96-웰 플레이트에 고정하였다. 멤브레인을 RIPA 용해 완충액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P-40, 및 0.1% SDS) 내 5 μg/ml PK로 90분간, PBS 내 2mM PMSF로 20분간 배양하였다. 그 후, 3 M 구아니딘 티오시아네이트에 10분간 노출시키고 PBS로 완전히 세척하였다. Superblock (ThermoFisher Scientific, USA) 용액으로 블로킹한 후, PrP^Sc를 마우스 단일클론 항-PrP 항체 6D11로 특이적으로 표지하고, 동일 농도의 알칼리성 탈인산화효소가 융합된 마우스 IgG (Abcam, UK)를 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. NBT/BCIP (nitro-blue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) 기질을 사용하여 발색시킨 후, 감염된 세포의 수를 S6 universal M2 ELISPOT 계측기 (ImmunoSpot, USA) 및 ImmunoSpot 소프트웨어 (ImmunoSpot, USA)를 이용하여 분석하였다.

1.8 아출 추출물 내 활성 성분의 활성 추적 동정

아출 조추출물을 물에 녹이고 n-헥세인 및 에틸 아세테이트로 연속적으로 분획하였다. 추출물 중 활성 n-헥세인 추출물 (HX)를 분취형 HPLC로 추가적으로 분리하였다. 각각의 분획에 대한 항-프리온 활성은 상기의 세포 기반 PrP^Sc 분석을 통해 확인하였다. 마지막으로, 활성 분획으로부터 화합물을 정제하고 이들의 화학 구조를 ESI-MS 및 NMR 스펙트럼으로 확인하였다.

1.9 실시간 원인병원체 증폭 검출법 (RT-QuIC) 분석

RT-QuIC 분석은 종래 연구에 기반하여 수행되었다 (Kang H-E, Mo Y, Abd Rahim R, Lee H-M, Ryou C. Prion Diagnosis: Application of real-time quaking-induced conversion. BioMed Res Int'l 2017;2017:5413936.; Caughey B, Baron GS, Chesebro B, Jeffrey M. Getting a grip on prions: oligomers, amyloids, and pathological membrane interactions. Annu Rev Biochem 2009;78:177-204.; Wilham JM, Orru CD, Bessen RA, Atarashi R, Sano K, Race B, et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog 2010;6:e1001217.; Schmitz M, Cramm M, Llorens F, Muller-Cramm D, Collins S, Atarashi R, et al. The real-time quaking-induced conversion assay for detection of human prion disease and study of other protein misfolding diseases. Nat Protoc 2016;11:2233-42.). 반응 혼합물은 바닥이 투명하고 평평한 96-웰 검은 플레이트에 준비하였다(Corning, USA). 최종 농도 100 μg/ml 재조합 마우스 PrP (23-231), 5 μl의 1 × 10^-4 희석 RML-SBH, 및 RT-QuIC 분석 완충액 (200 mM NaCl, 10 mM thioflavin T (ThT), 0.002% SDS, 10 mM EDTA, 및 10 mM 인산 완충액 (pH 7.4))을 100 μl 반응 부피로 혼합하였다. 퓨라노다이에논 및 쿠르제레논의 항-프리온 전환 활성을 시험하기 위하여, RT-QuIC 분석을 소정의 농도에서 화합물의 존재 또는 부재 하에 수행하였다. 반응 플레이트를 42℃에서 90 내지 120 시간 동안 FLUOstar Omega (BMG Labtech, Germany) 계측기에서 선택적으로 혼화하며 배양하였다. 450nm에서의 여기 및 480 nm에서의 발광으로 ThT 형광 강도를 매 15분마다 측정하여 PrP 응집을 측정하였다. 배경 형광 강도를 제거하여 AUC 값을 계산하였다. 유도기 (lag phase)의 길이는 ThT 형광의 시간 경로 데이터를 사용하여 확인하였다.

실시예 2. 결과 및 분석

2.1 ScN2a 세포에서 아출 추출물이 PrP ^Sc 수준을 감소시킴

지속 프리온 감염된, 불멸화된 신경 아종 세포주인 ScN2a 세포에서 아출 추출물의 항-프리온 효능을 확인하기 위하여 세포 기반 PrP^Sc 분석을 수행하였다. PrP^Sc 분석에서, 50 μg/ml의 아출 추출물과 함께 4일간 배양된 ScN2a 세포에서 PrP^Sc의 수준은 담체와 함께 배양된 대조군에 비하여 약 20% 미만으로 유의미하게 감소하였고 (도 1A), 이러한 효능은 농도 의존적으로 나타났다 (도 1B). 이는 아출 추출물이 프리온을 억제함을 설명한다.

2.2 아출 추출물이 프리온 질환의 경과를 변경함

아출 추출물의 항-프리온 효능을 마우스 적응형 RML 스크래피 프리온으로 감염된 마우스에서 평가하였다. 아출 추출물 100 mg/kg으로 투여한 경우, 담체만을 투여 받은 대조군에 비하여 사육 기간이 1주 연장되었다 (표 1).

군	사육 기간 Mean ± SEM (일)	n/n0
담체	202.4 ± 4.44	9/9
아출 추출물 100 mg/kg	209.0 ± 6.3	9/9
아출 추출물 200 mg/kg	212.8 ± 4.71	6/9

반면, 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 군에서는 실험 종료 시점인 452 dpi까지 마우스의 1/3이 건강한 상태로 유지되어, 프리온 질환에 대한 예방능이 있음을 보여주었다. 나머지 2/3 마우스는 프리온 질환의 징후를 보였으나, 이들의 사육 기간은 대조군에 비하여 10일을 초과하여 연장되었다.

로그순위법을 통해 각 군을 비교해 본 결과, 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 군의 평균 사육 기간은 담체만을 투여 받은 군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었다 (도 2A). 이러한 결과는 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 군에서 프리온 질환의 경과가 변화되었음을 의미한다.

웨스턴 블롯을 통해 마우스의 뇌에서 PrP^Sc의 축적 여부를 확인하였다. 100 mg/kg의 아출 추출물은 투여 받은 마우스 뇌 내 PrP^Sc의 수준은 대조군의 마우스 뇌와 유사하였다 (도 2B). 그러나 프리온 질환이 발병되고 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 마우스의 뇌에서의 PrP^Sc 수준은 대조군의 마우스 뇌 내의 PrP^Sc 수준에 비하여 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받고 실험의 종료 시점까지 살아남은 마우스의 뇌 내 PrP^Sc는 급격히 감소되어 있음을 확인하였다 (도 2B). 이러한 결과는 프리온 감염된 마우스에서 아출 추출물을 투여함으로써 질환의 경과에서 프리온 관련 생화학적 이벤트가 완전히 변경됨을 보여주는 것이다. 이러한 결과는 기존 대부분의 in vivo 활성 시험에서는 나타나지 않았던 결과이다 (Ryou C, Titlow WB, Mays CE, Bae Y, Kim S. The suppression of prion propagation using poly-L-lysine by targeting plasminogen that stimulates prion protein conversion. Biomaterials 2011;32:3141-9.; Telling GC, Scott M, Hsiao KK, Foster D, Yang SL, Torchia M, et al. Transmission of Creutzfeldt-Jakob disease from humans to transgenic mice expressing chimeric human-mouse prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:9936-40.; Vickery CM, Lockey R, Holder TM, Thorne L, Beck KE, Wilson C, et al. Assessing the susceptibility of transgenic mice overexpressing deer prion protein to bovine spongiform encephalopathy. J Virol 2014;88:1830-3).

2.3 아출 추출물이 신경 병리학적 악화를 예방함

프리온 질환의 경과 중 발생되는 신경 퇴행에 대한 아출 추출물의 효능을 확인하기 위하여, 100 내지 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받거나 투여 받지 않은, 프리온 감염된 마우스의 뇌 절편을 통해 공포 형성 및 신경아교증을 확인하였다. 특히, 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받아 프리온 질환이 발병되지 않은 마우스의 뇌 절편에서 변경된 병리학적 특성을 조사하고자 하였다.

H&E 염색을 통해, 대조군에서 마우스의 다양한 뇌 영역에 걸쳐 발견되는 공포가 아출 추출물을 투여 받은 마우스 군에서는 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다 (도 3A). 100 mg/kg 및 200 mg/kg을 투여 받은 군 모두에서 공포를 계수해본 결과, 아출 추출물이 해면상 변성이 통계학적으로 유의미한 수준으로 대뇌 피질, 해마, 및 줄무늬체에서 감소되었고, 시상 하부 및 시상에서는 그렇지 않음을 확인하였다. 구체적으로, 공포 형성은 농도 의존적으로 대뇌 피질에서 40% 내지 55%, 해마에서 43% 내지 49%, 줄무늬체에서 54% 내지 68% 감소되었다 (도 3A).

GFAP 면역조직화학을 통해 마우스 뇌에서 성상교세포를 확인하였다. 성상 세포 활성화는 200 mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 3마리 마우스 뇌의 전 영역에서 현저하게 덜 진행되었으므로, 100mg/kg의 아출 추출물을 투여 받은 군 및 담체만을 투여 받은 군과 비교할 때 질환의 발병 징후가 나타나지 않음을 보여준다 (도 3B). 이들 GFAP-양성 성상 세포의 정량화를 통해 마우스 뇌 영역에 따라 62% 내지 91% 활성 성상교세포를 감소시킴을 확인하였다. 공포 형성 및 활성 신경아교세포의 감소를 통해 아출 추출물의 투여가 프리온 질환에서 발생되는 뇌의 손상을 효과적으로 예방할 수 있음을 보여준다.

2.4 아출 추출물이 in vitro 에서 프리온 감염을 막음

아출 추출물의 프리온 질환 예방 효과를 확인하기 위하여, 세포 기반 프리온 감염을 아출 추출물 존재 하에 수행하였다. N2a 세포를 RML 스크래피 프리온과 함께 24시간 배양하고, 프리온이 없는 배양액에서 4계대하여 PrP^Sc-양성 세포가 형성됨을 확인하였다 (도 4). 그러나 아출 추출물의 존재 하에 프리온을 감염시킨 경우에는 PrP^Sc 양성 세포의 수가 실질적으로 감소되었다. 이러한 효능은 프리온-감염된 N2a 세포 4계대 배양 후 프리온 부재 배양액에서 추가적인 6계대 배양을 한 경우에 더 확실하게 나타났으며, 대부분의 프리온 감염 및 전파를 완전히 억제하였다.

in vitro 프리온 감염 실험의 결과를 통해 아출 추출물이 프리온 감염성을 감소시킴을 확인하였다. 또한, 이러한 결과는 PrP^Sc 축적이 되지 않고 뇌에서 신경병리학적인 특성이 나타나는 무증상 마우스가 동물 실험에서 프리온 감염 단계에서 실험 상의 실수로 야기된 것은 아님을 입증한다.

2.5 아출 추출물의 활성 추적 동정 후 세포 기반 PrP ^Sc 분석 기반 항-프리온 활성 성분의 동정: 쿠르제레논 및 퓨라노다이에논

프리온 억제 활성을 갖는 아출 조추출물의 활성 성분을 확인하기 위하여 활성 추적 동정을 수행하였다. 용매 분획 후, 아출 조추출물 및 이의 추출된 분획들을 이용하여 각 분획의 중량비에 따라 ScN2a 세포를 배양하였다 (도 3, 및 표 2).

분획	질량 (g)	질량비 (%)	농도 (μg/ml)
CpV Ext	4.26	100	50
HX	1.85	43.4	21.7
EA	1.72	40.4	20.2
ED	0.13	3.1	1.5
DW	0.56	13.1	6.6

CpV Ext: 아출 조추출물HX: n-헥세인 분획

EA: 에틸 아세테이트 분획

ED: 에틸 아세테이트 및 물 분획 사이의 미혼합 분획

DW: 물 분획

HX 분획에서 배양된 ScN2a 세포의 PrP^Sc의 수준은 총 아출 추출물에서 관찰된 수준과 유사하게 나타났다 (도 5). HX의 정제된 소분획으로 추가적인 활성 추적 동정을 동일한 방식으로 수행하였다. HX를 분취 HPLC로 12개의 소분획으로 분리하였다 (도 6 및 7). 각각의 소분획을 ScN2a 세포의 배양에 사용하였으며, 이 때 담체를 사용한 대조군의 PrP^Sc 수준에 비하여 PrP^Sc의 수준이 감소된 소분획은 HX7, HX8, 및 HX9로 나타났다 (도 8). HX7, HX8, 및 HX9 소분획에서 2개의 화합물이 분리되었고, 이들의 화학 구조를 통해 쿠르제레논 및 퓨라노다이에논임을 확인하였다 (도 9 내지 도 15).

2.6 퓨라노다이에논이 ScN2a 세포에서 PrP ^Sc 수준을 감소시킴

HX의 활성 소분획에 포함된, 동정된 화합물들(쿠르제레논 및 퓨라노다이에논)의 항-프리온 활성을 확인하기 위하여, 이들 화합물과 함께 배양하여 ScN2a 세포에서 PrP^Sc 수준을 측정하였다. 퓨라노다이에논은 ScN2a 세포에서 PrP^Sc의 수준을 농도 의존적으로 감소시켰다 (도 16). 그러나 쿠르제레논은 PrP^Sc의 수준을 증가시켰고, 화합물의 농도에는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 아출 추출물의 항-프리온 활성은 퓨라노다이에논에 기인함을 나타낸다.

2.7 퓨라노다이에논이 PrP 변화를 억제함

퓨라노다이에논 활성의 생화학적 방법을 확인하기 위하여, 프리온 시딩을 통해 PrP^C의 잘못 접힌 아이소폼으로의 변화를 모사한 RT-QuIC 분석을 수행하였다. RT-QuIC 반응에서 퓨라노다이에논을 첨가한 경우, 변화 과정에 의한 잘못 접힌 아이소폼의 발생에 의한, PrP 응집을 감소시켰다 (도 17). RT-QuIC 반응에서 퓨라노다이에논 농도는 계산된 AUC와 역상관되었고, 유도기의 길이와는 비례 상관 관계를 나타내었다. 이러한 결과는 퓨라노다이에논이 PrP 변화를 억제함을 보여준다.

예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

Claims (12)

1. 퓨라노다이에논을 포함하는, 프리온 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 스크래피 프리온 단백질(PrP^Sc)의 수준을 감소시키는, 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 프리온 단백질의 응집을 억제하는, 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 프리온 질환은 소의 해면상 뇌병증 (BSE); 양 및 염소의 전진병; 사슴, 엘크사슴, 무스, 및 순록의 만성 소모성 질병; 인간의 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병인, 약학 조성물.
5. 퓨라노다이에논을 포함하는, 프리온 질환 예방 또는 완화용 건강기능식품.
6. 제5항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 스크래피 프리온 단백질(PrP^Sc)의 수준을 감소시키는, 건강기능식품.
7. 제5항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 프리온 단백질의 응집을 억제하는, 건강기능식품.
8. 제5항에 있어서, 상기 프리온 질환은 소의 해면상 뇌병증 (BSE); 양 및 염소의 전진병; 사슴, 엘크사슴, 무스, 및 순록의 만성 소모성 질병; 인간의 크로이펠트-야콥병, 치명적 가족성 불면증, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 증후군, 및 알츠하이머병인, 건강기능식품.
9. 퓨라노다이에논을 포함하는, 프리온 질환 예방 또는 치료용 사료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 스크래피 프리온 단백질(PrP^Sc)의 수준을 감소시키는, 사료 조성물.
11. 제9항에 있어서, 퓨라노다이에논이 세포 내 프리온 단백질의 응집을 억제하는, 사료 조성물.
12. 제9항에 있어서, 상기 프리온 질환은 소의 해면상 뇌병증 (BSE); 양 및 염소의 전진병; 사슴, 엘크사슴, 무스, 및 순록의 만성 소모성 질병인, 사료 조성물.