KR20230149157A

KR20230149157A - 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 nibrfgc000501771 균주 및 이를 이용한 드라이 타입의 약주 제조 방법

Info

Publication number: KR20230149157A
Application number: KR1020220048519A
Authority: KR
Inventors: 조호철; 김순옥; 장영진; 김창무; 박길우; 강재신; 박찬순; 안초롱; 박장기; 이종수; 문준웅
Original assignee: 대한민국(환경부 국립생물자원관장); 대한민국(관리부서: 국세청주류면허지원센터장)
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2023-10-26

Abstract

본 발명은 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)은 발효가 완료된 술덧의 최종 알코올 도수가 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)인 드라이 타입의 약주를 제조할 수 있고, 응집성이 높으며, 향기 성분을 고함량으로 생성시키는 장점이 있어 관능성이 개선된 고품질의 약주 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주 및 이를 이용한 드라이 타입의 약주 제조 방법{SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAIN NIBRFGC000501771 FOR DRY-TYPT RICE WINE AND PROCESS FOR PREPARING METHOD OF DRY-TYPT RICE WINE USING SAME}

본 발명은 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주 및 이를 이용한 드라이 타입의 약주 제조 방법에 관한 것이다.

우리나라는 예로부터 가가호호 술을 빚어 마시는 풍습이 뿌리를 내려왔다. 지방에 따라, 가문에 따라 또 빚는 사람의 솜씨에 따라 갖가지 방법과 기술을 발휘한 가양주들이 등장하여 맛과 향기를 자랑했는 바, 이러한 배경에서 향토성을 띤 토속주가 명주로 등장하였고 현재에도 많은 양조장에서 전통적인 가양주를 살리고자 하는 노력이 진행되고 있으며 품질을 위해 현대적인 기술을 접목한 술들이 출시되고 있다.

다만, 양조 과정에서 누룩만을 사용하고 효모는 누룩에 존재하는 야생효모를 그대로 이용하여 만든 술은 발효와 공정 관리에 어렵고 품질이 안정적이지 않다. 일부 전통주 양조장에서는 안정적인 품질관리를 위해서 효모를 구매하여 사용하는데, 우리 전통주의 주조에 활용할 수 있는 효모는 매우 제한적이다. 실제로 효모 제품의 국내시장 규모는 연 230억이나, 대부분 수입에 의존하는 실정이며, 이로 인해 국산 주류의 정통성이 담보되지 못할 뿐 아니라, 외화 낭비도 심각한 실정이다.

특히, 양조에 사용되는 효모는 많은 양조장에서는 수입 제빵효모를 사용하는 경우가 많은데 이는 수입 효모가 배양된 환경이 외국이기에 우리나라 국산 원재료를 사용하는 양조와는 그 환경이 맞지 않는다. 따라서, 정통성을 확보하고 우수한 풍미를 발현하는 전통주의 양조를 위한 우수한 효모 균주의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 국내 현실을 반영하여 다양한 풍미를 발현하는 자생 효모 균주를 개발하고자, 본 발명자들은 전국의 꽃, 열매, 누룩, 토양 등에서 야생효모 1,700여 균주를 순수 분리·배양하여 보존 중이며, 이중 배양이 쉽고 알코올 발효 능력이 있어 양조에 활용이 가능한 88개 균주를 대상으로 양조 품질과 적합성을 평가하였다. 그 결과, 알코올 생성력과 응집성이 좋은 드라이 타입의 약주 제조에 적합한 우수한 양조효모의 특성을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

(0001) 특허공개 제10-2008-0053629호, 주류의 향기성분을 증가시키는 사카로마이세스 세레비제T084 및 식물약재를 이용한 약주의 제조방법 (0002) 특허공개 제10-1998-0049302호, 새로운 고향기 약주효모균주 사카로마이세스 세레비제 TD03과 이를 이용한 약주의 제조방법 (0003) 특허공개 제10-2017-0137237호, 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법

따라서, 본 발명의 주된 목적은 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 이용하여 드라이 타입 약주의 제조방법과 이에 따라 제조된 드라이 타입의 약주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 제공한다.

본 발명자들은 약주 제조에 사용되는 수입 효모를 대체하는 국산 효모 균주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)이 시중에서 판매되는 상용 효모보다 관능성에서 뛰어난 특성을 나타내며, 향기 성분을 고농도로 생산하고, 드라이 타입의 약주 생산에 유용함을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771은 국립생물자원관에서 분리·배양한 야생효모 1,700여 균주 중 배양이 쉽고, 알코올 발효 능력이 있어 양조에 활용이 가능한 88개 균주를 대상으로, 크기, 발효력, 응집성(Flocculation), Cu 배지 성장성, 포자 생성(Sporulation), Melibiose 이용 능력 등의 연구 및 약주 시험양조 연구를 통해 양조용으로 사업화 가능성이 높은 33종을 1차 선발한 후, 시험양조를 통해 알코올 생성력과 효모의 응집성이 좋은 드라이 타입의 효모 4종을 2차 선발하고, 최종적으로 알코올 생성력, 당함량 축적 정도, 발효의 안정성, 유기산 함량, 불휘발분 잔류량, 효모 응집성(Flocculation), 향기 성분 분석 및 관능 평가를 통해 도출된 드라이 타입의 약주 양조용 효모이다. 상기 균주는 2022년 02월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주로 기탁하여 KACC 83061BP를 부여받았다. 본 발명에서 "사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주", "NIBRFGC000501771 균주" 및 "501771 균주"는 동일한 의미로 서로 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "드라이 타입의 약주"는 알코올 함량이 높은 약주를 의미하며, 본 발명에서는 발효가 완료된 원주의 알코올 도수가 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)의 높은 알코올 함량을 갖는 약주를 의미한다.

따라서, 본 발명의 상기 NIBRFGC000501771 균주로 발효가 완료된 술덧(원주라고도 함)의 최종 알코올 도수는 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)인 것을 특징으로 한다. 도 1을 참조하면, 본담금 1일(발효 4일) 경과 시점에서 NIBRFGC000501771 균주를 사용한 제조예 1 술덧의 알코올 도수는 3.5%(v/v)이었고, 본담금 2일(발효 5일) 경과 시점에서 8.2%(v/v)이었으며, 본담금 3일(발효 6일) 경과 시점에서 12.3%(v/v)로 각각 분석되었다. 본담금 초기 에틸 알코올 생성력이 좋은 드라이 약주의 경우, 본담금 직후부터 높은 알코올 함량이 특징이다. 이러한 특징은 불필요한 오염균 생장의 저해 요인으로 작용한다. 따라서, 본담금 초기 발효 진행 속도가 빠른 특징은 높은 알코올 함량으로 다른 미생물 오염을 줄여서 안전한 발효에 유용하고 양조공정 관리에 효율적이다. 또한, 드라이 타입의 약주 제조 과정에서 술덧의 에틸알코올 함량이 높아지면 제품화 과정에서 술의 용량을 더 늘릴 수 있어 제조 수율이 높아지며, 경제적이다. 발효 진행 속도와 술덧의 최종 알코올 함량에 대한 실험 결과를 통해 검토해 본 바, 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주는 발효가 완료된 술덧(원주)의 최종 알코올 도수가 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)인 드라이 타입의 약주를 제조할 수 있는 것으로 확인되었으며, 상기에서 설명한 바와 같은 맥락에서 드라이 타입의 약주 제조에 특화된 균주이다.

또한, 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주는 발효 과정에서 시트르산(citric acid) 및 숙신산(Succinic acid)을 다량 생성시키며, 본 발명의 효모 균주를 이용한 약주는 특정 유기산 함량이 높은 특징이 있다(표 4 참조). 술의 관능적 품질에 가장 크게 영향을 미치는 성분은 당류, 산류 및 에틸알코올 성분이고, 당분 함량이 낮은 술에서는 어느 정도 신맛 성분이 높을수록 관능적으로 좋은 평가를 받는 것을 감안하면, 시트르산(citric acid) 및 숙신산(Succinic acid)을 다량 생성시키되, 젖산(Lactic acid) 및 아세트산(Acetic acid)을 소량 생성시키는 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주는 드라이 타입의 약주 제조에 적합한 특성을 갖는다.

본 발명의 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP) 균주는 효모의 응집성이 높은 것을 특징으로 한다(표 5 참조). 효모는 발효 후반부에 효모들 사이에서 엉김 현상이 일어나 발효 탱크 하단부에 가라앉는 특성이 있다. 특히, 약주는 혼탁한 형태로 제품화하는 탁주와 달리 발효가 끝난 술덧을 맑고 투명하게 하여 제품화하는 것이 특징인 술이고, 약주 양조공정에서 맑고 투명하게 만드는 여과 공정이 가장 어려운 공정에 해당한다. 드라이 타입의 약주용 효모는 응집성이 높아야 발효가 끝난 후 효모가 빠르게 침강해 이후 공정인 여과 공정을 손쉽게 진행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 수입 라빠리장 효모의 응집도 8.8%와 대비해 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주가 2배 이상 증가한 18.36의 응집도를 갖는 것을 확인하였으며, 이러한 높은 응집성은 드라이 타입의 약주 제조에 적합한 특성이다.

또한, 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주는 향기 성분을 고함량으로 생성시키는 것을 특징으로 한다(표 6 참조).

본 발명에서, 상기 향기 성분은 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소-부틸 아세테이트(iso-buthyl acetete), 에틸 부틸레이트(ethyl butylate), 1-프로판올(1-propanol), 이소부탄올(isobutanol), 이소펜틸 아세테이트(isopentyl acetate), 1-부탄올(1-butanol), 이소아밀 알코올(iso-amyl alcohol), 에틸 헥사노에이트(Ethyl hexanoate), 1-헥사놀(1-hexanol), 에틸 옥타노에이트(ethyl octanoate), 푸르푸랄(furfural), 페닐 아세테이트(phenyl acetate), 에틸페닐 아세테이트(ethylphenyl acetate), 및 에틸 도데카노에이트(ethyl dodecanoate) 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 NIBRFGC000501771 균주로 제조된 약주의 향기 성분을 면밀하게 분석하였고, 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주가 향기 성분의 총합을 가장 많이 생성시키는 효모 균주 중 하나임을 확인한 바 있다. 구체적으로 동 균주로 발효된 제조예 1의 시료는 장미향, 꿀향, 사과향으로 감지되는 ethyl phenyl acetate 성분, 바나나향으로 감지되는 iso butyl acetate 성분, 배향으로 감지되는 iso pentyl acetate 성분, 사과향으로 감지되는 ethyl hexanoate 성분, 그리고 멜론향, 풋사과향, 파인애플향으로 인지되는 ethyl octanoate 성분 함량이 동시에 높게 검출되는 것을 확인하였다. 따라서, 감칠맛과 특유의 신맛을 제공하는 숙신산 및 시트르산 함량이 높고, 향기성분을 다량 생성해 내는 본 발명의 NIBRFGC000501771 효모 균주는 드라이 타입의 약주 주조용 양조효모로 적합한 균주이다. 또한, 관능검사 결과에서도 NIBRFGC000501771 균주가 외관, 향, 맛, 감촉 등 모든 항목에서 가장 좋은 평가를 받은 바 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 정제수에 입국 및 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 첨가하고 2일 내지 5일 동안 발효하여 밑술을 제조하는 단계; 및 상기 밑술에 팽화미, 정제효소제 및 정제수를 첨가하고 6일 내지 15일 동안 발효하여 담금하는 단계;를 포함하는 드라이 타입의 약주 제조 방법을 제공한다. 상기 약주 제조방법에서, 전분질 원료인 팽화미 원료 중량의 15% 내지 30%에 해당하는 입국을 밑술 제조단계에 사용할 수 있으며, 급수되는 정제수는 전분 원료 대비 110% 내지 180% 중량으로 투입할 수 있다. 또한, 정제효소제는 전분 원료 대비 0.02% 내지 0.06% 중량부로 사용할 수 있으며, 효모는 1㎖ 당 8×10⁷ 내지 8×10⁸ cfu의 균수로 배양하여 입국 100 중량부 대비 1.0 내지 9.3㎖의 부피로 사용할 수 있고, 바람직하게는 1㎖ 당 2×10⁸ cfu의 균수로 배양하여 입국 100 중량부 대비 3.1㎖의 부피로 사용할 수 있다. 밑술 제조 단계의 발효는 2일 내지 5일, 바람직하게는 4일 내지 5일 진행할 수 있고, 담금 단계의 발효는 6일 내지 15일, 바람직하게는 10일 내지 14일 진행할 수 있는데, 담금 단계에서 알코올 도수의 변화가 없는 경우 발효 과정을 종료할 수 있다. 발효 과정이 종료된 술덧은 주대를 이용하여 거른 후, 밀폐 용기에 담아 0℃ 내지 5℃에서 3일 내지 7일간 보관하면서 침전물 제거한 후 1~2㎛ 종이필터 여과기로 정밀하게 여과하여 약주로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 드라이 타입의 약주 제조 방법으로 제조된 향기 성분이 강화된 드라이 타입의 약주를 제공한다.

본 발명의 드라이 타입의 약주는 향기 성분이 강화된 것을 특징으로 하는데, 상기 향기 성분의 예로는 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소-부틸 아세테이트(iso-buthyl acetete), 에틸 부틸레이트(ethyl butylate), 1-프로판올(1-propanol), 이소부탄올(isobutanol), 이소펜틸 아세테이트(isopentyl acetate), 1-부탄올(1-butanol), 이소아밀 알코올(iso-amyl alcohol), 에틸 헥사노에이트(Ethyl hexanoate), 1-헥사놀(1-hexanol), 에틸 옥타노에이트(ethyl octanoate), 푸르푸랄(furfural), 페닐 아세테이트(phenyl acetate), 에틸페닐 아세테이트(ethylphenyl acetate), 및 에틸 도데카노에이트(ethyl dodecanoate)를 들 수 있다.

본 발명의 드라이 타입의 약주 제조 방법과 드라이 타입의 약주는 상술한 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)에 의해 제조되는 것이기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 제공한다.

본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)은 발효가 완료된 술덧의 최종 알코올 도수가 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)인 드라이 타입의 약주를 제조할 수 있고, 효모의 응집성이 높으며, 향기 성분을 고함량으로 생성시키는 장점이 있으므로, 관능성이 개선된 고품질의 약주 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 선발 효모 3종 및 수입 상용 효모 1종을 이용하여 제조되는 약주의 발효 경과에 따른 알코올 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주를 YPD 배지에서 배양하고, 배양 형태를 촬영한 사진이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주를 YPD 배지에서 배양하고, 광학현미경(왼쪽, 1,000배)과 주사전자현미경(오른쪽)으로 촬영한 사진이다.
도 4는 YT 마이크로플레이트(MicroPlate)를 이용하여 NIBRFGC000501771 균주의 표현형 마이크로어레이(phenotype microarray) 분석을 수행한 결과이다[위의 표는 산화(oxidation), 아래 표는 동화(assimilation) 분석 결과임].
도 5는 NIBRFGC000501771 균주의 유연관계를 분석한 계통도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 실험 재료 및 방법

1-1. 효모

국립생물자원관에서 분리·배양하여 보존 중인 효모 균주 88종을 대상으로 효모의 크기, 발효력, 응집성(Flocculation), Cu 배지 성장성, 포자 생성(Sporulation), 멜리바이오스(Melibiose) 이용 능력 등의 평가와, 약주 시험양조를 통해 양조용으로 사용 가능한 33종의 효모 균주를 1차 선발하였다. 이후, 2차 시험양조를 통해 발효가 완료된 술덧의 최종 알코올 도수가 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)이고 향기가 뛰어난 드라이 타입의 효모 3종을 선발하여 실험에 사용하였다.

2차 선발된 효모 3종은 Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000501771(경기도 용인시 채집, 야생화), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503472(경기도 남양주시 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503478(강원도 홍천군)의 3종 균주이다. 대조군으로는 시판 중인 라빠리장 효모를 사용하였다.

효모는 glycerol 20% stock으로 -45℃에 보관하였고, YMA 평판배지에 도말하여 콜로니(colony)를 확인한 후, YMB 액체배지에 배양하여 사용하였다. 배지는 Yeast Malt Broth(MB Cell), Yeast Malt Agar(MB Cell) 제품을 사용하였다.

1-2. 약주 원료

약주 제조에 사용한 전분 원료는 쌀을 고온, 진공, 팽창시켜 만든 팽화미(국내산, ㈜조은곡식)를 사용하였고, 발효제로는 입국(역가 60sp, ㈜조은곡식)과 정제효소제(역가 15,000sp, ㈜바이오랜드)를 사용하였다.

1-3. 약주 제조

발효주 담금 방법은 전분 원료인 팽화미 원료의 20%에 해당하는 입국을 사용하였으며, 급수량은 전분 원료 대비 160%로 하였다.

정제효소제는 전분 원료 대비 0.04% 사용하였으며, 효모는 1㎖ 당 2×10⁸ cfu의 배양액 3.1㎖를 넣어주었다. 알코올 도수의 변화가 없으면 발효를 중지시키고, 알코올 등 품질분석을 바로 진행하였으며, 관능 평가용 시료는 3℃에서 보관하였다.

1-4. 성분 분석

[알코올 도수]

알코올은 발효주 시료 상등액 100㎖에 증류수 30㎖를 첨가하여 자동증류장치(C.Gerhardt, DE/VAPODEST200)를 통해 증류액 90㎖를 회수하고, 증류수로 총부피 100㎖를 적정한 후 디지털 알코올 측정장치(Multiple Auto Sampler, KEM, JP/DA-645)를 사용하여 15℃에서의 알코올 함량(%(v/v))을 측정하였다.

[당도]

당도 측정은 알코올 도수 측정 후 남은 잔액을 이용하여 디지털 당도 측정기(Atago, Japan)를 통해 °Brix 단위로 측정하였다.

[총산 및 아미노산도]

총산 및 아미노산도는 AOAC법을 참고하여 국세청 주류분석규정(국세청 기술 연구소, 2008)에 따라 CO₂를 제거한 시료 상층액 10㎖를 전위차 측정기(Metrohm, 855 Robotic Titrosampler)를 사용하여 0.1N NaOH pH 8.2가 될 때까지 적정한 ㎖ 수를 산도로 하고, 여기에 중성 포르말린 용액 5㎖를 가하여 유리된 산을 0.1N NaOH pH 8.2이 될 때까지 적정한 ㎖수를 아미노산도로 하였다.

초산으로 환산한 값을 총산으로 하여 g/100㎖ 단위로 나타내었다.

(총산)

Total acid(as acetic acid) g/100㎖ = 적정 ㎖ 수 × 0.006 × 10

글리신으로 환산한 값을 아미노산도로 하여 g/100㎖ 단위로 나타내었다.

(아미노산도)

Amino acid(as grycine) g/100㎖ = 적정 ㎖ 수 × 0.0075 × 10

[불휘발분]

시료 25㎖(15℃)를 증발접시에 넣고, 물중탕기에서 가열하여 충분히 증발시킨 후, 건조기를 이용하여 105~110℃에서 2시간 건조하였다. 건조 시료를 데시케이터에서 식힌 후(30분 방치) 무게를 달아 증발접시 무게를 제외하여 측정한 후, 측정값에 4배로 곱하여 불휘발분의 그램 수를 산출하였다.

[유기산]

시료를 원심분리(5,000×g, 10min)한 다음 0.5㎛의 membrane filter로 여과하여 Ion Chromatograph(Metrohm 850 Professional IC) 장치로 분석하였다. Column은 Metrosep Organic acid 250/7.8 모델을 사용하였고, Column 온도는 35℃, 솔벤트 시스템(Solvent system)은 Organic acid-H2SO4 0.002㎖, 유량(Flow rate)은 0.5mL/min의 조건으로 측정하였다.

[유리당]

시료를 50% Acetonitrile 용매로 10배 희석하고 0.2㎛ membrane filter로 여과한 후, UPLC(ACQUITY UPLC H-Class/RI Detector) 장치를 이용하여 과당(Fructose), 포도당(Glucose), 자당(Sucrose), 맥아당(Maltose), 유당(Lactose)을 분석하였다. Column은 ACQUITY BEH Amide(100mm x 2.1mm, 1.7㎛) 모델을 사용하였고, Column 온도는 35℃, 솔벤트 시스템(Solvent system)은 0.2% TEA in Acetonitrile: 0.2% TEA in DW = 75% : 25%, 유량(Flow rate)은 0.13㎖/min의 조건으로 측정하였다.

[주요 향기성분]

Gas Chromatography/Flame Ionization Detector(GC/FID)(Agilent 7890, Agilent Technologies INC., Santa Clara, USA)를 이용하여 향기성분을 분석하였다.

분석시료를 20mL 바이알(vial)에 캡(cap)을 닫아 밀봉한 후, 헤드스페이스 샘플러(headspace sampler)(7697Am Agilent Technologies INC.. Santaclara, USA)에 넣고, 오븐(oven) 70℃, 루프(loop)(3㎖) 80℃, 라인(line) 90℃로 유지하여 GC/FID 장치에 주입하여 분석하였다. Column은 Agilent HP-FFAP(30m x 320㎛ x 0.25㎛)를 사용하였고, 캐리어 가스(Carrier gas)는 N₂, 오븐(Oven) 온도는 40℃에서 4분간 유지 후 5℃/min의 속도로 100℃까지 상승시켰으며, 이후 6℃/min으로 200℃까지 상승 후 4분 유지하고, 10℃/min으로 220℃까지 상승시켰다. 스플릿 비율(Split ratio)은 10:1, 유량(Flow rate)은 0.8㎖/min의 조건으로 분석하였다.

[효모의 응집 테스트(Flocculation test)]

효모를 Yeast Malt Broth 배지에 1.5 × 10⁶ Cells/㎖ 농도로 배양한 다음 배양액을 Tube "A"에 10㎖, Tube "B"에 10㎖로 각각 채취하였다. Tube "A"는 원심분리(900×g, 2.5min)한 다음 상등액을 버리고, 증류수 9.9㎖와 용액 A(PH7 0.5M EDTA용액) 0.1㎖를 넣고 15초 동안 혼합하여 생성된 혼합 용액을 1㎖ 채취한 후, 9㎖ 증류수를 넣어 600㎚에서 흡광도를 측정하였다. Tube "B"는 원심분리(900×g, 2.5min)한 상등액을 버리고 세척액(증류수 1ℓ, CaSo₄ 0.51g) 10㎖를 넣어 15초 혼합 후 원심분리(900×g, 2.5min) 한 다음, 상등액을 버리고 용액 B(CaSo₄ 0.51g, CH₃COONa 6.8g, CH₃COOH 4.05g을 증류수 1ℓ에 녹인 후, pH 4.5로 만듦)를 넣어 15초 혼합하였다. 6분간 정치하여 상등액 1㎖를 채취한 후, 9㎖ 증류수를 넣어 600㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효모의 응집력은 하기 [식 1]을 이용하여 측정하였다.

[식 1]

실시예 2. 약주 제조

상기 실시예 1-1의 2차 선발 과정을 통해 선정된 드라이 타입의 효모 균주 3종[Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000501771(경기도 용인시 채집, 야생화), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503472(경기도 남양주시 채집), Saccharomyces cerevisiae NIBRFGC000503478(강원도 홍천군 채집)]의 발효능을 분석하기 위해 약주를 제조하였다. 대조군으로는 시판 중인 라빠리장 효모를 사용하였다.

밑술은 입국을 사용하였으며, 전체원료 500g 대비 20%인 100g을 사용하였다. 급수는 입국 중량 대비 160%(w/v)인 160㎖를 사용하였으며, 밑술 발효는 4일간 진행되었다. 밑술의 발효가 완료된 후, 팽화미 400g과 물 792㎖, 정제효소제 0.2g을 첨가하였고, 담금 발효는 13일 정도 진행하여 최종 발효가 멈추는 단계까지 발효를 진행하였다. 발효 기간이 경과한 후, 200 mesh 주대를 이용하여 술을 거른 후, 밀폐 용기에 담아 0℃에서 5일간 보관하여 침전물을 제거하였고, 1~2㎛ 종이필터 여과기로 정밀하게 여과하여 약주를 제조하였다. 제조된 약주의 기본 성분 분석과 기기 분석을 진행하였다. 약주 담금법은 하기 [표 1]에 정리하였다.

[표 1]

실시예 3. 약주의 발효 진행 속도 분석 및 일반성분 분석

3-1. 발효 진행 속도 분석

각 실험군별 발효 경과에 따른 에틸알코올 함량 분석을 수행하고, 분석 결과를 도 1에 정리하였다.

도 1을 참조하면, 각 실험군별 17일간 발효시킨 후 알코올 도수는 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 19.4%(v/v), 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주) 19.3%(v/v), 제조예 1(NIBRFGC000501771균주) 18.5%(v/v) 및 비교예 1(라빠리장) 16.9%(v/v)의 순으로 측정되었다.

효모의 종류를 달리한 3개 제조예와 비교예를 대상으로 밑술 발효 4일 및 담금 발효 13일의 기간별로 에틸알코올 생성 경과를 살펴보았다. 밑술 발효 구간에서는 모든 실험군에서 비교예인 라빠리장 사용군과 발효 속도가 유사한 것으로 분석되었다. 발효 1일째에는 NIBRFGC000503478 균주(7.4%(v/v)), 라빠리장(6.9%(v/v)), NIBRFGC000503472 균주(6.8%(v/v)), NIBRFGC000501771 균주(5.8%(v/v))의 순으로 발효 속도가 빠른 것으로 나타났다.

2일이 경과한 후에는 NIBRFGC000503478 균주, NIBRFGC000503472 균주 및 NIBRFGC000501771 균주의 순으로 각각 12.8%(v/v), 12.0%(v/v) 및 11.0%(v/v)의 알코올을 생성시키는 것으로 측정되었다.

밑술 발효 3일째 술덧의 알코올 도수는 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주) 16.2%(v/v), 제조예 1(NIBRFGC000501771 균주) 14.6%(v/v), 비교예 1(라빠리장) 14.3%(v/v), 및 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 13.9%(v/v)의 순으로 높게 측정되었다.

발효 4일째 1단을 담금 하였고, 술덧이 희석되어 알코올 도수는 3.0 ~ 3.7%(v/v) 수준으로 낮아졌다. 발효 6일째(담금 1일째) 알코올 도수를 비교해본 결과, 제조예 1(NIBRFGC000501771 균주)의 알코올 도수는 담금 초기 에틸알코올 발효 안정성이 높아 비교예 1(라빠리장)과 비교하여 2배 이상 높은 8.2%(v/v)로 측정되었고, 발효 7일째(담금 2일째)에는 12.3%(v/v)로 안정적인 에틸알코올 발효능을 보였다.

그러나, 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 및 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주)의 알코올 도수는 각각 4.3%(v/v) 및 4.0%(v/v)로 측정되어, 비교예 1(라빠리장)의 알코올 도수 5.3%(v/v)와 비교하여 낮은 수치로 측정되었다. 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 및 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주)은 담금 2일 차부터 급격한 거품발생과 함께 끓어 넘침 현상이 발생하였는데, 이는 초기 알코올 생성이 더딘 것과도 연결된다. 병행복발효 방식으로 담금 횟수를 증가시키는 방식을 적용하는 전통주의 발효공법에서 덧술 첨가에 따라 초기 발효가 저해되는 NIBRFGC000503472 및 NIBRFGC000503478 효모 균주는 최종 알코올 도수가 19.4%(v/v), 19.5%(v/v)로 높게 나왔음에도 불구하고 약주 발효에 적합하지 않은 효모로 분석되었다.

양조초기에는 발효가 빠르게 진행됨으로써 공정관리가 용이하여야 하는데, NIBRFGC000503472 및 NIBRFGC000503478 효모 균주와 같이 급격한 거품발생과 함께 끓어 넘침 현상이 발생하는 균주는 담금 초기 저조하게 발효가 진행되는 균주를 의미하고, 발효관리, 여과, 제품화 등의 공정 과정에서 적합하지 않은 균주에 해당한다.

한편, 본 발명의 NIBRFGC000501771 효모 균주로 발효한 약주는 최종 알코올 도수가 18.5%(v/v)로 높게 분석되었다. 드라이 타입의 약주 양조효모의 제조에서는 높은 알코올 생성능을 갖는 효모가 적합하며, 이를 이용하여 제조된 약주는 높은 수율로 생산될 수 있다. 즉, 드라이 타입의 약주 효모는 발효가 완료된 술덧의 최종 알코올 도수가 14.0%(v/v) 보다는 높아야 하며, 점진적으로 발효가 진행되면서 최대 20%(v/v)까지 발효되는 것이 드라이용 약주 제조에 적합한 효모이다.

발효 진행 속도와 술덧의 최종 알코올 함량으로 검토해 본 바, 드라이 타입의 약주 제조에 적합한 양조용 효모로는 NIBRFGC000501771 효모 균주가 적합한 것으로 분석되었다.

3-2. 일반 성분 분석

상기 발효가 끝난 제조예 및 비교예의 술덧에 대하여 일반성분을 분석하였고, 하기 [표 2]에 정리하였다.

[표 2]

산도(Acidity)와 아미노산도(Amino Acidity), 총산(Total acid) 함량은 모든 실험군에서 유사한 값이 검출되었다. 다만, 라빠리장으로 발효한 비교예 1의 시료는 총산 함량이 0.31g/100mL로 측정되어 다른 제조예에 비해 높게 나타났다. 또한, 불휘발분은 라빠리장으로 발효한 비교예 1의 시료가 6.2g/100㎖로 매우 높게 측정되었고, NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2의 시료가 3.3g/100㎖로 가장 낮게 측정되었다. 술덧에 있는 포도당 2%(v/v)는 효모에 의해 알코올 발효되어 약 1%(v/v)의 에틸알코올로 생성된다. 라빠리장 효모로 발효한 비교예 1의 시료는 알코올 도수가 가장 낮았던 실험군으로, 알코올 도수가 낮으면 발효되지 않은 당류가 술덧에 축적되어 불휘발분이 높아지는 상기 결과와 일치하였다. 반대로 알코올 도수가 가장 높았던 NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2의 시료에서 불휘발분이 가장 낮게 측정된 것도 상기 결과와 일치하였다.

3-3. 유리당 함량 분석

발효가 끝난 제조예 및 비교예의 술덧에 대하여 유리당 중 단당류와 이당류 함량을 분석하였고, 하기 [표 3]에 정리하였다.

[표 3]

유리당 함량은 모든 제조예와 비교예에서 과당, 자당, 맥아당, 유당은 검출되지 않았고, 포도당만 라빠리장으로 발효한 비교예 1의 시료에서 1.8%(w/v)로 높게 검출되었다. NIBRFGC000501771 균주로 발효한 제조예 1의 시료에서 0.3%(w/v), NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2의 시료에서 0.1%(w/v), NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3의 시료에서 0.1%(w/v) 순으로 낮게 검출되었다.

라빠리장으로 발효한 비교예 1의 시료는 알코올 도수가 가장 낮았던 실험군으로 알코올 도수가 낮으면 발효되지 않은 당류가 술덧에 축적되어 포도당 함량이 높아지는 상기 결과와 일치하였고, NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2와 NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3 시료는 당류가 적고 알코올 도수가 높아 드라이 약주 제조용으로 적합한 듯 보이지만, 담금 초기에 급격한 거품발생과 함께 끓어 넘침 현상이 발생하는 것은 제조관리가 어려워 실용성이 떨어지기 때문에 드라이 약주 제조용으로 부적합하다.

이에 반해 NIBRFGC000501771 균주로 발효한 제조예 1의 시료는 당류가 적고 알코올 도수가 높아 약주 제조용으로 적합한 것으로 분석된다.

실시예 4. 유기산 함량 분석

발효가 완료된 드라이 타입의 발효 술덧의 유기산 함량 분석 결과를 하기 [표 4]에 정리하였다.

[표 4]

효모의 종류별로 발효시킨 드라이 타입의 약주에 함유된 유기산은 사용한 효모의 종류에 따라 개별 유기산 함량에 차이가 있는 것으로 측정되었다.

구체적으로 아세트산(Acetic acid)은 NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2의 경우 469mg/L, NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3의 경우 383mg/L, NIBRFGC000501771 균주로 발효한 제조예 1의 경우 358mg/L, 그리고, 라빠리장으로 발효한 비교예 1의 경우 165mg/L로 측정되었고, 라빠리장으로 발효한 비교예 1이 가장 적은 양을 함유하는 것으로 측정되었다. 다만, 젖산(Lactic acid)은 라빠리장으로 발효한 비교예 1이 3,404mg/L로 측정되었고, NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2는 1,714mg/L, NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3은 1,694mg/L, NIBRFGC000501771 균주로 발효한 제조예 1은 929mg/L로 측정되었다.

NIBRFGC000501771 균주로 발효한 제조예 1의 경우, 젖산(Lactic acid), 아세트산(Acetic acid)의 낮은 수치를 통해 정상적인 알코올 발효가 진행되었음을 확인할 수 있었고, NIBRFGC000503472 균주로 발효한 제조예 2와 NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3의 경우, 담금 초기에 급격한 끓어오름 현상이 높은 수치의 젖산(Lactic acid) 및 아세트산(Acetic acid)의 생성에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 최 등의 연구(2005)에 따르면, 발효 도중에 생성된 알코올이 초산균(acetic acid bacteria)에 의해 아세트산(acetic acid)으로 전환되기도 한다. 즉, 젖산(Lactic acid) 및 아세트산(Acetic acid) 함량은 유산균, 초산균 및 다른 효모균의 오염 척도가 된다고 볼 수 있다. 유산균, 초산균 및 다른 효모균 등으로 술덧이 오염되면 이들이 생성한 부산물에 의해 최종 제품에 나쁜 향취가 이행되어 술의 품질이 저하되기도 한다.

한편, 라빠리장으로 발효된 비교예 1은 젖산 함량이 높아 이상발효 현상을 의심해 볼 수 있겠으나, 이상발효 시 함께 증가하는 아세트산 함량은 낮은 것으로 보아 이상발효 현상보다는 효모의 개별 특성으로 사료된다.

특히, 발효가 끝난 발효 원주의 에틸알코올(ethyl alcohol) 생성량이 높은 NIBRFGC000503472 균주로 발효된 제조예 2, 및 NIBRFGC000503478 균주로 발효한 제조예 3의 술덧에서 담금 초기에 급격한 끓어오름이 발생하는 현상이 관찰되었고, 발효 초기 알코올 생성이 낮은 현상이 관찰되었으며, 젖산(Lactic acid) 및 아세트산(Acetic acid)이 유의적으로 많이 검출된 결과를 통해, 상기 NIBRFGC000503472 및 NIBRFGC000503478 균주가 약주 제조에 바람직하지 못한 효모인 것으로 분석되었다.

또한, 시트르산(Citric acid), 숙신산(Succinic acid), 말산(Malic acid) 함량은 제조예 1(NIBRFGC000501771 균주)의 시료에서 가장 높은 수치로 검출되었다. 숙신산은 당류가 효모에 의해 발효될 때 부산물로 생성되는 산으로, 특유의 신맛, 감칠맛, 풍미를 제공하고, 시트르산의 경우 감귤류에 많이 함유되어 있으며, 말산의 경우 사과산이라고도 불리며 청량한 과일에 많이 포함되어 있어, 그 함량이 높을수록 관능적인 측면에서 좋은 평가를 받을 수 있다.

총산(Total acid) 함량은 비교예 1(라빠리장)의 실험군에서 6,606mg/L로 가장 높게 검출되었고, 다음으로 제조예 2(NIBRFGC000503472 균주) 및 제조예 3(NIBRFGC000503478 균주), 제조예 1(NIBRFGC000501771 균주)의 순으로 높게 검출되었다. 제조예 2 및 제조예 3의 총산 함량이 높은 것은 젖산(Lactic acid) 및 아세트산(Acetic acid) 함량이 높은 것에서 기인한 것으로 바람직한 효모라 할 수 없다.

실시예 5. 효모의 응집 테스트

효모는 발효 후반부에 효모들 사이에서 엉김 현상이 일어나 발효 탱크 하단부에 가라앉는 특성이 있다. 응집 테스트(Flocculation test)는 효모의 가라앉는 정도를 분석하는 것이다. 특히, 약주는 혼탁한 형태로 제품화하는 탁주와 달리 발효가 끝난 술덧을 맑고 투명하게 하여 제품화하는 것이 특징인 술이고, 약주 양조공정에서 맑고 투명하게 만드는 여과 공정이 가장 어려운 공정에 해당한다. 드라이 타입의 약주용 효모는 응집성이 높아야 발효가 끝난 후 효모가 빠르게 침강해 이후 공정인 여과 공정을 손쉽게 진행할 수 있다.

실시예 1-4의 응집 테스트 방법에 따라 실험하여 측정한 결과를 하기 [표 5]에 정리하였다.

[표 5]

[표 5]를 참조하면, NIBRFGC000503472 효모로 발효한 제조예 2 및 NIBRFGC000503478 효모로 발효한 제조예 3의 시료는 각각 41.75% 및 40.62%로 응집도가 높은 것으로 측정되어, 여과 공정만을 고려할 때 약주 제조용 효모로 유용하게 사용될 수 있는 것으로 볼 수 있는 여지가 있다. 다만, 전술한 발효 경과에 따른 에틸알코올 및 유기산 생성 프로파일을 참고하면 전반적으로 발효 과정에 문제가 있었고, 과도하게 응집성이 강한 특성은 발효 중 급격한 끓어 넘침 현상이 발생하는 원인 중 하나로 작용하는 것으로 볼 수도 있으므로, 드라이용 약주 효모로 부적합한 것으로 판정되었다. 따라서, NIBRFGC000503472 및 NIBRFGC000503478 효모를 제외하고, 응집성 및 침강성이 우수한 NIBRFGC000501771 효모가 드라이 타입의 약주 제조용 효모 후보로 선택되었다.

실시예 6. 향기성분 함량 분석

실시예 1-5의 향기성분 분석 방법에 따라 발효가 완료된 드라이 타입 약주의 발효 술덧에 함유된 주요 향기성분 분석 결과를 하기 [표 6]에 정리하였다.

[표 6]

효모의 종류별로 발효시킨 드라이 타입 약주의 주요 향기 성분의 총 함량은 제조예 1(NIBRFGC000501771 균주), 비교예 1(라빠리장)에서 각각 2,833.6mg/L, 2,414.0mg/L의 순으로 높게 측정되었다.

세부 성분별로 살펴보면, 과일향, 꽃향, 바나나향, 배향 등의 향기로 감지되는 methyl acetate, ethyl acetate 및 iso-buthyl acetete 성분의 함량 합계는 제조예 1(NIBRFGC000501771) 383.6mg/L, 비교예 1(라빠리장) 253.5mg/L, 제조예 3(NIBRFGC000503478) 207.7mg/L 및 제조예 2(NIBRFGC000503472) 201mg/L의 순으로 검출되었다.

멜론향, 풋사과향, 파인애플향 등으로 감지되는 ethyl octanoate 성분 함량은 제조예 1(NIBRFGC000501771) 3.7mg/L, 제조예 3(NIBRFGC000503478) 0.5mg/L, 및 제조예 2(NIBRFGC000503472) 0.4mg/L 순으로 높게 검출되었고, 비교예 1(라빠리장)은 1.3mg/L로 검출되었다.

또한, 장미향, 사과향, 꿀향 등으로 감지되는 ethyl phenyl acetate 성분 함량은 제조예 1(NIBRFGC000501771) 2.4mg/L, 제조예 3(NIBRFGC000503478) 2.0mg/L 순으로 높게 검출되었고, 비교예 1(라빠리장)은 2.2mg/L로 검출되었다.

그리고, 위스키, 브랜디, 사과향 등으로 감지되는 ethyl hexanoate 성분의 함량은 제조예 1(NIBRFGC000501771) 4.4mg/L, 제조예 3(NIBRFGC000503478) 1.8mg/L, 제조예 2(NIBRFGC000503472) 1.6 mg/L 순으로 높은 수치가 검출되었고, 비교예 1(라빠리장)은 1.7mg/L로 검출되었다.

발효 도중 효모로부터 아미노산 분해로 생성되는 퓨젤유(Fusel oil)에 해당하는 1-propanol, isobutanol, 1-butanol, isoamyl alcohol 성분의 검출량 합계는 제조예 1(2,340.4mg/L)과 비교예 1(2,067.0mg/L)에서 가장 높게 검출되었고, 제조예 2 및 제조예 3에서는 각각 1,554.9mg/L 및 1,540.3mg/L로 검출되었다.

지방산 성분이 효모 균체 내에서 에틸알코올 성분과 결합하여 주로 생성되는 지방산에스터는 사과향, 파인애플향, 꽃향, 왁스향 등으로 대별되며, 주요 성분인 ethyl octanoate 성분과 ethyl dodecanoate 성분의 함량 합계는 제조예 1(4.6mg/L) 및 비교예 1(2.3 mg/L)에서 높게 검출되었고, 제조예 2 및 제조예 3에서는 각각 1.7mg/L 및 1.1mg/L로 검출되었다.

상기 향기 성분 측정 결과를 종합하면, 제조예 2(NIBRFGC000503472)와 제조예 3(NIBRFGC000503478)은 급격한 거품발생 및 끓어 넘침 현상과 초기 발효 속도가 낮은 경향성을 보였는데, 이는 본 실험에서 향기 성분 함량이 낮은 수치로 검출된 것과 일맥상통하였고, 드라이 타입의 약주용으로 사용하기는 부적합한 것으로 평가되었다.

종합하면, 향기 성분 함량의 총합이 높게 검출된 시험군은 제조예 1(NIBRFGC000501771) 및 비교예 1(라빠리장)이었고, 세부적으로 에스터류와 퓨젤 오일, 지방산에스터 함량이 높은 실험군은 제조예 1(NIBRFGC000501771) 및 비교예 1(라빠리장)의 실험군이었다. 따라서, NIBRFGC000501771 균주로 제조된 드라이 타입의 약주는 관능 평가에서도 우수한 성적을 획득할 수 있을 것으로 예상되었다.

특히, 향기성분을 다량 함유한 NIBRFGC000501771 균주로 제조되는 약주는 장미향, 꿀향, 사과향으로 감지되는 ethyl phenyl acetate 성분, 바나나향으로 감지되는 iso butyl acetate 성분, 배향으로 감지되는 iso pentyl acetate 성분, 사과향으로 감지되는 ethyl hexanoate 성분, 그리고 멜론향, 풋사과향, 파인애플향으로 인지되는 ethyl octanoate 성분 함량이 동시에 높게 검출되는 것으로 확인되었다.

실시예 7. 관능 평가

효모별로 제조한 드라이 타입의 약주에 대한 관능 평가는 국세청주류면허지원센터의 관능평가 전문 패널(n=10)이 참여하여 외관, 맛, 향기, 감촉 항목에 대하여 묘사분석으로 평가하였다. 외관과 감촉 항목은 최저점 1에서 최고점 3점으로, 맛과, 향기 항목은 최저점 1에서 최고점 6점으로 하여 평가점수의 평균값을 하기 [표 7]에 정리하였다.

[표 7]

색상과 여과 정도 등 외관을 평가하는 항목에서, NIBRFGC000501771 균주로 제조한 약주가 높은 점수를 얻었다. 맑고 투명한 외관을 갖는 약주의 특성을 고려하면, 응집성이 뛰어나 빨리 침강되므로 여과를 쉽게 진행할 수 있는 특성을 갖는 효모가 좋은 효모이므로, 전술한 바와 같이 여과 정도가 뛰어난 NIBRFGC000501771 균주는 약주 드라이용 효모로 유리한 조건이라 할 수 있다. 향기와 맛이 모두 좋아 높은 관능평가 점수를 획득한 시료도 NIBRFGC000501771 균주로 제조한 실험군이다. 제조예 2(NIBRFGC000503472) 및 제조예 3(NIBRFGC000503478)의 시료는 모든 항목에서 나쁜 점수를 받았다. 이는 급격한 거품발생 및 끓어 넘침 현상에 따라 초기 발효 진행이 늦어져 충분하게 향기성분을 생산하지 못했기 때문으로 사료되며, 이들 균주는 드라이 약주 제조를 위한 양조용 효모로 사용되기 어려운 것으로 평가되었다.

라빠리장 효모를 사용한 비교예 1의 실험군은 2순위의 관능 평가점수를 획득하였으며, NIBRFGC000501771 균주로 제조한 제조예 1의 약주가 비교예에 비해 월등하게 높은 관능 평가점수를 획득함에 따라, NIBRFGC000501771 균주가 드라이 타입의 약주 제조를 위한 양조용 효모로 시판용 효모 균주보다 더 우수한 성능을 발휘할 수 있음을 확인하였다.

상기 실험 결과를 종합하면, 알코올 생산력, 당 함량 축적 정도, 발효의 안정성, 유기산 함량, 불휘발분 잔류량 등의 측면에서 NIBRFGC000501771 효모 균주가 드라이 타입의 약주 제조에 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 효모의 응집성(Flocculation)이 뛰어나 약주의 여과에 유리한 효모는 NIBRFGC000501771 효모 균주인 것으로 나타났다.

또한, 향기성분 분석 결과, NIBRFGC000501771 균주는 2833.6mg/L의 총 향기성분을 생산하는 것으로 측정되었다. 특히, NIBRFGC000501771 균주로 제조된 약주는 바나나향, 과일향, 꽃향으로 감지되는 iso butyl acetate 성분, 장미향, 사과향, 꿀향으로 감지되는 ethyl phenyl acetate 성분, 그리고 위스키, 브랜디, 사과향 등으로 감지되는 ethyl hexanoate 성분, 및 멜론향, 풋사과향, 파인애플향 등으로 감지되는 ethyl octanoate 성분 함량이 동시에 높게 검출되었다. 이외에도 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주로 제조된 약주는 감칠맛과 특유의 신맛을 제공하는 숙신산 및 시트르산 함량이 높았고, 말산 함량이 높은 것으로 분석되었으며, 이를 통해 NIBRFGC000501771 효모 균주가 드라이 타입의 약주 주조용 효모로 바람직하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 관능검사 결과에서도 NIBRFGC000501771 균주는 외관, 향, 맛, 감촉 등 모든 항목에서 가장 좋은 평가를 받았다.

상기 결과를 종합하면, NIBRFGC000501771 효모 균주가 드라이 타입의 약주 주조용 효모로 가장 적합한 균주로 평가된다.

실시예 8. NIBRFGC000501771 균주의 균학적 특성 분석

8-1. 배양 및 형태학적 특징

NIBRFGC000501771 균주가 평판배지에서 생장하는 양상을 YPD(Difco) 한천배지에 접종 후 25℃에서 7일간 정치배양 한 후 관찰하였다.

도 2를 참조하면, YPD 배지에서 배양된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000501771 균주의 콜로니 색깔은 흰색이며 가장자리는 부드러운 양상을 보였다.

8-2. 세포 형태

평판배지에서 자란 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000501771 균주의 세포 형태는 광학현미경 1,000배와 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy)으로 관찰하였다.

광학현미경으로 관찰한 결과, 구형 또는 난형의 모세포에서 딸세포가 출아하는 전형적인 효모 세포의 모습을 보였다(도 3 왼쪽 그림 참조).

주사전자현미경 하에서도 구형 또는 난형의 세포에서 딸세포가 출아하고, 딸세포가 떨어져 나간 스카가 관찰되었다(도 3 오른쪽 그림 참조). 또한, NIBRFGC000501771 균주에서는 분아해 나온 딸세포가 아닌 세포끼리도 연결되는 양상이 관찰되었다. 이는 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein) 중 어드헤신(adhesin) 등의 단백질들이 세포들의 응집을 촉진하는 것으로 생각된다. 이는 본 발명의 NIBRFGC000501771 균주가 응집력이 좋아 약주용 효모로 적합한 것과 일맥상통한다.

8-3. 생리적 특성

사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000501771 균주의 탄소원 이용 능력은 Biolog社의 YT MicroPlate를 이용한 표현형 마이크로어레이 테크놀로지(phenotype microarray technology) 기법으로 확인하였다. 96 웰 마이크로플레이트(96 well microplate)에 담긴 개별 탄소원을 이용하여 자랄 때, 세포 내 호흡의 결과로 무색의 테트라졸륨 바이올렛(tetrazolium violet) 시약이 보라색으로 바뀌는 양상 및 단일 탄소원에서 생장하는 양상을 측정하여 탄소원 이용 유무를 파악하였다.

실험 결과를 정리한 도 4를 참조하면, NIBRFGC000501771 균주는 산화시키는 기질로 Inulin, Maltose, D-Raffinose, Sucrose, Turanose, α-D-Glucose, D-Galactose를 이용할 수 있었다. D-Trehalose에 대한 산화력은 이용 가능한 다른 기질에 비해 낮은 것으로 조사되었다. 동화(Assimilation)에 이용할 수 있는 탄소원은 Inulin, Maltose, Maltotriose, D-Raffinose, Stachyose, Sucrose, Turanose, α-D-Glucose, D-Galactose, 및 D-Trehalose 성분이었다. D-Melezitose 성분은 다른 탄소원에 비해 이용도가 낮았으며, D-Trehalose 성분은 안정적으로 이용하지 못하는 것으로 나타났다. Maltitol과 D-Ribose, D-Xylose 성분은 이용도가 낮고 이용 안정성 또한 낮은 것으로 나타났다. D-xylose 성분과 혼합 이용도를 알아보는 조사 결과, [Succinic Acid Mono-Methyl Ester + D-Xylose]와 [N-Acetyl-L-Glutamic Acid + D-Xylose] 성분은 D-Xylose 성분 단독 이용 결과와 유사하게 이용도가 낮았고, 안정성이 낮은 양상을 보였으나, [D-Galactose + D-Xylose] 성분은 활발하게 이용하는 것으로 나타났다.

8-4. 유전적 특징

사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) NIBRFGC000501771 균주의 유전적 특징을 파악하고자, 6개의 하우스키핑(housekeeping) 유전자 서열을 이용하여 SGD (Saccharomyces Genome Database, https://www.yeastgenome.org/)의 얼터너티브 레퍼런스 스트레인(alternative reference strain)들과 비교하여 멀티 로코스 시퀀스 타이핑(multi locus sequence typing) 분석을 실시하였다.

구체적으로 NIBRFGC000501771 균주로부터 DNA를 추출하고, 잘 보존된 6종 마커 유전자를 증폭한 후 염기서열을 확보하였다. 6개 마커 유전자((ACC1, ADP1, GLN4, MET4, NUP116, RPN2)의 프라이머는 하기 [표 8]과 같다.

[표 8]

비교군으로는 효모 유전체 데이터베이스인 SGD(Saccharomyces Genome Database)에 등록된 얼터너티브 레퍼런스 스트레인(alternative reference strain)을 이용하였다. 분자계통수(Phylogenetic tree)는 Mega X 프로그램에서 설정된 기본값으로 네이버-조이닝(Neighbor-joining) 방법을 이용하여 작성하였다. 이때 유전적 거리는 타무라-네이(Tamura-Nei) 방법에 따라 계산하였다.

균주의 유연관계 분석 결과를 정리한 도 5를 참조하면, NIBRFGC000501771 균주는 미국의 캘리포니아의 와인통 부산물에서 분리된 BC187 균주 및 칠레 와인 생산 균주인 L1528 균주와 가장 가까운 유연관계를 형성하는 것으로 나타났다. 또한, 일본에서 분리된 사케 균주인 Kyokai7 균주와는 유전적으로 다소 거리가 있는 것으로 확인되었다.

상기와 같이 생리적, 유전적 특징 분석을 완료한 NIBRFGC000501771 균주는 2022년 2월 17일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 사카로마이세스 세레비지애 NIBRFGC000501771 균주로 기탁하여 수탁번호 KACC 83061BP를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

농업생명공학연구원

KACC83061

20220217

Claims

드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP).
제1항에 있어서,
상기 균주로 발효 완료된 술덧의 최종 에틸알코올 도수는 14.0%(v/v) 내지 20.0%(v/v)인 것을 특징으로 하는, 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 효모의 응집성이 높은 것을 특징으로 하는, 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 향기 성분을 고함량으로 생성시키는 것을 특징으로 하는, 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP).
제4항에 있어서,
상기 향기 성분은 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소-부틸 아세테이트(iso-buthyl acetete), 에틸 부틸레이트(ethyl butylate), 1-프로판올(1-propanol), 이소부탄올(isobutanol), 이소펜틸 아세테이트(isopentyl acetate), 1-부탄올(1-butanol), 이소아밀 알코올(iso-amyl alcohol), 에틸 헥사노에이트(Ethyl hexanoate), 1-헥사놀(1-hexanol), 에틸 옥타노에이트(ethyl octanoate), 푸르푸랄(furfural), 페닐 아세테이트(phenyl acetate), 에틸페닐 아세테이트(ethylphenyl acetate), 및 에틸 도데카노에이트(ethyl dodecanoate)인 것을 특징으로 하는, 드라이 타입의 약주 제조용 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP).
정제수에 입국 및 사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)을 접종하고 2일 내지 5일 동안 발효하여 밑술을 제조하는 단계; 및
상기 밑술에 팽화미, 정제효소제 및 정제수를 첨가하고 10일 내지 14일 동안 발효하여 담금하는 단계;를 포함하는,
드라이 타입의 약주 제조 방법.
사카로마이세스 세레비지애 신균주 NIBRFGC000501771(기탁번호 KACC 83061BP)로 발효하여 제조된 향기 성분이 강화된 드라이 타입의 약주.
제7항에 있어서,
상기 향기 성분은 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소-부틸 아세테이트(iso-buthyl acetete), 에틸 부틸레이트(ethyl butylate), 1-프로판올(1-propanol), 이소부탄올(isobutanol), 이소펜틸 아세테이트(isopentyl acetate), 1-부탄올(1-butanol), 이소아밀 알코올(iso-amyl alcohol), 에틸 헥사노에이트(Ethyl hexanoate), 1-헥사놀(1-hexanol), 에틸 옥타노에이트(ethyl octanoate), 푸르푸랄(furfural), 페닐 아세테이트(phenyl acetate), 에틸페닐 아세테이트(ethylphenyl acetate), 및 에틸 도데카노에이트(ethyl dodecanoate)인 것을 특징으로 하는, 드라이 타입의 약주.