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KR20230146035A - 스트렙토코커스 수이스를 억제하는 cath2 및 유도체 - Google Patents

스트렙토코커스 수이스를 억제하는 cath2 및 유도체 Download PDF

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KR20230146035A
KR20230146035A KR1020237030010A KR20237030010A KR20230146035A KR 20230146035 A KR20230146035 A KR 20230146035A KR 1020237030010 A KR1020237030010 A KR 1020237030010A KR 20237030010 A KR20237030010 A KR 20237030010A KR 20230146035 A KR20230146035 A KR 20230146035A
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KR
South Korea
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cath2
derivative
suis
subject
cmap4
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Pending
Application number
KR1020237030010A
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English (en)
Inventor
마이케 리에나 쉰스트라
롤랜드 마르텐 반 하르텐
헨드릭 피터 행스맨
알베르트 밴 디즈크
에드윈 조하네스 아드리아누스 벨드후이젠
Original Assignee
유니버시테이트 우트레크트 홀딩 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시테이트 우트레크트 홀딩 비.브이. filed Critical 유니버시테이트 우트레크트 홀딩 비.브이.
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Abstract

본 발명은 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는 S. suis를 억제하는 방법 및 대상체에게 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토코커스 수이스를 억제하는 CATH2 및 유도체
본 발명은 의학 및 수의학 분야에 관한 것으로, 특히, 감염질환에서 CATH2 유도체의 용도에 관한 것이다.
스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis, S. suis)는 그람 양성 조건 혐기성 세균(Gram-positive facultative anaerobe bacterium)으로 구형이며 혈액이 들어 있는 아가 플레이트(agar plates)에서 알파 용혈(hemolysis)을 포함한다[1, 2]. S. suis는 거의 모든 돼지에서 호흡기 미생물군의 공생균(commensal)으로 발견되나, 수막염(meningitis), 심내막염(endocarditis), 돌연사(sudden death)와 같은 침습성 감염을 일으킬 수도 있다[2]. 또한, S. suis는 새로운 인수공통전염병 인자(zoonotic agent)이며 인간에서 패혈증(sepsis) 및 수막염을 일으킬 수 있다[3]. 이것은 식균작용(phagocytosis)에 따른 제거를 방지하기 위해 큰 다당류 캡슐을 포함한다[4]. S. suis의 최대 35가지 다양한 혈청형(serotypes)이 지금까지 확인되었으며, 그 중 혈청형 2는 질병에 걸린 돼지에서 가장 흔하게 발견되고, 혈청형 9와 3이 그 뒤를 따른다. 인간의 경우 혈청형 2가 가장 흔하게 발견된다[5]. S. suis로 인한 질병을 치료하기 위해 다양한 항생제가 사용되었다. 그러나, 항생제 내성 S. suis 균주의 확산으로 새로운 치료제 개발이 시급하게 필요하다.
카텔리시딘(Cathelicidin)은 숙주 방어 펩티드(host defense peptides, HDP)이며 선천면역 체계(innate immune system)의 일부이다[8]. 이 펩티드는 조직 손상 또는 감염 시 미생물 노출 또는 호중구(neutrophil) 및 비만 세포(mast cell) 탈과립(degranulation)을 통해 수동적으로(괴사) 또는 능동적으로 방출되는 알려진 내인성 경고물(alarmin)이다[9]. 시험관 내에서 인간 카텔리시딘 LL-37 및 닭 CATH2에 대해 대식세포에 대한 강력한 면역 조절 효과가 보고되었다[10-13]. 카텔리시딘 유래 펩티드의 치료 가능성을 높이기 위해 전체 D-아미노산 유사체를 사용하여 낮은 면역원성을 유지하면서 프로테아제에 대한 높은 저항성을 얻을 수 있다[14]. 닭 배아에 DCATH2를 in ovo 주입하는 예방적 치료는 대장균증(colibacilossis)과 관련된 사망률과 질병률(morbidity)을 상당히 감소시켰다[15]. 또한, 제브라피시(zebrafish) 배아(embryo)의 난황(yolk)에 DCATH2를 주입한 후 치사량(lethal dose)의 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 정맥으로 감염시켰을 때 지연된 사망률이 관찰되었다[16].
다양한 항생제 및 항미생물 치료법이 알려져 있지만, S. suis를 포함하는 특정 감염성 질병의 개선된 치료 및 예방 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명의 목적은 CATH2 및 이의 유도체의 신규한 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 S. suis 및 S. suis 감염의 효과적인 억제, 치료 및/또는 예방을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 대상체에게 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서의 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 S. suis에 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 수이스를 억제하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 S. suis를 억제하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 스트렙토코커스 수이스를 억제하기 위한 약물의 제조에서의 CATH2 또는 이의 유도체의 용도를 제공한다.
일 실시형태에서, S. suis는 바람직하게는 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3, 바람직하게는 혈청형 2이다.
일 실시형태에서, 상기 대상체는 바람직하게는 포유동물 또는 조류 대상체, 바람직하게는 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소(bovine), 양을 포함하는 다른 반추 동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말이다.
상기 이를 필요로 하는 대상체는 바람직하게는 S. suis 감염으로 고통받는 상태이거나, 상기 감염으로 고통받는 상태인 대상체와 접촉하고 있는 대상체와 같은 S. suis 감염 위험이 있는 상태이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 대상체에서 선천적 면역 기억을 유도하거나 촉진하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 항균제를 가지고 하는 항균 치료 및/또는 항균제의 항균 활성을 개선 또는 강화하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, CATH2 유도체는 DCATH2, C-말단 및/또는 N-말단 절단형 CATH2 및 C-말단 또는 N-말단 절단 DCATH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 DCATH2, DCATH2(1-21), DCATH2(4-21), CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5 →W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→ Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21 (F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, CATH2 또는 유도체는 DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)이다.
발명의 상세한 내용
본 명세서에서, "포함하다" 및 그의 활용형은 비제한적인 의미로 단어 뒤에 오는 항목을 포함하지만 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는다는 의미로 사용된다. 또한, "구성되다"라는 용어는 본 명세서에서 정의된 화합물 또는 보조 화합물이 구체적으로 식별된 것 외의 추가 구성요소(들)를 포함할 수 있음을 의미하는 "본질적으로 구성되다"로 대체될 수 있으며, 상기 추가 구성요소(들)는 본 발명 고유의 특징을 변경하지 않는다.
"한" 및 "하나"는 여기에서 그것의 문법적 목적물의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 의미하는것으로 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소는"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
수치(대략 10, 약 10)와 관련하여 사용될 때 용어 "대략" 또는 "약"은 바람직하게는 그 값이 주어진 값의 10% 이상 또는 내지 10% 미만의 값일 수 있음을 의미한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 S. suis를 억제하는 것이다. 본 명세서에 기재된 "S. suis의 억제"는 S. suis의 성장을 방지하거나, 지연시키거나, 늦추거나, 방해하거나, 역전시키거나, 지체시키는 것을 의미한다. 특히, "S. suis를 억제하다"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 CATH2 또는 이의 유도체의 존재 하에 S. suis의 성장이 그의 부재 하에 S. suis의 성장보다 더 느리다는 것을 의미한다. 일 측면에서, S. suis의 성장은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CATH2 또는 이의 유도체의 존재 하에 느려진다. 또 다른 측면에서, S. suis 성장은 정지되고, 이는 본 병세서에 기술된 CATH2 또는 이의 유도체의 추가 또는 투여 후에 추가 성장이 관찰되지 않는다는 것을 의미한다. 또 다른 측면에서, S. suis의 성장은 역전되는데, 이는 본 명세서에 기술된 CATH2 또는 이의 유도체의 존재 하에서, 있었던 S. suis가 사멸된다는 것을 의미한다. S. suis 성장은 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같은 분석에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 CATH2 또는 이의 유도체의 존재 및 부재 하에 측정될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 기존 질병, 특히 S. suis 감염의 치료를 위한 것이다. 본 명세서에 기재된 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병 또는 질환 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 개시 지연 또는 진행 억제를 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발달한 후에 시행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료는 증상 없이 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상이 시작되기 전에 감염되기 쉬운 대상체에게 투여될 수 있다(예: 증상의 이력 및/또는 유전적 또는 기타 감수성 요인에 비추어). 예를 들어 재발을 예방하거나 지연시키기 위해 증상이 해결된 후에도 치료를 계속할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 질병, 특히 S. suis 감염의 예방을 위한 것이다. 본 명세서에 기재된 용어 "예방"은 질병 또는 상태의 개시 및/또는 질병의 임상 증상을 아직 경험하지 않은 대상체에서 질병 또는 상태의 임상 증상의 출현을 방지하거나 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 서열을 의미하며, 아미노산은 20개의 자연적으로 펩티드를 구성하는 아미노산 중 하나이고 아미노산 중 하나 또는 모두가 L -배열 또는 D-배열, 또는 이소류신 및 트레오닌이라면 D-알로 배위(키랄 중심 중 하나에서만 역위)일 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 선형일 수 있으며, 서열의 첫 번째 및 마지막 아미노산은 각각 유리 NH2- 또는 COOH-기를 갖거나 N-말단(아세틸화) 및/또는 C-말단(아미드화) 변형된다. 본 명세서에 정의된 아미노산 서열에서 아미노산은 단일 문자 기호 또는 세 문자 기호로 표시된다. 이들 단일 문자 기호 및 세 문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있고 다음의 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌이고, C(Cys)는 시스테인이고, D(Asp)는 아스파르트산이고, E(Glu)는 글루탐산이고, F(Phe)는 페닐알라닌이고, G(Gly)는 글리신이고, H(His)는 히스티딘이고, I(Ile)는 이소류신이고, K(Lys)는 라이신이고, L(Leu)는 류신이고, M(Met)는 메티오닌이고, N(Asn)은 아스파라긴이고, P(Pro)는 프롤린이고, Q(Gln)는 글루타민이고, R(Arg)은 아르기닌이고, S(Ser)는 세린이고, T(Thr)는 트레오닌이고, V(Val)는 발린이고, W(Trp)는 트립토판이고, Y(Tyr)는 티로신이다.
본 발명자들은 CATH2 및 이의 유도체를 S. suis의 강력한 억제제로 확인하였다. 본 명세서의 실시예에서 입증된 바와 같이, DCATH2 및 이의 말단 절단형은 세균 배지에서 4종의 상이한 S. suis 균주에 대해 강한 직접적 항균 활성을 갖고 혈청을 포함하는 더 많은 생리학적 세포 배양 배지에서 훨씬 더 강한 것으로 나타났다. 또한, D-CATH2 및 이의 유도체는 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM) 및 편향된 마우스 골수 수지상 세포(BMDC)의 세포에 대한 대식세포 유사 표현형의 효율성을 개선하는 것으로 나타났다. 상기 펩티드는 LTA에 직접 결합하여 LTA-유도 대식세포 활성화를 억제할 수 있었다. 또한, 펩티드는 S. suis를 소리 없이 죽이고 마우스 대식세포를 추가로 활성화할 수 없게 하여, 감염 시 과도한 면역 반응을 방지할 수 있다. S. suis 감염 24시간 및 7일 전 DCATH2 유도체 DCATH2(1-21)의 투여는 마우스에서 약간의 예방적 보호를 야기하고, 질병 중증도를 약간 감소시키고 처치된 마우스의 때 이른 사망을 줄인다.
첫번째 측면에서, 본 발명은 CATH2 또는 이의 유도체를 상기 S. suis에 투여하는 단계를 포함하는 스트렙토코커스 수이스(S. suis)를 억제하는 방법을 제공한다. 또한 S. suis를 억제하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 제공한다.
일 실시형태에서, S. suis는 샘플에서 억제되고, 본 발명의 방법 또는 용도는 상기 샘플에 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, S. suis는 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 세포에서 억제되며, 본 발명의 방법 또는 용도는 상기 세포에 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, S. suis는 이를 필요로 하는 대상체에서 억제된다. 따라서, 바람직한 실시형태에서 상기 방법 또는 용도는 CATH2 또는 이의 유도체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법 또는 용도는 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 따라서, 이를 필요로 하는 대상체에서 S. suis 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체가 또한 제공된다. 상기 대상체는 바람직하게는 포유동물 또는 조류 대상체이고, 보다 바람직하게는 상기 대상체는 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말이다. 이를 필요로 하는 대상체는 바람직하게는 S. suis 감염을 앓고 있거나 S. suis 감염으로 고통받을 위험이 있는 대상체이다. 감염 위험이 있는 대상체는 S. suis 감염 상태의 대상체와 접촉하는, 예를 들어, 동일한 공간, 토지, 마구간, 집 또는 농장에 사는, 바람직하게는 대상체와 접촉하는 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말이다.
일 실시형태에서, CATH2 또는 이의 유도체는 백신, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 또는 다른 치료 조성물에 포함된다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말에서 S. suis 감염의 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 백신, 면역원성 조성물, 약제학적 또는 치료 조성물을 제공한다. 본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 백신 또는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 하나 이상의 보조제를 포함하는 추가 구성요소를 포함할 수 있다.
S. suis는 돼지에서 수막염, 패혈증, 심내막염, 관절염, 폐렴 및 돌연사를 일으키는 중요한 원인균이며, 사람에서도 수막염을 일으킬 수 있으며 패혈증, 폐렴, 패혈성 관절염과 같은 관절염 및 심내막염을 유발할 수도 있다. 따라서, 일 실시형태에서, S. suis를 억제하기 위한 본 발명의 방법은 특히, 돼지에서 S. suis 감염과 관련되거나 그로부터 기인하는 수막염, 패혈증, 심내막염, 관절염, 폐렴 및/또는 돌연사를 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, S. suis를 억제하기 위한 본 발명의 방법은 특히, 사람에서 S. suis 감염과 관련되거나 그로 인한 수막염, 패혈증, 폐렴, 패혈성 관절염 같은 관절염 및/또는 심내막염을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다. 그러나, 가금류, 개, 고양이, 소 및 다른 반추동물 및 말로부터 S. suis의 분리도 보고되었다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 가금류, 개, 고양이 또는 말에서 S. suis 감염을 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다.
S. suis는 임의의 혈청형의 S. suis일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, S. suis는 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3이다. 특정 실시형태에서, S. suis는 S. suis 혈청형 2이다.
CATH2 또는 이의 유도체에 의한 S. suis의 억제는 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같은 검정법을 사용하여 측정될 수 있으며, CATH2 또는 유도체의 평균 살균 농도(mean bactericidal concentration, MBC)는 특히 S. suis에 대해 세균 성장 배지에서 측정된다. 따라서, 당업자는 본 명세서에 기술된 바와 같이 CATH2 유도체의 S. suis 억제 활성을 잘 측정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "CATH2" 및 "CMAP27"은 상호 교환적으로 사용된다. 카델리시딘 계열의 다른 구성원과 마찬가지로 CMAP27은 프리프로펩티드(154개 아미노산)로 암호화되며 단백질 분해 처리 후 강력한 광범위한 항균 활성을 나타내는 C-말단 펩티드가 방출된다. CMAP27 또는 CATH2라고 불리는 이 C-말단 펩티드의 27개 아미노산 서열은 RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "CATH2 유도체"는 일반적으로 CATH2 서열의 적어도 일부를 포함하고 CATH2의 적어도 하나의 항미생물 특성을 유지한다는 점에서 CATH2의 유도체인 펩티드를 의미하지만, 항미생물 특성이 반드시 동일한 정도일 필요는 없다. 특히, S. suis 세균에 대한 항균 활성이 유지된다.
본 명세서에 기재된 용어 "CATH2" 및 "CMAP27"은 상호 교환적으로 사용된다. 카텔리시딘 계열의 다른 구성원과 마찬가지로 CMAP27은 프리프로펩티드(154개 아미노산)로 암호화되며 단백질 분해 처리 후 강력한 광범위한 항균 활성을 나타내는 C-말단 펩티드가 방출된다. CMAP27 또는 CATH2라고 불리는 이 C-말단 펩타이드의 27개 아미노산 서열은 RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "CATH2 유도체"는 일반적으로 CATH2 서열의 적어도 일부를 포함하고 CATH2의 적어도 하나의 항미생물 특성을, 반드시 동일한 정도일 필요는 없지만 유지한다는 점에서 CATH2의 유도체인 펩티드를 의미한다. 특히, 그람(-)균에 대한 항균 활성이 유지된다.
일 바람직한 실시형태에서, CATH2 유도체는 C-말단 및/또는 N-말단 절단형 CATH2 유도체, D-아미노산 CATH2 유도체, C-말단 또는 N-말단 절단 D-아미노산 CATH2 유도체, 고리형 CATH2 유도체 및 인베르소 및 레트로인베르소 CATH2 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 유도체는 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CATH2 유도체는 C-말단 및/또는 N-말단 절단형 CATH2 유도체, D-아미노산 CATH2 유도체 및, C-말단 또는 N-말단 절단 DCATH2와 같은 C-말단 또는 N-말단 절단 D-아미노산 CATH2 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 바람직한 실시형태에서, CATH2 또는 DCATH2가 사용된다. DCATH2는 D-아미노산으로 구성된 전장 CATH2 펩티드이다.
"C-말단 절단 CATH2 유도체"는 CATH2의 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 결여된, 바람직하게는 최대 17개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 12개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 최대 6개의 아미노산이 결여된 절단된 펩티드를 의미한다. 바람직한 예는 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2010/093245에 기술되고, 특히, 상기 특허 명세서의 표 1에 CMAP26-NH2, CMAP26, CMAP26(P14→G), CMAP26(P14→L), CMAP1-21, CMAP1-15, CMAP1-15(F2→L), CMAP1-15(F5→L), CMAP1-15(F12→L), CMAP1-15(3xF→L), CMAP1-15(F2→W), CMAP1-15(F5→W), CMAP1-15(F12→W), CMAP1-15(F2→W; F5→W; F12→W), CMAP1-13, CMAP1-12, CMAP1-11 및 CMAP1-10로 나열된 펩티드이고, 이들의 아세틸화 및/또는 아미드화 유도체가 바람직하다. 여기에서 정의된 모든 아미노산 서열에서, 화살표 표기는 아미노산 치환을 나타낸다. 예를 들어, F2→L은 위치 2의 F가 L로 대체됨을 나타내고, F2, 5→W는 위치 2 및 5의 F가 W로 대체됨을 나타낸다. 보다 바람직하게는 CMAP1-21(F2→W), CMAP1-21(F5→W), CMAP1-21(F12→W), CMAP1-21(F2, 5→W), CMAP1-21(F5, 12→W), CMAP1-21(F2, 12→W), CMAP1-21(F2, 5, 12→W), CMAP1-21(F2→Y), CMAP1-21(F5→Y), CMAP1-21(F12→Y), CMAP1-21(F2, 5→Y), CMAP1-21(F5, 12→Y), CMAP1-21(F2, 12→Y), CMAP1-21(F2, 5, 12→Y), CMAP1-21(F2→W; F5→Y), CMAP1- 21(F2→Y; F5→W), CMAP1-21(F5→W; F12→Y), CMAP1-21(F5→Y; F12→W), CMAP1-21(F2→W; F12→Y), CMAP1-21(F2→Y; F12→W), CMAP1-21(F2→W; F5→Y; F12→Y), CMAP1-21(F2→Y; F5→W; F12→Y), 및 CMAP1-21(F2→Y; F12→Y; F12→W)이다. C-말단 절단된 CATH2 유도체의 바람직한 예는 본 명세서에 참고로 포함된 WO2015/170984에 또한 기재되어 있다. 상기 확인된 CMAP 단백질은 CATH2 펩티드로 표시될 수도 있다. 그러면 CMAP1-21은 CATH2(1-21)가 된다.
"N-말단 절단된 CATH2 유도체"는 CATH2의 N-말단 아미노산(아르기닌)에서 절단되어 CATH2의 N-말단에 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 최대 10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 7개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 최대 6개의 아미노산이 결여된 CATH2 유도체이다. 바람직하게는 CMAP1-21: CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y)의 N-말단 절단 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 유도체이다.
"D-아미노산 CATH2 유도체"는 D 배열인 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 CATH2 유도체(상기 정의된 C- 및 N-말단 절단된 CMAP27-유도체 포함)이다. 이러한 D-아미노산 CATH2 유도체의 특별한 범주는 D 아미노산으로만 구성된(즉, L 아미노산이 존재하지 않는) 펩티드이다. 이 특수 범주는 본 명세서에서 DCATH2로 정의된다. 또한, 하나 이상 또는 대안적으로 모든 D 아미노산을 포함하는 CATH2 자체도 이 정의에 포함된다. 바람직한 D-아미노산 CATH2 유도체는 DCATH2 및 하기 D-아미노산 CATH2 유도체(D-C로 표시되고 모든 아미노산이 D-형태임)이다:
D-C(1-26) RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH2
D-C(1-21) RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQ-NH2
D-C(4-21) RFLRKIRRFRPKVTITIQ-NH2
D-C(7-21) RKIRRFRPKVTITIQ-NH2
D-C(7-21)F/W RKIRR W RPKVTITIQ-NH2
D-C(7-21)F/Y RKIRR Y RPKVTITIQ-NH2
D-C(10-21)F/W RR W RPKVTITIQ-NH2
D-C(1-15) RFGRFLRKIRRFRPK-OH.
DCATH2 및 DCATH2 유도체 DCATH2(1-21)(DC(1-21)이라고도 함) 및 DCATH2(4-21)(DC(4-21)이라고도 함)이 특히 바람직하다.
"고리형 CATH2-유도체"는 적어도 2개의 인접하지 않은 아미노산이 연결되어 고리 구조를 형성하는 CATH2 유도체이다. 원칙적으로 임의의 상술된 CATH2 유도체에서 2개의 인접하지 않은 아미노산을 시스테인으로 대체하는 것과 같이 임의의 화학적 결합 구성이 사용될 수 있지만(이들 시스테인은 S-S 가교를 형성함), 바람직한 결합 시스템은 Bpg(Fmoc-L-비스호모프로파길글리신) 및 아지도-수지 사이의 결합을 사용한다(Bpg는 내부 아르기닌, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판 잔기에 부착되고, 상기 아지도-수지는 C-말단 글루탐산 잔기에 부착됨). 특히, 이러한 고리형 유도체는 다음과 같다:
cycCMAP(1-21)[Lys8] RFGRFLR(Bpg)IRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Arg7] RFGRFL(Bpg)KIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6] RFGRF(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe2/Trp RWGRF(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe2,5/Trp RWGRW(Bpg)RKIRRFRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe2,5,12/Trp RWGRW(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe5,12/Trp RFGRW(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지)
cycCMAP(1-21)[Leu6],Phe12/Trp RFGRF(Bpg)RKIRRWRPKVTITIQ(아지도-수지)
"인베르소(Inverso)" 및 "레트로인베르소(Retroinverso)" CATH2 유도체("I"-CATH2 및 "RI"-CATH2 유도체)는 아미노산이 서로 역순으로 연결되어 있다는 점에서 상기 언급된 CATH2 유도체에 대하여 역서열을 갖는 펩티드이다. 역 CATH2 유도체가 하나 이상의 D 아미노산을 포함하는 경우 "레트로인베르소" 또는 "RI"라고 한다. 역 유도체가 L-아미노산만 포함하는 경우 "인베르소" 또는 "I"라고 한다. 그러면 CATH2의 I 및 RI 등가물은 GFRASGQITITVKPRFRRIKRLFRGFR이 되고 이러한 I 또는 RI-CMAP27-유도체의 다른 바람직한 예는 다음과 같다:
RI-C(1-21) QITITVKPRFRRIKRLFRGFR
RI-C(4-21) QITITVKPRFRRIKRLFR
RI-C(7-21) QITITVKPRFRRIKR
RI-C(7-21)F/W QITITVKPRWRRIKR
RI-C(7-21)F/Y QITITVKPRYRRIKR
RI-C(10-21)F/W QITITVKPRWRR.
I 및 RI-CMAP27 유도체는 N-말단에서 아세틸화 및/또는 C-말단에서 아미드화될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 사용되는 CATH2 또는 이의 유도체는 CATH2, DCATH2, DCATH2(1-21), DCATH2(4-21), CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12 →W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y), 보다 바람직하게는 CATH2 또는 유도체는 CATH2, DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 사용되는 CATH2 또는 이의 유도체는 DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)이다.
본 명세서에 기재된 용어 "대상체"는 인간 그리고 젖소, 육우, 버팔로를 포함하는 그 외 소 종류, 양, 염소, 알파카, 말, 노새, 당나귀, 낙타, 라마, 돼지, 돼지류, 물고기, 설치류, 가금류, 개, 고양이, 친칠라, 페렛, 새, 햄스터, 토끼, 생쥐, 저빌(gerbil), 쥐 및 기니피그와 같은 가축 및 농장 동물를 포함하는 동물을 아우른다. 일 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 농장동물, 가축 또는 애완동물과 같은 포유동물이다. 일 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간, 돼지, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 가금류, 양, 말, 개 또는 고양이이다. 일 실시형태에서, 상기 대상체는 조류 대상체, 바람직하게는 가금류이다. 가금류라는 용어는 닭, 오리, 거위, 꿩 및 칠면조를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 가금류는 닭 또는 칠면조, 보다 바람직하게는 닭이다. 바람직한 대상체는 돼지, 소, 가금류, 양, 말, 개 및 고양이이다.
일 실시형태에서, "(치료가) 필요한 대상체"는 S. suis 감염의 치료 또는 예방이 필요한 대상체이다. 그러한 대상체의 예는 S. suis 감염을 앓고 있거나 S. suis 감염을 앓을 위험이 있는 대상체이다. 일 실시형태에서, S. suis 감염을 앓을 위험이 있는 대상체는 상기 감염을 앓는 대상체와 접촉하는 대상체, 예를 들어 한 집단의 하나 이상의 대상체가 S. suis 감염이 확립된 집단의 대상체이다. 따라서, 가금류, 소, 돼지, 염소, 양 및 말을 사육하는 농장에서와 같이 동물이 함께 사육되는 농장 또는 마구간에서 CATH2 또는 이의 유도체를 적용하는 것이 특히 유용하다. 이러한 환경에서 발생하는 감염병은 시설 전체에 빠르게 퍼질 수 있다. 일 실시형태에서, CATH2 또는 유도체의 투여를 필요로 하는 대상체는 감염성 질환을 앓고 있거나 S. suis 감염, 바람직하게는 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3, 보다 바람직하게는 S. suis 혈청형 2 감염를 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 상태이다. 일 실시형태에서, S. suis 감염으로 고통받을 위험이 있는 대상체, 바람직하게는 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말은 S. suis 감염을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 동일한 종의 대상체와 접촉하는 대상체이다. S. suis 감염으로 고통받을 위험이 있는 대상체, 예를 들어 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말은, 예컨대 같은 공간, 땅, 마구간, 집, 개집 또는 농장에 있기 때문에 S. suis 감염을 앓고 있는 대상체와 접촉하는 대상체이다. 예를 들어, 개집, 농장 또는 축사에서 S. suis 감염이 일단 발생하면, 감염되지 않은 대상체를 본 발명에 따른 CATH2 또는 이의 유도체로 치료하는 것이 유익하다. 일 실시형태에서, S. suis 감염 대상체 및 S. suis 감염 대상체와 접촉했기 때문에 S. suis 감염의 위험이 있는 대상체 모두는 본 발명에 따라 치료된다. 따라서, 일 구현예에서 CATH2 또는 이의 유도체는 S. suis 감염이 집단의 하나 이상의 대상체에서 발생된 대상체 집단의 대상체, 바람직하게는 상기 집단 내의 대상체의 대다수 또는 전부에 투여된다. 상기 S. suis는 바람직하게는 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3, 보다 바람직하게는 S. suis 혈청형 2이다. 상기 대상체는 바람직하게는 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말이며, 상기 대상체의 집단은 바람직하게는 동일한 종의 집단, 예를 들어 젖소와 육우를 포함한 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말이다. CATH2 및 유도체가 S. suis를 억제하므로, S. suis 감염으로 이미 고통받는 대상체 및 이로부터 감염 위험이 있는 대상체 모두를 효과적이고 동시에 치료하는 것이 유리함을 확인하였다.
S. suis는 새로운 인수공통전염병 인자이며 인간에서 패혈증 및 수막염을 일으킬 수 있다. 따라서, 일 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간, 보다 바람직하게는 S. suis 감염, 바람직하게는 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3, 보다 바람직하게는 S. suis 혈청형 2에 감염되거나 S. suis 감염의 위험에 놓인 인간이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 CATH2 및 유도체가 훈련된 면역 또는 선천적 면역 기억, 특히 감염성 질환에 대한 선천적 면역 기억을 유도 및/또는 자극할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 따라서, 이를 사용하여 항균 요법을 개선하여 치료 결과 및/또는 치료 효율성을 향상시키는 것이 가능해졌다. 특히, 상기 개선은 본 명세서의 다른 부분에서 보다 상세히 기술된 바와 같이 CATH2 또는 유도체의 투여시기, CATH2 또는 유도체의 투여량, CATH2 또는 유도체의 제형 및/또는 투여 경로, 다른 활성 또는 비-활성 화합물과 조합과 같은 치료 효율성에서의 개선이다. 특히, CATH2 및 유도체가 선천적 면역 기억을 자극한다는 사실이 알려짐에 따라 아쥬번트와 같은 적절한 보조제 및/또는 다른 활성 또는 비활성 성분과의 조합 및 투여 용량 및, 선천적 면역 기억의 유도나 촉진을 지원하는 계획을 포함하는 적절한 제제화를 선택하는 것이 가능해졌다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 대상체에서 선천적 면역 기억을 유도하거나 촉진하는 것을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 방법 또는 용도는 항균제로 항균 치료를 개선 또는 강화 및/또는 항균제의 항균 활성을 개선 또는 강화하는 것을 포함한다. 상기 치료는 특히 본 명세서에 정의된 S. suis 감염의 치료 또는 예방이다. 항균제는 특히 CATH2 또는 이의 유도체이다.
용어 "선천적 면역 기억" 및 "훈련된 면역"은 상호교환적으로 사용되며 외인성 또는 내인성 손상 후 기능적으로 재프로그래밍하고 비활성 상태로 돌아온 후 후속 공격에 비특이적으로 반응하는 선천 면역 세포의 능력을 지칭한다. 훈련된 면역은 타고난 면역 세포의 유전자 발현 및 세포 생리학의 변화로 이어지는 후생적 변형에 의해 조율된다. 선천적 면역 기억은 선천적 면역 세포의 면역 항상성, 프라이밍, 훈련 및 내성의 섬세한 균형을 조절하는 강력한 도구를 제공한다. 훈련된 면역으로 입증된 장기 적응은 항균제로 직접 치료하는 것과 비교하여 전염병을 포함한 다양한 면역 관련 질병에서 더 강력한 반응으로 장기적인 치료 이점을 달성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, CATH2 또는 이의 유도체는 선천적 면역 기억을 유도하거나 촉진할 수 있는 또 다른 작용제 또는 선천적 면역에 특이적인 보조제와 추가로 유리하게 조합된다. 이러한 작용제/보조제의 예는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 리간드, β-글루칸, 무라밀디펩티드(muramyl dipeptide, MDP) 또는 MDP를 포함하는 펩티드, 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG), 올리고데옥시뉴클레오티드 함유 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 포함한다. TLR 리간드는 당업자에게 공지되어 있고 지단백질(TLR2, TLR1, TLR6), 플라젤린(TLR5), 이중가닥 RNA(TLR3), 단일가닥 RNA(TLR7) 및 세균 및 바이러스(CpG) DNA(TLR9)의 트리아실 및 디아실 부분을 포함한다. MDP는 N-아세틸 뮤라민산과 L-알라닌 D-이소글루타민 디펩티드의 짧은 아미노산 사슬을 포함하는 합성 펩티드 접합체이다. β-글루칸은 효모, 세균 및 진균의 세포벽에서 발견되는 자연 발생 다당류이다. 바실 칼메트-구에린(BCG)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, TB)에 대한 백신이다. CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 일반적으로 바이러스/미생물 DNA에 존재하며 상술된 바와 같이 TLR9에 대한 리간드이다.
상술한 바와 같이, 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 대상체는 닭과 같은 가금류이다. 본 발명의 방법에 따른 CATH2 또는 유도체의 투여는 가금류 배아에 대한 종란내 투여(in ovo administration) 또는 부화 후 어린 가금류의 투여에 의해 이루어질 수 있다. 후자의 경우 투여는 부화 후 1주일 이내가 바람직하고, 부화 후 3일 이내가 보다 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "종란내 투여"는 조류 종의 알, 바람직하게는 인큐베이션 4/4 분기의 알에 대한 투여를 의미한다. 즉. 계란의 경우, 바람직하게는 인큐베이션 약 15 내지 19일 정도, 보다 바람직하게는 인큐베이션 약 18일 정도에 투여한다. 칠면조 알의 경우, 바람직하게는 인큐베이션 약 21일 내지 26일 정도, 보다 바람직하게는 인큐베이션 약 25일 정도에 투여한다. 이러한 투여는 하나 이상의 CATH2 또는 유도체를 난각을 통해 알에 도입시키는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 주사이다. 주사는 약 18 내지 22게이지의 바늘이 장착된 종래의 피하 주사기 또는 미국 특허 4,681,063, 4,040,388, 4,469,047 및 4,593,646에 기술된 바와 같은 고속 자동 계란 주사 시스템과 같은 잘 알려진 계란 주사 장치 중 임의의 것을 사용하여 수행할 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 CATH2 유도체를 2회 투여받는다. 2회 투여는 2일 이상의 간격을 두고 수행하는 것이 바람직하다. 대상체가 가금류인 경우, 일 실시형태에서, 투여 중 하나는 종란내 투여이고 투여 중 하나는 부화 후, 바람직하게는 부화 후 1주 이내, 보다 바람직하게는 부화 후 3일 이내 투여이다. 대상체가 포유동물, 예를 들어 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 개, 고양이 또는 말인 경우, 2차 투여는 예를 들어, 첫 투여 후 2일에서 20일 사이 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수의학적으로 허용되가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 허용가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅, 보조제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함할 수 있다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 유당 등을 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민을 포함한다.
본 방법에 사용하기에 적합한 보조제(adjuvant)는 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄; 라이소레시틴과 같은 표면 활성 물질; 글리코시드, 예를 들어 Quil A 또는 GPI-0100(미국 특허 번호 5,977,081)과 같은 사포닌 유도체; DDA, 플루로닉 폴리올과 같은 양이온성 계면활성제; 다가음이온; 비이온성 블록 중합체, 예를 들어 Pluronic F-127(B.A.S.F., USA); 펩티드; 미네랄 오일, 예를 들어 Montanide ISA-50(Seppic, Paris, France), 카르보폴(carbopol), 암피젠(Amphigen)(Hydronics, Omaha, Nebr. USA), BayolF/Arlacel A와 같은 광유와 물의 에멀젼과 같은 알하이드로겔(Alhydrogel)(Superfos Biosector, Frederikssund, 덴마크) 오일 에멀젼, 또는 식물성 오일, 물과 레시틴과 같은 유화제의 에멀젼; 명반, 콜레스테롤, rmLT, 사이토카인 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 면역원성 성분은 또한 리포솜에 혼입되거나 백신 제제에 사용하기 위해 다당류 및/또는 다른 중합체에 접합될 수 있다. 본 방법에서 사용하기 위한 제품에 포함될 수 있는 추가 물질은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 이나트륨 또는 사나트륨 염, 메르티올레이트 등과 같은 하나 이상의 보존제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원에 대한 면역 체계의 반응을 강화하는 면역자극제도 제품에 포함될 수 있다. 적합한 면역자극제의 예는 IL-12 또는 IL-2와 같은 사이토카인, 또는 무라밀디펩티드, 아미노퀴놀론, 지질다당류 등과 같은 자극 분자를 포함한다.
본 발명자들이 본 명세서에 기재된 바와 같은 CATH2 유도체가 훈련된 면역을 유도한다는 것을 확인했으므로, 선천성 면역 세포를 위한 보조제와 상기 유도체를 조합하는 것이 특히 유리하다. 따라서, 일 바람직한 실시형태에서, 상기 보조제는 선천성 면역 세포, 즉 호염기구, 수지상 세포, 호산구, 랑게르한스 세포, 비만 세포, 단핵구 및 대식세포, 호중구 및/또는 NK 세포에 대한 보조제이며, 이는 본 명세서에서 상술된 바와 같다: TLR 리간드, β-글루칸, 무라밀 디펩티드(MDP) 또는 MDP를 포함하는 펩티드, 바실레 칼메트-구에린(BCG) 및 CpG 함유 올리고디옥시뉴클레오티드.
일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액과 같은 완충 용액, 또는 콜레스테롤을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체를 포함하는 조성물은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액과 같은 완충 용액 및 콜레스테롤을 포함한다. 예를 들어, 콜레스테롤은 먼저 에탄올에 가용화되고 PBS와 혼합된 다음 바람직하게는 용해된 형태로 CATH2 또는 유도체와 혼합되어 미립자 조성물을 생성한다. 일 실시형태에서, 투여 전에 용해된 CATH2 또는 유도체를 콜레스테롤 용액과 혼합하여 미립자를 형성한 후 투여한다.
본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 본 명세서에 정의된 유효량의 CATH2 또는 유도체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 용어 "유효량"은 본 명세서에 정의된 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체에서 선천적 면역 기억을 유도 또는 촉진하기에 충분하게 투여되는 CATH2 또는 유도체의 양을 의미한다.
일 실시형태에서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 용어 "치료적 유효량"은 치료되는 질병 또는 상태, 특히 S. suis 감염의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기에 충분한 CATH2 또는 유도체의 투여량을 의미한다. 이는 증상의 감소 또는 완화, 질병 또는 상태의 원인의 감소 또는 완화 또는 임의의 다른 원하는 치료 효과일 수 있다. 특히, 치료학적 유효량은 S. suis를 억제하기에 충분한 CATH2 또는 유도체의 투여량을 말하며, S. suis의 억제는 상술된 바와 같다.
일 실시형태에서, 상기 조성물은 예방적 유효량의 CATH2 또는 이의 유도체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 용어 "예방적 유효량"은 대상체에서 질환 또는 상태의 개시, 및/또는 질병, 특히 S. suis 감염의 임상 증상을 아직 경험하지 않은 경우 질환 또는 상태의 임상 증상의 출현을 배제하거나 지연시키기에 충분한 CATH2 또는 유도체의 투여량을 의미한다. 특히 예방적 유효량은 S. suis 감염을 예방하기에 충분한 CATH2 또는 유도체의 투여량을 의미한다.
약제학적 조성물은 또한 본 명세서에 정의된 CATH2 및 하나 이상의 유도체를 포함할 수 있거나, DCATH2 및 D(1-21)의 조합과 같은 본 명세서에 정의된 둘 이상의 CATH2 유도체를 포함할 수 있다. 이런 경우, "유효량", " 치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"은 2개 이상의 CATH2 및/또는 하나 이상의 이의 유도체의 조합된 양을 말한다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용하기 위해 필요한 CATH2 또는 유도체의 유효량 또는 투여량은 예를 들어 동물 모델을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유효 투여량은 CATH2 또는 이의 유도체가 투여되는 대상체에서 약 0.01㎍/kg 내지 50mg/kg, 바람직하게는 0.5㎍/kg 내지 약 10mg/kg일 수 있다. 종란내 적용의 경우 동일한 용량이 사용될 수 있지만 배아의 무게에 대해 다시 계산된다.
본 발명의 임의의 방법 또는 용도에 따라 사용되는 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 상용성이고 그것의 수용자에게 유해하지 않은, 예를 들어 독성이 없음을 의미한다. 일반적으로 활성 화합물의 기능을 방해하지 않는 임의의 약제학적으로 적합한 첨가제가 사용될 수 있다. 부형제의 적합한 예는 담체 또는 희석제이다. 약제학적 조성물은 캡슐, 정제, 로젠지(lozenge), 당의정(dragee), 환(pill), 액적(droplet), 좌약(suppository), 분말, 스프레이, 백신, 연고, 페이스트, 크림, 흡입제, 패치, 에어로졸 등의 형태일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로서, 특정 투여 형태에 가장 적합하고, CATH2 또는 유도체와 호환되는 제형인 임의의 용매, 희석제 또는 기타 액체 부형제(vehicle), 분산제(dispersion) 또는 현탁 보조제(suspension aid), 표면 활성제(surface active agent), 등장화제(isotonic agent), 증점제(thickening) 또는 유화제(emulsifying agent), 보존제(preservative), 캡슐화제(encapsulating agent), 고체 결합제(solid binder) 또는 윤활제(lubricant)를 사용할 수 있다.
CATH2 또는 유도체의 염도 사용할 수 있다. 일 바람직한 실시형태에서, 약제학적으로 허용가능한 염이 사용된다. 펩티드의 염은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 전형적으로 펩티드를 약제학적으로 허용가능한 산과 혼합하여 산 부가염을 형성하거나 약제학적으로 허용가능한 염기와 혼합하여 염기 부가염을 형성하는 것을 포함한다. 산 또는 염기가 약제학적으로 허용가능한지 여부는 펩티드의 특정 용도를 고려한 후 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 젖산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 시나믹산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 질산, 과염소산, 인산 및 티오시안산과 같은 유기산 및 무기산을 포함하고, 이는 펩티드의 자유 아미노기 및 기능적 등가물과 함께 암모늄 염을 형성한다. 펩티드의 자유 카르복실기및 기능적 등가물과 카르복실레이트 염을 형성하는 약제학적으로 허용가능한 염기는 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민, 및 기타 모노-, 디- 및 트리알킬아민 뿐만 아니라 아릴아민을 포함한다.
경구 투여를 위해, 미세결정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 구연산나트륨(sodium citrate), 탄산칼슘(calcium carbonate), 인산이칼슘(dicalcium phosphate) 및 글리신(glycine)과 같은 다양한 부형제를 함유하는 정제를 폴리비닐피롤리돈, 자당(sucrose), 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립 결합제와 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 알긴산 및 특정 복합 규산염과 같은 다양한 붕해제와 함께 사용할 수 있다. 또한, 스테아르산 마그네슘, 라우릴 황산 나트륨 및 탈크와 같은 윤활제는 종종 정제 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 젤라틴 캡슐의 충전제로 사용될 수도 있다. 이와 관련하여 바람직한 물질은 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여에 필요한 경우, 활성 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색제 또는 염료, 그리고 원한다면 유화제 및/또는 현탁제 뿐만 아니라 물, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 및 이들의 다양한 유사한 조합의 희석제와 함께 배합될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 오일 또는 수성 프로필렌글리콜 중의 CATH2 또는 유도체 용액이 사용될 수 있다. 수용액은 적절하게 완충될 수 있고 액체 희석제는 등장성이 될 수 있다. 이러한 수용액은 정맥 주사 목적에 적합하다. 유성 용액은 관절 내, 근육 내 및 피하 주사 목적에 적합하다. 멸균 조건 하에서 이러한 모든 용액의 제조는 당업자에게 공지된 표준 약학 기술에 의해 쉽게 달성된다.
또한, CATH2 또는 유도체를 국소적으로 투여하는 것도 가능하며 이는 표준 약제학 관행에 따라 크림, 젤리, 젤, 페이스트, 패치, 연고 등을 통해 수행될 수 있다.
일단 제형화되면, 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 방법 또는 용도로 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 조성물의 직접 전달은 일반적으로 경구, 비경구(parenterally), 피하(subcutaneously), 설하(sublingually), 복강내(intraperitoneally), 정맥내(intravenously) 또는 근육내(intramuscularly), 폐(pulmonary)를 포함하는 투여 형태에 의해 달성된다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여로 수행될 수 있다.
경점막(transmucosal) 투여 형태로 CATH2 또는 유도체를 투여하는 것이 또한 유리할 수 있다. 이 투여 경로는 비침습적이어서 치료받는 대상에게 덜 번거롭고, 특히 화합물이 소화 시스템의 유체에서 안정하지 않은 경우, 또는 장에서 효과적으로 흡수되기에 너무 큰 경우, 경구 투여에 비해 개선된 생체이용률을 유도할 수 있다. 경점막 투여는 예를 들어 비강, 협측(buccal), 설하, 치은(gingival) 또는 질(vaginal) 투여 형태를 통해 가능하다. 이들 제형은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 그들은 점비제(nasal drops) 또는 스프레이, 삽입물, 필름, 패치, 젤, 연고 또는 정제로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 경점막 투여 형태에 사용되는 부형제는 점막부착을 제공하는 하나 이상의 물질을 포함하여 흡수 부위와 투여 형태의 접촉 시간을 연장하여 잠재적으로 흡수 정도를 증가시킨다.
일 실시형태에서, CATH2 또는 유도체는 정량 흡입기, 네불라이저, 에어로졸 스프레이 또는 건조 분말 흡입기를 사용하여 폐 경로를 통해 투여된다. 공지된 방법 및 기술에 의해 적절한 제제를 제조할 수 있다. 경우에 따라 경피, 직장 또는 안구 투여가 가능할 수도 있다.
본 발명에 따라 투여되는 약제학적 조성물은 통상적인 항생제(예를 들어, 반코마이신, 스트렙토마이신, 테트라시클린, 페니실린) 또는 항진균제, 이트라코나졸 또는 미코나졸과 같은 다른 항미생물 화합물과 같은 다른 활성제를 함유할 수 있다. 또한 열(예: 살리실산) 또는 피부 발진과 같은 다른 감염 증상을 완화하는 화합물을 추가할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체는 합성하여 또는 적용 가능한 경우 통상적인 방법에 의해 재조합으로 생성될 수 있다. 이와 관련한 적합한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참고로 통합된 문헌(van Dijk, A., et al., Identification of chicken cathelicidin-2 core elements involved in antibacterial and immunomodulatory activities (Mol Immunol, 2009. 46(13): p. 2465-73, 참조 [6]) 및 van Dijk, A., et al., Immunomodulatory and Anti-Inflammatory Activities of Chicken Cathelicidin-2 Derived Peptides (PLoS One, 2016. 11(2): p. e0147919, 참조 [7]))에 기술되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CATH2 또는 유도체는 예를 들어 Merrifield(J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154)에 의해 개시된 것과 같은 공지된 화학 합성 기술에 의해 통상적으로 제조된다. 이들은 역상 HPLC와 같은 크로마토그래피 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다.
또는, 본 발명에 따라 사용되는 CATH2 또는 유도체는 상술된 펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 DNA 단편을 숙주 미생물 또는 세포 내에서 클로닝 및 발현함으로써 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 핵산 코딩 서열은 합성d으로 제조될 수 있거나, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 기존의 핵산 서열(예를 들어, 야생형 CATH2를 코딩하는 서열)로부터 유도될 수 있다. 이어서, 이들 핵산 서열은 적합한 발현 벡터에서 클로닝되고 적합한 숙주 세포, 예를 들어 대장균, 바실러스, 락토바실러스, 스트렙토마이세스, 포유동물 세포(예를 들어 CHO, HEK 또는 COS-1 세포), 효모(예: Saccharomyces, Schizophyllum), 곤충 세포 또는 바쿨로바이러스 시스템과 같은 바이러스 발현 시스템 또는 식물 세포로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 당업자는 핵산 서열을 구성하고 그들의 발현을 가능하게 하는 수단을 제공하는 기술에 대한 지식을 가질 것이다. 이어서, CATH2 또는 유도체는 숙주 세포의 배양물로부터 분리될 수 있다. 이것은 당업계에서 이용 가능한 일반적인 단백질 정제 및 단리 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 면역 흡착 또는 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 합성 중에 태그(예: 히스티딘 태그)를 펩티드에 제공하는 것도 가능하며, 이는 빠른 결합 및 정제를 가능하게 하고, 그 이후에 태그를 효소적으로 제거하여 활성 펩티드를 얻는다. 또는, CATH2 또는 유도체는 Invitrogen의 Expressway™ 무세포 시스템과 같은 무세포 시스템에서 생성될 수 있다.
펩티드, 즉 CATH2 또는 이의 유도체를 포함하는 펩티드의 제조에 적용될 수 있는 방법의 좀 더 포괄적인 요약은 다음 문헌에 기술되어 있다: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.
명료함과 간결한 설명을 위해 본 발명의 동일하거나 별개의 측면 또는 구현예의 일부로서 특징이 여기에서 설명될 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위가 동일하거나 별도의 구현예의 일부로서 본 명세서에 기술된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시예를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도1: D-CATH2 및 이의 유도체는 THB 및 RPMI+FCS 모두에서 수개의 S. suis type2 균주를 효율적으로 죽인다.
106 CFU ml-1 S. suis 2형 균주(P1/7, D282, S735 및 OV625)에 대한 D-CATH2 및 이의 유도체의 항균 활성을 THB 배지(a) 및 RPMI+FCS(b) 모두에서 콜로니 수 분석을 사용하여 테스트하였다. 2logCFU mL-1을 실험의 검출 한계로 설정하였다. 데이터는 평균 +/- SEM(N=3-4)으로 그래프를 그렸다.
도2: 세포 독성 및 세포 마커 발현에 대한 BMDM 및 BMDC의 펩티드 적정.
마우스 BMDM(a, c, e, g) 및 BMDC(b, d, f, h)를 각각 GM-CSF 및 M-CSF와 함께 6일 동안 배양하였다. 6일째(a, b, e, f)에 다양한 농도를 첨가하거나 1-2일째(c, d, g, h)에 다양한 농도의 펩티드로 세포를 프라이밍하였다. 7일째에, 세포 생존력을 WST-1 시약을 사용하여 테스트하였으며, 펩티드가 없는 대조군은 100% 생존력(a-d)으로 설정되었고 세포는 세포 마커 발현에 대해 유세포 분석으로 분석되었다(e-h). 결과는 평균 +/- S.E.M. (n=3)로 나타냈다.
도3: D-CATH2 및 이의 유도체는 LTA-SA- 또는 S. suis-유도 활성화를 억제한다.
마우스 BMDM 세포는 MOI 0.2에서 다양한 S. suis 2형 균주로 활성화되기 전에 6일 동안 배양되었다. 자극 전에 세균이 1.25 μM D-CATH2 또는 이의 유도체와 5분 동안 혼합되었다. 자극 24시간 후, 세포를 유세포 분석법(a)으로 분석하고 사이토카인 발현을 측정하였다(b). 소화 완충액을 사용하여 WT 마우스로부터 새로 분리한 후 40μM 세포 필터를 통해 여과한 5*105 비장 세포를 MOI 0.2에서 5μM D-CATH2 또는 이의 유도체와 미리 혼합한 다양한 S. suis 2형 균주로 활성화시켰다. 자극 24시간 후 분비된 사이토카인을 ELISA를 이용하여 측정하였다(c). 데이터는 평균 +/- SEM(N=3-6)으로 그래프를 그렸다.
도4: D-CATH2 및 이의 유도체는 LTA에 결합한다.
등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)를 사용하여 200μM LTA-SA에 대한 200μM D-CATH2(a), DC(1-21)(b) 및 DC(4-21)(c)의 열역학적 결합 능력을 측정하였다. 매 300초마다 1.99μl 펩티드 용액을 164μl LTA 용액으로 적정하였다. 보정된 발열률(μJ sec-1) 그래프를 그렸고(상단 패널), 표준화된 적분 열이 LTA와 펩티드 사이의 몰비에 대해 그래프로 그려졌다(하단 패널). 독립 모델을 그래프화하고 피팅하기 전에 실험(N=3)들의 평균을 냈다. 비교를 위해 D-CATH2, DC(1-21) 및 DC(4-21)의 보정된 발열률을 나타냈다(d).
도5: D-CATH2 및 이의 유도체는 BMDM 효율성을 높인다.
마우스 BMDM 세포를 6일 동안 배양하였다. 1일차에 1.25μM D-CATH2 또는 이의 유도체를 24시간 동안 첨가하였다. 6일째에 세포를 MOI 0.2에서 상이한 S. suis 2형 균주로 활성화시켰다. 자극 전에 세균이 1.25 μM D-CATH2 또는 이의 유도체와 5분 동안 혼합되었다. 자극 24시간 후, 세포를 유세포 분석법(a)으로 분석하고 사이토카인 발현을 측정하였다(b). 데이터는 평균 +/- SEM(N=3-6)으로 그래프를 그렸다.
도6: 펩티드로 프라이밍된 수지상 세포는 대식세포 마커를 증가시켰다.
마우스 BMDC는 M-CSF와 함께 6일 동안 배양되었고 자극하는 동안 1-2일째에 1.25 μM 펩티드로 프라이밍(a) 또는 6일째에 1.25 μM 펩티드가 첨가되었다(b). 세포를 세포 마커 발현에 대해 유세포측정법(flow cytometry)으로 분석하였다. 결과는 평균 +/- S.E.M. (n=3)로 나타냈다.
도7: 예방적 DC(1-21) s.c. 주사는 마우스에서 S. suis P1/7의 임상 증상을 감소시킨다.
생체 내 실험 설정의 도식적 개요. 1일째에 모든 마우스는 목 부위에 DC(1-21) 또는 대조군을 피하 주사하였다. 24시간 후(24h DC(1-21) 또는 7일 후(7d DC(1-21)), 마우스에 107 CFU S. suis P1/7 또는 THB만 복강내 주사하였다. 감염 24시간 후, 혈액 몇 방울을 채취하고 감염 7일 후 마우스를 희생시켜 분석하였다. 검은색 화살표는 동물복지 평가시점을 칭량 및 임상증상 점수로 나타낸다(a). 100%로 설정된 감염 순간의 체중과의 상대적인 체중 차이를 24h DC(1-21)(b) 및 7d DC(1-21)(e)에 대해 도시했다. 8개의 다른 매개변수의 누적 임상 점수를 24h DC(1-21)(c) 및 7d DC(1-21)(f)에 대해 도시했다. 생존 곡선이 그려졌고, HEP에 도달한 마우스의 다른 장기에서의 세균 수를 24h DC(1-21)(d) 및 7d DC(1-21)(g)에 대해 나타냈다. S. suis 세균이 발견된 마우스당 장기의 수(h) 및 마우스당 장기당 평균 CFU(i)가 도시되었다. 펩티드 주사 후 24시간에 감염된 마우스를 나타내는 원과 펩티드 주사 후 7일의 정사각형으로 표시된 연구 종료 전에 죽은 마우스의 세균 부담(j). 결과는 평균 +/- S.E.M. (CNTR n=4, CNTR+S. suis n=12, DC(1-21)n=4, 및 DC(1-21)+S. suis n=12)로 나타냈다.
도8: S. suis 감염된 쥐의 혈액 및 다른 기관의 세균 수
감염 24시간 후 뺨의 천자(a) 및 7일 후 심장 천자(b)를 통해 혈액을 채취하고, 세균 계수를 위해(a, b) TSA/5% 양 혈액 플레이트에 도말하였다. 7일에 복막(peritoneum)을 세척하고, 복막세척액(peritoneal lavage) 속의 세포를 계수하였다(c). 비장 무게를 쟀다(d). 다양한 기관의 단일 세포 현탁액을 세균 계수를 위해TSA/5% 양 혈액 플레이트에 도말하였다. 기관 mg당 CFU가 계산되었다(e).
실시예
재료 및 방법
펩티드, 세균 균주 및 실험동물
순 양전하가 9(9+)인 닭 CATH2(RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH2)(D-CATH2)의 26개 아미노산 전체 D-안티오머(antiomer)와 2개의 유도체(DC(1-21), 8+ 및 D(4-21), 7+)가 본 연구에 사용되었다. 펩티드는 China Peptides(CPC Scientific, Sunnyvale, CA, USA)에서 Fmoc-chemistry에 의해 합성되었고 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 순도 > 95%로 정제되었다. 동결건조된 펩티드를 내독소가 없는 물에 용해시켰다.
S. suis 혈청2형 균주 P1/7, D282, S735 및 OV625가 이 연구에 사용되었다. 모든 균주는 이전에 특성 확인이 되었다[17]. 세균 균주는 사용하기 전에 Todd-Hewitt broth(THB)(Oxoid Ltd., London, UK)의 글리세롤 스톡에서 밤새 배양하였다.
7주에서 10주 된 Crl:CD-1 마우스(수컷 및 암컷 모두)는 Charles River에서 구입하였다. 모든 마우스는 동물에 대한 과학적 절차(CCD)에 대한 네덜란드 중앙 당국이 승인한 동물 실험 지침에 따라 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 특정 병원균이 없는 환경에서 유지되었다.
항균 활성
S. suis 혈청 2형 균주 P1/7, D282, S735 및 OV625를 THB에서 37℃에서 3-4시간 동안 중간 대수기(mid-logarithmic phase)로 성장시킨 후 세균을 4℃에서 10분 동안 1200xg에서 원심분리하고 신선한 THB에 재현탁했다. 농도는 0.1의 OD로 620nm에서 OD 값을 측정하여 확인되었다(1x108 콜로니 형성 단위(CFU) mL-1). 106 CFU mL-1 S. suis를 다양한 농도의 D-CATH 및 유도체(0.63-40μM)와 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 방치하였다. 10배 희석액을 준비하여 5%(vol/vol) 탈피브린 양 혈액(Oxoid)이 포함된 Tryptan Soy agar(TSA) 플레이트에 펴 바르고 콜로니를 48시간 동안 성장시켰다. 최소 살균 농도(MBC)는 분석의 검출 한계인 ≤100 CFU mL-1(2 logCFU mL-1)로 정의되었다.
세포 배양 및 유세포 분석
양쪽 뒷다리의 대퇴골 및 경골로부터 분리된 골수 세포를 액체 질소 내의 FCS/10% DMSO에 보관하였다. 세포는 10% 우태 혈청(FCS)(Corning, NY, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 페놀 레드가 없는 RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific) 중에 5x105 세포 mL-1의 농도로 배양시켰다. 골수 유래 대식세포(BMDM) 및 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 각각 20ngmL-1 쥐 재조합 M-CSF 또는 GM-CSF(Peprotech, NJ, USA)를 첨가하여 배양하였다. 표시된 경우, 세포는 1일에 1.25μM 펩티드를 첨가하여 훈련되었고, 2일에 새로운 배지로 교체되었다. 모든 세포의 배지는 3일에 항생제가 없는 신선한 배지로 교체되었다. 6일에 세포는 1 ㎍ mL-1의 S. aureus (LTA-SA) (Invivogen)의 리포테이코산 또는 감염 다중도(MOI)가 0.2인 상이한 S. suis 균주로 자극되었다. S. suis를 포함하는 배지는 2시간 후 제거하고 200μg/ml 젠타마이신(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 포함하는 배지로 교체하고 추가로 22시간 동안 방치하였다. 24시간 후, 배지를 수집하고 사이토카인 측정을 위해 -20℃에 보관하였다. 세포를 PBS/0.5mM EDTA와 함께 5분 동안 배양한 후 강력한 피펫팅으로 재현탁하고 유세포 분석에 사용하였다. 세포를 유세포 분석 완충액(PBS/0.5% BSA(Sigma Aldrich))에 재현탁하고 전체 절차 동안 얼음에 보관하였다. 세포를 항체(표1)로 20분 동안 염색하고 세척하고 BD FACSCanto-II(BD bioscience)를 사용하여 측정하고 FlowJo 소프트웨어(Ashland, OR, USA)로 분석하였다.
비장 세포 활성화
CO2 질식을 사용하여 마우스를 희생시킨 후 비장을 얻었다. 비장은 37℃에서 30분 동안 소화 완충액(1.5 WU/ml liberase TL 등급(Roche, Basel, Switzerland), 100 Units/ml 재조합 DNAse I(Roche))으로 소화시키고 40μm 필터(BD bioscience)를 통과시켜서 PBS/0.5mM EDTA 세척 완충액을 사용하여 단일 세포 용액을 준비하였다. 적혈구를 등장성 염화암모늄 완충액(155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)을 사용하여 얼음 위에서 5-10분 동안 용해하고 PBS 1x로 세척하였다. 그 후 세포를 계수하고 10% FCS(Corning, VA, USA)가 보충된 고당 DMEM(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 재현탁하였다. U-바닥 96-웰 플레이트에 웰당 5x105개의 비장 세포를 첨가하였다. 총 비장 세포는 0.2의 MOI에서 1㎍ LTA-SA 또는 다른 S. suis 균주로 자극되었다. 2시간 후, 상청액을 수집하고(원심분리 1800RPM, 2분) 세포를 200㎍/ml 젠타마이신이 보충된 100㎕ 신선한 배지에 재현탁하고 추가로 22시간 동안 방치하였다. 24시간 후, 배지를 수집하고 사이토카인 측정을 위해 -20℃에 보관하였다.
세포 생존력 및 활성
BMDC 및 BMDM의 세포 생존 및 활성화된 비장 세포의 세포 활성을 보기 위해 WST-1 시약(roche)이 사용되었다. 두 경우 모두 10% WST-1이 포함된 100μl의 신선한 배지를 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 30-60분 후, FLUOstar Omega 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Germany)를 사용하여 450nm에서 비색 변화를 측정하였다. 대사 활성은 처리되지 않은 BMDC/BMDM 또는 자극되지 않은 비장 세포를 100%로 설정하고 백분율로 표시된다.
ELISA
TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-6은 Duoset ELISA 키트(R&D systems, MN, USA)를 사용하여 상청액(필요한 경우 PBS/5% BSA에 희석)에서 측정되었다. ELISA는 제조사의 설명서에 따라 수행되었다. 비색 변화는 FLUOstar Omega 마이크로플레이트 판독기(BMG Labtech GmbH)를 사용하여 450nm에서 측정되었다.
등온 열량계(isothermal calorimetry, ITC)
등온 적정 열량계(ITC)를 사용하여 D-CATH2 펩타이드와 LTA-SA 간의 상호작용을 테스트하였다. 모든 ITC 실험은 Low Volume NanoITC(TA instrument - Waters LLC, New Castle, USA) 상에서 수행되었다. LTA-SA 또는 펩티드 용액 800μM을 MilliQ에 준비한 후 dPBS(Gibco)에 4배 희석하였다. 챔버를 164μL LTA-SA로 채우고 펩티드를 주사기에 넣었다. 300초마다 1.99μL의 펩티드가 37℃의 챔버로 적정되었다. Nano Analyze 소프트웨어(TA instrument-Waters LLC)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 세 번의 실험의 데이터를 평균내고 독립 모델을 사용하여 펩티드-LTA 상호작용을 확인하였다.
생체 내 감염 실험
도착하자마자, 마우스를 실험 시작 전 적어도 7일 동안 적응시켰다. 실험은 도7a에 도시된 바와 같이 수행되었다. 실험을 2회 반복하여 대조군은 총 4마리, 감염군은 12마리를 얻었다. 1일째에, 마우스에 PBS/콜레스테롤 내 1 mg/kg-1 DC(1-21) 또는 PBS/콜레스테롤 단독으로 목 부위에 sc로 주입하였다. 연구자의 영향을 피하기 위해 펩티드와 대조군을 눈가림 처리하였다. 24시간 후(그룹 1) 또는 7일 후(그룹 2), 마우스를 THB 내 107 CFU S. suis P1/7로 또는 대조군으로서 THB 단독으로 i.p.로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 세균 수를 측정하기 위해 뺨 천자를 통해 몇 방울의 혈액을 채취하였다. 상기 실험의 감염 단계 동안 마우스는 질병의 급성기(처음 48시간)에는 매 12시간마다, 그 이후에는 연구가 끝날 때까지 매일 확인되었다. Seitz et al.[18]에 따라, 표 4에 기술된 여러 변수를 질병의 척도로 사용하여 쥐에게 누적 임상 점수를 부여하였다. 마우스가 8가지 중 3가지에 대해 2점을 2일 연속으로 획득하거나 심각한 체중 감소(>20%)인 경우 동물 복지상(Humanized End Point, HEP)의 이유로 마우스를 안락사시켰고, 하기에 기술될 바와 같이 세균 계수를 위해 장기를 수집하였다. 감염 7일 후 추가 분석을 위해 모든 마우스를 희생시켰다. 마우스를 이소플루란(Isoflurane)을 사용하여 마취하고 심장 천자를 통해 1mL 혈액을 채취한 다음 경추탈골법을 수행하였다. 복막을 5mL PBS/0.5mM EDTA로 씻어내고 10mL 얼음처럼 차가운 PBS/0.5% FCS로 희석하였다. 장기(비장, 폐, 간, 림프절(겨드랑이, 사타구니 및 장간막), 뇌, 신장 및 골수)를 수집하여 얼음처럼 차가운 PBS에 보관하였다. 골수와 림프절을 제외한 모든 장기는 사토리우스 마이크로저울(sartorius microbalance)를 사용하여 무게를 측정하였다. 복막 세척(PTL) 샘플은 Countess II Automated Cell Counter(Thermofisher)를 사용하여 계수하였다. 폐, 간, 뇌 및 신장을 40μm 필터(BD bioscience)를 통해 5mL PBS와 함께 통과시켜서 단일 세포 현탁액을 얻었다. 비장과 림프절을 소화 완충액(1.5 WU/ml 리버라제 TL 등급(Roche, Basel, Switzerland), 100 Units/ml 재조합 DNAse I(Roche))으로 37℃에서 30분 동안 소화시키고 5mL PBS/0.5mM EDTA를 사용하여 40μm 필터를 통과시켰다. 혈액 및 비장의 적혈구를 등장성 염화암모늄 완충액(155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)을 사용하여 얼음 위에서 5-10분 동안 용해하고, PBS로 1회 세척하고 FACS 완충액(PBS/0.5%BSA)에 재현탁하였다. 골수 샘플을 양쪽 다리의 대퇴골과 경골에서 5mL PBS로 씻어내고 40μm 필터를 통해 여과하였다. 혈액, 골수, 비장, 복막 세척액 및 림프절의 샘플을 취하여 30분 동안 다양한 항체 패널로 염색하고(표 1) BD FACSCanto-II를 사용하여 측정하고 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 폐, 간, 뇌, 신장, 비장 및 복막 세척액 샘플의 10배 연속 희석액을 준비하고 샘플을 5%(vol/vol) 탈피브린 양 혈액을 포함하는 TSA 플레이트에 도말하였다. 콜로니를 48시간 동안 성장시켰다. 콜로니의 수는 분석의 검출 한계로서 ≤100 CFU mL-1(2 logCFU mL-1)로 계수하고, CFU/mg 장기로 계산하였다.
사용된 항체
항원 클론 표지 제조사
MHC-II M5/114.15.2 FITC eBioscience
CD11c HL3 PE BD Bioscience
Sirp-α P84 PerCP-eFluor710 eBioscience
CD19 1D3 PE-Cy7 BD Bioscience
CD8α 53-6.7 APC BD Bioscience
CD11b M1/70 APC-Cy7 BD Bioscience
CD24 M1/69 eFluor450 eBioscience
CD86 GL-1 PerCP BoiLegend
F4/80 BM8 APC eBioscience
Ly6C HK1.4 eFluor450 eBioscience
CD4 RM4-5 AF488 BD Pharmingen
CD62L MEL-14 PE eBioscience
CD335 29A1.4 PerCP-Cy5.5 BD Bioscience
CD44 IM7 PE-Cy7 BD Bioscience
CD3e 145-2C11 APC-Cy7 BD Pharmingen
CD25 eBio3C7 eFluor450 eBioscience
유세포 분석에 사용되는 항체. 모든 항체는 사용 전에 유세포 분석 완충액에서 1000x로 희석되었다(CD19 및 CD335는 500x 희석으로 사용됨).
통계
샘플은 Dunnett 사후 테스트와 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 펩티드가 없는 대조군과 비교되었다. 세포 배양 샘플에 대해 샘플을 짝지었다. *=p≤0.05; **=p≤0.01; ***=p≤0.001;****=p≤0.0001.
결과
D-CATH2 및 이의 유도체는 THB 및 RPMI+FCS 모두에서 여러 S. suis type2 하위 균주를 효율적으로 사멸시킨다.
d-CATH2 및 이의 유도된 펩티드의 항균 활성을 4개의 상이한 S. suis 혈청형 2 균주에 대해 평가하였다. 3개의 펩티드의 평균 살균 농도(MBC)는 세균 성장 배지 THB에서 4개의 하위 균주에 대해 2.5-5μM이다(도 1a 및 표 2). 그러나, 대부분의 분석은 세포 배양 배지 RPMI+10% FCS에서 수행되며 배지가 카텔리시딘의 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으므로, D-CATH2 및 DC(1-21)의 MBC를 RPMI+10%FCS 배지에서도 시험했다. D-CATH2 및 DC(1-21)의 활성은 0.6-2.5 μM으로 약간 증가한 반면, 가장 짧은 펩티드인 DC(4-21)는 2.5μM의 MBC로 유지되어서(도 1b 및 표 2), 아미노산의 전하 또는 수가 D-CATH2의 항균 기능에 중요하다는 것을 나타낸다.
d-CATH2가 사멸시키는 S. suis 균주의 MBC 값
THB RPMI + 10% FCS
d-CATH2 dC(1-21) dC(4-21) d-CATH2 dC(1-21) dC(4-21)
P1/7 2.5-5 2.5 5-10 1.25-2.5 1.25 2.5
S735 1.25-2.5 2.5 2.5 0.6-2.5 1.25 2.5
D282 2.5-5 2.5-5 2.5-5 0.6-2.5 0.6-1.25 1.25-2.5
OV625 1.25-5 0.6-5 1.25-2.5 1.25-2.5 1.25 2.5
세균 균주 및 배지에 따른 여러 펩티드의 MBC 값.
D-CATH2 및 그 유도체는 LTA에 결합하여 LTA-SA 또는 S. suis 유도 활성화를 억제한다.
CATH2의 생물학적 형태는 쥐 대식세포 세포주의 LPS 및 LTA 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있지만[21], CATH2의 전체 D 안티오머가 LTA로 유도된 1차 배양된 쥐 BMDM 및 BMDC 활성화를 억제할 수 있는지 여부는 불분명하다. 또한 카텔리시딘은 고농도에서 포유류 세포에 세포 독성을 나타낼 수 있다[19]. 따라서, 쥐 BMDM 및 BMDC를 D-CATH2, DC(1-21) 및 DC(4-21)에 노출시켰으며, 세포 생존력 및 분화에 대한 펩티드의 임의의 효과를 관찰하기 위해 배양 종료 시(6일) 또는 배양 시작 시(1일)에 첨가되었다.
BMDM은 D-CATH2 및 그 유도체, 특히 DC(1-21)의 첨가에 상대적으로 민감한 반면(도 2a), BMDC는 생존력이 약간 감소했지만 2.5μM 펩티드에서 시작하여 셋 사이에 차이가 없었다(도 2b). BMDM과 BMDC는 모두 배양 초기에 펩티드를 첨가한 경우 덜 민감했으며, 5μM에서 생존력이 약간만 감소하였다(도2c 및 d). 유세포 분석을 사용한 분석에서도 % BMDM가 감소한 것으로 나타났다. 살아남은 BMDM은 F4/80 발현이 증가하고 MHC-II가 감소하였다(도 2e). BMDC의 약간의 감소는 다른 세포 마커에 영향을 미치지 않고 5μM에서만 볼 수 있다(도 2f).
펩티드와 조합한 자극 효과를 분석하기 위해 1.25μM을 세포독성의 경계에 있지만 여전히 대식세포에서 F4/80의 발현에 영향을 주는 농도로 선택했다. S. suis 혈청형 2의 4개의 상이한 하위 균주를 1.25μM 펩티드와 혼합하고 6일째에 BMDM에 첨가하였다. 펩티드와 조합된 BMDM의 활성화는 유세포측정법에 의해 나타난 바와 같이 대식세포의 백분율에 영향을 미치지 않았다. 그러나, MHC-II, CD86 및 CD38과 같은 활성화 마커의 상향 조절은 4개의 하위 균주 모두에서 3개의 펩티드 전부에 의해 강력하게 억제되었다(도 1a). BMDC에 대해서도 유사한 결과가 확인되었다(도 6a). 또한, TNFα 및 IL-6의 분비는 펩티드의 존재 하에서 억제되었다(도 3b). 보다 복잡한 시스템에서 S. suis-유도된 활성화에 대한 펩티드의 영향을 연구하기 위해, 전체 비장세포를 생체외에서 활성화시켰다. 전체 살아있는 S. suis 세균에 더하여 순수한 LTA를 활성화에 사용하였다. 펩티드의 존재 하에, LTA 또는 전체 S. suis 세균은 TNFα 및 IL-6 분비의 억제에 의해 나타난 바와 같이 비장 세포를 활성화할 수 없었다(도 3c).
LTA와의 직접적인 상호작용에 대한 펩티드의 활성화 억제 효과를 알아보기 위해 ITC(isothermal titration calorimetry)를 이용하여 펩티드의 LTA 결합능을 시험하였다. LTA- 및 S. suis-유도 활성화는 세 가지 펩타이드 모두에 의해 강력하게 억제되며, 이는 2-10μM 사이의 해리 계수 Kd의 LTA에 대한 직접 결합으로 부분적으로 설명된다. 흥미롭게도, 이들 세 가지 펩티드는 LTA 및 S. suis 유도 활성화를 억제하는데 동일하게 효과적이만, Kd가 낮고 하나의 LTA 분자에 결합하는 더 작은 펩티드인 DC(1-21)는 다른 두 펩티드에 비해 덜 강하게 결합한다(도 4 및 표 3).
ITC 데이터
D-CATH2 DC(1-21) DC(4-21)
Kd (μM) 3.039 10.22 2.12
n 0.543 0.207 1.209
△H (kJ/mol) -21.16 -85.64 -16.73
△S (J/mol·K) 37.39 -180.6 54.68
37.2μM LTA-SA에 대한 200μM D-CATH2, DC(1-21) 또는 D-C(4-21)의 결합 능력에 대한 ITC 결과 개요. Kd - 해리 계수(μM); n - 하나의 LPS 분자에 결합하는 펩티드 분자의 수; ΔH - 엔탈피 변화; ΔS - 엔트로피 변화.
D-CATH2 및 이의 유도체는 BMDM 배양 효율을 증가시킨다.
대식세포에 대한 D-CATH2 및 이의 유도체의 효과를 추가로 연구하기 위해, 배양 시작 후 24시간 동안 세포를 펩티드에 24시간 동안 노출시켰다. BMDM의 효율성은 펩티드의 초기 노출에 의해 향상되었고, DC(1-21)에서 가장 두드러진 6일째의 더 높은 비율의 대식세포에 의해 나타났다(도 5a). 그러나, 세포의 프라이밍은 활성화 마커인 MHC-II, CD86 및 CD38을 변경하지 않았으며(도 5a), 펩티드 처리된 세포에 의한 사이토카인 발현에도 차이가 없었기(도 5b) 때문에 세포의 활성에 영향을 미치지 않았다.
BMDC 배양에서도 유사한 결과가 나타났으며, 배양 시작 후 24시간 동안 펩티드에 세포를 24시간 동안 노출시켰다. 6일째에 BMDC의 비율은 변하지 않았고 활성화 마커의 발현에도 차이가 없었지만, 대식세포 마커 F4/80이 증가하여 대식세포 유사 세포 쪽으로 치우침을 나타낸다(도 6b).
DC(1-21)은 마우스에서 S. suis P1/7의 임상 증상을 감소시킨다.
이전 연구에서 본 발명자는 부화 3일 전에 D-CATH2의 종란내 주입하면 부화 후 7일까지 닭을 감염으로부터 보호한다는 것을 확인하였다[22]. D-CATH2, 보다 구체적으로 DC(1-21)의 추가는 쥐 BMDM 배양의 효율성을 향상시키고 염증 반응의 균형을 유지했기 때문에, DC(1-21)의 주사가 마우스의 면역 반응을 우수하게 향상시킬 수 있는지 여부가 의문이었다. 따라서, 마우스에 1일째에 1mg/kg DC(1-21)를 피하 주사하고 펩티드 주사 후 24시간 또는 7일에 복강내로 107 CFU/ml S. suis P1/7로 감염시켰다. 마우스는 감염의 급성기 동안 하루에 두 번 그리고 감염 후 7일까지 매일 무게를 측정하였다(도 7a). 대조군 마우스로서 펩티드 처치된 두 마우스들은 펩티드 주입 후 감염이 24시간에 일어났는지(도 7b) 또는 7일에 일어났는지(도7e)와 독립적으로 S. suis 감염으로 인해 감염 후 최대 48시간까지 약 8%의 체중이 감소했고, 다시 체중이 증가하기 시작하였다. 또한, 감염의 급성기에는 1일 2회, 만성기에는 매일 누적 임상 점수를 점수표를 이용하여 마우스에게 부여하였다(표 4). 이것은 마우스가 펩티드 주입 후 24시간(도 7c)에 감염된 경우 질병의 후기 단계에서 또는 펩티드 주입 후 7일(도 7f)에 감염된 경우 질병의 급성기에서 마우스에 대한 누적 임상 점수의 작은 감소를 보여준다. 감소된 누적 임상 점수에 더하여, 처치된 마우스는 펩티드 주사 후 24시간(도 7d) 또는 7일(도 7g)에 감염이 이뤄졌을 때 더 높은 생존율 변화를 가졌다.
다른 장기의 세균 수 또한 측정되었다. 감염 24시간 후, 처치 여부에 관계없이 모든 마우스는 혈류에서 105-106 CFU mL-1 사이의 S. suis 세균을 보유하였다(도 8a). 7일 후, 대부분의 마우스는 혈액 내 모든 세균을 고갈시킬 수 있었으며, 이는 24h DC(1-21) 처치된 마우스에서 처치되지 않은 마우스에 비해 더 효율적이었다(도 8b). 연구 종료 섹션 동안 복막을 세척하고 복막 세척액에 존재하는 세포를 세었는데, 감염 시 증가를 나타내었지만 처치된 마우스와 처치되지 않은 마우스에서 차이가 없었고(도 8c), 유세포분석에서도 차이가 발견되지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), 마지막으로, 대부분의 마우스가 처치된 그룹과 처치되지 않은 그룹에서 유사한 비율로 복막에서 세균을 제거할 수 있음을 보여주는 세균의 양이 확인되었다(도 8e). S. suis 감염 마우스의 비장이 확대되어 효율적인 감염 모델을 나타내었지만, 처치된 마우스와 처치되지 않은 마우스 간에 차이가 발견되지 않았다(도 8d). 다양한 장기에서 S. suis의 양을 측정하였고, 약간의 차이만 발견되었다(도 8e). 그러나, 세균이 발견될 수 있는 장기의 수를 세어보면 24h DC(1-21) 처치된 마우스가 처치되지 않은 마우스에 비해 더 적은 양성 장기(도 7h)와 더 적은 총 CFU 수(도 7i)를 가지고 있음을 나타내었다. 이 효과는 7d DC(1-21) 처치된 마우스에서는 발견되지 않았다. 또한, 연구가 끝나기 전에 HEP에 도달한 DC(1-21) 처치된 마우스는 더 적은 세균 수를 보였고, 특히 덜 심각한 질병 과정을 나타낸 뇌에서 그러했다(도 7j). 여러 장기에 대해 면역 세포를 분석하였지만, 처치된 마우스와 처치되지 않은 마우스 사이에 차이가 발견되지 않았다.
S. suis-감염 마우스의 누적 점수에 대한 임상 점수화 변수
점수
0 1 2
체중 일정 또는 증가 >5% 체중 손실 > 20% 체중손실
털 고르고 광택 더 거침 부스스함
숨쉬기 리드미컬 빠름 빠르고 비정상
탈수 정상의 피부탄력 감소된 피부탄력 지속되는 피부주름
자세 정상 굽은 등 옹송그림
눈 정상 중간 정도로 작아짐 작아지고 및 부기
활동성 정상 활동 감소 냉담
움직임 정상 균형 감소 불안정, 운동불능
누적 임상 점수는 8가지 변수에 대한 임상 점수의 합으로 정의되었다. 마우스가 지속적인 심각한 임상 징후(8가지 중 3가지에 대해 2점, 연속 2일로 정의) 또는 심각한 체중 감소(> 20%)를 보이는 경우, 동물 복지 상 이유(Humanized End Point, HEP)로 안락사시켰다.
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Claims (20)

  1. CATH2 또는 이의 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis, S. suis) 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 이를 필요로 하는 대상체에서 스트렙토코커스 수이스(S. suis) 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 포유류 또는 조류 대상체인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 젖소 및 육우를 포함하는 소, 양을 포함하는 다른 반추동물, 돼지, 가금류, 개, 고양이 또는 말인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S. suis가 S. suis 혈청형 2, 혈청형 9, 혈청형 1 또는 혈청형 3인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S. suis가 혈청형 2인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 대상체는 S. suis 감염 상태이거나, 상기 감염 상태인 대상체와 접촉하고 있는 대상체와 같은 S. suis 감염 위험이 있는 상태인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체를 대상체 집단의 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 S. suis 감염이 상기 집단의 하나 이상의 대상체에서 발생된 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 CATH2 유도체를 2회 투여하는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 2일 간격으로 CATH2 유도체를 투여하는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 가금류이고 상기 투여는 종란내(in ovo) 및/또는 부화 후에 수행되는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 선천적 면역 기억을 유도하거나 촉진하는 것을 포함하는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항미생물제로 하는 항미생물 치료를 개선 또는 강화하는 것을 포함하는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  14. 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)에 CATH2 또는 이의 유도체를 투여하는 단계를 포함하는 S. suis를 억제하는 방법.
  15. 스트렙토코커스 수이스(S. suis)를 억제하는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 유도체가 DCATH2, C-말단 및/또는 N-말단 절단형 CATH2 및 C-말단 또는 N-말단 절단형 DCATH2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CATH2 유도체가 DCATH2, DCATH2(1-21), DCATH2(4-21), CMAP4-21, CMAP5-21, CMAP6-21, CMAP7-21, CMAP8-21, CMAP9-21, CMAP10-21, CMAP11-21, CMAP4-21(F5→W), CMAP4-21(F5→Y), CMAP4-21(F12→W), CMAP4-21(F12→Y), CMAP4-21(F5, F12→W), CMAP4-21(F5, F12→Y), CMAP4-21(F5→W, F12→Y), CMAP4-21(F5→Y, F12→W), CMAP7-21(F12→W), CMAP7-21(F12→Y), CMAP10-21(F12→W) 및 CMAP10-21(F12→Y)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 유도체가 DCATH2, DCATH2(1-21) 또는 DCATH2(4-21)인 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체가 톨-유사수용체(TLR)리간드, β-글루칸, 무라밀디펩티드(MDP), 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin, BCG), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 선천면역(innate immunity)에 대한 특이적 보조제(adjuvant)와 함께 조합되는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CATH2 또는 이의 유도체가 S. suis 또는 이의 항원 부분으로 처리하기 전, 후 또는 동시에 투여되는 것인 방법 또는 방법에 사용하기 위한 CATH2 또는 이의 유도체.
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