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KR20230140757A - 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 생산을 위한 재조합 미생물 - Google Patents

폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 생산을 위한 재조합 미생물 Download PDF

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KR20230140757A
KR20230140757A KR1020220039407A KR20220039407A KR20230140757A KR 20230140757 A KR20230140757 A KR 20230140757A KR 1020220039407 A KR1020220039407 A KR 1020220039407A KR 20220039407 A KR20220039407 A KR 20220039407A KR 20230140757 A KR20230140757 A KR 20230140757A
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KR
South Korea
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recombinant microorganism
gene
encoding
phbv
synthase
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Application number
KR1020220039407A
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English (en)
Inventor
고자경
조영윤
공경택
안정호
이선미
엄영순
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US18/059,330 priority patent/US20230313241A1/en
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Abstract

본 개시는 PHBV 생산을 위한 재조합 미생물, 이의 제조방법 및 상기 미생물을 사용하여 PHBV를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시는 우수한 물성의 생분해성 플라스틱 소재인 PHBV를 유기산의 보조원료 없이 저가의 단일 탄소원으로부터 고효율로 직접 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공할 수 있다. 본 개시는 높은 생산가와 제한적 물성의 PHA 활용도를 높이고, 또한 값싼 단일 탄소원을 이용하여 산업화에 더 효율적인 기술을 제공할 수 있다. 본 개시의 일 실시예에서 생산되는 PHBV는 환경 친화적 포장재와 같은 범용성 저가 제품 외에도 고부가 의료용 생체고분자 용도로 용이하게 활용될 수 있다.

Description

폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 생산을 위한 재조합 미생물 {Recombinant microorganism for producing poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)}
본 명세서는 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(이하 PHBV라 함)를 생산할 수 있는 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체 생산방법에 관하여 기술한다.
지속가능한 플라스틱 쓰레기 문제를 해결하기 위하여 석유계 난분해성 플라스틱 대체의 필요가 증가하고 있다. 화석원료 기반의 단량체로부터 만들어지는 플라스틱 대비되는 개념으로는 바이오 플라스틱이 있다. 바이오 플라스틱은 재생가능한 원재료로 만들어지는 플라스틱으로, 바이오플라스틱에는 세균에 의해서 분해되는 생분해성 플라스틱이 포함된다.
생분해성 바이오플라스틱의 주요 소재인 PHA 혹은 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate)는 미생물 세포 내에 축적되는 열가소성의 천연 폴리에스터 고분자로, 퇴비화가 가능하고 유독성 폐기물 발생도 없는 해양 생분해성 플라스틱이나, PHA는 아직까지 생산 비용과 가공 불안정성 문제로 인해 제한적으로 사용되어 오고 있다. 기존 PHA 제품은 석유화학 유래 플라스틱에 비해 물성이 약한 단점이 있다. 이 단점을 극복하기 위해 물성을 결정하는 다양한 단량체를 활용한 바이오 플라스틱이 연구되고 있다. PHA 계열 고분자 중 가장 대표적으로 알려진 물질인 C4 단량체 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate, 3HB)로 중합된 폴리하이드록시 부티르산(polyhydrohybutyrate; PHB)은 폴리프로필렌과 비슷한 물성을 가지고 있고 미생물이 비교적 효율적으로 합성할 수 있어 상업적 생산 연구가 많이 진행되어 왔다. 하지만 높은 결정화도로 인해 강하고 부서지기 쉬운 특성을 가지고 있으며, 가공성에 한계가 있다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 다양한 소재의 블렌딩 및 단량체의 공중합을 통한 PHA 공중합체를 합성하는 연구가 진행되어 오고 있다.
PHA의 생분해성, 생적합성, 기계화학적 물성 및 분자량을 포함하는 특성은 미생물 세포 내 대사경로를 조절하거나, 미생물에게 공급되는 탄소원 종류에 의해 결정되기도 한다. 즉, PHA 합성 효소의 기질인 단량체를 공급하는 PHA 합성 대사경로가 최종적인 PHA 구조를 결정하며, 탄소원은 PHA와 구조적으로 관련된 탄소원(유기산)과 그렇지 않은 탄소원(프럭토스, 글루코스, 자일로스 등의 단당류 및 이산화탄소 등)으로 구분된다. 하이드록시 알칸산과 구조적으로 유사한 탄소원인 유기산은 구조적으로 관련된 탄소원으로 구분되며, C5 이상 탄소 사슬 길이의 PHA 공중합체를 합성하는데 사용된다. 예를 들면, PHBV의 전구체인 3-하이드록시 발러레이트 생합성을 위해 프로피온산, 발레르산 등의 유기산이 보조 원료로써 필요하다. 하지만 보조 탄소원료로써 유기산은 값비싼 기질일 뿐만 아니라, 고농도로 공급될 경우 독성을 띄게 되어 미생물의 성장을 저해하는 문제가 있다.
Zhang et al., Engineering of Ralstonia eutropha for the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from glucose. Journal of Biotechnology, 2015 195:82-88 Chen et al., Production in Escherichia coli of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) with differing monomer compositions from unrelated carbon sources. Applied and Environmental Microbiology, 2011. 77:4886-4893
본 개시가 해결하고자 하는 과제는 PHA와 구조적으로 유사하지 않은 단일 탄소원을 사용하여 보조 원료 유기산 투입 없이 PHBV를 직접 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 개시가 해결하고자 하는 과제는 PHA와 구조적으로 유사하지 않은 단일 탄소원을 사용하여 보조 원료 유기산 투입 없이 PHBV를 직접 생산하는 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 개시가 해결하고자 하는 과제는 상기 미생물 보조 원료 유기산 투입 없이 배양하여 PHBV를 직접 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 일 실시예는 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되고, 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자 prpC1 및 prpC2가 결실된, 재조합 미생물을 제공한다.
본 개시의 일 실시예는 상기 재조합 미생물의 제조방법으로, 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계; 모균주에서 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자 prpC1 및 prpC2를 결실시키는 단계; 및 상기 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자가 결실된 모균주에 상기 벡터를 삽입하여 형질전환시키는 단계;를 포함하는, 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 개시의 일 실시예는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate, PHBV)의 생산방법을 제공한다.
본 개시의 일 실시예는 PHBV 생산을 위한 재조합 미생물, 이의 제조방법 및 상기 미생물을 사용하여 PHBV를 생산하는 방법을 제공한다. 일 실시예에 따르면 상기 재조합 미생물은 우수한 물성의 생분해성 플라스틱 소재인 PHBV를 유기산의 보조원료 없이 저가의 단일 탄소원으로부터 고효율로 직접 생산할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 대사공학을 통해 미생물에 아세토락테이트 합성 효소 이용 PHBV 합성 경로를 도입함로써 높은 함량의 3HV을 포함하는 생분해성 플라스틱 생산 방법을 제공할 수 있다. 본 개시는 높은 생산가와 제한적 물성의 PHA 활용도를 높이고, 또한 값싼 단일 탄소원을 이용하여 산업화에 더 효율적인 기술을 제공할 수 있다. 본 개시의 일 실시예에서 생산되는 PHBV는 환경 친화적 포장재와 같은 범용성 저가 제품 외에도 고부가 의료용 생체고분자 용도로 용이하게 활용될 수 있다.
도 1은 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase; alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소 ((R)-citramalate synthase; leuA) 인코딩 유전자, 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스 (Acetyl-CoA acetyltransferase; BktB) 인코딩 유전자를 도입하고, prpC1, 2 인코딩 유전자를 모두 결실시킨 쿠프리아비두스 네카토르의 PHBV 합성 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 2a는 alsS를 포함하는 pBBR-MCS 벡터 맵(Vector map)을 도시한 것이다.
도 2b는 alsS 및 BktB 유전자를 포함하는 pBBR-MCS 벡터 맵(Vector map)을 도시한 것이다.
도 2c는 alsS 유전자, BktB 유전자 및 leuA 합성 유전자를 포함하는 pBBR-MCS 벡터 맵(Vector map)을 도시한 것이다.
도 3a는 도 2a의 벡터(pHV01), 도 2b의 벡터(pHV02) 또는 도 2c의 벡터(pHV03)를 prpC1 유전자가 결실된 쿠프리아비두스 네카토르에 형질전환시킨 각 재조합 균주들의 프럭토스를 이용한 균주 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 3b는 도 2a의 벡터(pHV01), 도 2b의 벡터(pHV02) 또는 도 2c의 벡터(pHV03)를 prpC1 유전자가 결실된 쿠프리아비두스 네카토르에 형질전환시킨 각 재조합 균주들의 세포 내 PHBV 생산 함량을 나타낸 도이다.
도 4a는 쿠프리아비두스 네카토르 야생형 균주(WT)와 prpC1 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC1), prpC2 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC2), 또는 prpC1 및 prpC2 유전자 모두가 결실된 변이 균주(△prpC1,2)에 각각 상기 도 2c의 alsS, BktB, leuA 유전자 모두를 포함하는 벡터(pHV03)를 형질전환시킨 재조합 균주의 프럭토스를 이용한 균주 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 4b는 상기 도 4a의 야생형(WT), △prpC1, △prpC2 및 △prpC1,2 재조합 균주의 각 세포 내 PHBV 생산 함량을 나타낸 도이다.
본 명세서에 개시되어 있는 본 개시의 실시예들은 단지 설명을 위한 목적으로 예시된 것으로서, 본 개시의 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본문에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 실시예들은 본 개시를 특정한 개시 형태로 한정하려는 것이 아니며, 본 개시의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 물질, 숫자, 단계, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 물질, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제되지 않는다.
본 개시의 일 실시예는 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되고, 메틸시트레이트 합성 효소 유전자 인코딩 prpC1 및 prpC2가 결실된, 재조합 미생물을 제공할 수 있다.
일 실시예는 상기 재조합 미생물의 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 제조방법은, 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계; 모균주에서 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자 prpC1 및 prpC2를 결실시키는 단계; 및 상기 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자가 결실된 모균주에 상기 벡터를 삽입하여 형질전환시키는 단계;를 포함할 수 있다. 이때, 상기 유전자들의 도입 또는 결실 단계는 삽입 또는 결실되는 유전자들의 순서가 본 명세서에 기재된 순서에 제한되지 않는다.
도 1은 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase; alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소 ((R)-citramalate synthase; leuA) 인코딩 유전자, 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스 (Acetyl-CoA acetyltransferase; BktB) 인코딩 유전자를 도입하고, prpC1, prpC2 인코딩 유전자를 모두 결실시킨 쿠프리아비두스 네카토르의 PHBV 합성 대사 경로를 나타낸 도이다.
일 실시예로서 상기 재조합 미생물은 숙주 미생물을 형질전환한 것일 수 있으며, 이때 상기 숙주 미생물은 PHB를 생산할 수 있는 미생물일 수 있다. 예를 들어, 상기 숙주 미생물은 야생형 쿠프리아비두스 네카토르일 수 있다. 상기 야생형 쿠프리아비두스 네카토르 미생물은 시중에서 판매되고 있는 것이거나, 신용할 수 있는 보존기관에 보존되며 보존기관이 발행하는 카탈로그 등에 의하여 자유롭게 분양될 수 있는 사실이 확인된 것일 수 있다. 상기 관점에서, 일 실시예에 따른 상기 재조합 미생물은 재조합 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)일 수 있다. 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator)는 본래 보조 원료 유기산 투입 없이 PHBV를 생산 할 수 없지만, 본 개시의 일 실시예에 의하면 PHBV의 생산이 가능하게 형질전환될 수 있으며, 저렴한 원료인 단당류, 이산화탄소 등을 단일 탄소원료로 이용하여 PHBV를 생산 할 수 있으므로, 생분해성 플라스틱 생산 시 경제성과 지속가능성을 개선할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 것일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자는 서열번호 1로 표현되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자는 할로페락스 메디테라니(Haloferax mediterranei) 유래의 것일 수 있다. 상기 (R)-시트라말레이트 합성효소 인코딩 유전자는 서열번호 2로 표현되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)유래의 것일 수 있다. 상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스 인코딩 유전자는 서열번호 3으로 표현되는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 명세서에서, "벡터"는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포로 도입되기 위한 수단이 된다. 상기 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 다양한 벡터들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 예를 들어, pBAD, pBBRMCS2, pJQ200mp18Km, pBluescript II KS(+)), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다. 상기 박테리오파지 벡터는 예를 들어 lambda gt4 lambda B, lambda-Charon, lambda Δz1, 및 M13 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 예를 들어 SV40 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서, "재조합 벡터"는 외래의 목적 유전자를 포함하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다.
본 명세서에서 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 등 각종 숙주세포에서 목적하는 효소 유전자를 발현하고 이를 생산하는 기능을 할 수 있도록 하면 특별히 한정되지 않지만, 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것일 수 있다. 이러한 벡터는 목적 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.
유용한 발현 조절 서열의 예로는, araBAD 프로모터, phaC1 프로모터, pj5 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd코드 단백질의 조절 영역, 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵 세포 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.
세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 목적하는 유전자와 전사 및 해독 발현 조절 서열이 서로 작동가능하도록 연결되어야 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 단백질의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시예로서, 상기 형질전환은 당업계에서 공지된 적합한 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환은 열 충격 방법 (heat shock transformation), 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예로서, 상기 재조합 미생물은 단일 탄소원을 포함하는 배지에서 배양되는 것일 수 있다. 일 실시예에서 상기 "단일 탄소원"은 균주가 PHBV를 생산하는데 필요한 탄소원을 제공해 주는 원료로서 글루코스 및 프럭토스를 포함하는 단당류, 이산화탄소, 글리세롤 등을 예로 들 수 있다. 단당류는 대부분의 유기체가 이용할 수 있는 탄소원으로, 대량으로 구하기 쉽고, 가격이 싸다는 장점이 있어 산업화 배양에 이용가능하다. 이산화탄소는 석유화학의 부산물로 생성되며 지구 온난화에 문제가 되는 온실가스이므로, 이를 미생물이 이용한다면 이산화탄소 감축과 동시에 에너지로 활용할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 재조합 미생물은 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV)의 생산용일 수 있다. 일 실시예로서, 상기 생산되는 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체는 3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV)를 고함량으로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 “폴리하이드록시알카노에이트(PHA)”는, 미생물 세포 내에 축적되는 열가소성의 천연 폴리에스터 고분자로써, 생분해성 소재로 퇴비화가 가능하고, 유독성 폐기물 발생도 없으면서 유일한 해양 생분해성 플라스틱이기도 하다. PHA 계열 고분자 중 가장 대표적으로 알려진 물질은 C4 단량체 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate, 3HB)로 중합된 폴리하이드록시 부티르산 (polyhydrohybutyrate; PHB)이며, 그 외 다른 다양한 PHA는 3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV) 및 3-하이드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate, 3HHx)와 같은 다양한 탄소사슬길이의 3-하이드록시 지방산으로 구성된다.
본 개시의 일 실시예는, 상술된 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV)의 생산방법을 제공할 수 잇다.
본 개시에서, 상기 “배양”은 당업계에 알려져 있는 배양 방법에 의한 것이라면 제한 없이 적용 가능하다. 일 실시예로서 상기 미생물의 배양은 진탕배양, 정치배양, 회분식 배양, 유가식 배양 및 연속식 배양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 의한 배양일 수 있다. 상기 진탕배양은 미생물을 접종한 배양물을 흔들면서 배양하는 방법을 의미하고, 상기 정치배양은 미생물을 접종한 액체 배양물을 흔들지 않고 놓아둔 채로 배양하는 방법을 의미한다. 상기 회분식 배양은 배양물의 부피를 고정하고 외부에서 새로이 배양물을 첨가하지 아니하는 상태에서 배양하는 방법을 의미하고, 상기 유가식 배양은 원료를 최초에 전부 배양 탱크에 넣어서 배양하는 단일배양(batch)에 대조되는 말로서 먼저 소량의 원소를 넣고 이것에 소량씩 원료를 추가해가며 배양하는 방법을 의미한다. 상기 연속식 배양은 새로운 영양배지가 계속 공급되며 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양물이 계속 제거되는 배양방법을 의미한다.
일 실시예로서, 상기 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 단일 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 단일 탄소원은 이산화탄소, 글리세롤, 글루코스, 자일로스 및 프럭토스 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 배양은 상기 탄소원외 질소원, 아미노산, 비타민 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 미생물의 배양 요건을 충족하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배지는 LB(Luria-Bertani) 배지 또는 최소 배지(Minimal medium) 배지일 수 있다. 일 실시예로서 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 일 실시예로서 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 물질이 사용될 수 있다. 일 실시예로서, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 적절한 농도의 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 양과 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 배양 단계는 상기 배지에 PHBV 생산 미생물을 접종한 후 미생물을 일정범위의 온도 및 시간에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물의 배양 온도는 20-40℃, 구체적으로는 25-35℃, 보다 구체적으로는 30℃일 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물의 배양 시간은 48 내지 120 시간일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 생산방법은 상기 배양단계 이후 생산된 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체를 배양물로부터 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 분리 단계는 정제 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예로서, 상기 분리 단계는 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 분리 방법으로는 원심분리, 초음파파쇄, 유기용매 추출, 효소적, 기계적, 화학적 추출 등의 방법이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예로서, 상기 생산되는 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체는 3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV)를 고함량으로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 PHBV 100 몰%에 대하여 30 몰% 이상, 35 몰% 이상, 40 몰% 이상, 45 몰% 이상, 50 몰% 이상, 55 몰% 이상, 60 몰% 이상, 65 몰% 이상, 70 몰% 이상, 75 몰% 이상 또는 80 몰% 이상으로 포함할 수 있다.
일 실시예에 따라 생산된 PHBV은 생체재료, 포장재 등 다양한 생분해성 플라스틱 소재로 사용가능하다. 이때, 상기 “생분해성 플라스틱”은 박테리아나 미생물 등 다른 유기 생물체에 의하여 분해될 수 있는 플라스틱으로, 사용 후에 생물학적 분해가 가능한 이산화탄소, 질소, 물, 생물유기자원(biomass), 무기 염류 등의 천연 부산물을 내놓는 고분자 종류의 하나를 의미한다.
본 개시는 기존의 폴리하이드록시부티레이트(PHB)의 높은 결정화도로 인해 강하고 부서지기 쉬운 생분해성 플라스틱의 물성 한계를 극복할 수 있는 높은 함량의 3HV를 가진 PHBV를 효율적으로 생산할 수 있으므로, 생분해성 소재 분야에 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예와 도면을 참조하여 본 개시의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 도면은 본 개시에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 개시의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV) 합성 대사경로의 도입
(i) 아세토락테이트 합성효소 alsS를 포함하는 벡터(pHV01)를 제조하기 위하여, 바실러스 서브틸리스(ATCC 23857)에서 게놈을 분리한 후 아세토락테이트 합성효소가 부호화되어 있는 유전자(Acetolactate synthase, alsS; 서열번호 1)를 분리 및 정제하였다. 상기 정제한 alsS 유전자를 도 2a에 도시된 바와 같이 L-arabinose 첨가로 araBAD 프로모터(서열번호 4)에 의한 전사가 조절되는 pBBR-MCS 플라스미드에 클로닝하였다. 상기 클로닝된 플라스미드(pHV01)를 E.coli S-17(ATCC 700926)에 열 충격 방법을 사용하여 형질전환시켰다.
(ii) 아세토락테이트 합성효소 alsS 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(bktB) 포함 벡터(pHV02)를 제조하기 위하여, 쿠프리아비두스 네카토르(ATCC 17699)에서 게놈을 분리한 후 아세토락테이트 합성효소가 부호화 되어 있는 유전자를 분리 및 정제하였다. 이때 하나의 araBAD 프로모터로 alsS와 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase; BktB) 유전자가 함께 발현될 수 있도록 유전자 염기서열 사이에 리보솜 바인딩 사이트(Ribosome binding site,RBS)(서열번호 5)를 포함하여 pBBR-MCS 플라스미드(pHV02)를 제조하였다. 상기 제조된 플라스미드(pHV02)를 E.coli S-17(ATCC 700926)에 열 충격 방법을 사용하여 형질전환시켰다.
(iii) 아세토락테이트 합성효소 (alsS), 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(bktB) 및 (R)-시트라말레이트 합성효소(leuA) 포함하는 벡터(pHV03)를 제조하기 위하여, 할로페락스 메디테라니의 게놈에서 (R)-시트라말레이트 합성효소 ((R)-citramalate synthase; leuA)가 부호화 되어 있는 유전자를 쿠프리아비두스 네카토르의 코돈 편향을 수용하여 유전자 발현을 개선하기 위해 합성 유전자를 제작하였다. 이때 하나의 araBAD 프로모터로 alsS-bktB와 leuA 유전자가 함께 발현될 수 있도록 유전자 염기서열 사이에 리보솜 바인딩 사이트(RBS)(서열번호 5)를 포함하여 pBBR-MCS 플라스미드를 제조하였다. 상기 제조된 pBBR-MCS 플라스미드(pHV03)를 E.coli S-17(ATCC 700926)에 열 충격 방법을 사용하여 형질전환시켰다.
메틸시트레이트 합성 효소 유전자의 결실 균주의 제조
prpC1 또는 prpC2 중 하나 만이 결실된 균주는 다음의 방법으로 제조하였다. 결실하고자 하는 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자인 prpC1(서열번호 6) 또는 prpC2(서열번호 7)의 각각 유전자 염기서열 앞, 뒤로 500bp의 상동 염기서열을 PCR하여 Gibson 또는 오버랩 PCR을 통해 pJQ200mp18Km 플라스미드에 클로닝하여, pJQ200mp18Km-prpC1 및 pJQ200mp18Km-prpC2를 준비하였다. 상기 pJQ200mp18Km-prpC1 또는 pJQ200mp18Km-prpC2를 사용하여 각 E.coli S17-1에 열 충격 방법을 사용하여 형질전환시킨 다음, 콘쥬게이션 방법을 통해 야생형 쿠프리아비두스 네카토르(ATCC 17699)를 형질 전환시켰다. 상기 쿠프리아비두스 네카토르는 200μg/mL 카나마이신이 포함된 LB(Luria-Bertani) 배지에서 24시간 배양했다. 그 후 0.4%(w/v) 소듐 글루코네이트, 10μg/mL 겐타마이신 및 200μg/mL의 카나마이신이 포함되어있는 최소 배지 아가 플레이트에 스프레딩(spreading)한 후 48시간동안 배양했다. 그 후 같은 단일 콜로니만을 같은 조건의 최소 배지 아가 플레이트에 스트레킹(streaking)하였다. 스트레킹한 플레이트에서 단일 콜로니를 10μg/mL 겐타마이신과 200 μg/mL의 카나마이신이 포함되어있는 5mL LB 배지에서 밤새 배양했다. 그 후 5mL 저농도 소듐 LB 배지(2.5 g/L NaCl)에 15% (w/v) 수크로스가 포함된 배지에서 밤새 배양한 후 저농도 소듐 LB 아가 플레이트에 15% (w/v) 수크로스가 포함된 아가 플레이트에 스프레딩하였다. 그 후 단일 콜로니만을 항생제가 포함된 플레이트와 포함되지 않은 플레이트에 스트레킹하였고 마지막으로 항생제가 포함되지 않은 플레이트에서 뜬 콜로니를 PCR하여 유전자가 결실되어있는지 확인하였다.
prpC1 및 prpC2 유전자가 모두 결실된 균주는 CRISPR-Cas9 방법을 사용하여 제조했다. cas9유전자는 pCas9(Addgene number 42876) 플라스미드에 있는 유전자를 pBBR-MCS 플라스미드에 클로닝하였다. 상응하는 sgRNA는 구성 프로모터(constitutive promoter, 서열번호 8)로부터 전사되었다. sgRNA는 서열번호 9로 표현되는 서열로 선정했다. 상기에서 prpC2 유전자가 결실되어있는 쿠프리아비두스 네카토르(ATCC 17699)에 pBBR-MCS-cas9-prpC1 sgRNA를 포함하는 플라스미드를 콘쥬게이션을 통해 형질 전환시킨 후, 단일 콜로니를 2mg/mL 아라비노스(arabinose)와 200μg/mL 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 배지에서 72시간에서 120시간 동안 배양했다. 그 후 같은 농도의 아라비노스와 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에 스프레딩하였다. 그리고 콜로니 PCR로 유전자 결실이 이루어졌는지 확인한 후 플라스미드를 제거해주었다.
형질전환체의 제조
상기에서 pHV01, pHV02, pHV03 플라스미드는 열 충격 방법을 이용해서 E.coli S-17에 형질전환 했다. 형질전환을 위해 각각의 플라스미드(pHV01, pHV02, pHV03) 10μl, 3차증류수 70μl와 5X KCM 완충액(0.5N KCI, 0.15M CaCl2, 0.25M MgCl2) 20μl를 E.coli 10β competent cell 100μl와 함께 EP 튜브에 넣고 랩핑하여 얼음에 10분동안 차갑게 해준다. 그 후 42℃의 heat block에 1분 30초동안 반응한 후 얼음에 15 분동안 차갑게 해준다. 그 후 1ml의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한다. 배양액을 14000rpm에서 1분간 원심분리를 하여 상층액 1ml을 제거하고 남은 상층액과 세포 펠렛들을 현탁시켜주었다. 그 후 100μl의 현탁액을 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 플레이트에 스프레딩 후 37℃에서 16시간 동안 반응하였다.
상기에서 E.coli S-17에 넣은 플라스미드는 모두 콘쥬게이션 방법을 이용해서 쿠프리아비두스 네카토르에 형질전환했다. 형질전환을 위한 플라스미드(pHV01, pHV02, pHV03)가 들어있는 E.coli S-17 균주와 쿠프리아비두스 네카토르 야생형 균주(WT) 또는 prpC1 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC1) 또는 prpC1 및 prpC2 유전자 모두가 결실된 변이 균주(△prpC1,2)를 각각 LB 배지 10ml에 넣어주고, E.coli 균주가 포함된 배지에는 카나마이신 200 μg/ml를 더 넣어주었다. 상기 E.coli S-17 균주가 포함된 배지는 37℃, 쿠프리아비두스 네카토르 야생형 균주(WT) 또는 prpC1 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC1) 또는 prpC1 및 prpC2 유전자 모두가 결실된 변이 균주(△prpC1,2)를 포함하는 배지는 30℃에서 각각 200rpm에서 20시간동안 배양해주었다. 그 후 각각 배양액 1ml을 따서 원심분리기로 14000rpm에서 1분간 실시하였다. 그 후 상등액은 버려주고 남은 세포를 NaCl 0.85% 1ml로 2번 세척 후, 마지막에 1ml로 희석해 주었다. 콘쥬게이션을 위해 E.coli S-17 세포 희석액 20μl과 쿠프리아비두스 네카토르 세포 희석액 30μl을 튜브에 함께 섞어주고 항생제가 포함되어 있지 않은 LB 플레이트에 스팟팅(spotting) 해준 후 30℃에서 24h 배양하였다. 그 후 도말봉을 이용해 세포 스팟의 반을 긁어 NaCl 0.85% 300μl에 세포를 풀어주었다. 그 후 형질전환된 쿠프리아비두스 네카토르를 선별하기 위해 카나마이신 200 μg/ml와 겐타마이신 10μg/ml을 포함하는 LB 플레이트에 스프레딩 후 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
균주의 배양방법 및 배지 조성
상기 형질전환된 쿠프리아두스 네카토르 균주를 호기성 조건에서 LB(Luria-Bertani) 배지에서 24시간 전배양(seed culture)시켰다. 그 후, 24시간 전배양한 세포를 채취한 후 최소배지(minimal medium)에 접종하고 호기성 조건에서 배양시켰다 (OD600=0.2, 30C, 200 rpm, 배양 8시간 후 0.2% L-아라비노스로 인덕션(induction), 총 96시간동안 배양). 쿠프리아두스 네카토르 균주는 모두 프럭토스(fructose) 10g/L와 카나마이신 200μg/mL을 포함하는 최소 배지에서 30℃, 200rpm조건으로 배양했다. 최종 최소배지 조성은 6.74 g/L Na2HPO4·7H2O, 1.5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L (NH4)2SO4, 80 mg/L MgSO4·7H2O, 1 mg/L CaSO4·2H2O, 0.56 mg/L NiSO4·7H2O, 0.4 mg/L FeSO4·7H2O, 및 0.5g/L NaHCO3이다.
[시험예 1]
3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV) 합성 대사경로에 도입되는 유전자 종류에 따른 차이를 확인하기 위하여, 상기 실시예에 기재된 방법에 따라 pHV01 벡터, pHV02 벡터 또는 pHV03 벡터를 각각 prpC1 유전자가 결실된 쿠프리아비두스 네카토르에 형질전환시킨 재조합 균주들을 제조하고, 이를 프럭토스를 단일 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하였다. 세포 성장 곡선을 분석하여 도 3a에 나타내었으며, 배양시 생산되는 PHBV의 함량을 분석하여 도 3b에 나타내었다.
이때, 구체적인 분석 방법은 다음과 같다.
추출
배양액을 4200rpm에서 10분간 원심분리했다. 세포 펠렛들은 -80℃ 초저온 냉동고(deep-freezer)에 24시간동안 보관후 3시간 동안 동결건조했다. 건조된 세포 펠렛들을 10mg 무게를 재어 스크류캡 배양 튜브(screw-capped culture tubes)에 넣어주었다.
가스크로마토그래피 분석을 위해 메탄올분해 방법(methanolysis method)을 이용했다. 건조 세포 10mg이 들어있는 튜브에 클로로폼과 15%(v/v) 황산이 들어있는 메탄올을 각각 1ml씩 넣고 3초간 볼텍싱해준 후 97℃ 수조에서 2시간 30분동안 반응시켰다. 반응 후에 3초간 볼텍싱해준 후 아이스에 5분동안 식혀주었다. 그 후에 3차증류수와 메틸벤조에이트 0.2%(v/v)가 들어있는 클로로폼을 각각 1ml씩 넣어준후 2400rpm에서 3분간 볼텍싱해주었다. 그 후 2000rpm에서 15분간 원심분리해주어 아래층에있는 유기용액만을 취하여 가스크로마토그래피-불꽃이온화검출기(GC-FID) 분석하였다.
GC 분석
가스크로마토그래피-불꽃이온화검출기(Agilent)에 HP-INNOWAX 컬럼 (30 m X 0.320 mm X 0.25 μm)을 사용하여 분석했다. 오븐온도는 80℃에서 2분간 홀드하고 10℃/min의 속도로 245℃까지 올렸고 1분간 홀드시간을 실행하였다. 인젝터와 디텍터 온도는 각각 250℃, 275℃로 하였다.
PHBV 및 3HV 함량 계산 방법
PHBV (3HV content 8mol %) 표준 물질을 이용하여 PHBV 및 3HV 함량을 다음과 같이 계산하였다.
[수학식 1]
본 명세서에서 “OD600”는 파장 600nm의 빛에서의 흡광도나 광학밀도(Optical density)를 뜻하는 것으로서, 분광광도계(spectrophotometer) 등과 같은 장비를 통해 측정할 수 있고, 측정된 OD600을 통해 용액이나 시료 속의 미생물이나 세포의 밀도나 농도를 확인할 수 있다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 pHV03 벡터가 도입된 균주가 AlsS, bktB 및 leuA 유전자를 모두 포함함으로써 프럭토스를 단일 탄소원으로 하는 배양조건에서 pHV02보다 잘 성장할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, pHV03 벡터가 도입된 균주가 AlsS, bktB 및 leuA 유전자를 모두 포함함으로써 세포 내 PHBV 생산 함량도 가장 높은 것으로 나타났다.
[시험예 2]
형질전환 균주에서 결실되는 메틸시트레이트 합성 효소 유전자의 종류에 따른 차이를 확인하기 위하여, 상기 실시예에 기재된 방법에 따라 pHV03 벡터를 각각 야생형 쿠프리아비두스 네카토르, prpC1 유전자가 결실된 쿠프리아비두스 네카토르, prpC2 유전자가 결실된 쿠프리아비두스 네카토르, 또는 prpC1 및 prpC2 유전자가 모두 결실된 쿠프리아비두스 네카토르에 형질전환시킨 재조합 균주들을 제조하고, 이를 프럭토스를 단일 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하였다. 세포 성장 곡선을 분석하여 도 4a에 나타내었으며, 배양시 생산되는 PHBV의 함량을 분석하여 도 4b에 나타내었다. 이때, 구체적인 분석 방법은 상기 시험예 1과 동일하다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 쿠프리아비두스 네카토르 야생형 균주(WT)와 prpC1 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC1), prpC2 유전자가 결실된 변이 균주(△prpC2)는 prpC1 및 prpC2 유전자 모두가 결실된 변이 균주(△prpC1,2)보다 균주 성장 속도는 빠른 것으로 나타났지만, 도 4b에 나타난 바와 같이 prpC1 및 prpC2 유전자 모두가 결실된 변이 균주(△prpC1,2) 균주에서 각 세포 내 PHBV 생산 함량 중 3HV의 함량이 60몰% 이상으로 prpC1 및 prpC2 중 하나만이 결실된 균주보다 현저히 높은 것으로 나타났다.
서열정보
No. 생물명정보 염기서열
1 Acetolactate synthase, alsS ttgacaaaagcaacaaaagaacaaaaatcccttgtgaaaaacagaggggcggagcttgttgttgattgcttagtggagcaaggtgtcacacatgtatttggcattccaggtgcaaaaattgatgcggtatttgacgctttacaagataaaggacctgaaattatcgttgcccggcacgaacaaaacgcagcattcatggcccaagcagtcggccgtttaactggaaaaccgggagtcgtgttagtcacatcaggaccgggtgcctctaacttggcaacaggcctgctgacagcgaacactgaaggagaccctgtcgttgcgcttgctggaaacgtgatccgtgcagatcgtttaaaacggacacatcaatctttggataatgcggcgctattccagccgattacaaaatacagtgtagaagttcaagatgtaaaaaatataccggaagctgttacaaatgcatttaggatagcgtcagcagggcaggctggggccgcttttgtgagctttccgcaagatgttgtgaatgaagtcacaaatacgaaaaacgtgcgtgctgttgcagcgccaaaactcggtcctgcagcagatgatgcaatcagtgcggccatagcaaaaatccaaacagcaaaacttcctgtcgttttggtcggcatgaaaggcggaagaccggaagcaattaaagcggttcgcaagcttttgaaaaaggttcagcttccatttgttgaaacatatcaagctgccggtaccctttctagagatttagaggatcaatattttggccgtatcggtttgttccgcaaccagcctggcgatttactgctagagcaggcagatgttgttctgacgatcggctatgacccgattgaatatgatccgaaattctggaatatcaatggagaccggacaattatccatttagacgagattatcgctgacattgatcatgcttaccagcctgatcttgaattgatcggtgacattccgtccacgatcaatcatatcgaacacgatgctgtgaaagtggaatttgcagagcgtgagcagaaaatcctttctgatttaaaacaatatatgcatgaaggtgagcaggtgcctgcagattggaaatcagacagagcgcaccctcttgaaatcgttaaagagttgcgtaatgcagtcgatgatcatgttacagtaacttgcgatatcggttcgcacgccatttggatgtcacgttatttccgcagctacgagccgttaacattaatgatcagtaacggtatgcaaacactcggcgttgcgcttccttgggcaatcggcgcttcattggtgaaaccgggagaaaaagtggtttctgtctctggtgacggcggtttcttattctcagcaatggaattagagacagcagttcgactaaaagcaccaattgtacacattgtatggaacgacagcacatatgacatggttgcattccagcaattgaaaaaatataaccgtacatctgcggtcgatttcggaaatatcgatatcgtgaaatatgcggaaagcttcggagcaactggcttgcgcgtagaatcaccagaccagctggcagatgttctgcgtcaaggcatgaacgctgaaggtcctgtcatcatcgatgtcccggttgactacagtgataacattaatttagcaagtgacaagcttccgaaagaattcggggaactcatgaaaacgaaagctctctag
2 (R)-citramalate synthase, leuA gtgaacgtacgattcgggaagacccccgagctacgcacttttgatttgggacggctgtccgttatgacactagccgacggggagcatcagcgcggcgtttggccgtcgccggtcgtgaatcagggcatcgtccgcgtgctcgcccgcgtccgcgtcgcttgcatcgtagcgggaagcgcttgcaccgttcccggcgtgcgcgaaatcatcaagcgcgtcatgtcgctggcccgcgacgtgacggtgacgagtttcgtccgcggcgtccaaagcgtcatcgtccgcgcactcgtttgcgtcgtcgtcggcatcatgcgcgtcgttccgtcgagtgaccgccacgtcgagtcgaatcgcggcatcatccgcaagggtgtcgttcagatgatcgccgtactcgtcgtgtacgccaaggaccacggcctgtgggtcgcggtcatcggcggcgtcggttgagtcgcgccgccggagtttcgcgtcgcactcgcacgaaccagccacgtcgttggggcggaccgattttgtttcgtcgtcatggtcgtccgcatcagccgcgcgcacacgtacgatgtcgtttgtcggctcgtggaactcgggccgacatcgacccacacgcacgtcgtcctcggactcgtcatggcgaacgtacgcgccagtgtggccgcgggagcggacctcgtccacgccatggtcaacggcatcggcgagcgcgtcggcaacgtcgtactcgacgcggtcgctatcgcgccggcgcactgttgcgccgccgtgtcggtgaaacagcacgaattctacgcgctggctcagaaggtcgctcactcgacgggcgtttcgcttccgccgaacaaggccgagcagcgcgcgtacgccttcacccacgaaagcggcatccacaccgacggcacgctcaaagacgacgcgatgtacgaaccctacccgccggcgtcggtgggtcgtcagcgtcgcgagctccagcgtaaacacgctggacgcgcgggtgtcaaggccgctctcgacgaacacggcgtcgacgcaaccggcgaggaagtcgccgccgtcgtcgaacgagtgaaagaactcggcgaccgcggaaaacgcgtcaccgacgccgacctcctcgcgttcgcagaagacgtacaggggcacgaacgcgaacgacaggtcgaactcctcgacctcacggccgcctccggcggcgggactccgactgcaagcgtcagactccgcgtagagggcgaagaatgcgagccctccggaattggctccggcccggttgacgccgcggtgaaagcagttcggcaggccctcggttccgacgccgacgcacaactcgacgactaccacgtcgacgccatcaccggtgggaccgacgcggtcgtcaccgtcgaagtaaccatgtctcacggcgaccgaagcgagccagtcgccgccgcgtacgcggacatcacccgtgcgagcgtgcaggcgatggagcatgcgctcgaccgacttctcgcgccgggccataccgctgcgtcaccagcatcggccgacgactga
3 Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB atgacgcgtgaagtggtagtggtaagcggtgtccgtaccgcgatcgggacctttggcggcagcctgaaggatgtggcaccggcggagctgggcgcactggtggtgcgcgaggcgctggcgcgcgcgcaggtgtcgggcgacgatgtcggccacgtggtattcggcaacgtgatccagaccgagccgcgcgacatgtatctgggccgcgtcgcggccgtcaacggcggggtgacgatcaacgcccccgcgctgaccgtgaaccgcctgtgcggctcgggcctgcaggccattgtcagcgccgcgcagaccatcctgctgggcgataccgacgtcgccatcggcggcggcgcggaaagcatgagccgcgcaccgtacctggcgccggcagcgcgctggggcgcacgcatgggcgacgccggcctggtcgacatgatgctgggtgcgctgcacgatcccttccatcgcatccacatgggcgtgaccgccgagaatgtcgccaaggaatacgacatctcgcgcgcgcagcaggacgaggccgcgctggaatcgcaccgccgcgcttcggcagcgatcaaggccggctacttcaaggaccagatcgtcccggtggtgagcaagggccgcaagggcgacgtgaccttcgacaccgacgagcacgtgcgccatgacgccaccatcgacgacatgaccaagctcaggccggtcttcgtcaaggaaaacggcacggtcacggccggcaatgcctcgggcctgaacgacgccgccgccgcggtggtgatgatggagcgcgccgaagccgagcgccgcggcctgaagccgctggcccgcctggtgtcgtacggccatgccggcgtggacccgaaggccatgggcatcggcccggtgccggcgacgaagatcgcgctggagcgcgccggcctgcaggtgtcggacctggacgtgatcgaagccaacgaagcctttgccgcacaggcgtgcgccgtgaccaaggcgctcggtctggacccggccaaggttaacccgaacggctcgggcatctcgctgggccacccgatcggcgccaccggtgccctgatcacggtgaaggcgctgcatgagctgaaccgcgtgcagggccgctacgcgctggtgacgatgtgcatcggcggcgggcagggcattgccgccatcttcgagcgtatctga
4 araBAD promoter aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggattctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccat
5 Ribosome binding site ACAACCAAAGGAGGACAACC
6 methyl citrate synthase prpC1 atgtccgaagcgcaaccgctcgtcactcccaagcccaagaaatccgtcgccctgtcgggcgtgaccgccggcaataccgcgctgtgcaccgtcggccgcactggcaacgacctgcactaccgcggctacgacatcctcgacatcgccgagacctgcgagttcgaggaaatcgcccacctgctggtgcacggcaagctgccgaccaaatccgaactggccgcctacaaggccaagctcaagagcctgcgcggcctgcccgccaatgtgaaggccgcgttggaatgggtgcccgccagcgcccacccgatggacgtgatgcgcaccggcgtgtcggtgctgggcaccgtgctgccggagaaggaagaccacaacaccccgggcgcgcgcgacattgccgaccggctgatggccagcctcggctcgatgctgctgtactggtaccactacagccacaacggccgccgtatcgaagtcgaaaccgacgatgactccatcggcggccacttcctgcacctgctgcacggcgagaagccgtcggcgctgtgggagcgcgccatgaacacctcgctcaacctgtacgccgagcacgagttcaacgcctcgaccttcaccgcccgcgtgatcgccggcacgggctcggacatgtattcgtcgatcagcggcgccatcggcgcactgcgcggccccaagcacggcggcgccaatgaagtcgcgttcgagatccagaagcgctacgacaaccccgacgaggcccaggccgacatcacgcgccgcgtcgagaacaaggaagtcgtgatcggcttcggccacccggtgtacaccaccggcgacccgcgcaaccaggtgatcaaggaagtggcgaagaagctgtcgaaggatgccggctcgatgaagatgtttgacatcgccgagcgcctggaaacggtgatgtgggacatcaagaagatgttcccgaacctggactggttcagcgcggtgagctaccacatgatgggcgtgccgacggcgatgttcacgccgctgttcgtgatcgcgcgtacttcgggctgggccgcgcacattatcgagcagcgcatcgacaacaagatcatccgcccgagcgccaactacaccggtccggagaacctgaagttcgtgccgctgaaggatcgcaagtaa
7 methyl citrate synthase prpC2 atgtccgcctcgaagttcgccgcacccgacgctgcacccgacgccacggccagcgagccggccgcgccccgggtcaagaaatccgtcgccctgtcgggcgtgaccgccggcaataccgcgctgtgcaccgtcggccgcaccggcaacgacctgcactaccgcggctacgacatcctcgacatcgccgagacctgcgagttcgaggaaatcgcccacctgctggtacacggcaagctgccgaccaaatccgaactggccgcctacaaggccaagctcaagagcctgcgcggcctgcccgccaatgtgaaggccgcgttggaatgggtgcccgccagcgcccacccgatggacgtgatgcgcaccggcgtgtcggtgctgggcaccgtgctgccggagaaggaagaccacaacaccccgggcgcgcgcgacattgccgaccggctgatggccagcctcggctcgatgctgctgtactggtaccactacagccacaacggccgccgtatcgaagtcgaaaccgacgatgactccatcggcggccacttcctgcacctgctgcacggcgagaagccgtcggcgctgtgggagcgcgccatgcacacctcgctcaacctgtacgccgagcacgagttcaacgcctcgaccttcaccgcccgcgtgatcgccggcacgggctcggacatgtattcgtcgatcagcggcgccatcggcgcgctgcgcggccccaagcacggcggcgccaatgaagtcgcgttcgagatccagaagcgctacgacaaccccgacgaggcccaggccgacatcacgcgccgcgtcgggaacaaggaagtcgtgatcggcttcggccacccggtgtacaccaccggcgacccgcgcaaccaggtgatcaaggaagtggcgaagaagctgtctaaggatgccggctcgatgaagatgttcgacatcgccgagcgcctggaaacggtgatgtgggacatcaagaagatgttcccgaacctggactggttcagcgcggtgagctaccacatgatgggcgtgccgacggcgatgttcacgccgctgttcgtgatcgcgcgtacttcgggctgggccgcgcacattatcgagcagcgcatcgacaacaagatcatccgcccgagcgccaactacaccggtccggagaacctgaagttcgtgccgatcggcaagcgcaagtga
8 constitutive promoter ctaggtttatacataggcgagtactctgttatggagtcagatcttagc
9 sgRNA tcggctcgatgctgctgtac
<110> Korea Institute of Science of Technology <120> Recombinant microorganism for producing poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) <130> 22p062ind <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetolactate synthase, alsS <400> 1 ttgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60 gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120 gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180 caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240 ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300 gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360 acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420 gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480 gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540 acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600 agtgcggcca 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540 ctgtgggagc gcgccatgaa cacctcgctc aacctgtacg ccgagcacga gttcaacgcc 600 tcgaccttca ccgcccgcgt gatcgccggc acgggctcgg acatgtattc gtcgatcagc 660 ggcgccatcg gcgcactgcg cggccccaag cacggcggcg ccaatgaagt cgcgttcgag 720 atccagaagc gctacgacaa ccccgacgag gcccaggccg acatcacgcg ccgcgtcgag 780 aacaaggaag tcgtgatcgg cttcggccac ccggtgtaca ccaccggcga cccgcgcaac 840 caggtgatca aggaagtggc gaagaagctg tcgaaggatg ccggctcgat gaagatgttt 900 gacatcgccg agcgcctgga aacggtgatg tgggacatca agaagatgtt cccgaacctg 960 gactggttca gcgcggtgag ctaccacatg atgggcgtgc cgacggcgat gttcacgccg 1020 ctgttcgtga tcgcgcgtac ttcgggctgg gccgcgcaca ttatcgagca gcgcatcgac 1080 aacaagatca tccgcccgag cgccaactac accggtccgg agaacctgaa gttcgtgccg 1140 ctgaaggatc gcaagtaa 1158 <210> 7 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methyl citrate synthase prpC2 <400> 7 atgtccgcct cgaagttcgc cgcacccgac gctgcacccg acgccacggc cagcgagccg 60 gccgcgcccc gggtcaagaa atccgtcgcc ctgtcgggcg tgaccgccgg caataccgcg 120 ctgtgcaccg tcggccgcac cggcaacgac ctgcactacc gcggctacga catcctcgac 180 atcgccgaga cctgcgagtt cgaggaaatc gcccacctgc tggtacacgg caagctgccg 240 accaaatccg aactggccgc ctacaaggcc aagctcaaga gcctgcgcgg cctgcccgcc 300 aatgtgaagg ccgcgttgga atgggtgccc gccagcgccc acccgatgga cgtgatgcgc 360 accggcgtgt cggtgctggg caccgtgctg ccggagaagg aagaccacaa caccccgggc 420 gcgcgcgaca ttgccgaccg gctgatggcc agcctcggct cgatgctgct gtactggtac 480 cactacagcc acaacggccg ccgtatcgaa gtcgaaaccg acgatgactc catcggcggc 540 cacttcctgc acctgctgca cggcgagaag ccgtcggcgc tgtgggagcg cgccatgcac 600 acctcgctca acctgtacgc cgagcacgag ttcaacgcct cgaccttcac cgcccgcgtg 660 atcgccggca cgggctcgga catgtattcg tcgatcagcg gcgccatcgg cgcgctgcgc 720 ggccccaagc acggcggcgc caatgaagtc gcgttcgaga tccagaagcg ctacgacaac 780 cccgacgagg cccaggccga catcacgcgc cgcgtcggga acaaggaagt cgtgatcggc 840 ttcggccacc cggtgtacac caccggcgac ccgcgcaacc aggtgatcaa ggaagtggcg 900 aagaagctgt ctaaggatgc cggctcgatg aagatgttcg acatcgccga gcgcctggaa 960 acggtgatgt gggacatcaa gaagatgttc ccgaacctgg actggttcag cgcggtgagc 1020 taccacatga tgggcgtgcc gacggcgatg ttcacgccgc tgttcgtgat cgcgcgtact 1080 tcgggctggg ccgcgcacat tatcgagcag cgcatcgaca acaagatcat ccgcccgagc 1140 gccaactaca ccggtccgga gaacctgaag ttcgtgccga tcggcaagcg caagtga 1197 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constitutive promoter <400> 8 ctaggtttat acataggcga gtactctgtt atggagtcag atcttagc 48 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 9 tcggctcgat gctgctgtac 20

Claims (12)

  1. 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되고,
    메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자 prpC1 및 prpC2가 결실된,
    재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 재조합 쿠프리아비더스 네카투르(Cupriavidus necator)인, 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 것인, 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase) 인코딩 유전자는 할로페락스 메디테라니(Haloferax mediterranei, leuA) 유래의 것인, 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자는 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)유래의 것인, 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 단일 탄소원을 포함하는 배지에서 배양되는 것인, 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV)의 생산용인, 재조합 미생물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물의 제조방법으로,
    아세토락테이트 합성효소(Acetolactate synthase, alsS) 인코딩 유전자, (R)-시트라말레이트 합성효소((R)-citramalate synthase, leuA) 인코딩 유전자 및 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이스(Acetyl-CoA acetyltransferase, BktB) 인코딩 유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계;
    모균주에서 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자 prpC1 및 prpC2를 결실시키는 단계; 및
    상기 메틸시트레이트 합성 효소 인코딩 유전자가 결실된 모균주에 상기 벡터를 삽입하여 형질전환시키는 단계;
    를 포함하는, 재조합 미생물의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV)의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양 단계는 상기 재조합 미생물을 단일 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단일 탄소원은 이산화탄소, 글루코스, 자일로스, 프럭토스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 생산방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 제조되는 폴리하이드록시부티레이트-코-하이드록시발러레이트 공중합체는 3-하이드록시발러레이트(3-hydroxyvalerate, 3HV)를 30 몰% 이상 포함하는 것인, 생산방법.
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Chen et al., Production in Escherichia coli of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) with differing monomer compositions from unrelated carbon sources. Applied and Environmental Microbiology, 2011. 77:4886-4893
Zhang et al., Engineering of Ralstonia eutropha for the production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from glucose. Journal of Biotechnology, 2015 195:82-88

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