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KR20230124973A - 인간화 tslp 유전자, 인간화 tslp 수용체 유전자, 및/또는인간화 il7ra 유전자를 갖는 비인간 동물 - Google Patents

인간화 tslp 유전자, 인간화 tslp 수용체 유전자, 및/또는인간화 il7ra 유전자를 갖는 비인간 동물 Download PDF

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KR20230124973A
KR20230124973A KR1020237024353A KR20237024353A KR20230124973A KR 20230124973 A KR20230124973 A KR 20230124973A KR 1020237024353 A KR1020237024353 A KR 1020237024353A KR 20237024353 A KR20237024353 A KR 20237024353A KR 20230124973 A KR20230124973 A KR 20230124973A
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KR
South Korea
Prior art keywords
rodent
il7ra
gene
human
tslp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020237024353A
Other languages
English (en)
Inventor
야준 탕
수잔나 브릿지스
수바시니 스리밧산
데이버 프리에타
케이건 규레르
앤드류 제이. 머피
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하도록 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어 마우스 및 랫트, 이에 한정되지는 않음)가 본원에 개시된다. 이러한 유전적으로 변형된 설치류를 제조하기 위한 조성물 및 방법뿐만 아니라, 이러한 유전적으로 변형된 설치류를 알레르기성 질환 및 암과 같은 질환의 동물 모델로서 사용하는 방법도 제공된다.

Description

인간화 TSLP 유전자, 인간화 TSLP 수용체 유전자, 및/또는 인간화 IL7RA 유전자를 갖는 비인간 동물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/128,258호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
2021년 12월 2일에 생성되어 EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 37301_10589WO01_SequenceListing으로 명명된 192 KB의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로써 본원에 포함된다.
흉선 기질 림포포이에틴(TSLP)은 TSLP에 특이적인 사슬("TSLPR" 또는 "Tslpr"로 지칭됨) 및 IL7 수용체 a 사슬로 구성된 이종이량체 수용체를 통해 작용하며, 알레르기 질환 및 특정 암에 관여한다. 알레르기성 질환 및 암의 발병기전을 더 잘 이해하고 치료제를 개발하기 위한 효과적인 생체내 시스템이 요구된다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자를 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 설치류 동물이 본원에 개시되며, 여기서 인간화 Tslp 유전자는 설치류 Tslp 핵산 서열 및 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하고, 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 설치류 Tslp 단백질, 예를 들어 내인성 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열, 예를 들어 인간 TSLP 단백질(예를 들어, 서열번호 3에 제시된 인간 TSLP 단백질)의 아미노산 29~159를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslp 핵산 서열은 설치류 Tslp 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Tslp 유전자(예: 내인성 설치류 Tslp 유전자)의 엑손 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 핵산 서열은 마우스 Tslp 유전자의 엑손 1, 및 신호 펩티드 아미노산을 암호화하는 엑손 2의 5’ 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslp 핵산 서열은 설치류 Tslp 유전자(예: 내인성 설치류 Tslp 유전자)의 3’ UTR을 또한 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 인간화 Tslp 유전자는 (i) 마우스 Tslp 유전자의 엑손 1, 및 신호 펩티드 아미노산을 코딩하는 엑손 2의 5’ 부분; 및 (ii) 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 마우스 Tslp 유전자의 3’ UTR을 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 마우스 Tslp 유전자는 내인성 마우스 Tslp 유전자이다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 프로모터와 같은 설치류 Tslp 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌 이외의 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 위치한다.
인간화 Tslp 유전자가 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 위치하는 구현예 중 일부에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 게놈 DNA를 인간 TSLP 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 단백질의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는 인간 TSLP 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 치환되는 마우스 게놈 DNA는 성숙한 마우스 Tslp 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 2 내 코돈에서부터 내인성 마우스 Tslp 유전자의 엑손 5 내 종결 코돈까지 포함하고, 인간 게놈 DNA는 성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1 내 코돈에서부터 인간 TSLP 유전자의 엑손 4 내 종결 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslp 유전자에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslp 유전자에 대해 이형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 설치류 동물에서 인간화 Tslp 유전자로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 그의 게놈에 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 인간화 Tslp 유전자를 포함하는 게놈을 가진 단리된 설치류 조직 또는 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 난자 또는 정자이다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 조직 또는 세포는 마우스 조직 또는 세포이거나 랫트 조직 또는 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 인간화 Tslp 유전자를 포함하는 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 설치류 게놈이 인간화 Tslp 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계(여기서 인간화 Tslp 유전자는 설치류 Tslp 핵산 서열 및 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하고, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 암호화함); 및 변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 게놈을 변형시키는 단계는 다음 단계를 포함한다: 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내로 도입하는 단계; 설치류 Tslp 게놈 DNA와 치환할 인간 TSLP 핵산 서열이 내인성 Tslp 유전자좌에 통합된 설치류 ES 세포를 수득하여 인간화 Tslp 유전자를 형성하는 단계; 및 수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, ES 세포 내로 도입된 핵산 분자는 인간 TSLP 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하며, 여기서 5’ 및 3’ 상동 아암은 치환될 설치류 Tslp 게놈 DNA의 측면에 위치하는 내인성 설치류 유전자좌에 있는 핵산 서열과 상동이다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 프로모터, 예를 들어 내인성 설치류 Tslp 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 표적화 핵산 작제물이 본원에 개시되며, 상기 작제물은 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 유전자에 통합될 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하고, 상기 내인성 설치류 Tslp 유전자좌의 측면에는 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열과 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하며, 여기서 인간 TSLP 핵산 서열을 설치류 Tslp 유전자에 통합하면 설치류 Tslp 게놈 DNA가 인간 TSLP 핵산 서열과 치환되어 인간화 Tslp 유전자가 형성되고, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 표적화 핵산의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 TSLP 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Tslp 게놈 DNA를 인간 TSLP 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Tslp 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자를 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 설치류 동물이 본원에 개시되며, 여기서 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 핵산 서열 및 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하고, 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질(예: 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질(예: 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 동일한 막관통-세포질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질(예: 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자 내 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자 내 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR(예를 들어 서열번호 23에 제시된 것과 같은 인간 TSLPR)의 아미노산 29~231을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질의 엑손 2에서부터 엑토도메인 아미노산을 암호화하는 엑손 6 내 마지막 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자 내 설치류 Tslpr 핵산 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 설치류 Tslpr 유전자의 엑손 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 설치류 Tslpr 핵산 서열은 마우스 Tslpr 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 막관통 도메인의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 6 내 코돈에서부터 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslpr 핵산 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Tslp 유전자의 엑손 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 설치류 핵산 서열은 마우스 Tslpr 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 엑손 1을 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 인간화 Tslpr 유전자는 (i) 마우스 Tslpr 유전자(예: 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 엑손 1, (ii) 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈까지; 및 (iii) 마우스 Tslpr 유전자의 막관통 도메인의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈에서부터 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 프로모터와 같은 설치류 Tslpr 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌 이외의 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 위치한다.
인간화 Tslpr 유전자가 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 위치하는 구현예 중 일부에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 인간 TSLPR 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLPR 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 치환되는 마우스 게놈 DNA는 내인성 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈까지 포함하고, 인간 게놈 DNA는 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslpr 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslpr 유전자에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 폴리펩티드는 설치류 동물에서 인간화 Tslpr 유전자로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 그의 게놈에 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 인간화 Tslpr 유전자를 포함하는 게놈을 가진 단리된 설치류 조직 또는 세포가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 난자 또는 정자이다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 조직 또는 세포는 마우스 조직 또는 세포이거나 랫트 조직 또는 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 인간화 Tslpr 유전자를 포함하는 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 설치류 게놈이 인간화 Tslpr 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계(여기서 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 핵산 서열 및 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하고, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 암호화함); 및 변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 게놈을 변형시키는 단계는 다음 단계를 포함한다: TSLPR 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내로 도입하는 단계; 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 치환할 인간 TSLPR 핵산 서열이 내인성 Tslpr 유전자좌에 통합된 설치류 ES 세포를 수득하여 인간화 Tslpr 유전자를 형성하는 단계; 및 수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, ES 세포 내로 도입된 핵산 분자는 인간 TSLPR 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하며, 여기서 5’ 및 3’ 상동 아암은 치환될 설치류 Tslpr 게놈 DNA의 측면에 위치하는 내인성 설치류 유전자좌에 있는 핵산 서열과 상동이다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 프로모터, 예를 들어 내인성 설치류 Tslp 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 표적화 핵산 작제물이 본원에 개시되며, 상기 작제물은 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 유전자에 통합될 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하고, 상기 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌의 측면에는 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열과 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하며, 여기서 인간 TSLPR 핵산 서열을 설치류 Tslpr 유전자에 통합하면 설치류 Tslpr 게놈 DNA가 인간 TSLPR 핵산 서열과 치환되어 인간화 Tslp 유전자가 형성되고, 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 표적화 핵산의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 TSLPR 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslpr 유전자에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 TSLP 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 인간 TSLPR 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Tslpr 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자를 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 설치류 동물이 본원에 개시되며, 여기서 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 핵산 서열 및 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하고, 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질(예: 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질(예: 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열과 동일한 막관통-세포질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 내 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자의 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 21~236을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1 내 코돈에서부터 엑손 5까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 내 설치류 Il7ra 핵산 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 설치류 Il7ra 핵산 서열은 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 6에서부터 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 내 설치류 Il7ra 핵산 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 엑손 1의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 설치류 핵산 서열은, 5’ UTR을 모두 포함하고 마우스 Il7ra의 신호 펩티드를 암호화하는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 1의 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 인간화 Il7ra 유전자는 (i) 마우스 Il7ra 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 1의 일부; (ii) 인간 IL7RA 유전자의 성숙한 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지; 및 (iii) 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 6에서부터 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 프로모터와 같은 설치류 Il7ra 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌 이외의 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 위치한다.
인간화 Il7ra 유전자가 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 위치하는 구현예 중 일부에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 인간 IL7RA 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 핵산으로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 마우스이고, 여기서 치환되는 마우스 게놈 DNA는 성숙한 마우스 단백질 서열의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 내인성 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 5까지 포함하고, 인간 게놈 DNA는 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 인간 IL7RA 유전자의 엑손 5까지 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Il7ra 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Il7ra 유전자에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 폴리펩티드는 설치류 동물에서 인간화 Il7ra 유전자로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 설치류 동물은 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 또는 이들의 조합을 그의 게놈에 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Il7ra 유전자를 포함하는 게놈을 가진 단리된 설치류 세포 또는 조직이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 난자 또는 정자이다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 조직 또는 세포는 마우스 조직 또는 세포이거나 랫트 조직 또는 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 인간화 Il7ra 유전자를 포함하는 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 설치류 게놈이 인간화 Il7ra 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계(여기서 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 핵산 서열 및 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하고, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 암호화함); 및 변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 게놈을 변형시키는 단계는 다음 단계를 포함한다: 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈 내로 도입하는 단계; 설치류 Il7ra 게놈 DNA와 치환할 인간 IL7RA 핵산 서열이 내인성 Tslp 유전자좌에 통합된 설치류 ES 세포를 수득하여 인간화 Il7ra 유전자를 형성하는 단계; 및 수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, ES 세포 내로 도입된 핵산 분자는 인간 IL7RA 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하며, 여기서 5’ 및 3’ 상동 아암은 치환될 설치류 Il7ra 게놈 DNA의 측면에 위치하는 내인성 설치류 유전자좌에 있는 핵산 서열과 상동이다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 프로모터, 예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 표적화 핵산 작제물이 본원에 개시되며, 상기 작제물은 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 유전자에 통합될 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하고, 상기 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌의 측면에는 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열과 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하며, 여기서 인간 IL7RA 핵산 서열을 설치류 Il7ra 유전자에 통합하면 설치류 Il7ra 게놈 DNA가 인간 IL7RA 핵산 서열과 치환되어 인간화 Il7ra 유전자가 형성되고, 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 표적화 핵산의 일부 구현예에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 IL7RA 핵산 서열을 내인성 설치류 Il7ra 유전자에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 인간 IL7RA 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Il7ra 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Sirpα 유전자, 내인성 RAG2 유전자의 파괴, 내인성 IL-2RG 유전자의 파괴, 인간화 Tpo 유전자, 및 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌와 같은 하나 이상의 추가 유전자 변형을 이들의 게놈에 포함한다. 설치류는 이러한 추가 유전자 변형 중 어느 하나에 대해 이형접합체이거나 동형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 이형접합체이거나 동형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자 및 인간화 Tslpr 유전자, 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 동형접합체이거나 이형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 동형접합체이거나 이형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 하나 이상의 추가 유전자 변형을 임의로 포함하는, 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 유전적으로 변형된 설치류 동물은 알레르기성 질환(예를 들어 기도염 또는 피부염) 또는 암의 설치류 동물 모델을 제조하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 알레르기성 병태를 치료하기 위한 후보 제제를 시험하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 유전적으로 변형된 설치류 동물에서 알레르기성 병태를 유발하는 단계, 설치류 동물에게 후보 제제를 투여하는 단계; 및 후보 제제가 설치류 동물에서 알레르기성 병태를 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 암을 치료하기 위한 후보 제제를 시험하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 유전적으로 변형된 설치류 동물에게 인간 암세포를 이식하는 단계, 설치류 동물에게 후보 제제를 투여하는 단계; 및 후보 제제가 설치류 동물에서 암세포의 성장을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 Th2 유발암이며, 여기에는 예를 들어 유방암, 폐암, 및 췌장암이 포함된다.
본 특허 또는 출원의 파일은 컬러로 작업된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 사본은 요청 시 필요한 수수료를 납부하면 특허청에서 제공될 것이다.
본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 여러 가지 구현예를 도시하며, 개시된 조성물 및 방법을 설명과 함께 도시한다.
도 1a는 마우스 Tslp 유전자좌를 인간화하기 위한 전략의 예시적인 구현예를 도시한다. 마우스 Tslp 유전자 및 인간 TSLP 유전자는 수평선으로 표시되고, 이들의 엑손은 선 위에 놓인 박스로 표시된다. 내인성 마우스 Tslp 유전자좌에서, 아미노산 20을 암호화하는 엑손 2의 코돈에서 시작하여 엑손 5의 종결 코돈까지의 3486 bp의 연속 마우스 Tslp 게놈 단편은 아미노산 29를 암호화하는 인간 TSLP 엑손 1의 코돈에서 시작하여 엑손 4의 종결 코돈까지의 4100 bp의 인간 TSLP 게놈 단편으로 치환된다. 이러한 치환은 마우스 Tslp 신호 펩티드 및 인간 성숙한 TSLP 폴리펩티드를 포함하는 마우스-인간 하이브리드(“인간화”) Tslp 단백질을 생성한다. 도 1d 및 1f도 참조.
도 1b는 마우스 TSLP 유전자좌를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 마우스 Tslp 유전자좌를 포함하는 핵산, 및 인간화 마우스 Tslp 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물의 예시적인 구현예를 도시한 것으로서, 여기서 마우스 Tslp 유전자좌에 있는 3.49 kB의 마우스 게놈 단편은 다음을 포함하는 인간화 단편으로 치환된 것이다: 1.9 kb의 인간 게놈 단편 1(아미노산 29를 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 인간 TLSP의 엑손 3의 3’ 단부 이후 257 bp까지); loxP가 측면에 위치한 4.4 kb의 HUb-Puro 카세트(인간 TLSP 인트론 3에 삽입됨); 및 2.2 kb의 인간 게놈 단편 2(엑손 3의 단부 이후 258 bp에서부터 인간 TLSP의 엑손 4의 종결 코돈까지). 표적화 작제물 내 인간화 단편의 측면에는 114.3 kb의 마우스 5’ 상동 아암 및 65.3 kb의 마우스 3’ 상동 아암이 위치한다. 인간화 마우스 Tslp 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물은 마우스 게놈의 마우스 Tslp 유전자 내로 표적화된 삽입을 위해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 정확한 표적화를 확인하기 위한 인간 대립유전자 획득 및 마우스 대립유전자 상실 검정에 사용된 프라이머와 프로브의 위치도 표시되어 있다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 6에 제시되어 있다.
도 1c는 마우스 TSLP 대립유전자를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 및 도 1b에 대해 위에 기술된 마우스 Tslp 게놈 단편을 다음을 포함하는 인간화 단편으로 치환함으로써 생성된, MAID #7466으로 명명된 인간화 Tslp 대립유전자의 예시적인 구현예를 도시한 것이다: 인간 게놈 단편 1, loxP가 측면에 위치한 HUb-Puro 카세트, 및 인간 게놈 단편 2. loxP가 측면에 위치한 HUb-Puro 카세트가 제거된 후의 인간화 Tslp 대립유전자는 MAID# 7467로 명명된다.
도 1d는 마우스 Tslp의 단백질 서열(서열번호 1), 인간 TSLP 이소형 1의 단백질 서열(서열번호 3)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Tslp의 단백질 서열(서열번호 5)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)의 예시적인 구현예를 보여준다. 신호 펩티드는 각각의 단백질 서열에서 밑줄이 그어져 있다.
도 1e는 마우스 Tslp의 mRNA 서열(서열번호 2), 인간 TSLP 이소형 1의 mRNA 서열(서열번호 4)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Tslp의 mRNA 서열(서열번호 6)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)의 예시적인 구현예를 보여준다. 신호 펩티드를 암호화하는 부분은 각각의 mRNA에서 밑줄이 그어져 있다.
도 1f는 마우스 Tslp 단백질 서열(“mTslp”, 서열번호 1), 인간 TSLP 이소형 1 단백질 서열(“hTSLP”, 서열번호 3), 및 인간화(하이브리드) Tslp 단백질 서열(서열번호 5)의 예시적인 구현예들의 정렬을 보여준다. 단백질의 신호 펩티드는 박스로 표시되어 있다. 인간화(하이브리드) Tslp 단백질을 형성할 때 마우스 서열과 인간 서열 간의 접합부는 분자의 5’(N-말단) 및 3’(C-말단)에 화살표로 표시되어 있다. 삼각형은, loxP가 옆에 위치한 HUb-Puro 카세트가 삽입되는 인간 인트론 3(2429 bp)의 위치를 나타낸다.
도 1g는, 예시적인 구현예에서, 실시예 1에 기술된 것과 같이 Tslp 인간화에 대해 이형접합성인 마우스가, 인간화가 없는 마우스가 음성 대조군이고(좌측) 정상 인간 혈청이 양성 대조군일 때(우측), 마우스 혈청(중간)에서 성숙한 인간 TSLP 단백질을 발현했음을 보여준다. 각각의 점은 하나의 마우스를 나타낸다.
도 2a는 마우스 Tslpr 유전자좌를 인간화하기 위한 전략의 예시적인 구현예를 도시한다. 마우스 Tslpr 유전자 및 인간 TSLPR 유전자는 수평선으로 표시되고, 이들의 엑손은 선 위에 놓인 박스로 표시된다. 내인성 마우스 Tslpr 유전자좌에서, 엑손 2 이전 328 bp에 있는 인트론 1에서 시작하여 엑손 6의 47번째 bp에서 끝나는, 2362 bp의 연속 마우스 Tslpr 게놈 단편은 엑손 2 이전 909 bp에 있는 인트론 1에서 시작하여 엑손 6의 47번째 bp에서 끝나는 13743 bp의 인간 TSLPR 게놈 단편으로 치환된다. 이러한 치환은 마우스 Tslpr의 아미노산 27 내지 243을 결실시키지만, 마우스 Tslpr 신호 펩티드(아미노산 1~19), 마우스 Tslpr 성숙한 단백질의 첫 7개의 아미노산, 및 마우스 Tslpr 막관통 도메인(아미노산 244~264)과 세포내 도메인을 보존하며, 인간 TSLPR 엑토도메인의 실질적인 부분(아미노산 27에서 시작하여 아미노산 232~252의 인간 막관통 도메인 직전의 아미노산 231에서 끝남)을 삽입한다. 도 2d를 또한 참조한다.
도 2b는 마우스 Tslpr 유전자좌를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 마우스 Tslpr 유전자좌를 포함하는 핵산, 및 인간화 마우스 Tslpr 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물의 예시적인 구현예를 도시한 것으로서, 여기서 마우스 Tslpr 유전자좌에 있는 2.36 kB의 마우스 게놈 단편은 LoxP가 측면에 위치한 4.8 kb의 HUb-Neo 카세트 및 13.7 kb의 인간 게놈 단편(인간 TSLPR의 인트론 1의 3’ 부분, 엑손 2 내지 엑손 6의 47번째 bp까지 포함함)을 포함하는 인간화 단편으로 치환된 것이다. 표적화 작제물 내 인간화 단편의 측면에는 29.1 kb의 마우스 5’ 상동 아암(마우스 Tslpr의 엑손 2 이전 328 bp까지) 및 133.2 kb의 마우스 3’ 상동 아암(마우스 Tslpr의 엑손 6의 48번째 bp에서부터 엑손 8까지, 이어서 마우스 3’ 게놈 서열)이 위치한다. 인간화 마우스 Tslpr 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물은 마우스 게놈 내로의 표적화된 삽입을 위해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 정확한 표적화를 확인하기 위한 인간 대립유전자 획득 및 마우스 대립유전자 상실 검정에 사용된 프라이머와 프로브의 위치도 표시되어 있다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 9에 제시되어 있다.
도 2c는 마우스 TSLP 대립유전자를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 및 도 2b에 대해 위에 기술된 마우스 Tslpr 게놈 단편을 4.8 kb의 Floxed HUb-Neo 카세트 및 13743 bp의 인간 TSLPR 게놈 단편을 포함하는 인간화 단편과 치환함으로써 생성된, MAID #7558로 명명된 인간화 Tslpr 대립유전자의 예시적인 구현예를 도시한 것이다. Floxed HUb-Neo 카세트가 제거된 후의 인간화 Tslpr 대립유전자는 MAID# 7559로 명명된다.
도 2d는 마우스 Tslpr의 단백질 서열(서열번호 21), 인간 TSLPR의 단백질 서열(서열번호 23)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Tslpr의 단백질 서열(서열번호 25)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)의 예시적인 구현예를 보여준다. 신호 펩티드(“SP”) 및 막관통 분절(“TM”)은 각각의 단백질 서열에서 밑줄이 그어져 있다.
도 2e는 마우스 Tslpr의 mRNA 서열(서열번호 22), 인간 TSLPR의 mRNA 서열(서열번호 24)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Tslpr의 mRNA 서열(서열번호 26)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)의 예시적인 구현예를 보여준다. 신호 펩티드 및 막관통 분절을 암호화하는 각각의 부분은 각각의 mRNA에서 밑줄이 그어져 있다.
도 2f는 마우스 Tslpr(“mTslpr”, 서열번호 21), 인간 TSLP(“hTSLPR”, 서열번호 23), 및 인간화(하이브리드) Tslpr(서열번호 25)의 예시적인 구현예들의 정렬을 보여준다. 단백질의 신호 펩티드는 파선으로 그려진 박스로 표시되어 있다. 막관통 도메인은 실선으로 그려진 박스로 표시되어 있다. 인간화(하이브리드) Tslpr 단백질을 형성할 때 마우스 서열과 인간 서열 간의 접합부는 분자의 5’(인트론 1 내) 및 3’(엑손 6 내)에 삼각형으로 표시되어 있다.
도 3a는 마우스 Il7ra 유전자좌를 인간화하기 위한 전략의 예시적인 구현예를 도시한다. 마우스 Il7ra 유전자 및 인간 IL7RA 유전자는 수평선으로 표시되고, 이들의 엑손은 선 위에 놓인 박스로 표시된다. 내인성 마우스 Il7ra 유전자좌에서, 엑손 1의 코딩 서열 내 69번째 bp에서 시작하여 인트론 5의 5’ 부분까지, 19235 bp의 연속 마우스 Il7ra 게놈 단편은 엑손 1의 코딩 서열 내 69번째 bp에서부터 인트론 5의 5’ 부분까지를 포함하는 17232 bp의 인간 IL7RA 게놈 단편으로 치환된다. 이러한 치환은, 마우스 IL7ra 신호 펩티드, (마지막 2개의 아미노산인 Gly-Trp을 제외하고는) 실질적으로 인간인 엑토도메인, 및 마우스 Il7ra의 막관통 및 세포내 도메인을 포함하는 마우스-인간 하이브리드(“인간화”) Tslp 단백질을 생성한다. 도 3d를 또한 참조한다.
도 3b는 마우스 IL7ra 유전자좌를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 마우스 IL7ra 유전자좌를 포함하는 핵산, 및 마우스 IL7ra 유전자좌에서 19.2 kB의 마우스 게놈 단편이 다음을 포함하는 인간화 단편으로 치환된 인간화 마우스 IL7ra 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물의 예시적인 구현예를 도시한다: 126 bp의 인간 게놈 단편 1(인간 IL7RA의 엑손 1의 마지막 14 bp 및 인트론 1의 첫 112 bp를 포함함), 5.2 kb의 Floxed HUb-Hyg 카세트(인간 IL7RA 인트론 1에 삽입됨), 및 17106 bp의 인간 게놈 단편 2(인간 IL7RA의 인트론 1의 3’ 부분, 엑손 2 내지 엑손 5, 및 인트론 5의 5’ 부분을 포함함). 표적화 작제물 내 인간화 단편의 측면에는 48.8 kb의 마우스 5’ 상동 아암 및 124.3 kb의 마우스 3’ 상동 아암이 위치한다. 인간화 마우스 Il7ra 유전자좌를 포함하는 표적화 핵산 작제물은 마우스 게놈 내로의 표적화된 삽입을 위해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 정확한 표적화를 확인하기 위한 인간 대립유전자 획득 및 마우스 대립유전자 상실 검정에 사용된 프라이머와 프로브의 위치도 표시되어 있다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 12에 제시되어 있다.
도 3c는 마우스 Il7ra 대립유전자를 인간화하기 위한 전략(축적에 비례하지는 않음), 및 도 3b에 대해 위에 기술된 마우스 IL7ra 게놈 단편을 다음을 포함하는 인간화 단편으로 치환함으로써 생성된, MAID #7266으로 명명된 인간화 Il7ra 대립유전자의 예시적인 구현예를 도시한 것이다: 인간 게놈 단편 1(126 bp), Floxd HUb-Hyg 카세트, 및 인간 게놈 단편 2(17106 bp). Floxed HUb-hyg 카세트가 제거된 후의 인간화 Il7ra 대립유전자는 MAID# 7267로 명명된다.
도 3d는 마우스 Il7ra의 단백질 서열(서열번호 41), 인간 IL7RA의 단백질 서열(서열번호 43)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Il7ra의 단백질 서열(서열번호 45)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)을 보여준다. 신호 펩티드 및 막관통 도메인은 각각의 단백질 서열에서 밑줄이 그어져 있다.
도 3e는 마우스 Il7ra의 코딩 서열(CDS)(서열번호 42), 인간 IL7RA의 코딩 서열(서열번호 44)(굵은 이탤릭체로 표시됨), 및 인간화(하이브리드) Il7ra의 코딩 서열(서열번호 46)(인간 부위는 굵은 이탤릭체로 표시됨)의 예시적인 구현예를 보여준다. 인간화에 사용되는 인간 IL7RA 서열의 부분은 밑줄이 그어져 있다. 인간 기원을 갖는 하이브리드 Il7ra 서열의 부분 또한 밑줄이 그어져 있다.
도 3f는 마우스 Il7ra 단백질 서열(서열 번호 41, 상단) 및 인간 IL7RA 단백질 서열(서열 번호 43, 하단)의 예시적인 구현예들의 정렬을 보여준다. 단백질의 신호 펩티드 및 막관통 분절이 박스로 표시되어 있다. 도 3a~3e에 기술된 인간화 (하이브리드) Il7ra를 형성할 때 마우스 서열과 인간 서열 간의 접합부는 엑토도메인의 N-말단(“5’ 접합부”)에 수직선으로 표시되어 있고 C-말단 근처에 선(“3’ 접합부”)으로 표시되어 있다. 인간화에 관여하는 엑토도메인의 아미노산이 강조되어 있다(5’ 접합부 직후의 아미노산에서 시작하여 3’ 접합부에서 끝남). 삼각형은 코딩 서열에서 엑손의 접합부를 나타낸다.
도 4a~4e 0일차 및 14일차에 식염수 및 alum(alum 단독) 또는 오브알부민 및 alum(Ova-alum) 중 하나에 마우스를 i.p. 감작시키고, 이어서 21일차 내지 24일차에 Ova를 4회 연속하여 비강내 접종하였다. 25일차에, 추가 분석을 위해 폐 조직과 혈청을 수집하였다. 4a. 유세포 계측법에 의한 폐 세포 침윤물의 평가. 폐 조직 호산구의 세포 빈도는 총 생존 세포의 빈도로서 도표화되어 있다. 4b. 실시간 qPCR에 의해 측정되고 β2m(β2-마이크로글로불린) 대조군 mRNA 발현에 대비하여 표현된 Muc5acmRNA 발현 수준의 평가. 혈청 Ova-특이적 IgE (4c) 및 Ova-특이적 IgG1(4d)의 ELISA 분석. 각각의 점은 단일 마우스를 나타낸다. 기호는 염수 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 나타낸다(*). 4e는 실험 계획을 도시한다: 0일차 및 14일차에 식염수 및 alum(alum 단독) 또는 오브알부민 및 alum(Ova-alum) 중 하나에 마우스를 i.p. 감작시키고, 이어서 21일차 내지 24일차에 Ova를 4회 연속하여 비강내 접종하였다. 25일차에, 도 4a~4d에 도시된 파라미터의 추가 분석을 위해 폐 조직 및 혈청을 수집하였다.
인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하도록 유전적으로 변형된 설치류(예를 들어 마우스 및 랫트, 이에 한정되지는 않음)가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 설치류는, 예를 들어 Th2-유발성 알레르기성 질환에 대한 모델로서 또는 염증성 Th2-유발성 암에 대한 모델로서 사용될 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 유전적으로 변형된 설치류를 제조하기 위한 조성물 및 방법 뿐만 아니라 알레르시 또는 암의 치료를 위한 후보 채료제를 시험하기 위해 이러한 유전적으로 변형된 설치류를 사용하는 방법도 제공되며 아래에서 추가로 기술된다.
Tslp 인간화 설치류
흉선 기질 림포포이에틱(TSLP)은 4-나선 다발 사이토카인 계열의 구성원이며 인터루킨-7(IL-7)의 먼 부수체이다. TSLP는 원래 마우스 흉선 기질 세포주의 배양 상청액에서 발견되었고, T 세포 및 B 세포에 대한 성장 인자로서 작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어 Tsilingiri 등의 문헌[Cell Mol. Gastroenterology & Hepatology 2017; 3: 174-182]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. TSLP 발현 세포는 상피 세포, 각질 세포, 섬유아 세포, 간질 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 및 호염기구를 포함한다. 전술한 Tsilingiri 등의 (2017) 문헌 참조. 인간에는 다음 2개의 TSLP 이소형이 존재한다: 항정 상태에서 낮은 수준/검출 불가 수준으로 발현되고, 여러 조직에서 염증 동안 상향 조절되며, 다수의 Th2-연관 질환(예: 아토피성 피부염, 천식, 알레르기 반응, 및 특정 유형의 암, 이로 한정되지는 않음)에서 악화된 Th2 반응의 특징인 긴 TSLP 이소형(이소형 1); 및 별도의 프로모터로부터 구성적으로 발현되고 장 및 흉선에서 특정 면역 항상성 기능을 매개하는 짧은 TSLP 이소형(이소형 2). 전술한 Tsilingiri 등의 (2017) 문헌 참조. 구체적으로 명시되지 않는 한, 인간 TSLP 유전자의 엑손 넘버링은 긴 이소형(인간 TSLP 단백질 이소형 1)을 암호화하는 엑손을 기준으로 한다.
인간 TSLP 이소형 1, 마우스 Tslp, 랫트 Tslp, 및 인간화 Tslp에 대한 핵산 및 단백질 서열을 포함하여, 예시적인 서열은 서열목록에 개시되어 있고, 표 1에 요약되어 있다. 마우스 및 랫트 Tslp 유전자는 인간 TSLP 유전자에서와 같이 4개의 엑손이 아니라 총 5개의 엑손과 작은 코딩 엑손 1을 갖는다. 인간 TSLP 이소형 1, 마우스 Tslp, 및 인간화(하이브리드) Tslp 단백질 서열의 정렬은 도 1f에 제공되어 있다.
서열번호 설명 특징
1 생쥐 Tslp 단백질, NP_067342 길이: 140 aa
신호 펩티드: 1~19
성숙한 단백질: 20~140
2 생쥐 Tslp mRNA (CDS), NM_021367 길이: 423 bp
3 호모 사피엔스 TSLP 단백질 이소형 1, NP_149024 길이: 159 aa신호 펩티드: aa 1~28
성숙: aa 29-159
4 호모 사피엔스 TSLP mRNA (CDS), 이소형 1, NM_033035 길이: 480 bp
5 인간화 마우스/인간 키메라 Tslp 단백질 길이: 150 aa신호 펩티드: 1~19 (마우스 유래)
성숙한 단백질: 20~150 (인간 유래)
6 인간화 마우스/인간 키메라 Tslp CDS 길이: 453 bp
7 집쥐 Tslp 단백질, XP_008770274 길이: 136 aa
8 집쥐 Tslp mRNA, XM_008772052 길이: 411 bp
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자를 생식선에 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 설치류 Tslp 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Tslp 유전자를 게놈에 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “유전자의 뉴클레오티드 서열”은 유전자의 게놈 서열, mRNA, 또는 cDNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 예를 들어, 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 인간 TSLP 유전자의 게놈 서열, mRNA 서열, 또는 cDNA 서열일 수 있고; 설치류 Tslp 유전자의 뉴클레오티드 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 설치류 Tslp 유전자(예를 들어 내인성 Tslp 유전자)의 게놈 서열, mRNA 서열, 또는 cDNA 서열일 수 있다. 설치류 Tslp 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열은, 설치류 게놈 내 인간화 Tslp 유전자가, 예를 들어 Tslp 수용체(Tslpr)에 결합하여 Tslp 단백질의 기능을 수행하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화하도록, 서로 작동 가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, “인간 TSLP” 유전자 및 단백질은 인간 기원의 TSLP 유전자 및 단백질을 지칭한다.
일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질은 서열번호 3의아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질은 서열번호 3의아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질은 서열번호 3의아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “설치류 Tslp” 유전자 및 단백질은 설치류(예를 들어 마우스 또는 랫트) 기원의 Tslp 유전자 및 단백질을 지칭한다.
일부 구현예에서, 마우스 Tslp 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마우스 Tslp 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마우스 Tslp 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마우스 Tslp 단백질은 서열번호 1의아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 7의아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 인간화 Tslp 유전자를 그의 게놈에 포함하며, 여기서 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 단백질(예컨대 서열번호 3에 제시된 인간 TSLP 단백질)의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화한다.
“성숙한 단백질”은 N-말단 신호 펩티드가 절단된 후의 단백질의 부분을 지칭한다.
인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열은 (i) 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질과 적어도 98% 동일한 폴리펩티드 서열, 또는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질과 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열일 수 있다. 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 동일한 폴리펩티드 서열일 수 있다. 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열은 대안적으로 또는 추가적으로 (ii) 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드 서열, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비 4개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드 서열, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드 서열, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드 서열, 또는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드 서열일 수 있다. 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열은 대안적으로 또는 추가적으로 (iii) 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열 대비, 예를 들어 성숙한 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 아미노산(5개 이하의 아미노산산)의 추가, 결실, 또는 치환을 가짐으로서, 도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 상이한 폴리펩티드일 수 있으며; 여기서 “성숙한 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부분”이란 성숙한 단백질의 N-말단 또는 C-말단으로부터 5~10개의 아미노산 이내를 의미한다. 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열은 대안적으로 또는 추가적으로 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 하나 이상의 특징을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질과 적어도 95% 동일하고 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드이거나, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질과 적어도 98% 동일하고 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질은 서열번호 3에 제시된 것과 같은 인간 TSLP 단백질 이소형 1이고, 아미노산 29~159가 성숙한 단백질 서열을 구성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는, 서열번호 3의 아미노산 29~159로 제시된 것과 같은 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화하는 인간화 Tslp 유전자를 그의 게놈에 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 29~159를 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 30~159를 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 31~159를 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 32~159를 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 29~158을 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 29~157을 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 29~156을 포함하는 성숙한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 서열번호 3의 아미노산 29~159에 제시된 것과 같은 성숙한 단백질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 서열이 적어도 95% 동일한 신호 펩티드이다. 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 동일한 신호 펩티드일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드 대비 3개 이하의 아미노산 만큼, 2개 이하의 아미노산 만큼, 또는 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 신호 펩티드일 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 TSLP 단백질의 신호 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 1~28에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 설치류 Tslp 단백질, 예컨대 내인성 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 서열이 적어도 95% 동일한 신호 펩티드이고; 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 서열이 동일한 신호 펩티드이다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드 대비 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 신호 펩티드이고; 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드 대비 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 신호 펩티드이고; 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드 대비 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 신호 펩티드이다. 특정 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 마우스 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 1~19에 제시된 것과 같은 신호 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은 랫트 Tslp 단백질, 예를 들어 서열번호 7에 제시된 것과 같은 랫트 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
전술한 바와 같이, 유전적으로 변형된 설치류의 게놈 내 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열(“인간 TSLP 뉴클레오티드 서열”) 설치류 Tslp 유전자의 뉴클레오티드 서열(“설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열”, 예를 들어 내인성 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열”)을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 단백질(예: 인간 TSLP 단백질 이소형 1)의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 성숙한 Tslp 단백질 서열의 “실질적인 부분”은 성숙한 단백질 서열의 전장에 육박하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 전장 성숙한 단백질 서열의 적어도 95%인 폴리펩티드를 지칭하고; 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 전장 성숙한 단백질 서열의 적어도 98%인 폴리펩티드를 지칭하고; 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 전장 성숙한 단백질 서열의 적어도 99%인 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 성숙한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 5개 이하의 아미노산을 결여함으로써 성숙한 단백질 서열과 상이한 폴리펩티드를 지칭하고; 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 성숙한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 4개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 성숙한 단백질 서열과 상이한 폴리펩티드를 지칭하고; 일부 구현예에서, 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 성숙한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 3개 이하의 아미노산을 결여함으로써 성숙한 단백질 서열과 상이한 폴리펩티드를 지칭하고; 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 성숙한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 2개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 성숙한 단백질 서열과 상이한 폴리펩티드를 지칭하고; 성숙한 단백질 서열의 실질적인 부분은 성숙한 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 1개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 성숙한 단백질 서열과 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 단백질(예를 들어 인간 TSLP 단백질 이소형 1, 예컨대 서열번호 3에 제시된 것과 같은 인간 TSLP 단백질 이소형 1)의 성숙한 단백질 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 29~159를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 30~159를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 31~159를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 32~159를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 29~158을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 29~157을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 29~156을 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 단백질(예를 들어 인간 TSLP 단백질 이소형 1, 예컨대 서열번호 3에 제시된 것과 같은 인간 TSLP 단백질 이소형 1)의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편이며, 상기 단편은 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3의 코딩 부분, 및 엑손 4의 코딩 부분을 (즉, 엑손 4의 종결 코돈까지) 암호화하는 성숙한 단백질 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편이며, 상기 단편은 인간 TSLP 유전자의 3’ UTR(인간 TSLP 엑손 4의 3’ 부분)을 또한 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslp 단백질(예: 내인성 설치류 Tslp 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslp 단백질(예: 내인성 설치류 Tslp 단백질, 예: 마우스 또는 랫트 Tslp 단백질)의 신호 펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Tslp 유전자의 엑손 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslp 뉴클레오티드 서열이고, 일부 이러한 구현예에서, 마우스 Tslp 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslp 유전자(예: 내인성 마우스 Tslp 유전자)의 엑손 1, 및 엑손 2의 신호 펩티드 아미노산 코딩 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자 내 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslp 유전자(예: 마우스 또는 랫트 Tslp 유전자, 예컨대 내인성 마우스 또는 랫트 Tslp 유전자)의 5’ UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는, 인간화 Tslp 유전자의 발현이 설치류 Tslp 5’ 조절 서열(들)에 의해 조절되도록, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 조절 서열, 예를 들어 설치류 Tslp의 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 5’ 전사 조절 서열(들), 예컨대 내인성 설치류 5’ 전사 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는, 예를 들어 무작위 통합의 결과로서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌 이외의 유전자좌에 있다. 인간화 Tslp 유전자가 내인성 설치류 Tslp 유전자좌 이외의 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 설치류는, 예를 들어 내인성 설치류 Tslp 유전자의 불활성화(예를 들어 전체적 또는 부분적인 결실)의 결과로서, 설치류 Tslp 단백질을 발현할 수 없다.
인간화 Tslp 유전자가 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslp 유전자의 뉴클레오티드 서열을 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열과 치환함으로써 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 TSLP 유전자의 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 유전자의 엑손을 전체적 또는 부분적으로 포함하는 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 게놈 단편은 인간 TSLP 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3의 부분을 암호화하는 성숙한 단백질 아미노산, 및 엑손 4의 코딩 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 게놈 단편은 인간 TSLP 유전자의 엑손 4의 3’ UTR 부분을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 통합된 인간 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 통합된 인간 뉴클레오티드 서열은 내인성 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드를 실질적으로 암호화하는 내인성 설치류 Tslp 게놈 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 내인성 마우스 Tslp 유전자좌에 통합된 인간 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 마우스 Tslp 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되고; 일부 이러한 구현예에서, 마우스 Tslp 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslp 유전자(예: 내인성 마우스 Tslp 유전자)의 엑손 1, 및 엑손 2의 신호 펩티드 아미노산-코딩 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslp 단백질의 성숙한 단백질 서열에 대해 코딩하는 엑손 서열을 포함하는 게놈 단편(예: 성숙한 마우스 Tslp 단백질의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 2의 코돈에서부터 종결 코돈까지의 마우스 게놈 단편)은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열에 대해 코딩하는 엑손 서열을 포함하는 인간 TSLP 유전자의 게놈 단편(예를 들어 성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 1의 코돈에서 시작해서 엑손 4의 종결 코돈까지의 게놈 단편)으로 치환되었다. 그 결과, 인간화 Tslp 유전자가 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 마우스 Tslp 유전자좌에 형성되며, 다음을 포함한다: 마우스 Tslp 엑손 1, 마우스 Tslp 엑손 2의 신호 펩티드 아미노산 코딩 부분, 성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 인간 TSLP 엑손 1의 코돈에서 인간 TSLP 엑손 4의 종결 코돈까지, 및 마우스 Tslp 엑손 5의 마우스 3’ UTR. 이러한 인간화 Tslp 유전자는 마우스 Tslp 신호 펩티드 및 성숙한 인간 TSLP 폴리펩티드를 포함하는 인간화 Tslp 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 설치류는 그의 게놈에 있는 인간화 Tslp 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 설치류는 그의 게놈에 있는 인간화 Tslp 유전자에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자는 설치류에서, 예를 들어 설치류의 혈청에서 암호화된 인간화 Tslp 단백질을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslp 단백질은, 대조군 설치류(예를 들어 인간화 Tslp 유전자가 없는 설치류)에서 상대 설치류 Tslp 단백질이 발현되는 세포 및 조직에서, 예를 들어 피부, 장, 폐, 및 안구 조직의 상피 세포 및 각질 세포뿐만 아니라 수지상 세포, 비만 세포, 및 호염기구에서도 발현된다. 예를 들어 전술한 Tsilingiri 등의 (2017) 문헌 참조.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는, 예를 들어, 내인성 설치류 Tslp 유전자의 불활성화(예: 전체적 또는 부분적인 결실) 또는 (전체적 또는 부분적인) 치환의 결과로서 설치류 Tslp 단백질을 발현할 수 없다.
TSLPR 인간화
TSLP는 TSLP에 특이적인 사슬("TSLPR" 또는 "Tslpr"로서 지칭됨) 및 IL7 수용체 a 사슬로 구성된 이종이량체를 통해 작용한다. TSLPR은　신호 펩티드, 세포외 도메인("ECD" 또는 "엑토도메인"), 막관통 도메인, 및 세포내 (세포질) 도메인을 함유한다.
인간 TSLPR 이소형 1, 마우스 Tslpr 이소형 1, 랫트 Tslpr 이소형 1, 및 인간화 (마우스-인간 하이브리드) Tslpr에 대한 핵산 및 단백질 서열을 포함하여, 예시적인 서열은 서열목록에 개시되어 있고, 표 2에 요약되어 있다. 인간 TSLPR 이소형 1, 마우스 Tslpr 이소형 1, 및 인간화(마우스-인간 하이브리드) Tslp 단백질 서열의 정렬은 도 2f에 제공되어 있다. 구체적으로 명시되지 않는 한, 인간 및 마우스 유전자의 엑손 넘버링은 인간 및 마우스 단백질 이소형 1을 암호화하는 엑손을 기준으로 한다.
서열번호 설명 특징
21 생쥐 Tslpr 이소형 1 단백질, NP_001158207 길이: 370 aa
신호 펩티드: aa 1~19
엑토도메인: aa 20~243
막관통: aa 244~264
세포내: aa 265~370
22 생쥐 Tslpr mRNA (CDS), 이소형 1, NM_001164735 길이: 1113 bp
23 호모 사피엔스 TSLPR 단백질 이소형 1, NP_071431 길이: 371 aa신호 펩티드: aa 1~22
엑토도메인: aa 23~231
막관통: aa 232~252
세포내: aa 253~371
24 호모 사피엔스 TSLPR mRNA (CDS), 이소형 1, NM_022148 길이: 1116 bp
25 인간화 마우스/인간 키메라 Tslpr 단백질 길이: 358 aa신호 펩티드: 1~19 (마우스 유래)
엑토도메인: aa 20~231 (마우스 유래 aa 20~26 및 인간 유래 aa 27~231)
막관통: aa 232~252 (마우스 유래)
세포내: aa 253~358 (마우스 유래)
26 인간화 마우스/인간 키메라 Tslpr mRNA (CDS) 길이: 1077 bp
27 집쥐 Tslpr
단백질, AAL90454.1		 길이: 360 aa
28 집쥐 Tslpr mRNA, AF404510.1 길이: 1209 bp
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslpr 유전자를 생식선에 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 설치류 Tslpr 유전자(예: 내인성 설치류 Tslpr 유전자)의 뉴클레오티드 서열 및 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Tslpr 유전자를 그의 게놈에 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “유전자의 뉴클레오티드 서열”은 유전자의 게놈 서열, mRNA, 또는 cDNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 비제한적인 예로서, 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 유전자의 게놈 서열, mRNA, 또는 cDNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 설치류 Tslpr 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열은, 설치류 게놈 내 인간화 Tslpr 유전자가, (엑토도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는) Tslpr 단백질 구조를 갖고 Tslpr 기능을 수행하는 (예를 들어 Tslpr 단백질에 결합하여 IL-7 수용체와 이종이량체를 형성하는) 인간화 Tslpr 단백질을 암호화하도록, 서로 작동 가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, “인간 TSLPR” 유전자 및 단백질은 인간 기원의 TSLPR 유전자 및 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질은 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “설치류 Tslpr” 유전자 및 단백질은 설치류(예를 들어 마우스 또는 랫트) 기원의 Tslpr 유전자 및 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslpr 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Tslp 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 인간화 Tslpr 유전자를 그의 게놈에 함유하며, 여기서 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 함유하는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 동일한 기능(예: 리간드 결합 특성)을 나타낸다. “인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (i) 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 98% 동일한 폴리펩티드, 또는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 99% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. “인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 100% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (ii) 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 10개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 7개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 4개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (iii) 예를 들어 엑토도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 부분(즉, 엑토도메인의 N 또는 C 말단으로부터 5~10개 아미노산 이내)에서 아미노산의 추가, 결실, 및/또는 치환을 가짐으로써, 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 특징 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 95% 동일하고 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 10개 이하의 아미노산만큼 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 95% 동일하고 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 5개 이하의 아미노산만큼 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드, 또는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 98% 동일하고 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 3개 이하의 아미노산만큼 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질은 서열번호 23에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, 이의 엑토도메인은 서열번호 23의 아미노산 23~231로 구성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23에 제시된 것과 같은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한, 즉 서열번호 23의 아미노산 23~231과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 가진 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 23~231, 24~231, 25~231, 26~231, 27~231, 28~231, 23~230, 23~229, 23~228, 23~227, 또는 23~226을 포함하는 세포외 도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 23~231을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 25~231을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 27~231을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 23~228을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 23의 아미노산 23~226을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr(예를 들어 내인성 설치류 Tslpr)의 엑토도메인의 N-말단에서부터 인간 TSLPR의 엑토도메인 또는 이의 실질적인 부분까지의 아미노산을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 인간 TSLPR(또는 설치류 Tslpr) 단백질의 “엑토도메인의 실질적인 부분”은 단백질의 완전한 엑토도메인에 가까운 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 세포외 도메인의 실질적인 부분은 인간 TSLPR 단백질의 전장 엑토도메인의 적어도 95%인 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 세포외 도메인의 실질적인 부분은 인간 TSLPR 단백질의 전장 엑토도메인의 적어도 98%인 폴리펩티드를 지칭한다. 서열. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 10개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 전장 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 5개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 전장 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 4개 이하의 아미노산을 결여시킴으로써 전장 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열번호 23에 제시된 것과 같은 인간 TSLPR의 엑토도메인은 아미노산 23~231에 의해 정의되며, 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 서열번호 23의 아미노산 25~231, 26~231, 27~231, 23~228, 23~227, 또는 23~226을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 25~231을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 27~231을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~228을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~226을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질의 엑토도메인은 설치류 Tslpr(예: 내인성 설치류 Tslpr)의 엑토도메인의 N-말단에서부터 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분까지 6~8개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질의 엑토도메인은 설치류 Tslpr(예: 내인성 설치류 Tslpr)의 엑토도메인의 N-말단에서부터 서열번호 23의 아미노산 27~231까지 7개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 서열번호 25의 아미노산 20~231에 제시된 것과 같은 엑토도메인을 함유하는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화하며 - 이러한 엑토도메인은 마우스 Tslpr 엑토도메인의 N-말단에서의 7개의 아미노산을 포함하고, 이어서 서열번호 23의 아미노산 27~231(인간 Tslpr)을 포함하고; 서열번호 23의 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 엑토도메인의 N-말단이 상이하지만(서열번호 23의 인간 TSLPR에서는 “QGGA”(서열번호 68)인 반면 서열번호 25의 인간화 TSLPR에서는 “AAAVTSR”(서열번호 67)임), 나머지 ame 205개 아미노산에서는 인간 TSLP 엑토도메인과 동일하다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 단백질, 예를 들어 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열(즉, 막관통 도메인과 세포질 도메인 둘 다를 포함하는 서열)을 함유하는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열은 설치류 Tslpr 단백질, 예컨대 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 동일한 기능(예: 신호 전달 및/또는 세포내 분자와의 상호작용)을 나타낸다. “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (i) 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 또는 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 단백질과 서열이 적어도 98% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (ii) 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 4개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 또는 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (iii) 일부 구현예에서, 예를 들어 막관통-세포질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환을 가짐으로써, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는; (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 열거된 하나 이상의 특징을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 적어도 95% 동일하고, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드; 또는 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 적어도 95% 동일하고, 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. "막관통-세포질 서열의 N-말단 또는 C-말단 부분"이라는 말은, 막관통 도메인의 N-말단에서 5~10개의 아미노산 이내 또는 세포질 도메인의 C-말단에서 5~10개의 아미노산 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질(예컨대 내인성 마우스 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 랫트 Tslpr 단백질(예컨대 내인성 랫트 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 함유하는 인간화 Tslpr 단백질을 암호화한다. “설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (i) 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 또는 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 서열이 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (ii) 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 또는 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한” 신호 펩티드는, 예를 들어 신호 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환을 가짐으로써, 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 N-말단 또는 C-말단에서만 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 하나 이상의 특징을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 적어도 95% 동일하고, 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 N-말단 또는 C-말단에서만 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. "신호 펩티드의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분"이란 신호 펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 5~10개의 아미노산 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 마우스 Tslpr 단백질(예를 들어 내인성 마우스 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은 랫트 Tslpr 단백질(예컨대 내인성 랫트 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류의 게놈 내 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열(“인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열”) 및 설치류 Tslpr 유전자의 뉴클레오티드 서열(“설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열”, 예컨대 내인성 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열)을 포함하며, 여기서 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 전술한 바와 같이, 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 서열번호 23의 아미노산 25~231, 26~231, 27~231, 23~228, 23~227, 또는 23~226을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 27~231을 포함한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 25~231을 포함한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~228을 포함한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~226을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자 내 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 단백질(예를 들어 서열번호 23에서 정의된 것과 같은 인간 TSLPR 단백질 이소형 1)의 엑토도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 엑손 2에서부터 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 포함하는 인간 TSLPR 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 게놈 단편은 인간 TSLPR 이소형 1의 아미노산 27~231을 암호화하고, 인간 TSLPR 이소형 1의 엑토도메인의 N-말단에서 4개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 게놈 단편은, 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 엑손 2에서부터 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 작동 가능하게 연결된, 인트론 1의 3’ 부분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 게놈 내 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열 및 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예: 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자에 존재하는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자에 존재하는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열이고; 일부 이러한 구현예에서, 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslpr 유전자(예: 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 엑손 6의 부분(마우스 Tslpr 막관통 도메인의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 코돈에서 시작하여)에서 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 게놈 내 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열의 상류(5’)에 있는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예: 내인성 설치류 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열(예를 들어 내인성 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열), 또는 랫트 Tslpr 뉴클레오티드 서열(예를 들어 내인성 랫트 Tslpr 뉴클레오티드 서열)이다. 일부 구현예에서, 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드 서열 및 설치류 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 N-말단으로부터 아미노산(예: 6~8개 아미노산)을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열. 일부 구현예에서, 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드 서열 및 설치류 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 N-말단으로부터 7개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열. 일부 구현예에서, 설치류 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslpr 유전자(예: 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 엑손 1을 포함하는 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열이고; 일부 이러한 구현예에서, 마우스 Tslpr 뉴클레오티드 서열은 마우스 Tslp 유전자의 인토론 1의 5’ 부분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는, 인간화 Tslpr 유전자의 발현이 설치류 Tslpr 5’ 조절 서열(들)에 의해 조절되도록, 내인성 설치류 Tslpr 조절 서열과 같은 설치류 Tslpr 5’ 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 5’ 전사 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는, 예를 들어 무작위 통합의 결과로서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌 이외의 유전자좌에 있다. 인간화 Tslpr 유전자가 내인성 설치류 Tslpr 유전자 이외의 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 설치류는, 예를 들어 내인성 설치류 Tslpr 유전자의 불활성화(예를 들어 전체적 또는 부분적인 결실)의 결과로서, 설치류 Tslpr 단백질을 발현할 수 없다.
인간화 Tslpr 유전자가 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslpr 유전자의 뉴클레오티드 서열을 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열과 치환함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslpr 유전자의 뉴클레오티드 서열로서, 치환되는 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 내인성 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 치환되는 마우스 Tslpr 게놈 단편은 내인성 마우스 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 예를 들어, 서열번호 21의 마우스 Tslpr의 엑토도메인은 아미노산 20~243에 의해 정의되며, 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 서열번호 21의 아미노산 21~243, 22~243, 23~243, 24~243, 25~243, 26~243, 27~243, 20~241, 20~240, 20~239, 및 20~238을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 21의 아미노산 27~243을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 21의 아미노산 25~243을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 21의 아미노산 20~240을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 21의 아미노산 20~238을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Tslpr 게놈 단편은 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 TSLPR 유전자의 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 TSLPR 유전자의 게놈 단편은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLPR 유전자의 엑손을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 위에서 기술되었으며, 예를 들어, 서열번호 23의 아미노산 23~231, 24~231, 25~231, 26~231, 27~231, 28~231, 23~230, 23~229, 23~228, 23~227, 또는 23~22이다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 25~231을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 27~231을 포함한다. 23. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~228을 포함한다. 23. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 23의 아미노산 23~226을 포함한다. 23. 일부 구현예에서, 인간 게놈 단편은 인간 TSLPR 엑토도메인의 엑손 2에서부터 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 삽입된 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예컨대 내인성 설치류, 예를 들어 마우스 또는 랫트 Tslpr 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 서열에 작동 가능하게 연결된다. 설치류가 마우스인 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 유전자의 게놈 서열은, 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 막관통 도메인의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈에서부터 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 삽입된 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 설치류 Tslpr 단백질(예컨대 내인성 설치류, 예를 들어 마우스 또는 랫트 Tslpr 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 유전자의 게놈 서열에 작동 가능하게 연결된다. 설치류가 마우스인 구현예에서, 마우스 Tslpr 유전자의 게놈 서열은, 일부 구현예에서, 마우스 Tslpr 유전자(예를 들어, 내인성 마우스 Tslpr 유전자)의 엑손 1을 포함하고, 임의로 인트론 1을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 마우스 Tslpr 엑토도메인의 엑손 2에서부터 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 포함하고 내인성 마우스 Tslpr 유전자좌에 있는 내인성 마우스 Tslpr 유전자의 게놈 단편은 인간 TSLPR 엑토도메인의 엑손 2에서부터 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지 포함하는 인간 TSLPR 유전자의 게놈 단편과 치환된 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에서 형성되고, 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 1, 엑손 2에서부터 인간 TSLPR 유전자의 마지막 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈까지, 및 마우스 Tslpr 막관통 도메인의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 6의 코돈에서 시작해서 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 설치류는 그의 게놈에 있는 인간화 Tslp 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 설치류는 그의 게놈에 있는 인간화 Tslpr 유전자에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 유전자는 설치류에서 암호화된 인간화 Tslpr 단백질의 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 인간화 Tslpr 단백질은, 대조군 설치류(예를 들어, 인간화 Tslpr 유전자가 없는 설치류)에서 상대 설치류 Tslpr 단백질이 일반적으로 발현되는 세포 및 조직에서, 예를 들어 수지상 세포, CD4+ T 세포, 및 2군 선천성 림프 세포뿐만 아니라 상피 세포, 내피 세포, 및 평활근 세포와 같은 비-면역 세포 유형에서도 발현된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는, 예를 들어, 내인성 설치류 Tslpr 유전자의 불활성화(예: 전체적 또는 부분적인 결실) 또는 (전체적 또는 부분적인) 치환의 결과로서 설치류 Tslpr 단백질을 발현할 수 없다.
IL7RA 인간화
TSLP는 TSLP에 특이적인 사슬(“TSLPR” 또는 “Tslpr”로서 지칭됨) 및 IL7 수용체 α 사슬(인간의 경우 “IL7RA” 및 비인간 또는 인간화 분자의 경우 “Il7ra”)로 구성된 이종이량체를 통해 작용한다. IL7RA는 신호 펩티드, 세포외 도메인("ECD" 또는 "엑토도메인"), 막관통 도메인, 및 세포내 (세포질) 도메인을 함유한다.
인간 IL7RA, 마우스 Il7ra, 랫트 Il7ra, 및 인간화 (마우스-인간 하이브리드) Il7ra에 대한 핵산 및 단백질 서열을 포함하는 예시적인 서열은 서열 목록(Sequence Listing)에 개시되어 있고, 표 3에 요약되어 있다. 인간 IL7RA 및 마우스 Il7ra 단백질 서열의 정렬은 도 3f에 제공되어 있다.
서열번호 설명 특징
41 생쥐 Il7ra 단백질, NP_032398 길이: 459 aa신호 펩티드: aa 1~20
엑토도메인: aa 21~238
막관통: aa 239~263
세포내: 264~459
42 생쥐 Il7ra mRNA (CDS), NM_008372 길이: 1380 bp
43 호모 사피엔스 IL7RA 단백질, NP_002176 길이: 459 aa신호 펩티드: aa 1~20
엑토도메인: aa 21~238
막관통: aa 239~263
세포내: aa 264~459
44 호모 사피엔스 IL7RA mRNA (CDS), NM_002185 길이: 1380 bp
45 인간화 마우스/인간 키메라 Il7ra 단백질 길이: 459 aa신호 펩티드: 1~20 (마우스 유래)
엑토도메인: aa 21~238 (인간 유래 aa 21~236 및 마우스 유래 237~238)
막관통: aa 239~263 (마우스 유래)
세포내: aa 264~459 (마우스 유래)
46 인간화 마우스/인간 키메라 Il7ra mRNA (CDS) 길이: 1380 bp
47 집쥐 Il7ra
단백질, NP_001099888 		길이: 457 aa
48 집쥐 Il7ra mRNA
NM_001106418.1 		길이: 3124 bp
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Il7ra 유전자를 생식선에 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 설치류 Il7ra 유전자(예: 내인성 설치류 Il7ra 유전자)의 뉴클레오티드 서열 및 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Il7ra 유전자를 그의 게놈에 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “유전자의 뉴클레오티드 서열”은 유전자의 게놈 서열, mRNA, 또는 cDNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 비제한적인 예로서, 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 인간 IL7RA 유전자의 게놈 서열, mRNA, 또는 cDNA 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 설치류 Il7ra 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열은, 설치류 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자가, (엑토도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는) Il7ra 단백질 구조를 갖고 Il7ra 기능을 수행하는 (예를 들어 Il7ra 단백질에 결합하여 Tslp에 결합하는 Tslpr과 이종이량체를 형성하는) 인간화 Il7ra 단백질을 암호화하도록, 서로 작동 가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, “인간 IL7RA” 유전자 및 단백질은 인간 기원의 IL7RA 유전자 및 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질은 서열번호 43의아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질은 서열번호 43의아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질은 서열번호 43의아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “설치류 Il7ra” 유전자 및 단백질은 설치류(예를 들어 마우스 또는 랫트) 기원의 Il7rar 유전자 및 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 마우스 Il7ra 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Il7ra 단백질은 서열번호 41의아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Il7rar 단백질은 서열번호 41의아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마우스 Il7rar 단백질은 서열번호 41의아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Il7ra 단백질은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Il7ra 단백질은 서열번호 47의아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Il7ra 단백질은 서열번호 47의아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 랫트 Il7ra 단백질은 서열번호 47의아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 인간화 Il7ra 유전자를 그의 게놈에 함유하며, 여기서 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 함유하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 동일한 기능(예: 리간드 결합 특성)을 나타낸다. “인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드; 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 98% 동일한 폴리펩티드; 또는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 99% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. “인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 100% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (ii) 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 10개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 7개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 4개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 또는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (iii) 예를 들어 엑토도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 부분(즉, 엑토도메인의 N 또는 C 말단으로부터 5~10개 아미노산 이내)에서 아미노산의 추가, 결실, 및/또는 치환을 가짐으로써, 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한” 엑토도메인 또는 폴리펩티드는 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 특징 중 하나 이상을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 95% 동일하고 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 5개 이하의 아미노산만큼 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드; 또는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 서열이 적어도 98% 동일하고 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단 부분에서만 3개 이하의 아미노산만큼 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 단백질은 서열번호 43에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하고, 이의 엑토도메인은 서열번호 43의 아미노산 21~238에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한, 즉 서열번호 43의 아미노산 21~238과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 가진 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 서열번호 43의 아미노산 21~238을 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 서열번호 43의 아미노산 21~237을 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 서열번호 43의 아미노산 21~236을 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 서열번호 43의 아미노산 22~238을 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 서열번호 43의 아미노산 24~238을 포함하는 엑토도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는, 인간 IL7RA의 엑토도메인 또는 이의 실질적인 부분을 포함하고 이어서 설치류 Il7ra(예: 내인성 설치류 Il7ra)의 엑토도메인의 C-말단으로부터의 아미노산을 포함하는 엑토도메인을 갖는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 인간 IL7RA (또는 설치류 IL7ra) 단백질의 “엑토도메인의 실질적인 부분”은 인간 IL7RA (또는 설치류 IL7ra) 단백질의 전장 엑토도메인에 가까운 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 전장 엑토도메인 서열의 적어도 95%를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 전장 엑토도메인 서열의 적어도 98%를 포함한다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 10개 이하의 아미노산을 결여함으로써 엑토도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 7개 이하의 아미노산을 결여함으로써 엑토도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 5개 이하의 아미노산을 결여함으로써 엑토도메인과 상이하다. 일부 구현예에서, 엑토도메인의 실질적인 비율은 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단에서 3개 이하의 아미노산을 결여함으로써 엑토도메인과 상이하다. 예를 들어, 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 엑토도메인은 아미노산 21~238에 의해 정의되며, 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 서열번호 43의 아미노산 22~238, 23~238, 24~238, 21~237, 21~236, 21~235를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 43의 아미노산 21~236을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 43의 아미노산 21~237을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 43의 아미노산 22~238을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA의 엑토도메인의 실질적인 부분은 서열번호 43의 아미노산 23~238을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질의 엑토도메인은 인간 IL7RA의 엑토도메인의 실질적인 부분에 이어서, 설치류 Il7ra(예를 들어, 내인성 설치류 Il7ra)의 엑토도메인의 C-말단으로부터 1~3개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질의 엑토도메인은 서열번호 43의 아미노산 21~236에 이어서 설치류 Il7ra의 엑토도메인의 C-말단으로부터 2개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 서열번호 45의 아미노산 21~238을 포함하는 엑토도메인을 함유하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화하는데, - 이러한 엑토도메인은 서열번호 43(인간 IL7RA)의 아미노산 21~236 및 마우스 Il7ra의 엑토도메인의 C-말단으로부터 마지막 2개의 아미노산(“GW”)을 포함하고, 엑토도메인의 C-말단에 있는 2개의 아미노산이 서열번호 43의 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 상이하며(서열번호 43의 인간 IL7RA에서는 “EM”인 반면, 서열번호 45의 인간화 Il7ra에서는 “GW”임), 그렇지 않으면 인간 IL7RA 엑토도메인과 동일하다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 단백질, 예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열(즉, 막관통 도메인과 세포질 도메인 둘 다를 포함하는 서열)을 함유하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열은 설치류 Il7ra 단백질, 예컨대 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 동일한 기능(예: 신호 전달 및/또는 세포내 분자와의 상호작용)을 나타낸다. “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (i) 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 또는 일부 구현예에서는 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 단백질과 서열이 적어도 98% 동일한 폴리펩티드일 수 있다. “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (ii) 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 4개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Il7ra단백질의 막관통-세포질 서열과 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 또는 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (iii) 예를 들어 막관통-세포질 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환을 가짐으로써, 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, “설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한” 막관통-세포질 서열 또는 폴리펩티드는 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 하나 이상의 특징을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 서열이 적어도 95% 동일하고, 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. "막관통-세포질 서열의 N-말단 또는 C-말단 부분"이라는 말은, 막관통 도메인의 N-말단에서 5~10개의 아미노산 이내 또는 세포질 도메인의 C-말단에서 5~10개의 아미노산 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 마우스 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 단백질) 의 막관통-세포질 서열 또는 랫트 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 랫트 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 함유하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 함유하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 기준 단백질(인간 IL7RA 단백질 또는 설치류 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 “실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (i) 기준 단백질의 신호 펩티드와 서열이 적어도 95% 동일한 폴리펩티드, 또는 기준 단백질의 신호 펩티드와 서열이 동일한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기준 단백질의 신호 펩티드와 “실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (ii) 기준 단백질의 신호 펩티드와 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드, 기준 단백질의 신호 펩티드와 2개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드; 또는 일부 구현예에서는 기준 단백질의 신호 펩티드와 1개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기준 단백질의 신호 펩티드와 “실질적으로 동일한” 신호 펩티드는 (iii) 예를 들어 신호 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환을 가짐으로써, 기준 단백질의 신호 서열과 N-말단 또는 C-말단에서만 상이한 폴리펩티드; 또는 (iv) 상기 (i) 내지 (iii)에 기술된 하나 이상의 특징을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 기준 단백질의 신호 펩티드와 적어도 95% 동일하고, 기준 단백질의 신호 펩티드와 N-말단 또는 C-말단에서만 3개 이하의 아미노산만큼 상이한 폴리펩티드일 수 있다. "신호 펩티드의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분"이란 신호 펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 5~10개의 아미노산 이내를 의미한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 마우스 Il7ra 단백질(예컨대 내인성 마우스 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 랫트 Il7ra 단백질(예컨대 내인성 랫트 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류의 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열(“인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열”) 및 설치류 Il7ra 유전자의 뉴클레오티드 서열(“설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열”, 예컨대 내인성 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열)을 포함하며, 여기서 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 내 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43의 인간 IL7RA 단백질)의 엑토도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 인간 IL7RA 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 2의 코돈에서부터 엑손 5까지(즉, 인간 IL7RA 단백질의 막관통 분절이 시작되기 전 2개의 아미노산인 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈까지) 포함하는 인간 IL7RA 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 21~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 21~237을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 21~236을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 21~235를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 22~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질(예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA 단백질)의 아미노산 24~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인트론 5의 5’ 부분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열 및 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예: 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자에 존재하는 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자에 존재하는 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열이고; 일부 이러한 구현예에서, 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 마우스 Il7ra 유전자(예: 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 인트론 5의 3’ 부분 및 엑손 6 내지 엑손 8을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열의 상류(5’)에 있는 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예: 내인성 설치류 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열), 또는 랫트 Il7ra 뉴클레오티드 서열(예를 들어 내인성 랫트 Il7ra 뉴클레오티드 서열)이다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 내 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 마우스 Il7ra의 신호 펩티드에 대해 코딩하는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어, 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 1의 부분을 포함하고; 일부 구현예에서, 마우스 Il7ra 뉴클레오티드 서열은 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 1의 5’ UTR을 또한 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는, 인간화 Il7ra 유전자의 발현이 설치류 Il7ra 5’ 조절 서열(들)에 의해 조절되도록, 내인성 설치류 Il7ra 조절 서열과 같은 설치류 Il7ra 5’ 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 5’ 전사 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는, 예를 들어 무작위 통합의 결과로서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌 이외의 유전자좌에 있다. 인간화 Il7ra 유전자가 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌 이외의 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 설치류는, 예를 들어 내인성 설치류 Il7ra 유전자의 불활성화(예를 들어, 전체적 또는 부분적인 결실)의 결과로서, 설치류 Il7ra 단백질을 발현할 수 없다.
인간화 Il7ra 유전자가 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Il7ra 유전자의 뉴클레오티드 서열을 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열과 치환함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Il7ra 유전자의 뉴클레오티드 서열로서, 치환되는 뉴클레오티드 서열은 설치류 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 내인성 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화한다. 내인성 마우스 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 실질적인 부분의 예는 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예를 들어 서열번호 41)의 아미노산 22~238, 23~238, 24~238, 21~237, 21~236, 또는 21~235를 포함한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 21~235를 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 21~236을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 21~237을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 21~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 22~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 내인성 마우스 Il7ra 단백질(예: 서열번호 41)의 아미노산 23~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환되는 마우스 Il7ra 게놈 단편은 성숙한 Il7ra 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지 포함하며, 일부 구현예에서는 마우스 Il7ra 유전자의 인트론 5의 5’ 부분까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 IL7RA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 인간 IL7RA 유전자의 게놈 단편이다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 단편과 치환되는 인간 IL7RA 유전자의 게놈 단편은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 유전자의 엑손을 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 21~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 21~237을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 21~236을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 21~235를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 22~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 게놈 단편은 인간 IL7RA, 예를 들어 서열번호 43에 제시된 것과 같은 인간 IL7RA의 아미노산 24~238을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 게놈 단편은 성숙한 인간 IL7RA 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지 포함하며, 일부 구현예에서는 인간 IL7RA 유전자의 인트론 5의 5’ 부분까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 삽입된 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예컨대 내인성 설치류, 예를 들어 마우스 또는 랫트 Il7ra 단백질)의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 서열에 작동 가능하게 연결된다. 설치류가 마우스인 구현예에서, 마우스 Il7ra 유전자의 게놈 서열은, 일부 구현예에서, 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 6에서부터 엑손 8까지 포함하고; 일부 구현예에서는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 인트론 5의 3’ 부분에서 엑손 8까지 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 삽입된 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 설치류 Il7ra 단백질(예컨대 내인성 설치류, 예를 들어 마우스 또는 랫트 Il7ra 단백질)의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 게놈 서열에 작동 가능하게 연결된다. 설치류가 마우스인 구현예에서, 마우스 Il7ra 유전자의 게놈 서열은, 일부 구현예에서, 마우스 Il7ra의 신호 펩티드에 대해 코딩하는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 1을 포함하고; 일부 구현예에서는 엑손 1의 5’ UTR, 및 마우스 Il7ra의 신호 펩티드에 대해 코딩하는 마우스 Il7ra 유전자(예를 들어 내인성 마우스 Il7ra 유전자)의 엑손 1의 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 내인성 마우스 Il7ra 유전자좌에 있는, 성숙한 Il7ra 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 1의 제1 코돈에서부터 엑손 5까지(또는 일부 구현예에서는 인트론 5의 5’ 부분까지) 포함하는 내인성 마우스 Il7ra 유전자의 게놈 단편은 제1 성숙한 IL7RA 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 1의 제1 코돈에서부터 엑손 5까지(또는 일부 구현예에서는 인트론 5의 5’ 부분까지) 포함하는 인간 IL7RA 유전자의 게놈 단편으로 치환된 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 형성되고, 마우스 Il7ra 유전자의 5’ UTR, 및 엑손 1의 신호-펩티드 코딩 부분; 인간 IL7RA 유전자의 엑손 1의 성숙한 아미노산 코딩 부분에서부터 엑손 5까지; 및 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 6 내지 엑손 8을 포함하고; 일부 이러한 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자 5는 인간 인트론 5의 5’ 부분 및 내인성 마우스 인트론 5의 3’ 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류는 내인성 마우스 Il7ra 유전자좌에서 인간화 Il7ra 유전자를 포함하는 마우스이며, 여기서 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질의 신호 펩티드와 적어도 실질적으로 동일한 신호 펩티드, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 적어도 실질적으로 동일한 엑토도메인, 및 내인성 마우스 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질의 엑토도메인은 인간 IL7RA 단백질의 전장 엑토도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질의 엑토도메인은 (i) 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 C-말단에 있는 2개의 아미노산을 제외하고는 거의 전장인, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인, 및 (ii) 내인성 마우스 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 C-말단에 있는 2개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류는 CN111808882A(전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 것과 같은 내인성 마우스 Il7ra 유전자좌에서 인간화 Il7ra 유전자를 포함하는 마우스이다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 설치류는 그의 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 설치류는 그의 게놈 내 인간화 Il7ra 유전자에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 유전자는 설치류에서 암호화된 인간화 Il7ra 단백질을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 인간화 Il7ra 단백질은, 대조군 설치류(예를 들어 인간화 Il7ra 유전자가 없는 설치류)에서 상대 설치류 Il7ra 단백질이 일반적으로 발현되는 세포 및 조직에서, 예를 들어, T 림프구 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는, 예를 들어, 내인성 설치류 Il7ra 유전자의 불활성화(예: 전체적 또는 부분적인 결실) 또는 (전체적 또는 부분적인) 치환의 결과로서 설치류 Il7ra 단백질을 발현할 수 없다.
추가적인 유전적 특징
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Sirpα 유전자를 그의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류 Sirpα 유전자의 인간화는, 예를 들어 WO 2015/042557 A1(Regeneron Pharmaceuticals Inc.) 및 US20190373867A1(Beijing Biocytogen)에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 인간화 Sirpa 유전자는 인간 SIRPα 단백질의 세포외 도메인을 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 인간화 Sirpα 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpa 유전자는 리간드 결합(즉, CD47에 대한 결합)을 담당하는 인간 SIRPα 단백질의 세포외 부분을 포함하는 인간화 Sirpα 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpa 유전자는 인간 SIRPα 단백질, 예를 들어 GenBank 수탁 번호 NP_001035111.1에 제시된 것과 같은 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 잔기 28~362를 포함하는 인간화 Sirpα 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자는 설치류 Sirpα 단백질(예를 들어 내인성 설치류 Sirpα 단백질)의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 인간화 Sirpα 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2, 3, 및 4를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자는 내인성 설치류 Sirpα 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자는 내인성 설치류 Sirpα 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Sirpα 유전자의 엑손 2~4를 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2~4로 치환한 결과로서 형성된다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자는 내인성 설치류 Sirpα 유전자좌에 위치하고, 내인성 설치류 Sirpα 유전자의 엑손 1, 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2~4, 및 내인성 설치류 Sirpα 유전자의 엑손 5~8을 포함하되, 인간화 Sirpα 유전자는 내인성 설치류 Sirpα 유전자좌에 있는 설치류 Sirpα 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 Sirpα 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 Sirpα 유전자에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 인간화 Sirpα 유전자를 포함하는 설치류는 인간화 Sirpα 단백질, 예컨대 인간 SIRPα 단백질의 세포외 도메인 및 설치류 Sirpα 단백질의 막관통-세포질 도메인을 포함하는 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 (예를 들어 내인성 설치류 Sirpα 유전자의 파괴 또는 치환의 결과로서) 내인성 설치류 Sirpα 단백질을 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tpo(트롬보포이에틴) 유전자를 그의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류 Tpo 유전자의 인간화는, 예를 들어 미국 특허 제8541646호(Regeneron Pharmaceuticals Inc., Yale University, 및 Institute for Research in Biomedicine IRB), 및 Rongvaux 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108(6): 2378-2383]에 기술되었으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 인간화는 내인성 설치류 Tpo 유전자를 인간 TPO 유전자와 치환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자로부터 인간 TPO 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 인간화 Top 유전자를 포함하는 설치류는 (예를 들어 내인성 설치류 Tpo 유전자의 파괴 또는 치환의 결과로서) 내인성 설치류 Tpo 단백질을 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는, 내인성 설치류 GM-CSF 유전자가 인간 GM-CSF 유전자로 치환되고 내인성 설치류 IL-3 유전자가 인간 IL-3 유전자로 치환된 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 그의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류 GM-CSF/IL-3 유전자의 인간화는, 예를 들어 미국 특허 제8541646호(Regeneron Pharmaceuticals Inc., Yale University, 및 Institute for Research in Biomedicine IRB), 및 Willinger 등의 문헌[PNAS, 108(6):2390-2395, 2011]에 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌로부터 인간 GM-CSF 및 인간 IL-3을 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 (예를 들어 내인성 설치류 GM-CSF/IL-3 유전자의 파괴 또는 치환의 결과로서) 내인성 설치류 GM-CSF 단백질을 발현할 수 없고 내인성 설치류 IL-3 단백질을 발현할 수 없다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 그의 내인성 RAG2 유전자가 파괴되었고; 일부 구현예에서, 설치류는 파괴에 대해 동형접합체(RAG2-/- 또는 RAG 녹아웃)이고, 내인성 RAG2 단백질을 발현할 수 없다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 그의 내인성 IL-2RG 유전자가 파괴되었고; 일부 구현예에서, 설치류는 파괴에 대해 동형접합체(IL-2RG-/ 또는 IL-2RG 녹아웃)이고, 내인성 IL-2RG 단백질(“ηc”로도 알려짐)을 발현할 수 없다. RAG2 및 IL-2RG 이중 녹아웃(DKO) 설치류는 알려진 면역결핍 설치류이며(예를 들어 Traggiai E 등의 문헌[(2004) Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science 304:104-107]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), (예를 들어 Taconic Biosciences, Inc., New York으로부터) 상업적으로 쉽게 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 이형접합체이거나 동형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자 및 인간화 Tslpr 유전자, 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 동형접합체이거나 이형접합체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 및 인간화 Sirpα 유전자를 포함하며, RAG2 및 IL-2RG 유전자 둘 다에 대해 동형접합성 널이다. 일부 이러한 구현예에서, 설치류는 인간화 Tpo 유전자 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 이의 게놈에 추가로 포함한다. 설치류는 인간화 유전자에 대해 동형접합체이거나 이형접합체일 수 있다.
설치류 종 및 계통
일부 구현예에서, 본 개시의 설치류는 비제한적인 예로서 마우스, 랫트, 및 햄스터를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류는 쥐상과 아목으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 설치류는 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스 유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 미국 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(트루 마우스 및 랫트, 사막쥐, 아프리카 가시쥐, 갈기쥐), 네소미스과(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스(rock mice), 흰꼬리 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 두더쥐쥐, 대나무쥐, 및 조코(zokors))로부터 선택된 과로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 설치류는 트루 마우스 또는 랫트(쥐상과), 사막쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 갈기쥐(crested rat)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 마우스는 쥣과의 구성원으로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 계통으로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통의 마우스이다(예를 들어 Festing 등의 문헌[1999, Mammalian Genome 10:836]; Auerbach 등의 문헌[2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032] 참조). 일부 구현예에서, 설치류는 129 계통과 C57BL/6 계통의 잡종인 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 전술한 129 계통의 잡종이거나 전술한 BL/6 계통의 잡종인 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통의 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 BALB 계통과 전술한 또 다른 계통의 잡종인 마우스이다.
일부 구현예에서, 설치류는 랫트이다. 일부 소정의 구현예에서, 랫트는 위스타 랫트(Wistar rat), LEA 계통, 스프래그 다울리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 랫트 계통은 위스타, LEA, 스프래그 다울리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 계통의 잡종이다.
유전적으로 변형된 설치류의 조직 및 세포
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 게놈을 가진 단리된 설치류 세포 또는 조직이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 세포 또는 조직은 전술한 추가의 유전적 변형(예: 인간화 Sirpα 유전자, RAG2-/- 및 IL-2RG-/-, 인간화 Tpo 유전자, 또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌) 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조직은 지방, 방광, 뇌, 가슴, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 상피 세포, 각질 세포, 수지상 세포, 림프구(예를 들어 B 또는 T 세포), 대식세포, 비만 세포, 및 호염기구로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 세포는 설치류 난자 또는 설치류 정자이다.
인간화 설치류를 만들기 위한 조성물 및 방법
표적화 벡터(또는 핵산 작제물)이 본원에 개시되며, 상기 벡터는 본원에 기술된 것과 같은 인간화 유전자를 형성하기 위해 설치류 유전자좌에 통합하고자 하는 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열, 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열, 또는 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 본원에서 전술한 것과 같은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 아미노산 29~159를 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질의 제1 아미노산에 대한 코돈에서 시작하여 엑손 1에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 본원에서 전술한 것과 같은 인간 TSLP 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열은 서열번호 23의 아미노산 27~231을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열은 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 마지막 엑토도메인 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈까지 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 본원에서 전술한 것과 같은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43의 아미노산 21~236을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열은 인간 IL7RA 유전자의 성숙한 IL7RA 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지(및 일부 구현예에서는 인트론 5의 5’ 부분까지) 포함한다.
표적화 벡터는, 본원에서 전술한 것과 같은 인간화 유전자를 형성하기 위해, 통합될 인간 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하고, 상동성 재조합 및 인간 뉴클레오티드 서열의 표적 설치류 유전자좌(예: 내인성 설치류 Tslp 유전자좌, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌, 또는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌) 내로의 통합을 매개하는 5’ 및 3’ 설치류 서열(5’ 및 3’ 상동 아암으로도 알려짐)을 또한 포함한다. 일반적으로, 5’ 및 3’ 측면 설치류 서열은, 인간 뉴클레오티드 서열에 의해 치환될 표적 설치류 유전자좌에 있는 상응하는 설치류 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 전술한 것과 같은 인간화 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 전술한 것과 같은 인간 TSLP 뉴클레오티드 서열 및 설치류 Tslp 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Tslp 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 전술한 것과 같은 인간 TSLPR 뉴클레오티드 서열 및 설치류 Tslpa 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Tslpr 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 전술한 것과 같은 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열 및 설치류 Il7ra 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인간화 Il7ra 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터는 선택 마커 유전자를 포함한다. 선택 마커 유전자는 통합될 인간 게놈 서열의 인트론에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커 유전자는 인간 뉴클레오티드 서열의 성공적인 통합 후에 결실될 수 있는 자가 결실 카세트로서 제공된다.
예시적인 구현예에서, 표적화 벡터는 박테리아 상동성 재조합 및 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 설치류 Tslp, Tslpr, 또는 Il7ra 게놈 DNA를 가진 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론으로부터 생성된다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등의 문헌[(2003) Nature Biotech. 21(6):652-659]을 참조하고, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 박테리아 상동성 재조합의 결과로서, 설치류 게놈 서열이 BAC 클론으로부터 결실되고, 인간 뉴클레오티드 서열이 삽입되어, 5’ 및 3’ 설치류 상동성 아암이 측면에 위치한 인간 뉴클레오티드 서열을 갖는 변형된 BAC 클론이 생성된다. 일부 구현예에서, 인간 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열이거나 인간 게놈 DNA일 수 있다. 변형된 BAC 클론은, 선형화된 후, 설치류 배아 줄기(ES) 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 변형된 비인간 배아 줄기(ES) 세포를 만들기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터의 용도를 제공한다. 표적화 벡터는, 예를 들어 전기천공에 의해 설치류 ES 세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 ES 세포와 랫트 ES 세포 모두는 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 마우스 ES 세포, 및 유전적으로 변형된 마우스를 만들기 위한 VELOCIMOUSE® 방법을 기술하는 US 제7,576,259, US 7,659,442, US 제7,294,754, 및 US 2008-0078000 A1(이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨); 변형된 설치류 배아를 만드는 데 사용되어, 궁극적으로 설치류 동물을 만드는 데 사용될 수 있는 랫트 ES 세포 및 유전적으로 변형된 랫트를 만들기 위한 방법을 기술하는 US 2014/0235933 A1(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), US 2014/0310828 A1(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), Tong 등의 (2010) 문헌[Nature 467:211-215], 및 Tong 등의 (2011) 문헌[ Nat Protoc. 6(6): doi:10.1038/nprot.2011.338](이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)을 참조한다.
일부 구현예에서, 게놈에 통합된 바람직한 인간 뉴클레오티드 서열(예: 인간 TSLP, 인간 TSLPR, 또는 인간 IL7RA 뉴클레오티드 서열)을 갖는 ES 세포가 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포는 설치류 대립유전자의 상실 및/또는 인간 대립유전자의 획득 검정에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 그런 다음, 선택된 ES 세포는 VELOCIMOUSE® 방법(예: 미국 특허 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 US 2008-0078000 A1 참조, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 통합됨), 또는 US 2014/0235933 A1 및 US 2014/0310828 A1에 기술된 방법을 사용함으로써 상실배 전시기(pre-morula stage)의 배아(예: 8-세포기 배아)에 주입하기 위한 공여자 ES 세포로서 사용된다. 일부 구현예에서, 공여자 ES 세포를 포함하는 배아를 인큐베이션하고 대리모에게 이식하여 F0 설치류를 생산한다. 인간 뉴클레오티드 서열을 가진 설치류 새끼는 설치류 대립유전자 상실 및/또는 인간 대립유전자 획득 검정을 사용해, 꼬리 단편으로부터 단리된 DNA의 유전자형 분석에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 인간화 유전자에 대해 이형접합체인 설치류를 교배시켜 동형접합체 설치류를 생성할 수 있다.
본원에 기술된 것과 같은 인간화 설치류(즉, 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 설치류)를 서로 교배시키거나 다른 설치류와 교배시킬 수 있다. 따라서, 이러한 교배 방법을 비롯하여 이러한 교배로부터 수득된 자손도 본 개시의 구현예이다.
일부 구현예에서, 본원에서 전술한 것과 같은 제1 설치류, 예를 들어 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 게놈을 가진 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 인간화 Tslp, Tslpr, 및/또는 Il7ra 유전자(들)을 포함하는 게놈을 가진 자손 설치류를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 자손은 교배에 사용된 제2 설치류로부터 물려받은 다른 바람직한 표현형 또는 유전자 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 제1 설치류 유래의 인간화 유전자(들)에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 제1 설치류 유래의 인간화 유전자(들)에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 교배에 사용된 제2 설치류는 추가의 유전적 변형, 예를 들어 인간화 Sirpα 유전자, RAG2-/- 및 IL-2RG-/-, 인간화 Tpo 유전자, 또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간화 Tslp 유전자, 인간화 Tslpr 유전자, 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하는 게놈을 가진 자손 설치류가 제공되며, 여기서 자손 설치류는, 인간화 Tslp 유전자(들)를 포함하는 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 제1 설치류 유래의 인간화 유전자(들)에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 제1 설치류 유래의 인간화 유전자(들)에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 TSLP 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Tslp 게놈 DNA를 인간 TSLP 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Tslp 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 TSLPR 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslpr 유전자에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 TSLP 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 인간 TSLPR 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Tslpr 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 인간 IL7RA 핵산 서열을 내인성 설치류 Il7ra 유전자에 통합하는 것을 매개하는 설치류 상동 아암이 측면에 위치하고, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터를 설치류 세포에 도입하여, 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 인간 IL7RA 핵산 서열과 치환하여 본원에 기술된 것과 같은 인간화 Il7ra 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포는 설치류 ES 세포이고, 상기 방법은 유전적으로 변형된 설치류 ES 세포를 생성한다.
인간화 설치류의 사용 방법
본원에 개시된 설치류는 인간 질환(특히 TSLP 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 Th2-유발성 알레르기성 질환, 천식, 및 암 포함)을 치료하는 효능에 대해 화합물을 식별하고 시험하는 데 유용한 생체내 시스템 및 이를 위한 생물학적 물질의 공급원을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은 TSLP 신호전달을 표적으로 하는, 예를 들어 인간 TSLP, 인간 TSLPR, 또는 인간 IL7RA를 표적으로 하는 제제를 개발하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류는 인간 TSLP, 인간 TSLPR, 또는 인간 IL7RA에 특이적으로 결합하는 후보 제제(예: 항체)를 스크리닝하고 개발하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은 제제(예: 항체)의 결합 프로파일을 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은 인간 TSLP, TSLPR, 또는 IL7RA 활성을 차단하거나 조절하는 효과를 측정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은 인간 TSLP에 결합하여 이를 억제하는 후보 제제에 노출되며, 인간 TSLP-의존적 프로세스에 미치는 효과에 대해 분석된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 설치류는 알레르기성 질환의 모델로서 사용된다. 일부 구현예에서, 알레르기성 질환은 기도 염증(예: 천식)을 포함한다.
일부 구현예에서, 폐 염증의 ova-alum 모델이 Tslp 신호전달을 평가하는 데 사용된다. 폐 염증의 ova-alum 모델은 당업계에 잘 문서화되어 있다(Al-Shami 등의 문헌[JEM Vol. 202, No. 6, 829-839, 2005]; Chu 등의 문헌[J.Allergy Clin Immunol 2013;131:187-200], 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, 수산화알루미늄에 유화된 OVA, 또는 (대조군으로서) 수산화알루미늄 단독이 설치류 동물(예를 들어 마우스, 예컨대 본원에 개시된 것과 같이 Tslp, Tslpr, 및/또는 Il7ra 중 하나 이상에 대해 인간화된 마우스, 또는 인간화되지 않은 야생형 마우스)에게 복강내 투여된다. 그런 다음, 마우스에게 OVA를 비강내 접종하고, 이어서 예를 들어 혈청 ova-특이적 IgE 및 ova-특이적 -IgG1, 배상 세포 화생, 및/또는 폐 조직 호산구증가증을 포함하여, 폐 염증을 나타내는 파라미터에 대해 분석한다. 일부 구현예에서, 천식 폐의 기도에서 과발현된 대표적인 뮤신 유전자인 Muc5ac의 폐 발현을 접종 후에 분석하는데, 이는 배상 세포 화생에 대한 대리 평가변수의 역할을 할 수 있다. 예시적인 프로토콜에서, 2 mg의 수산화알루미늄에 유화된 50 μg의 OVA 또는 2 mg의 수산화알루미늄 단독을 설치류 동물(예를 들어 본원에 개시된 바와 같이 Tslp 및 Tslpr에 대해 이중 인간화된 마우스, Tslp, Tslpr, 및 Il7ra에 대해 삼중 인간화된 마우스, 또는 인간화되지 않은 야생형 마우스)에게 1일차 및 14일차에 복강내 투여한다. 마취시킨 마우스에게 PBS 중 150 μg의 OVA를 21일차부터 4일 동안 비강내 투여한다. 마지막 접종 후 24시간 시점에 혈청 Ova-특이적 IgE 및 Ova-특이적 -IgG1, 배상 세포 화생, 및/또는 폐 조직 호산구 증가증에 대해 마우스를 분석한다. 일부 구현예에서, 천식 폐의 기도에서 과발현된 대표적인 뮤신 유전자인 Muc5ac의 폐 발현을 접종 후에 분석하는데, 이는 배상 세포 화생에 대한 대리 평가변수의 역할을 할 수 있다.
일부 구현예에서, 일정 기간 동안 알레르겐(예: 집먼지 진드기 추출물 또는 “HDM” 모델)을 1회 이상의 투여량으로 설치류에게 비강내 투여함으로써 설치류에서 기도 염증을 유도할 수 있고, 점액 축적, 기관지 폐포 세척액 중 호산구 침윤 세포, 총 순환 IgE의 수준, 및/또는 마이크로어레이 발현 분석에 의해 측정할 수 있는 발현 프로파일의 변화에 기초하여 기도 염증을 측정할 수 있다. 후보 치료제의 효과는, ova-alum 모델 또는 HDM 모델 중 어느 하나에서, 기도 염증의 정도가 제제를 투여한 결과로서 감소되는지 여부를 측정함으로써 결정할 수 있다. 시험되는 제제 및 기도 염증을 유도하기 위해 사용되는 알레르겐은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 1회 이상의 투여량으로 설치류에 제공되고, 시험되는 제제는 적어도 1회 투여량의 알레르겐이 설치류에 투여된 후에 설치류에 투여된다.
일부 구현예에서, 알레르기성 질환은 피부 염증 또는 아토피성 피부염을 포함한다. 피부 염증은 피부 손상을 생성하고, 손상된 피부를 일정 시간 동안 1회 이상의 투여량의 알레르겐(예를 들어 박테리아 독소 또는 집먼지 진드기 추출물)에 노출함으로써 설치류에서 유도할 수 있다. 제제의 효과는 (예를 들어 IgE 수준, 소양증, 표피 비후, 및 아토피성 피부염의 다른 전형적인 증상을 평가함으로써 결정했을 때) 피부 염증이 제제의 투여의 결과로서 감소되는지 여부를 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은, 예를 들어 인간 암 세포를 표적으로 하는 치료제의 효능을 평가하기 위해, Th2-유발성 암과 같은 암에 대한 동물 모델로서 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물에게 인간 암세포를 생착하고, 이러한 인간 암세포를 표적으로 하는 후보 약물을 설치류 동물에게 투여한다. 그런 다음, 약물의 치료 효능은 약물의 투여 후 설치류 동물에서 인간 암세포를 모니터링함으로써, 예를 들어 약물 투여의 결과로서 설치류 동물에서 인간 암세포의 성장 또는 전이가 억제되는지 여부를 평가함으로써 결정할 수 있다. 설치류 동물에 생착하기에 적합한 인간 암 세포는, 예를 들어 특히 유방암 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 결장암 세포, 흑색종을 포함한다. 비인간 동물에서 시험할 수 있는 약물은 인간 세포를 표적화(예를 들어, 이에 결합 및/또는 이에 작용) 함으로써 인간 질환 및 병태의 치료를 위한 의도된 치료 효과를 갖는 소분자 화합물, 즉, 분자량이 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, 또는 800 달톤 미만인화합물, 고분자 화합물(예를 들어, 단백질, 예를 들어, 항체)을 포함한다.
본 명세서는 다음의 실시예들에 의해 추가로 예시되며, 이들 실시예는 어떤 방식으로도 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 모든 인용된 참조 문헌(문헌 참조, 발행된 특허 및 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 명백하게 포함된다.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 명세서에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 실시되고 평가되는지에 관한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 순수하게 예시적인 것으로 의도되며, 본 개시를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1. 인간화 Tslp 마우스의 생성
VELOCIGENE® 기술을 사용해 마우스 Tslp 유전자좌를 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등의 문헌[(2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659], 이들 모두는 참조로서 본원에 통합됨). 생성된 인간화 Tslp 유전자좌는 다음을 포함하였다: 마우스 Tslp 프로모터, 마우스 Tslp 엑손 1, 부분적으로 마우스 Tslp 엑손 2(엑손 2의 5’ 말단에서부터 마우스 Tslp 신호 펩티드의 마지막 아미노산을 암호화하는 코돈까지), 부분적으로 인간 TSLP 엑손 1(성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 코돈에서부터 엑손 1의 3’ 말단까지)에서 인간 TSLP 엑손 4의 종결 코돈까지, 이어서 마우스 Tslp 3’ UTR 및 하류 마우스 게놈 서열. 도 1a 내지 1c 참조.
마우스 Tslp 유전자좌를 인간화하기 위해, 다음의 마우스 및 인간 서열에 기초하여 표적화 핵산 작제물을 생성하였다:
NCBI GeneID RefSeq
mRNA ID		 UniProt
ID		 게놈
조립		 위치
마우스
Tslp		 53603 NM_021367 Q9JIE6 GRCm38/mm10 chr18:32,815,383-32,819,799　(+)
인간 TSLP 85480 NM_033035 Q969D9 GRCh38/hg38 chr5: 111,070,062-111,078,026 (+)
게놈 빌드 시작 종료 길이(bp)
5' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr18: 32701299 Chr18: 32815620 114322
인간 게놈 단편 1 GRCh38/hg38 Chr5:111071975 Chr5: 111,073,902 1928
인간 게놈 단편 2 GRCh38/hg38 chr5:111,073,903 Chr5: 111,076,074
2172
3' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr18:32819107 Chr18:32884365 65259
표적화 핵산 작제물은 5’에서 3’ 방향으로 다음을 함유하였다:
(i) 성숙한 마우스 Tslp 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 마우스 Tslp 엑손 2의 코돈의 상류에 있는 114.3 kb의 5’ 마우스 상동 아암(도 1b 참조);
(ii) 성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산(아미노산 29)을 암호화하는 인간 TSLP 엑손 1의 코돈에서 시작하여 인간 TSLP 엑손 3의 단부 이후 257 bp에서 끝나는, “인간 게놈 단편 1”로서 명명된 1.9 kb의 인간 TSLP 게놈 서열(도 1b 참조);
(iii) 인간 TSLP의 인트론 3에 삽입된, “Floxed HUb-Puro”(인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, LoxP 부위가 측면에 위치한 퓨로마이신 내성 유전자)로 명명된 4.4 kb의 선택 카세트(도 1b 참조);
(iv) 인간 TSLP 엑손 3의 단부 이후 258 bp에서 시작하여 인간 TSLP 엑손 4의 종결 코돈에서 끝나는, “인간 게놈 단편 2”로서 명명된 2.2 kb의 인간 TSLP 게놈 서열(도 1b 참조); 및
(v) 마우스 Tslp 엑손 5의 3’ UTR 서열 및 하류 마우스 게놈 서열을 포함하는 약 65.3 kb의 3’ 마우스 상동 아암(도 1b 참조).
표적화 핵산 작제물을 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포 내로 전기천공하였다. 성공적인 통합은, 예를 들어 Valenzuela 등의 전술한 문헌에 기술된 바와 같이, 대립유전자 변형(MOA) 검정에 확인하였다. 인간 TSLP 서열의 존재를 검출하고 마우스 Tslp 서열의 상실 및/또는 유지를 확인하기 위한 MOA 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 6에 기술되어 있고, 이들의 위치는 도 1b에 도시되어 있다.
7466hTU
순방향 CAGATGCGGACATCCAAAGGAT (서열번호 9)
프로브(FAM) TACTCACAAGCATAGTGCTATGTGCA (서열번호 10)
역방향 CCCTTCCCTCAAGCCATAAC (서열번호 11)
7466hTD
순방향 GCCCAGTGTACTACTCAAAGGTA (서열번호 12)
프로브(Cal) TACTGCAATCCTCTTTAAAATAAGC (서열번호 13)
역방향 CCCATTGTCTAGATGTGTCACAGA (서열번호 14)
7466mTU
순방향 GGCTGACAACAGATATGGATATTGG (서열번호 15)
프로브(FAM) ACTGCTTGGTACAGAATGGGAATCC (서열번호 16)
역방향 CACGGCTTCATGTCTTAGCTG (서열번호 17)
7466mTD
순방향 GTGCTGAGAGACAGGGCATTC (서열번호 18)
프로브(Cal) TGGAGAAGCACATGCAATCATACCGT (서열번호 19)
역방향 GGCTGAGTGGCACTATGTTTC (서열번호 20)
정확하게 표적화된 ES 세포 클론을 선택한 후에는 퓨로마이신 선택 카세트를 절제하였다. 생성된 인간화 Tslp 유전자의 코딩 서열 및 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 6 및 서열번호 5에 각각 제시되어 있다. 마우스 Tslp(서열번호 1), 인간 TSLP(서열번호 3), 및 인간화 Tslp(서열번호 5) 단백질 서열의 정렬은 도 1f에 제공되어 있다.
양성으로 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로서 사용하여, VELOCIMOUSE® 방법에 의해 상실배 전단계(8 세포) 마우스 배아에 미세주입하였다(예를 들어 미국 특허 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 US 2008-0078000 A1을 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 공여자 ES 세포를 포함하는 마우스 배아를 시험관내에서 인큐베이션한 다음, 대리모에게 이식하여 공여자 ES 세포로부터 전적으로 유래된 F0 마우스를 생산하였다. 인간화 Tslp 유전자를 가진 마우스를 전술한 MOA 검정을 사용하여 유전자형 분석에 의해 식별하였다. 인간화 Tslp 유전자에 대해 이형접합체인 마우스를 동형접합체와 교배시켰다.
Tslp 인간화에 대해 동형접합성인 마우스가 인간화 Tslp 단백질을 발현했는지 여부를 결정하기 위해, 마우스를 안락사시키고 심장 천자를 통해 채혈하였다. 혈액을 혈청 분리 튜브에 채취하여 혈청을 제조하였다. 혈청 내 인간 TSLP 수준은 인간 Quantikine TSLP ELISA(R&D systems; Cat # DTSLP0)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 결정하였다. 또한, 1000 pg/mL의 재조합 쥣과 Tslp(R&D systems Cat #555-TS-010)를 음성 대조군으로 사용하여 ELISA의 종 특이성을 검증하고(데이터 미도시), 정상 인간 혈청(NHS)을 양성 대조군으로 사용하였다. 전술한 것과 같이, Tslp 인간화에 대해 이형접합체인 마우스는 혈청에서 성숙한 인간 TSLP을 발현하는 것으로 확인되었다(도 1g).
실시예 2. 인간화 Tslpr 마우스의 생성
VELOCIGENE® 기술을 사용해 마우스 Tslp 유전자좌를 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등의 문헌[(2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659]을 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 생성된 인간화 Tslpr 유전자좌는 다음을 포함하였다: 마우스 Tslpr 프로모터, 마우스 Tslpr 엑손 1(5’ UTR, 및 마우스 Tslpr 신호 펩티드 및 마우스 Tslpr 성숙한 단백질의 첫 7개의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함함), 부분적으로 마우스 Tslpr 인트론 1(엑손 2 이전 최대 328 bp), 부분적으로 인간 TSLPR 인트론 1(엑손 2 이전 909 bp에서 시작함), 인간 TSLPR 엑손 2에서부터 엑손 6의 첫 47 bp까지(인간 TSLPR 엑토도메인, 즉 아미노산 27에서부터 막관통 도메인 직전까지를 실질적으로 암호화함), 48번째 bp에서 시작하여 엑손 8까지의 마우스 Tslpr 엑손 6(마우스 Tslpr 막관통 도메인과 세포내 도메인을 암호화하고, 마우스 Tslpr 3’ UTR을 포함함), 이어서 하류 마우스 게놈 서열. 도 2a 내지 2c 참조.
마우스 Tslpr 유전자좌를 인간화하기 위해, 다음의 서열 정보에 기초하여 표적화 핵산 작제물을 생성하였다:
NCBI 유전자 ID: RefSeq
mRNA ID 		UniProt
ID 		게놈
조립 		위치
마우스
Tslpr		 57914 NM_001164735 Q8CII9 GRCm38/mm10 chr5:109,554,709-109,558,993　(-)
인간 TSLPR 64109 NM_022148 Q9HC73 GRCh38/hg38 Chr X:1,187,549-1,212,750 (-)
게놈 빌드 시작 종료 길이(bp)
5' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr5: 109557943 Chr5: 109586999 29057
인간 삽입 GRCh37/hg37 ChrX:1314968 ChrX:1328710 13743
3' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr5: 109422337 Chr5: 109555580 133244
표적화 핵산 작제물은 5’에서 3’ 방향으로 다음을 함유하였다:
(i) 약 29.1 kb의 5’ 마우스 상동 아암 및 마우스 Tslpr 엑손 2 전의 최대 328 bp(도 2b 참조);
(ii) 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 내성 유전자를 함유하고, LoxP 부위가 측면에 위치하는 자가 결실 선택 카세트(“Floxed HUb-Neo”)(도 2b 참조);
(iii) 인간 TSLPR의 엑손 2 이전 909 bp에서 시작하여 엑손 6의 첫 47 bp까지 포함하고, 인간 TSLPR 엑토도메인을 실질적으로 암호화하는 13743 bp의 인간 TSLPR 핵산 서열, 즉 아미노산 27 내지 아미노산 231을 포함하는 핵산 서열(인간 TSLPR에서: 아미노산 1~22는 신호 펩티드를 구성하고 아미노산 232~252는 막관통 도메인을 구성함)(도 2b 참조); 및
(iv) 엑손 6의 48번째 bp에서 시작하여 엑손 8까지를 포함하고, 마우스 Tslpr 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 암호화하고, 마우스 Tslpr 3’ UTR에 이어서 하류 마우스 게놈 서열을 포함하는, 약 133.2 kb의 3’ 마우스 상동 아암(도. 2b 참조).
표적화 핵산 작제물을 마우스 배아 줄기(ES) 세포 내로 전기천공하였다. 성공적인 통합은, 예를 들어 Valenzuela 등의 전술한 문헌에 기술된 바와 같이, 대립유전자 변형(MOA) 검정에 확인하였다. 인간 TSLPR 서열의 존재를 검출하고 마우스 Tslpr 서열의 상실 및/또는 유지를 확인하기 위한 MOA 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 9에 기술되어 있고, 이들의 위치는 도 2b에 도시되어 있다. 정확히 표적화된 ES 세포 클론이 선택된 후에는 네오마이신 선택 카세트를 절제할 수 있다. 카세트가 있거나 없는 표적화된 (인간화) Tslpr 대립유전자의 게놈 서열은 서열번호 63 및 64에 각각 제시되어 있다. 생성된 인간화 Tslpr 유전자의 코딩 서열 및 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 26 및 서열번호 25에 각각 제시되어 있다. 마우스 Tslpr(서열번호 21), 인간 TSLPR(서열번호 23), 및 인간화 Tslpr(서열번호 25) 단백질 서열의 정렬은 도 2f에 제공되어 있다.
7558hTU
순방향 TGCCTCACCGTGAACTTCATG (서열번호 29)
프로브(FAM) CGTCTCTCTGTGTCTAGCAGAAGGA (서열번호 30)
역방향 TCACCTGCACGGTTTCTAAATTG (서열번호 31)
7558hTD
순방향 CAGCCGCACGTCATGTTG (서열번호 32)
프로브(Cal) TGACAGCCGCCTTTTCATTTTGTTTCA (서열번호 33)
역방향 GGACAGCTTTGGTTTGGGA (서열번호 34)
7558mTU
순방향 GCTAGCTGCTCATTGCATTCG (서열번호 35)
프로브(FAM) AGAAGCGCTTTCCATATTCATGAGCCC (서열번호 36)
역방향 GGGCGACACCTCATTTGCAT (서열번호 37)
7558mTD
순방향 GGGTCTGGGTAAGATGAACTCA (서열번호 38)
프로브(Cal) TCGGCTCCTGGATGCTTGACA (서열번호 39)
역방향 CATCCGGGTCACCAATGATG (서열번호 40)
양성으로 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로서 사용하여, VELOCIMOUSE® 방법에 의해 상실배 전단계(8 세포) 마우스 배아에 미세주입하였다(예를 들어 미국 특허 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 US 2008-0078000 A1 참조, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 공여자 ES 세포를 포함하는 마우스 배아를 시험관내에서 인큐베이션한 다음, 대리모에게 이식하여 공여자 ES 세포로부터 전적으로 유래된 F0 마우스를 생산하였다. 인간화 Tslpr 유전자를 가진 마우스를 전술한 MOA 검정을 사용하여 유전자형 분석에 의해 식별하였다. 인간화 Tslpr 유전자에 대해 이형접합체인 마우스를 동형접합체와 교배시켰다.
실시예 3. 인간화 Il7ra 마우스의 생성
VELOCIGENE® 기술을 사용해 마우스 Il7ra 유전자좌를 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela 등의 문헌[(2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. 21(6): 652-659], 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 생성된 인간화 Il7ra 유전자좌는 다음을 포함하였다: 마우스 Il7ra 프로모터, 부분적으로 마우스 Il7ra 엑손 1(5’ UTR 및 시작 코돈에서부터 첫 68 bps(마우스 Il7ra 신호 펩티드를 암호화함), 및 마우스 Il7ra 성숙한 단백질의 첫 3개의 아미노산을 포함함), 부분적으로 인간 IL7RA 엑손 1(엑손 1의 마지막 14 bps), 인간 IL7RA 인트론 1, 인간 IL7RA 엑손 2 내지 엑손 5, 부분적으로 인간 IL7RA 인트론 5, 부분적으로 마우스 Il7ra 인트론 5, 마우스 Il7ra 엑손 6 내지 엑손 8(마우스 Il7ra 엑토도메인의 마지막 2개의 아미노산, 마우스 Il7ra의 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 암호화하고, 마우스 Il7ra 3’ UTR을 포함함). 도 3a 내지 도 3f 참조.
마우스 Il7ra 유전자좌를 인간화하기 위해, 다음의 서열 정보에 기초하여 표적화 핵산 작제물을 생성하였다:
NCBI 유전자 ID: RefSeq
mRNA ID 		UniProt
ID 		게놈
조립 		위치
마우스
Il7ra		 16197 NM_008372 P16872 GRCm38/mm10 chr15: 9,505,788-9,530,176 (-)
인간 IL7RA 3575 NM_002185 P16871 GRCh38/hg38 chr5: 35,852,695-35,879,603 (+)
게놈 빌드 시작 종료 길이(bp)
5' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr15: 9529675 Chr15: 9578484 48810
인간 삽입 GRCh38/hg38 Chr5:35857046 Chr5:35874277 17232
3' 마우스 아암 GRCm38/mm10 Chr15: 9386119 Chr15: 9510439 124321
표적화 핵산 작제물은 5’에서 3’ 방향으로 다음을 함유하였다:
(i) 약 48.8 kb 이상의 5’ 마우스 상동 아암(마우스 Il7ra 5’ 서열 내지 엑손 1의 일부, 즉 5’ UTR 및 시작 코돈에서부터 첫 68 bps)(도 3b 및 도 3e 참조);
(ii) 126 bp의 인간 게놈 단편 1(서열 번호 69) (인간 IL7RA의 엑손 1의 마지막 14 bps 및 인트론 1의 첫 112 bps를 포함함)(도 3b 및 도 3e 참조);
(iii) LoxP 부위가 측면에 위치하는 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동가능하게 연결된 하이그로마이신 내성 유전자를 함유하는 약 5.2 kb의 자가 결실 선택 카세트(“Floxed HUb-Hyg”)(도 3b 참조);
(iv) 인간 IL7RA의 인트론 1의 3’ 부분, 엑손 2 내지 엑손 5, 및 인트론 5의 5’ 부분을 포함하는, 17106 bp의 인간 게놈 단편 2(도 3b 참조); 및
(v) 마우스 Il7ra(마우스 Il7ra 3’ UTR을 포함함)의 인트론 5의 3’ 부분, 엑손 6 내지 엑손 8, 이어서 하류의 마우스 게놈 서열을 포함하는, 약 124.3 kb의 3’ 마우스 상동(도 3b 및 3f 참조). 마우스 Il7ra의 엑손 6 내지 엑손 8은 마우스 Il7ra의 엑토도메인의 마지막 2개의 아미노산(Gly-Trp), 마우스 Il7ra의 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 암호화한다.
표적화 핵산 작제물을 F1H4 마우스 배아 줄기(ES) 세포 내로 전기천공하였다. 성공적인 통합은, 예를 들어 Valenzuela 등의 전술한 문헌에 기술된 바와 같이, 대립유전자 변형(MOA) 검정에 확인하였다. 인간 IL7RA 서열의 존재를 검출하고, 마우스 Il7ra 서열의 상실 및/또는 잔류를 확인하기 위한 MOA 검정에 사용한 파라이머 및 프로브는 표 12에 기술되어 있고, 이들의 위치는 도 3b에 도시되어 있다. 정확하게 표적화된 ES 세포 클론을 선택한 후에는, 하이그로마이신 선택 카세트를 절제할 수 있다. 카세트가 있거나 없는 표적화된 (인간화) Il7ra 대립유전자의 게놈 서열은 서열번호 65 및 66에 각각 제시되어 있다. 인간화 Il7ra 유전자의 코딩 서열 및 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 46 및 서열번호 45에 각각 제시되어 있다. 마우스 Il7ra(서열번호 41) 단백질 서열 및 인간 IL7RA(서열번호 43) 단백질 서열의 정렬은 도 3f에 제공되어 있다.
7266hTU2
순방향 GGGATCAATACTATGGGTGGTTTATAA (서열번호 49)
프로브(FAM) ACCTCAGTATTCTCAAGAAG (서열번호 50)
역방향 CTACACTTGGGAGTGAAATGCATT (서열번호 51)
7266hTD
순방향 GGAGGGCACTCTTACACTTTC (서열번호 52)
프로브(Cal) TTGGAGAATGACTTGCCTGCTGTC (서열번호 53)
역방향 CCTCTGCTTCCTTGTTCTTCACA (서열번호 54)
7266mTU
순방향 CAGGGCAAGCAAGAATTTAGCA (서열번호 55)
프로브(FAM) TGTGGGTATTAATCACCAGGACAGAGGG (서열번호 56)
역방향 ACAAGCCATTTGCAGTATTGTCA (서열번호 57)
7266mTD2
순방향 TGGGTCAGTTTGGCTATCCAT (서열번호 58)
프로브(Cal) TCTTTTCCCAGAACAATGAAGATGCTATGG (서열번호 59)
역방향 TGCTTTGGGTACTGTCCTGAAG (서열번호 60)
양성으로 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로서 사용하여, VELOCIMOUSE® 방법에 의해 상실배 전단계(8 세포) 마우스 배아에 미세주입하였다(예를 들어 미국 특허 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 US 2008-0078000 A1 참조, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 공여자 ES 세포를 포함하는 마우스 배아를 시험관내에서 인큐베이션한 다음, 대리모에게 이식하여 공여자 ES 세포로부터 전적으로 유래된 F0 마우스를 생산하였다. 인간화 Il7ra 유전자를 가진 마우스를 전술한 MOA 검정을 사용하여 유전자형 분석에 의해 식별하였다. 인간화 Il7ra 유전자에 대해 이형접합체인 마우스를 동형접합체와 교배시켰다.
실시예 4. 야생형, 이중 인간화 마우스( Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu ) 및 삼중 인간화 마우스( Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu /Il7ra hu/hu )에서 Ova-alum 유도성 2형으로 유발한 염증
다양한 인간화 마우스 계통이 2형 유발 염증 모델에서 비슷한 병리를 갖는다는 것을 확인하기 위해, 오브알부민(OVA)/alum-유도성 폐 염증 모델을 사용하였는데, 여기서 TSLP에 대한 역할은 이전에 보고된 적이 있다(Chu 등의 문헌[J Allergy Clin Immunol 2013; 131:187-200.e1-8]을 참조, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨). 전통적인 2형 염증 평가변수, 예컨대 항원 특이적 IgE 및 IgG1의 순환 수준, Muc5ac의 폐 조직 호산구 침윤 및 폐 발현, 천식성 폐의 기도에서 과발현되는 대표적인 뮤신 유전자, 및 배상 세포 화생(GCM)에 대한 대리 평가변수(Wills-Karp 등의 문헌[Science 1998; 282:2258-61], 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨)를 다음 3가지 마우스 계통을 대상으로 평가하였다: 야생형 마우스(WT), 이중 인간화 마우스(Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu ), 및 삼중 인간화 마우스(Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu /IL7R hu/hu ). Tslp, Tslpr, 및 IL7R 분자 각각에 대한 인간화는 실시예 1, 2, 및 3에 각각 기술된 바와 같다.
폐는 혈관이 고도로 분포된 기관이므로, 폐 혈관구조(폐 순환)에서 순환하는 세포들로부터 폐(폐 조직)을 침윤하는 세포는, 호산구 상에서 게이팅하기 전에 CD45-기반 혈관 내 표지화 기술(Anderson 등의 문헌[Nat Protoc 2014; 9:209-22], 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하여 구별하였다. 예상대로, TSLP/OVA 투여는 전체 마우스 계통에서 유사한 수준으로 폐 조직 호산구의 증가를 유도하였다(도 4a). 또한, TSLP/OVA는 유사한 수준의 Muc5ac의 폐 발현(도 4b)을 유도했을 뿐 아니라 유사한 수준의 Ova 특이적 IgE의 순환 수준(도 4c) 및 Ova 특이적 IgG1의 순환 수준(도 4d)도 유도하였다.
방법
Ova-alum-유도 폐 염증. 2 mg의 수산화알루미늄(Sigma Aldrich)에 유화시킨 50μg의 OVA(V 등급; Sigma Aldrich) 또는 2 mg의 수산화알루미늄 단독을 1일차 및 14일차에 WT Balb/c 마우스에게 복강내 투여하였다. 마취시킨 마우스에게 20 μL의 PBS 중 150 μg의 OVA(III 등급; Sigma Aldrich)를 21일차부터 4일 동안 비강내 투여하였다. 마지막 접종 후 24시간 시점에 마우스를 분석하였다.
임상시험 종료 후, 폐 조직에서의 호산구 침윤물, 실시간 qPCR에 의한 폐 유전자 발현, 및 순환하는 혈청 면역글로불린 수준의 분석을 위해 마우스를 희생시키고 혈액 및 폐를 채취하였다.
유세포 분석. 폐에서 순환하는 면역 세포 대 조직 침윤 면역 세포의 유세포 분석을 가능하게 하기 위해, 마우스를 희생시키기 5분 전에 항-CD45 BV650 항체(BD Biosciences)를 마우스에게 정맥 내 주입하여, 혈관구조에 여전히 존재하는 면역 세포를 선택적으로 표지하고, 폐 실질을 침윤시킨 이탈 세포는 표지하지 않았다. 마우스의 꼬리쪽 폐엽을 분해하고, Liberase TH(Roche) 및 DNase I(Roche)의 용액을 사용해 단세포 현탁액을 제조한 다음, 기계적으로 해리시켰다. 그런 다음, 세포를 LIVE/DEAD 고정 세포 염색(BD Biosciences)으로 염색하여 죽은 세포를 배제시키고, 이어서 다음에 대해 항체로 염색하였다: CD45, CD26, Siglec-F, Ly6G, Ly6C, CD11b, CD19, SIRPα, CD23, CD127, Sca-1, CD44, CD4, CD8, TCRb, CD69 CD62L (BD Biosciences); CD64, XCR1, I-A/I-E, CD11c, CD301b (Biolegend); MerTK, ST2 (eBioscience). HTS 부착물(BD)을 사용해 LSR Fortessa X-20 또는 FACSymphony 세포 분석기를 이용해 샘플을 확보하였다. 데이터 분석은 FlowJo v10 소프트웨어(BD)를 사용하여 수행하였다.
혈청 IgE 및 항원 특이적 IgE 또는 IgG1의 측정. 마이크로테이너 SST 혈청 튜브에 전혈을 수집하고, 4℃에서 15,000g로 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 혈청 샘플을 사용해 다음 농도를 결정하였다: IgE 샌드위치 ELISA OptEIA 키트(BD Biosciences)에 의한 총 IgE 농도; 간접 ELISA(Chondrex)에 의한 총 항-Ova IgE 및 항-Ova IgG1 농도; 샌드위치 ELISA(Chondrex)에 의한 총 항-HDM IgE; 및 인하우스 샌드위치 ELISA에 의한 총 항-HDM IgG1역가. 모든 ELISA 키트에 대해 제조사의 지침을 따랐다.
Muc5ac의 측정. 수확된 폐 조직에서 폐 Muc5ac 유전자 발현을 실시간 qPCR에 의해 검출하고 하우스키핑 유전자에 대해 정규화하였다. 요약하자면, 연구 종료 후, 마우스를 방혈시키고, 각 마우스의 우측 폐의 부엽을 제거하여, 400 μL의 RNA Later가 담긴 튜브에 넣고, -20℃에서 보관하였다. 모든 샘플을 TRIzol에서 균질화하고, 상 분리를 위해 클로로포름을 사용하였다. 총 RNA를 함유하는 수성상을, 제조사의 사양에 따라 마이크로어레이 총 RNA 단리 키트(Ambion by Life Technologies)용 MagMAX™-96을 사용하여 정제하였다. RNase-무함유 DNase 세트(Qiagen)을 사용해 게놈 DNA를 제거하였다. SuperScript® VILO™ Master Mix(Invitrogen by Life Technologies)를 사용해 mRNA를 cDNA로 역전사하였다. cDNA를 2ng/uL로 희석하고, ABI 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용해 SensiFAST 프로브 Hi-ROX(Meridian)로 10ng cDNA를 증폭시켰다. 내부 대조군 유전자를 사용해 임의의 cDNA 입력 차이를 정규화하였다. 대조군 마우스 대비 폐 조직 mRNA 발현 수준의 배수 변화를 측정하고, 하우스키핑 mRNA 발현과 대비하여 표현하였다.
군 MAID 유전자형 감작　i.p. 접종, i.n. 마우스의 수(초기/수확)
A 50500 야생형 (C57BL/6NTac(75%)/129S6SvEvTac(25%)) 염수 + alum 염수 7/7
B 50500 야생형 (C57BL/6NTac(75%)/129S6SvEvTac(25%)) Ova(gV) + alum Ova (gIII), 150μg 8/8
C 7467/7559 Tslphu/hu /Tslprhu/hu 염수 + alum 염수 7/7
D 7467/7559 Tslphu/hu /Tslprhu/hu Ova(gV) + alum Ova (gIII), 150μg 8/8
E 7267/7467/7559 Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu /Il7rahu/hu 염수 + alum 염수 8/8
F 7267/7467/7559 Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu /Il7rahu/hu Ova(gV) + alum Ova (gIII), 150μg 7/7
결론
폐 호산구 침윤, 폐 유전자 발현 분석, 및 순환 항체 수준의 분석에 기초하여, Ova-alum 모델은 이중 인간화(Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu) 및 삼중 인간화(Tslp hu/hu /Tslpr hu/hu /Il7ra hu/hu) 마우스에서 유사한 수준의 2형 유발성 염증을 유도하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED TSLP GENE, A HUMANIZED TSLP RECEPTOR GENE, AND/OR A HUMANIZED IL7RA GENE <130> 37301 (10589WO01) <150> 63/128,258 <151> 2020-12-21 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Val Leu Leu Arg Ser Leu Phe Ile Leu Gln Val Leu Val Arg Met 1 5 10 15 Gly Leu Thr Tyr Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Thr Ser Ile Thr Lys 20 25 30 Ile Tyr Cys Asn Ile Ile Phe His Asp Leu Thr Gly Asp Leu Lys Gly 35 40 45 Ala Lys Phe Glu Gln Ile Glu Asp Cys Glu Ser Lys Pro Ala Cys Leu 50 55 60 Leu Lys Ile Glu Tyr Tyr Thr Leu Asn Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ser 65 70 75 80 Leu Pro Asp Lys Thr Phe Ala Arg Arg Thr Arg Glu Ala Leu Asn Asp 85 90 95 His Cys Pro Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Arg Asn Asp Gly Thr Gln Glu 100 105 110 Met Ala Gln Glu Val Gln Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile 115 120 125 Leu Arg Leu Trp Tyr Ser Phe Met Gln Ser Pro Glu 130 135 140 <210> 2 <211> 423 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atggttcttc tcaggagcct cttcatcctg caagtactag tacggatggg gctaacttac 60 aacttttcta actgcaactt cacgtcaatt acgaaaatat attgtaacat aatttttcat 120 gacctgactg gagatttgaa aggggctaag ttcgagcaaa tcgaggactg tgagagcaag 180 ccagcttgtc tcctgaaaat cgagtactat actctcaatc ctatccctgg ctgcccttca 240 ctccccgaca aaacatttgc ccggagaaca agagaagccc tcaatgacca ctgcccaggc 300 taccctgaaa ctgagagaaa tgacggtact caggaaatgg cacaagaagt ccaaaacatc 360 tgcctgaatc aaacctcaca aattctaaga ttgtggtatt ccttcatgca atctccagaa 420 taa 423 <210> 3 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser 35 40 45 Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn 50 55 60 Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln 65 70 75 80 Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu 85 90 95 Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly 100 105 110 Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg 115 120 125 Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu 130 135 140 Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln 145 150 155 <210> 4 <211> 480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgttccctt ttgccttact atatgttctg tcagtttctt tcaggaaaat cttcatctta 60 caacttgtag ggctggtgtt aacttacgac ttcactaact gtgactttga gaagattaaa 120 gcagcctatc tcagtactat ttctaaagac ctgattacat atatgagtgg gaccaaaagt 180 accgagttca acaacaccgt ctcttgtagc aatcggccac attgccttac tgaaatccag 240 agcctaacct tcaatcccac cgccggctgc gcgtcgctcg ccaaagaaat gttcgccatg 300 aaaactaagg ctgccttagc tatctggtgc ccaggctatt cggaaactca gataaatgct 360 actcaggcaa tgaagaagag gagaaaaagg aaagtcacaa ccaataaatg tctggaacaa 420 gtgtcacaat tacaaggatt gtggcgtcgc ttcaatcgac ctttactgaa acaacagtaa 480 <210> 5 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid Tslp protein: (mouse signal P + human isoform 1 ecto + C-ter) <400> 5 Met Val Leu Leu Arg Ser Leu Phe Ile Leu Gln Val Leu Val Arg Met 1 5 10 15 Gly Leu Thr Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala 20 25 30 Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly 35 40 45 Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro 50 55 60 His Cys Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly 65 70 75 80 Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr 100 105 110 Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys 115 120 125 Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg 130 135 140 Pro Leu Leu Lys Gln Gln 145 150 <210> 6 <211> 453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse/Human Tslp mRNA (CDS): (mouse signal P + human isoform 1 ecto + C-ter) <400> 6 atggttcttc tcaggagcct cttcatcctg caagtactag tacggatggg 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ttctctgtaa gcctttgtct 21720 ctctcttcat ccagactttt gccttcaaat acaagcatgc gctattttct ggaa 21774 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 67 Ala Ala Ala Val Thr Ser Arg 1 5 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 68 Gln Gly Gly Ala 1 <210> 69 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 69 ctatgctcaa aatggtgagt catttctaag ttttcttatg gattttggat tatctgtagc 60 atggtttcag gttattcagt tccctaacag acctgagtca ggcactgggt ttgaatgcag 120 tttgag 126

Claims (137)

  1. 유전적으로 변형된 설치류 동물로서,
    설치류 Tslp 핵산 서열, 및
    인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 인간화 Tslp 유전자를 그의 게놈에 포함하되,
    상기 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  2. 제1항에 있어서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 적어도 95% 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  3. 제1항에 있어서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Tslp 단백질은 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  5. 제4항에 있어서, 인간화 Tslp 단백질은 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  6. 제4항에 있어서, 인간화 Tslp 단백질은 내인성 설치류 Tslp 단백질의 신호 펩티드와 동일한 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  8. 제7항에 있어서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  9. 제8항에 있어서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산에 대한 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 Tslp 핵산 서열은 설치류 Tslp 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Tslp 유전자의 엑손 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 설치류 핵산 서열은 마우스 Tslp 유전자의 엑손 1, 및 신호 펩티드 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 2의 5’ 부분을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 Tslp 핵산 서열은 설치류 Tslp 유전자의 3’ UTR을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 Tslp 유전자는 내인성 Tslp 유전자인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 인간화 Tslp 유전자는 (i) 마우스 Tslp 유전자의 엑손 1, 및 신호 펩티드 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 2의 5’ 부분; 및 (ii) 인간 TSLP 유전자의 성숙한 단백질 서열의 제1 아미노산에 대해 코딩하는 엑손 1에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  15. 제14항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 마우스 Tslp 유전자의 3’ UTR을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 설치류 Tslp 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  17. 제16항에 있어서, 설치류 Tslp 프로모터는 내인성 설치류 Tslp 프로모터인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 위치하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  19. 제18항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 게놈 DNA를 인간 TSLP 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  20. 제19항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLP 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  21. 제20항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 단백질의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열을 암호화하는 인간 TSLP 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  22. 제21항에 있어서, 설치류 동물은 마우스이고, 치환되는 마우스 게놈 DNA는 성숙한 내인성 마우스 Tslp 유전자의 성숙한 마우스 Tslp 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 2의 코돈에서부터 엑손 5의 종결 코돈까지 포함하고, 인간 게놈 DNA는 인간 TSLP 유전자의 성숙한 인간 TSLP 단백질의 제1 아미노산에 대한 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 4의 종결 코돈까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 인간화 Tslp 유전자에 대해 동형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 인간화 Tslp 유전자에 대해 이형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 발현하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 인간화 Tslpr 유전자, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 게놈을 가진, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 랫트인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  28. 단리된 설치류 조직 또는 세포로서, 설치류 Tslp 핵산 서열 및 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 인간화 Tslp 유전자를 포함하는 게놈을 갖고, 인간화 Tslp 유전자는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 암호화하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  29. 제28항에 있어서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 성숙한 단백질 서열을 포함하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 랫트인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  32. 제30항의 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아.
  33. 유전적으로 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
    설치류 게놈이 인간화 Tslp 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계(여기서 인간화 Tslp 유전자는 설치류 Tslp 핵산 서열 및 인간 TSLP 핵산 서열을 포함하고, 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 실질적으로 동일한 성숙한 단백질 서열을 포함하는 인간화 Tslp 폴리펩티드를 암호화함); 및
    변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 인간화 Tslp 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 성숙한 단백질 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 변형시키는 단계는
    인간 TSLP 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈에 도입하는 단계,
    인간 TSLP 핵산 서열이 내인성 Tslp 유전자좌에 통합되어 설치류 Tslp 게놈 DNA를 치환함으로써 인간화 Tslp 유전자가 형성된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계, 및
    수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 핵산 분자는 인간 TSLP 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하고, 5’ 및 3’ 상동 아암은 내인성 설치류 유전자좌에서 치환될 설치류 Tslp 게놈 DNA의 측면에 위치하는 있는 핵산 서열에 대해 상동인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslp 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 랫트인, 방법.
  40. 표적화 핵산 작제물로서,
    내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 설치류 Tslp 유전자에 통합될 인간 TSLP 핵산을 포함하되, 상기 핵산의 측면에는 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열 및 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하고,
    상기 인간 TSLP 핵산 서열을 설치류 Tslp 유전자 내로 통합하면 설치류 Tslp 게놈 DNA가 인간 TSLP 핵산 서열과 치환되어 인간화 Tslp 유전자가 형성되고,
    상기 인간 TSLP 핵산 서열은 인간 TSLP 단백질의 성숙한 단백질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 표적화 핵산 작제물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 표적화 핵산.
  42. 유전적으로 변형된 설치류 동물로서,
    설치류 Tslpr 핵산 서열, 및
    인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하는 인간화 Tslpr 유전자를 그의 게놈에 포함하되,
    상기 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 단백질은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  44. 제42항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 동일한 엑토도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  46. 제45항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류.
  47. 제46항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류.
  49. 제48항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  50. 제49항에 있어서, 인간화 Tslpr 단백질은 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  52. 제51항에 있어서, 인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 마지막 엑토도메인 아미노산에 대한 엑손 6의 코돈까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Tslpr 핵산 서열은 설치류 Tslpr 단백질의 막관통-세포질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 설치류 Tslpr 유전자의 엑손 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 설치류 Tslpr 핵산 서열은 마우스 Tslpr 유전자의 막관통 도메인의 제1 아미노산에 대한 엑손 6의 코돈에서부터 엑손 8까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Tslpr 핵산 서열은 설치류 Tslpr 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Tslpr 유전자의 엑손 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 설치류 핵산 서열은 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 1을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Tslpr 유전자는 내인성 Tslpr 유전자인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  58. 제40항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 (i) 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 1, (ii) 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산에 대한 엑손 6의 코돈까지; 및 (iii) 마우스 Tslpr 유전자의 막관통 도메인의 제1 아미노산에 대한 엑손 6의 코돈에서부터 엑손 8까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  59. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 설치류 Tslpr 프로모터는 내인성 설치류 Tslpr 프로모터인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  61. 제40항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 위치하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 인간 TSLPR 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 TSLPR 핵산으로 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 치환되는 상기 마우스 게놈 DNA는 내인성 마우스 Tslpr 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산을 암호화하는 엑손 6의 코돈까지 포함하고, 상기 인간 게놈 DNA는 인간 TSLPR 유전자의 엑손 2에서부터 엑토도메인의 마지막 아미노산에 대한 엑손 6의 코돈까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  65. 제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간화 Tslpr 유전자에 대해 동형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  66. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간화 Tslpr 유전자에 대해 이형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  67. 제40항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 발현하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  68. 제40항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 인간화 Tslp 유전자, 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 인간화 Il7ra 유전자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 게놈을 가진, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  69. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  70. 단리된 설치류 조직 또는 세포로서, 설치류 Tslpr 핵산 서열 및 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하는 인간화 Tslpr 유전자를 그의 게놈에 포함하되, 상기 인간화 Tslpr 유전자는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 암호화하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 폴리펩티드는 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  74. 제72항의 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아.
  75. 유전적으로 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
    인간화 Tslpr 유전자를 포함하도록 설치류 게놈을 변형시키는 단계(여기서 인간화 Tslpr 유전자는 설치류 Tslpr 핵산 서열 및 인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하고, 인간 TSLP 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Tslpr 폴리펩티드를 암호화함); 및
    변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 인간화 Tslpr 폴리펩티드는 인간 TSLP 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 변형시키는 단계는
    인간 TSLPR 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈에 도입하는 단계,
    인간 TSLPR 핵산 서열이 내인성 Tslpr 유전자좌에 통합되어 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 치환함으로써 인간화 Tslpr 유전자가 형성된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계, 및
    수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  78. 제75항에 있어서, 상기 핵산 분자는 인간 TSLPR 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하고, 상기 5’ 및 3’ 상동 아암은 내인성 설치류 유전자좌에서 치환될 설치류 Tslpr 게놈 DNA의 측면에 위치하는 있는 핵산 서열에 대해 상동인, 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 인간화 Tslp 유전자는 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Tslpr 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 TSLPR 핵산 서열은 상기 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 방법.
  82. 표적화 핵산 작제물로서,
    내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 설치류 Tslpr 유전자에 통합될 인간 TSLPR 핵산을 포함하되, 상기 핵산의 측면에는 설치류 Tslpr 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열 및 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하고,
    인간 TSLPR 핵산 서열을 설치류 Tslpr 유전자 내로 통합하면 설치류 Tslpr 게놈 DNA가 인간 TSLPR 핵산 서열과 치환되어 인간화 Tslpr 유전자가 형성되고,
    인간 TSLPR 핵산 서열은 인간 TSLPR 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 표적화 핵산 작제물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 표적화 핵산.
  84. 유전적으로 변형된 설치류 동물로서,
    설치류 Il7ra 핵산 서열, 및
    인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 인간화 Il7ra 유전자를 그의 게놈에 포함하되,
    상기 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  85. 제84항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  86. 제84항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 동일한 엑토도메인을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열과 실질적으로 동일한 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  88. 제87항에 있어서, 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  89. 제87항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 단백질은 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드와 실질적으로 동일한 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 단백질은 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  92. 제90항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 단백질은 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  93. 제84항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 유전자의 성숙한 인간 IL7RA 단백질의 제1 아미노산 을 암호화하는 엑손 2의 코돈에서부터 엑손 5까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  95. 제84항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Il7ra 핵산 서열은 설치류 Il7ra 단백질의 막관통-세포질 서열의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 엑손 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 설치류 Il7ra 핵산 서열은 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 6에서부터 엑손 8까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  97. 제84항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Il7ra 핵산 서열은 설치류 Il7ra 단백질의 신호 펩티드를 암호화하는 설치류 Il7ra 유전자의 엑손 1의 부분을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 설치류 Il7ra 핵산 서열은 상기 설치류 Il7ra 유전자의 엑손 1의 5’ UTR 부분을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 Il7ra 유전자는 내인성 Il7ra 유전자인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  100. 제84항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 (i) 마우스 Il7ra의 신호 펩티드를 암호화하는 서열 및 5’ UTR을 포함하는 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 1의 일부, (ii) 상기 성숙한 인간 IL7RA 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 인간 IL7RA 유전자의 엑손 1의 코돈에서부터 인간 IL7RA의 엑손 5까지; 및 (iii) 마우스 Il7ra 유전자의 엑손 6에서부터 엑손 8까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  101. 제84항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  102. 제101항에 있어서, 상기 설치류 Il7ra 프로모터는 내인성 설치류 Il7ra 프로모터인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  103. 제84항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 위치하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  104. 제103항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 인간 IL7RA 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  105. 제104항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 엑손 서열을 포함하는 설치류 게놈 DNA를 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는 인간 IL7RA 핵산과 치환한 결과로서 형성되는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  106. 제105항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스이고, 치환되는 마우스 게놈 DNA는 내인성 마우스 Il7ra 유전자의 성숙한 마우스 Il7ra 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지 포함하고, 상기 인간 게놈 DNA는 인간 IL7RA 유전자의 성숙한 인간 IL7RA 단백질의 제1 아미노산을 암호화하는 엑손 1의 코돈에서부터 엑손 5까지 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  107. 제84항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간화 Il7ra 유전자에 대해 동형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  108. 제84항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간화 Tslpr 유전자에 대해 이형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  109. 제84항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 발현하는, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  110. 제84항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 설치류 Tslp 유전자좌에 있는 인간화 Tslp 유전자, 내인성 설치류 Tslpr 유전자좌에 인간화 Tslpr 유전자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 게놈을 가진, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  111. 제84항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 유전적으로 변형된 설치류 동물.
  112. 단리된 설치류 조직 또는 세포로서, 설치류 Il7ra 핵산 서열 및 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 인간화 Il7ra 유전자를 포함하는 게놈을 갖고, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 암호화하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  113. 제112항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  115. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 단리된 설치류 조직 또는 세포.
  116. 제114항의 설치류 배아 줄기 세포를 포함하는 설치류 배아.
  117. 유전적으로 변형된 설치류를 제조하는 방법으로서,
    인간화 Il7ra 유전자를 포함하도록 설치류 게놈을 변형시키는 단계(여기서 상기 인간화 Il7ra 유전자는 설치류 Il7ra 핵산 서열 및 인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하고, 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인과 실질적으로 동일한 엑토도메인을 포함하는 인간화 Il7ra 폴리펩티드를 암호화함); 및
    변형된 설치류 게놈을 포함하는 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 폴리펩티드는 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 변형시키는 단계는
    인간 IL7RA 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 게놈에 도입하는 단계,
    인간 IL7RA 핵산 서열이 내인성 Il7ra 유전자좌에 통합되어 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 치환함으로써 인간화 Il7ra 유전자가 형성된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계, 및
    수득한 설치류 ES 세포로부터 설치류 동물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 핵산 분자는 인간 IL7RA 핵산 서열의 측면에 위치하는 5’ 상동 아암 및 3’ 상동 아암을 추가로 포함하고, 상기 5’ 및 3’ 상동 아암은 내인성 설치류 유전자좌에서 치환될 설치류 Il7ra 게놈 DNA의 측면에 위치하는 있는 핵산 서열에 대해 상동인, 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 인간화 Il7ra 유전자는 내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Il7ra 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  122. 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 IL7RA 핵산 서열은 상기 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 방법.
  123. 제117항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 방법.
  124. 표적화 핵산 작제물로서,
    내인성 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 설치류 Il7ra 유전자에 통합될 인간 IL7RA 핵산을 포함하되, 상기 핵산의 측면에는 설치류 Il7ra 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열과 상동인 5’ 뉴클레오티드 서열 및 3’ 뉴클레오티드 서열이 위치하고,
    인간 IL7RA 핵산 서열을 설치류 Il7ra 유전자 내로 통합하면 설치류 Il7ra 게놈 DNA가 인간 IL7RA 핵산 서열과 치환되어 인간화 Il7ra 유전자가 형성되고,
    인간 IL7RA 핵산 서열은 인간 IL7RA 단백질의 엑토도메인의 적어도 실질적인 부분을 암호화하는, 표적화 핵산 작제물.
  125. 제124항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 또는 랫트인, 표적화 핵산.
  126. 제1항 내지 제27항, 제42항 내지 제69항, 또는 제84항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 Sirpα 유전자를 추가로 포함하되, RAG2-/- 및 IL2RG-/-에 대해 동형접합체인, 유전적으로 변형된 설치류.
  127. 제126항에 있어서, 상기 설치류는 인간화 Tpo 유전자, 및/또는 인간화 GM-CSF/IL-3 유전자좌를 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류.
  128. 알레르기성 질환(예를 들어 천식 또는 피부염) 또는 암의 설치류 동물 모델을 제조하는 데 있어서, 제1항 내지 제27항, 제42항 내지 제69항, 제84항 내지 제110항, 또는 제126항 내지 제127항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류 동물의 용도.
  129. 알레르기성 병태를 치료하기 위한 후보 제제를 시험하는 방법으로서,
    제1항 내지 제27항, 제42항 내지 제69항, 제84항 내지 제110항, 또는 제126항 내지 제127항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류 동물에서 알레르기성 병태를 유발하는 단계;
    유전적으로 변형된 설치류 동물에게 후보 제제를 투여하는 단계; 및
    상기 후보 제제가 상기 유전적으로 변형된 설치류 동물에서 알레르기성 병태를 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  130. 암을 치료하기 위한 후보 제제를 시험하는 방법으로서,
    제1항 내지 제27항, 제42항 내지 제69항, 제84항 내지 제110항, 또는 제126항 내지 제127항 중 어느 한 항에 의해 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 설치류 동물에서 인간 암세포를 생착시키는 단계;
    유전적으로 변형된 설치류 동물에게 후보 제제를 투여하는 단계; 및
    상기 후보 제제가 상기 유전적으로 변형된 설치류 동물에서 암세포의 성장을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 후보 제제는 소분자 화합물, 핵산, 또는 항체인, 방법.
  132. 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법으로서,
    제40항 또는 제41항의 표적화 핵산 작제물을 설치류 세포 내로 도입하여 인간 TSLP 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslp 유전자에 통합함으로써 설치류 Tslp 게놈 DNA를 인간 TSLP 핵산 서열과 치환하여 인간화 Tslp 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 설치류 세포는 설치류 ES 세포인, 방법.
  134. 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법으로서,
    제82항 또는 제83항의 표적화 핵산 작제물을 설치류 세포 내로 도입하여 인간 TSLPR 핵산 서열을 내인성 설치류 Tslpr 유전자에 통합함으로써 설치류 Tslpr 게놈 DNA를 인간 TSLPR 핵산 서열과 치환하여 인간화 Tslpr 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 설치류 세포는 설치류 ES 세포인, 방법.
  136. 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하기 위한 시험관내 방법으로서,
    제124항 또는 제125항의 표적화 핵산 작제물을 설치류 세포 내로 도입하여 인간 IL7RA 핵산 서열을 내인성 설치류 Il7ra 유전자에 통합함으로써 설치류 Il7ra 게놈 DNA를 인간 IL7RA 핵산 서열과 치환하여 인간화 Il7ra 유전자를 형성하고, 이에 의해 유전적으로 변형된 설치류 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  137. 제136항에 있어서, 상기 설치류 세포는 설치류 ES 세포인, 방법.
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