KR20230121575A - Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents
Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230121575A KR20230121575A KR1020230018017A KR20230018017A KR20230121575A KR 20230121575 A KR20230121575 A KR 20230121575A KR 1020230018017 A KR1020230018017 A KR 1020230018017A KR 20230018017 A KR20230018017 A KR 20230018017A KR 20230121575 A KR20230121575 A KR 20230121575A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- present
- protein
- fusion protein
- cd40l
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 비면역원성 폴리펩타이드로서, CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합 가능하여 CD40L 및 CD40L을 발현하는 것으로 알려진 다양한 세포를 표적화 하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 뛰어난 CD40L 활성 억제 능력을 나타내어, CD40L과 관련한 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 의학적/약학적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
면역체계(Immune system)는 외부로부터의 침입으로부터 유기체를 보호하기 위해 구축된 다양한 세포 및 기관으로 구성되는 생물학적 네트워크를 총칭한다. 면역 시스템은 이를 구성하는 기관 및 세포가 지니고 있는 특이적인 기능 및 각 세포간의 신호전달 및 상호작용을 중심으로 작동한다. 면역 체계는 면역을 억제, 조절하는 면역 관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역 반응(immunity)의 면역작용이 적절한 균형을 이루어 면역 항상성(Immunological homeostatsis)을 유지한다. 면역 관용과 면역 반응은 다양한 원인으로 인해 불균형이 유도될 수 있으며, 이러한 면역의 불균형은 다양한 질병의 발생으로 이어진다. 예를 들어, 면역 관용 기작이 강해지는 경우, 암의 발생 또는 외부 감염원의 침입이 용이하게 되어 암, 감염성 질환 등을 발생시킬 수 있으며, 반대로, 면역 반응 기작이 강해지는 경우, 자가 면역질환 및 알러지성 질환과 같은 염증성 질환을 발생시킬 수 있다.
최근, 면역 체계를 구성하는 면역 세포 간 또는 표적 세포와 면역 세포 사이의 신호전달체계인 면역 시냅스에 관한 연구가 활발히 진행되었다. 면역 시냅스는 세포에서 분비되는 다양한 사이토카인 및 신호전달물질을 비롯하여, 세포 표면에 발현되는 다양한 공동자극분자 및 수용체 등에 의해 구성된다. 면역 체계의 항상성 유지에 관여하는 다양한 인자들이 보고됨에 따라 이를 표적으로 하여 면역 반응을 조절하는 면역 치료제에 관한 관심이 증대되고 있다. 지금까지 개발된 대부분의 면역 치료제는 사이토카인 또는 세포 표면 분자에 대한 항체 의약품이나, 효능 부족 또는 부작용으로 그 사용이 매우 제한된다. 최근 보다 효과적인 면역질환 치료 방법으로 T 세포, NK 세포 등의 분화된 면역 세포 또는 다양한 면역 세포로 분화가능한 줄기세포를 활용한 세포 치료제가 개발되고 있다. CAR-T 또는 CAR-NK와 같이 분화된 면역세포 기반의 세포 치료제는 자가 세포를 이용함으로 인한 높은 비용 및 제한적인 표적에 한계가 있으며, 중간엽 줄기세포는 치료 비용 대비 낮은 치료효과와 명확한 작용기전을 설명하기 어려운 한계가 있다(Blood Cancer J. 11, 69 (2021); World J Stem Cells. 2019;11(4):212-221).
한편, CD40 리간드(CD40L, 또는 CD154로도 명명됨)는 항원제시세포의 CD40에 결합하는 단백질로, 표적세포에 따라 다양한 효과를 나타낸다(The Journal of Experimental Medicine. 175 (4): 1091-101). CD40L은 대표적으로 CD40, α5β1 인테그린 및 αIIbβ3의 세 가지 결합 파트너가 있으며, CD40L은 공동자극 분자로 작용하며 T 여포 보조 세포(TFH 세포)라고 하는 T 세포의 서브셋에 특히 중요한 것으로 보고된다(Journal of Immunology. 149 (12): 3817-26). CD40L은 주로 활성화된 CD4+ T 세포에서 발현되나, 솔루블한 형태로도 발견되며, T 세포뿐만 아니라, 혈소판, 비만세포, 대식세포, 호염기구, NK 세포, B세포 및 내피 세포, 상피세포와 같은 비조혈 세포에서도 발현되는 것으로 보고된다(Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (1): 4-43). CD40L은 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 (tumor necrosis factor(TNF) superfamily)로 분류되며, co-stimulatory factor로서 CD40/CD40L 신호전달은 T 세포의 활성 및 T 세포 매개 B 세포의 분화 및 활성화에 중요한 역할을 수행한다. 뿐만 아니라, CD40/CD40L 신호전달의 자극은 같은 co-stimulatory factor인 OX40/OX40L의 발현 및 신호전달 기전조절에서 중요한 역할을 수행하며, 이를 통해 T 세포의 생존과 기억 T 세포(memory T cell)의 발달에 관여한다.
다양한 면역 항상성 관련 질환에 있어서, CD40L은 항원제시세포 (APC)와 T cell의 상호작용에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고된다. 특히 CD40L/CD40의 상호작용은 T세포 및 B세포의 활성화가 병리에 주요한 영향을 미치는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 병원성 인자로 작용한다. 구체적으로, 제1형 당뇨, 갑상선염, 건선, 루푸스 (Systemic Lupus Erythematosus; SLE), 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis; RA), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis; MS) 등과 같은 다양한 질환의 병원성 인자이다. 이러한 질환의 치료를 위해 CD40L을 표적으로 하는 다양한 화합물 또는 항체가 개발되고 있다(Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103).
Avacta 사(Avacta Life Sciences Limited)에 의해 개발된 Affimer®는 생체 내 단백질인 스테핀 A 단백질을 기반으로 엔지니어링하여 제조된 작고 안정한 단백질 분자이다. Affimer®는 무작위 서열을 갖는 2개의 짧은 펩타이드 서열 및 N-말단 서열을 포함하며, 이를 통해 단일클론 항체와 유사한 방식으로 표적 물질에 높은 친화도 및 특이도로 결합할 수 있다. Affimer®는 자유 펩타이드 라이브러리에 비해 현저히 향상된 결합 친화도 및 특이성을 나타내며, 항체에 비해 현저히 작은 크기와 뛰어난 안정성을 나타내어, 항체를 대체할 차세대 대체 의약 플랫폼으로서 매우 높은 관심을 받고 있다(미국 특허 제9447170호, 제8853131호 등).
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 자연 발생 단백질인 스테핀 단백질을 기반으로 엔지니어링하여, CD40L에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, CD40L에 뛰어난 친화도 및 특이도로 결합가능한 스테핀 A 단백질(Stefin A protein) 변이체를 발명하였으며, 특히 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체가 CD40L에 대한 뛰어난 억제활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 이들의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클 또는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 핵산 및/또는 벡터가 도입된 유전자 조작된 세포 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 숙주세포에 도입상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 접합체(conjugate)을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클(delivery veihicle)을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 도입된 유전자 조작된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 조작된 세포의 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질 또는 접합체의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 조작된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질 또는 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클의 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant), 융합단백질, 접합체, 핵산 및/또는 전달 비히클을 투여하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 비면역원성 폴리펩타이드로서, CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합 가능하여 CD40L 및 CD40L을 발현하는 것으로 알려진 다양한 세포를 표적화 하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 뛰어난 CD40L 활성 억제 능력을 나타내어, CD40L과 관련한 다양한 질환의 예방 및 치료를 위한 의학적/약학적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 CD40L에 대한 단량체 클론의 직접 결합 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 단량체 클론의 결합을 통해 HEK293 세포에서 인간 CD40L 발현을 확인한 것을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 3은 대조군 HEK 293 세포(아래)와 비교하여 hCD40L-HEK293 세포(위)의 hCD40L 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 상이한 농도에서 hCD40L-HEK293 세포에 대한 클론 230(서열번호: 249)의 결합을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 6은 CD40L에 대한 결합력(avidity)을 증가시키기 위해 사용된 다양한 인 -라인 퓨전(in line fusion, ILF)을 나타낸 것이다. 각 포맷에서 1 μg (왼쪽) 및 5 μg (오른쪽)의 농도가 시험되었다. 각각 포맷은 겔 상에 표시되었다(예, 단량체, 이량체, 또는 삼량체)
도 7은 BIACORETM 검정을 사용하여 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 나타낸 것이다.
도 8은 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 9는 단량체, 이량체 및 삼량체의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 ILF의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 클론의 결합에 대한 경쟁적 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 12는 clone-230 XT75(3개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER®)를 포함하는 ILF 단백질) 및 clone-230 XT76(4개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 ILF 단백질)을 사용하여, hCD40L/HSA bridging ELISAs를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 3t0 Gly XT58은 비 hCD40L 표적화 단백질 삼량체와 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 3t0 Gly XT59는 두 개의 비 hCD40L 표적화 단백질과 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 도 12A는 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12B는 HSA 존재하에 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12C는 결합된 hCD40L 및 HSA에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-HSA 항체로 측정됨).
도 13은 Haploidentical GVHD Mouse Model의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 Haploidentical GVHD mouse model에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 투여횟수와 투여간격을 나타낸 것이다.
도 15는 Haploidentical GVHD mouse model을 이용에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 효능을 몸무게 변화(위)와 GVHD clinical score로(아래) 나타낸 것이다.
도 2는 단량체 클론의 결합을 통해 HEK293 세포에서 인간 CD40L 발현을 확인한 것을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 3은 대조군 HEK 293 세포(아래)와 비교하여 hCD40L-HEK293 세포(위)의 hCD40L 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 상이한 농도에서 hCD40L-HEK293 세포에 대한 클론 230(서열번호: 249)의 결합을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 6은 CD40L에 대한 결합력(avidity)을 증가시키기 위해 사용된 다양한 인 -라인 퓨전(in line fusion, ILF)을 나타낸 것이다. 각 포맷에서 1 μg (왼쪽) 및 5 μg (오른쪽)의 농도가 시험되었다. 각각 포맷은 겔 상에 표시되었다(예, 단량체, 이량체, 또는 삼량체)
도 7은 BIACORETM 검정을 사용하여 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 나타낸 것이다.
도 8은 hCD40L에 대한 ILF 이량체 및 삼량체 구조를 포함하는 상이한 클론의 결합을 유세포 분석에 의해 나타낸 것이다.
도 9는 단량체, 이량체 및 삼량체의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 ILF의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 클론의 결합에 대한 경쟁적 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 포맷(DT, 리지드 링커를 갖는 삼량체; XT75, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 삼량체; XT76, 리지드 링커 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 갖는 사량체)의 hCD40L과 CD40의 결합 블록에 대한 용량 효과(dose effect)를 CD40L HEK-BLUE 리포터 세포 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 12는 clone-230 XT75(3개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER®)를 포함하는 ILF 단백질) 및 clone-230 XT76(4개의 clone 230 단량체 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 ILF 단백질)을 사용하여, hCD40L/HSA bridging ELISAs를 수행한 결과를 나타낸 것이다. 3t0 Gly XT58은 비 hCD40L 표적화 단백질 삼량체와 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 3t0 Gly XT59는 두 개의 비 hCD40L 표적화 단백질과 및 HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER)를 포함하며 서로 리지드 링커로 연결된 ILF 단백질이다. 도 12A는 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12B는 HSA 존재하에 결합된 hCD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-시스타틴 항체로 측정됨). 도 12C는 결합된 hCD40L 및 HSA에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 나타낸다(항-HSA 항체로 측정됨).
도 13은 Haploidentical GVHD Mouse Model의 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 Haploidentical GVHD mouse model에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 투여횟수와 투여간격을 나타낸 것이다.
도 15는 Haploidentical GVHD mouse model을 이용에서 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체(XT54 서열번호: 729, XT55 서열번호: 730)의 효능을 몸무게 변화(위)와 GVHD clinical score로(아래) 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 용어, “단백질” 또는 “폴리펩타이드”는 모든 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 또한 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형. 예를 들어, 아미노산의 적어도 하나의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산을 포함함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 의미로 사용된다.
대부분의 경우, 본 명세서에 기재된 아미노산 및 아미노산 서열은 단백질에서 발견되는 자연 발생 아미노산, 또는 아미노 및 카르복실기를 함유하는 아미노산의 동화 작용 또는 이화작용의 생성물, 이의 이성질체(예를 들어, D- 또는 L- 이성질체)일 수 있다.
본 명세서에서 기재된 특정 아미노산 잔기는 천연 아미노산뿐만 아니라, 이의 유사체(analogs), 유도체(derivatives) 및 동족체(congeners)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체가 화합적 합성에 의해 생성된 경우, 시아노알라닌(cyanoalanine), 카나바닌(canavanine), 젠콜산(djenkolic acid), 노르류신(norleucine), 3-포스페린(3-phosphoserine), 호모세린(homoserine), 디하이드록시페닐알라닌(dihydroxy-phenylalanine), 5-하이드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 1-메틸히스티딘(1-methylhistidine), 3-메틸히스티딘(3-methylhistidine), 디아미노피멜산(diaminopimelic acid), 오르니틴(ornithine), 또는 디아미노부티르산(diaminobutyric acid)과 같은 아미노산 유사체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 아미노산 또는 핵산 서열에서, 동일한(identical) 또는 %로 표시되는 동일성(identity)은 동일하거나 특정 백분율의 일치를 갖는 서열을 의미한다. 최대 일치를 위해 두 서열을 비교 및 정렬하는 경우 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 2개의 핵산 또는 아미노산 서열은 “실질적으로 동일”할 수 있으며, 이는 2개의 서열이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것을 의미할 수 있다. 일부 실시예에서 적어도 약 10개, 20개, 40~60개, 60~80개, 80~100개 또는 그 이상의 길이의 잔기에 걸쳐 동일성이 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 단백질 또는 폴리펩타이드, 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체, 융합단백질, 융합단백질의 구성은 이와 관련하여 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라, 보존적 치환을 통해 상기 아미노산 서열의 일부가 치환된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “보존적 치환”이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩타이드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩타이드의 변형을 의미한다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 단백질의 서열에서의 보존적 치환은 이들의 기능의 손실을 야기하지 않는다. 예를 들어 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 변이체는 이의 보존적 치환에 의해 CD40L과의 결합을 폐지하지 않는다. 이러한 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
"단리된(isolated)" 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 예를 들어, 단리된 단백질, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 물질이 적어도 50% 순수(예, 오염물질 없음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수, 또는 적어도 99% 순수한 경우 물질은 실질적으로 순수한 것으로 간주된다.“CD40L(Cluster of Differentiation 40 ligand)”는 인간의 경우, CD40L 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, CD40L은 CD40/TNFRSF5에 대한 리간드로 작용하고, T 세포 증식 및 사이토카인의 생산을 공동자극한다. T 세포에 대한 교차 연결은 TCR/CD3 ligation 및 CD28 공동자극과 함께, IL4 및 IL10의 생산을 향상시키는 공동자극 신호를 생성한다. CD40L은 NK-kappa-B의 활성화를 유도하고, T 세포에서 kinase MAPK8 및 PAK2의 활성화를 유도하며, CD28의 isoform3의 티로신 인산화를 유도한다. 또한, CD40L은 IL4의 존재 아래에서 IGE의 생산뿐만 아니라 공동자극이 없는 경우, B-세포 증식을 매개한다. B세포는 TFH 세포에 항원을 제시할 수 있으며, 활성화된 TFH 세포가 B 세포가 제시한 펩타이드를 인식하면 T 세포의 CD40L이 B 세포의 CD40에 결합하여 B 세포 활성화를 유발한다. T 세포는 또한 B 세포에 직접적으로 영향을 미치는 IL-4를 생성합니다. 이 자극의 결과로 B 세포는 급속한 세포 분열을 거쳐 항체 이소형 전환 및 친화성 성숙뿐만 아니라 형질 세포 및 기억 B 세포로의 분화가 일어나는 배 중심을 형성할 수 있다. 최종 결과는 항원 표적에 대한 특정 항체를 대량 생산할 수 있는 B 세포이다. 이러한 효과에 대한 초기 증거는 CD40 또는 CD154 결핍 마우스에서 클래스 전환 또는 배 중심 형성이 거의 없고 면역 반응이 심각하게 억제된다는 것이다. CD40L은 또한 면역글로불린의 클래스 전환에 관여한다.
CD40L(예: 활성화된 혈소판에서)에 의한 내피 세포의 활성화는 반응성 산소종 생산, 케모카인 및 사이토카인 생산, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 부착 분자의 발현을 유도한다. 내피 세포에서의 이러한 염증 반응은 병변으로의 백혈구 모집을 촉진하고 잠재적으로 죽종형성을 촉진할 수 있다. CD40L은 또한 죽상동맥경화성 불안정성에 대한 잠재적인 바이오마커인 것으로 보고되었다.
상기 CD40L은 일반적으로 막 결합 단백질로 간주되지만 완전한 생물학적 활성을 갖는 천연 단백질 분해 절단 15-18-kDa 가용성 형태의 CD40L도 보고된 바 있다. CD40L은 B 세포 및 수지상 세포의 수용체 CD40에 결합하여 배 중심 형성, 이소타입 클래스 전환 및 면역글로불린 항체 생산에 필요한 중요한 헬퍼 T 세포 신호를 제공할 수 있다. CD40L의 결함은 고-IgM(HIGM1)이 있는 X-연관 면역결핍, IgM 농도 증가 및 기타 모든 이소형의 감소를 특징으로 하는 면역글로불린 스위치 결함의 원인이다. CD40L 녹아웃 마우스는 T 세포 의존성 항원에 대한 2차 항체 반응을 일으키지 못하고 이소형 클래스 전환을 겪는다. CD40L은 또한 신호를 다시 T 세포로 전송하여 단기 T 세포 증식을 유발할 수 있다. 상피, 섬유아세포 및 평활근 세포의 증식에서 CD40L의 역할도 보고된 바 있다.
본 발명에서는 CD40L에 뛰어난 친화도 및 특이도로 결합가능한 스테핀 A 단백질(Stefin A protein) 변이체를 발명하였으며, 특히 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체가 CD40L에 대한 뛰어난 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다.
*따라서, 본 발명은 일 관점에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)에 관한 것이다.
CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)
본 발명의 용어, “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 스테핀 A 단백질의 스캐폴드로, 스테핀 A 단백질, 예를 들어 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 스테핀 A 단백질로부터 유래된 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 “스테핀 A 폴리펩타이드 변이체” 또는 “AFFIMER® 단백질”과 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 개발하였으며, 상기 “CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체”는 “항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체”, “항-CD40L Affimer”와 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
“스테핀 단백질(Stefin Protein)” 또는 “스테핀 폴리펩타이드(Stefin polypeptides)” 는 다수의 시스타틴-유사 서열을 포함하는 단백질을 포괄하는 과인 시스타틴 슈퍼패밀리에서 단백질의 서브그룹을 포함한다. 시스타틴 패밀리의 스테핀 하위 그룹은 상대적으로 작은(약 100개 아미노산) 단일 도메인 단백질을 포함한다. 이들은 번역 후 변형이 일어나지 않으며, 이황화 결합이 적어 다양한 세포 외 및 세포 내 환경에서 동일한 접힘 구조를 나타낸다. 스테핀 A 단백질은 98개 아미노산으로 구성된 단일체, 단일 사슬, 단일 도메인 단백질로 보고되었다. Avacta 사는 Stefin A의 구조를 기반으로, 돌연변이를 통한 단백질 엔지니어링 기법으로 Affimer® 플랫폼을 개발하였다. 시스타틴의 유일하게 알려진 생물학적 활성은 카텝신 활성의 억제이며, 이는 조작된 단백질의 잔류 생물학적 활성에 대한 철저한 테스트를 허용한다.
본 발명의 용어, “스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”는 상시 스테핀 단백질의 조작된(engineered) 변이체로서, 작고 매우 안정적인 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체는 항체와 유사한 방식으로 표적 단백질에 높은 친화도 및 특이도로 결합할 수 있도록 하는 무작위 서열의 2개 펩타이드 루프 및 N-말단 서열을 제시할 수 있다. 스테핀 A 단백질 스캐폴드에 의한 두 펩타이드의 안정화는 펩타이드가 취할 수 있는 가능한 형테를 제한하여, 자유 펩타이드 라이브러리에 비해 결합 친화도와 특이성을 증가시킨다. 이러한 조작된 비항체 결합 단백질은 다양한 응용 분야에서, 단일클론항체의 분자인식 특성을 모방하도록 설계되었다. 스테핀 A 단백질 서열의 다른 부분에 대한 추가적 변형이 수행될 수 있으며, 이를 통해 온도, pH에 대한 안정성 증가 등의 특성이 개선될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 예를 들어, 인간 스테핀 A 단백질과 같은 스테핀 A 단백질 야생형 서열과 실질적으로 동일성을 공유하는 스테핀 A 단백질로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체는 인간 스테핀 A에 상응하는 서열에 대해 적어도, 25%, 35%, 45%, 55% 또는 60%의 동일성(identity), 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%의 동일성을 가질 수 있다. 위와 같은 변형은 스캐폴드가 원하는 표적(예, CD40L)에 결합하는 능력에 부정적 영향을 미치지 않으며, 예를 들어 야생형 스테핀 A가 소유하지만 본원에 기술된 돌연변이 변화에서 폐지되는 것과 같은 생물학적 기능을 복원하거나 생성하지 않을 수 있다. 이와 같은 스테핀 A 단백질 변이체를 활용한 표적 단백질 특이적 결합 플랫폼은 미국 특허 제9447170호, 제8853131호 등에 상세히 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 스테핀 A 단백질의 엔지니어링을 통해 표적 단백질인 CD40L에 높은 친화도 및 특이도로 결합가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 특이적으로 결합하여, CD40L의 활성을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “CD40L” 또는 “CD40 리간드”는 이의 수용체인 CD40에 결합하는 단백질을 의미하며, “CD154”로도 명명된다. CD40L은 TNF-연관 활성화 단백질(TNF-Related Activation Protein), TRAP, 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리 멤버(Tumor Necrosis Factor (Ligand) Superfamily Member), T-B 세포 활성화 분자(T-B Cell-Activating Molecule), CD40 항원 리간드(CD40 Antigen Ligand), T 세포 항원 Gp39(T- Cell Antigen Gp39), TNFSF5, HCD40L, CD154, Gp39, 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리, Member 5 (Hyper-IgM Syndrome), 종양 괴사 인자(리간드) 슈퍼패밀리, Hyper-IgM Syndrome, CD154, CD40LG, HIGM1, T-BAM, IMD3, IGM, 및 CD40-L 등과 실질적으로 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 인간 CD40L 아미노산 및 핵산 서열은 GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot와 같은 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 인간 CD40L의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot. Accession No. P29965에서 찾을 수 있으며, 이를 암호화하는 핵산 서열은 Accession No. NM_000074.2.에서 찾을 수 있다.
상기 CD40L은 세포에서 CD40L 전구체 단백질로부터 생성되는 임의의 천연 CD40L 및 성숙 CD40L을 포함한다. 상기 CD40L은 달리표시되지 않는 경우, 모든 생물, 바람직하게는 동물로부터 얻을 수 있는 CD40L을 포함하며, 예를 들어, 영장류(예: 인간 및 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예: 마우스 및 래트)와 같은 포유동물로부터 수득 가능한 CD40L을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 CD40L은 또한 돌연변이, 예를 들어 전장 야생형 CD40L의 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실, 및 스플라이스 변이체를 포함하는 임의의 CD40L 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 적어도 하나의 CD40L에 결합 가능한 야생형 스테핀 A 단백질 유래의 용매 접근 가능한 루프(solvent accessible loops)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 대해 1x10-6 M이하의 Kd 값으로 결합 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 백본 서열을 갖고, 루프 2 및 루프 4 중 어느 하나 이상이 대체 루프 서열, (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체된 스테핀 A 단백질 유래의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 I]
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3
여기서, 상기 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TGETYGKLEA VQYKTQVX (서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 1에서 상기 X는 V일 수 있으며;
상기 FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고;
상기 FR3는 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며; 및
Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, (Xaa)n 및 (Xaa)m은 각각 독립적으로 3~20개의 임의의 아미노산 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2은 서열번호 2과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 식 II(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 II]
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 4),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 하기 서열번호 5로 표시되는 아미노산과 적어도 90%(예, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n- GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 5),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp 또는 Glu, 바람직하게는 Gly, Ala, Arg 또는 Lys, 더욱 바람직하게는 Gly 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa3는 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Arg, Lys, Asn 또는 Gln, 더욱 바람직하게는 Lys 또는 Asn인 것을 특징으로 할 수 있다.
*본 발명에 있어서, 상기 Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr, 바람직하게는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro, 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Pro, 더욱 바람직하게는 Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu, 바람직하게는 Ala, Val, Asp 또는 Glu, 더욱 바람직하게는 Ala 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa7는 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys, 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Arg, 더욱 바람직하게는 Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, n은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9의 정수인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, m은 3 내지 15, 3 내지 12, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 12, 5 내지 15, 7 내지 12 또는 7 내지 9의 정수인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Xaa는 각각 독립적으로 원핵 또는 진핵 세포에서 발현 시, 폴리펩타이드에 첨가될 수 있는 아미노산, 바람직하게는 20종의 자연 발생 아미노산 중 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 서열 및 식에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 6 내지 125의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동성(homology)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 6 내지 125로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 서열 및 식에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 126 내지 245로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 상동성(homology)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245 로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 126 내지 245로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 코딩하는 핵산
본 발명의 용어, “핵산”은 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드로, DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 디옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 뿐만 아니라 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 혼입될 수 있는 임의의 기질인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 RNA, DNA, TNA(Threose nucleic acids), GNA(glycol nucleic acids), PNA(peptide nucleic acids), LNA(locked nucleic acids, 예를 들어, β- D-ribo 배열을 갖는 LNA, a-L-ribo 배열을 갖는 a-LNA(LNA의 부분입체이성질체), 2 '-amino 관능화를 갖는 2'-아미노-LNA 또는 2'-amino- a-LNA), ENA(ethylene nucleic acid), CeNA(cyclohexenyl nucleic acids) 또는 이의 하이브리드 또는 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “암호화하는 핵산”은 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 의미하는 것이다. 당업계에서 특정 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열이 공개된 경우, 이를 암호화하는 핵산을 설계 도는 도출하는 방법이 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 암호화하는 핵산은 상기한 “CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)”에 관한 기재로부터 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)는 서열번호 366 내지 485로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)는 서열번호 366 내지 485로부터 선택된 핵산 서열에 혼성화하는 암호화 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 혼성화는 예를 들어, 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)의 존재에서 혼성화 후 65℃에서 0.2X SSC로 세척조건에서 혼성화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 상기 기재된 루프 2 및 루프 4의 특징 이외에도 명세서에 기재된 스테핀 A 단백질 또는 이의 변이체 서열에 대한 일부 결실 또는 추가(예를 들어, 야생형 스테핀 A 단백질 대비 약 10개의 아미노산의 추가 또는 결실)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 인간 CD40L에 대해 약 1μM이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 BIACORE™ assay와 같은 수단에 의해 측정할 때, 인간 CD40L에 대해 적어도 약 10-3 s-1(1/second 단위), 10-4 s-1, 또는 10-5 s-1, 10-6 s-1 또는 이들 중 어느 하나보다 느린 Koff(off-rate constant) 값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 BIACORE™ assay와 같은 수단에 의해 측정할 때, 인간 CD40L에 대해 적어도 약 103M-1s-1 , 104 M-1s-1, 105 M-1s-1, 106M-1s-1 또는 이들 중 어느 하나보다 느린 Kon(association constant) 값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 경쟁적 결합 검정(competitive binding assay)에서 인간 CD40L에 대해 약 1μM이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하의 IC50값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 약 65℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 80℃ 이상, 또는 약 85℃ 이상, 약 65℃ 이상의 용융온도(Tm, 접힘 상태 및 비접힘 상태가 동일한 온도)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 접힘 상태 및 비접힘 상태의 단백질의 상대적 비율은 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 측정될 수 있다("Measuring the conformational stability of a protein" in Protein structure: A practical approach 2: 299-321).
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 다중체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는, 이중체, 삼중체, 사중체, 오중체 또는 그 이상의 다중체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체의 아미노산 잔기 간의 상호 작용에 의해 공유적 또는 비공유적으로 결합되어 형성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체와 융합된 융합 도메인을 통해 형성되는 융합단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중체는 스테핀 A 단백질 변이체의 인-라인 융합에 의해 형성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 다중체 형태의 인-라인 융합 단백질은 하기 융합 단백질에서 상세히 서술한다.
융합 단백질
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)의 융합단백질의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 스테핀 A 단백질 변이체의 생물학적 활성의 조절 또는 추가적인 생물학적 활성의 추가 등을 위해 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드가 추가, 치환 및/또는 결실된 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 대한 결합 친화도 조절, 반감기 조절, 안정성 조절, 프로테아제에 의한 절단 조절, 용량 조절, 방출 또는 생체 이용률 조절, 정제 촉진, 탈아미드화 감소, 저장 안정성 개선 또는 투여 경로 변경을 위해 다른 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체 외에도 프로테아제 절단서열, 반응성 작용기, 항체 결합 도메인, 단백질 발현 및 정제를 위한 융합 도메인(예, FLAG, poly-His, GST, c-myc 등), 결합 분자(예, 바이오틴 등), 또는 다른 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체의 한쪽 말단 및/또는 다른 쪽 말단에 추가적인 펩타이드 서열(융합 도메인)이 융합된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “융합 도메인”은 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 직/간접거으로 융합되어 포함될 수 있는 추가 도메인 또는 모이어티를 의미한다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 융합 도메인은 세포로부터 분비, 또는 세포 표면에의 고정(anchor), 또는 세포 내 국소화와 같은 발현 특성의 부여; 번역 후 변형을 위한 기질 또는 기타 인식 서열 추가; 단백질-단백질 상호작용에 의해 응집되는 다량체 구조의 생성; 반감기의 연장 또는 감소; 또는 조직 국소화, 조직 배제 또는 기타 ADME 특성의 변경, 또 다른 기능을 갖는 단백질 또는 펩타이드의 추가를 위해 융합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체의 수송 및 분비를 위해 신호 서열이 융합단백질에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체가 막 고정형 또는 세포 표면에 발현시키려는 경우, 상기 융합단백질은 막 관통 도메인 또는 세포 표면 보유 신호 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열(신호 펩타이드 또는 리더 서열)은 스테핀 A 단백질 변이체의 N-말단에 위치할 수 있다. 상기 신호 서열은 스테핀 A 단백질 변이체를 소포체로 표적화 하며 분비할 수 있도록 기능한다. 일반적으로 상기 신호서열은 소포체로 수송된 뒤 절단될 수 있으며, 신호서열 내의 잔기에서 절단되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 약 5 내지 40개의 아미노산 길이(예를 들어, 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 또는 약 35 내지 약 40개의 아미노산 길이)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 예를 들어 인간으로부터 유래된 천연 신호 펩타이드(native signal peptide)인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 비-천연 신호 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 비-천연 신호 펩타이드는 예를들어 상응하는 천연 분비형 인간 단백질에서 유래된 신호 펩타이드에서 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변이체 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 서열은 면역 글로불린(예를 들어, IgG 중쇄 또는 IgG-카파 경쇄), 사이토카인(예를 들어, IL-2 또는 CD33), 혈장 알부민, 인간 아주로시딘 전단백질 신호 서열(a human azurocidin preprotein signal sequence), 루시퍼라아제, 트립시노겐, 키모트립시노겔 또는 다른 분비형 단백질에서 유래한 신호 서열과 같은 비-igSF 단백질 패밀리로부터 유래한 신호 펩타이드 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 하기 표 5는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 분비를 위해 사용될 수 있는 신호 펩타이드의 예를 나열하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예를 들어, 상기 융합 도메인은 융합 단밸질의 단리 및/또는 정제를 위해 융합될 수 있다. 이러한 용도를 위한 융합 도메인은 폴리히스티딘 태그, Strep II 태그, 스트렙타비딘 결합 펩타이드(SBP) 태그, 칼모듈린-결합 펩타이드(CBP) 태그, S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, 티오레독신(thioredoxin), protein A 및 protein G와 같은 친화성 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체와 융합 도메인을 연결하는 적어도 하나의 링커를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 “링커”는 본 발명의 융합 단백질의 제1 폴리펩타이드(예, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체) 및 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 또 다른 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합도메인)의 사이에 삽입된다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 구조에 따라 플렉시블 링커(flexible linker), 리지드 링커(rigid linker) 및 in vivo 절단 가능한 링커(in vivo cleavable linker)로 구분될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 기능적 도메인의 융합 이외에도, 생물학적 활성 개선, 발현 수율 증가 및 약동학적 프로파일의 개선과 같은 추가적인 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 각 도메인의 기능적 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 링커는 면역원성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 바람직하게는 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 GS 링커인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 글리신-세린 링커 외에도 상기 링커는 트레오닌 알라닌 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 예를 들어, 약 1~50 개의 아미노산 길이, 1-22개 아미노산 길이, 1-10개 아미노산 길이, 1-5개 아미노산 길이, 또는 1-3개 아미노산 길이인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 플렉시블 링커(flexible linker)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 플렉시블 링커는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 결합된 융합도메인이 어느 정도의 이동 또는 상호작용을을 요구할 때 사용되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 플렉시블 링커의 예는 Argos P. (1990) “An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures 및 possible candidates for general gene fusion” J Mol Biol. 211:943- 958에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 플렉시블 링커는 융합 단백질의 유연성 및 연결된 융합 도메인의 이동성을 부여한다. 세린 또는 트레오닌의 혼입은 수용액에서 링커의 안정성을 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 플렉시블 링커는 주로 GS 링커로, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열번호 508)로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 508에서 n은 1 이상의 정수로 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 반복 수를 조정함으로써 융합 도메인의 적절한 거리 및 상호작용을 위해 최적화될 수 있다. 상기 플렉시블 링커는 Gly 및 Ser 이외에도, Thr, Ala, Lys, Glu등의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 리지드 링커(rigid linker)인 것을 특징으로 할 수 있다. 플렉시블 링커는 기능성 융합 도메인을 연결하고 일정 정도의 움직임을 허용하는 이점이 있으나, 링커의 강성 부족은 발현 수율 또는 생물학적 활성과 같은 특정 융합 단백질의 실시예에서는 제한 요인으로 작용할 수 있다. 이때, 융합 단백질의 각 도메인간의 고정된 거리를 유지하고 독립적인 기능을 유지하기 위해 리지드 링커가 사용될 수 있다.
대부분의 천연 링커는 α-나선(α-helical)구조를 갖는다 α-나선 구조는 세그먼트 내의 수소결합 및 밀접하게 팩킹된 백본으로 견고하며 안정적인 구조를 이룬다. 따라서, stiff α-나선 링커는 단백질 도메인 사이의 강성(rigid) 스페이서로서 사용될 수 있다(George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification 및 role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9). 일반적으로 리지드 링커는 α -나선 구조를 채택하거나 다수의 Pro 잔기를 포함하여 상대적으로 강성인 구조를 나타낸다. 리지드 링커는 기능성 융합 도메인을 플렉시블 링커에 비해 효율적으로 분리할 수 있다. 링커의 길이는 도메인 간의 최적 거리를 달성하기 위해 반복 수를 조정하여 쉽게 최적화할 수 있다. 결과적으로 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생체 활성을 보존하는 데 중요한 경우 리지드 링커가 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, (EAAAK)n(서열번호 509)의 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커가 많은 융합 단백질의 구축에 일반적으로 사용되며, 다른 리지드 링커의 예로 (XP)n, 여기서 X는 임의의 아미노산이며 바람직하게는 Ala, Lys 또는 Glu인 Pro-풍부 서열이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 하기 표 6은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 분비를 위해 사용될 수 있는 링커의 예를 나열하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 융합 단백질에 사용 가능한 또 다른 링커의 예는 다음과 같으나 이에 제한되는 것은 아니다:
SerGly, GGSG (서열번호 519), GSGS (서열번호 520), GGGS (서열번호 521), S(GGS)n (서열번호 522) n은 1 내지 7임, GRA, poly(Gly), poly(Ala), GGGSGGG (서열번호 523), ESGGGGVT (서열번호 524), LESGGGGVT (서열번호 525), GRAQVT (서열번호 526), WRAQVT (서열번호 527), 및 ARGRAQVT (서열번호 528).
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체에 Fc 도메인이 융합되는 경우, 힌지 영역(hinge regions)은 링커로 간주될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 아래에서 선택되는 하나 이상의 링커 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
SGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT (SEQ ID NO: 529)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (SEQ ID NO: 530)
SAPVLSAVATVGITIGVLARVALI (SEQ ID NO: 531)
SSPDLSAGTAVSIMIGVLAGMALI (SEQ ID NO: 532)
TLGGNSASYTFVSLLFSAVTLLLLC (SEQ ID NO: 533)
SGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI (SEQ ID NO: 534)
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 일부로 제공되는 플랭킹 폴리펩타이드 모이어티(Flanking polypeptide moiety)에 적용될 수 있는 또 다른 변형은 효소에 의한 번역 후 변형을 위한 부위로서의 서열을 하나 이상 포함하는 것이다. 이는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트의 첨가, 인산화, 당지질-결합 등의 변형을 위한 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 세포 내 특정 기관 또는 위치에 국소화 되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비형 융합 단백질 및/또는 막 고정형 융합 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 융합 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 항원 결합 단백질(도메인), 사이토카인, 반감기 연장 도메인, 성장인자, 효소, 및 세포 투과 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 융합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인은 치료용 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “치료용 펩타이드 또는 단백질”은 특정 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 치료용 펩타이드 또는 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체 (본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체와 같거나 다를 수 있음)일 수 있으며, 이외에도 당업계에 특정 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 갖는 것으로 보고된 펩타이드 및 단백질을 제한 없이 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 결합 도메인(또는 결합 모이어티)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 결합 도메인을 포함하는 경우, CD40L과 함께 하나 이상의 표적 분자에 결합 가능한 다중 특이성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체(본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체와 같거나 다를 수 있음), 항체 또는 이의 단편, 항체 유사 물질, 항원 결합 펩타이드, 수용체의 리간드 결합 부위(예, 수용체 트랩 폴리펩타이드), 수용체-결합 리간드(예, 사이토카인, 성장인자), 엔지니어링된 T-세포 수용체, 및 효소 또는 이의 촉매 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 또 다른 예를 들어, 아드넥틴/모노바디(Adnectins/monobody), 아필린(Affilins), 아피바디(Affibody), 아피틴(Affitins), 안티칼린(Anticalin), 안트리머(Atrimers), 아비머(Avimers), 바이사이클릭 펩타이드(Bicyclic peptides), C7 펩타이드, 센타이린(Centyrin), 탄수화물 결합 모듈(Carbohydrate-binding module; CBM), Cys-knots, 다르핀(Darpin), 엘-텐덤(El-tandem), 파이노머(Fynomers), 노틴(Knottin), 쿠니츠도메인(Kunitz domains), O바디(OBodies), 프로넥틴(Pronectin), ScFv, Sac7d, Sso7d, Tn3 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체에 융합되는 융합 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 동일한 또는 상이한 스테핀 A 단백질 변이체일 수 있으며, 및/또는 다른 표적에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인이 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체인 경우, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 두 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L의 동일하거나 상이한 부위에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L의 2개의 부위(biparatopic) 또는 2개 이상의 부위(multiparatopic)에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 표적(항원)에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다. 상기 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역 글로불린의 Fc 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질이 Fc 부분을 포함하는 경우, Fc 수용체에 결합하여 Fc 수용체 양성 세포를 활성화함으로써 사이토카인 및/또는 공동자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킬 수 있으며, 항체 의존성 세포 독성(ADCC)를 유발할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 전장 면역 글로불린을 포함하는 경우, 상기 융합단백질은 면역 글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능을 보존할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 Fc 영역을 통해 Fc 수용체 양성 세포의 Fc 수용체에 결합 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 Fc 수용체에 결합하여 Fc 수용체 양성 세포를 활성 시킬 수 있으며, 사이토카인 및/또는 보조자극 항원의 발현을 개시하거나 증가시킬 수 있다. 사이토카인 및/또는 보조작극 항원은 T 세포의 활성화에 필요한 2차 활성화 신호 이상의 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에 있어서, 면역세포, 간 세포 및 내피 세포와 같은 면역계의 이펙터세포의 표면에 존재하는 Fc 수용체를 발현하는 다른 세포에 대한 Fc 영역의 결합으로 상기 융합단백질은 항체 의존성 세포독성(ADCC) 기능을 보유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질의 Fc 영역은 Fc-매개 세포독성과는 별개로 상기 융합단백질의 혈청 수준의 유지에 긍정적인 영향을 미칠 수 있으며, 이는 체내 안정성 및 지속성의 향상을 의미할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피 세포 및 식세포의 Fc 수용체에 결합할 때 AFFIMER® 제제는 내재화되어 혈류로 다시 재활용되어 체내 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다중 특이적 융합단백질의 다른 예시적인 표적은 면역체크포인트 단백질 및 면역 공동 자극 수용체, 수용체, 사이토카인, 성장인자 또는 종양 관련 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 결합 도메인은 적어도 하나의 자가면역 표적(예를 들어, TNFR2 또는 IL6-R)에 대한 단일클론 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 자가면역 상태에서 상향조절된 단백질(예를 들어, TNFR2 또는 IL6-R)에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 융합단백질의 다양한 형태는 William BA et al. J. Clin. Med. 2019; 8(8): 1261에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 도메인은 예를 들어, 면역 체크포인트 단백질, 면역 공동자극수용체, 수용체(또는 수용체 작용제), 사이토카인, 성장 인자 또는 종양 관련 항원일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 세포간의 신호 전달에 중요한 역할을 하는 분비형 단백질을 총칭하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 상기 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 성장인자는 세포 증식, 상처의 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 물질 또는 이의 변이체를 의미한다. 예를 들어 상기 성장인자는 GH, EGF, VEGF, FGF, bFGF, HGF, BMPs, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, EPO, GDNF, IGF, KGF, BDNF, NGF, PDGF, TPO, TGF 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 효소는 생물학적 반응을 촉매하는 단백질을 총칭하는 의미로 사용된다. 예를 들어, 상기 효소는 α-chymotrypsin, lysozyme, urate oxidase, acetylcholinesterase, thermomyces lanuginose lipase, glucose oxidase, superoxie dismutase, caspase, β-glucosidase, Trametes versicolor laccase, alcohol oxidase, Cas9, Cas12, Cas13, Cas14, zinc-finger nuclease, TALLEN, dimethyl sulfoxide, uricase, Agalsidase beta, Agalsidase alfa, Imiglucerase, Taliglucerase alfa, Velaglucerase alfa, Alglucerase, Sebelipase alpha, Laronidase, Idursulfase, Elosulfase alpha, Galsulfase, Alglucosidase alpha, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 다양한 분자의 세포 섭취 및 흡수를 촉진하는 짧은 펩타이드를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 투과 펩타이드를 포함하는 경우 스테핀 A 단백질 변이체가 세포 내로 흡수되는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 투과 펩타이드는 Tat, Penetrantin, Transporant, Pept1, Pept 2, pVEC, DPV3, DPV6, R8, R9, MPG, MAP, Bip4, C105Y, Melittin, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 유전자 조작된 세포의 세포 막에 고정되거나, 세포 표면 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 막에 고정되거나, 세포 표면 발현되는 경우, 막 관통 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 용어, “막 관통 도메인”은 세포의 막에 걸쳐있는 단백질 도메인을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 알파-나선 구조를 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 막 관통 도메인은 예를 들어, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, 면역글로불린(예를 들어 IgG1, IgG4, IgD 등), PDGFR, PTGFRN 등으로부터 유래한 막 관통 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 막 관통 도메인 외에 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어, “힌지 도메인”은 막 고정 단백질의 막 관통 도메인과 세포 외 도메인 사이에 존재하는 일련의 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 막 관통 도메인 사이에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 힌지 도메인은 예를 들어, 예를 들어, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD99, 면역글로불린(예를 들어 IgG1, IgG4, IgD 등), PDGFR, PTGFRN 등으로부터 유래한 힌지 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 코일드 코일 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어, “코일드 코일 도메인(coiled coil domain)”은 2개 내지 7개의 알파 나선이 로프 가닥과 같이 감겨있는 단백질의 구조적 모티프를 의미한다. 바람직하네는 상기 코일드 코일 도메인은 2개 또는 3개의 알파 나선이 감겨있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코일드 코일 도메인은 류신 지퍼(Leucine zipper), 폴돈(foldon), 심장 포스포람반(Cardiac phospholamban), 막 포스포람반의 수용성 유사체(water-soluble analogue of a membrane phospholamban), COMP(Cartilage oligomeric matrix protein), 트롬보스폰딘 3(thrombospondin 3), 트롬보스폰딘 4(thrombospondin 4), VASP(vasodilator-stimulated phhosphoprotein)에서 유래한 코일드 코일 도메인 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코일드 코일 도메인은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및 막 관통 도메인 사이에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 바이러스 유래 펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스 유래 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 신사이틴-1(syncytin-1), 신사이틴-2(syncytin-2), VSVG(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 니파 바이러스(Nipah virus)의 F 및 G 단백질, 홍역 바이러스(measles virus)의 F 및 H 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스(tupaia paramyxovirus)의 F 및 H 단백질, 파라믹소바이러스(paramyxovirus)의 F 및 G 단백질 F 및 H 단백질 또는 F 및 HN 단백질, 헨드라 바이러스(Hendra virus)의 F 및 G 단백질, 헤니파바이러스(Henipavirus)의 F 및 G 단백질, 모르빌리바이러스(Morbilivirus)의 F 및 H 단백질, 레스피로바이러스(respirovirus)의 F 및 HN 단백질, 센다이 바이러스(a Sendai virus)의 F 및 HN 단백질, 루불라바이러스(rubulavirus)의 F 및 HN 단백질, 또는 아불라바이러스(avulavirus)의 F 및 HN 단백질, 또는 이의 변이체 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인은 막 고정 단백질의 세포질 방향에 위치하는 도메인으로서, 세포 외 도메인에 표적 항원이 결합하였을 때, 면역 반응을 활성화 또는 억제시키는 부위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 조절 도메인 또는 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3, CD28, CD40L, ICOS, OX40, 4-1BB, TNFR2 등에서 유래한 면역 조절 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 키메릭 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 키메릭 항원 수용체인 경우, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 세포 외 결합 도메인으로 기능하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 키메릭 항원 수용체인 경우, 상기한 막 관통 도메인, 힌지 도메인, 세포 내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지되 다양한 키메릭 항원 수용체 또는 이의 유사체의 세포외 항원 결합 도메인을 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체로 변경하여 쉽게 설계 및 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 국소화 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 세포 내 발현되는 경우, 국소화 도메인을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 용어, “국소화 도메인”은 단백질을 세포 내 특정 기관 또는 세포 내의 특정 위치에 국소화 하도록 기능하는 펩타이드 또는 단백질 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 국소화 도메인은 기관 특이적 국소화 도메인 또는 세포내 단백질 국소화 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 국소화 도메인은 예를 들어, VACM-1/CUL5, CXCR4, VP1, 53BP1, ING4, IER5, ERK5, Hrp1, UL79, EWS, PTHrP, Pho4, 및 rpL23a등으로부터 유래된 핵 특이적 국소화 도메인; ATP 합성효소 F1b, 사이토크롬 c 옥시다아제 폴리펩타이드 VIII, SOD2, 시트레이트 합성효소, Tu 번역 신장 인자(Tu translation elongation factor) 등으로부터 유래된 미토콘드리아 특이적 국소화 도메인; PTS1, PTS2 등으로부터 유래된 퍼옥시좀 국소화 도메인인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 반감기 연장 도메인(Half-life extension domain)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기를 연장시키기 위한 목적으로 융합된 도메인 또는 모이어티를 의미하며, 예를 들어, 상기 반감기 연장 도메인은 Fc 도메인, Fc 결합 단백질 또는 펩타이드, 알부민(예, HSA), 알부민 결합 단백질 또는 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스 페린 결합 단백질 또는 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약물 동태학(Pharmacokinetic) 및 ADME(Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) 특성 엔지니어링된 융합 단백질
본 발명에서 사용된 용어, “반감기”는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질과 같은 유효 성분이 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 절반을 잃는 데 걸리는 시간을 의미한다. 생물학적 반감기는 물질의 제거, 배설, 분해(예, 효소적 분해) 또는 신체의 특정 기관 또는 조직에서의 흡수 및 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명에 있어서, 생물학적 반감기는 물질의 혈장 농도가 정상상태 수준의 절반에 도달하는데 걸리는 시간을 결정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 적절한 반감기 및/또는 약물 동태학적 프로파일(PK profile)을 갖지 않을 수 있으며, 반감기 또는 프로파일(PK profile)를 보다 개선하기 위한 반감기 연장 도메인(또는 반감기 연장 모이어티)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “반감기 연장 도메인” 또는 “반감기 연장 모이어티”는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기 연장을 위해 직접적으로 또는 링커 등을 통해 간접적으로 접합 또는 융합된, 약학적으로 허용되는 모이어티, 도메인 또는 분자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 생체내 단백질 분해 또는 스테핀 A 단백질 변이체의 활성 감소 또는 변형을 방지하거나 완화, 반감기 연장, 흡수속도 증가, 독성 감소, 용해도 개선, 단백질 응집 감소, 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성 증가, 생산성 증가, 면역원성의 감소와 같은 약동학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하거나 변경할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “반감기 연장 도메인”은 단백질 또는 펩타이드뿐만 아니라, 비 단백질성 반감기 연장 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 discrete PEG, HES(hydroxyethyl starch), 지질, 분지형 또는 비분지형 아실기, 분지형 또는 비분지형 C8~C30 아실기, 분지형 또는 비분지형 알킬기, 분지형 또는 비분지형 C8~C30 알킬기와 같은 수용성 폴리머; 및 혈청 알부민(Serum albumin), 트랜스페린, 아드넥틴(예를 들어, 알부민 결합 아드넥틴 또는 약동학 확장 아드넥틴(PKE adnectin)), Fc 도메인, XTEN 및 PAS 폴리펩타이드와 같은 구조화되지 않은 폴리펩타이드(예를 들어, 아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser) 및 이 들의 단편과 같은 단백질성 반감기 연장 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인은 이를 포함하지 않는 융합 단백질의 반감기와 비교하여, 대상의 혈청에서 순환되는 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 반감기를 연장시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 반감기는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배 또는 6.0배 이상 연장될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 반감기는 투여 후 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 72시간 이상, 96시간 이상 또는 1주 이상 연장될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질의 제조 예는 다음과 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
- 스테핀 A 단백질 변이체 서열과, 자연적으로 긴 반감기 단백질 또는 단백질 도메인의 유전적 융합(예를 들어, Fc 도메인 융합, 트랜스페린 (Tf) 융합, 또는 알부민 융합). 상기 단백질성 반감기 연장 도메인과의 융합 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43. 등 참조).
- 스테핀 A 단백질 변이체 서열과, 불활성 폴리펩타이드(inert polypeptide)의 유전적 융합(예를 들어, XTEN(재조합 PEG 또는 rPEG로도 알려짐), HAP(homoamino acid polymer, HAPylation), 프롤린-알라닌-세린 폴리머(PAS; PASylation), 또는 엘라스틴 유사 펩타이드(ELP; ELPylation)). 상기 불활성 폴리펩타이드와 융합 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides 및 proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative 내지 PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372- 98. 등 참조).
- PEG(PEGylation) 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 화학 모이어티의 반복을 위한 약리학적으로 활성 펩타이드 또는 단백질의 화학적 컨쥬게이션에 의한 유체역학적 반경 증가. 화학적 컨쥬게이션에 의한 유체역학적 반경 증가 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic 및 biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28; Kontermann (2009) “Strategies 내지 extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93-109; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80; 및 Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan 내지 proteins” Carb Polymers. 92:2163-70. 등 참조).
- 폴리시알릴화(polysialylation)에 의한 약리학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질을 융합의 음전하를 현저히 증가; 또는 선택적으로, (b) 음으로 하전된 고도로 시알릴화된 펩타이드의 융합(예를 들어, carboxy-terminal peptide [CTP; of chorionic gonadotropin (CG) b-chain], 인간 CG b-서브유닛과 같은 천연 단백질의 반감기 연장 방법으로 잘 알려져 있음) 폴리시알릴화를 통한 반감기 연장 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.(Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005; 300:125-30; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary- suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987-93; 및 Fares et al. “Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35; and Fares “Half- life extension through O-glycosylation. 등 참조).
- HSA, IgG, 트랜스페린 또는 피브로넥틴과 같은 일반적으로 긴 반감기를 갖는 단백질에 대한 펩타이드 또는 단백질-결합 도메인을 통한 비공유 결합. 이와 같은 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234-41; O'Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans―PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014;9:e102566. 등 참조).
수명이 긴 혈청 단백질에 대한 고전적인 유전적 융합은 PEG 또는 지질에 대한 화학적 접합과는 다른 반감기 연장의 대안적 방법을 제공한다. 항체 Fc 도메인과 인간 혈청 알부민은 반감기 연장을 위한 전통적인 융합 도메인으로 사용되었다. Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 대한 펩타이드, 단백질 또는 수용체 엑소 도메인의 융합을 포함한다. Fc 와 알부민 융합 단백질은 펩타이드 약물의 크기를 증가시켜 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라, 신체의 자연적 재활용 메커니즘인 FcRn(neonatal Fc receptor)를 이용한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH 의존적 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이러한 단백질이 융합된 융합 단백질은 약 3~16일 정도의 반감기를 가질 수 있으며, 이는 일반적인 PEG화 또는 지질화 펩타이드의 반감기보다 훨씬 길다. 항체 Fc 도메인의 융합은 펩타이드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 향상시킬 수 있다. 인간 혈청 알부민은 지방 아실화 펩타이드에 의해 이용되는 것과 동일한 단백질로 반감기 연장을 위해 사용되는 또 다른 융합 도메인이다. Fc 도메인과 알부민의 주요 차이점은 Fc는 일반적으로 이량체화 되어 사용되며, HSA는 단량체 구조로 사용된다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 및 Fc 도메인의 융합 단백질은 이량체로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Fc 도메인의 융합
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인(Fc 도메인)또는 이의 단편 또는 변이체, 예를 들어 기능성 Fc 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 영역은 FcγR null-binding Fc 영역인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역에 펩타이드 백본을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 적어도 하나의 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체의 Fc 영역(이펙터 기능 및 약동학적 특성을 촉진함) 및 동일한 펩타이드의 일부로서 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역은 또한 적어도 하나의 CD40L에 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용되기 위한 다양한 링커가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 있어서, Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질은 이량체화 되어 사용될 수 있으며, 동종 이량체 또는 이종 이량체화되어 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 경우 안정성이 개선될 수 있으며, Fc 영역에 의해 부여되는 항체 유사 특성을 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 경우, 세포내 이입 후 FcRn 매개된 융합 단백질의 세포 표면으로의 재활용을 포함하는 회수 신생 FcRn 수용체 경로(the salvage neonatal FcRn receptor pathway)가 진행될 수 있으며, 이를 통해 리소좀 분해를 회피하고 혈류로 방출되어 반감기가 연장될 수 있다. Fc 도메인의 융합은 반감기의 연장뿐 아니라, 본 발명의 융합 단백질의 분리 및 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 두개의 불변 영역 면역 글로불린 도메인 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 포함할 수 있다. IgA, 및 IgM의 경우 Fc 도메인은 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 이뮤노 글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1와 Cγ2 사이의 힌지를 포함할 수 있다. Fc 도메인의 경계는 다양할 수 있으나, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 카르복실 말단의 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 여기서 아미노산의 번호는 Kabat 넘버링을 사용한다. 본 발명의 용어, “Fc”, “Fc 도메인” 및 “Fc 영역”은 상호호환적으로 사용될 수 있으며, 상기 Fc 도메인은 상기한 영역을 분리하여 지칭하거나, 항체, 이의 단편, 융합 단백질의 일부로서 지칭될 수 있다. Fc 도메인의 다형성은 다양한 위치에서 보고되며, 제한 없이 본 발명의 융합 단백질의 융합 도메인으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 “기능성 Fc 영역(functional Fc region)”인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 기능성 Fc 영역은 FcRn에 결합 가능한 Fc 도메인 또는 이의 단편을 의미한다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 이의 단편의 능력은 당업계에 공지된 표준 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 Fc 영역은 FcRn에 결합하나, 이펙터 기능을 갖지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 “이펙터 기능”은 예를 들어, C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC); 식균 작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체 등)의 하향 조절 등을 포함할 수 있다. 상기 이펙터 기능은 이를 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 검증 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등으로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 면역 글로불린 Fc 도메인으로부터 유래한 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 Fc 도메인은 다음의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 535).
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질에 포함되는 Fc 영역은 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 인간 IgG1 Fc 도메인의 서열 위치 1~16에 있는 코어 힌지 잔기(예를 들어, DKTHTCPPCPAPELLG (서열번호: 536))를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 부분적으로 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기에 의해 다량체 구조(예를 들어, 이량체)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열의 측면에 있는 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 537) 또는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 538)를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 힌지 영역은 바람직하게는 약동학적, 생물물리학적 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 다음의 서열을 포함하거나, 이로 구성될 수 있다:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 539);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 540);
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542);
DKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 543); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 544).
본 발명에 있어서, 상기 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인 서열의 18번째 잔기 P는 Fc 이펙터 기능의 제거를 위해 S로 치환될 수 있고; 이러한 치환예는 다음과 같다:
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541);
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 544).
본 발명에 있어서, 상기 인간 IgG1 면역글로불린 Fc 도메인의 1~2번째 위치의 DK는 잠재적인 클립 부위(Clip site)를 제거하기 위해 GS로 치환될 수 있으며, 이러한 치환예는 다음 서열과 같다:
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542).
본 발명에 있어서, 인간 IgG의 중쇄 불변 영역(예를 들어, CH1~CH3)의 103번째 잔기 C는 경쇄의 부재 시 부적절한 시스테인 결합의 형성을 방지하기 위해 S로 치환될 수 있으며, 이러한 치환예는 다음 서열과 같다:
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열번호 540),
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 541), 및
EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열번호 542).
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 포유동물 유래의 Fc 도메인, 바람직하게는 인간 Fc 도메인 인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 Fc 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 천연 Fc 도메인 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성(identity)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 천연 Fc 도메인 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 도메인과 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 실시예에 기재된 서열번호 545 내지 558의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, Fc 도메인의 C-말단의 라이신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질에 선택적인 구성으로 이해되어야 한다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 이의 C-말단에 존재하는 라이신이 생략된 서열번호 545 내지 558로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “항체 의존적 세포 독성” 또는 “ADCC”는 특정 세포독성 세포에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비형 이뮤노글로불린의 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적에 특이적으로 결합하여 세포독성을 나타내어 세포를 사멸시키는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 갖지 않거나, 감소된 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인은 IgG2 또는 IgG4 이소타입의 자연적으로 비활성화된 불변영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 변형 Fc 도메인은 EP0307434등에 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 Fc 도메인은 위치 235 및 237(EU 인덱스 넘버링)에서 알라닌 잔기의 치환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 일부 또는 모두 Fc의 기능(예를 들어, ADCC 및/또는 CDC)을 보유한 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질은 인간 IgG1 또는 IgG3의 Fc 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 Fc 도메인의 이펙터 기능의 수준은 공지된 방법에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 돌연변이, 예를 들어, IgG1의 CH2의 239 및 332 및 330 위치에서 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 Fc 영역의 푸코실화가 감소되도록 글리코실화 프로파일이 변경된 것을 특징으로 할 수 있다.
알부민 융합
본 발명의 실시예에서, 상기 융합 단백질은 알부민 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 알부민 서열 또는 이의 단편은 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 서열로의 혼입 또는 화학적 연결을 통해 융합 또는 접합되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 알부민, 알부민 변이체 또는 알부민 단편은 인간 혈청 알부민(HSA), 이의 변이체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, HSA외의 알부민 혈청 단백질은 예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 소, 개, 토끼 및 쥐에서 유래한 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, BSA는 HSA와 구조적으로 가장 유사하다(Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24). 본 발명에 있어서, 상기 알부민은 시노 혈청 알부민(cyno serum albumin) 또는 소 혈청 알부민과 같은 비인간 혈청 알부민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
약 20일의 혈청 반감기를 갖는 585개의 아미노산 폴리펩타이드(약 67kDa)의 성숙한 HSA는 주로 콜로이드성 삼투압, 혈액 pH, 수많은 내인성 및 외인성 리간드의 수송 및 분포의 유지를 담당한다. 혈청 알부민 단백질은 3개의 구조적으로 상동의 도메인(도메인 I, II, 및 III)을 가지며, 대부분 알파-나선 형태를 나타내고, 17개의 이황화 결합에 의해 고도로 안정화된다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 스테핀 A 단백질 변이체; 및 성숙한 인간 혈청 알부민(예를 들어, 서열번호 559) 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 알부민은 원하는 수준의 PK 및/또는 생체 분포 특성을 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 559)
본 발명에 있어서, 상기 알부민 서열은 링커 서열을 통해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 다른 flanking 서열로부터 분리될 수 있다.
별도로 기재하지 않는 한, 본 발명에서 알부민 또는 성숙 알부민은 인간 혈청 알부민을 의미한다. 그러나, 전장 HSA는 18개의 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드(MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열번호: 486)) 및 이어지는 6개의 아미노산으로 구성된 프로-도메인 서열 (RGVFRR (서열 번호 560))을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기한 총 24개의 아미노산은 프리-프로 도메인으로 명명될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 HSA 프리-프로 도메인에 의해 발현 및 분비되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 스테핀 A 단백질 변이체 및 HSA를 포함하는 융합 단백질은 상기 스테핀 A 단백질 변이체에서 기재한 신호 서열을 포함할 수 있으며, 이를 통해 발현 및 분비되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청 알부민은 예를 들어, 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 아미노산 측쇄를 통한 화학적 접합 등과 같이, 아미드 결합 이외의 결합에 의해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질에 공유적으로 커플링될 수 있다.
혈청 결합 도메인
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 혈청 결합 도메인(또는 모이어티)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 혈청 결합 도메인은 융합 단백질 서열의 일부로 포함될 수 있으며, 또는 다른 부위를 통해 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청 결합 도메인은 알부민 결합 도메인인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 알부민은 다수의 소수성 결합 포켓을 포함하며, 자연적으로 지방산, 스테로이드와 같은 다양한 리간드의 운반체 역할을 수행할 수 있으며, 알부민의 표면은 음으로 하전되어 높은 수용성(water soluble)을 나타낸다.
본 발명의 용어, “알부민 결합 도메인”은 알부민에 결합 가능한 임의의 그룹을 의미하며, 예를 들어, 알부민 결합 친화도를 갖는 화합물을 의미할 수 있다. 알부민은 지방산과 같은 내인성 리간드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 와파린, 페니실린 및 디아제팜과 같은 외인성 리간드와 상호작용할 수 있다. 이러한 약물과 알부민의 결합은 가역적이며, 알부민-약물 복합체는 약물의 생체 분포 및 생체 이용률을 향상시킬 수 있는 약물 저장소 또는 약물 전달체의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 융합 단백질에 적용될 수 있는 화학적 변형은 지방산을 펩타이드 측쇄에 공유결합하는 지질화인 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 방법은 인슐린의 반감기 연장 방법으로 당업계에 잘 알려져 있으며, PEG화(PEGylation)와 같이 유체역학적 반경을 증가시켜 신장 여과를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 지질 부분의 자체는 상대적으로 작으며, 순환하는 알부민과의 비공유 결합에 의해 간접적으로 반감기 연장을 나타낼 수 있다. 지질화는 펩타이드의 수용성을 감소시킬 수 있으나, 펩타이드와 지방산 사이의 링커의 엔지니어링을 통해 이를 조절할 수 있다. 링커 엔지니어링 및 지질의 변형은 알부민과 무관하게 생체 내 반감기의 증가에 기여할 수 있다(Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14).
본 발명에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 알부민 결합 아드넥틴(albumin-binding (PKE2) adnectins; WO2011140086 “Serum Albumin Binding Molecules”, WO2015143199 “Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains” 및 WO2017053617 “Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains” 참조), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) G148의 Proein G의 알부민 결합 도메인 3(ABD3), 알부민 결합 도메인 항체(예를 들어, GSK2374697, AlbudAb), 또는 알부민 결합 나노바디 (예를 들어, ATN103, Ozolralizumab)인 것을 특징으로 할 수 있다.
AFFIMER® XT
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 혈청 단백질에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체(HSA AFFIMER®)의 용매 접근가능한 루프 중 적어도 하나는, HSA에 결합할 수 있도록 하는 야생형 스테핀 A 단백질 로부터 유래하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 1x10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-7M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-8M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-9M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-10M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4 내지 7.6에서 1x10-11M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-9 M 내지 1x10-6 M의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-6M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-7M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-8M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-9M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-10M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 pH 7.4에서 1x10-11M 이하의 Kd로 HSA에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 백본 서열을 갖고, 루프 2 및 루프 4 중 어느 하나 이상이 대체 루프 서열, (Xaa)n 및 (Xaa)m으로 대체된 야생형 인간 스테핀 A 단백질 유래의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 I]
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3 (I),
여기서 상기 FR1은 상기 FR1은 MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA (서열번호 1A)로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열이고; FR2는 GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL (서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고;
상기 FR3는 EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%(예, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며; 및
Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A와 적어도 80%-98%, 82%-98%, 84%- 98%, 86%-98%, 88%-98%, 90%-98%, 92%-98%, 94%-98%, 또는 96%-98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A와 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 또는 98% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR1은 서열번호 1A의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%-96%, 84%-96%, 88%-96%, 또는 92%-96% 상동성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 880%, 84%, 88%, 92%, 또는 96% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR2는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3는 서열번호 3과 적어도 80%-95%, 85%-95%, 또는 90%-95% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 상동성을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 FR3은 서열번호 3의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 II(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 II]
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 4),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 식 III으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
[식 III]
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD-(Xaa)n- GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF(서열번호 5),
여기서, Xaa는 각각의 경우 개별적으로 임의의 아미노산 잔기이며; n 및 m은 각각 독립적으로 3~20의 정수임.
본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu; Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr; Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, 또는 Thr; Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr; Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro; Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu; 및 Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly, Ala, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa1은 Gly 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa2는 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Arg, Lys, Asn 또는 Gln인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa3은 Lys 또는 Asn인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa4은 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa4은 Gly 또는 Ser인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Ile, Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa5은 Leu 또는 Pro인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Ala, Val, Asp 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa6은 Ala 또는 Glu인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Ile, Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, Xaa7은 Leu 또는 Arg인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, n은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, m은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, m은 8 내지 10, 7 내지 11, 6 내지 12, 5 내지 13, 4 내지 14, 또는 3 내지 15 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n 은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9,
여기서, aa1은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa2은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa4은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa5은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa6은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa7은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa8은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; 및 aa9은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산임.
본 발명에 있어서, (Xaa)m은 식 V로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 V]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (V),
여기서, aa1은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa2은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa3은 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa4은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa5은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa6은 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa7은 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; aa8은 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산; 및 aa9은 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산임.
중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 시스테인 (Cys) 및 글리신(Gly)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Cys일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gly일 수 있다.
중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 알라닌(Ala), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 트립토판 (Trp), 및 발린 (Val)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ile일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Met일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Val일 수 있다.
중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 및 티로신(Tyr)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, 중성 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Tyr일 수 있다.
양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아르기닌 (Arg), 히스티딘 (His), 및 리신 (Lys)을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, 양으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Lys일 수 있다.
음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 예는 아스파테이트 (Asp) 및 글루타메이트 (Glu)를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, 음으로 하전된 극성 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 Glu일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
여기서, aa1은 Asp, Gly, Asn, 및 Val로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp, Tyr, His, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, Gly, Trp, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Gln, Ala, 및 Pro로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Ala, Gln, Glu, Arg, 및 Ser로부터 선택되는 아미노산; aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산; aa7은 Trp 및 Gln로부터 선택되는 아미노산; aa8은 Pro 및 His로부터 선택되는 아미노산; 및/또는 aa9은 His, Gly, 및 Gln로부터 선택되는 아미노산. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gln일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)m은 식 IV로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IV]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9 (IV),
여기서, aa1은 Tyr, Phe, Trp, 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Lys, Pro, His, Ala, 및 Thr; aa3은 Val, Asn, Gly, Gln, Ala, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 His, Thr, Lys, Trp, Lys, Val, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Gln, Ser, Gly, Pro, 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa6은 Ser, Tyr, Glu, Leu, Lys, 및 Thr로부터 선택되는 아미노산; aa7은 Ser, Asp, Val, 및 Lys로부터 선택되는 아미노산; aa8은 Gly, Leu, Ser, Pro, His, Asp, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및/또는 aa9은 Gly, Gln, Glu, 및 Ala로부터 선택되는 아미노산임.
본 발명에 있어서, aa1은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Lys. 본 발명에 있어서, aa2은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Thr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Val일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa7은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Leu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Pro일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa8은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Glu일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa9은 Ala일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 V로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 V]
Asn-aa1-aa2-Gln-Gln-Arg-Arg-Trp-Pro-Gly (V),
여기서, aa1은 Trp 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; 및 aa2은 Tyr 및 Phe로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VI로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VI]
aa1-aa2-Trp-aa3-aa4-Lys-Trp-Pro-aa5 (VI),
여기서, aa1은 Asp 및 Gly로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Gln 및 Ala로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala 및 Ser로부터 선택되는 아미노산; 및 aa5은 His 및 Gly로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gly일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VII로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VII]
aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-Trp-Pro-Gly (VII),
여기서, aa1은 Gly 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Tyr, Phe, Trp, 및 His로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala 및 Gln로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Ala, Ser, Gln, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa6은 Lys, Arg, 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Gly일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Tyr일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 VIII로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 VIII]
Gly-aa1-aa2-Ala-aa3-aa4-Trp-Pro-Gly (VIII) (SEQ ID NO: 561),
여기서, aa1은 Tyr, Phe, 및 His로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Ala, Ser, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa4은 Lys 및 Tyr로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Phe His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Ser일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Tyr일 수 있다.
본 발명에 있어서, (Xaa)n은 식 IX로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[식 IX]
aa1-aa2-aa3-Gln-aa4-aa5-Trp-Pro-aa6 (IX),
여기서, aa1은 Asp 및 Asn로부터 선택되는 아미노산; aa2은 Trp 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa3은 Trp, Tyr, 및 Phe로부터 선택되는 아미노산; aa4은 Ala, Gln, 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; aa5은 Lys 및 Arg로부터 선택되는 아미노산; 및 aa6은 His 및 Gly로부터 선택되는 아미노산임. 본 발명에 있어서, aa1은 Asp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa1은 Asn일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa2은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Trp일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Tyr일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa3은 Phe일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Ala일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Gln일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa4은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Lys일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa5은 Arg일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 His일 수 있다. 본 발명에 있어서, aa6은 Gly일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 562 내지 614 (표 8)의 아미노산 중 선택되는 어느 하나의 loop2 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 615 내지 667 (표 8)의 아미노산 중 선택되는 어느 하나의 loop4 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)n는 서열번호 562 내지 614 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 서열번호 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 서열번호 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 (Xaa)m는 615 내지 667 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(표 9).
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 668 내지 674 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 내지 90%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 다른 분자(예를 들어, 치료용 폴리펩타이드 또는 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체)에 연결되어, 상기 분자의 반감기를 연장시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 예를 들어, 마우스 시노몰구스(cyno) 원숭이와 같은 다른 종과 교차 반응하는 다양한 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 AFFIMER XT™ 플랫폼으로 명명된다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 생체내 약동학(PK) 연구에서 제어된 방식으로 단일 유전자 융합 방식으로 접합된 다른 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체(AFFIMER XT™)는 다른 펩타이드 또는 단백질 치료제의 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 생체 내에서, 분자, 예를 들어 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질과 같은 치료용 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체는 분자, 예를 들어 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질과 같은 치료용 단백질의 혈청 반감기를 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 적어도 2배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 30배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 2배 내지 5배, 2배 내지 10배, 3배 내지 5배, 3배 내지 10배, 15배 내지 5배, 4배 내지 10배, 또는 5배 내지 10배 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 경우 HSA에 결합 가능한 스테핀 A 단백질 변이체가 연결되지 않은 분자에 비해 혈청 반감기를 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 예를 들어, 적어도 생체 내 투여 후 일주일 이상 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 비해 증가된 혈청 반감기를 가지며, 서열번호 667 내지 702(표 10)의 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한(identical) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 비해 증가된 혈청 반감기를 가지며, 서열번호 667- 702 (표 10) 및 서열번호 703-728 (표 11)의 서열과 적어도 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한(identical) 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
PEG화, XTEN, PAS 및 기타 중합체
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 매우 다양한 고분자 중합체(macromolecular polymer) 및 기타 분자가 연결되어, 생물학적 특성을 조절하고/하거나 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 고분자 중합체는 자연적으로 암호화된 아미노산, 비-자연적으로 암호화된 아미노산, 또는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 기능적 치환기, 또는 자연적 또는 비자연적 아미노산에 추가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체에 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 중합체의 분자량은 약 100Da 내지 약 100,000Da일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 고분자 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da를 포함하는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da, 약 100 Da 내지 약 40,000 Da, 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da, 또는 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da인 것을 특징으로 할 수 있다.
이를 위해 PEG화(PEGylation), 폴리시알릴화(polysialylation), HES화(HESylation), 글리코실화(glycosylation), 또는 플렉시블하고 친수성의 아미노산 사슬(아미노산 500~600개)에 융합된 재조합 PEG 유사체를 포함하는 방법이 개발되었다 (Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246) 등 참조).
본 발명에 있어서, 상기 중합체는 예를 들어, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시-캡핑된 유사체(예, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/폴리필렌 글리콜 및 이의 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜 후자는 폴리에틸렌 글리콜이라고도 명명됨); dPEG(discrete PEG); 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidones); 폴리비닐알킬 에테르(polyvinylalkyl ethers); 폴리옥사졸린(polyoxazolines), 폴리알킬 옥사졸린(polyalkyl oxazolines) 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린(polyhydroxyalkyl oxazolines); 폴리아크릴아마이드(polyacrylamides), 폴리알킬 아크릴아마이드(polyalkyl acrylamides), 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아마이드(polyhydroxyalkyl acrylamides)(예, 폴리하이드록시프로필메타크릴아마이드 (polyhydroxypropylmethacrylamide) 및 이의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트(polyhydroxyalkyl acrylates); 폴리시알산(polysialic acids) 및 이의 유사체; 친수성 펩타이드 서열(hydrophilic peptide sequences); 덱스트란 및 덱스트란 유도체(예, 카르복시메틸덱스트란 다당체 및 이의 유도체(polysaccharides and their derivatives)), 아미도 덱스트란을 포함하는 다당체 및 이의 유도체(polysaccharides and their derivatives); 셀룰로오스 및 이의 유도체(cellulose and its derivatives, 예, 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 하이드록시알킬 셀룰로오스(hydroxyalkyl celluloses); 키틴 및 이의 유도체(chitin and its derivatives, 예, 키토산(chitosan), 숙시닐 키토산(succinyl chitosan), 카르복시메틸키틴(carboxymethylchitin), 카르복시메틸키토산(carboxymethylchitosan)); 히알루론산 및 이의 유도체(hyaluronic acid and its derivatives); 전분(starches); 알지네이트(alginates); 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate); 알부민(albumin); 풀루란(pullulan) 및 카르복시메틸 플루란(carboxymethyl pullulan); 폴리아미노산 및 이의 유도체(polyaminoacids and derivatives thereof, 예, 폴리글루탐산(polyglutamic acids), 폴리리신(polylysines), 폴리아스파탐산(polyaspartic acids), 폴리아스파타마이드(polyaspartamides)); 말레산 무수물 공중합체(maleic anhydride copolymers) (예를 들어, 스티렌 말레산 무수물 공중합체(styrene maleic anhydride copolymer), 다이비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체(divinylethyl ether maleic anhydride copolymer); 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohols); 이들의 공중합체; 이들의 삼원 공중합체; 이들의 혼합물; 및 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중합체는 융합 단백질이 생리적 환경 등의 수성 환경에서 침전되지 않도록 수용성 중합체인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 수용성 중합체는 선형, 분기형(forked) 또는 분지형을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 구조를 가질 수 있다. 일반적으로, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 폴리 알킬렌글리콜일 수 있으나, 다른 수용성 중합체 일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, PEG는 본 발명의 일부 실시예에서 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체는 약학적으로 허용가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “폴리에틸렌글리콜(PEG)” 은 크기나 PEG 말단의 변형 여부에 관계없이, 임의의 폴리에틸렌글리콜 분자를 포괄하는 의미로 광범위하게 사용되며, 다음 식과 같이, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다:
XO―(CH2CH2O)n―CH2CH2― , 또는
XO―(CH2CH2O)n― ,
여기서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 비제한적인 예를 들어, C1-4 알킬, 보호 작용기, 또는 말단 작용기와 같은 말단 변형임.
본 발명에 있어서, 상기 PEG는 한쪽 말단이 히드록시 또는 메톡시로 종결될 수 있으며, 예를 들어, X는 H 또는 CH3인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 화학식에서 말단 “―”로 표시되는, PEG의 다른 말단은 자연 발생 또는 비자연적으로 암호화된 아미노산을 통해 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 부착은 아마이드(amide), 카르바메이트(carbamate) 또는 유레아(urea) 연결을 통해 아민기(예, 라이신의 앱실론 아민, 또는 N-말단을 포함하나, 이에 제한되지 않음)에 연결될 수 있다. 선택적으로, 상기 중합체는 말레이미드 결합에 의해 티올기(예를 시스테인의 티올기를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 연결될 수 있다. 이에 의해 중합체가 융합 단백질에 결합되는 경우 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체의 잔기를 시스테인으로 치환할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질에 연결된 수용성 중합체의 수(예, PEGylation 또는 글리코실레화 정도는 반감기와 같은 약리학적, 약동학적, 약역학적 특성을 제공 또는 변경할 수 있도록 조정될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 중합체를 포함하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이의 융합 단백질은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 100배 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 PK 또는 생물학적 특성을 수정하는데 유용한 중합체는 본 발명의 융합 단백질의 일부로서, PEG와 기능적으로 유사한 친수성 아미노산 중합체를 사용하는 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 친수성 아미노산 중합체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 폴리펩타이드의 고유한 생분해성은 PEG에 대한 잠재적인 대안으로 각광받고 있다. 또한, PEG의 다분산성과 대조적으로 친수성 아미노산 중합체는 정확한 분자 구조 갖는다.
융합 도메인의 3차원 접힘을 유지해야하는 HSA 및 Fc 도메인의 융합과 달리, 구조화되지 않은 도메인을 포함하는 융합 단백질은 대부분 더 높은 온도 또는 HPLC 정제와 같은 가혹한 조건에 노출될 수 있다는 장점이 있다.
이러한 폴리펩타이드의 비제한적 예로서, XTEN (Amunix)은 A, E, G, P, S 및 T로 구성되는 864개의 아미노산으로 구성된다(Schellenberger et al. “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner” 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90 참조). XTEN의 생분해성 특성은 일반적으로 사용되는 40KDa PEG보다 훨씬 크며, 반감기 연장을 수반한다. XTEN을 포함하는 융합 단백질은 XTEN을 포함하지 않는 경우에 비해 반감기를 60배 내지 130배 연장 가능할 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 또 다른 예로서, PAS (XL-Protein GmbH)가 있다(Schlapschy et al. “PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins” 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501 참조). 상기 PAS는 프롤린, 알라닌 및 세린의 비전하성 아미노산으로 구성된 제한적인 세트로 구성된 랜덤 코일 중합체이다. Fc 도메인, HSA 및 XTEN과 마찬가지로 PAS는 본 발명의 유전자 조작된 세포에서 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질을 발현할 때, 인라인 융합 단백질로 제조되기 위해 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산과 함께 유전적으로 암호화될 수 있다.
인-라인 융합 단백질(In line fusion)
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 하기 표 10의 폴리펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 표 11에 제공된 핵산에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열과 함께, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 융합 도메인의 폴리펩타이드 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열에 기반하여, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 설계 및 예측할 수 있음은 자명하게 이해될 수 있다.
스테핀 A 단백질 변이체-접합체(Stefin A protein variant-Conjugate)
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant)의 접합체의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “접합체(Conjugate)” 또는 “접합(Cojugation)”은 당업계에 공지된 임의의 연결 또는 연결 방법에 의해 2개 이상의 화합물을 함께 연결(linking)하거나, 결합하여(joining) 다른 화합물을 형성하는 것 또는 2개 이상의 화합물을 결합하거나 연결하여 생성되는 화합물을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-접합체(Stefin A protein variant-Conjugate)는 광범위하게는 융합단백질을 포함하는 의미로 이해될 수 있다. 보다 구체적인예를 들어, 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질의 C-말단 및/또는 N-말단을 통한 연속적인 펩티드 결합의 형성을 통한 것 이외의 화학적 접합을 통해 접합된 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 접합체를 의미할 수 있다. 상기 접합체는 예를 들어, 하나의 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체일 수 있으며, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체는 적어도 하나의 약리학적 활성을 갖는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 다양한 작용기, 치환체 또는 모이어티와 같은 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 예를 들어, 라벨; 염료; 면역부착 분자(immunoadhesion molecule); 방사성 핵종(radionuclide); 세포독성 화합물(cytotoxic compound); 약(drug); 친화성 라벨; 광친화성 라벨; 반응성 화합물(reactive compound); 수지(resin); 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 공동인자(cofactor); 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오타이드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오타이드; 당류(saccharide); 수용성 덴드리머(water-soluble dendrimer); 사이클로덱스트린; 억제성 리보핵산(inhibitory ribonucleic acid); 바이오머터리얼(biomaterial); 나노입자; 스핀 라벨(spin label); 형광체(fluorophore), 금속 함유 모이어티(metal-containing moiety); 방사성 모이어티(radioactive moiety); 신규 기능성 작용기(novel functional group); 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 작용기; 포토케이지 모이어티(photocaged moiety); 화학적 방사선 여기성 모이어티(actinic radiation excitable moiety); 광이성질화성 모이어티(photoisomerizable moiety); 비오틴; 비오틴 유도체(derivative of biotin); 비오틴 유사체(biotin analogue); 중원자를 포함하는 모이어티(moiety incorporating a heavy atom); 화학적으로 절단 가능한 작용기(chemically cleavable group); 광분해성 작용기(photocleavable group); 긴 사이드체인(elongated side chain); 탄소 결합 당(carbon-linked sugar); 산화환원 활성제(redox-active agent); 아미노 티오산(amino thioacid); 독성 모이어티(toxic moiety); 동위원소 표지된 모이어티(isotopically labeled moiety); 생물물리학적 프로브(biophysical probe); 인광성 작용기(phosphorescent group); 화학발광성 작용기(chemiluminescent group); 전자 밀집 작용기(electron dense group); 자성 작용기(magnetic group); 인터칼레이팅 작용기(intercalating group); 발색단(chromophore); 에너지 전달제(energy transfer agent); 생물학적 활성제(biologically active agent); 검출가능한 라벨(detectable label); 소분자(small molecule); 양자점(quantum dot); 나노전달체(nanotransmitter); 방사성뉴클레오타이드(radionucleotide); 방사성전달체(radiotransmitter); 중성자-포획제(neutron-capture agent); 또는 이들의 조합, 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
- 라벨 및 검출가능한 모이어티(Labels and Detectable Moieties)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 검출가능한 라벨일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 라벨은 형광 라벨, 방사성 라벨, 효소 라벨 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 라벨일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 의학적 이미징에 사용하기위한 접합체의 일부로서 포함될 수 있는 검출가능한 라벨일 수 있다. 본 발명의 용어, 의학적 이미징(medical imaging)은 진단, 연구 또는 치료 목적으로 인체 또는 동물 신체의 내부영역을 시각화하는데 사용될 수 있는 모든 기술을 의미한다. 예를 들어, 방사선신티그래피(scintigraphy), 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT scan), 핵 이미징(nuclear imaging), PET(positron emission comprising a metal tomography) 조영제, 광학 이미징(예, 근적외선 형광(NIRF) 이미징을 포함한 형광 이미징) 생물발광 이미징(bioluminescence imaging) 또는 이의 조합일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 선택적으로 X-레이 영상화를 위한 조영제일 수 있다. 이러한 이미징 기술의 향상에 유용한 물질은 신체 내 특정 위치, 기관 또는 질병 부위의 시각화를 가능하게 하고/하거나 이미징 기술에 의해 생성된 이미지의 품질을 일부 개선하여, 개선되거나 더욱 쉬운 해석이 가능하도록 한다. 이러한 제제는 조영제로 지칭될 수 있으며, 조영제의 사용은 다른 영역과 이미징 영역 사이의 대비를 증가시킴으로써 특정 부분의 구별을 용의하게 한다. 따라서, 이러한 조영제에는 이미지 품질의 향상을 위한 제제(예, MRI 등)뿐만 아니라 이미지 생성을 위한 전제 조건으로서의 제제(예, 핵 이미징 등)를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 금속을 킬레이트화하기 위한 킬레이트 모이어티, 예를 들어 방사성 금속(radiometal) 또는 상자성 이온(paramagnetic ion)을 위한 킬레이트제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 방사선 요법 또는 영상화에 유용한 방사성 핵종에 대한 킬레이트제일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 유용한 방사성 핵종은 감마 방사체(gamma-emitters), 양전자 방사체(positron-emitters), Auger 전자 방사체(Auger electron-emitters), X선 방사체(X-ray emitters) 및 형광 방사체(fluorescence-emitters)를 포함하며, 치료용 베타- 또는 알파-방사체를 포함한다. 방사선 요법에서 독소로 유용한 방사성 핵종의 예는 다음과 같다: 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi 및 213Bi. 킬레이터가 금속을 배위하는 조건은 예를 들어, Gansow et al., 미국 특허 제 4,831,175호, 제4,454,106호 및 제4,472,509호와 같다. 본 발명에 있어서, 상기 킬레이터의 예는 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid (NOTA) 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (DOTA) 1 ,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'"-tetraacetic acid (TETA)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 폴리펩타이드의 아미노산 잔기에 직접 혼입될 수 있거나, 킬레이터를 필요로하지 않는 또 다른 검출가능한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S 및 36Cl를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 상자성 이온은 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 상자성 이온의 예는 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III), 에르븀(III), 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 형광라벨의 예에는 유기 염료(예, 시아닌(cyanine), 플루오레세인(fluorescein), 로다민)rhodamine, Alexa Fluors, Dylight fluors, ATTO 염료, BODIPY 염료 등), 생물학적 형광체(예, GFP(green fluorescent protein), R-Phycoerythrin, 등) 및 양자점 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 비제한적 형광 화합물은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Cy5, Cy5.5 (Cy5++로도 알려짐), Cy2, FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate), 피코에리트린(*phycoerythrin), Cy7, FAM(fluorescein), Cy3, Cy3.5 (Cy3++로도 알려짐), Texas Red, LightCycler-Red 640, LightCycler Red 705, TMR(tetramethylrhodamine), 로다민(rhodamine), 로다민 유도체(rhodamine derivative, ROX), HEX(hexachlorofluorescein), R6G(rhodamine 6G), 로다민 유도체 JA133, Alexa 형광 염료 (예, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 555, 및 Alexa Fluor 647 등), DAPI(4), 프로피듐 이오다이드(Propidium iodide), AMCA, 스펙트럼 그린(Spectrum Green), 스펙트럼 오렌지(Spectrum Orange), 스펙트럼 아쿠아(Spectrum Aqua), 리사민(Lissamine), 및 유로피움과 같은 형광 전이 금속 복합체(fluorescent transition metal complexes) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 형광 화합물의 다른 예로는 형광단백질, 예를 들어, GFP (green fluorescent protein), EGFP(enhanced GFP), 청색 형광 단백질 및 이의 유도체 (BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), 청록색(cyan) 형광 단백질 및 이의 유도체 (CFP, ECFP, Cerulean, CyPet) 및 노랑 형광 단백질 및 이의 유도체 (YFP, Citrine, Venus, YPet)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 형광화합물의 예는 WO2008142571, WO2009056282, WO9922026의 특허문헌에도 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효소 라벨은 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 포스파타아제(AP), 포도당 산화효소 및 β-갈락토시다아제등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 라벨은 비오틴 라벨일 수 있다. 상기 비오틴 라벨은 일반적으로 비오티닐 그룹, 스페이서 암 및 단백질의 표적 작용기에 대한 부착을 담당하는 반응성 그룹으로 구성된다. 상기 비오틴은 표지된 단백질을 아비딘 모이어티를 포함하는 다른 모이어티에 부착시키는 데 유용하게 사용될 수 있다.
- 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체는 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "치료제"는 인간 또는 다른 동물의 질병을 회복(cure), 완화(mitigation), 처치(treatment) 또는 예방하는데 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 치료제는 한국을 비롯한 공식 국가기관에 의해 인정되는 치료용 물질이 포함될 수 있으며, 소분자, 뉴클레오타이드, 올리코펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체에 접합될 수 있는 치료제의 예에는 세포독성제(cytotoxic agents), 항대사제(anti-metabolites), 알킬화제(alkylating agents), 항생제(antibiotics), 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokines), 항혈관신생제(anti-angiogenic agents), 항유사분열제(anti-mitotic agents), 독소(toxins), 세포사멸제(apoptotic agents) 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적인 예를 들어 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents), 토포아이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitors), 미세소관 억제제(microtubule inhibitors, 예, DM1, DM4, MMAF and MMAE), 소포체 스트레스 유도제(endoplasmic reticulum stress inducing agents), 백금 화합물(platinum compounds), 항대사물질(antimetabolites), 빈칼칼로이드(vincalkaloids, taxanes), 탁산(epothilones), 효소억제제(enzyme inhibitors), 수용체 길항제(receptor antagonists), 치료용 항체(therapeutic antibodies), 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitors), 방사선 감작제(radiosensitizers), 및 일러스트레이션과 같은 화학요법 병용 요법 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 접합체를 제조하기 위해 항체 및 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체와 같은 단백질에 접합을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. 등에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 유기/무기 모이어티를 항체 및 단백질에 접합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이를 사용하여 본 발명의 접합체를 쉽게 개조할 수 있다. 예를 들어, 접합된 모이어티가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 경우, 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체에 화학적으로 가교될 수 있거나, 융합단백질의 일부로 포함될 수 있다. 이러한 예로서, Avacta 사의 diptheria toxin-AFFIMER®가 공지된 바 있다. 비 펩타이드 모이어티의 경우, 일반적으로 스테핀 A 단백질 변이체에 대한 화학적 컨쥬게이션(예, 아미노산 측쇄 상의 작용기 또는 C-말단의 카르복실기 또는 N-말단 말단의 아미노기 등)을 통해 접합될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합된 모이어티는 그 종류에 관계없이 환경 조건(예, pH 등)에 민감성인 적어도 하나의 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 환경 조건에 민감성인 모이어티는 질병 조직 또는 보호 조직과 같은 표적 조직에서 접합 부분을 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
스페이서(Spacer)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 스페이서 또는 예를 들어, 염증성 미세환경에 존재하는 효소에 의해 절단가능한, 기질 인식 서열(substrate recognition sequence, SRS) 및 반감기 연장 모이어티 사이의 결합(L1)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 임의의 분자, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드, 아미노산, 화학적 작용기일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 펩타이드 링커(예를 들어, 2개 이상의 아미노산)이다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 폴리펩티드의 발현, 분비 또는 생체 활성에 악영향을 미치지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 항원성이 아니며 면역 반응을 유도하지 않을 수 있다. 상기 면역 반응은 선천 면역 체계 및/또는 적응 면역 체계로부터의 반응을 포함한다. 따라서, 상기 면역 반응은 세포-매개 반응 및/또는 체액성 면역 반응일 수 있다. 상기 면역 반응은 예를 들어 T 세포 반응, B 세포 반응, 자연 살해(NK) 세포 반응, 단핵구 반응 및/또는 대식세포 반응일 수 있다. 본 발명에 있어서 다른 세포 반응이 고려될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커는 비-단백질-암호화(non-protein-coding)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L1은 6-말레이미도카프로일(6-maleimidocaproyl), 말레이미도프로파노일(maleimidopropanoyl) 및 말레이미도메틸 사이클로핵산-1-카르복실레이트(maleimidomethyl cyclohexane-l-carboxylate)와 같은 탄화수소(직쇄 또는 고리형)이거나, 또는 상기 L1은 N-숙시니미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(N-Succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate), N-숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(N- Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate), N-숙시니미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조네이트(N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L1은 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 다른 친수성 링커와 같은 폴리에테르일 수 있다. 예를 들어, L1이 결합하는 부위 또는 잔기가 티올(예: 시스테인 잔기)을 포함하는 경우 L1은 말레이미드 모이어티를 통해 티올 그룹에 결합된 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 본 발명에 사용가능한 링커는 예를 들어 참조로 포함된 WO2019/236567에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 L1는 예를 들어, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
여기서, p는 1 내지 100, 바람직하게는 6 내지 50, 보다 바람직하게는 6 내지 12의 정수를 나타냄.
본 발명에 있어서, L1이 결합하는 부위 또는 잔기가 티올을 포함하고, L1이 말레이미드 모이어티를 통해 티올기에 결합된 탄화수소 모이어티인 경우, 상기 L1는 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
또는
여기서, p는 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 4의 정수임.
자가-희생 링커(Self-Immolative Linkers)
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 효소에 대한 기질 인식 서열(SRS) 및 약물 모이어티 사이에 자가-희생 링커(L2)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자가-희생 모이어티는 두 개의 이격된 화학적 모이어티가 일반적으로 안정한 분자로 공유 결합가능한 이기작용성 화학적 그룹(bifunctional chemical group)로 정의될 수 있으며, 효소 절단에 의해 분자로부터 이격된 화학적 모이어티를 중 하나를 방출하고, 효소절단 후 이기작용성 화학 그룹의 나머지로부터 자발적으로 절단되어 상기 이격된 잔기 중 다른 하나를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 자기-희생 모이어티는 이의 말단 중 하나에서, 직접적으로 또는 스페이서 유닛을 통해 간접적으로, 아마이드 결합에 의해 리간드에 공유결합되고, 다른 말단에서 약물 모이어티의 화학 반응성 부위(chemical reactive site, Functional group)에 공유결합될 수 있다. 본 발명에 있어서, 자가-희생 모이어티에 의한 약물 모이어티의 유도체화는 약물이 절단될 때까지 약물을 약리학적으로 활성을 감소시키거나 활성을 차폐할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체는 일반적으로 순환계에서 안정하거나, 또는 적어도 기질 인식 서열(효소 절단가능한 링커)와 자가-희생 모이어티 사이의 아마이드 결합을 절단할 수 있는 효소가 없는 경우 안정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체가 적절한 효소에 노출되면 아마이드 결합이 절단되어, 자발적인 자가 희생 반응을 개시하며, 자가-희생 모이어티와 약물 모이어티의 공유결합의 절단 및 유도체화 되지 않은 형태 또는 약리학적 활성 형태의 자유 약물 모이어티의 방출을 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 접합체의 자가-희생 모이어티는 하나 이상의 이종 원자를 통합하며, 향상된 용해도, 절단속도의 개선 및 접합체의 응집 경향 감소효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 벤질옥시카르보닐기(benzyloxycarbonyl group)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 자가-희생 링커 L2는 또는 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L2는 PABC(p-aminobenzyloxycarbonyl)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L2는 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린(2,4-bis(hydroxymethyl)aniline)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체는 치료 모이어티 및 절단가능한 기질 인식 서열에 공유 결합된 헤테로사이클릭 자가-희생 모이어티를 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 벤질옥시카르보닐기(benzyloxycarbonyl group)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기 화학식일 수 있다:
여기서, 상기 R1은 수소, 비치환 또는 치환된 C1-3 알킬, 또는 비치환 또는 치환된 헤테로사이클릴임. 본 발명에 있어서, 상기 R1은 수소일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 R1은 메틸일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다:
,
,
,
,
, 및
.
본 발명에 있어서, 상기 L2는 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다:
,
, 및
.
여기서, U 는 O, S 또는 NR6이며;
Q는 CR4 또는 N 이고;
V1, V2 및 V3 는 독립적으로 CR4 또는 N이며, 단, 상기 Q, V1, V2 중 적어도 하나는 N이고;
T 는 상기 치료 모이어티에서 계류 중인 NH, NR6, O 또는 S이며;
R1, R2, R3 및 R4 는 독립적으로 다음으로부터 선택되고, H, F, Cl, Br, I, OH, ―N(R5)2, ―N(R5)3 +, C1-C8 알킬할라이드(C1-C8 alkylhalide), 카르복실레이트(carboxylate), 설페이트(sulfate), 설파메이트(sulfamate), 설포네이트(sulfonate), ―SO2R5, ―S(=O)R5, ―SR5, ―SO2N(R5)2, ―C(=O)R5, ―CO2R5, ―C(=O)N(R5)2, ―CN, ―N3, ―NO2, C1-C8 알콕시, C1-C8 할로치환된 알킬(C1-C8 halosubstituted alkyl), 폴리에틸렌옥시(polyethyleneoxy), 포스포네이트(phosphonate), 포스페이트(phosphate), C1-C8 알킬, C1-C8 치환된 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 치환된 알케닐, C2-C8 알키닐(alkynyl), C2-C8 치환된 알키닐, C6-C20 아릴, C6-C20 치환된 아릴, C1-C20 헤테로사이클, 및 C1-C20 치환된 헤테로사이클; 또는 R2 및 R3이 함께 결합되어 카르보닐(=O)을 형성하거나, 탄소 수 3~7의 스피로 탄소환 고리(spiro carbocyclic ring)를 형성함; 및
R5 및 R6 는 독립적으로 다음으로부터 선택되며, H, C1-C8 알킬, C1-C8치환된 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 치환된 알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 치환된 알키닐, C6-C20 아릴, C6-C20 치환된 아릴, C1-C20 헤테로사이클, 및 C1-C20 치환된 헤테로사이클;
여기서, C1-C8 치환된 알킬, C2-C8 치환된 알케닐, C2-C8치환된 알키닐, C6-C20 치환된 아릴, 및 C2-C20 치환된 헤테로사이클은 독립적으로 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로부터 치환됨. F, Cl, Br, I, OH, ―N(R5)2, ―N(R5)3 +, C1-C8 알킬할라이드(C1-C8 alkylhalide), 카르복실레이트, 설페이트, 설파메이트, 설포네이트, C1-C8 알킬설포네이트, C1-C8 알킬아미노, 4-디알킬아미노피리디늄(4-dialkylaminopyridinium), C1-C8 알킬하이드록실, C1-C8 알킬티올, ―SO2R5, ―S(=O)R5, ―SR5, ―SO2N(R5)2, ―C(=O)R5, ―CO2R5, ―C(=O)N(R5)2, ―CN, ―N3, ―NO2, C1-C8 알콕시, C1-C8 트리플로로알킬, C1-C8 알킬, C3-C12 카보사이클(C3-C12 carbocycle), C6-C20 아릴, C2-C20 헤테로사이클, 폴리에틸렌옥시(polyethyleneoxy), 포스포네이트 및 포스페이트.
본 발명에 있어서, 상기 T가 NH인 경우, 이는 치료 모이어티(자가 희생 모이어티에 커플링되기 전)에 계류 중인 1차 아민(-NH2)으로부터 유도되고, 상기 T가 N인 경우, 2차 아민(-NH-)으로부터 유도되는 것으로 이해될 수 있다. 유사하게, 상기 T가 O 또는 S인 경우, 이는 자가 희생 모이어티에 커플링되기 전에 치료 모이어티로부터 계류 중인 하이드록실(-OH) 또는 설프하이드릴(-SH) 그룹으로부터 각각 유도된다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 -NH-(CH2)4-C(=O)- 또는 -NH-(CH2)3-C(=O)-일 수 있다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 PABC(p-aminobenzyloxycarbonyl)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 자가-희생 링커 L2는 2,4-비스(하이드록시메틸)아닐린(2,4-bis(hydroxymethyl)aniline)일 수 있다.
본 발명에 기재된 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체에 사용되기 위해 쉽게 적용가능한 자가-희생 링커의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 제7,754,681호, WO2012/074693; US 9,089,614; WO2019236567A; EP 1,732,607; WO 2015/038426A1, Walther et al. "Prodrugs in medicinal chemistry and enzyme prodrug therapies" Adv Drug Deliv Rev. 2017 Sep 1; 118:65-77; and Tranoy-Opalinski et al."Design of self- immolative linkers for tumor-activated prodrug therapy", Anticancer Agents Med Chem. 2008 Aug;8(6):6l8-37; 등에 교시되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 기재된 스테핀 A 단백질 변이체-약물 접합체에 사용되기 위해 쉽게 적용가능한 자가-희생 링커의 또 다른 예는 국제공개공보 WO 2019/236567에 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 전달 비히클은 in vivo에 전달을 위해 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산 또는 벡터가 도입된 유전자 조작된 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 In vivo 전달되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산의 in vivo 전달
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합단백질, 접합체의 전달에 대한 대안적 접근법은 치료용 폴리펩티드의 생산을 신체 자체에 맡기는 것이다. 다수의 임상 연구에서 다양한 전달 시스템을 사용하여 세포로의 생체 내 유전자 전달의 유용성이 보고된 바 있다. 생체 내 유전자 전달은 환자에게 스테핀 A 단백질 변이체가 아닌 이를 암호화하는 핵산을 투여하는 것이다. 이를 통해 환자의 신체는 장기간 동안 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 생산하고 생산 부위에 따라 전신적으로 또는 국소적으로 분비할 수 있다. 유전자 기반으로 암호화된 핵산은 단백질의 기존 생산, 정제 및 투여에 대한 노동 및 비용 효율적인 대안을 제시할 수 있다. 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산의 전달을 위해 다양한 생체 내 항체 발현 플랫폼이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 벡터 네이키드 DNA 또는 RNA 등이 포함된다. 핵산의 유전자 전달은 상품 및 생산 비용을 줄임으로써 비용 절감을 가능하게 할 뿐만 아니라 약물 투여 빈도를 줄일 수도 있다. 전반적으로, 핵산의 발현에 의한 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체의 생체내 생산은 (i) 저비용으로 광범위한 치료 또는 예방 용도로의 작용, (ii) 선진국 및 개발도상국에서의 접근성 향성 및 (iii) 보다 효과적이고 저렴한 치료 방법으로서의 장접을 갖는다. 생체 내 유전자 전달 외에도, 숙주(또는 기증자)로부터 수확된 세포를 기반으로 본 발명의 핵산으로 유전자 조작된 세포 치료제를 생산하고 환자에게 투여할 수 있다.
근육내 항체 유전자 투여는 가장 널리 평가되었으며(Deal et al. (2015) "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" Curr Opin Immunol. 35:113-22.) 본 발명의 핵산의 생체 내 전달을 위한 투여 방법으로 적용될 수 있다. 실제로, 골격근의 고유한 해부학적, 세포적 및 생리학적 특성으로 인해 long-term 암호화된 핵산의 발현 및 전신 순환을 위한 안정적인 환경이 제공되며, 쉽게 반복 투여가 가능하다. 풍부한 혈관은 생체 내에서 발현 및 분비된 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체가 순환계로 효율적으로 수송될 수 있는 시스템을 제공한다. 본 발명에 있어서, 생체 내 전달된 핵산은 숙주 게놈에 통합될 수 있으나, 숙주 게놈에서의 통합은 장기간 단백질의 발현을 달성하기 위한 전제 조건이 아니다. 간은 전임상 항체 유전자 전달에 자주 사용되는 또 다른 부위이며 일반적으로 정맥(i.v.) 주사를 통해 형질감염될 수 있다. 간은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질의 혈관 분비 및 전신 순환을 위한 유전자 전달 부위일 수 있다. 간은 혈장 단백질을 합성하며, 다양한 생리기능을 가져 본 발명의 핵산의 전달을 통한 스테핀 A 단백질 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질의 발현에 적합할 수 있다.
유전자 치료의 성공은 주로 비바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터의 개선에 의해 주도되었다. 일련의 물리적 및 화학적 비바이러스 방법이 DNA와 mRNA를 포유류 세포로 전달하는 데 사용되었으며 이들 중 상당 수는 생체 외 및 생체 내에서 유전자 치료를 위한 임상 단계 기술로 개발되어 본 발명의 핵산을 사용한 유전자 치료에 쉽게 적용 가능하다. 양전하를 띤 머리 그룹과 소수성 지질 꼬리를 가진 양친매성 지질이 음전하를 띤 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 세포내이입에 의해 세포로 들어가는 입자를 형성하는 능력을 갖는 양이온성 리포솜 기술을 사용할 수 있다. 일부 양이온성 리포좀은 또한 중성 공지질(neutral co-lipid)을 함유하고 있는데, 이는 포유동물 세포에 의한 흡수를 향상시키는 것으로 이해된다. (Felgner et al. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417; San et al. (1983) "Safety and short-term toxicity of a novel cationic lipid formulaion for human gene therapy" Hum. Gene Ther. 4:781-788; Xu et al. (1996) "Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection" Biochemistry 35:5616-5623; and Legendre et al. (1992) "Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes" Pharm. Res. 9, 1235-1242. 참조).
유사하게, 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 폴리양이온은 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 폴리양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 이루고 DNA 또는 RNA가 나노입자로 응축되는 것을 도와주며, 나노입자는 엔도솜 매개 흡수를 위한 기질이 된다. 플라스미드 DNA, 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 포함하여 이러한 양이온성 핵산 복합체 기술 중 몇 가지가 잠재적인 임상 제품으로 개발되었다. 변형된(Modified) 및 변형되지 않은(Unmodified, 또는 "네이키드") DNA 및 RNA는 또한 여러 상황에서 성공적인 유전자 전달을 매개하는 것으로 나타났으며 암호화된 핵산의 전달을 위한 시스템으로도 사용될 수 있다. 여기에는 직접 근육 주사에 의한 플라스미드 DNA의 사용이 포함된다. 예를 들어, Rodrigo et al. (2012) "De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells" PNAS 109:15271-15276; Oishi et al. (2005) "Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages" Chembiochem. 6:718-725; Bhatt et al. (2015) "Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer" Drug Deliv. 22:849-861; Ulmer et al. (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines" Vaccine 12: 1541-1544; and Heinzerling et al. (2005) 등이 참조된다.
바이러스 벡터는 현재 대부분의 전임상 및 임상 유전자 치료 시험에서 전달 수단으로 사용되며 최초로 승인된 유전자 치료에서 사용된다(Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)). 이에 대한 주요 동인은 자연적인 진화 발달을 반영하는 탁월한 유전자 전달 효율성이다. 바이러스 벡터 시스템은 바이러스가 감염에 의해 세포막을 통과하는 능력을 진화시켜 본 발명의 핵산을 표적 세포에 전달하기 때문에 유전자 전달에 매력적이다. 아데노바이러스 시스템에 의해 개척된 바이러스 벡터 매개 항체 유전자 전달 분야는 지난 수십 년 동안 상당한 발전을 이루었다. 성공적으로 평가된 무수히 많은 투여 경로, 전임상 모델 및 질병 적응증은 항체 유전자 전달 능력을 완전히 보여주며, 이를 통해 숙련된 기술자는 항체 유전자 전달 시스템을 본 발명의 핵산의 생체 내 전달을 위한 기술로 쉽게 선별하고 적용시킬 수 있다. 근육은 연장된 mAb 발현을 위한 선택 투여 부위로 떠오르고 있으며, 본 발명의 핵산의 발현을 위한 적합한 표적 조직이 될 수 있다.
본 발명의 핵산의 생체 내 유전자 전달은 발현 플라스미드와 같은 비바이러스 벡터를 사용하여 달성할 수도 있다. 비바이러스 벡터는 쉽게 생성되며 특정 면역 반응을 유도하지 않는 것으로 보고된다. 근육 조직은 혈관이 잘 형성되어 있으며 쉽게 접근할 수 있고, 근세포는 수명이 긴 세포이기 때문에 형질감염을 위한 표적 조직으로 가장 자주 사용된다. 네이키드 플라스미드 DNA를 근육 내 주사하면 일정 비율의 근세포가 형질감염된다. 이러한 접근법을 사용하여 사이토카인 및 사이토카인/IgG1 키메라 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA가 생체 내에서 도입되었으며 (자가 면역) 질병 결과에 긍정적인 영향을 미친 것으로 보고되었다.
일부 경우에, 유전자 전달 및 발현 수준의 향상을 나타내는 혈관 내 전달을 통한 형질 감염 효율을 증가시키기 위해 정맥에 짧은 기간의 일시적 고압을 유도할 수 있다. 이러한 일시적인 혈관 압력의 증가는 국소 흡수를 촉진할 수 있으며, 이를 위한 특수 혈압 커프가 보고된 바 있다(Zhang et al. (2001) "Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates" Hum. Gene Ther., 12:427-438).
생체 내 유전자 전달 효율은 화학적 운반체(양이온성 중합체 또는 지질)를 사용하거나 물리적 접근 방식(유전자총 전달 또는 전기천공법)을 통해 핵산 전달을 개선하는 것과 같은 다른 기술을 통해서도 증가될 수 있다(Tranchant et al. (2004) "Physicochemical optimization of plasmid delivery by cationic lipids" J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35; and Niidome et al. (2002) "Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors" Gene Ther., 9:1647-1652. Electroporation is especially regarded as an interesting technique for nonviral gene delivery. Somiari, et al. (2000) "Theory and in vivo application of electroporative gene delivery" Mol. Ther. 2:178-187; and Jaroszeski et al. (1999) "In vivo gene delivery by electroporation" Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137). 전기천공을 사용하면 펄스 전류가 국소 조직 영역에 적용되어 세포 투과성을 향상시켜 막을 통한 유전자 전달을 가능하게 한다. 연구에 따르면 전기천공을 사용한 생체 내 유전자 전달은 전기천공법이 없는 것보다 적어도 10-100배 더 효율적일 수 있다(예, Aihara et al. (1998) "Gene transfer into muscle by electroporation in vivo" Nat. Biotechnol. 16:867-870; Mir, et al. (1999) "High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses" PNAS 96:4262-4267; Rizzuto, et al. (1999) "Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation" PNAS 96: 6417-6422; and Mathiesen (1999) "Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer in vivo" Gene Ther., 6:508-514.).
본 발명에 있어서, 상기 암호화된 핵산은 바이러스, 비바이러스 또는 물리적을 포함한 유전자 치료에 일반적으로 사용되는 광범위한 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988, and Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989). Discussion of methods and compositions for use in gene therapy include Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000, 및 미국 특허 제6,080,728호 참조.
전달 경로는 예를 들어 전신 투여 및 in situ 투여를 포함한다. 효과적인 유전자 전달을 위해서는 필요한 특정 조직/세포로 향해야 하며, 결과로 생성되는 도입유전자 발현은 특정 용도에 적합한 수준이어야 한다. 프로모터는 세포 특이성뿐만 아니라 발현의 전반적인 강도를 지시할 수 있는 벡터 게놈 디자인 내의 주요한 시스 작용 요소(cis-acting element)이다.
본 발명에 있어서, 모든 세포 유형에서 암호화된 핵산의 유비쿼터스 발현이 바람직할 수 있다. EF1α(Human elongation factor 1α-subunit), CMV(Immediate-early cytomegalovirus), CBA(chicken β-actin) 및 이의 유도체 CAG, GUSB(β glucuronidase) 또는 유비퀴틴 C(UBC)와 같은 구성적 프로모터는 대부분의 조직에서 암호화된 핵산의 발현을 촉진하는 데 사용된다. 일반적으로 CBA와 CAG는 구성적 프로모터 중에서 더 강한 발현을 촉진한다. 그러나 CMV(~0.8kbs) 또는 EF1α(~1.2kbs)와 비교하여 ~1.7kbs의 크기는 AAV와 같은 패키징 제약이 있는 벡터에서의 사용을 제한할 수 있으며, 특히 본 발명의 핵산의 크기가 큰 경우 사용이 제한될 수 있다. GUSB 또는 UBC 프로모터는 각각 378 bps 및 403 bps의 작은 크기로 유비쿼터스 유전자 발현을 제공할 수 있지만 CMV 또는 CBA 프로모터보다 비교적 약하다. 따라서 발현에 영향을 미치지 않으면서 크기를 줄이기 위한 구성적 프로모터에 대한 변형이 추구되었으며 CBh(~800bps) 및 miniCBA(~800bps)와 같은 예는 선택된 조직에서 유사하고 훨씬 더 높은 발현을 촉진할 수 있다(Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153).
본 발명에 있어서, 상기 암호화된 핵산의 발현이 기관 내의 특정 세포 유형으로 제한되어야 하는 경우, 프로모터를 사용하여 이 특이성을 매개할 수 있다. 예를 들어, 신경계 내에서 프로모터는 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포에 대한 발현을 제한하는 데 사용된다. 뉴런에서 뉴런 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터는 유비쿼터스 프로모터보다 더 강력한 발현을 유도한다. 또한 혈소판 유래 성장 인자 B-사슬(PDGF-β), 시냅신(Syn) 및 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 프로모터는 NSE보다 낮은 수준에서 뉴런 특이적 발현을 유도할 수 있다. 성상 세포에서 신경교 섬유성 산성 단백질(GFAP, 2.2kbs) 프로모터의 680bps 길이 단축 버전[gfaABC(1)D]은 GFAP 프로모터와 동일한 성상 세포 특이성을 가진 더 높은 수준의 발현을 부여할 수 있다. 발현을 신경아교세포로 제한하는 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터의 선택으로 희소돌기아교세포를 표적으로 발현을 부여할 수 있으나 1.9kbs의 크기와 낮은 발현 수준으로 인해 사용이 제한됩니다.
골격근 세포에서 본 발명의 핵산을 발현하는 경우, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 및 desmin(1.7kbs)에 기반한 예시적인 프로모터는 높은 비율의 특이성을 나타낸다(원하는 경우 간에서 최소 발현됨). α-미오신 중쇄의 프로모터(α-MHC; 1.2kbs)는 다른 근육 프로모터와 비교하여 상당한 심장 특이성을 보였다(Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22). 조혈 줄기 세포에서 합성 MND 프로모터(Li et al., 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64) 및 2AUCOE (ubiquitous chromatin opening element)에 함유된 프로모터는 각각 EF1α 및 CMV 프로모터와 비교할 때 모든 세포 계통에서 더 높은 트랜스진 발현을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85; Dighe et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; al., 2014 PLoS One.9(8): e104805.). 반대로, 벡터 매개 유전자 전달 후 발현을 간 간세포로만 제한하기 위해 프로모터를 사용하는 것은 위험이 있는 시스템에서 트랜스유전자 특이적 면역 반응을 감소시키고 심지어 발현된 단백질에 대한 면역 내성을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72). α1-항트립신(hAAT; 347bps) 및 티록신 결합 글로불린(TBG; ~400bps) 프로모터는 다른 조직에 대한 침입을 최소화하면서 간으로 제한된 유전자 발현을 유도한다(Yan et al., 2012 Gene. 506(2): 289-94; Cunningham et al., 2008 Mol Ther.16(6):1081-8).
본 발명에 있어서, 생체 내 전달된 암호화된 핵산 발현의 기간 및 양을 제어하기 위한 메커니즘이 요구되며, 당업계에 바이러스 벡터화 및 플라스미드 DNA 기반 유전자 전달에 사용할 수 있는 다양한 유도성 프로모터가 공지되어 있다: Fang et al. (2007) Mol Ther. 5(6):1153-9; and Perez et al. (2004) Genet Vaccines Ther. 2(1):2. 현재 임상 시험 중인 조절 가능한 메커니즘의 예는 소분자 리간드에 의해 활성화되는 엑디손 기반 유전자 스위치이다: Cai et al. (2016) Clin Pharmacol Drug Dev. 2016.
본 발명의 핵산의 생체 내 전달 및 발현에 있어서, 바이러스 전사후 조절 요소(PRE)가 사용될 수 있다; 이러한 cis-작용 요소는 인트론 없는 바이러스 RNA의 핵 탈출(export)에 요구된다(Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9; 및 1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9). 예를 들어, HPRE(B형 간염 바이러스 PRE, 533bps) 및 WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus PRE, 600bps)를 포함하며, 이는 특정 경우에 전달된 유전자의 발현 수준을 거의 10배까지 증가시킬 수 있다(Donello et al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92). 추가적으로, 렌티바이러스 및 AAV 벡터를 사용할 때, WPRE는 CMV 프로모터 구동 트랜스진의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 PPE, PDGF 및 NSE 프로모터 구동 트랜스진 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. WPRE의 또 다른 효과는 암호화된 핵산 유전자의 침묵으로부터 보호하는 것일 수 있다(Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb;16(1):167-76).
암호화된 핵산의 전사체의 폴리아데닐화는 또한 핵 탈출, 번역 및 mRNA 안정성에 중요할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 수 있다. 유전자 발현 및 mRNA 안정성에 대한 다양한 polyA 신호의 영향을 결정한 다양한 연구가 공지되어 있다. 예시적인 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 후기 또는 소 성장 호르몬 폴리A(bGHpA) 신호 서열뿐만 아니라 최소 합성 폴리A(SPA) 신호를 포함한다(Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25; Yew et al. ., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84). 폴리아데닐화의 효율은 다른 polyA 신호의 상류에 위치한 SV40 후기 polyA 신호 상류 인핸서(USE)에 의해 증가된다(Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93). 본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 핵산은 SV40 late + 2xUSE polyA 신호를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 바람직하게는 임의의 프로모터 서열에 더하여 적어도 하나의 조절 인핸서(regulatory enhancers)를 추가로 포함할 수 있다. CMV 인핸서는 -598 내지 -68에서 CMV 프로모터의 업스트림이고(Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30)(~600bps) 전사 결합 부위를 함유한다. 본 발명에 있어서, 예를 들어, ANF (atrial natriuretic factor) 프로모터, CC10 (club cell 10) 프로모터, SP-C (surfactant protein C) 프로모터, 또는 PDGF-β (platelet-derived growth factor-β) 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터 구동 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 CMV 인핸서가 컨스트럭트에 포함될 수 있다. 전체적으로, CMV 인핸서는 상이한 세포 특이적 프로모터 및 상이한 세포 유형 하에서 도입유전자 발현을 증가시켜 도입유전자 발현 수준을 증가시키는 데 광범위하게 적용할 수 있는 도구이다. 근육에서, 예를 들어 AAV 발현 시스템에서 근육 특이적 프로모터와 함께 CMV 인핸서를 사용하는 이식유전자 발현은 이식유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 핵산을 근육세포에서 발현하는데 특히 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 적어도 하나의 인트론 서열을 추가로 포함할 수 있다. mRNA에서 인트론 또는 개재 서열의 존재는 시험관 내에서 mRNA 프로세싱 및 증가된 도입유전자 발현에 중요하다고 보고된 바 있다(Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10; Niwa et al., 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9). 인트론(들)은 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있고/있거나 프로모터와 이식유전자 사이에 위치할 수도 있다. 표 14는 간 트랜스진 발현에 대해 AAV2를 사용하는 마우스에서 프로모터와 트랜스진 사이에 배치된 다양한 인트론을 비교한 것이다(Wu et al., 2008). MVM(생쥐의 미세 바이러스) 인트론은 테스트된 다른 어떤 인트론보다 더 많이 이식유전자 발현을 증가시켰으며, 인트론이 없는 경우보다 80배 이상 증가한 것으로 보고되었다(Wu et al., 2008). 그러나, AAV 발현 카세트를 사용하는 배양된 뉴런에서, 도입유전자 발현은 WPRE와 비교하여 도입유전자와 polyA 신호 사이에 키메라 인트론(human β-globin donor and immunoglobulin heavy chain acceptor)이 있는 CaMPKII 프로모터 하에서 더 적게 나타났다(Choi et al., 2014). 본 발명에 있어서, 상기 인트론은 이식유전자 발현을 증가시키기 위해 발현 카세트에 포함되는 중요한 요소가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는 에피솜 벡터일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터가 에피솜 벡터인 경우, 적어도 하나의 복제 원점, 미니염색체 유지 요소(MME) 및/또는 핵 국소화 요소를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 벡터가 자가-복제되고, 여러 세대에 걸쳐 숙주 세포에서 지속되는 데 필요한 복제 원점(ori)을 암호화하는 바이러스 게놈 DNA의 일부를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 에피솜 벡터는 복제에 필요한 적어도 하나의 바이러스 단백질, 예를 들어 복제자 단백질(replicator protein)을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 복제 개시를 돕는 복제자 단백질은 본 발명의 자가 복제 에피솜 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서 또 다른 벡터 또는 숙주 게놈 DNA와 같은 또 다른 DNA 분자 상에서 트랜스로 발현될 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 자기 복제 에피솜 LCR 함유 발현 벡터는 감염성 바이러스 입자를 생성하는 코어 또는 캡시드 단백질을 암호화하는 바이러스 게놈 DNA 또는 전장 바이러스 게놈 DNA 분자에 존재할 수 있는 바이러스 온코제닉 서열과 같은 진핵 숙주 세포에서 장기간 안정적인 유지에 필요하지 않은 바이러스 서열을 함유하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, “안정적인 유지”는 2, 3, 4 또는 5세대 또는 그 이상의 세대에 대한 벡터의 복제 수에서 비분열 세포 또는 연속 선택이 없을 때 분열하는 세포의 자손 세포에서 상당한 손실 없이 (예: >50%) 지속되거나 유지되는 자가-복제 에피솜 발현 벡터의 능력을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 10 내지 15 또는 그 이상의 세대에 걸쳐 유지될 수 있다. 대조적으로 숙주세포에서 플라스미드의 “일시적(transient)” 또는 “단기(short term)” 지속성은 벡터가 숙주세포에서 안정적인 방식으로 복제 및 분리될 수 없음을 의미한다. 이 경우, 벡터는 1~2세대 후에 손실되거나 연속적인 세대 사이에 복제 수의 >51% 손실을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 유용한 몇 가지 대표적인 자기 복제, LCR 함유, 에피솜 벡터가 아래에서 추가로 설명된다. 자가 복제 기능은 Wohlgeuth et al., 1996, Gene Therapy 3:503; Vos et al., 1995, Jour. Cell. Biol., Supp. 21A, 433; 및 Sun et al., 1994, Nature Genetics 8:33 등에서 서술된 것과 같이, 대안적으로 적어도 하나의 포유동물 서열에 의해 제공될 수 있으며, 선택적으로 핵 유지(nuclear retention) 필요할 수 있는 적어도 하나의 서열과 조합될 수 있다. 자가 복제 기능을 제공하기 위한 포유류, 특히 인간 서열 사용의 이점은 독성 또는 발암 특성을 가질 수 있는 외래 활성화 인자가 필요하지 않다는 것이다. 통상의 기술자는 본 발명이 하나의 복제 원점 또는 임의의 하나의 에피솜 벡터에 제한되지 않고, 에피솜 벡터에서 LCR의 조직 제한된 조절의 조합을 포함할 수 있음을 이해할 수 있다. 또한, 본 발명에서 WO1998007876 및 미국 특허 제7,790,446호가 참조된다.
본 발명에 있어서, 상기 에피솜 발현 벡터는 예를 들어, Epstein-Barr 바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(Yates et. al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3806-3810 (1984); Yates et al., Nature 313:812-815 (1985); Krysan et al., Mol . Cell . Biol . 9:1026-1033 (1989); James et al. Gene 86: 233-239 (1990), Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991); and Pan et al., Som . Cell Molec. Genet . 18:163-177 (1992)); 파필로마 바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(예를 들어, 소 파필로마 바이러스 및 인간 파필로마 바이러스((Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J . 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 898-902 (1993))); 또는 파포바이러스 기반 자가 복제 에피솜 발현 벡터(Papovavirus-Based, Self-Replicating, Episomal Expression Vectors, De Benedetti and Rhoads, Nucleic Acids Res . 19:1925 (1991), as can a 3.2 kb fragment of the BK virus (Cooper and Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993))일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 원형 또는 선형 핵산으로 제공될 수 있다. 상기 원형 또는 선형 핵산은 적절한 표적 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시할 수 있다, 본 발명에 있어서, 상기 발현을 위한 적어도 하나의 핵산 시느템은 키메라일 수 있으며, 이는 이러한 구성요소중 적어도 하나가 다른 요소중 적어도 하나와 관련하여 이종임을 의미한다.
핵산(또는 벡터)의 도입 방법
본 발명의 용어, “도입”은 숙주세포가 갖지 않는 외부 유전자(핵산 또는 벡터)을 숙주세포가 수용하도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 이를 포함하는 벡터를 사용하여 숙주세포에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “벡터”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 바이러스벡터 또는 비 바이러스성 벡터일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터(예, 감마레트로 바이러스 벡터), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657(1999); Ridgeway, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) and Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999)), 단순 헤르페스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 폴리오바이러스와 같은 바이러스 유래 벡터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비 바이러스성 벡터는 네이키드 플라스미드 DNA(pDNA), 선형 핵산 또는 선형 발현 카세트(linear expression cassette, LEC, 플라스미드 벡터(Sambrook et al., 1989) 및 미니 서클(Yew et al. 2000 Mol Ther 1(3), 255-62)과 같은 비-바이러스성 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체, 또는 이를 포함하는 융합단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결될 수 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 CMV 프로모터, PGK 프로모터, EF1α 프로모터, EFS 프로모터, CBh 프로모터, MSCV 프로모터, SFFV 프로모터, 및 UbC 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF1α 프로모터 및 CBh 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 인핸서(enhancer) 서열을 포함하는 것을 추가적인 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린(ampicillin), 겐타마이신(gentamycin), 카베니실린(carbenicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 푸로마이신(puromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 하이그로마이신(hygromycin), 게네티신(geneticin), 네오마이신(neomycin) 및 테트라사이클린(tetracyclin)에 대한 내성 유전자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 숙주세포의 유전자 내로 혼입되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 작제될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 관심 재조합 폴리펩타이드가 생성될 숙주세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 분리된 관심 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구성할 수 있다. 또한, 특정 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오타이드를 합성한 다음 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 수득되면, 이를 포함하는 벡터는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다. (예를 들어 Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN 분자 생물학, John Wiley & Sons, NY).
본 발명에 있어서, 숙주세포로의 핵산 또는 벡터의 도입은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant) 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 이를 포함하는 비-바이러스성 발현 벡터는 통상적인 기술(예를 들어, RNA 매개 유전자 전달, 전기천공, 리포솜 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주세포로 전달 및 도입될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터 구축을 기반으로 구축되는 경우, 당업계에 공지된 통상적인 감염 방법으로 전달이 수행될 수 있다. 예를 들어, 전기천공(electroporation; Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); and Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), DNA를 입자(예, 금)에 로드하고 세포내로 침투시키는 유전자 충격(gene bombardment, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990), 소노포레이션(sonoporation), 자기감염(magnetofection), 유체역학적 전달(hydrodynamic delivery) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 또는 벡터는 RNA 매개 유전자 전달을 통해 숙주세포로 전달될 수 있다(mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs” Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80.; Pardi et al. 2015 J Control Release 217:345-51; WO2017/162266; Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817; WO/2017/036889; WO2015/034928; WO2015/034925; WO2013/151666 등 참조). 본 발명에 있어서, 예시적인 mRNA 및 다른 핵산은 WO2017/049275, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2016/011226, WO2015/196128, WO/2015/196130, WO/2015/196118, WO/2015/089511, 및 WO2015/105926등에 기재된 명세서 및 도면을 참조한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 또는 벡터는 전기천공을 통해 숙주세포에 도입될 수 있다(Kim et al. Cancer Gene Ther, (2016) 23(10): 341-347, 본 발명에 있어서, 전기천공은 예를 들어 미국 특허 제7,245,963호; 제6,302,874호; 제5,676,646호; 제6,241,701호; 제6,233,482호; 제6,216,034호; 제6,208,893호; 제6,192,270호; 제6,181,964호; 제6,150,148호; 제6,120,493호; 제6,096,020호; 제6,068,650호; 및 제5,702,359호; 국제 공개공보 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655 등에 기재된 방법을 참조하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산의 전달을 위해 형질전환 강화 제형(Transfection Enhancing Formulations)이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산은 세포막과 상호작용할 수 있고 융합하거나 세포내이입을 거쳐 핵산을 세포로 전달할 수 있는 리포좀 바람직하게는 양이온성 리포좀((Wong, T. K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 21:185-190 (1982); and Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987))), 또는 폴리머좀(합성 리포좀)에 캡슐화 될 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA는 또한 중합체(폴리플렉스) 또는 세포의 세포질로 부하를 직접 방출할 수 있는 덴드리머와의 복합체로 형성될 수 있다. 예시적인 담체로서, 폴리(락타이드-코-클리콜라이드) (poly(lactide-co-glycolide)), 폴리아크릴레이트, 락텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미립자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예시적인 담체로서, 비액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당체 또는 올리고당) 및 임의의 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 레이어를 포함하는 초분자 바이오벡터(supramolecular biovectors)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다 , (미국 특허 제5,151,254호, WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638 등 참조). 생분해성 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 조성물을 위한 담체로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 적합한 생분해성 마이크로스피어의 예는 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호와 같다. WO/99 40934 및 이에 인용된 참고문헌에 기재된 변형된 헤파티티스 B 코어 단백질 담체 시스템(Modified hepatitis B core protein carrier system)또한 유용하게 응용될 수 있다. 또 다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 것과 같은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용하며, 이는 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 때 추가 이점을 가질 수 있다.생분해성 고분자 나노입자는 세포로의 비바이러스성 핵산 전달을 촉진할 수 있다. 작고(약 200nm), 양전하를 띄는(약 10mV) 입자는 양이온성, 가수분해가능한 poly(beta-amino esters) 및 플라스미드 DNA의 자가조립에 의해 형성된다.
본 발명의 핵산은 또한 직접적인 미세주사, 일시적 세포투과(예를 들어, 억제인자 및/또는 활성인자와 세포 투과제의 동시투여), 막전좌 펩타이드로의 융합 등에 의해 세포에 도입될 수 있다.
in vitro 및 in vivo에서 mRNA를 포함하는 외래 핵산의 지질-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기반 비바이러스 제형은 바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현재 생체 내 지질 전달 방법은 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제제의 발전으로 생체 내 유전자 전달 효율이 개선되었다(WO 98/07408 참조). 예를 들어, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP)과 콜레스테롤의 등몰비로 구성된 지질 제제는 전신 생체 내 유전자 전달을 상당히 향상시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포솜(sandwich liposome)"이라는 독특한 구조를 형성합니다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '꽃병(vase)' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치(sandwich)"하는 것으로 보고되었다. 이러한 지질 구조는 양성 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 증가된 혈청 안정성을 포함하는 장점을 갖는다.
양이온성 리포솜 기술은 양전하를 띤 헤드 그룹과 소수성 지질 꼬리를 갖는 양친매성 지질이 음전하를 띤 DNA 또는 RNA에 결합하고 일반적으로 엔도사이토시스에 의해 세포로 들어가는 입자를 형성하는 능력을 기반으로 한다. 일부 양이온성 리포좀은 또한 중성 공지질을 함유하고 있는데, 이는 포유동물 세포에 의한 리포좀 흡수를 향상시키는 것으로 이해된다. 유사하게, 폴리-L-리신 및 폴리에틸렌-이민과 같은 다른 폴리양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체를 형성하고 DNA 또는 RNA가 나노입자로 응축되는 것을 돕고, 이는 엔도솜 매개 흡수를 위한 기질이 된다. 이러한 양이온성-핵산 복합 기술 중 몇 가지는 플라스미드 DNA(pDNA), 올리고데옥시뉴클레오티드 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합물을 포함하여 잠재적인 임상 제품으로 개발되었으며 본 발명의 암호화된 핵산 전달 시스템의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명의 암호화된 핵산은 세포로의 흡수를 향상시키는 역할을 하는 다가양이온성 분자와 회합될 수 있다. 다가양이온성 분자로 핵산 구성물을 복합화하는 것은 또한 그 크기가 감소되도록 구성물을 패키징하는 데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 여겨진다. 일단 엔도솜에 들어가면 낮은 pH로 인해 복합체가 해리되고 다중양이온성 분자가 엔도솜의 막을 파괴하여 DNA가 분해되기 전에 세포질로 탈출하는 것을 촉진할 수 있다. 기존의 데이터는 핵산 구조물 실시예가 다가양이온성 분자인 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 복합화될 때 DC보다 SC로의 흡수가 향상되었음을 보여준다. 핵산 작제물과의 복합화에 유용한 다가양이온성 분자의 한 예는 세포 침투 펩티드(CPP)를 포함하고, 예는 폴리라이신(상기 기술됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩티드를 포함한다. 세포 침투 펩타이드(CPP)는 DNA에 결합할 수 있는 작은 펩타이드로 일단 방출되면 세포막을 통과하여 엔도솜에서 세포질로 DNA의 탈출을 촉진한다. CPP의 또 다른 예는 MPG라고 하는 27개 잔기 키메라 펩타이드와 관련이 있으며, 얼마 전에 안정한 방식으로 ss- 및 ds-올리고뉴클레오티드에 결합하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 DNase에 의한 분해로부터 핵산을 보호하고 체외에서 세포에 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 전달하는 비공유 결합 복합체를 생성한다 (Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 상기 비공유 결합 복합체는 상이한 펩티드:DNA 비율, 10:1 및 5:1 비율(각각 150nm 및 1um)을 조사할 때 약 150nm 내지 1um의 작은 입자를 형성하였다. 또 다른 CPP는 변형된 테트라펩타이드 TL-GCP(modified tetrapeptide [tetralysine containing guanidinocarbonylpyrrole (GCP) groups]과 관련되며, 이는 6.2kb 플라스미드 DNA에 높은 친화도로 결합하여 700-900nm의 양전하 응집체를 생성하는 것으로 보고되었다 (Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4). RNA는 또한 생체내 전달을 위해 이러한 다중양이온성 분자에 의해 복합체화될 수 있다. 본 발명에 기술된 핵산 작제물과 착화될 수 있는 다가양이온성 분자의 다른 예는 JETPRIME® 및 In vivo JET(Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France)로 상업적으로 입수 가능한 다가양이온성 중합체를 포함한다.
본 발명에 있어서, (i) 화학식 I의 화합물, 인지질, 구조적 지질(structural lipid) 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 (ii) mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 나노입자를 투여하여 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 인코딩하는 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 환자의 세포에 전달하는 방법을 고려하며, 상기 투여는 상기 투여는 상기 포유동물 세포를 상기 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 이로써 상기 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)가 상기 세포로 전달된다.
예를 들어, 본 발명에 있어서, PEG 지질은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티드 산, PEG-변형 세라마이드, PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤 및 PEG-변형 디알킬글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산 및 알파토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모이어티를 포함할 수 있다: 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 포스파티딜 글리세롤(phosphatidyl glycerol), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine), 포스파티드산(phosphatidic acid), 2-리소포스파티딜 콜린(2-lysophosphatidyl choline), 및 스핑고미엘린(sphingomyelin). 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 지방산 모이어티를 포함할 수 있다: 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 미리스톨레산(myristoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀레산(alpha-linolenic acid), 에루크산(erucic acid), 아라키드산(arachidic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 피타노산(phytanoic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 베헨산(behenic acid), 도코사펜타엔산(docosapentaenoic acid), 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid). 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 1 ,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC), 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycero-phosphocholine (DMPC), 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1 ,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1 ,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine (DUPC), 1 -palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1 ,2-di-0-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1 8:0 Diether PC), 1 -oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OChemsPC), 1 -hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16 Lyso PC), 1 ,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 ,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 ,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanola mine (DOPE), 1 ,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ME 1 6.0 PE), 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1 ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1 -glycerol) sodium salt (DOPG), 및 스핑고미엘린. 본 발명에 있어서, 상기 인지질은 DOPE 또는 DSPC일 수 있다.
추가적인 예를 들어, 상기 인지질은 DOPE일 수 있고, 상기 지질 성분은 약 35 mol% 내지 약 45 mol%의 상기한 화합물, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%의 DOPE, 약 38.5 mol% 내지 약 48.5 mol%의 구조적 지질 및 약 1.5 mol%의 PEG 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질성분은 약 40mol%의 상기한 화합물, 약 15 mol%의 인지질, 약 43.5 mol%의 구조적 지질 및 약 1.5 mol%의 PEG 지질을 포함할 수 있다
본 발명에 있어서, 지질 성분 대 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합 단백질 또는 접합체 코딩 mRNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)의 중량/중량비는 약 5:1 내지 약 50:1, 또는 약 10:1 내지 약 40:1일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물의 평균 크기는 약 50 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 120 nm 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물의 다분산 지수는 약 0 내지 약 0.18, 또는 약 0.13 내지 약 0.17 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 약 -10 내지 약 +20 mV의 제타 전위를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질을 추가로 포함할 수 있다: 3-(didodecylamino)-N1 ,N 1 ,4-tridodecyl-1 -piperazineethanamine (KL1 0), 14,25-ditridecyl-1 5, 1 8,21 ,24-tetraaza-octatriacontane (KL25), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLin-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1 ,3]-dioxolane (DLin-K-DMA), heptatriaconta-6, 9,28,31 -tetraen-1 9-yl 4-(dimethylamino)butanoate (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1 ,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA), 1 ,2-dioleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DODMA), and (2R)-2-({8-[(3P)-cholest-5-en-3-yloxy]octyl}oxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,1 2Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -yl oxy]propan-1 -amine (Octyl-CLinDMA (2R)).
상기 핵산 또는 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 암호화 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 상기 벡터를 도입하기 위해, 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 암호화되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호화되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 암호화되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 형질전환의 효율을 높이기 위해 “형질전환 강화제”가 추가로 사용될 수 있다. 상기 “형질전환 강화제”는 일반적으로 양이온성 폴리머인 것이 바람직하며, 음전하를 띄는 핵산 또는 유전자가 숙주 세포에 혼입되기 쉽도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 강화제는 양이온성 폴리머인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 폴리브렌(polybrene), 프로타민 설페이트(protamine sulfate) 및 Sirion사의 Lentiboost로부터 선택되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리브렌(polybrene)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발현 방법 및 시스템
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서, 본 발명의 핵산을 적합한 숙주에 도입하고 발현시키는 것까지 다양하다. 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체가 화학적 변형 또는 접합과 같은 다양한 변형을 포함하는 경우, 숙주세포로부터 분리 또는 화학적 합성 후 화학적 또는 효소적으로 추가 조작되어 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 조작된 세포를 배양하여 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 생산하는 단계를 포함하는 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체가 화학적 변형 또는 접합과 같은 다양한 변형을 포함하는 경우, 숙주세포로부터 분리 또는 화학적 합성 후 화학적 또는 효소적으로 추가 조작되어 제조될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 숙주 세포로 도입 및 발현하여, 제조하는 방법은 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 및 WO 2009/068627 등에 기재된 것을 참조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드 합성기기를 사용한 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오타이드는 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열에 기초하여 설계될 수 있고, 숙주세포에서 선호되는 코돈을 선택하는 코돈 최적화를 수행할 수 있다. 본 발명의 핵산의 합성을 위해 표준 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역 유전자를 구성할 수 있다. 또한, 분리된 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 보완 조립을 위해 5' 또는 3' 오버행을 포함할 수 있다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 표 4에 기재된 것 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 암호화하는 핵산을 기반으로 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여, 이를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 단백질의 생산을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 통상의 기술자는 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화 하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합 기술 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY 참조).
본 발명에 있어서, 발현 벡터는 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공법, 리포솜 형질감염 및 인산 칼슘 침전등)에 의해 숙주세포로 전달될 수 있으며, 형질감염된 세포는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 배양되어, CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현할 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질의 발현은 구성적, 유도적 또는 조직적, 특이적 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 사용되는 숙주세포의 유형에 기초하여 선택될 수 있는 복제 원점을 포함할 수 있다. 예를 들어, pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass.)는 대부분의 그람 음성 박테리아에 유용한 반면, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV(vesicular stomatitus virus) 또는 파필로마바이러스(HPV, BPV)는 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하기에 유용하게 사용된다. 일반적으로 포유류 발현 벡터에는 복제원점이 필요하지 않을 수 잇다(예를 들어, SV40 복제원점은 초기 프로모터를 포함하므로 사용될 수 있음).
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어, 선택 배양 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 암호화하는 유전적 요소를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 원핵 숙주 세포에 대한 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신에 대한 내성 부여; (b) 세포의 영양요구 결핍 보완; 또는 (c) 복합 배지에서 얻을 수 없는 중요한 영양소의 공급을 위해 관련 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 선별 마커는 카나마이신 내성 유전자 암피실린 내성 유전자 또는 테트라사이클린 내성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 네오마이신 내성 유전자는 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 선택을 위해 사용될 수 있다. 다른 선별 유전자를 사용하여 발현될 유전자를 증폭할 수 있다. 증폭은 성장에 중요한 단백질 생산에 큰 수요가 있는 유전자가 연속적인 재조합 세포 세대의 염색체 내에서 나란히 반복되는 과정을 의미한다. 포유동물 세포에 대한 선별가능한 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 벡터에 존재하는 마커 덕분에 형질전환체만이 생존하도록 고유하게 적응되는 선택 압력하에 놓여진다. 선택 압력은 배지 내 선택제의 농도가 연속적으로 변화하는 조건 하에서 형질전환된 세포를 배양함으로써 부과되며, 이로써 선택 유전자 및 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 DNA 모두가 증폭될 수 있고, 그 결과 증폭된 DNA로부터 증가된 양의 단백질이 합성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 리보솜 결합 부위는 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 mRNA로 전사될 수 있다. 예를 들어, 상기 리보솜 결합 부위는 Shine-Dalgarno 서열(원핵생물) 또는 Kozak 서열(진핵생물)일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 결합 부위는 들은 전형적으로 발현될 폴리펩티드의 프로모터에 대해 3' 방향 및 암호화 서열에 대해 5' 방향에 위치할 수 있다. 다양한 Shine-Dalgarno 시퀀스가 있으나, 일반적으로 폴리퓨린(A-G 함량이 높음)이다. 많은 Shine-Dalgarno 서열이 확인되었으며, 상기 설명한 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수 있고 원핵 벡터에서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 수 있다. 발현에 사용되는 숙주 세포 및 원하는 수율에 따라 천연 또는 이종 프로모터가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 원핵 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알카라인 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템; 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 등이 포함된다. 이외의 또 다른 알려진 박테리아 프로모터도 적합할 수 있다. 이러한 프로모터의 서열은 공개되었고 제한 부위를 제공하기 위해 원하는 대로 링커 또는 어댑터를 사용하여 원하는 핵산 서열(들)에 연결될 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터도 당업계에 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 잘 알려져 있으며 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 플로우폭스 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, hepatitis-B 바이러스, 가장 바람직하게는 Simian 바이러스 40(SV40)에서 유래한 프로모터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 heat-shock 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가 프로모터는 예를 들어, SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); CMV 프로모터; Rous sarcoma 바이러스의 3' 장 말단 반복을 포함하는 프로모터 (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); 헤르페스 타이미딘 카이나아제 프로모터 (herpes thymidine kinase promoter, Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982); 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터 (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); 또는 tac 프로모터 (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에서 활용된 도물 전사 제어영역도 사용될 수 있다: 췌장 선포 세포(pancreatic acinar cells)에서 활성화되는 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성화되는 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); 림프 세포에서 활성화되는 면역 글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44); 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성화되는 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95), 간에서 활성화되는 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76); 간에서 활성화되는 알파태아단백 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); 간에서 활성화되는 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71); 골수 세포에서 활성화되는 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성화되는 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); 골격근에서 활성화되는 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); 및 및 시상 하부에서 활성화되는 성선 자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8)ㅇ,ㄹ 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인핸서 서열은 진핵 숙주 세포에서 전사를 증가시키기 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 포유류 유전자에서 사용할 수 있는 여러 인핸서 서열이 알려져 있다(예: 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나 일반적으로 바이러스의 인핸서가 사용된다. SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸서이다.
인핸서는 폴리펩티드 코딩 영역의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 방향에 위치한다.
본 발명에 있어서, 핵산을 발현하기 위한 벡터는 박테리아, 곤충 및 포유류 숙주 세포와 호환되는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 inter alia, pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR- alpha (PCT Publication No. WO90/14363) 및 pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.)등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 가능한 추가 벡터에는 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 다만 벡터는 선택한 숙주 세포와 호환되어야 한다. 그러한 벡터는 Bluescript® 플라스미드 유도체(고카피수 ColE1 기반 파지미드, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.), Taq-증폭 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드(예, TOPO™. TA Cloning® Kit, PCR2.1 플라스미드 유도체, Invitrogen, Carlsbad, CA)와 같은 플라스미드, 및 포유동물, 효모 또는 바쿨로바이러스 발현 시스템(pBacPAK 플라스미드 유도체, Clontech, Palo Alto, CA)과 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 벡터와 같은 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 또는 기타 알려진 기술을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현을 위한 숙주로서 포유동물 세포를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, American Type Culture Collection(ATCC)에서 입수할 수 있는 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예: Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함할 수 있다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지 결정함으로써 특정 선호도의 세포주가 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주로는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포주, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포가 사용될 수 있다. 상기 진균세포에는 효모 및 사상균 세포(filamentous fungus cells)가 포함되며, 예를 들어, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens 및 Neurospora crassa. Pichia sp., 임의의 Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, 임의의 Kluyveromyces sp., Candida albicans, 임의의 Aspergillus sp., Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, 임의의 Fusarium sp., Yarrowia lipolytica, 및 Neurospora crassa 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 숙주-발현 시스템은 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 서열을 생산하고 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 적절한 핵산 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 in situ에서 발현할 수 있는 세포를 나타내기도 한다. 여기에는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예: E. coli 및 B. subtilis)와 같은 미생물; 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, Saccharomyces pichia); 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래한 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 를 포함하는 재조합 발현 구조체, 또는 포유동물 바이러스(예: 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)에서 유래된 프로모터를 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프 세포(미국 특허 제5,807,715호 참조), Per C.6 세포(Crucell에서 개발한 래트 망막 세포)))를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
박테리아 시스템에서 발현되는 단백질의 용도에 따라, 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 생성을 위해 이러한 단백질을 대량으로 생산해야 하는 경우, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어, 융합단백질의 생성을 위해 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 코딩 영역이 lac Z 코딩 영역과 프레임 내 벡터에 개별적으로 결찰된 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791-1794); pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재 하에서 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티에서 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되었다.
곤충 시스템에서 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)는 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용된다. 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포에서 자란다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 서열은 바이러스의 비필수 영역(예: 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예: 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 단백질 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열에 연결될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이어서 in vitro 또는 in vivo 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예: 영역 E1 또는 E3)에 삽입하면 감염된 숙주에서 생존 가능하고 면역글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다. (예를 들어, Logan et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659 참조). 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열이 포함된다. 또한 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 동상이어야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함함으로써 향상될 수 있다(Bitter et al.(1987 Methods in Enzymol. 153:516-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질의 이러한 변형(예: 글리코실화) 및 가공(예: 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포는 번역 후 처리 및 단백질 및 유전자 산물의 변형을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 가지고 있다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장할 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사, 글리코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기구를 소유한 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 진핵 숙주 세포는 예를 들어, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해 안정적인 발현이 고려된다. 예를 들어, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 허용될 수 있으며, 그런 다음 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점을 형성하도록 한다. 이 방법은 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 재조합 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 다양한 선택 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타이미딘 카이나아제(herpes simplex virus thymidine kinase; Wigler et al. (1977) Cell 11:223-232), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase; Szybalska et al. (1962), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), 및 아데닌 포스포리보실 전이효소 (adenine phosphoribosyltransferase; Lowy et al. (1980), Cell 22:817-823) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 항대사물질 저항성은 다음 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); 아미노글루코사이드 G-418에 저항성을 부여하는 neo(Tachibana et al. (1991) Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14에 기재되어 있음; 및 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al. (1984) Gene 30:147-156).
본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(Bebbington 및 Hentschel, in DNA CLONING, 3권. (Academic Press, New York, 1987) 참조). 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭될 때 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제 수를 증가시킬 수 있다. 증폭된 영역이 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 암호화하는 핵산 서열과 연관되기 때문에, 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 생산 또한 증가할 수 있다(Crouse et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
본 발명의 융합단백질이 항체 융합체 또는 기타 다중단백질 복합체인 경우, 숙주 세포는 2 개의 발현 벡터, 예를 들어 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 벡터와 경쇄 유도된 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 벡터로 동시 형질감염될 수 있다. 상기 2개의 발현 벡터 중 어느 하나 또는 둘 다 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체 암호화 서열을 포함할 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 상황에서 경쇄는 과도한 독성을 갖는 자유 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 위치해야 한다(Proudfoot (1986) Nature 322:562-565; Kohler (1980) ) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 유전성 DNA를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생성된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생성된 당단백질에 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 따라서 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 특정 글리코실화 패턴은 단백질을 생산하는 데 사용되는 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 변이체-항체 융합 단백질의 일부 실시예에서, 푸코실화되지 않은 N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴이 유리할 수 있는데, 이는 항체의 경우 시험관내 및 생체내 모두에서 푸코실화된 대응물보다 전형적으로 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 나타났기 때문이다. (예를 들어, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); 미국 특허 제6,946,292호 및 제7,214,775호 참조).
또한, 생산 세포주로부터의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 강화될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성 효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 향상시키기 위한 일반적인 접근 방식이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0216846호, 제0256055호, 및 제0323997호 및 유럽 특허 출원 번호 제89303964.4호와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 기재된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되어 있고 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장하지만, 면역글로불린 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 글루타민 신테타제 유전자를 포함하며 이는 숙주 세포의 유전자 부족을 보완할 수 있다. 본 발명의 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체, 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 함유하는 이러한 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 사용하여 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 생산하기 위한 발현 방법은 본 발명의 범위의 일부로 제공된다.
곤충 세포 배양 시스템(예: 바쿨로바이러스)에서 재조합 단백질의 발현은 또한 올바르게 폴딩되고 생물학적으로 기능하는 단백질을 생산하기 위한 강력한 방법을 제공한다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 배큘로바이러스 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다.
형질전환된 숙주 세포에 의해 생성된 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 표준 방법에는 크로마토그래피(예: 이온 교환, 친화성 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도 또는 단백질 정제를 위한 기타 표준 기술이 포함된다. 헥사-히스티딘, 말토오스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제와 같은 친화성 태그를 단백질에 부착하여 적절한 친화성 컬럼을 통과시켜 쉽게 정제할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 질량분석법(MS), 핵자기공명(NMR), 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 및 x선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특성화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 박테리아 배양물에서 생성된 스테핀 A 단백질 또는 이를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체는 예를 들어 세포 펠릿으로부터 초기 추출에 이어 적어도 하나의 농축, 염석(salting-out), 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파쇄될 수 있다.
용도
본 발명은 상기 유전자 조작된 세포의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질의 제조(manufacturing)를 위한 사용을 권리범위에서 제외한다.
본 발명의 유전자 조작된 세포의 용도는 스테핀 A 단백질 변이체 및/또는 이를 포함하는 융합 단백질의 제조(manufacturing)를 위한 사용을 제외한 모든 용도를 제한없이 포함한다. 바람직한 예를 들어, 의학적, 약제학적, 임상적 용도를 모두 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용도
용도 - 의약용도(방법, 약학적 조성물 등)
특히 CD40L/CD40의 상호작용에 의한 T세포 및 B세포의 활성화가 병리에 주요한 영향을 미치는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 병원성 인자로 작용한다는 점은 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, 제1형 당뇨, 갑상선염, 건선, 루푸스 (Systemic Lupus Erythematosus; SLE), 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis; RA), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis; MS) 등과 같은 다양한 질환의 병원성 인자이다. 이러한 질환의 치료를 위해 CD40L을 표적으로 하는 다양한 화합물 또는 항체가 개발되고 있다(Semin Immunol. 2009;21(5):293-300; Advanced Drug Delivery Reviews Volume 141, 15 February 2019, Pages 92-103).
본 발명의 실시예에서는 이식편대 숙주병(GVHD)을 갖는 동물 모델에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체를 투여하는 경우, 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 유효성분으로 함유하는 융합 단백질, 및/또는 이를 포함하는 접합체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 CD40L과 관련한 다양한 질환, 특히 CD40L에 대한 표적화 또는 CD40L의 억제를 통해 예방 또는 치료효과를 달성할 수 있는 당업계에 알려진 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클의 면역질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체, 상기 융합 단백질, 상기 접합체, 상기 핵산, 및/또는 상기 전달 비히클의 약학 조성물의 제조 용도에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용도인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 면역질환의 발병이 예상되는 개체에게 본 발명에서 제공하는 약학적 조성물을 투여하여 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 저해, 전이의 예방, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 경감 또는 일시적인 완화 및 예후의 개선이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 건선을 비롯한 자가면역질환이 발병된 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여 상기 자가면역질환의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제형화 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 의약품 또는 약학 조성물과 병행 또는 병용하여 투여할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 다른 면역요법제, 화학요법제, 항체치료제 등과 병용 투여될 수 있다.
구체적인 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 질병 완화 항류마티스 약물(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs); 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory medication, NSAID); 코르티코스테로이드(Corticosteroids); 야누스 키나아제 억제제(Janus kinase inhibitors); 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors); mTOR 억제제; IMDH 억제제; 및 생물학적 제제로 구성된 군에서 선택되는 약물과 조합하여 사용되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 질병 완화 항류마티스 약물(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs)은 예를 들어, Actarit, Auranofin, Azathioprine, Bucillamine, Cyclophophamide, D-penicillamine, Leflunomide, Lobenzarit disodium, Methotrexate, Minocycline hydrochloride, Mizoribine 및 Salazosulfapyridine 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory medication, NSAID)는 Celecoxib, Diclofenac sodium, Ibuprofen, Ketoprofen, Meloxicam, Naproxen, Piroxicam 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코르티코스테로이드(Corticosteroids)는 prednisone (Deltasone, Orasone), budesonide (Entocort EC), prednisolone (Millipred), methylprednisolone 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 야누스 키나아제 억제제(Janus kinase inhibitors)는 승인된 약물로, tofacitinib, Abrocitinib, Baricitinib, Delgocitinib, Fedratinib, Filgotinib, Oclacitinib, Peficitinib, Ruxolitinib, Upadacitinib, 임상 중인 약물로, Cerdulatinib, Gandotinib, Lestaurtinib, Momelotinib, Pacritinib, Deucravacitinib 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitors)는 cyclosporine, tacrolimus 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 sirolimus (Rapamune), everolimus (Afinitor, Zortress) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 IMDH 억제제는 azathioprine (Azasan, Imuran), mycophenolate (CellCept, Myfortic) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 제제는 abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, ixekizumab, natalizumab, rituximab, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab, vedolizumab, basiliximab, daclizumab 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환 또는 염증성 질환인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역질환은 루푸스(SLE), 루푸스 신염(예를 들어, 약물 유발 루푸스 신염), 면역 혈소판 감소증(ITP), 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환(IBD)(예: 크론병 및 대장염/궤양성 대장염), 이식편대숙주질환(GvHD) 또는 동종이식 거부, 이식/고체장기이식(SOT), 원발성 담즙성 담관염(PBC), 건선, 건선성 관절염, 콜라겐-유발 관절염, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 난소염, 알레르기성 비염, 천식, 쇼그렌 증후군, 아토피성 습진, 중증 근무력증, 그레이브 질병 및/또는 사구체 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
루푸스
루푸스라고 하는 전신성 홍반성 루푸스(SLE)는 전신에 부종(염증)과 통증을 유발할 수 있는 만성 자가면역질환이다. 루푸스에는 여러 가지 유형이 있으며, 전신성 홍반성 루푸스가 가장 흔하다. 다른 유형의 루푸스는 다음과 같다:
피부 홍반성 루푸스: 이 유형의 루푸스는 피부에 영향을 미친다. 큐타너스는 피부를 의미하는 용어이다. 피부 홍반성 루푸스가 있는 사람은 태양에 대한 민감성 및 발진과 같은 피부 문제를 경험할 수 있다. 탈모 역시 이 질환의 증상일 수 있다.
약물 유발 루푸스: 이러한 루푸스는 특정 약물에 의해 발생한다. 약물 유발성 루푸스가 있는 사람은 전신성 홍반성 루푸스와 동일한 증상을 많이 가질 수 있지만 일반적으로 일시적이다.
신생아 루푸스: 드문 유형의 루푸스인 신생아 루푸스는 출생시 유아에서 발견되는 질환이다. 신생아 루푸스를 가지고 태어난 어린이는 어머니로부터 항체를 물려받으며, 산모는 임신 당시 루푸스를 앓았거나 나중에 이 질환을 앓을 수 있다. 루푸스가 있는 산모에게서 태어난 모든 아기가 루푸스에 걸리는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 요법은 예를 들어 스테로이드 (코르티코스테로이드, 프레드니손 포함); 하이드록시클로로퀸 (Plaquenil®); 아자티오프린 (Imuran®); 메토트렉세이트 (Rheumatrex®); 사이클로포스파미드 (Cytoxan®) 및 미코페놀레이트 모페틸 (CellCept®); 벨리무맙 (Benlysta®); 및/또는 리툭시맙 (Rituxan®)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
루푸스 신염
루푸스 신염은 루푸스의 합병증으로 발병한다. 루푸스 신염은 루푸스 자가항체가 노폐물을 걸러내는 신장의 구조에 영향을 미칠 때 발생한다. 이는 신장 염증을 일으키고 소변의 혈액, 소변의 단백질, 고혈압, 신장 기능 장애 또는 신부전으로 이어질 수 있다. 전신성 루푸스가 있는 성인의 절반 정도에서 루푸스 신염이 발생한다. 전신성 루푸스는 면역계 단백질이 신장을 손상시켜 노폐물을 걸러내는 능력을 손상시킨다.
류마티스 관절염
류마티스 관절염은 손, 손목 및 무릎과 같은 신체의 양쪽 관절에서 발생하는 만성 (진행 중인) 관절염의 한 유형이다. 류마티스 관절염 약물의 단기 목표는 관절 통증과 부종을 줄이고 관절 기능을 개선하는 것이다. 장기 목표는 질병 진행, 특히 관절 손상을 늦추거나 멈추는 것이다.
관절염은 관절의 염증을 설명하는 일반적인 용어이다. 류마티스 관절염은 일반적으로 관절 (손, 손목 및 무릎과 같은 신체의 양쪽)에서 대칭적으로 발생하는 만성 (진행 중인) 관절염 (통증 및 붓기 유발)의 일종이다. 여러 관절의 이러한 침범은 류마티스 관절염을 다른 유형의 관절염과 구별하는 데 도움이 된다.
관절에 영향을 주는 것 외에도 류마티스 관절염은 때때로 피부, 눈, 폐, 심장, 혈액, 신경 또는 신장에 영향을 줄 수 있다.
류마티스 관절염을 치료하기 위해 본 발명의 약학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 요법은 예를 들어 다음을 포함할 수 있다:
진통소염제: 이러한 제품에는 이부프로펜(MOTRIN®), 나프록센(ALEVE®), 셀레콕십(Celecoxib), 디클로페낙 나트륨(Diclofenac sodium), 케토프로펜(Ketoprofen), 멜록시캄(Meloxicam),피록시캄(Piroxicam)과 같은 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)가 포함된다. 또 다른 유형의 약물인 COX-2 억제제도 이 약물 범주에 속하며 류마티스 관절염의 징후와 증상을 완화한다. COX-2 억제제 중 하나인 세레콕시브(CELEBREX®)는 미국에서 사용 가능하다. COX-2 억제제는 위장 출혈 부작용이 적도록 설계되었다.
질병완화 항류마티스 약물(disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs): 다른 NSAIDs와 달리 DMARDs는 실질적으로 면역 체계를 수정하여 질병 진행을 늦출 수 있다. 이전의 DMARDs에는 메토트렉세이트(TREXALL®), 금제제 (gold salts), 페니실라민(CUPRIMINE®), 하이드록시클로로퀸(PLAQUENIL®), 설파살라진(AZULFIDINE®), 사이클로스포린(SANDIMMUNE®), 사이클로포스파미드(CYTOXAN®) 및 레플루노마이드(ARAVA®)가 포함된다. 현재는, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 하이드록시클로로퀸과 설파살라진이 가장 흔하게 사용된다 (사이클로스포린, 사이클로포스파미드, 금염, 페니실라민은 더 이상 일반적으로 사용되지 않는다).
생물학적 제제. 이러한 "전통적인" DMARDs 외에도, 새로운 약물이 승인되고 있다. 현재는, 7가지 종류의 약물이 있으며, 경우에 따라 각 분류에 서로 다른 종류들이 있다 (그 중 일부는, 항-TNF 계열로 2000년부터 사용되어 왔다.). 집합적으로, 이러한 DMARDs는 다른 이름인 생물학적 제제 (또는 생물학적 반응제)로 알려져 있다. 전통적인 DMARDs와 비교하여 이들 제품은 류마티스 관절염에서 염증을 일으키는 분자를 표적으로 한다. 관절의 염증 세포는 류마티스 관절염 자체의 발병에 관여한다. 생물학적 제제는 류마티스 관절염에서 볼 수 있는 관절 손상을 궁극적으로 유발하는 염증 과정을 줄인다. 염증 자체보다 구체적인 수준에서 세포를 공격함으로써 생물학적 제제는 보다 효과적이고 보다 구체적으로 표적화되는 것으로 간주된다. 생물학적 제제에는 에타너셉트(ENBREL®), 인플릭시맙(REMICADE®), 아달리무맙(HUMIRA®), 아나킨라(KINARET®), 아바타셉트(ORENCIA®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세르톨리주맙 페골(CIMZIA®), 골리무맙(SYMPON®), 토실리주맙(ACTEMRA®) 및 토파시티닙(XELJANJ®)이 포함된다. 일부 생물학적 제제는 전통적인 DMARDs, 특히 메토트렉세이트와 병용하여 사용된다.
다발성 경화증
다발성 경화증(MS)은 자가면역질환이다. 이러한 조건에서 면역 체계는 실수로 건강한 세포를 공격한다. 다발성 경화증 환자에서 면역 체계는 뇌와 척수의 신경을 둘러싸고 있는 보호막인 미엘린(myelin) 세포를 공격한다. 미엘린이 손상되면 뇌에서 신체의 다른 부분으로 보내는 신경 신호가 차단된다. 손상은 뇌, 척수 및 눈에 영향을 미치는 증상을 유발할 수 있다.
다발성 경화증에는 네 가지 유형이 있다.
임상적 단독증후군(CIS): MS 증상의 첫 번째 증상이 있을 때, 의료 서비스 제공자는 주로 CIS로 이를 분류한다. CIS가 있는 모든 사람이 다발성 경화증으로 진행되는 것은 아니다.
재발-완화형 MS(RRMS): 이는 다발성 경화증의 가장 흔한 형태이다. RRMS가 있는 사람들은 새로운 또는 악화되는 증상의 발적--재발 또는 악화라고도 하는--이 있다. 완화 기간이 계속된다 (증상이 안정되거나 사라질 때).
원발성 진행성 MS(PPMS): PPMS로 진단받은 사람들은 재발하거나 완화되지 않고 서서히 점진적으로 악화되는 증상을 가진다.
이차 진행성 MS(SPMS): 대부분의 경우에는, 원래 RRMS로 진단된 사람들이 결국 SPMS로 진행된다. 이차-진행성 다발성 경화증의 경우, 계속해서 신경 손상이 축적된다. 증상이 점차 악화된다. 일부 재발이나 발적 (증상이 증가할 때)을 경험할 수 있지만, 그 후에는 더 이상 완화 기간이 없다 (증상이 안정되거나 사라질 때).
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어:
질병-수정 요법(DMT): 여러 약물이 장기 MS 치료에 대한 FDA 승인을 받았다. 이러한 약물은 재발 (발적 또는 발작이라고도 함)을 줄이는 데 도움이 된다. 그들은 질병의 진행을 늦춰준다. 그리고 뇌와 척수에 새로운 병변이 형성되는 것을 방지할 수 있다.
재발 관리 약물치료: 심한 발작이 있는 경우, 신경과 전문의는 고용량의 코르티코스테로이드를 권장할 수 있다. 약물은 염증을 빠르게 줄일 수 있다. 신경 세포를 둘러싸고 있는 수초의 손상을 느리게 한다.
신체 재활치료: 다발성 경화증은 신체 기능에 영향을 줄 수 있다. 신체적으로 건강하고 강한 상태를 유지하면 이동성을 유지하는 데 도움이 된다.
정신 건강 상담: 만성 질환에 대처하는 것은 정서적으로 어려울 수 있다. MS는 때때로 기분과 기억에 영향을 줄 수 있다. 신경심리학자와 협력하거나 다른 정서적 지원을 받는 것은 질병 관리에 필수적인 부분이다.
염증성 장질환
염증성 장 질환(IBD)은 장의 만성 염증(통증 및 부기)을 유발하는 장애 그룹이다.
크론병과 궤양성 대장염은 IBD의 주요 유형이다. 유형은 다음과 같다:
크론병은 소화관에 통증과 부기를 유발한다. 입에서 항문까지 모든 부분에 영향을 줄 수 있다. 가장 흔하게 소장과 대장의 상부에 영향을 미친다.
궤양성 대장염은 대장(결장 및 직장)에 종기와 상처(궤양)를 유발한다.
미세대장염은 현미경으로만 감지할 수 있는 장 염증을 유발한다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어:
아미노살리실레이트(설파살라진, 메살라민 또는 발사라자이드와 같은 항염증제)가 내장에 대한 자극을 최소화하고; 항생제는 감염과 농양을 치료한다; 생물학적 제제는 염증을 유발하는 면역계의 신호를 차단한다; 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드는 면역 체계를 억제하고 발적을 관리한다; 면역조절제는 과민성 면역 체계를 진정시킨다; 지사제; 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs); 비타민 및 프로바이오틱스와 같은 보충제.
이식편대숙주질환(GvHD)
*이식편대숙주질환(GvHD)은 동종 이식 후 발생할 수 있는 질환이다. GvHD에서는 기증된 골수나 말초혈액줄기세포가 수혜자의 몸을 이물질로 보고 기증된 세포/골수가 몸을 공격한다.
GvHD에는 급성 이식편대숙주질환 (aGvHD); 및 만성 이식편대숙주질환 (cGvHD)이 포함될 수 있다.
건선
건선은 사라지지 않는 피부 질환을 의미하는 만성 피부 장애이다. 건선이 있는 사람은 흰색 또는 은빛 비늘로 덮인 두꺼운 분홍색 또는 붉은색 피부 패치가 있다. 두꺼운 비늘 모양의 패치를 플라크라고 한다. 건선은 일반적으로 성인 초기에 시작되지만 나중에 시작될 수도 있다. 붉고 비늘 모양의 패치 외에도 건선의 증상에는 가려움, 갈라짐, 건조한 피부, 비늘 모양의 두피, 피부 통증, 움푹 들어간 손톱, 금이 가거나 부서지기 쉬운 손톱, 관절 통증이 있다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어: 스테로이드 크림, 건성 피부용 보습제, 안트랄린 (피부 세포 생성을 늦추는 약물), 두피 건선을 개선하기 위한 약용 로션, 샴푸 및 목욕 용액, 비타민 D3 연고, 비타민 A 또는 레티노이드 크림, 광선 요법, PUVA (소랄렌이라는 약물과 특수한 형태의 자외선 노출을 결합한 치료), 메토트렉세이트, 레티노이드, 사이클로스포린 및/또는 면역 요법이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
쇼그렌 증후군
쇼그렌 증후군은 눈과 입의 땀샘에서 생성되는 수분의 양을 감소시키는 평생 지속되는 자가면역질환이다. 이 질환을 처음 기술한 스웨덴 안과 의사인 헨리크 쇼그렌의 이름을 따서 명명되었다. 구강 건조와 안구 건조가 주요 증상이지만, 이러한 문제를 가진 대부분의 사람들이 쇼그렌 증후군인 것은 아니다. 건조한 구강은 구강건조증이라고도 한다.
쇼그렌 증후군에는 두 가지 형태가 있다: 원발성 쇼그렌 증후군, 다른 건강 상태 때문이 아니라 자체적으로 발생하는 것, 및 이차 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 루푸스 및 건선성 관절염과 같은 다른 자가면역질환이 추가로 발생하는 것.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어, 안구 건조 치료 (예: 인공 눈물, 처방 안약, 눈물점마개, 수술, 자가혈청 점안액), 구강 건조 치료 (예: 타액 생성제), 관절 또는 장기 문제에 대한 치료 (예: 진통제, 항류마티스제, 면역억제제, 스테로이드제, 항진균제 및 질건조증 치료제).
중증 근무력증
중증 근무력증(MG)은 자가면역질환으로 신체의 면역 체계가 실수로 자신의 부분을 공격한다. MG는 신경과 근육 (신경근육접합부) 간의 신호전달에 영향을 준다.
중증 근무력증을 앓는 환자는 자발적으로 근육을 제어하는 능력을 잃는다. 그들은 다양한 중증도의 근육 약화와 피로를 경험한다. 눈, 얼굴, 목, 팔다리의 근육을 움직이지 못할 수도 있다. MG는 평생 지속되는 신경근 질환이다.
중증 근무력증은 100,000명 중 약 20명에게 영향을 미친다. 전문가들은 36,000~60,000명의 미국인이 이 신경근 질환을 앓고 있다고 추정한다. 경증 환자 중 일부는 자신이 질병에 걸렸다는 사실을 모를 수 있으므로 영향을 받는 실제 사람의 수는 더 많을 수 있다. MG는 주로 20~40세의 여성과 50~80세의 남성에게 영향을 미친다. MG의 약 10건 중 1건은 십대에서 발생한다 (청소년 MG). 이 질병은 모든 연령대의 사람들에게 영향을 미칠 수 있지만 어린이에게는 드물다.
자가면역 MG는 이 신경근 질환의 가장 흔한 형태이다. 자가면역 MG는 다음과 같다:
안구형: 눈과 눈꺼풀을 움직이는 근육이 약해진다. 눈꺼풀이 처지거나 눈을 뜨지 못할 수 있다. 어떤 사람들은 복시를 가지고 있다. 시력 약화는 종종 MG의 첫번째 징후이다. 안구형 MG가 있는 사람의 거의 절반이 첫 증상 후 2년 이내에 전신형 형태로 진화한다.
전신형: 근육 약화는 눈과 얼굴, 목, 팔, 다리 및 목과 같은 다른 신체 부위에 영향을 미친다. 말하거나 삼키기, 팔을 머리 위로 들기, 앉은 자세에서 일어서기, 먼 거리 걷기, 계단 오르기 등이 어려울 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물과 병용하여 사용될 수 있는 치료법은 다음을 포함한다, 예를 들어, 약물, 단일클론 항체, IV 면역글로불린(IVIG), 혈장 교환(혈장교환술), 및/또는 수술.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이 라이브러리에서
항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 선별
*후보 클론 식별
본 발명의 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(이하, 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체)는 두 개의 무작위 루프 서열을 갖는 스테핀 A 단백질 변이체 라이브러리에서 선별하여 식별되었으며, 각 루프는 스테핀 A의 아미노산 서열을 기반으로 일정한 스테핀 A 단백질 변이체 프레임워크 골격에 디스플레이되며, 약 9개의 아미노산 길이를 갖는다. 이러한 선별 절차는 당업계에 잘 알려져 있다(Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145-155 and Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005 참조). 이러한 절차에 따라, 스테핀 A 단백질 변이체(AFFIMER®)을 발현하는 파지의 현탁액을 필요에 따라 인간 CD40L (ACROBiosystems, CDL-H82Q8) 또는 마우스 CD40L (ACROBiosystems, CDL-M5248)과 함께 배양하였다. 어떤 경우에는 CD40L을 비오틴화하여 스트렙타비딘과 뉴트라비딘 비드에 교대로 캡처하였고, 그렇지 않은 경우 CD40L이 표면에 수동적으로 흡수되었다. 그 다음 결합되지 않은 파지 입자는 세척하고, 세척 후 결합된 파지를 용출하였다. 결합된 파지의 용출은 항원을 낮은 pH 용액에서 배양한 후 높은 pH 용액과 트립신에 노출시켜 배양함으로써 수행되었다. 그 다음, 용출된 파지 입자는 대장균(E. coli)을 감염시키는 데 사용하였으며, 감염된 박테리아는 박테리오파지의 복제에 적합한 조건에서 배양되었다. 이들 감염된 박테리아로부터 박테리오파지 입자가 방출된 후, 파지 입자가 표적 항원에 결합하도록 하고, 결합된 파지 입자를 용출하였다. 용출된 파지 입자를 박테리아에 증식시키고, 감염된 박테리아에서 방출된 파지 입자를 분리하도록 하는 사이클을 반복하여 표적 항원에 결합하는 단백질을 디스플레이하는 파지 입자에 대한 박테리오파지 개체군을 풍부하게 하였다. 이 사이클에서 표적 항원에 더 강하거나 특이적으로 결합하는 파지 입자 디스플레이 단백질을 선별하기 위해 세척 단계의 수를 늘리거나, 사용 가능한 항원의 양을 줄이거나, 차단제를 추가하는 것과 같은 특정 조건이 수정되었다.
파지 디스플레이 라이브러리 선별 및 증폭을 여러 차례 수행한 후, 파지에 의해 발현된 단백질은 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 통해 발현 및 스크리닝되었다. 구체적으로, 스테핀 A 단백질 변이체는 파지미드 벡터로부터 과발현되었고, 박테리아 세포는 용해되었으며, 용해물은 ELISA에서 기질로 사용되었다. ELISA에서, 인간 CD40L을 플레이트에 고정(immobilized)시키고, 용해물을 첨가하여, 후보 스테핀 A 단백질 변이체에 발현되는 6xMyc tag에 특이적인 검출 항체를 사용하여 각 플레이트에서 CD40L 결합 스테핀 A 단백질 변이체의 양을 측정하였다. 인간 CD40L 결합 활성이 가장 우수한 스테핀 A 단백질 변이체를 코딩하는 파지미드 벡터는 추가 개발을 위한 후보 클론의 DNA 서열을 확인하기 위하여 서열분석하였다. 이들 후보 클론 각각의 루프 2 및 루프 4 아미노산 서열은 각각 표 1과 표 2에 제시되어 있다.
실시예 2: 직접 ELISA에 의한 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체의 스크리닝
hCD40L에 대한 서로 다른 단량체 DAW01 클론의 친화력을 측정하기 위해 결합 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 플레이트를 5 μg/ml의 hCD40L 항원으로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트를 플레이트 세척기로 150μl의 세척 완충액(PBS, Tween 20 0.1%)으로 2회 세척하고 카제인 5% (Sigma)의 PBS로 실온(25±1℃)에서 90분 동안 포화 상태로 만들었다. 결합을 위해 각 DAW01 클론과 rhCD40 Fc를 각각 1μM, 3분의 1부터 300 nM, 3분의 1을 플레이트에 추가하였다. 플레이트는 앞서 설명한 것과 같은 방법으로 3회 세척하였다. 그 다음 플레이트에 항-인간 CD40 비오티닐화된 폴리클로날 항체를 첨가하고, 90분간 배양하였다. 그런 다음, 시스타틴 A 비오티닐화된 폴리클로날 항체 (BAF1407)를 희석 완충액 (PBS, 1% 카제인, 0.01% Tween 20)에 0.05μg/ml의 농도로 희석하고 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분간 배양하였다. 그 다음 폴리HRP-streptavidin을 희석 완충액에 희석하고 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음 플레이트를 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(TMB, Pierce Thermo-Scientific)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이 반응은 산성 용액을 사용하여 중지시키고, 플레이트를 450 - 630 nm에서 판독하였다. 그 결과는 도 1에 도시된 것과 같으며, EC50 값은 0.67 내지 60 nM 사이의 범위이다.
실시예 3: 유세포 분석에 의한 hCD40L-HEK293 세포에서의 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 스크리닝
세포 표면에 발현된 hCD40L에 대한 DAW01 단량체 스테핀 A 단백질 변이체의 결합 수용력을 조사하기 위해, 유세포 분석 세포 결합 분석법을 수행하였다. 간략하게, hCD40L-HEK-293 세포(Crown Biosciences, C2041)를 300rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포를 PBS에 재현탁시키고 round bottom 96 well 플레이트의 각 well 당 200,000개의 세포를 분주하였다. 세포는 PBS로 세척하였다. 스테핀 A 단백질 변이체와 대조군은 duplicate로 DPBS에 1% BSA, 0.01% Sodium Azide (NaN3), 2 mM EDTA를 포함하는 염색 완충액에 희석하고 세포에 첨가하여 4±1℃에서 약 60분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고 항-시스타틴 A (R&D, AF1407) 이차 항체를 염색 완충액에 0.2 mg/ml로 희석하고 세포에 첨가하여 4±1℃에서 약 45분 동안 염색하였다. 세포를 다시 세척하고 A488 antigoat (ThermoFisher, A21467) 검출 항체를 염색 완충액에 1:500으로 희석하고 세포에 추가하여 염색하였다 (4±1℃에서 약 30분). 마지막으로, 세포를 세척하고 염색 완충액에 희석한 L/D stain Zombie Yellow (Biolegend, 423103)를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 4±1℃에서 10분 동안 염색하였다. 세포를 다시 세척하고 각 well에 고정 완충액(R&D)을 4 ±1℃에서 10분 동안 첨가한 다음 EDTA (Lonza)가 포함된 PBS를 첨가한 후 유세포 분석기(Guava 12 HT, Millipore)에서 플레이트를 판독하였다. 죽은 세포는 제외하고, 녹색 형광 채널(488 nm/525/30)을 획득하였다. 결과는 Incyte를 사용하여 분석되었고 데이터는 GraphPad를 사용하여 점도표로 표시하였다. 1 μM에서의 결과의 한 예시를 도 2에 나타내었다. 스테핀 A 단백질 변이체는 hCD40L-HEK293 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다 (진한 회색). HEK-293 음성 세포도 비특이적 결합 (밝은 회색)을 평가하기 위해 실험에 사용되었다. HuCD40L HEK293 세포와 대조군 HEK293 세포를 BV711 mAb (클론 24-31)를 사용하여 hCD40L의 발현을 평가하였다. 그 결과는 도 3에 도시된 것과 같다. hCD40L-HEK293 세포에 대한 클론 230 (서열 번호: 249)의 결합은 0.7 내지 500 nM 범위의 서로 다른 투여량 (dose)에서 평가하였다. 클론 230의 결합은 도 4에서 보이는 바와 같이 0.7-55 nM 사이에서는 투여량-의존적이고 55 nM 이상에서는 포화도에 도달한 것으로 나타났다.
실시예 4: CD40-HEK Blue 리포터 분석법에서의 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체 스크리닝
HEK-Blue CD40 발현 세포(Invivogen)는 CD40 자극 후 NF-κB의 활성화를 통해 생체활성 CD40L을 검출할 수 있다. NF-κB 경로의 활성화는 세포 배지에서 분비 배아 알칼리성 phosphatase (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP)의 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다. 분석법은 제조업체의 설명에 따라 수행하였다.
간략하게, 세포를 시험 배지 (Blasticin와 Zeocin이 포함된 DMEM High glucose)에 담아 96-well flat bottom 조직 배양 플레이트의 각 well 당 20,000개 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 그 다음 세포에서 50μl의 시험 배지를 제거하고 hCD40L (최종 농도 0.8 nM)이 들어있는 시험군 스테핀 A 단백질 변이체 또는 대조군의 50 μl 4X 희석액을 첨가하여 세포에 처리하였다. 그런 다음 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 22시간 동안 배양하였다. 그 다음 날, 상층액을 수집하고 각 well의 30 μl씩과 HEK-Blue 검출 시약(Invivogen) 200 μl을 혼합하여 SEAP 활성을 검출하였다. 이 혼합물을 37℃에서 배양하고 모든 색상 변화를 주기적으로 모니터링하였다. Pherastar 플레이트 판독기를 사용하여 3시간 동안 흡광도(640 nm)를 측정했다. 그 데이터를 점도표로 표시하였다. 그 다음 IC50은 OD=f(log 농도)로서 비선형 4-매개변수 보간 곡선 (interpolated non-linear four-parameters curve)을 사용하여 계산하였다. 이 분석법의 양성 대조군으로는 임상 등급의 모노클로널 항-hCD40L 항체인 5C8을 사용하였다. 계산된 IC50의 범위는 11.6 내지 100 nM의 범위였다 (예: 클론 230(서열번호: 249) 및 클론 248(서열번호: 267)). 이 결과의 한 예시는 도 5에 도시된 것과 같다.
실시예 5: hCD40L에 대한 결합력 증가를 위한 이량체 또는 삼량체 구성의 스테핀 A 단백질 변이체 포맷팅(Formatting)
스테핀 A 단백질 변이체는 결합력 증가를 위해 안정적인 다량체 올리고머로 조립되도록 설계할 수 있다. 생성된 스테핀 A 단백질 변이체는 In Line Fusion (ILF) 단백질로, 도 6과 같이 다양한 링커(리지드링커(rigid linkers) 참조 예: 서열 번호:508, 510-514; 또는 플랙서블 링커(flexible linker) 참조 예: 서열 번호:509, 515-518)를 가진 이량체 또는 삼량체일 수 있다.
상이한 스테핀 A 단백질 변이체(단량체, 이량체, 삼량체)과 hCD40L의 결합을 상기 기재된 바와 같이 조사하였다. 그 결과는 도 7에 도시된 것과 같으며 ILF 단백질이 표적 리간드에 대해 단량체 형태보다 같거나 더 큰 결합 친화도를 가지는 것으로 나타났다. 유세포 분석기로 이 결합을 추가 분석하였고 (도 8), 스테핀 A 단백질 변이체 (단량체, 이량체와 삼량체 형태)가 항-CD40L 항체와 유사한 수준으로 hCD40L에 결합하는 것을 보여주었다.
다른 형식들도 상기 설명한 대로 HEK-Blue 세포-기반 분석법을 사용하여 스크리닝하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었고, 클론 230 DJ 형식(삼량체)이 5.99 nM의 EC50으로 가장 우수함을 보여주었다.
실시예 6: HSA 결합 스테핀 A 단백질 변이체를 사용한 삼량체 또는 사량체 구성의 In Line Fusion (ILF) 스테핀 A 단백질 변이체 특성분석
추가 실험에서, 스테핀 A 단백질 변이체는 안정적인 다량체 올리고머로 조립되도록 설계되었다. 생성된 스테핀 A 단백질 변이체는 In Line Fusion (ILF) 단백질로, 다양한 링커(리지드링커(rigid linkers) 참조 예: 서열 번호:508, 510-514; 또는 플랙서블 링커(flexible linker) 참조 예: 서열 번호:509, 515-518)를 가진 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 4개의 스테핀 A 단백질 변이체를 시험하였다: 클론-230 DT (리지드 링커를 가진 삼량체), 클론-230 XT75 (리지드 링커와 HSA 스테핀 A 단백질 변이체가 있는 삼량체), 클론-230 DS (리지드 링커가 있는 사량체), 및 클론-230 XT76 (리지드 링커와 HSA 스테핀 A 단백질 변이체가 있는 사량체).
다양한 형식의 결합력을 평가하기 위해, CD40L 경쟁 ELISA를 수행하였다. 간략하게, 플레이트를 1 μg/ml의 rhCD40 Fc로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트 세척기로 플레이트를 150 μl의 세척 완충액(PBS, Tween 20 0.1%)으로 2회 세척하고 카제인 5% (Sigma)의 PBS로 실온(25±1℃)에서 90분 동안 포화 상태로 만들었다. 2x EC80 (1 nM)의 인간 CD40L을 10 nM부터 시작하는 항-hCD40L 모노클로날 항체 또는 각 시험 ILF 클론과 결합시켰다. 그 다음 생성된 용액을 혼합하여 플레이트에 첨가하였다. 플레이트는 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하였다. 그 다음 비오티닐화된 항-hCD40L 폴리클로날 항체를 희석 완충액에 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온(25±1℃)에서 90분간 배양하였다. 그런 다음 플레이트를 세척하였다. 그 다음 폴리HRP-streptavidin을 희석 완충액에 희석하고 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온(25±1℃)에서 추가적으로 90분간 배양하였다. 플레이트를 앞서 설명한 바와 같이 3회 세척하고, 기질(TMB, Pierce Thermo-Scientific)을 플레이트에 10분 동안 첨가하였다. 이 반응은 산성 용액을 사용하여 중지시키고, 플레이트를 450 - 630 nm에서 판독하여 최종 억제 백분율을 계산하였다. 그 결과는 도 10과 같다.
스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 In Line Fusion (ILF) 융합단백질의 CD40L 저해활성을 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 HEK-Blue assay를 통해 평가하였다. 그 결과는 도 11에 도시된 것과 같다.
서로 다른 ILF 단백질이 두 표적(인간 CD40L 및 HSA)을 동시에 결합할 수 있음을 입증하기 위해, 브릿지 ELISA (bridging ELISA)를 수행하였다. 이 분석법에서는 hCD40L을 사용하여 이중특이적 스테핀 A 단백질 변이체를 포착하고 항-HSA 항체를 사용하여 스테핀 A 단백질 변이체를 검출하여, 즉, HSA-결합 스테핀 A 단백질 변이체를 검출하도록 한다. 간략하게, 96 well 플레이트에 0.5 mg/ml의 인간 CD40L이 들어있는 carbonate 완충액을 코팅하였다. 5% 카제인/PBS 완충액으로 포화시킨 후, 플레이트를 세척하고 스테핀 A 단백질 변이체 또는 대조군의 희석액을 HSA와 함께 최종 농도 10 μM로 90분 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 세척하고, 비오티닐화된 폴리클로날 항체와 항-HSA(HRP-conjugated) (Abcam)를 90분 동안 첨가하였다. 마지막 세척 단계 후, 실험의 개발을 위해 TMB를 추가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 그 다음 EC50은 비선형 4-매개변수 보간 표준 곡선 (interpolated non-linear four-parameters standard curve)을 사용하여 계산하였다 (도 12). 대조군 실험에서, 스테핀 A 단백질 변이체의 스테핀 A 프레임워크에 결합한 항-시스타틴 항체가 HSA의 부재(도 12A) 또는 존재(도 12B) 하에 항-HSA 항체 대신 첨가되었고, 스테핀 A 단백질 변이체가 두 조건 모두에서 hCD40L에 결합한다는 것을 입증하였다. 브릿지 ELISA 데이터는 HSA의 참여도가 테스트한 두 스테핀 A 단백질 변이체 형식 중 어느 것에도 CD40L 결합에 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
실시예 7: 반수체 유전형 GVHD 동물 모델에 대한 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체의 치료효과
반수체 유전형 GVHD 동물 모델에 대한 항-CD40L 스테핀 A 단백질 변이체의 치료효과는 Avacta Life Sciences Limited에서 수행하였다.
실시예 7-1: 실험방법
192마리의 건강한 암컷 C57BL/6 마우스 (6주령)를 Janvier (프랑스)에서 구입하여 GVHD 유도를 위한 splenocyte 적출에 사용하였다. 12마리의 건강한 암컷 B6D2F1 마우스 (6주령)을 Charles River에서 구입하여 GVHD 유도 (syngeneic control)에 사용하였다. 70마리의 건강한 암컷 B6D2F1 마우스 (6주령)을 Charles River에서 구입하여 공여자 마우스로 사용하였다.
마우스 CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체는 삼량체의 인-라인 융합 단백질(In line fusion)형태로 발현되었다(표 15).
| 스테핀 A 단백질 변이체 | 서열 | 서열번호 |
| XT54 | IPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLANFFQRRWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWKFRNTDRGADRVLTGYQVDKNKDDELTGFAAAGEQKLISEEDLGAAHHHHHH-- | 729 |
| XT55 | IPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKMIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKMIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVVFQYVFSDEDGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFRWQRGNPEDLVLTGYQVDKNKDDELTGFAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVLANFFQRRWPGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPWKFRNTDRGADRVLTGYQVDKNKDDELTGFAAAGEQKLISEEDLGAAHHHHHH-- | 730 |
C57BL/6 및 B6D2F1 마우스의 비장을 적출하여, 비장세포를 추출하여 HBSS 완충액에 제조하였다. 추출된 비장세포에 함유된 적혈구는 적혈구 용해액 (BD Pharma)을 이용하여 용해시킨 후 세척하여 제조하였다. 64마리 (G4~G11)의 B6D2F1 마우스는 C57BL/6의 비장으로 부터 분리된 비장세포를 6x107 cells/head로 i.v 주입하였다. 3마리의 B6D2F1 (G3)는 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 분리된 비장세포를 6x107 cell/head로 i.v. 주입하였다. 3마리의 B6D2F1 (G2)는 동일한 B6D2F1 마우스의 비장으로부터 분리된 비장세포를 6x107 cells/head로 i.v. 주입하였다(도 13).
본 실험의 동물들은 실험을 위하여 개별 체중을 기준으로 무작위 배정을 진행하였고, 그룹간의 균질성은 분산분석 (ANOVA)을 진행하여 통계적 유의성이 없음을 확인하였다.
시험물질의 투여경로는 i.p.로 진행하였고, i.p. 투여를 위하여 제형의 pH는 7.3~7.4로 맞췄으며, 부피는 20 mL/kg로 진행하였다. 시험동물에 투여된 투여물질종류, 투여물질의 양은 table과 같이 진행하였다. 시험물질의 투여는 GVHD 유발 후 1시간 후에 1차 투여를 진행하였으며, 투여 물질에 따른 투여 간격은 다음과 같이 진행하였다. 항체 투여군을 제외한 스테핀 A 단백질 변이체 투여군은 GVHD 유도 후 2일 간격으로 6회 투여를 진행하였고, MR-1 항체 는 GVHD 유도 후 2일 간격으로 3회 투여를 진행하였다(도 14, 표 16). 동물의 생존, 행동을 매일 관측하였으며, 임상 조치에 대한 사항을 매일 기록하였다. 체중 및 clinical score는 매일 기록하였다. GVHD의 clinical score는 다음과 같은 평가 양식을 통하여 육안으로 관찰하고, 관찰된 점수의 합을 기록하여 clinical score를 평가하였다. 각 그룹간의 통계학적 유의성은 GraphPad Prism을 이용하여 ANOVA 를 진행하였다. 각 그룹간의 통계학적 유의성은 p value <0.05 이하인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
실시예 12-2: 결과
무작위 배정 후 동물군의 전체 평균은 21.5g 이었으며, 체중 범위는 18.8g ~ 23.8g의 분포를 보였다. 통계적 분석 결과 그룹간에 유의한 차이는 보이지 않았다. 실험동물의 체중 변화는 연구기간 전반에 걸쳐 모니터링을 진행하였다. 체중 변화를 확인하기 위하여, 평균 체중 변화 (MBWC%)는 D18일을 기준으로 변화율을 비교하였다. G1 그룹의 평균 체중 변화는 9.7%로 증가하였으며, G2 그룹의 평균 체중 변화는 15.6%로 증가하였다. GVHD control 그룹인 G3 그룹은 평균 체중 변화가 24.4%로 감소하는 경향을 확인하였다. 약물 투여 그룹인 G4 ~ G11 그룹의 평균 체중 변화는 다음과 같다:
G4 그룹: 1.6% 증가, G5 그룹: 4.1% 감소, G6 그룹: 14.6% 감소, G7 그룹: 2.8% 증가, G8 그룹: 6.4% 감소, G9 그룹: 9.0% 감소, G10 그룹: 4.4% 감소, G11 그룹: 21.7% 감소로, 스테핀 A 단백질 변이체를 투여한 그룹에서 G3 그룹 대비 평균 체중 변화가 양호한 상태를 보였다.
개별 동물에 대한 clinical score의 변화는 신체, 피부, 털 및 이동성 기준을 포함한 점수표를 이용하여 기록하였다. G1 및 G2 그룹의 평균 GVHD 점수는 연구기간 전반에 걸쳐 증가하지 않는 것을 확인하였다. G3 그룹은 D15일에서 증가하기 시작하여, D18에 평균점수 8.0을 기록하였다. G4 그룹은 G1 및 G2 그룹과 유사하게 연구 기간 전반에 걸쳐 GVHD socre가 증가하지 않았고, G5 ~ G7 그룹은 GVHD 유도 후 9일 에서 14일에 증가하기 시작하여, 실험 종료일인 18일차에는 0.3 ~ 1.1 사이의 GVHD 스코어를 나타내었다. G8 ~ G10 그룹의 clinical score는 GVHD 유도 후 7일 과 10일 사이에 증가하기 시작하여, 실험종료일인 18일차에는 0.3 ~ 1.4의 GVHD 스코어를 나타내었다. (도 15).
이를 고려할 때, 스테핀 A 단백질 변이체에 의한 치료효과는 GVHD control 대비 통계적으로 유의하게 억제되어 있음을 확인할 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (40)
- CD40L에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체(Stefin A protein Variant).
- 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 CD40L에 1×10-6M 이하의 Kd 값을 나타내는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체:
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVV-(Xaa)n-GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL-(Xaa)m-EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
여기서, Xaa는 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수임.
- 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 서열번호 246 내지 365로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
- 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)n은 서열번호 6 내지 125로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
- 제3항에 있어서, 상기 (Xaa)m은 서열번호 126 내지 245로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스테핀 A 단백질 변이체.
- 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 융합단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 681, 691, 694 또는 695의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 스테핀 A 단백질 변이체의 삼중체 또는 사중체이고, 삼중체 또는 사중체는 스테핀 A 단백질 변이체가 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제10항에 있어서, 상기 링커는 리지드 링커(rigid linker) 또는 플렉시블 링커(flexible linker)인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제10항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 508 내지 534로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제12항에 있어서, 상기 링커는 (EAAAK)n을 포함하는 펩타이드 링커이고, 상기 n은 1 내지 6의 정수인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 결합 도메인, 사이토카인, 반감기 연장 도메인, 성장인자, 효소, 및 세포 투과 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 막 관통 도메인, 힌지 도메인, 코일드 코일 도메인, 바이러스 유래 도메인, 세포 내 신호전달 도메인 및 국소화 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 치료용 또는 진단용 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 치료용 모이어티는 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제17항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 진단용 모이어티는 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 치료용 또는 진단용 모이어티는 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제21항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 항체 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민, 및 혈청 결합 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 ?ス溶?.
- 제21항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 1×10-6M 이하의 Kd 값으로 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 스테핀 A 단백질 변이체 인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체를 포함하는 접합체(Conjugate).
- 제24항에 있어서, 상기 스테핀 A 단백질 변이체는 약물과 접합된 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 제8항의 융합단백질을 암호화하는 핵산.
- 제26항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제27항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제26항의 핵산을 포함하는 전달 비히클.
- 제29항에 있어서, 상기 전달 비히클은 바이러스성 전달 비히클 또는 비바이러스성 전달 비히클인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
- 제30항에 있어서, 상기 바이러스성 전달 비히클은 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관 바이러스(AAV) 벡터인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
- 제30항에 있어서, 상기 비 바이러스성 전달 비히클은 리포좀 또는 지질 나노입자인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
- 제32항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질 나노입자인 것을 특징으로 하는 전달 비히클.
- 제26항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 제34항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제26항의 핵산이 도입된 유전자 조작된 세포.
- 제36항의 유전자 조작된 세포를 배양하여 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질을 생산하는 단계; 및
생산된 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 스테핀 A 단백질 변이체 또는 융합단백질의 제조방법.
- 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체, 제8항의 융합단백질, 제24항의 접합체, 제1항의 스테핀 A 단백질 변이체 또는 제8항의 융합단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 전달 비히클로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
- 제38항에 있어서, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제39항에 있어서, 상기 면역질환은 루푸스(SLE), 루푸스 신염, 면역 혈소판 감소증(ITP), 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환(IBD, 이식편대숙주질환(GvHD) 또는 동종이식 거부, 이식/고체장기이식(SOT), 원발성 담즙성 담관염(PBC), 건선, 건선성 관절염, 콜라겐-유발 관절염, 난소염, 알레르기성 비염, 천식, 쇼그렌 증후군, 아토피성 습진, 중증 근무력증, 그레이브 질병 및 사구체 경화증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202263308629P | 2022-02-10 | 2022-02-10 | |
| US63/308,629 | 2022-02-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230121575A true KR20230121575A (ko) | 2023-08-18 |
Family
ID=87564775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230018017A Pending KR20230121575A (ko) | 2022-02-10 | 2023-02-10 | Cd40l에 특이적으로 결합하는 스테핀 a 단백질 변이체 및 이의 용도 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4477665A1 (ko) |
| JP (1) | JP2025509078A (ko) |
| KR (1) | KR20230121575A (ko) |
| CN (1) | CN119213021A (ko) |
| WO (1) | WO2023153876A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025058962A1 (en) * | 2023-09-11 | 2025-03-20 | Absci Corporation | High-throughput methods for kinetic characterization, quantifying and optimizing antibodies and antibody fragments expression in bacteria |
Family Cites Families (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4454106A (en) | 1982-06-07 | 1984-06-12 | Gansow Otto A | Use of metal chelate conjugated monoclonal antibodies |
| US4472509A (en) | 1982-06-07 | 1984-09-18 | Gansow Otto A | Metal chelate conjugated monoclonal antibodies |
| US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| WO1986005807A1 (en) | 1985-04-01 | 1986-10-09 | Celltech Limited | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
| GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
| US4831175A (en) | 1986-09-05 | 1989-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate |
| US6024983A (en) | 1986-10-24 | 2000-02-15 | Southern Research Institute | Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation |
| US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| JP3101690B2 (ja) | 1987-03-18 | 2000-10-23 | エス・ビィ・２・インコーポレイテッド | 変性抗体の、または変性抗体に関する改良 |
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
| ATE133087T1 (de) | 1989-05-04 | 1996-02-15 | Southern Res Inst | Einkapselungsverfahren |
| WO1990014363A1 (en) | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Amgen Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
| KR920007887B1 (ko) | 1989-08-29 | 1992-09-18 | 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 | 내연기관의 배기가스 정화장치 |
| US5545130A (en) | 1992-04-08 | 1996-08-13 | Genetronics, Inc. | Flow through electroporation method |
| JPH08505625A (ja) | 1993-01-11 | 1996-06-18 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート | 細胞毒性ｔリンパ球応答の誘導 |
| FR2702160B1 (fr) | 1993-03-02 | 1995-06-02 | Biovecteurs As | Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation. |
| US5702359A (en) | 1995-06-06 | 1997-12-30 | Genetronics, Inc. | Needle electrodes for mediated delivery of drugs and genes |
| FR2704145B1 (fr) | 1993-04-21 | 1995-07-21 | Pasteur Institut | Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant. |
| FR2723849B1 (fr) | 1994-08-31 | 1997-04-11 | Biovector Therapeutics Sa | Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique |
| US6080728A (en) | 1996-07-16 | 2000-06-27 | Mixson; A. James | Carrier: DNA complexes containing DNA encoding anti-angiogenic peptides and their use in gene therapy |
| DK0918874T3 (da) | 1996-08-16 | 2001-05-14 | Medical Res Council | Selvreplikerende episomale ekspressionsvektorer, som giver vævsspecifik genekspression |
| ATE209902T1 (de) | 1996-08-19 | 2001-12-15 | Us Gov Health & Human Serv | Neue liposomkomplexe mit erhöhter systemischer verabreichung |
| US5869326A (en) | 1996-09-09 | 1999-02-09 | Genetronics, Inc. | Electroporation employing user-configured pulsing scheme |
| US6216034B1 (en) | 1997-08-01 | 2001-04-10 | Genetronics, Inc. | Method of programming an array of needle electrodes for electroporation therapy of tissue |
| US6055453A (en) | 1997-08-01 | 2000-04-25 | Genetronics, Inc. | Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy |
| US6241701B1 (en) | 1997-08-01 | 2001-06-05 | Genetronics, Inc. | Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes |
| GB2330907A (en) | 1997-10-28 | 1999-05-05 | Applied Imaging Int Ltd | A karyotyper and methods for producing karyotypes |
| US6208893B1 (en) | 1998-01-27 | 2001-03-27 | Genetronics, Inc. | Electroporation apparatus with connective electrode template |
| US6120493A (en) | 1998-01-27 | 2000-09-19 | Genetronics, Inc. | Method for the introduction of therapeutic agents utilizing an electroporation apparatus |
| CA2320488C (en) | 1998-02-12 | 2007-03-06 | Immune Complex, Corporation | Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives |
| AU761522B2 (en) | 1998-07-13 | 2003-06-05 | Genetronics, Inc. | Method and apparatus for electrically assisted topical delivery of agents for cosmetic applications |
| US6192270B1 (en) | 1998-08-14 | 2001-02-20 | Genetronics, Inc. | Apparatus and method for the delivery of drugs and genes into tissue |
| US6150148A (en) | 1998-10-21 | 2000-11-21 | Genetronics, Inc. | Electroporation apparatus for control of temperature during the process |
| WO2000061739A1 (en) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
| US7245963B2 (en) | 2002-03-07 | 2007-07-17 | Advisys, Inc. | Electrode assembly for constant-current electroporation and use |
| EP2336179A1 (en) | 2002-11-08 | 2011-06-22 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies |
| AU2005216251B2 (en) | 2004-02-23 | 2011-03-10 | Genentech, Inc. | Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates |
| ES2741524T3 (es) | 2004-03-23 | 2020-02-11 | Ascendis Pharma Gmbh | Profármaco polimérico con un enlazador autoinmolador |
| US7790446B2 (en) | 2005-02-11 | 2010-09-07 | Kosagen Cell Factory Oü | Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products |
| HUE045710T2 (hu) | 2005-05-18 | 2020-01-28 | Ablynx Nv | Javított, alfa tumor nekrózis faktor elleni nanobodies |
| CA2666599A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| EP1995327A1 (en) | 2007-05-21 | 2008-11-26 | Humboldt Universität zu Berlin | Probe for detecting a particular nucleic acid sequence |
| EP2152747B1 (en) | 2007-05-24 | 2018-01-03 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders |
| DE102007052517A1 (de) | 2007-10-29 | 2009-04-30 | Autoimmun Diagnostika Gmbh | ELISPOT-Verfahren mit zwei Filtersystemen |
| CN101970490A (zh) | 2007-11-27 | 2011-02-09 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽 |
| GB0807065D0 (en) | 2008-04-18 | 2008-05-21 | Univ Leeds | Novel scaffolds |
| TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
| US8828678B2 (en) | 2010-11-16 | 2014-09-09 | Enzo Life Sciences, Inc. | Self-immolative probes for enzyme activity detection |
| CN108949772A (zh) | 2012-04-02 | 2018-12-07 | 现代泰克斯公司 | 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸 |
| EP2911736A4 (en) | 2012-10-25 | 2016-06-15 | Oncosec Medical Inc | electroporation |
| CN105102455B (zh) | 2012-12-21 | 2018-05-25 | 荷商台医(有限合伙)公司 | 亲水性自消耗连接子及其缀合物 |
| WO2015034925A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Circular polynucleotides |
| WO2015034928A1 (en) | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| WO2015038426A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Asana Biosciences, Llc | Self-immolative linkers containing mandelic acid derivatives, drug-ligand conjugates for targeted therapies and uses thereof |
| EP2918275B1 (en) | 2013-12-13 | 2016-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| EP3092250A4 (en) | 2014-01-08 | 2017-05-24 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for the in vivo production of antibodies |
| EA202090216A3 (ru) | 2014-03-20 | 2020-07-31 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Связывающие сывороточный альбумин домены фибронектина iii типа |
| US20170136132A1 (en) | 2014-06-19 | 2017-05-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| EP3157573A4 (en) | 2014-06-19 | 2018-02-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| EP3157572A4 (en) | 2014-06-19 | 2018-02-14 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| US20170204152A1 (en) | 2014-07-16 | 2017-07-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
| ES2809734T3 (es) | 2015-01-09 | 2021-03-05 | Oncosec Medical Inc | Terapia génica y electroporación para el tratamiento de neoplasias malignas |
| WO2016118724A1 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
| WO2016118725A1 (en) | 2015-01-23 | 2016-07-28 | Moderna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
| EP3286311B1 (en) | 2015-03-26 | 2021-05-05 | OncoSec Medical Incorporated | Method for the treatment of malignancies |
| WO2016161201A2 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Oncosec Medical Incorporated | Systems and methods for improved tissue-sensing based electroporation |
| WO2017036889A1 (en) | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Method for reducing immunogenicity of rna |
| DK3350333T3 (da) | 2015-09-17 | 2022-01-31 | Modernatx Inc | Polynukleotider, der indeholder en stabiliserende haleregion |
| EP3353199B1 (en) | 2015-09-23 | 2020-02-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains |
| EP3390643B8 (en) | 2015-12-18 | 2023-08-02 | OncoSec Medical Incorporated | Plasmid constructs for heterologous protein expression and methods of use |
| WO2017162266A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna replicon for versatile and efficient gene expression |
| GB201805963D0 (en) * | 2018-04-11 | 2018-05-23 | Avacta Life Sciences Ltd | PD-L1 Binding Affirmers and Uses Related Thereto |
| JP2021527042A (ja) | 2018-06-04 | 2021-10-11 | トラスティーズ オブ タフツ カレッジ | 腫瘍微小環境活性化薬物・結合剤コンジュゲート、及びそれに関連する使用 |
| KR20210006301A (ko) * | 2019-07-08 | 2021-01-18 | 주식회사 프로젠 | 신규 융합단백질 및 그의 용도 |
-
2023
- 2023-02-10 JP JP2024547836A patent/JP2025509078A/ja active Pending
- 2023-02-10 KR KR1020230018017A patent/KR20230121575A/ko active Pending
- 2023-02-10 WO PCT/KR2023/002022 patent/WO2023153876A1/ko active Application Filing
- 2023-02-10 EP EP23753222.1A patent/EP4477665A1/en active Pending
- 2023-02-10 CN CN202380025990.1A patent/CN119213021A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN119213021A (zh) | 2024-12-27 |
| WO2023153876A1 (ko) | 2023-08-17 |
| EP4477665A1 (en) | 2024-12-18 |
| JP2025509078A (ja) | 2025-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12173060B2 (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
| CN106573966B (zh) | 用于治疗代谢异常的组合物和方法 | |
| JP2020532949A (ja) | 足場タンパク質 | |
| CN105263958A (zh) | p97片段及其应用 | |
| JP2012511029A (ja) | アルブミン結合ペプチド介在性の疾患標的化 | |
| EP4477665A1 (en) | Stefin a protein variants specifically binding to cd40l, and uses thereof | |
| CN113454108A (zh) | 包含去免疫化志贺菌毒素a亚基效应子的cd38结合蛋白 | |
| TW202440627A (zh) | Ｔｎｆｒ２結合多肽及使用方法 | |
| AU2023418194A1 (en) | Genetically modified cells comprising a nucleic acid encoding a cd40l binding agent and uses thereof | |
| FR3147278A1 (fr) | Polypeptides de liaison au tnfr2 et procedes d'utilisation | |
| KR20250047619A (ko) | Tnfr2 결합 에이전트를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 변형된 세포 및 이의 용도 | |
| TW202513793A (zh) | 已經引入至有編碼特異性結合ｔｎｆｒ２的ｓｔｅｆｉｎ ａ蛋白變體或包括該蛋白變體的融合蛋白的核酸中的經遺傳修飾的細胞，及其用途 | |
| HK40035218A (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
| HK1242595A1 (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders | |
| HK1242595B (en) | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20230210 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20250509 Patent event code: PE09021S01D |