KR20230108960A

KR20230108960A - 내이 오가노이드 제조 방법

Info

Publication number: KR20230108960A
Application number: KR1020220004739A
Authority: KR
Inventors: 김장호; 정연훈; 박선호; 김연주
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2023-07-19
Also published as: WO2023136504A1; US20250002846A1

Abstract

본 발명은 마이크로 웰 플레이트를 이용하여 내이 오가노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 내이 오가노이드 제조를 위한 세포 응집체를 용이하게 형성할 수 있고, 본 발명의 구체적인 초기 세포 수 조절 방법, 성장 인자 처리 방법을 이용하여 균일하고 성숙한 내이 오가노이드를 제조할 수 있다.

Description

내이 오가노이드 제조 방법{PREPARING METHODS FOR INNER EAR ORGANOIDS}

본 발명은 내이 오가노이드 제조 방법에 관한 것으로, 내이와 관련된 신약개발, 질병치료 및 인공장기 개발 분야에서 활용될 수 있다.

내이는 유모세포, 지지세포 및 신경 세포들로 상호 연결된 상피층의 감각 기관으로 민감한 부동섬모의 움직임을 통해 소리를 감지할 수 있다. 유전적 돌연변이, 감염, 소음, 노화 및 외부 충격이 청력 저하나 균형감각 장애의 발생 원인이 되는데, 특히 나이가 들면서 발생할 수 있는 청각 기능 장애는 전세계적으로 약 10억 명으로 추정되나 그 원인이 복잡하고 연구 플랫폼의 한계로 치료제 개발에 어려움이 있다.

현재 난청 연구를 위한 여러 연구 모델 플랫폼 (예: 생체 외 조직 모델, 세포 모델 및 생체 내 모델) 들이 사용되고 있으나 내이 구조의 특성 및 감각 수용체의 기능을 재현하기 어려워 이를 대체할 효율적인 연구 모델 플랫폼이 필요한 실정이다.

생체 내 장기의 다세포 구성, 구조와 기능을 모방한 3차원 (3D) 오가노이드는 줄기세포를 이용한 발달생물학, 질환 기전 연구에서 소개되고 있으며, 이는 기존 연구 모델 플랫폼의 한계를 극복할 수 있을 것으로 여겨진다.

오가노이드의 경우 실제 장기와 같이 다양한 세포 구조를 구축하기 위해 분화능을 보유한 줄기세포의 3D 배양이 필요하며, 성장 인자가 오가노이드 제조과정에서 단계에 맞게 순차적으로 추가되어 신호전달 경로를 제어하여 특정 세포로 분화한다. 오가노이드는 실제 장기처럼 비선형적 상태에서 세포가 결정되는 플랫폼이기 때문에 오가노이드 분화 전 초기 상태 (예: 줄기세포 응집체)는 최종 오가노이드의 장기 고유의 구조 및 기능에 매우 중요하다.

이에 본 발명에서는 마이크로 웰 플레이트를 이용한 새로운 내이 오가노이드 제조 방법을 개발하였으며, 구체적인 초기 세포 수 설정, 성장 인자 조절을 통한 내이 오가노이드 제조 효과를 규명하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제2292457호

본 발명은 내이 오가노이드 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 내부면에 하방 경사진 굴곡면을 갖는 마이크로 웰 플레이트 상에 줄기세포와 배양액을 처리하여, 각 마이크로 웰에 줄기세포를 시딩하는 단계; 및 상기 각 마이크로 웰에 시딩된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 내이 오가노이드 제조 방법.

2. 위 1에 있어서, 상기 마이크로 웰의 너비는 100 내지 1000 μm인, 내이 오가노이드 제조 방법.

3. 위 1에 있어서, 상기 마이크로 웰은 내주면이 하방 경사진 제1 굴곡면 및 상기 제1 굴곡면과 이어지는 하방 경사진 제2 굴곡면을 갖는 것인 내이 오가노이드 제조 방법.

4. 위 1에 있어서, 상기 마이크로 웰은 너비가 450 내지 550 μm이고, 각 마이크로 웰에 1.5 x10³ 내지 4.5 x10³개의 줄기세포를 시딩하는, 내이 오가노이드 제조 방법.

5. 위 1에 있어서, 상기 줄기세포의 배양 1일째에 Matrigel을 처리하는 단계; 및 배양 3일째에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 SB-431542를 처리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.

6. 위 1에 있어서, 상기 줄기세포를 비신경 외배엽으로 분화시키는 단계; 및 상기 비신경 외배엽을 마이크로 웰에서 분리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.

7. 위 6에 있어서, 분리된 비신경 외배엽에 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2) 및 LDN193189를 처리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.

본 발명의 방법을 통해 내이 오가노이드 제조에 적절한 줄기세포 응집체를 균일하고 용이하게 형성할 수 있다.

본 발명의 방법을 통해 성숙도가 높고 균일성이 향상된 내이 오가노이드를 제조할 수 있다.

도 1의 (a)는 제조된 마이크로홀에서 Embryonic Stem Cells (ESCs) 응집체 형성의 개략도를 나타낸 것이다. (b)는 유지된 ESCs의 대표 이미지이다. (c)는 마이크로홀 칩의 대표적인 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다. (d)는 ESC가 마이크로홀 칩에서의 시간에 따라 형성되는 것을 나타낸 이미지이다. (e)는 서로 다른 초기 세포 수에 따른 ESCs 응집체의 대표적인 면역형광 이미지이다. F-액틴(빨간색), 라미닌 리셉터(녹색), DAPI(파란색)으로 표시되었다. (f)는 6시간, 12시간, 1일 및 3일 동안 초기 세포 수를 다르게 하여 응집체 면적을 정량화한 것이다. (g)는 3일에 초기 세포 수가 다른 최종 응집체 면적의 정량화한 것이다. (h)는 초기 세포 수에 따른 시간의존적 응집체 지수를 정량화한 것이다. (i)는 3일 째의 초기 세포 수에 따른 ESC 응집체의 대표적인 면역형광 이미지이다. 응집체는 서로 다른 세포 구조와 압축을 보였다. (j)는 인테그린 베타4 발현을 사용하여 측정된 정규화된 형광 강도를 나타낸 것이다. (k)는 응집체에서 ESCs 밀도 및 면적을 정량화하여 나타낸 것이다. (l)은 서로 다른 세포 압축을 갖는 서로 다른 응집체 크기가 내이 오가노이드 형성에 미치는 영향을 도식화한 것이다.
도 2는 서로 다른 초기 세포 수로 진행된 마우스 ESC의 마이크로홀 칩 기반 외배엽 형성을 나타낸 것이다. (a)는 ESC로부터의 외배엽 형성의 개략도를 나타낸 것이다. (b)는 ESC의 외배엽 형성 전(1일)/후(3일) 대표적인 현미경 이미지이다. (c)는 ESC의 외배엽 형성 전후의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지이다. (d)는 1일째에 mESC 응집체 표면의 세포 밀도 및 면적의 정량화한 것이다. (e)는 ESC 응집체의 외배엽 형성 전/후 표면의 거칠기를 정량화한 것이다. (f)는 ESC의 외배엽 형성 전/후의 대표적인 면역형광 이미지이다. 다능성 인자(적색), 라미닌(세포외 기질 당단백질, 녹색), DAPI(파란색)으로 나타내었다. (g)는 ESC 응집체 형성 전후의 라미닌 베타1, 코넥신 43, 사이클린D1 및 베타-액틴의 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (h)는 ESC 응집체에서 외배엽 형성 및 줄기 세포 다분화능에 대한 초기 세포 수 의존 효과를 요약한 것이다.
도 3은 서로 다른 초기 세포 수로 진행된 마우스 ESC의 마이크로홀 칩 기반 내이 오가노이드(IEO) 형성을 나타낸 것이다. (a) ESC에서 IEO로의 마이크로홀 칩 기반 개발 개략도를 나타낸 것이다. (b)는 다양한 시간(1일, 3일, 5일, 8일, 10일, 13일 및 15일)에 마이크로홀에서 성장한 IEO를 표시하는 대표적인 현미경 이미지이다. (c)는 IEO 개발에 대한 초기 세포 수 의존 효과를 요약한 것이다. (d)는 14일 째의 서로 다른 초기 세포 수별 IEO의 대표적인 이미지이다. (e)는 ESC의 외배엽 형성 전/후의 대표적인 면역형광 이미지이다. 내이 감각전구세포(빨간색), 지지 세포(녹색), DAPI(파란색)로 나타내었다. (f)는 L(large) 세포 수로 각 U 웰 플레이트와 마이크로홀 칩에서 형성된 IEO의 대표적인 고배율 면역형광 이미지를 병합한 것이며, 유모 세포 소포 형성을 보여준다. (g)는 14일째의 응집체 수, 30일째의 오가노이드 면적, 버드/소포 수를 정량화한 것이다.
도 4는 균일성과 성숙도를 가진 내이 오가노이드(IEO)의 발달에 대한 마이크로홀 칩의 영향을 나타낸 것이다. (a)는 IEO의 균일성을 보여주는 U 웰 플레이트 및 마이크로홀 칩 상의 IEO의 대표적인 이미지이다. (b)는 1일 및 30일에 마이크로홀 칩 및 U 웰 플레이트에서 성장한 IEO를 나타내는 대표적인 현미경 이미지이다. (c)는 IEO의 둘레 및 면적을 정량화한 것이다. (d)는 30일에 U 웰 플레이트 및 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO의 외부 표면 및 찢어진 표면의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지이다. (e)는 내이 유모세포(빨간색), 지지 세포(녹색), DAPI(파란색)를 보여주는 마이크로홀 칩 및 U 웰 플레이트에서 성장한 IEO의 대표적인 면역형광 이미지이다. (f)는 30일째의 마이크로홀 칩 및 U 웰 플레이트에서 성장한 IEO 소포의 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지이다. 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO에서 성숙한 키노실리아 (kinocilia)가 나타난다. (g)는 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO의 운동성 섬모 단면의 대표적인 TEM 이미지이다. (h)는 IEO에서 미세 융모 및 섬모 길이를 정량화한 것이다. (i)는 IEO의 성숙에 대한 마이크로칩의 영향을 요약한 것이다.
도 5는 내이 오가노이드(IEO)에서 유모 세포 유사 세포의 전기 생리학적 기능에 대한 마이크로홀 칩의 효과를 나타낸 것이다. (a)는 IEO에서 유모 세포 유사 세포의 막 전류 분석에 대한 개략도이다. (b)는 IEO에서 유모 세포, ESC 및 유모 세포 유사 세포의 대표적인 현미경 이미지이다. (c-f)는 쥐 코르티기관 유래 유모 세포, ESC, U 웰 플레이트 및 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO 내 세포의 활성화 범위 및 칼륨 전류의 패치 클램프 기록이다. 신속한 내부 Na+ 전류 확인을 보여준다. (g) 시스플라틴 기반 IEO 손상의 개략도이다. (h-j)는 U 웰 플레이트 및 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO 내의 유모세포와 비슷한 유모 세포의 활성화 범위 및 칼륨 전류의 패치 클램프 기록이다. (k)는 시스플라틴 처리 전/후 U 웰 플레이트와 마이크로홀 칩에서 성장한 IEO의 Myo7a, 산화 스트레스 관련 유전자 및 염증 관련 유전자의 PCR 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 내주면이 하방 경사진 굴곡면을 갖는 마이크로 웰 플레이트 상에 줄기세포와 배양액을 처리하여, 각 마이크로 웰에 줄기세포를 시딩하는 단계; 및 상기 각 마이크로 웰에 시딩된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 내이 오가노이드 제조 방법에 관한 것이다.

상기 내이 오가노이드는 줄기세포를 3차원적으로 배양하거나 재조합해 만든 내이(inner ear) 유사체를 의미하며, 신약개발 및 질병치료와 인공장기 개발 등의 목적으로 이용된다.

상기 줄기세포는 인간을 포함한 동물에서 얻을 수 있는 줄기세포로 특별한 제한 없이 사용자에 의해 적절히 선택되어 사용될 수 있으며, 예를 들면 배아줄기세포(ESC), 유도 만능 줄기세포(iPSC), 성체줄기세포(ASC)를 포함한다.

상기 마이크로 웰(micro well)은 상기 줄기세포를 배양할 수 있도록 플레이트(plate), 즉 판 상에 마이크로 단위의 홈이 파여진 것을 의미한다. 본 명세서에서 마이크로 웰과 마이크로 홀(micro hole)은 상호교환적으로 사용 가능하다.

상기 마이크로 웰의 너비는 예를 들면 100 내지 1000 μm로, 일반적으로 세포 배양에 6 내지 35mm 너비의 웰이 사용되는 것과 비교하여 현저히 작은 크기이다.

상기 플레이트 상에는 마이크로 웰이 하나 또는 복수 개로 존재할 수 있고, 예를 들면 복수 개의 웰이 소정 간격을 두고 이격되어 배열된 형태일 수 있다.

상기 마이크로 웰은 내주면이 하방 경사진 굴곡면을 포함하여 예를 들면 웰의 내부가 반구 형태이거나 종단면이 U자 형태일 수 있다.

또한, 상기 마이크로 웰은 상기 제1 굴곡면과 이어지는 하방 경사진 제2 굴곡면을 가질 수 있으며, 예를 들면 상기 제2 굴곡면이 상기 제1 굴곡면을 갖는 마이크로 웰의 입구를 둘러싼 형태일 수 있다.

도 1a에는 마이크로 웰 플레이트의 일 예시가 도시되어 있다. 도 1a에 예시된 것은 내주면이 하방 경사진 제1 굴곡면 및 상기 제1 굴곡면과 이어지는 하방 경사진 제2 굴곡면을 갖는 마이크로 웰이다.

상기 시딩(seeding)은 상기 마이크로 웰에 줄기세포를 분주하는 것을 의미한다. 예를 들면 상기 줄기세포를 세포액 형태로 피펫 등의 도구를 이용하여 상기 플레이트에 떨어트림으로써 도 1a에 예시된 바와 같이 줄기세포 또는 그 응집체가 내주면의 하방 경사진 굴곡면을 따라 들어가도록 할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 시딩하는 단계가 하방 경사진 굴곡면을 갖는 마이크로 웰 플레이트 상에서 이루어짐으로써, 외력 없이도 내이 오가노이드 제조에 적절한 줄기세포의 응집체를 형성할 수 있고, 상기 줄기세포 응집체로부터 생성된 내이 오가노이드는 성숙하고 균일성이 높게 제조될 수 있다.

또한, 상기 제1 굴곡면과 이어지는 하방 경사진 제2 굴곡면을 포함하는 경우 시딩 단계에서 제2 굴곡면에 의해 세포들이 응집체를 형성하는 제1 굴곡면을 포함하는 웰의 하부로 더 용이하게 모일 수 있다.

상기 시딩 단계에서 마이크로 웰 각각에 시딩되는 세포 수는 마이크로 웰의 크기, 세포 종류, 배양 조건 등에 따라 사용자에 의해 적절하게 조절될 수 있다.

예를 들면, 상기 마이크로 웰은 너비가 450 내지 550 μm일 때, 초기에 각 마이크로 웰에 1.5 x10³ 내지 4.5 x10³개의 줄기세포를 시딩할 수 있다. 또는, 웰의 너비가 450 내지 550 μm일 때 2.5 x10³ 내지 4.5 x10³ , 3.5 x10³ 내지 4.5 x10³ 개 일 수 있다. 예를 들면 웰의 너비가 450 내지 550 μm일 때 1 x10³ , 2 x10³ , 3x10³ 또는 4 x10³개, 구체적으로 마이크로 웰의 너비가 500μm일 때 4 x 10³개의 줄기세포를 시딩하는 것일 수 있다.

상기 마이크로 웰의 크기 및 세포 수를 조절함으로써 형성되는 응집체의 성질이 달라질 수 있고, 예를 들면 같은 크기의 마이크로 웰 상에서 시딩된 세포 수가 증가함에 따라 형성된 줄기세포 응집체의 크기가 더 크며, 인테그린을 더 잘 형성하고, 응집체의 밀도가 높아질 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 상대적으로 크고, 인테그린을 더 많이 형성하고, 밀도가 높았던 응집체가 이후 내이 오가노이드로의 분화 단계 진행의 성공률이 높고, 마이크로 웰 상에서 배양되지 않은 대조군과 비교하여 성숙하고 균일한 내이 오가노이드로 분화한다.

상기 배양은 상기 세포를 인공적인 환경조건에서 배양하는 것을 의미한다.

상기 내이 오가노이드를 제조하기 위한 배양은, 줄기세포를 시딩한 후 줄기세포 응집체를 형성하고, 이를 진정 외배엽(definitive ectoderm, DE)-비신경 외배엽(non-neural ectoderm, NNE)-전 기원판 외배엽(pre-placodal ectoderm, PPE) 순서로 유도하는 것을 포함한다.

구체적으로, 상기 전 기원판 외배엽(Preplacodal ectoderm, PPE)은 범용적인 전 기원판으로, 수정체, 후각, 귀, 선하수체 등을 포함한 모든 감각 기원판의 전구체를 포함한다. 상기 전 기원판 외배엽을 이기원판(otic placode)으로 유도할 수 있으며, 이기원판에서 내이 전체가 발달한다.

이후, 상기 이기원판은 이와(otic pit)을 형성하기 위해 함입되고, 이후 이와가 떨어져 나오면서 이소포(otic vesicle)를 형성한다. 이소포는 성숙되고 보다 복잡한 구조인 감각 상피(sensory epithelia)로 발달하게 된다.

상기와 같은 줄기세포의 배양을 통한 내이 오가노이드의 형성 과정은 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자라면 알려진 적절한 성장 인자를 처리함으로써 수행될 수 있는 것이다.

상기 내이 오가이노이드 형성을 위한 성장 인자는 다음 순서에 따라 배지에 첨가하는 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들면 i) 외배엽 분화 배지에서 줄기세포에 Matrigel을 처리하여 진정 외배엽을 유도하는 단계, ii) BMP(Bone morphogenetic protein) 및 TGF-β inhibitor를 처리하여 비신경 외배엽을 유도하는 단계, iii) 상기 비신경 외배엽을 전 기원판 외배엽으로 유도하기 위해 BMP inhibitor 및 FGF(Fibroblast Growth Factor)를 처리하는 단계, iv) 상기 전 기원판 외배엽이 이기원판으로 분화 후 성숙 배지에서 이소포 및 감각상피를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계의 구체적인 배지 조건이나 각 단계의 기간, 처리되는 성장인자의 농도, 양, 종결 단계의 조절은 기존에 본 발명이 속한 분야의 사용자가 적절히 선택하여 수행할 수 있는 것이다. 예를 들면, 기존 알려진 프로토콜(Longworth-Mills, E., Koehler, K.R. & Hashino, E. Generating Inner Ear Organoids from Mouse Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol 1341, 391-406 (2016). 참조)에 따라 수행될 수 있다.

예를 들면, 외배엽 분화 배지에서 줄기세포를 시딩 후 배양 0 내지 3일 사이에 상기 i) 단계인 Matrigel을 처리하고, 시딩 후 배양 2 내지 5일 사이에 상기 ii) 단계인 BMP 및 TGF-β inhibitor를 처리할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 시딩 후 배양 1일째에 Matrigel을 처리하는 단계; 및 배양 3일째에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 SB-431542를 처리하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 Matrigel의 처리는 응집체 표면의 상피 형성에 기여하는 인자로, Matrigel 처리 직후에 배아에서의 최종 외배엽을 연상시키는 상피가 형성된다. 시간이 지나도 상피가 형성되지 않거나 두꺼워지지 않으면 Matrigel이 외배엽 분화 배지에 제대로 용해되지 않았을 수 있다. Matrigel은 차가운 배지에 첨가하고 완전히 혼합되기 위해 즉시 혼합하는 것이 필수적이다.

상기 BMP의 처리는 최종 외배엽이 신경 외배엽으로 분화되는 것을 억제하며, 상기 BMP는 예를 들면 BMP-4일 수 있다.

상기 SB-431542는 TGF-β inhibitor의 한 종류이며, TGF-β inhibitor는 줄기세포가 중배엽이나 내배엽으로 분화되는 것을 억제하여 외배엽 형성을 촉진하는 역할을 한다.

또한, 본 발명은 상기 ii) 단계 이후 상기 비신경 외배엽을 마이크로 웰에서 분리하여 다른 웰에서 분화를 진행하는 것일 수 있다.

즉, 본 발명은 상기 줄기세포를 비신경 외배엽으로 분화시키는 단계; 및 상기 비신경 외배엽을 마이크로 웰에서 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기와 같이 마이크로 웰에서 초기 배양 후 너비가 큰 웰로 이동하여 분화 및 성숙할 경우 세포의 크기 성장을 원활하게 한다. 내이 오가노이드는 최대 2 mm까지 성장할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 최종 응집체의 크기는 최초 줄기세포의 응집체의 약 10배 이상일 수 있다.

상기 마이크로 웰에서 형성된 응집체는 이후 이를 분리하여 일반적인 웰, 예를 들면 6 내지 35 mm 너비의 웰에서 분화, 성숙하더라도 형성된 최초 응집체의 특성, 예를 들면 크기, 압축률, 구성성분, 성분비 등이 동일하여 본 발명의 효과를 유지한다.

상기 ii) 단계의 비신경 외배엽은 세포 응집체의 크기가 최초 응집체의 크기와 비교하여 현저히 크지 않고, 표면이 분리에 용이하게끔 단단하여 다른 웰로 분리하기에 적합하다.

BMP 신호 기작은 상기 비신경 외배엽 유도에는 필수적인 것이나, 이후 분화 단계인 전 기원판 외배엽을 유도하기 위해서는 약화되어야 하므로, 이후 상기 iii) 단계에서는, BMP 억제제가 처리될 수 있다.

상기 BMP inhibitor로 예를 들면 LDN이 사용될 수 있고, 구체적으로 LDN-193189일 수 있다.

상기 BMP inhibitor는 FGF와 함께 처리될 수 있고, 상기 FGF는 예를 들면 FGF-2일 수 있다.

예를 들면, 본 발명은 상기 분리된 비신경 외배엽에 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2) 및 LDN193189를 처리하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 iv) 단계에서, 상기 전 기원판 외배엽을 이기원판으로 유도하기 위해 FGF 및 Wnt를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

FGF 및 Wnt의 동시 처리는 이기원판을 유도함과 아울러 이후 이소포 및 내이 감각 세포들의 발달을 유도한다.

또한, 상기 전 기원판 외배엽이 이기원판으로 분화된 후에는 성숙 배지로 이동하여 배양할 수 있다.

상기 성숙 배지는 예를 들면 Matrigel과 CHIR을 포함할 수 있고, 구체적으로 CHIR-99021을 사용할 수 있다.

본원 도 3a에서는 마이크로 웰 상에서 줄기세포를 비신경 외배엽까지 분화하고, 이후 96 well, 6 well로 이동하여 분화하는 총 30일이 소요된 전체적인 배양 단계의 일 예를 도식화하여 나타내었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시 예를 제시하나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술 사상 범위 내에서 실시 예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 사용자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. ESC 배양

마우스 배아 줄기 세포(ESCs R1: American Type Culture Collection(ATCC), SCRC-1036)를 0.1% 젤라틴 코팅 접시에서 계대 배양하고 확장하는 동안 LIF-2i ESCs 유지 배지를 사용하여 유지했다. 유지 배지, 분화 배지 및 성숙 배지를 포함한 모든 배지는 이전 프로토콜에 따라 준비되었다(Longworth-Mills, E., Koehler, K.R. & Hashino, E. Generating Inner Ear Organoids from Mouse Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol 1341, 391-406 (2016). 참조). 80% confluency에서 ESC는 1:10 분할로 다시 계대 배양되었다. 트립신 처리 후 피펫을 사용하여 배지에 기포 없이 세포 덩어리를 단일 세포로 분리했다.

2. 마이크로홀 칩에서 ESC 응집체 형성

ESC를 분화 배지를 사용하여 단일 세포로 해리하고, 2회 세척하여 LiF-2i ESC 유지 배지를 제거하였다. ESC는 마이크로홀 칩(2x10³ (Small, S-Org) 3x10³ (M-Org), 4x10³ (Large, L-Org)/마이크로홀)에서 각각 200 μL의 분화 배지로 계수되고 다시 점착되었다(50 마이크로홀 /12). 마이크로홀 상부에 남아있는 세포를 제거하기 위해 분화배지를 이용하여 칩을 조심스럽게 2회 세척하였다. 2 mL의 분화 배지를 각 웰에 하루 동안 처리하였다. 다음 날, Matrigel 2 mL(Matrigel 440μL 대 10.56 mL 외배엽 분화 배지)이 포함된 분화 배지를 첨가하여 2일 동안 외배엽을 형성했다. 1 mL의 BMP/SB를 포함하는 분화 배지는 2일 동안 웰에서 1 mL의 배지를 제거한 후 처리하였다. 125 μL 배지가 있는 마이크로홀의 응집체를 96 웰 플레이트로 옮기고 25 μL FGF/LDN이 포함된 분화 배지를 각 웰에 3일 동안 첨가하였다. 96웰 플레이트 상의 15개의 응집체를 성숙 배지를 이용한 세척을 통해 분화 배지를 제거한 후 표면이 미처리된 6웰 플레이트로 옮기고, Matrigel 및 CHIR 5 mL가 포함된 성숙 배지를 2일 동안 첨가하였다. 30일까지는 격일로 숙성 배지를 교체하였다.

3. 면역형광 염색

ESC의 응집체를 면역형광 염색 하였다. 요약하면, 응집체를 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 30분 동안 고정하고 1x PBS로 5분 동안 3회 세척했다. 그런 다음 샘플을 PBS 중 0.1% Triton X-100으로 30분 동안 처리하고 매번 5분 동안 1% PBS로 3회 세척했다. 그 후 응집체를 1% BSA(bovine serum albumin) 용액으로 3시간 동안 블로킹 단계를 거친 후 BSA로 희석한 1차 항체로 6시간 동안 염색하였다. 1X PBS로 3회 세척한 후 1% BSA 희석한 2차 항체(FITC and TRITC-conjugated phalloidin; Sigma-Aldrich)로 응집체를 염색하였다. 1% PBS로 5분씩 3회 세척한 후, 세포의 핵을 희석된 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI; Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 염색된 세포의 이미지는 레이저 공초점 주사 현미경 시스템(TCS SP5/AOBS/Tandem, Wetzla, Germany)을 사용하여 얻었다. 응집체 및 세포의 정량화는 ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 수행되었다.

4. 주사 전자 현미경(SEM) 이미징

1일, 3일 및 30일에 IEO의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 JSM-7500F 전계 방출 주사 전자 현미경(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었다. 요약하면, 응집체를 4시간 동안 0.05M 인산완충식염수(PBS)(Sigma-Aldrich)에서 2% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich) 및 2% 글루타르알데히드 (Sigma-Aldrich)로 고정했다. 그런 다음 샘플을 0.05M PBS로 3회 세척하고 마지막으로 1% 사산화 오스뮴(Sigma-Aldrich)으로 3시간 동안 고정했다. 그런 다음 샘플을 매번 10분 동안 1x PBS로 3회 세척하고 단계별 농도의 에탄올(30%, 50%, 70%, 90% 및 100%, v/v)로 탈수했다. 금속 스퍼터링에 의해 샘플을 최종적으로 Pt 층(~5 nm 두께)으로 코팅하고 SEM 이미지를 얻었다.

5. 패치 클램프

-44 mV의 일정한 전위로 돌아가기 전에 -164 ~ +46 mV 범위를 포함하는 -84 mV의 유지 전위에서 0 mV 공칭 증분하였다.

실험 결과

1. ESC 응집체를 생성을 위한 마이크로홀 칩

마이크로 공학 기반의 IEO의 개발을 위해 서로 다른 세포 농도를 가진 마우스 배아 줄기 세포(ESC)를 마이크로홀 칩에서 배양했다(도 1a). 제작된 마이크로홀 칩을 상용 세포 배양 플레이트에 이식하여 ESC의 현탁 배양이 가능했다. 유지된 ESC는 젤라틴이 코팅된 웰 플레이트에서 배양되었으며 둥근 응집체 구조를 가지고 있다(도 1b). 정교한 소프트 리소그래피에 의해 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성된 제안된 마이크로홀 칩은 세포 수집을 가능하게 하는 경사 아래에서 각 구멍의 직경이 500 μm이다(도 1c). 원심분리 같은 힘이 없이, 마이크로홀에 수집된 세포가 자발적으로 응집되었으며 도 1d는 시간이 지남에 따른 ESC 응집체의 형성을 보여준다. 응집체의 세포 수 의존적 영향을 확인하기 위해, 서로 다른 세포 농도(각각 2x10³(Small, S-Org) 3x10³(Medium, M-Org), 4x10³(Large, L-Org)/마이크로홀)로 세포를 배양하고 유지했다. 3일 후, 수집된 세포는 빠르게 3차원(3D) 응집체의 구형 구조를 형성했으며 최종 응집체 크기는 세포 농도에 따라 차이가 있었다.

도 1e에 도시된 바와 같이, 면역형광 이미지는 마이크로홀 칩 상의 ESC의 액틴 세포골격 및 인테그린을 나타낸다. 인테그린 세포외 기질(ECM)의 단백질로 알려진 인테그린 베타 4 및 모든 응집체는 인테그린 ECM을 보유했다. 시간에 따른 면적과 스페로이드 지수를 정량화하였으며, 응집체의 면적(응집체 면적: 2x10³(S-Org) < 3x10³(M-Org) < 4x10³(L-Org))(도 1f 및 1g)은 세포 농도에 민감하게 영향을 받았다. 또한, 응집체의 면적은 감소하였다가 증가하여 응집 후 ESC의 세포 증식을 보여주고 있다. 회전 타원체 지수는 응집체의 구형 구조를 나타내며 1에 가까울수록 더 많은 구형 구조를 가진다(도 1h). S-Org와 L-Org의 집합체는 M-Org의 집합체보다 더 둥근 모양이다.

세포 수의 영향을 확인하기 위해, 응집체 내 세포의 인테그린 형성과 세포 골격을 정량화했다. 이는 ECM 섬유(예를 들어, Integrin)의 긴 사슬이 분산된 세포로부터 빠른 응집체 형성에 필수적이기 때문이다. 마이크로 홀에서, 서로 다른 세포 수의 응집체들은 다른 인테그린 형성 및 세포 압축을 보여 주었다(도 1i). 구체적으로, 인테그린과 팔로이딘 발현 면역 형광 영상은 세포 수를 증가시킴으로써 인테그린 형성과 세포 압축의 증가를 보여주었다. 도 1j에서 볼 수 있듯이, 인테그린의 ECM 단백질의 면역 형광 강도는 세포 수가 클수록 ECM 응집체의 통합 형성에 의해 더 높게 발현된다. 정량화 결과 (도 1k)에 따르면, 세포 밀도는 더 큰 세포 수(세포 밀도: 0.009375 (S-Org) < 0.009688 (M-Org) < 0.012656 (L-Org) / μm2 - cell area (a.u.): 1 (S-Org) > 0.9724 (M-Org) > 0.95147 (L-Org))에 따라 증가하여, 마이크로홀 칩의 더 큰 세포 수가 세포 압축을 유도함을 나타낸다.

즉, 초기 세포 수는 셀 응집체에 영향을 미칠 수 있고, 더 큰 세포 수(즉, 4x10³ (L-Org)) 응집체는 향상된 인테그린 형성 및 세포 압축(도 1k)을 가진다. 따라서, 세포 수의 차이가 IEO 발달을 조절할 것으로 예상할 수 있다.

2. ESC 외배엽을 생성하는 마이크로홀 칩

상기 예상을 검증하기 위해 먼저 Matrigel과 분화 배지에 의해 초기 세포 수가 다른 마이크로 공학 기반의 IEO 외배엽 형성을 확인했다. 청각, 균형, 후각, 시각과 관련된 한 쌍의 두개 안면 감각기관은 전신경판 부근의 외배엽 기원판에서 유래하는 것으로 알려져 있으며, 그 외배엽은 특정 두개골 기원판을 형성하도록 선별되어 있는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 ECM 단백질 (예: Matrigel)은 배아 발달 동안 최종 외배엽을 연상시키는 상피로 조직화되는 응집체 표면의 기저막 형성을 촉진하는 데 사용된다. 시딩 1일 후 마이크로홀의 각 응집체 표면에 진정 외배엽(Definitive Ectoderm, DE)의 조직을 자극하기 위해 Matrigel을 추가했다(도 2a). 도 2b와 같이 초기 세포수가 다른 시딩된 세포는 분화배지에 의해 미세구멍에 얇은 외배엽층을 가진 응집체로 변화하였고, Matrigel 처리 후 표면에 두꺼운 층이 형성된 조직의 구조를 보였으며, 이들의 서로 다른 응집체 크기 차이를 유지하면서 외배엽 조직이 나타났다.

주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 사용하여 응집체의 표면을 비교했다. 1일째에는 M-Org와 L-Org의 표면에서 세포와 세포 사이의 공간과 달리 S-Org의 표면에서 세포와 세포 사이의 공간이 거의 구별할 수 없으며(도 2c), 세포 밀도의 정량화 면적은 유지 배지에서 세포 밀도 및 응집체 면적의 정량화와 동일한 경향을 보여준다(도 2d). 3일에 모든 응집체의 표면은 1일의 응집체 표면보다 더 매끄러워졌다. 응집체는 ECM 구성요소를 포함하는 최종 외배엽을 가지고 있기 때문이다. 도 2e에 나타난 바와 같이, 1일차보다 3일차에 표면 거칠기가 감소했으며 1일차에 S-Org의 표면 거칠기가 다른 Org(즉, M-Org 및 L-Org)의 거칠기보다 낮았다. 1일째에 더 작은 세포 수에서 더 빠른 매끄러운 표면의 형성을 보여준다.

오가노이드에서 외배엽 및 다능성을 확인하기 위해 면역형광 염색으로 라미닌 베타1(laminin beta1) 및 Oct 4의 발현을 평가하였다. 면역형광 이미지(도 2f)에서 관찰된 바와 같이, 오가노이드는 3일째에 외배엽을 갖고 강도가 약간 감소했지만 다능성이 유지되었다. 웨스턴 블롯 분석은 외배엽(라미닌 베타 1), 다능성(OCT4), 갭 접합 단백질(Cx43) 및 세포 주기 진행(사이클린 D1)의 발현을 보여주었다(도 2g). 외배엽과 다능성을 극성의 반대 현상으로 보는 관점에서, 세포 수가 적은 오가노이드는 다능성을 갖는 세포를 감소시켜 외배엽을 빠르게 형성하지만, 더 높은 세포 수를 가진 오가노이드는 다능성을 가진 세포의 수를 유지함으로써 다소 나중에 외배엽을 형성했다. 또한, 간극연접(gap junction) 단백질의 발현 및 세포 주기 진행은 세포 수가 클수록 더 높았고, 발현을 도 2h에 요약하였다.

3. 내이 오가노이드를 개발하기 위한 마이크로홀 칩

마이크로홀 칩에서 ESC를 배양하는 동안 세포 응집체와 외배엽 형성은 마이크로홀 칩 및 세포 수(즉, 소형, 중형, 대형)의 구조적 자극에 민감하게 영향을 받았다. 이러한 차이가 IEO 개발에 미치는 영향을 확인하기 위해 마이크로홀 칩에서 IEO 개발 프로세스를 최적화했다(도 3a). IEO는 최대 2 mm까지 성장할 수 있기 때문에 마이크로홀 칩에서 적정 시점에 IEO를 분리할 수 있다. 이의 다양한 시점을 확인했으며, 본 발명에 따르면, 내이와 표피를 생성하는 표면 외배엽으로 알려진 비신경 외배엽(Nonneural Ectoderm, NNE) 형성 후 FGF-2 및 LDN193189의 처리 전인 5일째에 IEO를 분리하는 것이 적합하다.

손상된 IEO가 서로 달라붙을 수 있기 때문에 IEO의 안정성을 높이기 위해 NNE가 형성된 IEO를 96웰로 이동시켰다. 이후 숙성 과정은 기존 기법과 동일하다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 5일 동안 마이크로홀 칩에서 응집체를 분화시켰고, 성장인자 처리에 의해 그 형태가 민감하게 변화하였다. NNE 형성 유도제이자 중배엽 형성 억제제인 BMP-4와 SB-431542를 처리하면 응집체가 주름진 표면을 형성하여 두꺼운 외배엽 형성을 보였다. 이러한 조건은 모든 시료에서 확인되었으며 시간이 지날수록 응집체의 크기가 증가한다. 이 응집체에 FGF-2와 LDN193189를 첨가하여 귀-표피 기원판 유도제이자 BMP 억제제로 사용하였으며, 응집체는 두꺼운 외피를 나타내어 귀 상피 기원판(Otic Epibranchial Placode, OEPD) 형성을 보였다. 이전 연구에 따르면, 응집체는 내부 세포가 외부 상피를 둘러싸고 있는 표면으로 이동하여 매끄러운 형태를 가지고 있다. 다만, 적은 번호의 응집체는 두꺼운 외부 상피를 형성하지 않았으며, 11일째(FGF-2 및 LDN193189 처리 후)에 점차적으로 분화가 진행되지 않고 세포가 소실되었다.

M-Org 응집체에서 세포를 잃어 약한 OEPD 형성을 나타내며 다음 과정(즉, IEO의 성숙)을 진행할 수 없었다. S-Org 및 M-Org의 두 샘플을 제외하고 더 큰 세포 수를 가진 L-Org 및 U-well 오가노이드의 다른 두 샘플을 사용하여 마이크로홀 칩 기반 효과를 확인했다. 성숙 배지를 첨가함으로써, 응집체는 감각 유모 세포를 포함하는 외부 가장자리를 따라 원형의 고리 구조를 갖는 귀 소포의 형성을 보여주었다.

요약하면 S-Org와 M-Org의 두 샘플은 다음 단계로 진행할 수 없었다(도 3c). S-Org는 OEPD 형성의 매끄러운 형태를 형성할 수 없었으며, 외피 형성 후 S-Org와 M-Org가 L-Org보다 낮은 분화능을 보였기 때문에 내부 세포가 외부 표면으로 이동하지 않았거나 세포 수가 다음 단계를 처리하기에 부족했을 가능성은 아닌 것으로 보인다(도 2g). 도 3d의 이미지와 같이 S-Org와 M-Org는 응집체에서 세포를 잃어버렸고 성장하지 않았다. 특정 세포 발현을 확인하기 위해 Pax 8(감각 내이 전구세포), E-cadherin(감각 외피상피) 및 DAPI(핵)를 사용하여 면역형광 염색을 수행했다. 14일째에 응집체는 일반적으로 귀 소포를 갖지만, 중심은 S-Org 및 M-Org의 내부 코어에서 비정렬 구조를 유지하여 중배엽 및 신경 세포가 응집체의 외부 표면으로 이동하지 않았음을 나타낸다.

S-Org 및 M-Org와 달리 L-Org 및 U-Org는 응집체의 가장자리 부분에서 귀 소포의 형성을 보였다. 확대 이미지에서 L-Org가 감각 세포 구조가 잘 정렬된 소포를 형성했음을 확인할 수 있다.

4. 마이크로홀 칩이 내이 오가노이드 발달에 미치는 영향

마이크로홀 칩이 IEO 발달에 영향을 미치는지 알아보기 위해 먼저 L-Org와 U-Org의 구조를 비교했다. 도 4a에서 보는 바와 같이 초기의 균일성이 최종 IEO의 균일성을 유도하였고, 최종 IEO 균일성이 마이크로홀 칩에서 초기 응집체 형성에 의해 촉진되었음을 보이는 명백한 증거이다. 최종 응집체에는 버드와 소포가 있으며 최종 크기는 초기 크기보다 10배 이상 컸다(도 4b).

L-Org의 최종 둘레 및 면적은 U-Org의 최종 둘레 및 면적보다 컸다. 특히, L-Org는 전체적으로 유사한 면적을 나타내어 응집체의 균일성이 더 높다(도 4c). IEO의 최종 구조적 형태는 초기 배양 조건의 영향을 받는 IEO 기능에 대한 추가적인 증거를 제공했다. 주사 전자 현미경 이미지는 IEO의 외부 및 찢어진 표면을 보여준다(도 4d). 고배율 이미지를 비교한 결과 U-Org와 L-Org의 약간의 차이가 있음을 알 수 있었으며, L-Org의 외부 표면은 세포가 밀접하게 연결된 조밀한 세포외 기질을 가지고 있다.

또한, L-Org의 찢어진 표면의 이미지는 U-Org의 찢어진 표면보다 더 조밀한 세포외기질의 형성을 보여준다.

IEO의 성숙을 확인하기 위해 면역형광염색 및 투과전자현미경(TEM) 분석을 수행하여 감각유모세포의 형성을 확인하였다. 유모세포와 지지 세포는 면역형광 염색에 의해 시각화 되었으며 L-Org에서 MyoVIIa의 발현은 U-Org에서 MyoVIIa의 발현보다 더 높았다(도 4e). 놀랍게도 TEM 이미지는 유모 세포의 미성숙을 나타내는 U-Org의 미세 융모와 달리 L-Org에 유모 세포 운동모가 존재함을 나타내며, L-Org에 외부 dynein arm, 외부 이중선 미세소관 및 중앙 단일선 미세소관이 있는 kinocilium이 존재함을 보여주었다(도 4f-g). 이 구조는 독특한 운동성 섬모 구조를 가진 (9x2)+2 axoneme 패턴을 보여주며, 이는 유모세포의 활성을 나타낸다. 도 4i에 이를 요약했다.

기존의 U 웰 플레이트 및 마이크로홀 칩에서 개발된 IEO의 전기 생리학을 확인하기 위해 패치 클램프 분석을 사용하여 IEO 유래 유모 세포 유사 세포의 whole-cell, tight seal technique를 수행했다(도 5a). IEO의 두꺼운 3D 구조는 트립신 처리를 통해 단일 세포로 분리되었다. 먼저, 쥐의 코르티기관 유래 유모 세포, mESCs R1/E, IEO 유래 유모 세포 유사 세포를 포함한 세포의 형태를 확인하였다(도 5b).

이미지는 세 가지 세포 유형 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났지만 IEO 유래 유모세포는 태양의 코로나와 같은 구조를 갖고 있다. 도 5c에서 보는 바와 같이 쥐의 코르티기관 유래 유모세포는 과분극과 탈분극 전압 단계에 의해 순간적인 반응을 보이며, -45 mV 정도로 활성화되어 -3mV에서 최대 크기 170pA에 도달했다. 반면에 mESCs R1/E 그룹은 다른 그룹과 달리 전기생리학의 기능이 없으며, 미분화 세포가 유모세포의 기능이 없음을 보여주었다. 증가된 막 탈분극에 따라 전압 클램프는 빠른 활성화를 보여 내부 전류, 아마도 Na+ 전류를 비활성화했다. U 웰 플레이트와 마이크로홀 기반 IEO 유래 유모세포 유사 세포는 전압 단계에 따라 즉각적인 반응을 보였고 두 개의 샘플은 약 -45mV에서 활성화되었다. 그러나 K+ 전류와 외부 K+ 전류는 약간 차이가 있어 -3 mV(U 웰 플레이트)에서 최대 크기 25 pA, -3 mV에서 최대 크기 54 pA를 보였다. 이 결과는 마이크로홀 기반 IEO유래 유모세포가 U웰 플레이트 기반 IEO유래 유모세포보다 자극 민감도가 더 크다는 것을 보여주었다.

Claims

내주면이 하방 경사진 굴곡면을 갖는 마이크로 웰 플레이트 상에 줄기세포와 배양액을 처리하여, 각 마이크로 웰에 줄기세포를 시딩하는 단계; 및
상기 각 마이크로 웰에 시딩된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로 웰의 너비는 100 내지 1000 μm인, 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로 웰은 내주면이 하방 경사진 제1 굴곡면 및 상기 제1 굴곡면과 이어지는 하방 경사진 제2 굴곡면을 갖는 것인 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로 웰은 너비가 450 내지 550 μm이고, 각 마이크로 웰에 1.5 x10³내지 4.5 x10³개의 줄기세포를 시딩하는 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포의 배양 1일째에 Matrigel을 처리하는 단계; 및 배양 3일째에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 SB-431542를 처리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포를 비신경 외배엽으로 분화시키는 단계; 및 상기 비신경 외배엽을 마이크로 웰에서 분리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.
청구항 6에 있어서, 분리된 비신경 외배엽에 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2) 및 LDN193189를 처리하는 단계;를 더 포함하는 내이 오가노이드 제조 방법.