KR20230079777A

KR20230079777A - 삼차원 바이오 프린팅을 이용한 인공 피부조직의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 인공 피부조직

Info

Publication number: KR20230079777A
Application number: KR1020210166893A
Authority: KR
Inventors: 권현주; 김병우; 진수정; 박정하; 오유나
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-06-07
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: KR102796480B9; KR102796480B1

Abstract

본 발명은 (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 배양한 세포를 하이드로젤과 혼합하여 바이오 잉크 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린팅하는 단계; 및 (d) 상기 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 액-액 계면 배양(Liquid-Liquid Interface, LLI)으로 배양 후 기-액 계면 배양(Air-Liquid Interface, ALI)으로 배양하는 단계를 포함하는, 인공 피부조직의 제조방법 및 이에 따라 제조된 인공 피부조직을 제공한다.
본 발명에 따르면 비교적 간단한 공정을 통해 대량으로 인공 피부조직을 제작 가능하게 하며, 실제 피부와 유사한 물성 및 높은 세포생존율을 가질 수 있다.

Description

삼차원 바이오 프린팅을 이용한 인공 피부조직의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 인공 피부조직{Method for manufacturing artificial skin tissue using three-dimensional bioprinting and artificial skin tissue manufactured by thereof}

본 발명은 삼차원 바이오 프린팅을 이용한 인공 피부조직의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 인공 피부조직에 관한 것이다.

삼차원 바이오 프린팅은 세포 및 기타 생체 적합성 물질을 결합하여 자연 조직 특성을 최대한 모방하는 생체 의학 부품을 제작하는 기술이다. 일반적으로 생체 조직과 유사한 구조를 만들기 위해 바이오 잉크를 출력 및 적층하여 제조한다. 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하며, 우수한 세포 친화성을 가지는 소재이다. 이러한 삼차원 바이오 프린팅을 통해 제조된 생체 의학 부품은 해부학적으로 및 기능적으로 생체 조직과 동일한 특성을 가져야 한다.

현재 바이오 잉크로서 살아있는 세포 및 천연 유래 또는 합성 하이드로젤을 포함한 하이드로젤 기반의 바이오 잉크가 개발되어 사용되고 있으나, 이러한 구성요소만으로는 프린팅된 조직 유사 구조 내에서 세포의 원활한 성장 및 분화가 잘 이루어지지 않아 낮은 세포생존율을 보여, 실제 생체 조직을 대체하는 데 한계를 보이고 있다.

이를 개선하기 위해 탈세포화된 세포외기질(d-ECM)과 같은 조직유래 성분이 많은 하이드로젤 기반의 바이오 잉크에 포함되고 있다. 그러나 위와 같이 조직유래 성분을 추가로 포함할 경우, 복잡한 탈세포화 과정을 거쳐야 하므로 제조 공정이 까다로우며 생체 의학 부품을 제조하기까지 소모되는 비용이 크게 증가하는 단점이 있다.

대한민국 등록특허 제10-2198455호 대한민국 등록특허 제10-1913374호

본 발명의 목적은 세포의 원활한 성장 및 분화가 이루어져 생체 조직과 동일한 특성을 가지는 인공 피부조직 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 세포의 생존율이 매우 높은 인공 피부조직 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 배양한 세포를 하이드로젤과 혼합하여 바이오 잉크 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린팅하는 단계; 및 (d) 상기 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 액-액 계면 배양(Liquid-Liquid Interface, LLI)으로 배양 후 기-액 계면 배양(Air-Liquid Interface, ALI)으로 배양하는 단계를 포함하는, 인공 피부조직의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 인공 피부조직을 제공한다.

본 발명에 따른 인공 피부조직 및 이의 제조방법은 비교적 간단한 공정을 통해 대량으로 인공 피부조직을 제작 가능하게 하며, 실제 피부와 유사한 물성 및 높은 세포생존율을 가질 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 인공 피부조직을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직에 대해 LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity kit를 사용하여 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직이 표피층 및 진피층이 잘 유지되고 있음을 보여주는 결과이다.
도 5의 (A) 및 (B)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직의 사진을 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직을 절편으로 제작하여 H&E 염색법으로 관찰한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직의 각질형성 분화 표지자인 로리크린(loricrin, Lor)의 발현이 증가하였음을 보여주는 결과이다.
도 8의 (A) 및 (B)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인공 피부조직에 대해 LIVE/DEAD^® Viability/Cytotoxicity kit 및 Alamar blue^® assay kit를 사용하여 세포의 생존율 및 증식률을 측정하고 이를 수치화한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 배양한 세포를 하이드로젤과 혼합하여 바이오 잉크 조성물을 제조하는 단계; (c) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린팅하는 단계; 및 (d) 상기 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 액-액 계면 배양(Liquid-Liquid Interface, LLI)으로 배양 후 기-액 계면 배양(Air-Liquid Interface, ALI)으로 배양하는 단계를 포함하는 인공 피부조직의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 세포는 구체적으로 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 세포는 제작된 인공 피부조직의 표면이 실제 피부와 유사한 물성을 갖도록 하기 위해 각질세포(keratinocyte)를 포함할 수 있다. 상기 각질세포를 포함할 경우, 출력 이후 (d) 배양 단계에서 인공 피부조직의 표면으로 각질화된 세포들이 이동하고, 표면은 수분이 증발하여 건조하고 거친 느낌을 가지는 물성으로 변하여 실제 피부와 유사한 인공 피부조직을 제조할 수 있다.

상기 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다.

상기 세포는 상기 바이오 잉크 조성물 전체 함량에 대하여 0.1 x 10⁷ cells/ml 내지 1 x 10⁸ cells/ml로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로 1 x 10⁷ cells/ml 내지 5 x 10⁷ cells/ml로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 배양 배지를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 것으로서, 세포 배양 배지의 비제한적인 예시로는 둘베코 인산 완충 식염수, 얼 균형화 염, 행크 균형화 염, 티로드 염, 알시버 용액, 게이 균형화 염 용액, 크랩-헨젤라이트 변성 완충제, 크랩-링거 중탄산 완충제, 퍽 식염수, 둘베코 변성 이글 배지, 둘베코 변성 이글 배지/영양소 F-12 Ham, 영양소 혼합물 F-10Ham(Ham's F-10), 배지 199, 이글 최소 필수 배지, RPMI-1640 배지, 에임즈배지, BGJb 배지(Fitton-JacksonModification), 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배지, 글라스코우 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브 변성 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이 5A 변성 배지, NCTC 배지, 스윔 S-77 배지, 웨이마우스 배지, 윌리엄 배지 E, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 세포 배양 배지는, 이에 제한되지는 않으나, 혈청, 알부민, 셀레늄, 트랜스페린, 페투인, 슈가, 아미노산, 칼슘, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항생물질, 지질, 지질 담체, 시클로덱스트린, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 일 예에서, 상기 (a) 단계 이후 혈소판 농축 혈장(Platelet-Rich Plasma; PRP)을 배양된 세포에 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. PRP는 혈소판이 풍부한 혈장을 의미하는 것으로서, 마이크로리터 당 1000 x 10³ 이상의 혈소판을 포함하며 전혈(whole blood)과 비교하여 혈소판을 3-5배 더 포함하고 있다. PRP는 여러 성장인자들을 고농도로 함유하고 있어 주변 세포들의 증식을 촉진하고 콜라겐 등의 성분들을 풍부히 합성하도록 자극해 주는 효과가 있다고 보고되고 있으며 최근 요통과 같은 통증치료분야, 탈모치료, 피부재생이나 화상치료와 같은 피부질환분야 등 다양한 분야에서 PRP가 사용되고 있다.

본 발명의 일 예에 따라 상기 (a) 단계 이후 세포에 PRP를 전처리하는 단계를 추가로 포함할 경우, 프린팅 후 세포의 분화 및 증식이 더욱 활발하게 이루어지며 세포 생존율 또한 향상될 수 있다. 상기 PRP 전처리는 배양 접시에 이식한 세포에 처리하거나, 세포에 전처리한 후 배양 접시에 이식할 수 있으며 5분 내지 3시간, 구체적으로 5분 내지 1시간, 보다 구체적으로 10 내지 30분 동안 실시할 수 있다.

상기 PRP는 자가조직, 동종 이계 또는 혈소판 및/또는 혈장의 원천으로부터 얻을 수 있으며, 다양한 동물로부터 수득할 수 있다. 수득 방법으로는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다.

또한 상기 PRP를 전처리하는 단계는 세포에 전처리하기 전 또는 전처리 시에 PRP를 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계에서 하이드로젤은 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트, 콜라겐, 알지네이트, 피브리노겐, 피브린, 히알루론산, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 엑스트라셀(Extracel™), 플루로닉(pluronic®)-F127, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 하이드로젤로서 젤라틴, 알지네이트 및 피브리노겐을 함께 포함할 수 있다. 젤라틴은 온도에 따라 가역적으로 변화가 가능하여 토출 방식을 이용한 삼차원 바이오 프린팅에 적합하며, 알지네이트는 겔화 반응 속도가 빠르며 다른 생체 재료에 비하여 핸들링이 쉽다는 장점을 가진다. 또한 피브리노겐은 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성할 수 있는 장점이 있다. 따라서 위와 같이 젤라틴, 알지네이트 및 피브리노겐을 하이드로젤로서 사용하는 경우 프린팅 적합성이 가장 뛰어나, 목적하는 형태로 바이오 잉크 조성물이 출력될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 젤라틴, 알지네이트 및 피브리노겐은 10 : 1 내지 7 : 1 내지 7, 더 구체적으로 10 : 3 내지 5 : 3 내지 5, 일 예에서 10 : 5 : 5의 농도비(w/v%)로 포함될 수 있다.

상기 (c) 단계에서 삼차원 바이오 프린팅은 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다.

본 발명에서의 삼차원 바이오 프린팅 방법은 연속 및/또는 실질적으로 연속이다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 니들을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 추가 구체예에서, 바이오 프린팅된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅된다(예를 들면, 적층된다). 구체적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 된다.

바이오 프린팅된 기능 단위는 격자무늬(tessellated) 패턴으로 반복된다. 격자무늬 패턴은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 평면 도형이다. 연속 및/또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 바이오 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 바이오 잉크의 요소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 바이오 잉크의 대형 저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다.

바이오 프린트로부터 적당한 및/또는 최적의 분사 거리는 재료 편평화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 바이오 프린터 분사 니들은 gauge 12 내지 28의 범위로서 0.17 이상 2.18 mm 이하의 내경을 가지며 0.36 이상 2.75 mm 이하의 외경을 갖는다. 또한, 바이오 프린터의 바이오 잉크 저장소는 약 .5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고/하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고, 보다 높은 비율은 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다. 바이오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 인공 피부조직의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 상기 (a) 단계에서 두 종류 이상의 세포를 각각 배양할 수 있고, 이는 (b) 단계에서의 하이드로젤과 각각 혼합됨으로써 여러 개의 바이오 잉크 조성물을 만들 수 있다. 상기와 같이 여러 개의 바이오 잉크 조성물을 사용하는 경우, 상기 (c) 단계에서 각각의 바이오 잉크 조성물은 목적하는 물성 및 특성에 따라 각각 층을 이루며 적층으로 배열될 수 있다.

예를 들어, 상기 세포로서 각질세포와 다른 세포를 사용할 수 있으며, 이를 각각 하이드로젤과 혼합하여 복수 개의 바이오 잉크 조성물을 만들 수 있다. 상기 각질세포를 포함하는 바이오 잉크 조성물은 삼차원 바이오 프린트 시 인공 피부조직의 상단에 적층될 수 있고, 이는 각질화가 진행되어 표피층을 형성할 수 있다.

또한 일 실시예에서, 본 발명은 필요에 따라 세포 없이 하이드로젤만을 삼차원 바이오 프린트하여 세포를 포함하는 바이오 잉크 조성물 층과 함께 적층할 수도 있다.

바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사 및 적층된 이후에는, 예를 들어 트롬빈과 같은 가교 결합 촉매를 처리함으로써 가교 결합될 수 있다. 바이오 잉크 조성물이 프린팅 된 직후에는 졸(sol) 상태의 물성이 강하며, 이러한 가교 결합을 통해 겔(gel)화 되어 보다 단단한 구조를 가질 수 있다.

상기 (d) 단계에서 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 액-액 계면 배양(Liquid-Liquid Interface, LLI)으로 배양 후 기-액 계면 배양(Air-Liquid Interface, ALI)으로 배양할 수 있다. 기-액 계면 배양(ALI)은 기저 세포가 배지와 접촉하여 기저 표면을 성장시키고 세포층의 상단이 공기에 노출되는 세포 배양 방법이며, 액-액 계면 배양(LLI)은 ALI와 달리 세포층의 상단이 액체에 잠겨있는 세포 배양 방법이다. 본 발명에서는 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 기-액 계면 배양 이전에 액-액 계면 배양함으로써 프린팅 된 바이오 잉크 조성물에 포함되어 있는 세포의 생존율, 증식율을 현저하게 높일 수 있다. 나아가, 이와 같은 과정을 통해 진피층과 표피(각질)층의 균형을 유지하여 인간의 피부 조직과 유사도를 현저하게 높일 수 있다.

상기 액-액 계면 배양 및 기-액 계면 배양에 사용되는 배양 배지에 대해서는 상기 (a) 단계에서의 세포 배양 배지에 대해 상술한 바와 같다.

예를 들면, 상기 액-액 계면 배양 배지는 소태아혈청 및 CaCl₂를 포함하는 DMEM 배지일 수 있다. 구체적으로 15%의 소태아혈청 및 0.03mM의 CaCl₂를 포함하는 DMEM 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 상기 기-액 계면 배양 배지는 소태아혈청, 인간 케라티노사이트 성장 인자, 항생제/항진균제, CaCl₂를 포함하는 DMEM 배지일 수 있다. 구체적으로, 20%의 소태아혈청, 1X 인간 케라티노사이트 성장인자, 1X 항생제/항진균제 및 3~8 mM CaCl₂를 포함하는 DMEM 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 액-액 계면 배양 및 기-액 계면 배양은 목적하고자 하는 인공 피부조직의 물성에 따라 배양 조건을 다양하게 변경할 수 있다. 예를 들어, 세포 생존율을 최대로 높이기 위해 상기 액-액 계면 배양을 1 내지 5일, 상기 기-액 계면 배양을 7 내지 21일동안 행할 수 있으며 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 이루어질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

제조예: 인공 피부조직의 제조

(1) 세포 배양

인체섬유아세포(HFF-1 cells, ATCC社, USA)를 15%의 소태아혈청(FBS, ATCC社, USA)을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 또한 인체각질세포(HaCaT cells, CLS社, 독일)를 10%의 소태아혈청, 4.5g/L 글루코스, 2mM L-글루타민을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(2) 바이오 잉크 조성물의 제조

하이드로젤로서 10%의 젤라틴, 1%의 알지네이트 및 20 mg/ml의 피브리노겐을 사용하였으며, 37℃에서 하루 동안 교반되어 균일하게 혼합되었다. 상기 혼합된 하이드로젤을 세 개 준비하고, 이 중 하나에 상기 (1) 단계에서의 HFF-1 세포 배양액을 혼합하여 바이오 잉크 조성물 (a)를 제조하였으며, 나머지 하나에 상기 (1) 단계에서의 HaCaT 세포 배양액을 혼합하여 바이오 잉크 조성물을 (b)를 제조하였다. 또한, 세포 배양액을 넣지 않은 하이드로젤로 바이오 잉크 조성물 (c)를 제조하였다. 각 바이오 잉크 조성물의 함량은 아래 표 1과 같다.

성분	바이오 잉크 조성물
성분	(a)	(b)	(c)
HFF-1 세포	1x10⁷ cells/ml	-	-
HaCaT 세포	-	2x10⁷ cells/ml	-
젤라틴	10% 농도
알지네이트	1% 농도
피브리노겐	20 mg/ml

(3) 삼차원 바이오 프린팅

상기 바이오 잉크 조성물 (a) 내지 (c)를 각각 주입한 카트리지를 준비하고, 삼차원 바이오 프린터(㈜로킷헬스케어)에 상기 카트리지를 장착하였다. 4~15℃ 조건하에서 50-80 kPa의 압력으로 300㎛ 구경의 노즐을 통해 프린팅하였으며, 10x10㎜ 격자무늬(tessellated) 패턴으로 바닥에서부터 바이오 잉크 조성물 (c)가 2층, 바이오 잉크 조성물 (a)가 4층, 바이오 잉크 조성물 (c) 1층, 그리고 가장 상층에 바이오 잉크 조성물 (b)가 3층이 되도록 적층하였다. 배양 효율을 높이기 위하여 웰 플레이트의 인서트에 직접적으로 프린팅하였다. 프린팅 후 10 U/ml의 트롬빈 용액을 처리하고 실온에서 약 30분 두어 가교결합이 되도록 하였다.

(4) 삼차원 바이오 프린팅된 인공 피부조직의 배양

아래 표 2에 기재된 배지 조성 및 배양 조건으로 상기 (3)에서 웰 플레이트의 인서트에 직접적으로 프린팅된 인공 피부조직을 액-액 계면 배양 후 기-액 계면 배양을 진행하였다. 다만, 대조군의 경우 기-액 계면 배양만 진행하였다.

	액-액 계면 배양 배지(LLI)	기-액 계면 배양 배지(ALI)
배양 배지 조성	15% FBS in DMEM + 0.03 mM CaCl₂	20% FBS in DMEM + 1x Human keratinocyte growth supplement + 1x Antibiotics/Antimycotics + 3~8 mM CaCl₂
배양 조건	37℃, 5% CO₂	37℃, 5% CO₂
배양 기간	2일	0일, 7일, 14일 1일에 한번 배지교환

실험예 1: 세포생존율 측정

액-액 계면 배양 후, 기-액 계면 배양을 수행한지 0일째, 7일째 및 14일째에 LIVE/DEAD^® Viability/Cytotoxicity kit를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 이 때 살아있는 세포는 녹색 형광을 나타내며, 죽은 세포는 빨강 형광을 나타낸다. 이에 대한 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

세포생존율 측정 결과, 본 발명에 따른 인공 피부조직은 액-액 계면 배양 2일, 기-액 계면 배양 14일 후에도 죽은 세포가 거의 발견되지 않았으며 90% 이상의 세포 생존율을 보이는 것으로 나타났다. 반면, 대조군(기-액 계면 배양만 수행한 경우)에는 최종 출력된 인공 피부 조직이 으스러져 세포 생존율 등과 관련된 실험을 할 수 없었다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 인공 피부조직의 제조 방법의 경우에는 액-액 계면 배양을 수행한 뒤에 기-액 계면 배양을 진행하는 과정을 통해 최종적으로 제조된 인공 피부조직에서 생존할 수 있는 세포의 수를 현저하게 높일 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 표피층 및 진피층 유지 확인

상기 제조예에서, 인체섬유아세포(HFF-1 cells)를 녹색 형광 시약으로, 인체각질세포(HaCaT cells)를 빨간색의 형광 시약으로 염색한 것을 제외하고는 제조예 및 실험예 1에서와 동일한 조건으로 프린팅 및 배양을 진행하였다. 이에 대한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5를 참고하면, 액-액 계면 배양 2일 및 기-액 계면 배양 14일 후(LLI + ALI culture)에도 3D 프린팅 출력물의 표피층과 진피층이 잘 유지되었음을 확인할 수 있었다.

반면, 기-액 계면 배양만을 수행한 경우(ALI culture only)에는 3D 프린팅 출력물이 수축되고, 경도가 약해 조직 구조물이 으스러지는 현상을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통해 기-액 계면 배양을 수행한 경우에는 세포 생존율과 같은 구체적인 실험 데이터를 얻을 수 없는 정도에 해당하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 액-액 계면 배양, 및 기-액 계면 배양을 함께 수행하는 경우에는 기-액 계면 배양만을 수행한 경우와 비교하여 3D 프린팅 출력물의 경도 등을 조절하여 최적의 인공 피부조직을 출력물로서 얻을 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: 각질층 형성 확인(1)

상기 제조예 및 실험예 1에서와 동일하게 제조한 인공 피부조직에 대해, 이를 절편으로 제작하여 H&E 염색법으로 관찰하였다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. 실험 결과 출력 시에 고르게 분포되어 있던 HaCaT 세포가 표피 표면까지 이동하며 각질화가 되어 얇은 각질층을 형성하였음을 확인할 수 있었다. 반면, 기-액 계면 배양만을 수행한 대조군의 경우에는 경도가 약해 조직 구조물이 으스러져 각질층 형성 확인이 어려웠다.

실험예 4: 각질층 형성 확인(2)

상기 제조예 및 실험예 1에서와 동일하게 제조한 인공 피부조직에 대해, 이를 절편으로 제작하여 면역형광법(Immunofluorescence staining)을 수행하여 HaCaT 세포의 로리크린(loricrin, Lor)의 발현을 확인하였다. 로리크린은 표피층의 가장 위(cornified layer)에서 발현됨을 나타내는 지표이다. 또한 대비염색(counter stain)을 위해 DAPI를 추가로 라벨링 하였다. 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다. 관찰 결과, 각질층 부분에 로리크린의 발현이 증가함을 확인하여, 출력물의 HaCaT 세포가 분화하여 각질화가 진행됨을 확인하였다.

상기 실험예 1 내지 4에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 인공 피부조직은 기-액 계면 배양 이전에 액-액 계면 배양을 추가로 수행함으로써 표피층과 진피층이 잘 유지되며 표피층의 각질화를 촉진시켜 인간의 피부조직과 동일한 물성을 가질 수 있고, 세포 생존율이 90% 이상으로 나타나 인공 피부의 제작 분야에서 매우 유용하게 활용될 수 있음을 입증하였다.

실험예 5: PRP(platelet rich plasma, 다혈소판 혈장)를 전처리하는 단계에 따른 세포 생존율 및 증식률 확인

표준 수집 프로그램에 따라 백혈구제거 세트(COBE spectra LRS Turbo; Caridian BCT, Lakewood, CO, USA)를 갖는 혈소판분리반출 시스템을 이용하여 사람의 혈액으로부터 PRP를 수득하였다. 수득된 PRP에서의 혈소판 농도는 1,400 x 10³ platelet/㎕이었다.

상기 제조예의 '(1) 세포 배양' 단계에서 배양된 인체섬유아세포 및 인체각질세포를 상기 수득된 PRP에 분주한 뒤 10분간 부유시키는 단계인 전처리 단계를 수행한 뒤, 상기 제조예의 (2), (3) 단계 및 실험예 1에서와 동일하게 배양하는 단계를 거쳐 인공 피부조직을 제조하였다. 대조군으로는 PRP를 이용한 전처리 과정 없이 상기 제조예 및 실험예 1에서와 동일하게 제조된 인공 피부조직을 사용하였다.

위와 같이 제조된 인공 피부조직들에 대하여, LIVE/DEAD^® Viability/Cytotoxicity kit 및 Alamar blue^® assay kit(Thermo fisher)를 사용하여 각각 배양 0, 7, 14일 후 세포의 생존율(viability) 및 증식률(proliferation)을 측정하여 도 8과 같이 수치화하였다.

도 8의 (a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 세포에 PRP를 전처리하는 단계를 포함하여 제조한 인공 피부조직의 경우 세포 생존율이 더욱 뛰어나며 시간 흐름에 따라 세포가 현저하게 증식함을 확인하였다.

Claims

(a) 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양한 세포를 하이드로젤과 혼합하여 바이오 잉크 조성물을 제조하는 단계;
(c) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린팅하는 단계; 및
(d) 상기 삼차원 바이오 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 기-액 계면 배양(Air-Liquid Interface, ALI)으로 배양하는 단계를 포함하는, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서, 상기 기-액 계면 배양 이전에 액-액 계면 배양(Liquid-Liquid Interface, LLI)을 추가로 수행하는, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 젤라틴, 젤라틴 메타크릴레이트, 콜라겐, 알지네이트, 피브리노겐, 피브린, 히알루론산, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 엑스트라셀(Extracel™), 플루로닉(pluronic®)-F127, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 바이오 잉크 조성물은 웰 플레이트의 인서트에 삼차원 바이오 프린팅되는 것인, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 세포를 배양하는 단계 이후 혈소판 농축 혈장(Platelet-Rich Plasma; PRP)을 배양된 세포에 전처리하는 단계를 추가로 포함하는, 인공 피부조직의 제조방법.
제1항의 제조방법에 따라 제조된 인공 피부조직.
제7항에 있어서, 상기 인공 피부조직은 LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit으로 측정한 세포생존율이 90% 이상인, 인공 피부조직.