KR20230057939A - 중력을 이용하는 자성입자 기반 바이오칩 및 이를 이용한 분석물질 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자성입자를 이용하여 분석물질을 검출할 수 있는 바이오칩에 관한 것으로, 이 바이오칩은 중력에 의해 세척용액이 흘러가도록 함으로써 기기를 사용하지 않고도 세척 과정을 수행할 수 있는 특징을 가지고 있다.
Description
본 발명은 자성입자를 이용하여, 분석물질을 현장에서 간편하게 정량적으로 검사할 수 있는 바이오칩 및 이 바이오칩을 이용한 분석물질 검출 방법에 관한 것이다.
현장검사(point-of-care testing, POCT)는 시료를 분석 검사실로 가져가지 않고 현장에서 바로 검사하는 것이다. 현장검사를 위해서는 크고 복잡한 기기를 사용하지 않고 동물세포, 박테리아, 바이러스, 핵산, 단백질, 기타 유기물 또는 무기물과 같은 분석물질(analyte)을 검사할 수 있는 간단한 키트가 필요하며 특히 배터리와 같이 저전력을 이용하는 키트(low-powered kit)나 아예 전기를 사용하지 않는 무동력 방식의 키트(non-powered kit)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 현장검사는 숙련된 분석 기술자가 아닌 일반인이 쉽게 사용할 수 있을 정도로 작동이 쉽고 간단해야 하며 경제적이어야 한다.
현장검사를 위해 가장 널리 이용되고 있는 것은 임신진단에 사용되는 측면 흐름(lateral flow) 방식의 키트, 또는 혈당량 검사에 사용되는 전기화학 진단 키트 등이 있다. 그러나 이와 같이 작동이 쉽고 간단한 저전력 또는 무동력 키트는 검출 감도가 매우 낮고 대부분 정성적인 검사만 가능하다는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 형태의 랩온어칩(lab-on-a-chip)들도 개발되고 있지만 구조가 복잡하거나 감도가 낮거나, 또는 신뢰성이 낮은 문제점을 가지고 있다.
자성입자(magnetic particle)는 스스로는 자성이 없으나 자기장 가운데 있을 때는 자성을 갖는 입자로, 자석을 이용하여 쉽게 모을 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점 때문에 자성입자는 단백질 또는 핵산의 분리, 면역분석, 바이오센서 등에서 고체상(solid phase)으로 널리 사용되고 있다.
자성입자를 고체상으로 사용할 때는, 자석으로 자성입자를 모은 후 자성입자에 결합하지 않은 물질을 제거하는 세척 과정이 필요하다. 지금까지 분리 및 세척을 위해 주로 두 가지 방법이 사용되었다.
첫 번째는 시료가 든 튜브 외부에 자기장을 가하여 튜브 내벽에 자성입자를 모으고 피펫으로 튜브 내에 포함된 용매를 제거한다. 다음으로 자석을 제거한 상태에서 피펫으로 세척용액을 취하여 튜브에 넣어주면 자성입자들이 분산된다. 이 두 과정을 반복함으로써 자성입자의 세척이 이루어진다.
두 번째 방법으로는 플라스틱 플런저(plunger)를 씌운 자석을 시료에 담가 자성입자를 모은다. 다음으로 플런저가 씌워진 자석을 세척용액을 포함하는 다른 튜브로 옮긴 후 플런저로부터 자석을 빼내면 자성입자들이 분산된다. 이 과정을 반복함으로써 자성입자를 세척할 수 있다.
이 두 가지 방법 모두 손으로 수행할 경우에는 번거로울 뿐만 아니라 일정한 결과를 얻기 어렵다. 또한 이 두 가지 방법을 자동화된 장치에 적용할 경우 피펫(pipette)이나 자석을 이동시키는 액추에이터(actuator)들이 필요하기 때문에 장치가 커지고 가격이 비싸지는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 자성입자 세척장치 및 이를 이용한 자성입자 세척방법이 요구되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 고체상으로 사용되는 자성입자를 이동함으로써 분석물질을 검출하는 방법이 제시되었었다(등록특허 10-1398764, 10-1608598, 10-1811134). 이 방법에 의하면 액체상을 이동시키는 대신 자성입자를 이동시키기 때문에 기존의 랩온어칩에 비해 구조가 더 단순하고 분석을 수행하는 장치도 간단한 장점이 있었다. 그러나 여전히 자성입자를 일정하게 이동시키기 위해 전기로 작동되는 구동장치를 사용해야 하는 단점이 있었다.
본 발명은 자성입자를 사용하는 분석과정을 기기를 사용하지 않고 간편하게 수행할 수 있는 바이오칩과 이 바이오칩을 이용한 분석물질 검출 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 세척용액 주입구를 포함하는 세척용액 챔버(washing solution chamber); 외부로 열린 방출구(vent hole) 및 방출 채널(vent channel)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber); 및 시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber)를 포함하고, 상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물의 주입을 위한 시료 주입구, 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber)를 포함하며, 상기 포획입자는 분석물질(analyte)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인 자성입자 기반 바이오칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 시료 내 분석물질을 검출하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 시료를 포획입자(capture particle) 및 표지시약(labeling agent)과 혼합하는 단계; 상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계; 상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및 상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오칩은 단순하여 제작이 쉽고 경제적인 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이오칩은 기기를 사용하지 않고 자성입자를 세척할 수 있기 때문에 현장검사에 적용이 가능하다.
도 1(a) 및 도 1(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 도시한 도면이다.
도 2(a) 및 도 2(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 3(a) 내지 (c)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 4(a) 및 도 4(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 5(a) 및 도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이고, 도 5(c) 및 5(d)는 이에 따라 3D 프린터로 제작된 바이오칩의 사진이다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 이용하여 바이러스 모방 입자를 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8(a) 내지 (e)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 9(a) 및 도 9(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 설치되고 자석이 포함된 자성입자 기반 바이오칩의 사진이다.
도 10(a) 및 도 10(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 살모넬라균을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2(a) 및 도 2(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 3(a) 내지 (c)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 4(a) 및 도 4(b)는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면이다.
도 5(a) 및 도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이고, 도 5(c) 및 5(d)는 이에 따라 3D 프린터로 제작된 바이오칩의 사진이다.
도 6(a) 및 도 6(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 이용하여 바이러스 모방 입자를 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8(a) 내지 (e)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 구조를 도시한 도면이다.
도 9(a) 및 도 9(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 설치되고 자석이 포함된 자성입자 기반 바이오칩의 사진이다.
도 10(a) 및 도 10(b)는 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩의 자성입자 포집 효율과 세척 효율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 제작한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 살모넬라균을 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서는 기기를 사용하지 않고 간편하게 자성입자를 이용한 분석물질의 검출 과정을 수행하기 위해 중력을 이용하여 완충용액을 이동시키는 바이오칩을 고안하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩을 도시한 도면이다. 도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩(100)은 세척용액 주입구(111)를 포함하는 세척용액 챔버(washing solution chamber, 110); 외부로 열린 방출구(vent hole, 122) 및 방출 채널(vent channel, 121)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber, 120); 및 시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle, 미도시)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber, 130)를 포함하고, 상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물(미도시)의 주입을 위한 시료 주입구(131), 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet, 132), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet, 133)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber, 140)를 포함하며, 상기 포획입자는 분석물질(analyte, 미도시)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자성입자 기반 바이오칩은 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버를 포함하고, 상기 자석 챔버는 자석을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 자성입자 기반 바이오칩의 시료 챔버의 일면은 투명한 창(window, 150)을 포함할 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하는 검출 방법의 원리를 도시한 도면으로, 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 세웠을 때, 세척용액이 시료 챔버를 통해 폐기 챔버 측으로 이동하는 것을 특징으로 한다.
이와 같이 세척용액 챔버에 세척용액(washing solution)을 주입하고 세척용액 챔버가 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세우면 중력에 의해 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 이동하면서 시료 챔버에 포집된 포획입자(220)를 세척한다(도 2(b)). 즉 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하게 되는 것이다. 이때 용액 출구의 단면적을 조절함으로써 세척용액의 흐름 속도를 조절할 수 있다. 상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기로 설치될 수 있다.
본 발명에서 고안한 바이오칩에는 세척용액 챔버(110), 시료 챔버(130), 폐기 챔버(120)가 차례로 배열되어 있다(도 1(a)). 시료 챔버 하부에는 자석을 수용할 수 있는 자석 챔버(140)가 있고, 상기 시료 챔버는 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(132)를 포함하고, 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(133)를 포함한다(도 1(b)).
본 발명의 일 실시예에 따른 자성입자 기반 바이오칩은 자성입자를 이용하는 분석물질의 검출 방법에서 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체는 자성입자에 고정시킨 포획입자를 고체상으로 사용한다. 따라서 상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체를 자성입자에 고정시킨 입자이고, 상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있다. 즉 포획입자는 분석물질을 포획하여 다른 불순물들로부터 분리하는 역할을 하는 것이다.
본 발명에서 상기 분석물질(210)은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 자성입자에 고정되는 수용체는 상기 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체일 수 있다. 예를 들어, 상기 분석물질이 단백질, 유기 분자, 바이러스, 박테리아, 식물 세포 또는 동물 세포와 같이 항체가 형성될 수 있는 물질인 경우 각 분석물질에 대한 항체(antibody)를 수용체로 사용할 수 있다. 따라서, 분석물질이 항원일 경우 수용체는 항체가 될 수 있고, 반대로 분석물질이 항체일 경우 수용체는 항원이 될 수 있다. 다른 예로, 상기 분석물질이 렉틴(lectin)인 경우 탄수화물을 수용체로 사용할 수 있으며, 반대로 탄수화물을 포함하는 물질일 경우 상기 렉틴을 수용체로 사용할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 분석물질이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산일 경우에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 또는 PNA(peptide nucleic acid)를 수용체로 사용할 수 있다. 그 외에도 핵산으로부터 얻어지는 앱타머(aptamer), 펩티드 문고로부터 얻어지는 펩티드 리간드, affibody 문고로부터 얻어지는 단백질 리간드 등 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 모두 수용체로 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료 혼합물(134)은 분석물질의 검출 시 포획입자 및 분석물질을 혼합하여 반응시키는 물질로서, 표지시약을 추가로 포함할 수 있다(도 4).
본 발명에서 상기 표지시약(230)은 포획입자에 포획된 분석물질에 결합하여 분석물질의 양에 비례하는 신호를 생성하거나, 분석물질과 경쟁적으로 포획입자에 결합하여 분석물질의 양에 반비례하는 신호를 생성함으로써 분석물질을 정량적으로 검출할 수 있게 해준다(도 2).
또한, 표지물질을 포함하는 비자성 입자에 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 고정시킨 표지입자(labeling particle, 231)를 표지시약으로 사용할 수도 있다(도 4). 표지입자에는 많은 양의 표지물질이 포함될 수 있어서 더 강한 신호를 생성할 수 있는 장점이 있다.
상기 표지입자는 상기 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 입자로서, 박테리아와 같은 세포를 검출할 때 사용할 수 있는 분석시약이다. 상기 표지입자는 박테리아를 포함하는 시료 및 포획입자와 함께 혼합되면 상기 박테리아의 크기가 크기 때문에 한 개의 박테리아에 다수의 포획입자와 표지입자가 동시에 결합하게 될 수 있다.
상기 비자성 입자는 실리카 입자, 폴리스티렌 입자, 폴리카보네이트 입자, 덱스트란(dextran) 입자, 유리 입자, 알루미나 입자, 금 입자, 은 입자, 팔라듐 입자, 백금 입자, 티아니아 입자, 지르고늄 입자 및 코어-쉘(core-shell) 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
상기 표지시약은 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 표지입자(labeling particle), 상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체 및 상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나일 수 있다.
상기 수용체-표지 복합체는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체를 표지물질과 연결할 수 있다. 포획입자와 표지시약은 동일한 수용체를 사용할 수도 있고 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 다른 수용체를 사용할 수도 있다.
상기 수용체-표지 복합체는 단백질과 같은 고분자의 검출 방법인 샌드위치 면역분석법(sandwich immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 상기 수용체와 표지물질이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 이 방법으로 단백질을 검출하는 경우, 포획입자에는 다른 항체가 고정될 수 있고, 상기 포획입자에 고정되는 항체를 포획항체(capture antibody)라고 하고, 표지물질과 연결되는 항체를 검출항체(detection antibody)라고 부른다. 샌드위치 면역분석법에서는 포획입자에 고정된 포획항체에 분석물질이 결합되고 다시 그 분석물질에 항체-표지 복합체가 결합되어 분석물질을 중심으로 샌드위치를 형성하게 될 수 있다.
표지시약의 또 다른 예로는 분석물질을 표지물질(labeling material)과 연결한 분석물질-표지 복합체를 들 수 있다. 상기 분석물질-표지 복합체는 저분자 물질의 검출 방법인 경쟁적 면역분석법(competitive immunoassay)에서 사용할 수 있는 분석시약으로서, 분석물질에 표지물질(labeling material)이 연결되어 있는 복합체일 수 있다. 경쟁적 면역분석법에서는 시료에 있는 분석물질과 분석물질-표지 복합체가 포획입자에 경쟁적으로 결합하게 될 수 있다.
상기 표지물질은 흡광 성질, 형광 성질, 발광 성질, 방사성, 촉매 활성 등 측정 가능한 신호를 발생할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질로는 기질에 반응을 일으켜 흡광 성질 또는 형광 성질을 갖는 생성물을 만들어 내거나, 빛을 발생시키거나, 또는 기체를 발생시킬 수 있는 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 포스파타아제(phosphatase)와 같은 효소를 사용할 수 있다. 또한, 상기 표지물질로는 형광을 낼 수 있는 유기 형광 분자나 유로퓸 킬레이트(europium chelate)와 같은 형광 물질을 사용할 수 있다. 그 외에도 측정가능한 신호를 발생할 수 있는 물질은 모두 표지 물질로 사용할 수 있다.
본 발명에서 폐기 챔버에는 방출구(vent hole)를 통해 외부로 열린 방출 채널(vent channel)이 설치되어 있어 세척용액이 폐기 챔버로 이동할 때 압력이 걸리지 않고 원활하게 이동하게 해준다(도 1).
또한, 시료 챔버에 포집된 포획입자에 결합한 표지시약의 신호를 측정하여 분석물질을 검출할 수 있다. 색깔이나 형광과 같은 광학 신호의 측정이 가능하도록 시료 챔버의 상부에는 투명한 창을 포함할 수 있다.
세척용액 챔버 상부에는 세척용액 주입을 위한 세척용액 주입구(washing solution injection hole)를 포함할 수 있고, 시료 챔버 상부에는 시료 주입을 위한 시료 주입구(sample injection hole)를 포함할 수 있다(도 1).
상기 세척용액은 트리톤(Triton) X-100, Tween-20, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(NP-40)와 같은 계면 활성제를 포함시킬 수 있다.
도 3과 같이 시료 챔버를 자석 챔버의 상부에 설치하는 대신 자석 챔버의 하부에 설치할 수도 있다. 이 바이오칩은 구조는 좀 더 복잡하지만, 다음과 같은 두 가지 장점이 있다.
첫째, 시료 혼합물을 시료 챔버에 주입할 때 자기장과 중력이 서로 반대 방향으로 작용하기 때문에 자성입자가 포집되는 면에 불순물의 비특이적 흡착을 줄일 수 있다. 즉 물에 용해되지 않은 입자 상태의 불순물은 중력에 의해 밑에 가라앉고 포획입자에 결합한 물질들만 시료 챔버의 위쪽 면, 즉 자석이 설치된 면에 포집되기 때문이다.
둘째, 세척용액 챔버가 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세울 때 세척용액이 흘러가는 경로가 자성입자가 포집되는 면을 세척하는데 더 유리하다(도 4(a)). 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 바이오칩에서는 용액 입구로 들어간 세척용액이 일직선으로 진행하여 시료 챔버 상부를 지나가기 때문에 시료 챔버 바닥 면에 있는 불순물들은 확산에 의해 세척용액으로 이동해야 한다. 그러나 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치한 바이오칩에서는 세척용액의 방향이 꺾이면서 시료 챔버 전체를 휩쓸고 지나가게 된다(도 4(b)).
시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 있는 바이오칩에서는 시료 챔버의 아랫면에 광학 신호 측정을 위해 투명한 창을 설치할 수 있다(도 3(c)).
또한, 본 발명은 상기 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 시료 내 분석물질을 검출하는 분석물질의 검출방법에 관한 것으로, 일 실시예에서, 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계; 상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계; 상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및 상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법을 제공한다.
상기 분석물질의 검출방법은, 전술한 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 후술하는 검출장치 및 검출장치에 사용되는 분석물질, 포획입자, 표지시약 등의 물질들에 대한 구체적인 사항은 자성입자 기반 바이오칩(100)에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계에서 자석 챔버에 자석이 포함된 상태로 제작된 바이오칩에서 수행할 경우, 자석에 의해 포획입자가 포집되어 포획입자와 분석물질의 결합이 방해를 받을 수 있다. 따라서 상기 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계는 별도의 튜브에서 진행하고, 그 혼합물을 바이오칩에 주입하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거할 수 있다. 이때 포획입자는 시료 챔버 내에서 자석이 설치된 면에 포집된다(도 2(a)).
반면, 자석이 포함되지 않은 상태로 제작된 바이오칩에서는 상기 시료를 포획입자 및 표지시약과 혼합하는 단계부터 수행할 수 있다. 즉 분석물질이 포함된 시료, 포획입자 및 표지시약을 시료 챔버에 넣어 결합반응을 수행한 후, 자석 챔버에 자석을 삽입하여 포획입자를 포집할 수 있다.
시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 위치한 바이오칩에서 포획입자를 포집할 때, 시료 혼합물을 시료 챔버에 주입한 후 바이오칩을 뒤집어 주면, 자기장과 중력이 서로 반대 방향으로 작용하기 때문에 자성입자가 포집되는 면에 불순물의 비특이적 흡착을 줄일 수 있다. 또한, 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 위치하고 자석이 상부에 있는 상태에서는 물에 용해되지 않은 입자 상태의 불순물은 중력에 의해 밑에 가라앉고 포획입자에 결합한 물질들만 위쪽 면, 즉 자석이 설치된 면에 포집된다.
이와 같이 세척용액 챔버에 세척용액(washing solution)을 주입하고 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세우면 중력에 의해 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 이동하면서 시료 챔버에 포집된 포획입자를 세척한다(도 2(b)). 즉 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하게 되는 것이다. 이때 용액 출구의 단면적을 조절함으로써 세척용액의 흐름 속도를 조절할 수 있다. 상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기로 설치될 수 있다.
폐기 챔버에는 방출구(vent hole)를 통해 외부로 열린 방출 채널(vent channel)이 설치되어 있어 세척용액이 폐기 챔버로 이동할 때 압력이 걸리지 않고 원활하게 이동하게 해준다(도 1).
마지막으로 시료 챔버에 포집된 포획입자에 결합한 표지시약의 신호를 측정하는 단계를 수행함으로써 분석물질을 검출할 수 있다. 색깔이나 형광과 같은 광학 신호의 측정이 가능하도록 시료 챔버의 상부에는 투명한 창을 설치할 수 있다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 있는 바이오칩을 사용하여 바이러스 모방 입자 검출
본 실시예에서는 시료 챔버가 자석 챔버의 상부에 있는 바이오칩을 제작하여 바이러스 모방 입자를 검출하였다.
바이오칩의 본체는 Fusion360(Autodesk) 프로그램을 이용하여 설계한 후 3D 프린터로 제작했다. 도 5(a) 및 도 5(b)는 설계한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 도면이고, 도 5(c)와 도 5(d)는 3D 프린터로 제작한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 사진이다. 바이오칩의 윗면은 투명한 실리콘 테이프를 붙여 밀폐시켰다.
바이오칩의 포집 성능을 확인하기 위해 자성입자에 유로퓸(europium)으로 표지된 자성입자(Eu-MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)를 사용하였다. 튜브에서 PBS-TB(0.1% Tween-20, 0.25% BSA in PBS) 195 μL와 2 mg/mL Eu-MP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광을 측정하였다(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm). 측정이 끝난 후 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써 자성입자 포집 효율을 평가하였다. 그 결과 도 6(a)와 같이 세척 이후에 약 82%의 자성입자가 포집되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)와 자성이 없는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 바이오칩의 세척 효율을 평가하였다.
튜브에서 PBS-TB 190 μL, 2 mg/mL MP 5 μL(10 μg), 2 mg/mL Eu-FP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm)을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써, MP에 결합하지 않은 Eu-FP가 제거되는 효율을 평가하였다. 그 결과 도 6(b)와 같이 세척 이후에 97.7%의 Eu-FP가 제거된 것을 확인할 수 있었다.
바이러스 모방입자(virus-mimicking particle, VMP)는 카복실기로 기능화되어있는 실리카 나노입자(SNP, 직경 100 nm, Microspheres-Nanospheres, New York, NY, USA)에 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)를 이용해 토끼의 면역글로불린 G(IgG)를 고정시켜 제조하였다.
바이러스 모방입자를 포획할 수 있는 포획입자(VMP-CP)는 카복실기로 기능화되어있는 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)에 EDC를 이용해 염소에서 생성된 이차항체(anti-rabbit immunoglobulin G antibody)를 고정시켜 제조하였다.
바이러스 모방입자 검출에 사용할 표지입자(VMP-LP)는 카복실기로 기능화되어있는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 EDC를 이용해 염소에서 생성된 이차항체(anti-rabbit immunoglobulin G antibody)를 고정시켜 제조하였다.
위와 같이 제조한 세 종류 입자를 이용하여 바이오칩의 검출 효율을 평가하였다. VMP를 8.7×103∼107 개/mL의 농도로 묽혀주었다. 튜브에서 PBS-TB 90 μL, 2 mg/mL VMP-CP 5 μL(10 μg), VMP-LP 5 μL(10 μg), 서로 다른 농도로 묽힌 VMP 100 μL를 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 음성 대조군은 VMP 대신 PBS-TB 100 μL를 주입하여 반응시켰다. 반응물을 바이오칩의 시료 챔버에 넣고 시료 주입구를 테이프로 막은 후. 바이오칩을 뒤집은 상태에서 2분간 포획입자를 포집하였다.
바이오칩을 다시 뒤집어 PBS-T 4.5 mL를 세척용액 챔버에 넣고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척이 끝난 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 시료 챔버에 남아있는 VMP-LP의 형광을 측정하였다. 그 결과 도 7과 같이 8.7×103∼107 개/mL 구간에서 VMP 수에 비례하여 형광이 증가하였고 최저 검출 한계(LOD)는 11개였다.
실시예 2. 시료 챔버가 자석 챔버의 하부에 있는 바이오칩을 사용하여 살모넬라균 검출
본 실시예에서는 시료 챔버가 자석챔버의 하부에 있는 바이오칩을 제작하여 살모넬라균을 검출하였다.
바이오칩의 본체는 Fusion360(Autodesk) 프로그램을 이용하여 설계한 후 3D 프린터로 제작했다. 도 8(a) 및 도 8(b)는 설계한 바이오칩 본체에 자석 챔버 모듈을 삽입하기 전과 삽입한 후의 도면이고, 도 8(c)는 바이오 칩 윗면에 투명한 실리콘 테이프를 붙여 밀폐시킨 도면이며, 도 8(d)는 바이오칩을 뒤집었을 때의 도면, 도 8(e)는 뒤집어진 바이오칩에 창을 설치한 도면이다. 도 9(a) 및 도 9(b)는 3D 프린터로 제작하여 자석을 삽입한 바이오칩을 바르게 눕혔을 때와 뒤집었을 때의 사진이다.
바이오칩의 포집 성능을 확인하기 위해 자성입자에 유로퓸(europium)으로 표지된 자성입자(Eu-MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)를 사용하였다. 튜브에서 PBS-TB 195 μL와 2 mg/mL Eu-MP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광(excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 620 nm)을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T(0.1% Tween-20 in PBS) 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써 자성입자 포집 효율을 평가하였다. 그 결과 도 10(a)와 같이 세척 이후에 100%의 자성입자가 포집되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)와 자성이 없는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 바이오칩의 세척 효율을 평가하였다.
튜브에서 PBS-TB 190 μL, 2 mg/mL MP 5 μL(10 μg), 2 mg/mL Eu-FP 5 μL(10 μg)를 혼합한 후 자석이 설치된 바이오칩의 시료 챔버에 주입하고 5분간 포집하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 포집된 Eu-MP의 형광을 측정한 후, 세척용액 챔버에 PBS-T 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다. 세척 이후 시료 챔버에 남아있는 형광을 측정하여 세척 이전의 형광 값과 비교함으로써, MP에 결합하지 않은 Eu-FP가 제거되는 효율을 평가하였다. 그 결과 도 10(b)와 같이 세척 이후에 99% 이상의 Eu-FP가 제거된 것을 확인할 수 있었다.
살모넬라균을 포획할 수 있는 포획입자(ST-CP)는 카복실기로 기능화 되어있는 자성입자(MP, 직경 300 nm, Amo Lifescience, Korea)에 EDC를 이용해 토끼에서 생성된 살모넬라균 항체(anti-S. typhimurium antibody)를 고정시켜 제조하였다.
살모넬라균 검출에 사용할 표지입자(ST-LP)는 카복실기로 기능화 되어있는 유로퓸(Europium) 형광 입자(Eu-FP, 직경 300 nm, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 EDC를 이용해 토끼에서 생성된 살모넬라균 항체(anti-S. typhimurium antibody)를 고정시켜 제조하였다.
위와 같이 제조한 입자들을 이용하여 바이오칩에서 살모넬라균 검출 효율을 평가하였다. 살모넬라균은 102∼107 CFU/mL의 농도로 묽혀주었다. 튜브에서 PBS-TB 90 μL, 2 mg/mL ST-CP 5 μL(10 μg), ST-LP 5 μL(10 μg), 서로 다른 농도로 묽힌 살모넬라균 100 μL를 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 음성 대조군은 살모넬라균 대신 PBS-TB 100 μL를 주입하여 반응시켰다. 반응물을 바이오칩의 시료 챔버에 넣고 2분간 포획입자를 포집하였다. 세척용액 챔버에 PBS-T 4.5 mL을 주입하고, 세척용액 챔버가 위를 향하도록 바이오칩을 세워서 PBS-T가 폐기 챔버로 흘러가게 하였다.
세척이 끝난 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 시료 챔버에 남아있는 ST-LP의 형광을 측정하였다. 그 결과 도 11과 같이 102∼107 CFU/mL 구간에서 살모넬라 수에 비례하여 형광이 증가하였고 최저 검출 한계(LOD)는 2.6 CFU였다.
100: 자성입자 기반 바이오칩
110: 세척용액 챔버
111: 세척용액 주입구 112: 세척 용액
120: 폐기 챔버 121: 방출 채널
122: 방출구 130: 시료 챔버
131: 시료 주입구 132: 용액 입구
133: 용액 출구 134: 시료 혼합물
140: 자석 챔버 141: 자석
150: 창 160: 커버
210: 분석물질 220: 포획입자
230: 표지시약 231: 표지입자
111: 세척용액 주입구 112: 세척 용액
120: 폐기 챔버 121: 방출 채널
122: 방출구 130: 시료 챔버
131: 시료 주입구 132: 용액 입구
133: 용액 출구 134: 시료 혼합물
140: 자석 챔버 141: 자석
150: 창 160: 커버
210: 분석물질 220: 포획입자
230: 표지시약 231: 표지입자
Claims (13)
- 세척용액 주입구를 포함하는 세척용액 챔버(washing solution chamber);
외부로 열린 방출구(vent hole) 및 방출 채널(vent channel)을 포함하는 폐기 챔버(waste chamber); 및
시료 및 자성을 띄는 포획입자(capture particle)를 수용하기 위한 시료 챔버(sample chamber)를 포함하고,
상기 시료 챔버는 세척용액 챔버와 폐기 챔버 사이에 위치하며, 상기 포획입자를 포함하는 시료 혼합물의 주입을 위한 시료 주입구, 상기 세척용액 챔버로 연결되는 용액 입구(solution inlet), 및 상기 폐기 챔버로 연결되는 용액 출구(solution outlet)를 포함하고, 상기 시료 챔버의 하부 또는 상부에 자석 챔버(magnet chamber)를 포함하며,
상기 포획입자는 분석물질(analyte)과 특이적으로 결합하는 수용체(receptor)를 자성입자(magnetic particle)에 고정시킨 입자인, 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 세웠을 때, 세척용액이 시료 챔버를 통해 폐기챔버 측으로 이동하는 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 용액 출구는 단면적 1 mm2 이하의 크기인, 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 자석 챔버에 자석이 설치되어 있는 것을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 분석물질은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체(receptor)를 자성입자에 고정시킨 입자이고,
상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있는 것인, 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 시료 혼합물은 표지시약을 추가로 포함하는 것인, 자성입자 기반 바이오칩.
- 제7항에 있어서,
상기 표지시약은 분석물질과 특이적으로 결합하는 수용체와 표지물질을 비자성 입자에 고정시킨 표지입자,
상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체, 및
상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나이고,
상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사성 물질을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 있어서,
상기 시료 챔버의 일면은 투명한 창(window)을 포함하는 자성입자 기반 바이오칩.
- 제1항에 따른 자성입자 기반 바이오칩을 이용하여 시료 내 분석물질을 검출하는 분석물질의 검출방법에 관한 것으로,
시료를 포획입자(capture particle) 및 표지시약(labeling agent)과 혼합하는 단계;
상기 혼합물과 세척용액을 각각 바이오칩의 시료 챔버와 세척용액 챔버에 주입하는 단계;
상기 세척용액 챔버를 폐기 챔버보다 위로 향하도록 바이오칩을 세워 세척용액이 시료 챔버를 거쳐 폐기 챔버로 흘러가도록 하여 포획입자에 결합하지 않은 물질들을 제거하는 단계; 및
상기 시료 챔버에 남아있는 표지시약의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
- 제10항에 있어서,
상기 분석물질은 세포, 바이러스, 박테리아, 단백질, 핵산, 탄수화물, 유기분자, 및 금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
- 제10항에 있어서,
상기 포획입자는 분석물질에 대한 수용체를 자성입자에 고정시킨 입자이고,
상기 수용체는 분석물질과 직접 결합할 수 있는 것인 시료 내 분석물질의 검출방법.
- 제10항에 있어서,
상기 표지시약은 표지물질(labeling material)과 분석물질에 대한 수용체를 비자성 입자에 고정시킨 표지입자,
상기 수용체와 표지물질이 연결된 수용체-표지 복합체, 및
상기 표지물질과 분석물질이 연결된 분석물질-표지 복합체 중 선택된 하나이고,
상기 표지물질은 효소, 형광물질 또는 방사성 물질을 포함하는 시료 내 분석물질의 검출방법.
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| KR101398764B1 (ko) | 2013-08-29 | 2014-05-27 | 강릉원주대학교산학협력단 | 입자의 이동에 의해 분석물질을 검출하는 장치 및 방법 |
| KR101608598B1 (ko) | 2014-11-20 | 2016-04-04 | 강릉원주대학교산학협력단 | 정지 액체상 랩온어칩 |
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