KR20230038477A

KR20230038477A - 유산균 및 그 취득 방법과 유산균 함유 음식품

Info

Publication number: KR20230038477A
Application number: KR1020237001266A
Authority: KR
Inventors: 토모아키 코우야; 요헤이 이시야마
Original assignee: 도쿠리츠교세이호징 고쿠리츠코토센몬갓코키코; 가부시키가이샤 미야토우 야소우 겐큐쇼
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2023-03-20
Also published as: TWI849293B; CN115836121B; TW202214838A; CN115836121A; WO2022079929A1

Abstract

저pH이면서 고슈크로스 환경 하에서 양호하게 생육하는 유산균을 제공한다. 수탁 번호： NITE　BP－03116(식별의 표시： WR16－4)으로 기탁되어 있는 락토바실루스속에 속하는 종(Lactobacillus sp.)인 유산균.

Description

유산균 및 그 취득 방법과 유산균 함유 음식품

본 발명은, 신규한 유산균 및 그 취득 방법과 상기 유산균을 함유하는 유산균 함유 음식품에 관한 것이다.

일반적인 유산균의 최적 생육 pH 영역은 pH6∼7이고, 산성 영역에서의 생육 한계치는 pH4, 알칼리성 영역에서의 생육 한계치는 pH8이라고 말해지고 있다. 그렇지만, 유산균 중에는 우수한 내산성을 가지고, 일반적인 유산균에서는 생육이 어려운 가혹한 환경 하(pH3 전후)에서도 생육 가능한 것도 있다(예를 들어 특허문헌 1, 2).

또, 된장이나 간장 등의 염분 농도가 높은 환경 하에서도 생육이 가능한 우수한 내염성을 가지는 유산균도 있다(예를 들어 특허문헌 3, 4).

이와 같이 유산균 중에는 가혹한 환경 하에서도 생육 가능한 것이 많이 존재하지만, 저pH(고산성)이면서 고슈크로스 농도라고 하는 가혹한 환경 하에서 양호하게 생육할 수 있는 유산균의 존재에 대하여는 본 출원인이 아는 한 지금까지 보고되어 있지 않다.

그래서, 본 출원인은, 이와 같은 유산균의 존재에 의해, 예를 들어 식물과 당을 혼합하고 압착해서 얻어지는 액(液)이나 이 액을 기초로 한 음료, 혹은 잼, 과일소스(fruit sauce) 등의 산성 값 및 슈크로스 농도가 높고, 일반적인 유산균에서는 발효가 어려운 소재를 용이하게 발효시킬 수 있어, 새로운 발효 식품이나 발효 음료의 제공이 가능해진다고 생각하며, 상술한 바와 같은 저pH 환경이면서 고슈크로스 환경 하에서 양호하게 생육할 수 있는 유산균에 대하여 연구를 진행시켜, 마침내 저pH이면서 고슈크로스 농도라고 하는 가혹한 환경 하에서 양호하게 생육할 수 있는 유산균의 취득에 성공했다.

일본특허공개 특개2009－225792호 공보 국제공개 WO2013/001862호 공보 일본특허공개 특개2007－236344호 공보 일본특허공개 특개2018－42557호 공보

본 발명은, 저pH이면서 고슈크로스 환경 하에서 양호하게 생육할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

첨부 도면을 참조해서 본 발명의 요지를 설명한다.

수탁 번호： NITE　BP－03116(식별의 표시： WR16－4)으로 기탁되어 있는 락토바실루스속에 속하는 종(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 기재의 유산균에 있어서, 상기 유산균은 서열(Sequence) 번호 1로 나타내어지는 16S rDNA 영역의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 기재의 유산균에 있어서, 식물 발효 엑기스로부터 취득된 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 2 기재의 유산균에 있어서, 식물 발효 엑기스로부터 취득된 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 3 기재의 유산균에 있어서, 상기 식물 발효 엑기스는 무(大根) 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 4 기재의 유산균에 있어서, 상기 식물 발효 엑기스는 무 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 5 기재의 유산균에 있어서, 상기 무 발효 엑기스는 무, 정백당(上白糖) 및 균액을 혼합하여 발효시킨 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 6 기재의 유산균에 있어서, 상기 무 발효 엑기스는 무, 정백당 및 균액을 혼합하여 발효시킨 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 7 기재의 유산균에 있어서, 상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 8 기재의 유산균에 있어서, 상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 유산균에 있어서, pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 슈크로스 농도 30∼60 wt%의 고농도 슈크로스 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 유산균에 있어서, pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 프럭토스 농도 및 글루코스 농도가 각각 10∼30 wt%인 프럭토스·글루코스 고농도 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 유산균에 있어서, pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 슈크로스 농도 30∼60 wt%의 고농도 슈크로스 환경 하에서도 증식하며, 또한 pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 프럭토스 농도 및 글루코스 농도가 각각 10∼30 wt%인 프럭토스·글루코스 고농도 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균에 관계된 것이다.

또, 멸균한 액체 배지(培地)에 식물 발효 엑기스를 더해서 배양액을 얻고, 계속해서, 이 배양액을 집적 배양해서 집적 배양액을 얻고, 계속해서, 이 집적 배양액을 멸균한 분리용 배지와 혼석(混釋)해서 평판 배지를 작성하고, 계속해서, 이 평판 배지에 출현한 콜로니를 조균(釣菌)해서 저pH 환경이면서 고농도 슈크로스 환경 하에서 증식 가능한 유산균을 취득하는 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법에 관계된 것이다.

또, 청구항 14 기재의 유산균의 취득 방법에 있어서, 상기 식물 발효 엑기스는, 무와 정백당과 균액을 혼합하여 발효시킨 무 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법에 관계된 것이다.

또, 청구항 15 기재의 유산균의 취득 방법에 있어서, 상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법에 관계된 것이다.

또, 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 기재된 유산균의 취득 방법에 있어서, 상기 액체 배지는, 야채 발효 엑기스 및 과일 발효 엑기스의 어느 한쪽 혹은 쌍방을 이용해서 얻어진 혼합 발효 엑기스와, 들풀 우려낸 액체(野草煮出液)와 정백당을 혼합해서 얻어진 야채·정백당 혼합액을 혼합한 것에 항생 물질을 첨가한 것인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법에 관계된 것이다.

또, 청구항 17 기재의 유산균의 취득 방법에 있어서, 상기 항생 물질은 사이클로헥시미드인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법에 관계된 것이다.

또, 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 11 기재의 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 12 기재의 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 13 기재의 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 19 기재의 유산균 함유 음식품에 있어서, 상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 20 기재의 유산균 함유 음식품에 있어서, 상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 21 기재의 유산균 함유 음식품에 있어서, 상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

또, 청구항 22 기재의 유산균 함유 음식품에 있어서, 상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품에 관계된 것이다.

본 발명의 유산균은, 저pH이면서 고슈크로스 환경 하에서 우위로 생육(증식)하기 때문에, 예를 들어, 식물과 당을 혼합하고 압착해서 얻어지는 액이나 이 액을 기초로 한 음료, 혹은 잼, 과일소스 등의 산성 값 및 슈크로스 농도가 높고, 일반적인 유산균에서는 발효가 어려운 소재를 용이하게 발효시킬 수 있어, 새로운 발효 식품이나 발효 음료의 제공이 가능해진다.

도 1은, 본 실시예에 있어서의 Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T의 pH 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 본 실시예에 있어서의 Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007의 pH 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 본 실시예에 있어서의 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T의 pH 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 본 실시예에 있어서의 WR16－4주(株)의 pH 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 본 실시예에 있어서의 Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T의 슈크로스 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 본 실시예에 있어서의 Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007의 슈크로스 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 본 실시예에 있어서의 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T의 슈크로스 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은, 본 실시예에 있어서의 WR16－4주의 슈크로스 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는, 본 실시예의 슈크로스 내성 시험에 있어서의 MRS 배지의 조성을 나타내는 표이다.
도 10은, 본 실시예의 프럭토스·글루코스 내성 시험에 있어서의 MRS 배지의 조성을 나타내는 표이다.
도 11은, 본 실시예에 있어서의 WR16－4주의 프럭토스·글루코스 내성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 본 발명의 유전자 데이터베이스(NCBI)에 있어서의 상동성(相同性) 검색 결과를 나타내는 데이터 일람표이다.

호적하다고 생각하는 본 발명의 실시형태를, 도면에 기초하여 본 발명의 작용을 나타내어 간단하게 설명한다.

본 발명의 유산균은, 락토바실루스속에 속하는 종(Lactobacillus sp.)이고, 수탁 번호： NITE　BP－03116(식별의 표시： WR16－4)으로 기탁되어 있다.

본 발명의 유산균으로부터 얻어진 서열 데이터(16S rDNA 서열)를 기초로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 유전자 데이터베이스에서 상동성 검색을 행한 결과, 상기 서열과 상동성이 가장 높았던 것에서 93%이고(도 12 참조), 이 결과로부터 본 발명의 유산균은 종래에 없던 신종의 유산균(락토바실루스속에 속하는 종)이라고 말할 수 있다.

본 발명의 유산균은, 일반적인 유산균의 최적 생육 환경으로 되는 pH6∼7에서는 생육하기 어렵고, 이것보다도 낮은 pH(예를 들어 pH3.5∼5.5)의 환경 하에서 양호하게 생육하는 특징을 가진다.

또한, 본 발명의 유산균은, 일반적인 유산균에서는 생육하기 어려운 저pH(예를 들어 pH5 이하)이면서 고슈크로스(예를 들어 30 wt% 이상) 환경 하에서도 양호하게 생육하는 특징을 가진다.

이와 같이, 본 발명의 유산균은, 저pH이면서 고슈크로스 환경 하에서 우위로 증식하는 특징을 가지기 때문에, 예를 들어, 식물과 당을 혼합하고 압착해서 얻어지는 액이나 이 액을 기초로 한 음료, 혹은 잼, 과일소스 등의 산성 값 및 슈크로스 농도가 높고, 일반적인 유산균에서는 발효가 어려운 소재를 용이하게 발효시킬 수 있는 것으로 된다.

실시예

본 발명의 구체적인 실시예에 대하여 도면에 기초하여 설명한다.

본 실시예의 유산균은, 서열 번호 1로 나타내는 16S rDNA 영역의 염기 서열(鹽基配列)을 가지고, 수탁 번호： NITE　BP－03116(식별의 표시： WR16－4)으로 기탁되어 있는 락토바실루스속에 속하는 종(Lactobacillus sp.)의 유산균이다.

본 실시예의 유산균은, 세포 형태가 단간상(短桿狀)이고, 또, 콜로니의 상태에서는 백색을 띠고 있으며, 균체외 다당(exopolysaccharides)(점성 물질)을 생산한다.

이하, 본 실시예의 유산균(이하, WR16－4주(株)라고 한다.)에 대하여 상세하게 기술한다.

＜WR16－4주의 균종에 대하여＞

WR16－4주의 16S rDNA 데이터를 기초로 미생물 동정(同定) 검사를 행하고, WR16－4주의 균종에 대하여 조사했다. 한편, 미생물 동정 검사는 주식회사 파스막크(FASMAC)에 의뢰했다.

미생물 동정 검사의 결과, 가장 높은 상동치(相同値)를 나타낸 균종은, Lactobacillus kefiri(ATCC=35441)였다(상동치 93.14%).

＜WR16－4주의 신규성에 대하여＞

WR16－4주의 16S rDNA 데이터를 기초로 NCBI의 유전자 데이터베이스에서 상동성 검색을 행하고, WR16－4주의 신규성에 대하여 조사했다.

도 12는 이 상동성 검색에 있어서 샘플 유래 서열과 높은 상동성을 나타낸 데이터의 일람표이다. 이 도 12에 나타내는 바와 같이, 이 WR16－4주와 상동성이 가장 높았던 것에서도 93% 정도였다. 일반적으로, 상동치가 98.7% 이상인 종(種)이 없는 경우는, 신종이라고 판단된다는 점에서, 이 WR16－4주는 신규한(신종의) 유산균이라고 말할 수 있다.

＜WR16－4주의 분리원＞

WR16－4주는 식물 발효 엑기스, 구체적으로는, 무 발효 엑기스를 분리원으로 하는 것이다.

분리원이 되는 무 발효 엑기스는, 무, 정백당(상백당, 백설탕) 및 균액을 혼합하여 발효시킨 것이고, 구체적으로는, 자른(재단한) 무와, 이 무와 같은 양의 정백당을 혼합하고, 이것에 효모균을 발효시킨 후, 압착해서 얻어진 액분(液分)을 더욱 발효, 숙성시킨 것이다. 한편, 분리원이 되는 식물은 무 이외의 야채(채소)라도 된다.

＜WR16－4주의 분리 방법＞

WR16－4주는, 상기 무 발효 엑기스로부터 분리할 때, 일반적인 유산균의 분리 방법으로는 분리할 수 없고, 본 출원인이 찾아낸 이하의 분리 방법에 의해 분리할 수가 있다.

(1) 습식 멸균(121℃, 15분)한 액체 배지(培地) 10 ㎖에 상기한 무 발효 엑기스 80 ㎕를 더하고, 25℃에서 6일간 보온해서 배양액을 얻는다.

(2) 얻어진 배양액 80 ㎕를 상기한 액체 배지 10 ㎖에 더하고, 다시 25℃에서 3∼4일간 보온해서 배양액을 얻는다.

(3) 상기 2의 처리를 수회(여러 번)(본 실시예에서는 8회) 반복하는 집적 배양을 행하여, 집적 배양액을 얻는다.

(4) 얻어진 집적 배양액 1 ㎖를 습식 멸균(121℃, 15분)한 분리용 배지 15 ml와 혼석(混釋)한 후, 냉각 고화해서 평판을 작성한다.

(5) 이 평판을 25℃에서 10일간 보온한다.

(6) 상기 평판에 출현한 콜로니를 조균(釣菌)함으로써, WR16－4주가 얻어진다.

한편, 상기 액체 배지는, 야채(채소) 발효 엑기스 및 과일 발효 엑기스의 어느 한쪽 혹은 쌍방을 이용해서 얻어진 혼합 발효 엑기스와, 들풀(야초) 우려낸 액체와 정백당을 혼합해서 얻어진 들풀·정백당 혼합액을 혼합한 것에 항생 물질을 첨가한 것, 구체적으로는, 상기한 혼합 발효 엑기스와, 복수의 들풀류 우려낸 액체에 정백당을 1：1로 혼합해서 얻은 들풀·정백당 혼합액과, 1 g/L 사이클로헥시미드(cycloheximide) 용액을, 10：90：1로 혼합한 혼합액이다.

또, 상기 분리용 배지는, 아래 표에 나타내는 배지A 및 배지B를 습식 멸균하고 혼합한 것이다.

배지A		배지B
MRS 브로스	5.5 g	슈크로스	10 g
혼합 발효 엑기스	10 ㎖	한천	1.4 g
순수(純水)	50 ㎖	순수	50 ㎖

상기 분리 방법에 의해 취득한 WR16－4주의 특성을 확인하기 위해, 일반적인 유산균을 이용하고, 이것들과의 비교에 의한 pH 내성 시험 및 슈크로스 내성 시험을 행했다.

구체적으로는, WR16－4주의 비교 대상의 유산균으로서, 유산균 중에서는 널리 알려져 있는 속에 속하는 종이고, 일반적인 유산균과 마찬가지로, 최적 생육 pH 영역을 pH6∼7로 하는, 락토바실루스(Lactobacillus)속의 Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T, 락토코커스(Lactococcus)속의 Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007, 류코노스톡(Leuconostoc)속의 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T의 3종의 유산균을 이용했다.

＜각 유산균의 전배양(前培養)＞

상기 2종의 내성 시험을 행함에 있어서, 각 유산균에 대해서 이하와 같은 전배양을 행했다.

(1) 도 9에 나타내는 MRS 배지를 2배 농축으로 조정했다. 이 때, 4N 수산화 소듐(나트륨) 용액 또는 4N 염산을 첨가하는 것에 의해, WR16－4주용의 것은 pH4.5로, 비교 대상용의 것은 pH6.5로 조정했다.

(2) 4 wt% 슈크로스 용액 또는 4 wt% 글루코스 용액을 조정했다.

(3) 상기 (1), (2)에 대하여, 각각 오토클레이브를 이용한 습열 멸균(121℃, 20분)을 행했다.

(4) 습열 멸균한 (1) 및 (2)의 용액을 냉각한 후, 클린 벤치 내에서 1：1(v/v)로 되도록 혼합하고, 2 wt% 슈크로스 함유 MRS 배지(pH4.5) 또는 2 wt% 글루코스 함유 MRS 배지(pH6.5)를 조정했다.

(5) WR16－4주는 2 wt% 슈크로스 함유 MRS 배지(pH4.5), 비교 대상용은 2 wt% 글루코스 함유 MRS 배지(pH6.5)를 이용하고, 30℃에서 24∼48시간의 혐기 조건(嫌氣條件)에서 행했다.

＜pH 내성 시험＞

전배양한 각 유산균의 pH 내성 시험을 이하와 같이 해서 행했다.

(1) 도 9에 나타내는 MRS 배지를 2배 농축으로 조정했다. 이 때, 4N 수산화 소듐(나트륨) 용액 또는 4N 염산을 첨가하는 것에 의해, pH3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5로 조정했다.

(2) 4 wt% 슈크로스 용액을 조정했다.

(4) 습열 멸균한 (1) 및 (2)의 용액을 냉각한 후, 클린 벤치 내에서 1：1(v/v)로 되도록 혼합하고, 2 wt% 슈크로스 함유 MRS 배지(pH3∼6.5)를 조정했다.

(5) 전배양한 각 유산균주를 원심분리(15,000×g, 10분)해서 상청(上淸)을 없앤 후, (3)에서 조정한 배지에 초기 농도가 A_660nm≒0.05∼0.10으로 되도록 재현탁했다.

(6) 96홀(穴) 마이크로 플레이트에 200 ㎕/well로 되도록, 각 3 well씩 분주(分注)한 후(n=3), 30℃, 혐기 조건에서 배양했다.

(7) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 경시적으로 탁도 측정을 행했다.

도 1 내지 도 3은 비교 대상용(Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T(도 1), Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007(도 2), Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T(도 3))의 유산균의 탁도 측정 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4는 WR16－4주의 탁도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 2 wt% 슈크로스를 탄소원으로 한 pH 내성 시험에 있어서는, 각 유산균의 탁도 측정 결과에 나타내어지는 바와 같이, 비교 대상용의 유산균은 pH5∼6.5의 중성에 가까운 산성 영역에서 생육이 양호했던 것에 비하여, WR16－4주는 이 유산균들이 양호하게 생육하는 영역보다도 더욱 산성측의 영역, 구체적으로는, pH3.5∼5의 저pH 영역에서 생육하고, 이것으로부터 pH가 높은 중성에 가까운 영역에서는 거의 생육하지 않는다는 것이 확인되었다.

＜슈크로스 내성 시험＞

전배양한 각 유산균의 슈크로스 내성 시험을 이하와 같이 해서 행했다.

(1) 슈크로스를 첨가한 도 9에 나타내는 MRS 배지를, 슈크로스 농도가 5 wt%, 10 wt%, 20 wt%, 30 wt%, 40 wt%, 50 wt%, 60 wt%, 70 wt%로 되도록 조정한 후, 각각에 대해서 4N 염산을 첨가해서 pH4.5로 되도록 조정했다.

(2) 상기 (1)에 대하여, 각각 오토클레이브를 이용한 습열 멸균(121℃, 20분)을 행했다.

(3) 전배양한 각 유산균주를 원심분리(15,000×g, 10분)해서 상청(상층액)을 없앤 후, (2)에서 조정한 배지에 초기 농도가 A_660nm≒0.05∼0.10으로 되도록 재현탁했다.

(4) 96홀(穴) 마이크로 플레이트에 200 ㎕/well로 되도록, 각 3 well씩 분주한 후(n=3), 30℃, 혐기 조건에서 배양했다.

(5) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 경시적으로 탁도 측정을 행했다.

도 5 내지 도 8은 비교 대상용(Lactobacillus acidophilus JCM 1132^T(도 5), Lactococcus lactis subsp. lactis NBRC12007(도 6), Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495^T(도 7))의 유산균의 탁도 측정 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8은 WR16－4주의 탁도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 초기 pH4.5의 산성 조건 하에서의 슈크로스 내성 시험에 있어서는, 각 유산균의 탁도 측정 결과에 나타내어지는 바와 같이, 비교 대상용의 유산균은 슈크로스 농도가 20 wt% 이하에서의 생육이 확인되었지만 그 생육 상태(증식율)는 낮고, 30 wt% 이상의 고슈크로스 환경에서는 거의 생육할 수 없는 결과였던 것에 비하여, WR16－4주는 슈크로스 농도 40 wt% 정도까지는 양호한 생육 상태를 나타내고, 60 wt%의 고슈크로스 환경에서도 생육하는 것이 확인되었다.

＜프럭토스·글루코스 내성 시험＞

슈크로스는, 단당(單糖)의 프럭토스와 글루코스가 결합한 이당류(二糖類)이고, WR16－4주는 상기와 같이 고슈크로스 환경에서 생육 가능한 것이 확인되었다는 점에서, 프럭토스 및 글루코스가 각각 단당 상태로 존재하는 프럭토스·글루코스 고농도 환경 하에서도, 슈크로스의 경우와 마찬가지로 생육 가능하지는 않을까 생각하고, 상기 슈크로스 내성 시험과 마찬가지로, 프럭토스·글루코스 내성 시험을 이하와 같이 해서 행했다.

(1) 슈크로스, 프럭토스, 글루코스의 당을 각각 단독으로 첨가한 도 10에 나타내는 MRS 배지를, 각각 당 농도가 20 wt%로 되도록 조정한 후, 각각에 대해서 4N 염산을 첨가해서 pH4.5로 되도록 조정했다.

(2) 별도로, 프럭토스 및 글루코스를 첨가한 도 10에 나타내는 MRS 배지를, 프럭토스, 글루코스 각각의 당 농도가 10 wt%(합계로 20 wt%)로 되도록 조정한 후, 각각에 대해서 4N 염산을 첨가해서 pH4.5로 되도록 조정했다.

(4) 전배양한 WR16－4주를 원심분리(15,000×g, 10분)해서 상청(상층액)을 없앤 후, 조정한 배지에 초기 농도가 A_660nm≒0.05∼0.10으로 되도록 재현탁했다.

(5) 96홀 마이크로 플레이트에 200 ㎕/well로 되도록, 각 3 well씩 분주한 후(n=3), 30℃, 혐기 조건에서 배양했다.

(6) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 경시적으로 탁도 측정을 행했다.

이 초기 pH4.5의 산성 조건 하에서의 프럭토스·글루코스 내성 시험에 있어서의 상기 탁도 측정의 결과를 도 11에 나타낸다.

이 도 11에 나타내어지는 바와 같이, WR16－4주는, 프럭토스, 글루코스의 어느 하나가 단독으로 포함되어 있는 경우는 증식율이 낮지만(저생육 상태이지만), 프럭토스, 글루코스가 둘 다(양쪽) 포함되는 경우는, 슈크로스를 포함하는 경우와 마찬가지로, 증식율이 높아지고(고생육 상태로 되고), 이 결과로부터, WR16－4주는, 슈크로스 내성 뿐만 아니라, 프럭토스·글루코스 내성도 가진다는 것이 확인되었다.

또, 전술한 바와 같이 슈크로스는 프럭토스와 글루코스가 결합한 이당류라는 점에서, WR16－4주는, 슈크로스의 경우와 마찬가지로, 예를 들어, 프럭토스와 글루코스를 각각 30 wt%씩 포함하는(당 농도의 합계가 60 wt%) 고당(高糖) 농도 환경에서도 충분히 생육 가능하다고 생각한다.

＜WR16－4주의 용도＞

WR16－4주는 유산균 함유 음식품, 구체적으로는, 발효 음식품에 이용할 수가 있다.

WR16－4주는, 상술한 바와 같이, 저pH이면서 고슈크로스 환경 하에서 우위로 증식하는 특징을 가지는 유산균이기 때문에, 예를 들어, 식물과 당을 혼합하고 압착해서 얻어지는 액이나 이 액을 기초로 한 음료, 혹은 잼, 과일소스 등의 산성 값 및 슈크로스 농도가 높고, 일반적인 유산균에서는 발효가 어려운 소재(산성이면서 고당 농도 추출액)를 용이하게 발효시킬 수가 있고, 이것에 의해 상기 추출액에 유기산을 함유시킬 수 있어, 신맛(酸味)의 부여(달콤함의 경감이나 상쾌함의 부여)나 방부(첨가물로서의 보존료가 필요없게 된다) 등의 효과가 얻어진다.

또, WR16－4주는, 저pH이면서 고프럭토스·글루코스 환경 하에서도 우위로 증식하는 특징을 가지는 유산균이기 때문에, 상기한 것 외에, 프럭토스와 글루코스를 둘 다 포함하는 당(이성화(異性化) 당, 포도당(葡萄糖) 및 과당(果糖)의 각각의 정제당(精製糖)을 혼합한 것 등)을 이용한 음식품에도 이용할 수가 있다.

또, 상기 산성이면서 고당(高糖) 농도 추출액의 취득 방법의 일례를 이하에 나타낸다. 한편, 추출액의 취득 방법은 이것에 한정되는 것은 아니다.

(1) 자른 야채나 과일과 정백당(백설탕)을 같은 비율로 혼합하고, 균액을 더해서 발효시킨다.

(2) 발효 후, 압착해서 액분을 회수하고, 이 회수액을 더욱 발효·숙성시켜서 발효액A를 얻는다.

(3) 들풀(야초) 우려낸 액체에 정백당을 더한 것에 발효액A를 더하고, 발효·숙성시켜서 발효액B를 얻는다.

이 발효액A나 발효액B가 산성이면서 고당 농도 추출액으로 된다. 한편, 이 발효액A 및 발효액B는 음료로서 제조되는 것이고, WR16－4주에 의해서 발효시킴으로써, 신맛을 부여함과 함께, 보존료를 첨가하는 일 없이 방부 효과가 얻어져서, 지금까지 없던 음료의 제공이 가능해진다.

또, WR16－4주는, 상기 시험 결과에 나타내는 바와 같이, 일반적인 유산균의 최적 pH 환경인 pH6∼7의 환경 하에서 거의 생육하지 않는 특성을 가지기 때문에, 예를 들어, 슈크로스 농도가 높아서 pH가 중성 부근인 소재를, WR16－4주와 다른 미생물(예를 들어 일반적인 유산균이나 효모 등)로 발효시키려고 하는 경우, WR16－4주는 최적 pH에 도달할 때까지의 동안에는 생육하지 않으므로, 다른 미생물의 생육을 저해하지 않는다. 따라서, 복수 종의 미생물에 의한 복합적인 발효를 이용하는 경우에 유용하게 된다.

또, 상기 특성으로 인해, WR16－4주는, 소재의 pH를 중성 부근으로 조정함으로써 발효를 비가열적으로 정지시킬 수 있어, 가열할 수 없는 발효 제품에의 이용도 유용하게 된다.

한편, 본 발명은, 본 실시예에 한정되는 것은 아니고, 각 구성 요건의 구체적 구성은 적당히 설계할 수 있는 것이다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터

NITEBP-03116

20200205

SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Technology MIYATOU YASOU KENKYUJO CO., LTD <120> Lactic acid bacterium (LAB), method for separating LAB and food or drink using LAB <130> TY0304-PCT <150> JP2020-171989 <151> 2020-10-12 <150> JP2020-214170 <151> 2020-12-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Lactobacillus sp. <400> 1 cgctggcggc atgcctaata catgcaagtc gaacgaggtt tccttaatga tagttggtgc 60 ttgcatcaat ttgacttaag atctaaccga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgccctga agtaggggat aacatttgga aacaaatgct aataccgtat aacaacataa 180 accacatggt ttatgtttga aagatggctc tgctatcgct tttggatgga cccgcggcgt 240 attagctagt tggtgagata atggctcacc aaggcgatga tacgtagccg acctgagagg 300 gtaatcggcc acattggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 360 aatctttcac aatggacgaa agtctgatga agcaatgccg cgtgagtgat gaagggtttc 420 ggctcgtaaa gctctgttgt tagagaagaa caggtgtaag agtaactgtt tacatctcga 480 cggtatctaa ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540 ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagtgagcgc aggcggtttt ttaagtctaa 600 tgtgaaagcc ttcggcttaa ccgaagaagt gcattggaaa ctaagaaact tgagtgcaga 660 aaaggatagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720 tggcgaaggc ggctatctgg tctgttactg acgttgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa 780 caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttagaggatt 840 tccgtccttt agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa 900 ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagtg gtggagcatg tggtttaatt 960 cgatgctacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt ctgctagcct aagagattag 1020 gtgttccctt cggggacaga ttgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattcagtt 1140 gggcactctg gtgagactgc cggtgataaa ccggaggaag gcggggatga cgtctaatca 1200 tcatgcccct tacgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagtacaa agagttgcaa 1260 aaccgcgagg tcaagcaaat cccataaagc tgttctcagt tcggattgca ggctgcaact 1320 cgcctgcatg aagttggaat cactagtaat cgtggatcag aatgccacgg tgaatacgtt 1380 ctcaggcctt gtacataccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagccggtg 1440 atgtaaccct tcggggaact agccgtctaa ggtgggacag atgattaggg tgaa 1494

Claims

수탁 번호： NITE　BP－03116(식별의 표시： WR16－4)으로 기탁되어 있는 락토바실루스속에 속하는 종(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 유산균.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 서열 번호 1로 나타내어지는 16S rDNA 영역의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유산균.
제1항에 있어서,
식물 발효 엑기스로부터 취득된 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제2항에 있어서,
식물 발효 엑기스로부터 취득된 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제3항에 있어서,
상기 식물 발효 엑기스는 무 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균.
제4항에 있어서,
상기 식물 발효 엑기스는 무 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균.
제5항에 있어서,
상기 무 발효 엑기스는 무, 정백당(上白糖) 및 균액을 혼합하여 발효시킨 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제6항에 있어서,
상기 무 발효 엑기스는 무, 정백당 및 균액을 혼합하여 발효시킨 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제7항에 있어서,
상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제8항에 있어서,
상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 슈크로스 농도 30∼60 wt%의 고농도 슈크로스 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 프럭토스 농도 및 글루코스 농도가 각각 10∼30 wt%인 프럭토스·글루코스 고농도 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 슈크로스 농도 30∼60 wt%의 고농도 슈크로스 환경 하에서도 증식하며, 또한 pH3.5∼5.5의 저pH 환경 하에서 증식하면서, 프럭토스 농도 및 글루코스 농도가 각각 10∼30 wt%인 프럭토스·글루코스 고농도 환경 하에서도 증식하는 것을 특징으로 하는 유산균.
멸균한 액체 배지(培地)에 식물 발효 엑기스를 더해서 배양액을 얻고, 계속해서, 이 배양액을 집적 배양해서 집적 배양액을 얻고, 계속해서, 이 집적 배양액을 멸균한 분리용 배지와 혼석(混釋)해서 평판 배지를 작성하고, 계속해서, 이 평판 배지에 출현한 콜로니를 조균(釣菌)해서 저pH 환경이면서 고농도 슈크로스 환경 하에서 증식 가능한 유산균을 취득하는 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법.
제14항에 있어서,
상기 식물 발효 엑기스는, 무와 정백당과 균액을 혼합하여 발효시킨 무 발효 엑기스인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법.
제15항에 있어서,
상기 균액은 효모균으로 이루어지는 것인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 액체 배지는, 야채(野菜) 발효 엑기스 및 과일 발효 엑기스의 어느 한쪽 혹은 쌍방을 이용해서 얻어진 혼합 발효 엑기스와, 들풀 우려낸 액체(野草煮出液)와 정백당을 혼합해서 얻어진 야채·정백당 혼합액을 혼합한 것에 항생 물질을 첨가한 것인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법.
제17항에 있어서,
상기 항생 물질은 사이클로헥시미드인 것을 특징으로 하는 유산균의 취득 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제11항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제12항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제13항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제19항에 있어서,
상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제20항에 있어서,
상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제21항에 있어서,
상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.
제22항에 있어서,
상기 유산균 함유 음식품은 발효 음식품인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 음식품.