KR20230024228A - 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 복합소재의 경피수분손실 개선 피부외용제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 경피수분손실의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물, 또는 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 와 같은 천연유래 소재를 이용함으로써, 경피수분손실 개선을 위한 장기 투여에도 안전하게 사용될 수 있다. 특히, 아토피피부염 질환을 비롯한 자가면역성 피부질환을 개선할 수 있는 효율적인 피부외용제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 복합소재의 경피수분손실 개선 피부외용제{External skin preparation for improving skin percutaneous moisture loss with a complex material containing bellflower bioconversion and ginsenoside Rg3}

본 발명은 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 복합소재의 피부 경피수분손실 개선 피부외용제에 관한 것이다.

인체에 있어서 피부는 외부환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 기능을 하는 기관으로서, 인체 내의 생체성분 즉, 물이나 전해질 등의 손실을 방지하는 동시에 외부로부터 유해물질이 인체 내로 침입하지 못하도록 하는 역할을 한다. 이러한 피부는 크게 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구분된다. 표피층은 각질세포와 멜라닌 세포로 구성되는데, 피부 최외곽의 각질세포층은 외부환경과 직접 접촉하기 때문에 물리적, 화학적 혹은 물질의 투과에 대한 강한 저항성이 요구되며, 인체로부터 외부로 수분이 손실되는 것을 막아줌과 동시에 자체로도 적당한 수분을 보유함으로써 유연성을 유지하여야 한다.

일반적으로 피부의 수분량은 진피층에서는 70% 정도이나 표피층으로 갈수록 감소하여 각질세포층에서는 약 10 내지 30%가 된다. 진피층에서 공급된 물은 주로 수동적 확산에 의해 각질층 상부로 이동하며 최종적으로는 외부로 배출된다. 이를 경피수분손실(Trans Epidermal Water Loss; TEWL)이라 하며, 이러한 경피수분손실을 적절한 수준으로 유지시켜주는 것이 각질세포층의 지질막 성분인 피지성분과 표피지질이라고 알려져 있다. 한편, 각질세포층에는 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF) 라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 각질세포층은 수분이 10 내지 30% 정도가 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다. 하지만, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다.

따라서, 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 천연보습인자 성분 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH 기)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기(OH 기)가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있다. 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 보습능력에 한계가 있었다.

피부외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발의 필요성이 요구되고 있다. 따라서 본 발명은 담자균류 균사로 발효하거나, 추가로 효소 처리를 통해 생물전환된 도라지 생물전환체 및 진세노이드 Rg3를 포함하는 경피수분손실 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물에 대한 것이다.

본 발명은 피부외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발을 위하여 예의연구 노력하였다. 그 결과 경피수분손실 개선을 위한 천연물 유래의 원료 및 제품 개발에 노력함으로써, 최종적으로 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 복합소재의 피부수분 개선제를 발명함으로써 보다 안전하고, 피부질환을 개선할 수 있는 효율적인 피부외용제로 사용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 경피수분손실 개선 피부외용제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하고 섬유소 분해효소를 처리한 후에 불용성잔사를 제거한 도라지 생물전환체(도라지발효효소처리추출물) 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 포함하는 경피수분손실 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 피부외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습효과가 높은 물질의 개발을 위하여 예의연구 노력하였다. 그 결과 경피수분손실 개선을 위한 천연물 유래의 원료 및 제품 개발에 노력함으로써, 최종적으로 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 복합소재의 피부수분 개선제를 발명함으로써 보다 안전하고, 피부질환을 개선할 수 있는 효율적인 피부외용제로 사용될 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어, "외용제 조성물"은 피부, 모발 또는 점막에 적용되는 화장료 및 치료용 약제를 포함하고, 특히 피부 또는 모발 화장료 및 치료용 약제, 특히 스킨 케어 용품을 포함한다. 구체적인 물질로서는, 예를 들면 화장수(스킨 로션), 유액, 영양 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 영양 에센스, 파운데이션, 보습 크림, 콜드 크림, 핸드 크림, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로션, 립스틱, 팩 재료, 샴푸, 린스, 바디샴푸, 나아가서는 목욕용제 등을 들 수 있다. 본 발명의 외용제 조성물의 제형은, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 액상, 크림상, 고체상, 겔상 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 용어 “담자균류”는 진균류의 한 아문으로 유성생식 한 결과로 담자기라는 세포가 되어 홀씨를 만드는 균류이다. 스스로 양분을 만들지 못하여 다른 생물체에 붙어 기생하며, 버섯으로 알려진 것이 많은데 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯 따위가 대표적이다. 성숙한 버섯의 갓주름 면에는 담자기가 빽빽이 생긴다. 담자균류 버섯의 대부분은 고등식물의 유체에서 부생적으로 생활하며, 특히 셀룰로오스와 리그닌을 분해하여 물질의 생물학적 순환에 없어서는 안 될 중요한 역할을 하지만, 또 수목의 뿌리에 균근을 형성하여 공동생활을 하는 것도 많다. 그밖에 식용균으로 중요시되거나 독버섯으로 주의를 해야 할 종류도 있다.

본 명세서에서 용어 “균사”는 사상균(곰팡이)의 영양세포이다. 영양적 기능이나 생리적 기능 같은 기능 분화도 볼 수 있다. 형태적으로는 격벽의 유무가 분류에 사용되고 있으며, 포자의 발아관에서 발육하여 선단생장에 의해서 신장한다. 분지한 균사의 집단을 균사체(mycelium)라고 한다. 생리적 기능에 따라 배지나 기주의 표면 또는 내부에 들어가면서 신장하는 기저균사와 공기 중에서 신장하는 기생균사로 구별된다. 기생균사는 영양을 기저균사로부터의 이송에 의존하고 있으며, 그 일부는 포자 형성기관 등으로 분화한다. 유기물이 있고 적당한 습도와 온도 등 환경조건이 양호하면 여러 가지 균사조직을 형성한다. 자낭균류의 균사의 격막은 단순하지만 담자균류에서는 꺾쇠연결을 형성하는 것을 많이 볼 수 있다. 곰팡이류에서는 여러 갈래로 분지하여 실처럼 엉겨 있고, 버섯류에서는 집합하여 자실체를 만든다. 엽록소가 없어 광합성을 하지 못하고 기주생물에 붙어서 영양분을 흡수한다. 버섯인 담자균류의 경우, 포자에서 발아한 균사는 핵을 1개 가지고, 이것이 다른 균사와 융합하면 1개의 세포에 핵을 2개 가지게 된다. 핵을 1개 가진 균사를 1차 균사, 핵을 2개 가진 균사를 2차 균사라고 한다. 본 명세서에 있어서 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사로 구성된 군으로부터 선택되는 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양받아 사용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “도라지(Platycodon grandiflorum)”는 굵은 뿌리줄기를 가지고 있는 여러해살이풀이다. 줄기는 곧게 서고 40~80cm 정도의 높이로 자라며, 가지를 거의 치지 않는다. 잎은 마디마다 서로 어긋나게 자리하거나 2~3장의 잎이 한 자리에 나기도 한다. 잎은 길쭉한 계란 꼴 또는 타원 꼴로 생겼으며 잎자루라고 할 만한 것은 없다. 잎의 양끝이 뾰족하고 가장자리에는 날카로운 톱니를 가지고 있고, 잎 뒷면은 흰 가루를 쓰고 있는 것처럼 보인다. 줄기 끝에 종과 같이 생긴 여러 송이의 큰 꽃이 피는데, 꽃의 끝 부분이 다섯 갈래로 갈라져 있고 5개의 수술을 가지고 있다. 꽃의 지름은 4cm 안팎이고 빛깔은 짙은 하늘빛이나, 간혹 흰색으로 꽃이 피는 것도 있다. 뿌리줄기를 약재로 사용하는데, 뿌리줄기에 포함된 사포닌(Saponin)의 일종인 플라티코딘(Platycodin)과 플라티코디게닌(Platycodigenin) 등이 거담작용과 진해작용을 한다고 알려져 있다.

본 발명에 따르면, 도라지 또는 도라지 분말은 도라지 전체 또는 일부로 구성된 것을 의미하며, 도라지 일부는 도라지 뿌리, 뿌리털, 줄기, 가지, 잎, 나무갓, 껍질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “발효”는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 발효라고 하는 것은 효소작용에 의해 유기물이 간단한 화합물로 변화해 자유에너지를 내놓는 현상이지만, 일반적으로는 미생물이 유기물의 분해과정을 통해 대사물을 축적하는 현상을 말한다. 즉, 효모가 당을 무산소적으로 분해해서 에틸알코올과 이산화탄소로 하는 알코올 발효, 락트산균이 당을 무산소적으로 분해해서 락트산으로 하는 락트산 발효 등이 전형적인 발효이지만, 현재는 아세트산균이 공기 중의 산소를 이용해서 알코올을 아세트산으로 산화시키는 현상, 곰팡이가 공기 중의 산소를 이용해서 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 현상 등도 각각 아세트산 발효, 글루콘산 발효 등으로 부르고 있다. 또 이러한 것들을 혐기적 발효, 호기적 발효(산화 발효)로 나누어 논하기도 하고, 위에 언급한 것 외의 혐기적 발효로는 글리세롤 발효, 아세톤 발효, 부탄올 발효, 2, 3-부틸렌글리콜 발효, 부티르산 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이, 또 호기적 발효로는 시트르산 발효, 이타콘산 발효, 숙신산 발효, 2-케토글루타르산 발효, 옥살산 발효, 푸마르산 발효, 소르보오스 발효 등이 있다. 이외에 미생물에 의한 아미노산, 비타민, 항생물질의 생산도 예를 들면 글루탐산 발효, 리보플라빈 발효, 페니실린 발효 등으로 불리는데, 그다지 좋은 호칭은 아니다. 발효작용명은 생산물로 부르는 것이 원칙이나, 때로는 셀룰로오스 발효, 펙틴 발효 등으로 기질의 이름을 붙이기도 한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 도라지 액상배지로 만든다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 용어 “아밀라아제 계열의 가수분해효소”는 다당류의 α-글리코시드 결합을 우선적으로 가수분해하여 저분자량의 탄수화물/당 절편을 생성하는 효소 계열로서, α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 γ-아밀라아제를 들 수 있다.

본 명세서에서 용어 “셀룰라아제 계열의 가수분해효소”는 나무껍질, 근피, 뿌리, 잎 등을 분해할 수 있는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 또는 글루카나아제를 포함할 수 있다. 시판품인 셀룰라아제 제제로서는, 예를 들면 셀룰라아제 T「아마노」, 셀룰라아제 A「아마노」[이상 아마노 엔자임 가부시키가이샤(Amano Enzyme inc.）제조], 트리세라아제 KSM, 멀티팩트 A40, 셀룰라아제 GC220[이상 제넨코아 쿄와 가부시키가이샤 제조], 셀룰라아제 GODO-TCL, 셀룰라아제 GODO TCD-H, 벳세렉스, 셀룰라아제 GODO-ACD[이상 고도슈세이 가부시키가이샤(GODO SHUSEI CO., LTD.）제조]), Cellulase[토요보세키 가부시키가이샤(Toyobo Co., Ltd.) 제조], 셀라이저, 셀룰라아제 XL-522[이상 나가세 켐텍스 가부시키가이샤(Nagase ChemteX Corporation) 제조], 셀소프트, 데니맥스[이상 노보자임즈사(Novozymes A/S) 제조], 셀룰로신 AC40, 셀룰로신 AL, 셀룰로신 T2[이상 에이치비아이 가부시키가이샤(HBI enzymes Inc.) 제조], 셀룰라아제 "오노즈카" 3S, 셀룰라아제 Y-NC[이상 야쿠르트 야쿠힌 코교 가부시키가이샤(Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) 제조], 스미팀 AC, 스미팀 C[이상 신니혼 가가쿠 코교 가부시키가이샤(SHINNIHON CHEMICALS Corporation) 제조], 엔티론 CM, 엔티론 MCH, 바이오히트[이상 라쿠토 가세이 코교 가부시키가이샤(Rakuto Kasei Industrial CO., LTD.) 제조] 등을 들 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 조합물 일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 구성된 군으로부터 선택된 담자균류의 균사이다.

본 발명에 따르면, 상기 불용성 잔사 제거는 원심분리 또는 여과 등의 통상의 고액분리 방법을 통해 이루어진다.

본 명세서에서 용어 “IgE”란, 면역글로불린 E라고도 불리는 항체 단백질이다. 알레르기반응에서 중요한 역할을 하므로 종종 "알레르기 항체"라고도 한다. 특정물질(알레르겐)에 알레르기반응을 보이는 경우, 면역체계가 일반적으로 무해한 물질을 몸에 유해하다고 잘못 판단하는데, 이런 특정한 물질에 노출되면 면역체계는 우리 몸을 보호하기 위해 IgE를 생산하기 시작한다. IgE 항체는 몸 안에 남아있다가 다음에 알레르겐 물질과 다시 접촉하면 알레르기반응을 일으킨다. 결과적으로 알레르기가 있는 사람은 혈중 IgE 농도가 증가하며, IgE는 각 알레르겐에 특이도를 나타낸다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3는 홍삼으로부터 추출된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3는 추가로 아토피성 피부염을 개선할 수 있는 것인, 조성물이다.

본 발명에 따르면, 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3는 경피수분손실을 예방 또는 개선하는 외용제 조성물로 제공이 되며, 추가적으로 아토피성 피부염과 같은 건조 질환에 사용가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “진세노사이드 Rg3”는 인삼에 있는 사포닌으로 화학적으로 배당체(glycoside)라 부르는 화합물의 일종이다. 사포닌(saponin)은 비누를 뜻하는 희랍어의 sapona에서 유래되었는데, 수용액에서 비누처럼 미세한 거품을 내는데서 붙여진 이름이다. 사포닌은 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 껍질, 씨 등에 있는데 예전에는 비영양물질로 알려졌으나, 최근 항암, 항산화, 콜레스테롤 저하효과가 밝혀지면서 생리활성물질로 각광받기 시작했다. 한방약에서는 강심제나 이뇨제로 사용되어 왔으며, 특히 인삼의 여러 가지 유효성분 중 주된 약리작용을 하는 것이 사포닌이다. 인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며 약리효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 '진세노사이드(Ginsenoside)'라고 불린다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하고 섬유소 분해효소를 처리한 후에 불용성 잔사를 제거한 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 포함하는 피부보습 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “화장료 조성물”은 피부상태 또는 피부질환의 개선을 위한 조성물이다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜워시, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다. 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸알콜, 옥틸도데칸올, 올레일알콜, 판텐올, 라놀린알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명에서 제공하는 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물, 또는 식품 조성물의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, (a) 도라지를 액상으로 배양배지화 하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상 도라지 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소처리공정을 수행하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 생물전환 효소처리공정에 의해 생산된 발효물로부터 불용성 잔사를 제거하고, 수용성분획을 수득하는 고액분리 단계를 포함하는, 경피수분손실의 예방, 또는 개선용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 (a) 단계의 도라지의 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 도라지 배지로 만드는 것일 수 있다. 여기서, 가수분해효소를 처리한 후 필요에 따라 살균 또는 멸균을 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 상기 (a) 단계의 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 (b) 단계의 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 구성된 군으로부터 선택되는 담자균류의 균사로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 상기 담자균류 균사는 1%(v/v) 내지 20%(v/v), 바람직하게는 5%(v/v) 내지 15%(v/v), 보다 구체적으로는, 8%(v/v) 내지 12%(v/v)의 양으로 접종할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 (b) 단계의 배양 발효 시 온도는 28~30℃ 및 pH 4.5 내지 7의 조건에서 수행하여, 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상 도라지 배지를 첨가하는 유가식 공정으로 7~10일간 배양하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 상기 (c) 단계의 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합물일 수 있고, 구체적인 예로는 섬유소 분해효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소 분해효소인 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 섬유소분해효소는 각 효소제품의 제품설명서에서 제시하는 최적량, 적정 온도 및 pH에서 실시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 상기 (c) 단계의 생물전환 효소처리공정은 50~60℃의 온도 조건 하에서 1 내지 3시간 동안 교반시키며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 도라지를 액상으로 배양배지화 하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상 도라지 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소처리공정을 수행하는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계의 생물전환체에 진세노이드 Rg3를 추가하는 단계를 포함하는, 경피수분손실 예방 또는 개선용 외용제 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (a)단계의 도라지의 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 도라지 액상배지로 만드는 것인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (C)단계의 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 및 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물인, 방법이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 (b)단계의 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는, 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하고 섬유소 분해효소를 처리한후에 불용성 잔사를 제거한 도라지 생물전환체; 및 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 유효성분으로 포함하는 피부보습 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 도라지 생물전환체; 및 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 포함하는 경피수분손실 예방 또는 개선용 조성물은 피부외용제로서, 경구용 조성물과의 차이를 나타낸다. 경피수분손실 개선을 위한 이상적인 조성물은 소수성과 친수성의 성질을 모두 가지고 있어야 하지만 극친수성인 분자인 경우 경피로 전달될 수 없으며, 과도한 소수성 분자인 경우는 경피층에 잔류하는 경향이 있다. 그러나 각질층의 지질의 양과 지질층의 두께로 인해 상대적인 피부 투과율은 소수성 물질이 수용성 물질보다 높다고 알려져 있으며, ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 조성물화장품의 경우 ginsenoside Rg3 및 platycodin D는 각질층 및 진피층에 잔존하고 있어 매우 효과적이며, 혈액으로 투과되지 않는다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하고 섬유소 분해효소를 처리한 후에 불용성잔사를 제거한 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 경피수분손실의 예방, 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물, 또는 외용제 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 상기 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3와 같은 천연유래 소재를 이용함으로써, 경피수분손실 예방 또는 개선을 위한 장기 투여에도 안전하게 사용될 수 있으며, 아토피피부염 질환을 비롯한 자가면역성 피부질환을 개선할 수 있는 효율적인 피부외용제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLC를 이용한 진세노사이드 Rg3를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, Nanoliposome, Nanovesicle, 및 Micelle 현탁액 및 제품사진을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, Micropig Franz Cell membrane 및 경피흡수시스템 LOGAN FDC-6T를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, Ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle의 Ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, Ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품에서 Ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, Ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle의 피부흡수 실험에 있어 각질층 및 진피층에 남아있는 Ginsenoside Rg3 및 platycodin D 피부함유량을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부흡수 실험에 있어 진피를 통과한 caffeine의 함량과 함께 각질층 및 진피층에 남아있는 Caffeine의 피부함유량을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, Ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품의 피부흡수 실험에 있어서 각질층 및 진피층에 남아있는 피부 함유량을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최대한 적은 함량으로 베이스 원료의 향을 커버하는 향을 선택하기 위하여 Argeville 사로부터 피부트러블이 가장 적은 19개의 향을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출액 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후의 보습 개선을 분석한 단일시험군에서의 인체적용시험 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실험예에 따른, 피시험자의 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후의 건조에 의한 가려움 완화에 대한 설문조사를 실시한 단일시험군에서의 인체적용시험 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른, 피시험자의 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후의 가려움증으로 인한 심리상태에 대한 단일시험군에서의 인체적용시험 설문조사 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후의 경피수분손실량 개선 평가에 관한 단일 시험군에서의 인체적용시험 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후의 피부 이상반응 평가에 관한 단일시험군에서의 인체적용시험 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실험예에 따른, 피시험자의 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 화장품의 사용 전후 피부상태 및 사용감에 관한 단일시험군에서의 인체적용시험 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 복합소재 함유 화장품에 대한 사용 전후의 경피수분손실량을 시점별 비교 통계분석한 2중맹검 인체적용시험 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 복합소재 함유 화장품에 대한 사용 전후의 피부 수분량을 시점별 전후 비교 통계분석한 2중맹검 인체적용시험 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 복합소재 함유 화장품에 대한 사용 전후의 가려움개선을 자가평가 시점별 전후 비교 통계분석한 2중맹검 인체적용시험 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실험예에 따른, 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 복합소재 함유 화장품에 대한 사용 전후의 긍정적 답변의 설문 평가 결과 및 사용성에 관해 평가한 2중맹검 인체적용시험 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 도라지 생물전환체

실시예 1-1. 도라지 전처리 작업

구입한 도라지의 원물로부터 분말화하기까지의 전처리 작업을 위하여 원재료 상태의 곰팡이 오염도를 측정한 후, 도라지 원재료의 이물 및 오염물 제거를 위한 수세작업을 하였다. 수세작업은 총 3단계를 거쳐 수행하였으며 ①이물 및 곰팡이 포자를 제거하기 위한 공기 세척 단계, ②잔류 농약 등의 제거를 위한 물 세척 단계, ③미생물 등의 오염을 제거하기 위한 알코올(Et-OH) 세척 단계를 통해 원재료의 수세작업을 수행하였다. 수세 및 절단작업을 마친 원재료는 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조작업을 수행한 후 조분쇄 및 미분쇄 공정을 거쳐 도라지 원재료의 분말화 작업을 수행하였다.

실시예 1-2. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 수득

이물 및 미생물 등의 오염을 제거한 도라지분말은 액상 배양배지화를 위해 물을 첨가한 후 효소처리 및 열처리 살균공정을 수행하였다. 효소는 아밀라아제(amylase) 계열의 가수분해효소를 사용하였고, 상기 효소를 첨가 후 반응시키고, 고온에서 30분간 살균처리하여 도라지의 배양배지화를 수행하였다. 이 때, 상업적으로 판매되고 있는 효소제품을 사용할 수 있다. 이 경우, 적당량(각 효소제품의 제품설명서에서 제시하는 최적량) 및 적정조건(각 효소제품의 제품설명서에서 제시하는 적정 온도 및 pH)에서 실시하였다. 보다 구체적으로 노보자임(Novozyme)사의 펑가밀800엘(Fungamyl 800L)제품이 될 수 있으며, 펑가밀800엘의 제품설명서에서 제시하는 추천농도(0.02%)로 첨가하고, 60℃ 조건에서 1시간 동안 250rpm으로 회전시키면서 효소/기질반응을 수행하였다. 이후, 상기 배양(발효)배지에 별도로 배양한 담자균류 균사 중 표고버섯균사를 첨가하였다. 담자균류 균사 종균배양액을 10%(v/v) 접종하고 28~30℃ 및 pH 4.5~7의 조건에서 배양하였다. 또한 잔류 탄소원의 농도가 일정농도 이하로 고갈되는 시점에서 농축된 액상 도라지 배지를 첨가하는 유가식 배양공정으로 7~10일간 배양할 수 있다. 상기의 담자균류 균사는 구체적으로 약용 및 식용 가능한 담자균류인 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯, 치마버섯 등의 균사로 구성된 군으로부터 선택되는 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 표고버섯균사가 될 수 있으며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 또한, 이들 담자균류 균사는 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC), 한국세포주은행(KCLB), 한국농업미생물자원센터(KACC), 미국표준균주배양수록보존소(ATCC) 등의 기관에서 균주를 분양 받아 사용할 수 있다.

상기 발효물에 대한 생물전환공정의 효소처리는 섬유소분해효소 중 셀룰라아제를 사용하였다. 이때, 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나, 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소제가 함께 포함된 상업적으로 판매되고 있는 효소 제품을 사용할 수 있다. 이 경우, 적당량(각 효소제의 제품설명서에서 제시하는 최적량)을 첨가하여 실시하였다. 효소로는 상업적으로 판매되고 있는 효소제 즉, 섬유소분해효소인 라미넥스(Laminex:Tricoderma reesei 유래 복합물), 비스코자임(Viscozyme:Aspergillus 유래 복합물), 셀룰라아제(Cellulase: Aspergillus niger 유래), 필트라제(Filtrase:Tricoderma reesei 유래 복합물), 라피다제(Rapidase:Aspergillus niger 유래 복합물) 및 스미자임(Sumizyme:Aspergillus niger 유래 펙티나아제를 함유한 복합물) 등의 섬유소분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수를 선택 하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 라미넥스가 될 수 있으며, 그 효과는 동일한 것으로 확인하였다. 라미넥스 효소제의 제품설명서에서 제시하는 추천 농도(0.05%)로 첨가하고, 50 ~ 60℃조건에서 1~3시간 동안 250 rpm으로 회전시키며 효소/기질반응을 수행하였다. 생물전환공정에 의해 생산된 도라지발효물은 90℃, 1시간 효소 불활성화 과정 및 살균과정을 거친 후 도라지발효물 발효액을 수득하거나 또는 동결건조하여 분말화 하였다. 또한 상기 도라지발효물 발효액 또는 면역활성 효능을 가지는 도라지발효물의 분말을 20배의 물에 녹인 용해액을 10,000rpm, 30분간 원심분리하여 불용성 잔사를 제거하고, 상등액을 동결건조하여 수용성분획인 도라지발효효소처리추출물의 분말로 수득하였다.

실시예 1-3. 도라지발효효소처리추출물의 체외(in vitro) 효능평가

세포배양

실험에 사용한 U266.B1, HMC-1.2, RBL-2H3, 및 HaCaT 세포주는 ATCC (Manassas, VA)에서 구입하였다. U266B1 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL, Grand Island, USA), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 RPMI-1640(GibcoBRL) 배지를 사용하였고, 세포 배양액은 HMC-1 cell을 IMDM에 10% FBS, 100 unit penicillin과 100 unit streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며, RBL-2H3과 HaCaT은 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum)(Hyclone, USA)과 1% PEST(penicillin-streptomycin)(Hyclone, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’ modified eagle medium)(Hyclone,USA) 배지를 사용하였다. 모든 세포는 CO₂ 배양기(Forma Direct Heat CO2 Incubator, 311, Thermo, USA)에서 5% CO₂, 95% air, 37℃ 배양하였다.

U266.B1 세포주에서의 IgE 측정

96 웰 플레이트에 1x10 cells/well로 접종한 뒤, 10μg/mL의 LPS와 5μg/mL의 IL-4를 처리하여 자극하였으며, 자극과 동시에 100, 200μg/mL의 도라지발효효소처리추출물의 처리하였고, 72시간 경과 후 상층액 내로 분비된 IgE의 양을 IgE ELISA 키트 (Bethyl, Montgomery, TX)를 이용하여 IgE의 생성량을 측정하였다

HMC-1.2 세포주에서의 TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 측정

96 웰 플레이트에 5x10⁵개 cells/well로 접종한 HMC-1.2 세포에 100, 200μg/mL의 도라지발효효소처리추출물을 2시간 전처리 하였다. 이후 50μM의 PMA와 1μg/mL의 calcium ionophore A23187을 처리하여 자극하고, 7시간 후 상층액 내로 분비된 TSLP의 양을 측정하였다.

RBL-2H3 세포주에서의 β-hexosaminidase측정

96 웰 플레이트에 RBL-2H3 세포를 1x10⁵ cells/well로 접종한 뒤, 100, 200μg/mL의 도라지발효효소처리추출물을 15분간 전처리 한 후, 10μM의 calcium ionophore A23187를 20분간 처리하여 탈과립을 유도하였으며, 방출된 과립 내 β-hexosaminidase의 양을 측정하였다.

HaCaT 세포주에서의 세포주에서의 사이토카인 측정

HaCaT 세포를 48 웨 플레이트에 4x10⁵ cells/well로 접종한 뒤 24시간 배양하고, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 24시간 starvation 하였다. 이후 10ng/mL의 TNF-α와 IFN-γ를 처리하였으며, 동시에 50, 100μg/mL의 도라지발효효소처리추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 상층액을 회수하여 상층액 내 cytokine과 chemokine의 발현량 측정하였다.

결과 1. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 B세포에서의 IgE 생성 저해 효능 평가

사람 유래 B세포주인 U266.B1 세포에서 도라지발효효소처리추출물의 효능을 검증하기 위해 IgE 생성 효능을 평가하였다. LPS와 IL-4의 자극에 의해 IgE가 48배 증가하였고, 도라지발효효소처리추출물을 처리한 경우 증가된 IgE의 양을 농도 의존적으로 억제하였으며, 최대 79.5%의 억제 효과가 있는 것으로 나타나, B세포에서의 IgE 생성 저해 효능이 우수한 것으로 확인되었다.

결과 2. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 인간 비만세포에서의 TSLP 생성 저해 효능 평가

도라지발효효소처리추출물의 비만세포에서의 직접적인 TSLP 생성 저해 효능을 확인하기 위하여, 사람 유래 비만세포주인 HMC-1.2 세포를 이용하여 TSLP의 양을 측정하였다. PMA와 A23187의 처리로 TSLP의 생성량이 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 도라지발효효소처리추출물을 처리한 경우 모든 시료에서 TSLP의 생성이 농도 의존적으로 억제되었으며, 최대 61.8%의 억제 효과가 있는 것으로 나타나, 비만세포에서의 TSLP 생성 저해 효능은 우수한 것으로 확인되었다.

결과 3. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 랫 비만세포에서의 β-hexosaminidase 생성 저해 효능 평가

랫 유래 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 도라지발효효소처리추출물의 직접적인 탈과립 억제 효능을 평가하였다. A23187 처리에 의해 탈과립이 유도되어 β-hexosaminidase의 양이 증가하였고, 도라지발효효소처리추출물을 처리할 경우 증가된 β-hexosaminidase의 양을 농도 의존적으로 억제하였다. 최대 47.4%의 억제 효과가 있는 것으로 나타나, 비만세포에서의 탈과립 억제 효능은 우수한 것으로 확인되었다.

결과 4. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 인간 각질형성피부세포에서의 사이토카인 생성 저해 효능 평가

도라지발효효소처리추출물의 효능을 검증하기 위해, 사람 유래 각질세포주인 HaCaT cell을 이용하여 cytokine 및 chemokine의 발현 억제 효능을 평가하였다. TNF-α 및 IFN-γ의 처리에 의해 TARC, MDC, IL-6의 생성량이 대조군에 비해 각각 26배, 14배, 46배 정도 증가하는 것을 확인하였다. 도라지발효효소처리추출물은 TARC, MDC에서 농도 의존적으로 우수한 억제 효능을 보인 반면, IL-6에서는 100μg/mL까지 감소하였으나 400μg/mL을 처리한 경우 오염으로 확인하지 못하였다. 특히, 도라지발효효소처리추출물에서 TARC 농도가 대폭 감소하여 25μg/mL에서만 TARC가 낮은 농도로 확인되고 100μg/mL부터는 완전히 억제되어 억제 효과가 매우 뛰어난 것으로 나타났다. 도라지발효효소처리추출물의 각질형성피부세포에서의 사이토카인 생성 억제 효능은 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 1-4. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 체내(in vivo) 효능 평가

DNCB와 mite extract로 유도된 아토피피부염 마우스모델에서 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 효능을 확인하고자 DNCB와 동일하게 아세톤3:올리브오일1의 제형으로 실험을 진행하였으며, 각각 25 및 2.5 mg/mL에 해당하는 도라지발효효소처리추출물의 피부도포제형물을 제조한 뒤 귀 조직에 도포하여 아토피피부염 억제 효과를 확인하였다. 각 소재의 투여 및 아토피피부염 유도는 총 5주간 DNCB와 mite extract로 아토피피부염을 유도하였으며, 아토피피부염 유도 시작 1주일 후부터 각 소재를 총 4주간 매일 도포하고, 이후 마우스를 희생하여 피부도포에 따른 아토피피부염 억제 효과를 확인하였다.

귀 종창 측정

CO₂ 흡입을 통해 마우스를 희생한 뒤, 두께측정기 (Mitutoyo, Kanagawa, Japan)을 이용하여 귀 두께를 측정하였다.

혈청 내 단백질 측정

CO₂ 흡입을 통해 희생한 마우스의 심장에서 채혈한 뒤, 30분간 얼음에 방치하여 혈액 응고를 유도하였다. 응고된 혈액은 2,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 혈청 내 IgE의 양은 IgE ELISA kit (Bethyl, Montgomery, TX)를 이용하여 측정하였다.

귀 조직에서의 단백질 측정

적출한 귀 조직을 protease inhibitor cocktail이 포함된 2 ml의 TNT lysis buffer에 넣고, homogenize(PRO Scientific, Oxford, CT)를 이용하여 균질화 하였다. 균질화 된 시료는 1.5ml tube에 1ml씩 옮긴 뒤, 14,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액 내 단백질은 각각의 ELISA 키트 (R&D systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.

결과 1. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 귀 종창 억제 효과

아토피피부염이 유발된 마우스의 귀 두께를 측정하여 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 귀 종창 억제 효과를 평가하였다. 아토피피부염이 유발된 경우 정상 마우스에 비해 2배의 귀 두께 증가가 나타났으며, 아토피피부염 마우스에 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따라 30%의 억제 효과가 나타났다.

결과 2. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 혈중 IgE 생성 억제 효과

아토피피부염이 유발된 마우스의 혈청 내 IgE를 측정하여 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 혈중 IgE 생성 억제 효과를 평가하였다. 아토피피부염이 유발된 경우 정상 마우스에 비해 6.3배의 IgE 생성이 증가하는 것으로 나타났으며, 아토피피부염 마우스에 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따라 35%의 억제 효과가 나타났다.

결과 3. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 귀 조직 내 TSLP 발현 억제 효과

TSLP는 각질형성세포에서 생성되어 수지상세포를 활성화시킴으로서 만성적인 Th2 염증반응을 유도하는 것으로 알려져 있어, 아토피피부염이 유발된 마우스의 귀 조직을 homogenize 하여 조직 내 TSLP의 발현 억제 효과를 평가하였다. 아토피피부염이 유발된 경우 정상 마우스에 비해 6.5배의 TSLP 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 아토피피부염 마우스에 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따라 40%의 억제 효과가 나타났다.

결과 4. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 귀 조직 내 가려움증 관련 IL-31 발현 조절 효과

IL-31은 아토피피부염에서 가려움증을 유도하는 주된 요인으로 알려져 있어, 아토피피부염이 유발된 마우스의 귀 조직 내 IL-31의 발현 억제 효과를 평가하였다. 아토피피부염이 유발된 경우 정상 마우스에 비해 10.8배의 IL-31의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 아토피피부염 마우스에 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따라 37%의 억제 효과가 나타났다.

결과 5. 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물의 피부도포에 따른 Th1 cytokine 및 Th2 cytokine 조절 효과

아토피피부염의 면역학적 기전은 Th1/Th2 면역반응의 불균형으로 알려져 있어, 아토피피부염이 유발된 마우스의 병변조직 내 Th2 cytokine의 양을 측정하였다. Th2 cytokine인 IL-4, IL-5, IL-13의 양을 확인한 결과, 아토피피부염이 유발된 경우 정상 마우스에 비해 대략 7배 정도 증가하는 것으로 확인되었다. IL-4, IL-5, IL-13의 발현량은 도라지발효효소처리추출물의 경우 최소 25%, 36%, 27% 이상의 억제 효과가 나타났다.

이러한 결과를 종합하면, 도라지발효효소처리추출물의 피부 도포는 병변부위에 직접 작용하여 IgE 생성 억제, Th2 cytokine 생성 억제, TSLP 생성 억제, 비만세포의 활성화 억제 등을 통하여 아토피피부염을 어느 정도 완화할 수 있을 것으로 판단되며, IL-31의 억제를 통해 가려움증 역시 상당부분 완화할 수 있을 것으로 사료된다. 다만, 식이를 통한 효과와는 달리 Th1 cytokine의 회복을 통한 효과는 거의 나타나지 않는 것으로 확인되어, 개발소재의 식이와 함께 도포 시 더 큰 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 2. 진세노사이드 Rg3

실시예 2-1. 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 수득

선행연구 결과에 따르면, 고함량 진세노사이드 Rg3를 대량 생산하기 위하여 다공성 컬럼(HP-20) 및 역상 레진(C18)을 사용하여, 일차적으로 HP-20레진을 이용하여 저농도 진세노사이드 Rg3를 확보하고, 이것을 C18레진을 이용하여 재차 정제를 하는 step을 이용하고 있다.

상기 연구의 결과를 참조하여 80% 주정을 이용하여 금산의 공장에서 100 kg의 홍미삼을 이용하여서 85℃에서 3회 추출하고 0.45μm필터로 여과 후 45 kg의 농축액을 얻을 수 있었다. 농축액 일부분을 HP-20레진과 C18레진을 이용하여 선행 실험의 방법에 따라 진세노사이드 Rg3(순도 90% 이상) 파우더를 얻었다.

실시예 3. 경피 전달 화장품 처방

실시예 3-1. 특성에 적합한 원료 처방

진세노사이드 Rg3는 물 및 폴리올에 난용성 물질로 여러 종류의 오일과 계면활성제를 사용하여 유화를 시켜 처방에 필요한 원료를 만들 수 있으나, 아토피성 피부병변을 완화시키기 위한 제형에서는 피부에 안전하며, 피부 침투에 많이 사용되는 인지질과 화장품 원료를 사용하여 반원료로 개발하였다. 액상 타입의 리포좀은 수상에는 BG와 같은 polyol 10 내지 50% Sucrose stearate 와 같은 보조계면활성제 0.5 내지 3% 그리고 정제수를 사용하였다. 유상에는 Caprylic/Capric triglyceride 5 내지 20% EtOH 5∼~20%, 95% Phosphatidyl choline 1 내지 5%, 진세노사이드 Rg3 0.1 내지 5%, Tween과 같은 보조계면활성제 0.5 내지 3%를 사용하였다. 수상은 80℃로 가온용해하고, 유상도 70 내지 75℃로 가온 용해 후 교반하며 투입하여 유화, 1000 bar에서 3회 실시하였다. 진세노사이드 Rg3는 5%까지 리포좀에 투입하기는 매우 어려웠으며, 0.8에서 1%가 최적의 농도임을 알 수 있었다. 즉 완제품에 다량의 진세노사이드를 처방하기 위해서는 파우더 제형의 리포좀을 만들 필요가 있다.

파우더제형의 리포좀을 만들기 위하여서는 위에서 만들어진 1차 캡슐의 액상리포좀을 동결건조기 또는 진공건조기를 이용하여 건조하며 물을 제거하여 캡슐화 되어있는 활성성분 함량을 극대화시켰다. 또한 회전증발 농축기를 이용하여 2차 캡슐레이션 진행 - phospholipid mitrix내에 1차 캡슐 재포접 (캡슐간의 응집 방지 및 활성성분의 안정성 극대화), 동결건조기 또는 진공건조기를 이용하여 2차 캡슐 건조 실시, 분쇄기를 이용하여 2차 가공된 캡슐을 분쇄하였다.

상기 결과를 보면 완제품에 다량의 진세노사이드 Rg3을 처방하기 위해서는 파우더 제형의 리포좀을 만들 필요가 있어, 액상으로 리포좀을 제조한 후 동결건조기를 사용하여 리포좀을 파우더로 만들어 진세노사이드 Rg3를 37 내지 39%까지 포집시킬 수 있었다. 반면에 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물은 수상에서 용해도가 좋아 특별하게 리포좀 처방이 필요하지 않았다. 그러나 본 연구에서 사용되는 기능성원료가 고분자이므로 피부 침투에 용이할 수 있도록 하기 위해 Nanovesicle과 Micelle(가용화) 처방으로 디자인하는 것이 적합하다는 특징을 알 수 있었다. 또한, 난용성 진세노사이드 Rg3를 리포좀화 시켜 최종 처방에 넣었을 때 유화입자의 안정화를 확인할 수 있었다.

리포좀의 가변형성 평가를 위해서 mini extruder를 사용하여 리포좀이 인공 투과장벽을 통과하는 정도를 측정하였다. 리포좀 현탁액을 0.5 MPa의 압력을 1분간 가했을 때 0.08μm(80 nm) 크기의 기공을 갖는 polycarbonate membrane을 통과하여 나온 리포좀 현탁액의 양을 측정하였다. 결과로는 Micelle 처방에서 극소량 통과되는 것을 보여주었고, 나머지 Nanoliposome, Nanovesicle은 통과가 안되는 것으로 보아 본 연구에서 개발된 리포좀은 탄성이 없는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 Nanoliposome의 크기가 234 nm, Nanovesicle의 크기가 111.11 nm 및 741.2 nm, Micelle의 크기는 70.9 nm 및 545.6 nm이므로 Micelle의 일부가 통과되었기 때문으로 생각된다. 즉 위에서 개발된 리포좀과 Micelle의 경우 탄성이 없어 처방에서 오랫동안 안정화를 유지할 수 있다고 사료된다. 기능성원료 개발내용은 표 1에 나타내었다.

원료	Nanoliposome	Nanovesicle (도라지추출물 A)	Micelle (도라지추출물 B)
진세노사이드 Rg3	20
도라지 추출물(A,B)		2	2
PEG-100 stearate	30
Soya SPL 95H	10
Soya SPL 75H		10
Stearic acid	3
Fucogel 1000
주정	36	20
증류수		57	77
Keltro-F
1.3-BG		5	5
1,2-Hexanediol		2	2
HCO-60		2	2
Glycerine		1	1
사이즈 측정	234.4nm	111.1&741.2nm	70.9& 545.6nm
육안 판단	투명	특이의 색감	특이의 색감
원료 상태	파우더 및 액상	파우더 및 액상	액상

실시예 3-2. 피부투과 실험을 위한 기초처방연구

하기 작성된 처방의 특징은 진세노사이드 Rg3 리포좀과 도라지발효효소처리추출물 Micelle을 이용하여 아토피성 피부에서 일어날 수 있는 면역활성을 높이고, 여러 종류의 polyol과 hyaluronate를 이용하여 도포 후 피부보습을 유지할 수 있도록 처방하였다. 아토피크림 처방 조성물은 표 2에 나타내었다.

No.	Ingredient	%	Ingredient
A	Water	64.00	192
	Disodium EDTA	0.02	0.06
	Tromethamine	0.14	0.42
	Allantoin	0.10	0.30
	DL-Panthenol	0.3	0.9
	Lipidplex 300	1.5	4.5
	도라지발효효소처리추출물	0.1	0.3
	Gisenoside Rg3(20%)	0.2	0.6
	Butylene Glycol	3	9.00
	Dipropylene Glycol	5	15.00
	Glycerin	5	15.00
B	Montanove 202	2.5	7.50
	Kalcol 6850 (Lanette O)	1.8	5.40
	KM105 (GMS105)	1	3.00
	Shea buffer	2	6.00
	Phytosqualane	2	6.00
	jojoba oil	2	6.00
	Sya SPL 95H	2	6.00
	Macadamia Nut oil	4	12.00
	Vitamin E Acetate	0.5	1.50
	Cooling: 30∼35℃
C	Fragrance(Parfum)	0.04	0.12
D	1,2-Hexandiol	2	6
	SC-Glucan	0.5	1.5
	Sodium Hyaluronate 1%	2	6
	Sepiplus 400(후기점증제)	0.3	0.9

Ginsenoside Rg3 리포좀, 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle, Ginsenoside Rg3 리포좀, 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품의 피부흡수율을 확인하기 위해 생체외 피부흡수시험 가이드라인 (Guideline for in vitro Skin Absorption method)에 따라 피부 투과 대체 실험을 Franz diffusion cell method을 이용하여 진행하였다. 피부흡수 실험에 사용한 membrane은 인간피부표피와 가장 유사한 아퓨어스(주) 사의 Micropig Franz Cell membrane (2cm X 2cm X 70 μm)을 사용하였으며 유효면적은 0.785 cm² 이다. Franz Diffusion Cell system은 ㈜유엠씨사이언스 사의 경피흡수시스템 LOGAN FDC-6T을 사용하였다(도 3).

냉동 상태의 Micropig Franz Cell membrane을 상온에서 해동시킨 후 0.9% NaCl에서 30분 동안 수화시킨 후 Receptor chamber에 올려 조립하였다. receptor fluid는 시험물질이 잘 녹고 분석에 영향을 주지 않는 용액으로 ginsenoside Rg3는 sodium phosphate buffer (pH 7.4), platycodin D는 DiH2O:EtOH(4:1) 각 5 mL를 채운 후 각질층이 위로 향하도록 donor와 receptor phase사이에 membrane을 고정시켰다. 피부 흡수 실험은 항온수조를 이용해 온도를 37.5 ℃ 습도는 30 내지 70%로 유지하며 30분간 안정화 후 진행하였다. ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle, ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품 각 0.2 mL씩 donor를 통하여 피부 표면에 도포한 후 마그네틱바를 이용하여 600 rpm을 유지하여 receptor fluid가 잘 혼합될 수 있게 하였으며 도포 후 1, 2, 5, 10, 24 처리시간에 따라 매회 0.5 mL의 receptor phase를 sampling port를 통하여 채취하였다. 채취 직후 동량의 receptor phase를 receptor chamber에 보충하였다.

24시간 초과 시 membrane 상태가 악화되므로 시료 채취 시간은 24시간을 넘기지 않았으며 채취한 시료 속 ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량은 LC-MS/MS를 이용하여 크로마토그램 면적 값을 계산된 회귀직선 방정식에 대입하여 총 누적투과량의 함량을 나타냈으며 피부흡수 노출 시험의 결과를 해석하기 위한 수치로 amount permeated(μg/cm²) 값으로 표현하였다. 처리 24 시간 후 각질층과 진피층에 남아있는 ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 측정하기 위해 membrane을 각각의 수용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 각질층에 존재하는 ginsenoside Rg3 및 platycodin D를 추출하기 위하여 tape stripping (3M sticky tape) 방법을 3반복 사용하였다. 진피층에 존재하는 ginsenoside Rg3 및 platycodin D는 추출하기 위하여 receptor phase와 닿지 않은 부분을 잘라내고 남은 부분에 대해 수술용 가위를 이용해 세절하였다. 각질층과 진피층에서의 추출 방법은 1 mL의 ethanol/water(1:1, v/v)을 넣고 24시간동안 초음파 세척기를 이용하여 추출 처리하였으며 membrane에 남아있는 ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 따로 측정하였다. 피부흡수율이 높은 caffeine을 이용하여 대조구로 실험을 진행하였다. 피부흡수 시험 조건은 표 3에 나타내었다.

	Ginsenoside Rg3	Platycodin D	Caffeine
수용액(5mL)	Sodium phosphate buffer(pH 7.4)	DiH2O:EtOH (4:1)	생리식염수 (pH 7.4)
온도(°C)	37.5
처리 시간(H)	1, 2, 5, 10, 24

각질층 표면에서 화학물질의 피부투과는 분배와 확산을 거쳐 각질층 이하로 다시 분배되며 표피와 진피를 지나 혈관으로 전달된다. 각질층은 친수성과 불투과성 막으로 구성되어 있으며, 다양한 수분함량의 차이는 화학물질의 용해도에 영향을 미치므로, 화학물질의 피부투과를 측정하는 것은 매우 어려운 일이다. 본 연구에서는 생체외 피부흡수시험 가이드라인 (Guideline for in vitro Skin Absorption method)에서 제시된 Franz method에 따라 FMicropig Franz Cell membrane를 사용하여 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle, ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품의 시간에 따른 피부흡수투과 특성 실험을 진행하였다. Ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 분석하기 위하여 LC-MS/MS를 이용하였다. ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물을 함유하는 화장품을 Franz diffusion cell에 도포하여 시간에 따른 ginsenoside Rg3 및 platycodin D의 투과 여부를 확인하기 위해 먼저 ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 분석하였다(도 4).

그 결과 평균 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle의 ginsenoside Rg3 함량은 20.4%, platycodin D 함량은 0.02%이었다. 또한 ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle을 함유하고 있는 화장품의 평균 ginsenoside Rg3 함량은 0.076% 이었으며 platycodin D 함량은 정량은 되지 않았으나 precursor ion 및 product ion의 특성이온 확인으로 정성을 확인하였다. 이는 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle의 함량이 비교적 낮고 더불어 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품에서의 낮은 비율에서 기인한 것으로 추정된다 (도 5).

Micropig Franz Cell membrane에 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle의 피부 흡수량을 LC-MS/MS로 정량한 결과 1h, 2h, 5h, 10h, 24h 경과 후 receptor phase에서 sampling한 각각의 sample에서 모두 ginsenoside Rg3 및 platycodin D는 검출되지 않았다. 반면에 membrane에 남은 잔존 ginsenoside Rg3 및 platycodin D 함량을 측정한 결과 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 처리구에서 각질층에 4.2 μg/cm2, 1.8 μg/cm2, 진피층에 9.6 μg/cm2, 3.2 μg/cm2이 각 각 잔존하고 있었다(도 6). Caffeine을 도포한 대조구의 피부 흡수량을 LC-MS/MS로 정량한 결과 1h, 2h, 5h, 10h, 24h 경과 후 receptor phase에서 sampling한 각각의 sample에서 시간이 경과함에 따라 receptor fluid 내의 Caffeine 함량은 증가하였으며 처리 시간 내에 receptor fluid로 투과되지 않은 caffeine은 각질층 및 진피층에 소량 잔존하였다 (도 7). 또한 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 처리구와 유사한 경향으로 ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품 처리구의 피부 흡수량은 1hr, 2hr, 5hr, 10hr, 24hr 경과 후 receptor phase에서 sampling한 각각의 sample에서 모두 ginsenoside Rg3 및 platycodin D이 검출되지 않았으며 membrane에 남은 잔존 Ginsenoside Rg3 및 Platycodin D 함량을 측정한 결과, ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품 처리구에서 각질층에 14.8 μg/cm2, 0.03 μg/cm2, 진피층에 26.4 μg/cm2, 0.1 μg/cm2이 각각 잔존하고 있었다 (도 8).

아토피성 피부염 치료를 위한 이상적인 화장품은 소수성과 친수성의 성질을 모두 가지고 있어야 하지만 극친수성인 분자인 경우 경피로 전달될 수 없으며, 과도한 소수성 분자인 경우는 경피층에 잔류하는 경향이 있다. 그러나 각질층의 지질의 양과 지질층의 두께로 인해 상대적인 피부 투과율은 소수성 물질이 수용성 물질보다 높다고 알려져 있으며, ginsenoside Rg3 리포좀 및 도라지발효효소처리추출물(지표성분 platycodin D) Micelle 함유 화장품의 경우 ginsenoside Rg3 및 platycodin D는 각질층 및 진피층에 잔존하고 있어 매우 효과적이다.

실시예 4. 아토피성 피부 기능성화장품 제조

아토피성 피부 기능성화장품 제조를 위하여 홍삼 및 도라지로부터 제조한 ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물을 사용하였다. Ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물을 함유한 크림제 형태의 화장품을 제조하는데 있어서 제형의 안정성, 소비자의 사용성, 피부에 대한 질감 등을 고려하여 원료는 EWG(Environmental Working Group)의 1, 2급의 안전한 그린 등급 원료를 사용하였고 여러 가지 오일들 중 식용 가능한 식품 등급의 천연오일을 선택하였다. 안정한 크림제 형성과 시간이 경과함에도 층분리가 일어나지 않는 안정한 제품을 제조하기 위하여 몇 몇 유화제, 유화안정제와 유연제 등을 조합하여 피부에 대한 화장품 질감을 증대시킬 수 있는 적정한 농도를 결정하여 첨가하였으며, 크림제 처방을 근거로 하여 아토피성 피부 기능성화장품의 사용감에는 영향을 주지않는 9개 원료의 함량을 고정하였다. 또한 ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물 원료의 효과 증대를 위해서는 많은 함량의 ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물을 조성해야 하지만 연구 결과, 석출되는 특성으로 인하여 많은 양을 조성할 수 없다. 따라서 보습제 및 계면활성제의 함량을 줄여 상대적으로 ginsenoside Rg3 및 도라지발효효소처리추출물 함량을 높이며 사용감을 향상시키고자 폴리머 Aristoflex AVC의 함량을 조절해봤으나 폴리머의 함량이 높을수록 무거운 사용감이 들어 Aristoflex AVC 함량을 0.5%을 낮추었다. 또한 무거운 사용감의 보습제 glycerin을 4%, 비료적 가벼운 보습제인 DIOL PD, polycast-3의 함량을 3%을 낮추어서 발림 현상을 향상시켜 사용감을 증대시켰다. Zemwa propanediol 함량을 3% 감소시켜 봤으나 사용감에는 큰 차이가 없었으며 총 폴리올의 함량은 15%로 사용감을 향상시켰다.

초기 아토피성 피부 기능성화장품의 안정도를 위하여 과량 처방한 주 계면활성제인 Montanov 68의 함량을 2.5%로, Biophilic H의 함량을 1%로 올려 고온안정성 및 제형안정도를 확보하였다, 유화안정성을 위하여 Lanette O 2.8% 로 증가시켰으며, Lipex Shea는 사용감에 많은 영향을 미치므로 초기 1% 함량에서 0.5% 함량으로 감소시켜 사용감을 증대시켰다. 이상의 조성에서 전체적으로 오일양이 줄어들어 Meadow Foam Seed Oil 함량을 2.3% 높여 아토피성 피부 기능성화장품의 제형 및 사용감 등에 있어서 적합한 농도를 결정하였다.

아토피성 피부 기능성화장품의 설정된 베이스 제형에 최대한 적은 함량으로 베이스 원료의 향을 커버하는 향을 선택하기 위하여 Argeville 사로부터 피부트러블이 가장 적은 19개의 향을 추천받아 베이스 제형에 향을 첨가하는 실험을 진행하였다(도 9). 아토피성 피부 기능성화장품의 제형 및 사용감 등에 있어서 적합한 농도 및 향료을 선택하여 각각 원료의 농도를 달리하여 최종 제품에 적용하였다. 아토피성 피부 기능성화장품 조성 함량은 표 4에 나타내었다.

실시예 5. 아토피성 피부 기능성화장품의 단일시험군에서의 인체적용시험.

아토피성 피부로 인한 건조함 완화 효과 평가를 위한 소규모 인체적용시험을 위해 전문시험기관인 한국피부과학연구원과 논의를 통해 기본적인 프로토콜을 설정하였다. 시험자 20명 대상, Split test(좌우측 부위에 대조군과 시험군을 각각 평가), 평가항목으로 경피수분손실량 측정, 수분량 측정, 해당부위 사진촬영, 설문평가, 시험기간은 4주를 설정하였다. 피시험자 기본정보는 표 5에 나타내었다.

등록 피시험자	24명
최종 완료 피시험자	24명
성별	여성
평균연령	46.67세
표준편차	6.86
평균 피부 수분량	38.14

결과 1. 보습 개선 평가

실시예 4에서 제조된 도라지 생물전환체 및 진세노이드 Rg3 함유 아토피성 피부 기능성화장품을 시험물질로 하여 사용 전과 2주 사용 후의 보습 개선을 평가한 결과는 다음과 같다. 시험물질을 사용하여 왼쪽 전완부위의 보습 개선도를 분석한 결과, 피부 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 57.42%가 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나(p<.001) 시험물질이 보습 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 10에 나타내었다.

결과 2. 피시험자의 설문조사를 통한 건조에 의한 가려움증 완화 평가.

피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 대해 설문조사한 결과는 다음과 같다. 피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 대해 설문조사 한 결과, 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.33에서 2주 사용 후 0.96으로, 가려움 빈도는 시험물질 사용 전 3.29에서 2주 사용 후 0.67로, 수면시 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.04에서 2주 사용 후 0.33으로, 가려움이 가장 심할 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.46에서 2주 사용 후 0.92로, 가려움이 가장 적을 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.13에서 2주 사용 후 0.63으로 각각 감소됨을 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나(p<.001) 시험물질이 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 11에 나타내었다.

결과 2-1. 피시험자의 가려움증에 대한 심리상태 설문조사

10 cm Visual Analogue Scale (0=전혀 없다, 10=매우 심하다)을 이용하여 피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 심리상태에 대해 설문조사 한 결과는 다음과 같다. 피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 심리상태에 대해 설문조 사한 결과, 가려움증으로 인한 우울함 정도는 시험물질 사용 전 6.21에서 2주 사용 후 1.29로, 가려움증으로 인한 집중력 저하 정도는 시험물질 사용 전 6.21에서 2주 사용 후 1.17로, 가려움증으로 인한 분노 정도는 시험물질 사용 전 6.17에서 2주 사용 후 1.13으로 각각 감소됨을 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나 (p<.001) 시험물질이 가려움증으로 인한 심리상태 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 12에 나타내었다.

결과 3. 피부수분손실량 개선 평가

Vapometer를 이용한 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 피부수분손실량 개선을 평가한 결과는 다음과 같다. Vapometer를 이용하여 왼쪽 전완부위의 피부수분손실량 개선도를 분석한 결과, 경피수분손실량이 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 21.85%가 감소되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의하게 나타나(p<.01) 시험물질이 피부수분손실량 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. 상기 결과는 도 13에 나타내었다.

결과 4. 피부이상반응 평가

시험담당자에 의한 피부이상반응 평가

피시험자에게 시험물질을 사용한 후 알레르기성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)이나 자극성 접촉 피부염(irritant contact dermatitis)에 대한 이상반응은 관찰되지 않았다.

피시험자 설문조사에 의한 피부이상반응 보고

시험담당자에 의한 이상반응 평가와는 별도로, 피시험자를 대상으로 설문조사를 한 결과 피시험자가 보고한 피부이상반응은 다음과 같다. 피시험자를 대상으로 한 설문조사에서 특별한 피부이상반응은 관찰되지 않았다. 상기 결과는 도 14 및 15에 나타내었다.

아토피성 피부 기능성화장품의 단일시험군에서의 인체적용시험의 결과를 종합하면, 한국피부과학연구원에서는 성인 여성 24명의 피시험자를 대상으로 건조에 의한 가려움증 완화, 피부수분손실량 개선에 대한 인체적용시험을 진행하였다. 시험물질을 이용하여 건조에 의한 가려움증 완화 평가 중 보습 개선도를 분석한 결과, 시험물질 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의한 수준으로(p<.001) 2주 사용 후 57.42%의 보습 개선율을 나타냈다. 피시험자 설문조사를 이용하여 건조에 의한 가려움증 완화를 분석한 결과, 시험물질 사용 전후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 대한 설문조사 결과에서 시험물질 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의한 수준으로(p<.001) 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.33에서 2주 사용 후 0.96으로, 가려움 빈도는 시험물질 사용 전 3.29에서 2주 사용 후 0.67로, 수면시 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.04에서 2주 사용 후 0.33으로, 가려움이 가장 심할 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.46에서 2주 사용 후 0.92로, 가려움이 가장 적을 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.13에서 2주 사용 후 0.63으로 각각 개선됨을 나타냈다. 10 ㎝ Visual Analogue Scale을 이용한 피시험자의 시험물질 사용 전후의 가려움증으로 인한 심리상태 설문조사 결과에서 우울함 정도는 시험물질 사용 전 6.21에서 2주 사용 후 1.29로, 집중력 저하 정도는 시험물질 사용 전 6.21에서 2주 사용 후 1.17로, 분노 정도는 시험물질 사용 전 6.17에서 2주 사용 후 1.13으로 각각 개선됨을 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계학적으로 유의하게 나타나(p<.001), 시험물질이 가려움증으로 인한 심리상태 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. 그리고 Vapometer를 이용하여 피부수분손실량 개선도를 분석한 결과, 시험물질 사용 전과 비교하여 통계적으로 유의한 수준으로(p<.01) 2주 사용 후 21.85%의 피부수분손실량 개선율을 나타냈다. 따라서 시험물질은 건조에 의한 가려움증 완화, 피부수분손실량 개선에 도움을 주는 제품으로 판단된다.

실시예 6. 아토피성 피부 기능성화장품의 2중맹검 인체적용시험

실시예4에서 제조된 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 아토피성 피부 기능성화장품을 시험물질로 하여 피부장벽 기능 회복을 통한 가려움 개선 효과 평가시험이 헬싱키 선언에 근거하여 주식회사 더마프로 기관생명윤리위원회로부터 윤리적, 과학적 타당성을 심의 받아 피험자의 자발적 동의에 의해 윤리적 원칙에 따라 수행되었다. 시험대상자는 화장품 표시, 광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인에 준하여 피부장벽 기능이 저하되어 가려움을 느끼고 건조한 피부를 가진 25~58세 남성 및 여성 피험자 20명(평균 연령 45.70±10.93세)으로 4주간 진행하였다. 시험 제품 중 시험군은 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 복합소재로 도라지 생물전환체인 도라지발효효소처리추출물 함유 Micelle(도라지 H200, 0.2%) 및 순도 90% 이상의 진세노사이드 Rg3 함유 리포좀(정제된 홍삼추출물(Rg-3 H200, 0.4%) 외에 세라마이드(Lipidplex300, 1.5%) 함유) 및 히알루론산(BIO-HYALURONATE 0.5% SOLUTION, 2%)이 함유된 화장품이며, 대조군으로는 유효성분인 도라지발효효소처리추출물 함유 Micelle 및 진세노이드 Rg3 함유 리포좀이 미함유된 아토피성 피부 크림이다. 시험제품은 피험자가 내용물의 차이를 인식할 수 없도록 동일한 제형, 동일한 용기로 진행되었으며 4주 동안 1일 3회(아침, 점심, 저녁), 시험부위(전박, 종아리, 겨드랑이 등 가려움을 느끼는 부위)를 물로만 세정한 후 제품을 적당량 취하여 골고루 펴 바른 뒤 흡수시켜주도록 하였다. 평가는 제품 사용 전, 사용 1주 및 4주 후 시점에서 경피수분손실량, 피부수분량 측정, 피험자에 의한 가려움 자가평가, 설문 평가 및 안전성 평가를 실시하였다. 상기 피험자 정보는 표 6에 나타내었다.

결과 1. 경피수분손실량 평가

경피수분손실량은 Tewameter TM300 (C+K, Germany)를 이용하여 단위 면적당 시간 경과에 따른 수분증발량 (g/h㎡)을 측정하였다. 경피수분손실량은 제품 사용 전과 비교 시, 시험군과 대조군 모두 제품 사용 1주 및 4주 후 시점에서 경피수분손실량이 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 시험군에서 각각 18.87%, 38.08%, 대조군에서 각각 9.73%, 25.20% 였다. 군간 비교 시 시험군은 대조군에 비해 제품 사용 1주 및 4주 후 시점에서 경피수분손실량이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 상기 결과는 도 16에 나타내었다.

결과 2. 피부수분량 분석평가

피부수분량은 Corneometer CM 825 (C+K, Germany)를 이용하여 피부의 수분량이 높을수록 기기내 도체의 전기 용량(capacitance)이 증가하는 원리를 이용하여 수분함량을 측정하였다. 피부수분량 분석은 제품 사용 전과 비교 시, 시험군과 대조군 모두 제품 사용 1주 및 4주 후시점에서 피부수분량이 유의하게 증가하였고(p<0.05), 증가율은 시험군에서 각각 32.53%, 32.41%, 대조군에서 각각 36.33%, 36.18% 였다(p<0.05). 군간 비교 시, 두 군간 유의차는 없었다. 상기 결과는 도 17에 나타내었다.

결과 3. 피부 가려움 자가평가

가려움 자가평가는 Visual Analog Scale (VAS)법을 이용하였고, 0~10점 척도(0, 가려움 없음; ~ 10, 많이 가려움)로 실시하였다. 피험자에 의한 가려움 자가평가는 제품 사용 전과 비교 시, 시험군과 대조군 모두 제품 사용 1주 및 4주 후시점에서 가려움이 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 시험군에서 각각 32.98%, 58.51%, 대조군에서 27.66%, 50.00% 였다. 군간 비교 시 시험군은 대조군에 비해 제품 사용 4주 후 시점에서 가려움이 유의하게 감소하였다(p<0.05). 상기 결과는 도 18에 나타내었다.

결과 3-1. 피부개선 효능에 대한 설문평가

효능에 관한 설문평가는 제품 사용 1주 및 4주 후 시점에서, 사용성에 관한 설문평가는 제품 사용 4주 후 시점에서 5지선다(1, 매우 그렇지 않다; 2, 그렇지 않다; 3, 변화 없음; 4, 그렇다; 5, 매우 그렇다/1, 매우 좋지 않다; 2, 좋지 않은 편이다; 3, 보통이다; 4, 좋은 편이다; 5, 매우 좋다)로 실시하였으며, 긍정적인 답변(4, 5)을 분석하였다. 효능에 관한 설문 평가 결과, 시험군은 제품 사용 1주 후 시점에서 ‘갈라짐 개선’ 항목을 제외한 모든 항목에 대해 피험자의 50%~75%가, 제품 사용 4주 후 시점에서 모든 항목에 대해 피험자의 55%~70%가 긍정적으로 응답하였다. 대조군은 제품 사용 1주 후 시점에서 ‘갈라짐 개선’ 항목을 제외한 모든 항목에 대해 피험자의 50%~80%가, 제품 사용 4주 후 시점에서 모든 항목에 대해 피험자의 60%~80%가 긍정적으로 응답하였다. 사용성에 관한 설문 평가 결과, 시험군은 피험자의 60%~80%가, 대조군은 피험자의 60%~85%가 모든 항목에 대해 긍정적으로 응답하였다. 상기 결과는 도 19에 나타내었다.

결과 4. 안전성 평가

본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않아 안전성을 확인하였으며 도라지 생물전환체 및 진세노사이드 Rg3 함유 복합소재는 피부장벽 기능 회복을 통한 가려움 개선에 도움을 주는 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 도라지 생물전환체; 및 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 포함하는 경피수분손실 예방 또는 개선용 외용제 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 도라지 액상배지로 만드는 것인, 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소인, 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 및 글루카나아제로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 조합물인, 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 구성된 군에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는 것인, 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 Rg3는 홍삼으로부터 추출된 것인, 조성물
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 추가로 아토피성 피부염을 개선할 수 있는 것인, 조성물.
   
8. (a) 도라지를 액상으로 배양배지화 하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계의 배양배지화 한 액상 도라지 배지에 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효하는 생물전환 발효공정을 수행하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계의 생물전환 발효공정에 의해 생산된 발효물로부터 섬유소 분해효소를 처리하는 생물전환 효소처리공정을 수행하는 단계; 및
   (d) 상기 (c)단계의 생물전환체에 진세노이드 Rg3를 추가하는 단계를 포함하는, 경피수분손실 예방 또는 개선용 외용제 조성물의 제조 방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 (a)단계의 도라지의 배양배지화는 도라지를 분말화하여 액상에서 도라지 분말을 가수분해효소로 처리한 후 도라지 액상배지로 만드는 것인, 방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 가수분해효소는 아밀라아제 계열의 가수분해효소 및 셀룰라아제 계열의 가수분해효소 중 적어도 하나인, 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 (C)단계의 섬유소 분해효소는 셀룰라아제를 단독으로 사용하거나 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 및 글루카나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합물인, 방법.
    
12. 제 8항에 있어서,
    상기 (b)단계의 담자균류 균사는 표고버섯, 상황버섯, 차가버섯, 잎새버섯, 목이버섯, 눈꽃송이버섯 및 치마버섯으로 이루어진 그룹에서 선택된 담자균류의 균사로 이루어지는, 방법.
    
13. 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 도라지 생물전환체; 및 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 유효성분으로 포함하는 피부보습 개선용 식품 조성물.
    
14. 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 도라지 생물전환체; 및 진세노사이드 Rg3(Ginsenoside Rg3)를 포함하는 피부보습 개선용 화장료 조성물.
    
    

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