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KR20230015191A - 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법 - Google Patents

무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법 Download PDF

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KR20230015191A
KR20230015191A KR1020210096645A KR20210096645A KR20230015191A KR 20230015191 A KR20230015191 A KR 20230015191A KR 1020210096645 A KR1020210096645 A KR 1020210096645A KR 20210096645 A KR20210096645 A KR 20210096645A KR 20230015191 A KR20230015191 A KR 20230015191A
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South Korea
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dermal layer
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hydrogen peroxide
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KR1020210096645A
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이대형
최예지
김미리
이은규
이승현
김민정
정홍희
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한스바이오메드 주식회사
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Publication date
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Abstract

무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 방법은 이식될 부위의 피부 두께와 유사하게 동종 진피의 두께를 증가시킬 수 있고, 동시에 보다 유연하고 탱탱한 조직을 만들 수 있어 이식 부위에서 조직의 이탈 없이 생착하여 원활한 피부 조직 재생성을 유도할 수 있다.

Description

무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법 {A method for increasing thickness of acellular dermal matrix}
본 발명은 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
피부는 신체의 표면을 덮고 있는 기관으로서 표피, 진피, 피하조직으로 이루어져 있으며 피지선, 한선, 모발, 입모근, 조갑등의 부속기관이 존재한다. 외부환경으로부터 신체를 보호하는 동시에 체온 조절 기능, 감각 기능, 비타민 D 합성 기능 등의 다양한 생리적 작용을 담당하며 표면적은 약 1.6 m2이고 두께는 평균 2~2.2mm 정도이며 부위에 따라 차이가 있다.
현재 손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 자가이식 방법이 주로 이용되고 있는데, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생하여 환자의 고통이 증가하고, 완치되는데 시간이 많이 소요되며, 경제적 부담 또한 크다. 게다가 심한 화상환자와 같이 건강한 신체부위가 충분히 남아있지 않는 경우에는 자가 이식방법을 적용할 수 없거나 여러 차례에 걸쳐 이식수술을 시행하여야 한다는 문제점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다른 사람의 피부를 이용하는 동종이식, 돼지 등과 같은 다른 동물의 피부를 이용하는 이종이식 등이 시도되고 있다 (한국공개특허 10-2018-0028229). 피부 이식재는 기증받은 인체 피부에서 면역반응을 일으키는 표피와 진피에 있는 세포들을 제거하여 진피층의 3차원 구조를 그대로 유지한 무세포 진피 구조 (Acellular Dermal Matrix; ADM) 형태로 제조된다. 이러한 무세포 진피는 면역거부 반응 없이 외상으로 인하여 결손된 피부조직에 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성 등에 필요한 골격을 제공한다.
한편, 피부는 부위에 따라 두께가 상이하므로, 이식이 필요한 부위에 따라 두께가 두꺼운 피부가 요구되나, 기증받은 피부는 요구되는 두께를 만족하지 못하는 경우들이 발생한다. 따라서, 피부이식재의 두께를 효과적으로 증진시킬 수 있는 방법이 요구되는 실정이다.
일 양상은 세포가 제거된 진피층을 과산화수소 용액을 포함하는 반응 용기에 침지시키는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재를 제공한다.
일 양상은 세포가 제거된 진피층을 과산화수소 용액을 포함하는 반응용기에 침지시키는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법을 제공한다.
용어 “세포가 제거된 진피층”은 용어 “무세포 진피층”과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 개체로부터 분리된 피부 조직에서 면역반응을 일으키는 표피와 진피 내의 세포들이 제거된 상태의 피부 조직으로서, 이식 후 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성을 위한 3차원 구조의 지지체를 제공하는 무세포 진피 기질 (Acellular Dermal Matrix; ADM)을 의미할 수 있다. 상기 “세포가 제거된” 또는 “무세포”란, 면역거부반응을 일으킬 수 있는 세포들이 “실질적으로 제거되어” 세포를 “실질적으로 포함하지 않는”의 의미이며, “실질적으로”란 원재료와 비교하여 세포가 90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 제거된 상태를 의미할 수 있다.
상기 세포가 제거된 진피층은 개체로부터 분리된 피부조직에서 표피층을 제거하는 단계; 및 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계;에 의해 수득되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 침지시키는 단계 이전에, 개체로부터 분리된 피부조직에서 표피층을 제거하는 단계; 및 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계;를 더 추가할 수 있다. 표피층의 제거 및 진피층 내 세포의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표피층은 단백질 분해효소, 이온 용액 또는 이들의 조합을 이용하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것일 수 있다. 효소를 사용하는 경우 사용 농도가 낮거나 처리 시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으킬 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등일 수 있다. 1.0 units/㎖ 농도의 디스파아제로 37 ℃에서 60∼120분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 또는 200㎍/㎖ 농도의 터몰리신을 37 ℃에서 30분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 이온 용액을 사용하는 경우 이온 강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 분리 정도가 달라질 수 있다. 상기 이온 용액은 염화나트륨 용액, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 1M 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 1M 이상의 염화나트륨 용액에서는 세균이나 곰팡이 등이 증식할 수 없기 때문에 미생물의 오염 위험을 낮출 수 있다. 또는 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하여 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. EDTA를 이용하면 EDTA가 단백질분해효소 억제제의 역할을 하기 때문에 단백질분해효소에 의한 조직의 손상을 줄일 수 있다. 따라서, 1M의 염화나트륨 용액에 1∼10mM의 EDTA를 첨가하여 처리하면 미생물의 오염이나 효소에 의한 조직 손상을 최소화하며 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 진피층의 세포를 제거하는 단계는 계면활성제, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 처리하여 제거하는 것일 수 있다. 계면활성제로는 소듐도데실설페이트(SDS) 같은 이온성 계면활성제와 트리톤 엑스-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40(NP-40) 등의 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있으며, 이들의 처리농도 및 처리시간은 각 계면활성제에 따라 달라진다. 예를 들어, SDS의 경우에는 실온에서 0.2 내지 1%(w/v)의 농도로 30 내지 120분간 처리하고, 트윈 20의 경우에는 0.1 내지 2.0%(w/v)의 농도로 실온에서 30∼180분간 처리하며, 트리톤 엑스-100 또는 노니데트피-40 용액의 경우에는 0.2 내지 2%(w/v)의 농도로 22 내지 37℃에서 30 내지 180분간 처리하여 세포를 제거할 수 있다. 초음파를 사용할 경우에는 10 내지 100kHz의 초음파를 5 내지 60분 동안 조사하여 세포를 제거할 수 있다. 또는 상기 계면활성제와 초음파를 조합하여 사용하여도 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다. 대부분의 면역반응은 세포막에 존재하는 막 단백질에 의하여 유발되므로, 상기 방법에 의하여 진피층의 세포를 제거할 경우에는, 면역반응을 유발시키는 원인이 제거되어, 이식 후에 면역거부반응으로 인한 조직의 이탈이 발생하지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 기니피그, 또는 개일 수 있으며, 구체적으로, 상기 분리된 피부조직은 인간 사체로부터 분리된 동종 피부일 수 있다.
상기 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 방법은 세포가 제거된 진피층을 과산화수소 용액을 포함하는 반응 용기에 침지시키는 단계;를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 5.0 내지 30.0% (w/v)의 농도일 수 있다. 상기 농도는 상기 범위 내에서 목적하는 피부 두께에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 상기 과산화수소 용액의 농도는 5.0 내지 30.0% (w/v), 5.0 내지 25.0% (w/v), 5.0 내지 20.0% (w/v), 5.0 내지 15.0% (w/v), 5.0 내지 10.0% (w/v), 10.0 내지 30.0% (w/v), 10.0 내지 25.0% (w/v), 10.0 내지 20.0% (w/v), 10.0 내지 15.0% (w/v), 15.0 내지 30.0% (w/v), 15.0 내지 25.0% (w/v), 또는 15.0 내지 20.0% (w/v)일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 과산화수소의 농도가 너무 낮을 경우 두께 증대가 잘 이루어지지 않을 수 있고, 농도가 너무 높을 경우 두께 증대가 이루어지더라도 조직의 치밀도가 떨어져 전반적으로 뻣뻣해지는 양상을 나타낼 수 있거나, 두께 증대가 이루어지더라도 과산화수소에 의한 조직의 손상 및 와해가 있어 보플이 심하게 발생되어 이에 따른 기계적 강도가 약해질 수 있다. 상기 침지시키는 단계는 실온에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 25 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다.
이후, 상기 방법은 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 반응 용기에 진공 조건을 가하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서 확인된 바와 같이, 과산화수소만을 처리하여 반응시키는 것보다 진공 처리를 더 수행하여 반응시킬 경우, 목적하는 두께 증대 효과를 달성하면서도 보다 유연하고 탱탱한 조직을 갖는 피부 이식재의 제조가 가능한 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 두께가 증대된 무세포 진피층 이식재는 소프트하면서 탱탱한 조직이 요구되는 유방과 같은 조직의 재건에 사용되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서. 상기 진공 조건을 가하는 단계는 상기 반응 용기에 1 내지 950 mTorr의 압력 조건을 가하는 것일 수 있다. 다시 말해, 상기 진공 조건을 가하는 단계는 상기 반응용기 내부의 가스의 압력을 1 내지 950 mTorr로 유지시켜 진공상태 하에서 세포가 제거된 진피층과 과산화수소 용액을 30분 내지 24시간 동안 반응시킴으로써 두께를 증대시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 압력 조건은 1 내지 900 mTorr, 1 내지 700 mTorr, 1 내지 500 mTorr, 1 내지 300 mTorr, 1 내지 100 mTorr, 1 내지 50 mTorr, 1 내지 30 mTorr, 1 내지 10 mTorr, 5 내지 900 mTorr, 5 내지 700 mTorr, 5 내지 500 mTorr, 5 내지 300 mTorr, 5 내지 100 mTorr, 5 내지 50 mTorr, 5 내지 30 mTorr, 5 내지 10 mTorr, 10 내지 900 mTorr, 10 내지 700 mTorr, 10 내지 500 mTorr, 10 내지 300 mTorr, 10 내지 100 mTorr, 10 내지 50 mTorr, 또는 10 내지 30 mTorr일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 상기 압력이 너무 높을 경우 두께 증대로 약화된 기계적 강도의 개선 효과가 나타나지 않을 수 있고, 상기 압력이 너무 낮을 경우 압력에 의한 진피층 조직이 치밀화 또는 손상되거나 구조적 변형이 발생할 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 진공 상태 하에의 반응 시간은 30분 내지 24시간, 30분 내지 18시간, 30분 내지 12시간, 30분 내지 6시간, 30분 내지 3시간, 30분 내지 2시간, 30분 내지 1시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 18시간, 1시간 내지 12시간, 1시간 내지 6시간, 1시간 내지 3시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 24시간, 2시간 내지 18시간, 2시간 내지 12시간, 2시간 내지 6시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 24시간, 3시간 내지 18시간, 3시간 내지 12시간, 3시간 내지 6시간, 6시간 내지 24시간, 6시간 내지 18시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 24시간, 또는 12시간 내지 18시간일수 있다. 상기 범위를 벗어나 반응 시간이 너무 짧으면 두께 증대가 잘 이루어지지 않을 수 있고, 반응 시간이 너무 길면 두께 증대가 이루어지더라도 조직의 치밀도가 떨어져 전반적으로 뻣뻣해지는 양상을 나타낼 수 있거나, 두께 증대가 이루어지더라도 과산화수소에 의한 조직의 손상 및 와해가 있어 보플이 심하게 발생되어 이에 따른 기계적 강도가 약해질 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 방법은 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 진공 조건을 가하는 단계 이후에, 상기 진피층에 전자선을 조사하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 진공 조건을 가하는 단계 이후에, PBS와 같은 세척용액을 처리하여 잔여 과산화수소 용액을 제거한 후, 두께가 증가된 진피층을 보관용액에 침지하여 전자선(E-beam)을 조사하는 것일 수 있다. 상기 보관용액은 멸균수, 생리식염수, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 당업계에서 사용되는 공지의 보관용액이라면 어떤 것이든 이용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 전자선의 조사 선량은 1 내지 30 kGy일 수 있다. 예를 들어, 상기 전자선의 조사 선량은 1 내지 30 kGy, 5 내지 30 kGy, 10 내지 30 kGy, 15 내지 30 kGy, 20 내지 30 kGy, 25 내지 30 kGy, 1 내지 25 kGy, 5 내지 25 kGy, 10 내지 25 kGy, 15 내지 25 kGy, 20 내지 25 kGy, 1 내지 20 kGy, 5 내지 20 kGy, 10 내지 20 kGy, 15 내지 20 kGy, 1 내지 15 kGy, 5 내지 15 kGy, 10 내지 15 kGy, 1 내지 10 kGy, 또는 5 내지 10 kGy일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 조사 선량이 너무 낮을 경우 두께 증대로 약화된 기계적 강도의 개선 효과가 나타나지 않거나 증대된 두께가 시간 경과에 따라 감소할 수 있고, 상기 범위를 벗어나 조사 선량이 너무 높을 경우 콜라겐의 2차 구조에 치밀성이 증가되고, 층화되는 경향이 심해지고, 단백질 번들이 열적 변형에 의해 변형되어 전체적으로 뻣뻣한 양상을 나타낼 수 있고, 이전 공정에 의해 증대된 두께가 감소될 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 침지시키는 단계 이전에, 상기 세포가 제거된 진피층의 표면에 복수의 홀을 형성하는 단계;를 더 추가할 수 있다. 상기 복수의 홀은 미세 침을 이용하여 형성할 수 있으며, 예를 들어, 미세 침이 부착된 롤러를 이용하여 세포가 제거된 진피층 상부 및 하부 표면을 1 내지 10회 찔러 미세 크기의 복수의 홀을 균일하게 형성하는 것일 수 있다. 상기 세포가 제거된 진피층 표면에 복수의 미세 홀이 형성됨에 따라 이후 과산화수소 침지 과정에서 과산화수소가 잘 침투되어 두께 증대 효과가 약 3배 가량 향상되는 것일 수 있다. 따라서, 이식될 부위에서 매우 두꺼운 피부가 요구되는 경우 상기 복수의 홀을 형성하는 단계를 더 추가할 수 있다. 상기 복수의 홀은 세포가 제거된 진피층 상부 표면 및/또는 하부 표면에 형성될 수 있으나, 균일한 두께 증대를 위해서는 어느 일 표면이 아닌 상부 및 하부 표면에 모두 형성되는 것이 바람직할 수 있다.
다른 양상은 세포가 제거된 진피층을 과산화수소 용액을 포함하는 반응 용기에 침지시키는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 침지시키는 단계 이후에, 상기 반응 용기에 진공 조건을 가하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 침지시키는 단계 이전에, 세포가 제거된 진피층의 표면에 복수의 홀을 형성하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 진공 조건을 가하는 단계 이후에, 상기 진피층에 전자선을 조사하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 세포가 제거된 진피층, 과산화수소 용액, 침지, 진공 조건, 전자선 조사, 복수의 홀 형성에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 방법은 진공 조건을 가하는 단계 및/또는 전자선 조사 단계를 더 포함함으로써, 목적하는 두께 증대 효과를 달성하면서도 보다 유연하고 탱탱한 조직을 갖는 피부 이식재의 제조가 가능한 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 유방과 같은 조직의 재건을 위한 무세포 진피층 이식재를 제조하는 것일 수 있다,
또 다른 양상은 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재를 제공한다. 상기 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재는 이식 환자에서 면역거부반응을 일으키지 않고, 결손된 피부 조직과 유사한 두께를 형성할 수 있어 조직의 이탈이 없이 생착하고, 섬유아세포의 유입, 신경의 생성, 혈관 재생성 등이 원활하게 이루어질 수 있는 골격을 제공할 수 있다.
일 양상에 따른 방법은 기계적 강도를 유지하면서 이식될 부위의 피부 두께와 유사하게 동종 진피의 두께를 증가시킬 수 있어, 이식 부위에서 조직의 이탈 없이 생착하여 원활한 피부 조직 재생성을 유도할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법의 순서도를 나타낸 것이다.
도 4는 무세포 진피층에 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행한 실시예 1과 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행하지 않은 비교예 1 및 과산화수소 처리 단계를 수행한 비교예 2의 인장력, 최대 힘, 및 신장력을 비교한 결과이다.
도 5는 무세포 진피층에 spike 처리 없이 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행한 후 전자선 조사(5 kGy, 15 kGy)를 수행한 실시예 3과 spike 처리 없이 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계만을 수행한 전자선 조사 전의 실시예 1, 및 두께 증대 처리 전의 비교예 1에 대하여 보관용액에서 4주간 보관 후의 인장력, 최대힘, 및 신장력을 비교한 결과이다.
도 6은 무세포 진피층에 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행하여 두께를 증대시켜 보관용액에 4주간 보관하는 동안의 두께 변화를 전자선 무처리군, 전자선 5 kGy 조사군, 전자선 15 kGy 조사군에 대해 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 과산화수소 처리 및 진공 처리를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조 (BC-H 2 O 2 (vacuum))
조직 은행에서 입수한 시체의 피부를 냉동상태가 유지될 수 있도록 운반하였다. 운반된 피부 조직을 꺼내어 진피층이 아래로 가도록 하여 적당한 크기로 절단하였다. 피부조직을 세척한 뒤, 1M NaCl + 10mM EDTA가 포함된 멸균 증류수를 처리하였다. 핀셋을 이용하여 표피층을 가볍게 잡은 다음, 진피층으로부터 벗겨내 표피층을 제거하고, 세척하여 남아있는 이온 용액을 제거하였다. 그런 다음, 40㎖의 둘베코의 인산완충용액(Dullbecco's phosphate buffered saline, Sigma Chem. Co., USA)을 가하고, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켰다. 이어, 상기 인산 완충용액을 제거하고, 1%(w/v)의 트윈 20이 첨가된 둘베코의 인산완충용액 40㎖을 다시 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 120분간 서서히 진탕시켰다. 이어 1mM EDTA와 gentamicin을 포함하는 멸균 증류수로 세척하여 이식용 무세포 진피층을 제조하였다.
상기 제조된 무세포 진피층을 실온에서 30 %(w/v) 과산화수소 용액에 침지하여 진공 조건(900 mTorr)으로 1 시간 가량 처리한 후, PBS 세척을 수행하였다.
실시예 2. Spike 전처리 후 과산화수소 처리 및 진공 처리를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조 (BC-spike+ H 2 O 2 (vacuum))
상기 실시예 1에서 과산화수소 용액에 침지시키는 단계 이전에 spike 처리 단계를 더 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다. 구체적으로, 미세침이 부착된 롤러를 이용하여 (이하, 'spike 처리'로 명명)하여 무세포 진피층 상단 표면과 하단 표면을 각각 5회 찔러 작은 구멍을 낸 후 복수의 홀이 형성된 무세포 진피층을 실온에서 30 %(w/v) 과산화수소 용액에 침지하여 진공 조건(900 mTorr)으로 1 시간 가량 처리한 후, PBS 세척을 수행하였다.
실시예 3. 과산화수소 처리, 진공 처리, 및 전자선 조사를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조 (BC-H 2 O 2 (vacuum)+전자선 조사(5, 15 kGy))
상기 실시예 1에서 전자선 조사 단계를 더 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다. 전자선 조사 단계는 구체적으로, 서울방사선서비스㈜에 의뢰하여 진행하였고, 자동 컨베이어를 따라 전자빔 조사시설로 들어가며, 전자선 목표 선량을 각각 5 kGy, 15 kGy로 설정하였고, 전자빔은 수직하방의 방향으로 단면조사를 실시하였다. 전자선의 선량은 별도의 선량측정 시스템을 통하여 확인하였다.
실시예 4. Spike 전처리 후 과산화수소 처리, 진공처리, 및 전자선 조사를 수행한 무세포 진피층 이식재 제조 (BC-spike+ H 2 O 2 (vacuum)+전자선 조사(5, 15 kGy))
상기 실시예 2에서 전자선 조사 단계를 더 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다. 전자선 조사 단계는 구체적으로, 서울방사선서비스㈜에 의뢰하여 진행하였고, 자동 컨베이어를 따라 전자빔 조사시설로 들어가며, 전자선 목표 선량을 각각 5 kGy, 15 kGy로 설정하였고, 전자빔은 수직하방의 방향으로 단면조사를 실시하였다. 전자선의 선량은 별도의 선량측정 시스템을 통하여 확인하였다.
비교예 1. 무세포 진피층 이식재의 제조 (BC)
상기 실시예 1에서 무세포 진피층을 과산화수소 용액에 침지하여 진공 조건으로 처리하는 단계를 생략한 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
비교예 2. 과산화수소 처리를 수행한 무세포 진피층 이식재의 제조 (BC- H 2 O 2 )
상기 실시예 1에서 진공 조건으로 처리하는 단계를 생략하여, 무세포 진피층을 실온에서 30 %(w/v) 과산화수소 용액에 침지하여 1시간 가량 처리한 후, PBS 세척을 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무세포 진피층을 제조하였다.
실험예 1: 과산화수소 처리 및 진공 처리에 따른 효과 확인
1.1. 과산화수소 처리 및 진공 처리에 따른 두께 증대 효과 확인
과산화수소 처리 및 진공 처리에 따른 무세포 진피층의 두께 증대 효과를 확인하기 위하여, 과산화수소 처리 및 진공 처리 전후 무세포 진피층의 두께 차이를 평가하였다. 하기 표 1은 과산화수소 처리(30.0 %(w/v), 1 시간)만을 수행한 비교예 2와 과산화수소(30.0 %(w/v), 1 시간) 및 진공 처리를 수행한 실시예 1의 두께 차이를 무처리 대조군인 비교예 1과 비교 평가한 결과이다.
그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 과산화수소 처리 및 진공 처리를 수행한 실시예 1의 무세포 진피층은 무처리 대조군과 비교하여 두께가 평균 0.47 mm 가량 증대된 것을 확인하였다. 이는 과산화수소 처리 및 진공 처리 공정을 통해 무세포 진피층의 두께를 유의하게 증대시킬 수 있음을 의미한다.
구분
(단위: mm) 		원래 두께
(비교예 1) 		H 2 O 2 처리 후 두께
(비교예 2) 		H 2 O 2 + vacuum 처리 후 두께
(실시예 1) 		전/후 두께 차 전/후 두께 차 평균
1 2.82 3.80 - 0.98 0.98
2 2.86 3.83 - 0.97
3 2.76 3.75 - 0.99
4 2.77 - 3.18 0.41 0.47
5 2.75 - 3.14 0.39
6 2.70 - 3.30 0.60
1.2. Spike 전처리에 따른 두께 증대 효과 확인
두께 증대 공정을 수행하기 전에 무세포 진피층에 spike 전처리를 수행할 경우 두께 증대에 영향이 있는지를 확인하기 위하여, spike 전처리 없이 과산화수소 처리 및 진공 처리를 수행한 실시예 1의 무세포 진피층과 spike 전처리 후 과산화수소 처리 및 진공 처리를 수행한 실시예 2의 무세포 진피층을 대상으로, 무처리 대조군인 비교예 1 대비 두께 증대 정도를 비교하였다. 하기 [표 2]는 spike 처리를 하지 않은 실시예 1과 spike 처리를 수행한 실시예 2에서 무처리 대조군인 비교예 1 대비 두께 증대 정도를 확인한 결과이다.
그 결과 하기 표 2에 나타난 바와 같이, spike 비처리군에서는 비교예 1 대비 약 0.462 mm 정도 두께가 증대되었으나, spike 처리군에서는 비교예 1 대비 약 1.183 mm 정도 두께가 증대된 것을 확인하였다. 이는 과산화수소 처리 및 진공 처리 단계를 수행함에 따른 두께 증대 효과가 spike 전처리 단계를 수행함에 따라 평균적으로 3배 가량 증대될 수 있음을 의미한다.
구분 Spike (○) 경우
증대 전/후 두께 차
(실시예 2) 		Spike (X)경우
증대 전/후 두께 차
(실시예 1)
1 2.04 mm 0.40 mm
2 1.33 mm 0.45 mm
3 0.88 mm 0.20 mm
4 1.38 mm 0.37 mm
5 0.80 mm 0.89 mm
6 0.67 mm 0.46 mm
평균 1.183 mm 0.462 mm
1.3. 진공 처리에 따른 물성 저하 개선 효과 확인
무세포 진피층의 두께를 증대시키는 구조적 변형에 따라 무세포 진피층의 기계적 물성이 저하될 수 있는 바, 진공 처리 단계를 수행함으로써 이러한 물성 저하를 개선할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2를 대상으로 기계적 물성 평가를 수행하였다.
구체적으로, 각 조직 시료를 1×5 cm의 크기로 제단하여 만능시험기(universal test machine) 양쪽 지그에 고정하고 시편을 고정한 양쪽 그립 사이 거리는 3 cm가 되게 조절한 후 cross-head speed 50 mm/min의 속도로 인장하여 인장력, 최대 힘, 및 신장력을 측정하였다.
도 4는 무세포 진피층에 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행한 실시예 1, 과산화수소 처리 단계만을 수행한 비교예 2, 무처리 대조군인 비교예 1의 인장력, 최대 힘, 및 신장력을 비교한 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 2의 경우 과산화수소 처리에 의해 두께가 증대됨에 따라 물리구조적으로 버티는 힘인 인장력과 최대 힘은 감소하고 이와 반비례로 신장력은 증가하여 높은 밀착력 및 커버력을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 한편, 과산화수소 및 진공 처리를 수행한 실시예 1의 경우, 비교예 2에 비해 인장력 및 최대 힘 값은 더 높게 나타났는 바, 두께 증대에 의해 감소된 물리구조적 힘을 진공 처리에 의해 개선할 수 있음을 확인하였다. 또한, 두께 증대에 의해 증가된 신장력은 진공 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났으나, 비교예 1보다는 여전히 신장력이 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는, 과산화수소만을 처리하는 것보다 과산화수소 및 진공 처리를 수행하는 본 공정이 목적하는 두께 증대 효과를 달성하면서도 보다 유연하고 탱탱한 조직을 만들 수 있어 상품성이 우수한 피부 이식재를 제조할 수 있으며, 특히, 유방과 같은 조직의 경우 소프트하면서 탱탱한 조직이 요구되므로, 유방 재건을 위한 피부 이식재 제조에도 유용하게 활용될 수 있음을 의미한다.
실험예 2: 전자선 조사에 따른 효과 확인
2.1. 전자선 조사에 따른 물성 저하 개선 효과 확인
전자선 조사에 의해 두께 증대에 따른 물성 저하를 보다 개선할 수 있는지 확인하기 위하여, spike 비처리군인 실시예 1 및 3과 spike 처리군인 실시예 2 및 4에서 전자선 조사 전후의 기계적 물성을 비교 평가하였다. 기계적 물성 평가는 상기 실험예 1.3과 동일한 방법으로 수행하였다.
하기 표 3은 spike 비처리군에서, 과산화수소 처리 단계(30 %(w/v), 1시간) 및 진공 처리 단계만을 수행한 실시예 1과 여기에 전자선 조사(5 kGy, 15 kGy)를 더 수행한 실시예 3의 기계적 물성을 비교 평가한 결과이다. 또한, 하기 표 4는 spike 처리군에서, 과산화수소 처리 단계 (30 %(w/v), 1시간) 및 진공 처리 단계만을 수행한 실시예 2와 여기에 전자선 조사(5 kGy, 15 kGy)를 더 수행한 실시예 4의 기계적 물성을 비교 평가한 결과이다.
실시예 1
(전자선 조사 전)		 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
9.05 130.12 173.18
8.35 128.34 155.64
8.14 156.24 173.56
평균 8.51 138.23 167.46
STDEV 0.48 15.62 10.24
실시예 3(전자선 조사(5kGy) 후) 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
9.24 145.91 146.79
8.17 130.93 163.28
9.15 157.25 151.42
평균 8.85 144.70 153.83
STDEV 0.59 13.20 8.51
실시예 3(전자선 조사(15kGy) 후) 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
10.56 210.72 125.66
13.87 225.69 149.61
11.23 208.31 134.52
평균 11.89 214.91 136.60
STDEV 1.75 9.42 12.11
실시예 2
(전자선 조사 전)		 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
8.02 134.22 172.32
8.11 137.56 168.34
7.92 120.44 178.33
평균 8.02 130.74 173.00
STDEV 0.10 9.08 5.03
실시예 4(전자선 조사(5kGy) 후) 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
10.38 206.85 148.92
14.27 246.33 172.34
12.65 233.46 156.28
평균 12.43 228.88 159.18
STDEV 1.95 20.13 11.98
실시예 4(전자선 조사(15kGy) 후) 구분 Tensile Strength (MPa) Load at Maximum Load (N) Percentage Total Elongation at Maximum Force
10.97 223.00 136.94
17.13 315.20 178.32
12.57 275.38 118.55
평균 13.56 271.19 144.60
STDEV 3.20 46.24 30.61
그 결과, 상기 표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, spike 처리군 및 spike 비처리군 모두에서 전자선 조사 전후로 인장력과 최대 힘 값은 증가하는 것을 확인하였는 바, 두께 증대에 의해 감소된 물리구조적 힘을 전자선 조사에 의해 한번 더 개선할 수 있음을 확인하였다. 또한, 두께 증대에 의해 증가된 신장력은 전자선 조사 전후로 감소되는 것으로 나타났으나, 원재료보다는 여전히 높은 신장력 값을 나타냄을 확인하였다. 이러한 경향성은 15 kGy 조사 조건에서 더 뚜렷하게 나타났다. 상기 결과는, 과산화수소 및 진공 처리만을 수행하는 것보다 전자선 조사를 더 수행하는 본 공정이 목적하는 두께 증대 효과를 달성하면서도 보다 유연하고 탱탱한 조직을 만들 수 있어 상품성이 우수한 피부 이식재를 제조할 수 있으며, 특히, 유방과 같은 조직의 경우 소프트하면서 탱탱한 조직이 요구되므로, 유방 재건을 위한 피부 이식재 제조에도 유용하게 활용될 수 있음을 의미한다.
또한, 전자선 조사에 따른 물성 저하 개선 효과가 장기간 유지 가능한지 확인하기 위하여, 보관용액에 4주간 보관 후의 전자선 선량에 따른 기계적 물성을 무처리군인 비교예 1과 비교 평가하였다.
도 5는 spike 비처리군에서 과산화수소 처리 단계(30 %(w/v), 1시간) 및 진공 처리 단계만을 수행한 실시예 1, 여기에 전자선 조사(5 kGy, 15 kGy)를 더 수행한 실시예 3, 및 무처리군인 비교예 1을 대상으로, 보관용액에서 4주간 보관 후의 인장력, 최대힘, 및 신장력을 비교한 결과이다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 인장력을 제외한 최대 힘과 신장력은 보관용액 4주 후 15 kGy 조사 조건에서 두께 증대 처리 전의 비교예 1과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 이는 특히, 15 kGy 조사 조건에서 콜라겐 층의 가교가 좀 더 조밀하고 층화되어 구조 유지에 유리한 조건을 형성함으로써 전자선 조사에 따른 물성 저하 개선 효과가 장기간 유지 가능함을 의미한다.
2.2. 전자선 조사에 따른 두께 유지 효과 확인
과산화수소 처리 및 진공 처리에 의한 두께 증대 효과가 전자선 조사에 의해 유지될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 [표 2]에서 확인된 두께 증대 정도와 전자선 조사를 더 처리한 후의 두께 증대 정도를 비교하여 두께 변화를 관찰하였다. 하기 [표 5]는 두께 증대 후인 실시예 1 및 실시예 2의 비교예 1 대비 두께 증대 정도, 두께 증대 후 전자선을 조사한 실시예 3 및 실시예 4의 비교예 1 대비 두께 증대 정도, 전자선 조사 전후 두께 감소 정도를 확인한 결과이다.
그 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 전자선 조사에 따라 조사 전에 비해 두께가 소폭 감소하였으나, 15 kGy 조사 조건에서 5 kGy보다 두께 감소 폭이 더 작은 것을 확인하였다. 이는 기계적 물성 강화를 위해 전자선 조사시 15 kGy 조건에서 증대된 두께가 전자선 조사에 의해 감소되는 것을 최소화할 수 있음을 의미한다.
구분 Spike (○) Spike (X)
전자선 조사 전 두께 차
(실시예 2) 		전자선 조사 후 두께 차 (실시예 4) 전자선 전/후 감소정도 전자선 조사 전 두께 차
(실시예 1) 		전자선 조사 후 두께 차 (실시예 3) 전자선 전/후 감소정도
5 kGy 1 2.04 mm 1.75 mm -0.29 mm 0.40 mm 0.29 mm -0.11 mm
2 1.33 mm 1.13 mm -0.20 mm 0.45 mm 0.37 mm -0.08 mm
3 0.88 mm 0.80 mm -0.08 mm 0.20 mm -0.20 mm -0.40 mm
평균 -0.19 mm -0.20 mm
15 kGy 4 1.38 mm 1.07 mm -0.31 mm 0.37 mm 0.30 mm -0.07 mm
5 0.80 mm 0.70 mm -0.10 mm 0.89 mm 0.76 mm -0.13 mm
6 0.67 mm 0.56 mm -0.11 mm 0.46 mm 0.39 mm -0.07 mm
평균 -0.17 mm -0.09 mm
전체 평균 1.183 mm 1.00 mm -0.18 mm 0.462 mm 0.32 mm -0.14 mm
또한, 전자선을 조사하여 두께 증대 효과를 장기간 유지할 수 있는지 확인하기 위하여, 보관용액에 4주간 보관 후의 두께 변화를 전자선 선량에 따라 비교하였다. 도 6은 무세포 진피층에 과산화수소 처리 단계 및 진공 처리 단계를 수행하여 두께를 증대시켜 보관용액에 4주간 보관하는 동안의 두께 변화를 전자선 무처리군, 전자선 5 kGy 조사군, 전자선 15 kGy 조사군에 대해 비교한 결과이다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 전자선 무처리군의 경우 보관용액 상태에서 4주 후 두께 변화가 상대적으로 큰 것으로 나타났으나, 전자선 처리군(5 kGy, 15 kGy)의 경우 4주 후에도 증대된 두께가 유지되는 것으로 나타났으며, 특히, 15 kGy 조사 조건에서 4주 후에도 증대된 두께가 가장 잘 유지되며, 유지된 상태를 넘어 보관용액 상태에서도 어느 정도의 두께 증대가 추가적으로 나타나는 것을 확인하였다. 이는 전자선을 조사함에 따라 과산화수소 및 진공 처리에 의한 두께 증대 효과를 보다 장기간 유지 및 향상시킬 수 있음을 의미한다.

Claims (11)

  1. 세포가 제거된 진피층을 과산화수소 용액을 포함하는 반응 용기에 침지시키는 단계;를 포함하는 무세포 진피층 이식재의 두께를 증가시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 반응 용기에 진공 조건을 가하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 진공 조건을 가하는 단계는 상기 반응 용기에 1 내지 950 mTorr 압력 조건을 가하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 5.0 내지 30.0% (w/v)의 농도인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 침지시키는 단계 이전에, 상기 세포가 제거된 진피층의 표면에 복수의 홀을 형성하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 방법은 상기 진공 조건을 가하는 단계 이후에, 상기 진피층에 전자선을 조사하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 전자선의 조사 선량은 1 내지 30 kGy인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 침지시키는 단계 이전에, 개체로부터 분리된 피부조직에서 표피층을 제거하는 단계; 및 상기 표피층이 제거된 피부조직에서 진피층의 세포를 제거하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 표피층은 단백질 분해효소, 이온용액 또는 이들의 조합을 이용하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 진피층의 세포를 제거하는 단계는 계면활성제, 초음파 처리 또는 이들의 조합을 처리하여 제거하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 무세포 진피층 이식재.
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