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KR20230009682A - 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 제조방법 및 이 제조방법에 의해 생산된 코디세핀 함유 추출물을 활성성분으로 하는 조성물 - Google Patents

항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 제조방법 및 이 제조방법에 의해 생산된 코디세핀 함유 추출물을 활성성분으로 하는 조성물 Download PDF

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KR20230009682A
KR20230009682A KR1020210090389A KR20210090389A KR20230009682A KR 20230009682 A KR20230009682 A KR 20230009682A KR 1020210090389 A KR1020210090389 A KR 1020210090389A KR 20210090389 A KR20210090389 A KR 20210090389A KR 20230009682 A KR20230009682 A KR 20230009682A
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KR
South Korea
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coffee beans
cordycepin
mushroom
roasting
green coffee
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Ceased
Application number
KR1020210090389A
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English (en)
Inventor
유연혁
유화진
유현진
Original Assignee
유화진
유현진
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유화진, 유현진 filed Critical 유화진
Priority to KR1020210090389A priority Critical patent/KR20230009682A/ko
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Abstract

본 발명은 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 종균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종 발효하여 코디세핀이 현저하게 증진된 커피 생두를 제조한 다음 이 생두를 추출하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코디세핀을 함유하는 추출물을 제조할 수 있으며, 기본 베이스가 커피이기 때문에 코디세핀을 함유하는 음료 형태로 공급이 가능하여 산업화 및 상업화에 매우 유용하다.

Description

항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 제조방법 및 이 제조방법에 의해 생산된 코디세핀 함유 추출물을 활성성분으로 하는 조성물{A novel method for producing cordycepin using coffee and mushroom strains showing antibacterial, antifungal, immune enhancement, anticancer, and antithrombotic effects, and a composition comprising an extract containing cordycepin produced by the production method as an active ingredient}
본 발명은 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 제조방법 및 이 제조방법에 의해 생산된 코디세핀 함유 추출물을 활성성분으로 하는 조성물에 관한 것이다.
코디세핀(cordycepin)은 1950년 쿠닝햄(Cunningham) 등에 의해 밝혀진 이후, 약리 활성에 관해 많은 연구가 이루어졌으며. 이와 같은 코디세핀은 m-RNA의 합성을 저해하고 항균, 항진균, 면역증강 및 항암효과가 있는 것으로 주로 알려져 있다(Nature, 166, 949~954, 1950; Cancer Res., 21, 216~220, 1961 ; Biochem. Biophys. Acta., 80, 640~647, 1964).
최근에는 코디세핀의 혈소판 응집억제 작용에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데, 이에 대한 예로, 한국등록특허 제10-464876호에서는 동충하초의 코디세핀을 함유하는 항혈전제 조성물이 개시되어 있다.
그리고 코디세핀 성분을 분리 정제하는 방법으로서, 한국공개특허 제10-2001-0054264호에 동충하초로부터 분리 추출된 항암제용 코디세핀과 그 제조방법이 개시되어 있는데, 이 방법은 동충하초 버섯의 기주와 자실체의 건체를 메탄올로 열탕추출 한 후, 여과하여 메탄올추출물을 제조하고 상기 메탄올 추출물을 Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, Buthanol, Water층으로 분획을 실시한 후, 각 분획에 대하여 검정을 실시하여 활성을 나타낸 분획에 대하여 실리카겔 컬럼상에서 클로로포름-메탄올로 용리시킨 다음, 이를 prep HPLC로 정제하고 메탄올-물(2:8)을 사용하여 활성 peak를 얻은 후 이에 대해서 검정을 실시하고 이 부위만을 계속해서 분리하는 것으로 구성되어 있다.
또한, 한국공개특허 제10-2017-0049353호에는 동충하초로부터 고순도의 코디세핀을 신속하게 추출하는 방법이 개시되어 있는데, 이 방법은 동충하초로부터 동충하초 추출물을 추출하는 단계; 상기 동충하초 추출물을 다공성 겔 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 코디세핀 분획을 얻는 단계; 및 상기 코디세핀 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제한 후 재결정하여 코디세핀을 얻는 단계를 포함하고 있다.
그러나 상술한 방법은 동충하초만을 활용하고 있어 산업화, 상업화 및 우리가 자주 마시는 음료 형태로 제조하는데에 한계를 가지고 있다.
1. 한국등록특허 제10-464876호 2. 한국공개특허 제10-2001-0054264호 3. 한국공개특허 제10-2017-0049353호
따라서 본 발명이 이루고자 하는 과제는 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 제조방법 및 이 제조방법에 의해 생산된 코디세핀 함유 추출물을 활성성분으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은
영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종하여 발효시키는 단계; 및
용매를 물 또는 에탄올로 하여 상기 발효 생두를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 함유 추출물 제조방법을 제공한다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 커피 생두는 발아시킨 것일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균은 효모균에 접종을 한 후에 20 내지 40℃에서 70 내지 170시간 배양한 것일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 발효는 상기 발효는 온도 20 내지 45℃, 습도 35 내지 70%에서 12 내지 120시간 동안 상기 커피 생두에 접종된 복합 종균을 배양하는 것일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 제조방법은 추출단계 전에 상기 커피 생두를 로스팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균이 접종 발효되어 코디세핀 함량이 증진된 커피 생두 및 이를 로스팅한 커피 원두를 제공한다.
또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 상술한 바와 같이 제조된 코디세핀을 다량 함유하는 커피 생두 또는 커피 원두를 추출한 추출물을 활성성분으로 하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 조성물을 제공한다.
본 발명은 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 종균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종 발효하여 코디세핀이 현저하게 증진된 커피 생두를 제조한 다음 이 생두를 추출하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코디세핀을 함유하는 추출물을 제조할 수 있으며, 기본 베이스가 커피이기 때문에 코디세핀을 함유하는 음료 형태로 공급이 가능하여 산업화 및 상업화에 매우 유용하다.
본 발명에 따른 조성물을 복용하는 경우 함량이 증진된 코디세핀에 의해 인간 정상 세포의 면역기능을 활성화하여 암세포의 증식과 재발을 억제하고 혈소판 응집 억제를 통한 항혈전, 항균, 항진균 효과를 얻을 수 있으며, 부수적으로 부드러운 초콜릿 향에 돋보이는 카카오향, 연하고 깊고 풍부한 맛과 향을 느낄 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 커피 생두 제조 방법에 대한 흐름도이다.
도 2 내지 7은 본 발명에 따라 5종 버섯 복합 종균 접종 후 배양 상태를 시간에 따라 커피 생두 사진이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 구체적 내용을 첨부 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 일차적으로 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코디세핀의 함량이 증진된 커피 생두를 제조할 수 있는 방법을 제공하며, 이에 따라 제조된 커피 생두, 이 생두를 이용한 추출물, 이 생두를 로스팅하여 제조되는 커피 원두와 커피 원두를 이용한 추출물을 제공한다. 따라서, 코디세핀의 함량이 증진된 커피 생두 제조방법을 도 1을 참조하여 우선적으로 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 코디세핀 함량이 증진된 본 발명에 따른 커피 생두 제조 방법에 대한 흐름도로서 먼저 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 버섯 복합 종균에 대하여 설명하기로 한다.
코디세핀 함량이 증진된 커피 생두를 제조하는 방법을 다양하게 연구한 끝에 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 종균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 종균을, 특히 바람직하게는 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초의 5종 버섯 복합 종균을 사용하는 것이 생두에서 유효하게 배양 발효되어 코디세핀의 함량을 현저하게 증진시키는 것을 확인하여 본 발명에 적용한 것이다.
상기 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 5종 버섯 종균은 영지버섯 균사체, 상황버섯 균사체, 차가버섯 균사체, 꽃송이버섯 균사체 및 동충하초 균사체를 배양 배지에 각각 또는 2종 이상을 동시에 혼합하여 배양하여 얻어지는 것으로 가장 바람직한 것은 배양 단계에서부터 5종을 혼합하여 복합 배양하는 것이 바람직하며, 5종을 복합 배양할 때 이들의 비율은 특별한 제한이 없으나 바람직하게는 영지버섯 균사체 100중량을 기준으로 다른 균사체는 30 내지 150중량일 수 있다(S100).
즉 2종 이상을 복합 배양할 때는 하나의 균사체 100중량을 기준으로 다른 균체를 30 내지 150중량을 혼합하여 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 배양하여 얻어진 상 버섯 종균을 커피 생두에 직접 접종하여 배양 발효할 수 있으나, 코디세핀의 함량을 더욱 증진하고 원활한 배양 발효를 위하여 효모균에 버섯 종균을 접종하여 배양 배지에서 20 내지 40℃에서 70 내지 170시간 배양한 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 버섯 종균의 배양방법의 배양 온도, 배양 배지, 진탕 속도 및 배양기간 등 본 발명이 속하는 기술 분양 널리 알려진 것이라면 특별한 제한 없이 이용이 가능하며, 배양 배지의 예를 들면 질소원과 무기질 원이 풍부한 배지에서 활발한 생육을 보이는바, MCM 배지 또는 YMPG 배지에서 배양할 수 있다.
이어서 커피 생두에서 잔류농약, 이물질을 제거하는 세척 및 생두 멸균하는데(S200), 커피 생두의 세척 및 멸균의 방법 내지 조건은 본 발명이 속하는 기술에 분야에서 널리 알려진 것이라면 특별한 제한이 없이 이용 가능하다.
다음으로, S 200에서 세척 멸균한 커피 생두에 상기 5종 버섯 복합 종균을 접종한다(S 300). 이때 종균의 접종은 각 버섯의 종균이 액상으로 되어 있으므로 포트(200ml 또는 500ml)에 커피 생두와 종균을 넣어 쉐이킹(shaking) 함으로써 접종된다. 커피 생두와 버섯의 종균의 중량비는 특별한 제한이 없으나 1:0.05~0.30인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 코디세핀 함량 증가의 효율성을 높이기 위하여 커피 생두를 발아한 후에 버섯 종균을 접종할 수 있는데, 발아 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 것이라면 특별한 제한이 없으며, 커피 생두와 물의 중량비를 1:1.0~2.5로 하여 3시간 내지 5시간 동안 36 내지 68℃에서 침지하여 발아시키는 방법을 예로 들 수 있다.
마지막으로, 버섯 종균이 접종된 커피 생두를 배양 발효 후 건조하게 되면(S 400), 본 발명에 따른 코디세핀이 현저하게 증가한 커피 생두 제조방법은 완료된다.
상기 배양 발효는 접종한 커피 생두를 발효기에 넣고 온도 20 내지 45℃, 습도 35 내지 70%에서 12 내지 120시간 동안 실시하는 것이 바람직하며, 배양 발효를 시작하여 대략 12 내지 24시간 후부터 시큼한 발효된 식초 향이 올라오며 커피 생두 표면에 버섯 균주가 착상하는 것을 육안으로 확인이 가능하며, 커피 생두 표면에 배양된 버섯 균주가 피어나고 시큼한 발효된 식초 향이 강하게 올라오면 발효를 멈추면 되며 이때까지의 시간이 12 내지 120시간까지 다양한 폭으로 소요될 수 있다.
상술한 배양 발효의 예로서 발아된 커피 생두에 20중량%의 5종 복합 버섯 종균을 접종한 후에 발효기에 넣고 온도 25℃, 습도 60%에서 배양 발효하여 버섯 균주가 피어나는 상태에 사진을 도 2 내지 도 7에 나타냈다.
상술한 바와 같이 제조된 커피 생두를 추출하면 본 발명에 따른 추출 조성물을 제조할 수 있으며, 또는 커피 생두를 로스팅하여 제조한 커피 원두를 추출하여 제조할 수 있는데, 이를 로스팅 방법 내지 추출 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 것이라면 특별한 제한이 없으며, 물 또는 에탄올을 용매로 추출하는 것이 바람직하다.
이하 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
< 실시예 1>
영지버섯 균사체, 상황버섯 균사체, 차가버섯 균사체, 꽃송이버섯 균사체 및 동충하초 균사체를 동일 중량 비율로 하여 MCM 배지에 동시에 혼합한 후 23℃에서 168시간 동안 복합 배양하여 얻어진 5종 버섯 복합 종균을 세척 멸균한 커피 생두와 함께 포트에 넣어 쉐이킹(shaking)하여 접종하였다. 이때 커피 생두와 5종 버섯 복합 종균의 중량비는 1:0.2이었다.
이어서 발효기에 온도 29℃~39℃, 습도 46~60%에서 배양 발효하여 버섯 균주가 피어나는 상태를 확인하여 발효를 종료하였으며, 종료 때까지 총 발효 시간은 120시간 이었다.
< 실시예 2>
실시예 1과 동일하며 다만 커피 생두를 멸균한 후에 커피 생두와 물의 중량비를 1:2로 하여 3시간~5시간 동안 36℃ 내지 68℃에서 침지하여 발아시킨 것을 사용하여 5종 버섯 복합 종균을 접종한 것에 차이가 있다.
< 실시예 3>
상기 실시예 1과 동일하며 다만 배양한 효모균에 5종 버섯 복합 종균을 접종하여 36℃에서 168시간 동안 배양하여 커피 생두에 접종한 것에 차이가 있다.
< 실시예 4>
실시예 1과 동일하며 영지버섯 균사체만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 5>
실시예 1과 동일하며 상황버섯 균사체만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 6>
실시예 1과 동일하며 차가버섯 균사체만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 7>
실시예 1과 동일하며 꽃송이버섯 균사체만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 8>
실시예 1과 동일하며 동충하초 균사체만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 9>
실시예 1과 동일하며 영지버섯 균사체. 상황버섯 균사체 및 동충하초 균사체 3종만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 10>
실시예 1과 동일하며 상황버섯 균사체, 차가버섯 균사체 및 꽃송이버섯 균사체 3종만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 11>
실시예 1과 동일하며 영지버섯 균사체, 차가버섯 균사체 및 동충하초 균사체 3종만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 12>
실시예 1과 동일하며 영지버섯 균사체, 상황버섯 균사체, 차가버섯 균사체, 및 동충하초 균사체 4종만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 실시예 13>
실시예 1과 동일하며 영지버섯 균사체, 상황버섯 균사체, 차가버섯 균사체, 및 꽃송이 버섯 균사체 4종만을 사용한 것에 차이가 있다.
< 시험예 1: 로스팅 원두 추출물의 코디세핀 함량 측정>
상기 실시예의 커피 생두를 건조한 후에 90℃ ~ 189℃ 21분, 189℃~ 198℃ 2분의 저온 로스팅하여 원두를 제조한 후 이를 분쇄하여 원두 분말을 제조하여 제조한 원두 분말에 대하여 코디세핀 함량을 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈으며, 대조군으로 동충하초 에탄올 추출물을 다공성 겔 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 얻은 분획을 사용하였다.
코디세핀의 함량은 HPLC를 이용하여 다음과 같이 분석하였다.
기기 : Waters (Waters e2695 module, Waters 2998 PDA)
컬럼 : Waters Spherisorb?? 10㎛ ODS2 컬럼 (4.6 × 250㎜ Analytical)
유속 : 1㎖/min
파장 : 254㎚
이동상 : 0.01M KH2PO4의 15% 메탄올
코디세핀 함량(mg/g)
대조군 0.0012
실시예 1 12.3
실시예 2 14.7
실시예 3 16.2
실시예 4 5.8
실시예 5 5.9
실시예 6 5.6
실시예 7 5.8
실시예 8 5.9
실시예 9 7.5
실시예 10 7.8
실시예 11 8.1
실시예 12 10.7
실시예 13 10.9
상기 표 1의 결과를 보면 대조군과 비교하여 현저하게 코디세핀 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 5종의 복합 종균을 이용한 실시예에서 코디세핀의 함량 차이가 매우 크다는 것을 알 수 있었습니다.
< 시험예 2: 원두 추출물의 향 및 맛 평가>
시험예 1에서 사용한 커피 원두 분말과 동일한 분말을 이용하여 추출물을 제조한 후 관능검사 패널로는 해당 분야에 경험이 많은 숙련된 10명(20~30대 남자 5, 여자 5)을 모집하였고, 5점 척도법에 따라 탄맛, 쓴맛, 신맛 및 뒷맛과 바디감 등에 대한 종합 평가를 조사하여 그 결과를 표 2에 나타냈다. 대조군은 아무 처리도 하지 커피 생두를 시험예 1과 동일하게 로스팅하여 사용하였다.
관능 종합 평가
대조군 2.4
실시예 1 4.1
실시예 2 4.4
실시예 3 4.9
실시예 4 3.2
실시예 5 3.2
실시예 6 3.1
실시예 7 3.2
실시예 8 3.5
실시예 9 3.3
실시예 10 3.4
실시예 11 3.4
실시예 12 3.8
실시예 13 3.8
상기 표 2의 결과에서도 본 발명에 따른 추출물에서 우수한 평가를 확인할 수 있었으며, 특히 본 발명에 추출물에 대해서는 부드러운 초콜릿 향에 돋보이는 카카오향, 연하고 깊고 풍부한 맛과 향을 느낄 수 있는 종합 평가를 내렸다.
<시험예 3: HepG2 및 HeLa 세포주를 이용한 항암 효과 평가>
상기 실시예의 커피 생두를 건조한 후 열수 추출한 추출물과 상기 실시예의 커피 생두를 건조한 후 90℃ ~ 189℃ 21분, 189℃~ 198℃ 2분의 저온 로스팅하여 원두를 열수 추출물의 항암 효과를 알아보기 위하여 미국 종균협회 ATCC(American Type Culture Collection)사로부터 입수한 인간 자궁 경부암 세포주(haman cervical carnoma cell line)인 HeLa 세포주 및 인간 간암 세포주(Hapatocellular carcinoma cell line)인 HepG2 세포주를 이용하여 세포수준에서의 종양세포 증식 억제 효과를 관찰하였다.
상기 추출물의 종양 세포 증식 억제 효과를 관찰하기 위해서 널리 사용되고 있는 MTT 분석법(MTT assay)을 이용하였다.
HeLa 세포주를 56℃로 불활성화시킨 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 항생제/항균제(10,000U/ml의 페니실린, 25㎍/㎖의 암포테신 D 또는 10mg/㎖의 스트렙토 마이신)가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃의 온도로 가습된 5% CO2 상태를 유지하면서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 1㎖당 1ⅹ105 개의 HeLa 세포를 24웰 배양 플레이트에 접종하고 12시간 동안 배양한 후 부착되지 않은 세포를 멸균 인산 완충액으로 3회 세척하고 상기 추출물을 500㎍/㎖의 농도로 처리한 후 37℃의 온도로 가습된 5% CO2 항온 반응기에서 48시간 배양하였다.
배양이 종료되기 4시간 전에 암세포가 배양되고 있는 각각의 웰에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(이하, MTT라 함)(최종농도 0.5㎍/㎖)을 첨가하였다. 다음, 이소프로판올에 염산이 최종 농도 0.04N로 첨가된 용액 100ml를 넣고 약 20분간 실온에서 혼합한 후 ELISA 판독기를 사용하여 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
HepG2 세포에 대해서도 상기 MTT 방법과 동일한 방법으로 실시하여 측정된 암세포의 생존율로부터 종양 세포 증식 억제 효과를 평가하였다. 그 결과는 표 3에 나타냈으며, 대조군은 아무 처리도 하지 않은 건조 생두 추출물과 동일한 조건으로 저온 로스팅한 커피 원두 추출물로 하였다.
HepG2 세포주 생존율(%) HeLa 세포주 생존율(%)
대조군 생두 91.2±1.2 89.4±1.1
대조군 로스팅 원두 91.5±1.3 90.5±0.9
실시예 1 생두 24.1±1.3 23.4±1.3
실시예 1 로스팅 24.5±1.2 24.9±1.3
실시예 2 생두 20.1±1.3 20.5±1.2
실시예 2 로스팅 20.8±1.3 21.1±1.3
실시예 3 생두 17.2±1.1 17.1±1.3
실시예 3 로스팅 17.9±1.3 17.3±1.2
실시예 4 생두 44.1±1.1 44.3±1.3
실시예 4 로스팅 44.5±1.3 44.8±1.3
실시예 5 생두 43.9±1.2 43.1±1.1
실시예 5 로스팅 43.9±1.4 43.8±1.3
실시예 6 생두 44.2±1.3 44.9±1.2
실시예 6 로스팅 44.3±1.2 45.1±1.3
실시예 7 생두 44.1±1.2 44.9±1.2
실시예 7 로스팅 43.9±1.3 17.9±1.2
실시예 8 생두 44.4±1.3 17.9±1.2
실시예 8 로스팅 44.9±1.2 17.9±1.2
실시예 9 생두 35.1±1.2 35.4±1.3
실시예 9 로스팅 36.7±1.3 36.2±1.1
실시예 10 생두 36.4±1.2 36.7±1.3
실시예 10 로스팅 36.9±1.2 37.5±1.2
실시예 11 생두 34.1±1.3 35.1±1.2
실시예 11 로스팅 34.9±1.1 36.5±1.1
실시예 12 생두 31.4±1.3 31.8±1.3
실시예 12 로스팅 32.1±1.1 32.7±1.2
실시예 13 생두 30.9±1.1 31.4±1.1
실시예 13 로스팅 30.9±1.2 31.6±1.3
상기 표 3의 결과를 보면 대조군과 비교하여 본 발명의 추출물에서 HepG2 및 HeLa 세포의 암세포주의 생존율이 현격히 감소하여 암세포 생존율이 17~45%에 이르는 것을 확인할 수 있었으며, 복합 종균을 사용할수록 효과가 증가함을 알 수 있었다. 상기 시험 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 추출물의 종양 세포 증식 억제효과가 우수함을 알 수 있다.
<시험예 4: 시험동물을 이용한 항암 효과 평가>
상기 시험예 3에서 사용한 추출물의 항암 효과를 시험동물 단계에서 검토하였다.
시험동물은 생후 5주된 25~30g의 웅성 Balb/c 마우스를 대한 바이오 링크사로부터 구입하여 사용하였다. 시험 기간 동안 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물 시험실의 온도는 22± 1℃, 습도 55± 5%로 유지하였다. 또한, 12시간 마다 낮과 밤이 반복되도록 시험실 내 명암주기(light-dark cycle)를 조절하였다.
Balb/c 마우스의 복강내에서 1주일간 계대 배양하여 보존하고 있는 육종세포(sarcoma-180)를 시험용 종양세포로 사용하였다. 즉 시험 동물의 복강내에서 1주일간 배양된 sarcoma-180 세포를 복수와 함께 취하고 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline:PBS)와 함께 원심분리(1,200rpm, 10min)하여 종양세포를 분리하였다.
분리된 세포를 다시 PBS에 부유시켜 재차 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1.0×106 cells/㎖가 되도록 종양세포 부유액을 만들어 1㎖씩을 복강 주사하여 이식 보존하면서 시험에 사용하였다.
시료는 멸균된 PBS를 사용하여 조제하였으며 투여량은 마우스 ㎏당, 40㎎으로 하였다. 투여하지 않을 때는 냉동실에 보관하면서 사용하였다.
시험동물을 각 군 당 10마리씩으로 하여 시험실에서 1주일 간격으로 계대 보관 중인 종양세포 부유액 0.2㎖(5×106cells/mouse)씩을 시험 동물의 왼쪽 서혜부(left groin)에 피하 이식한 후 일주일 후부터 4주간 매일 1회씩 시료 용액를 복강으로 투여하였다.
종양세포 이식 35일째 되는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고 그 무게를 측정한 후, 다음 수학식 1에 따라 종양 성장 저해율(tumor growth inhibition ratio, IR: %)을 계산하였다.
<수학식 1>
Figure pat00001
(상기 수학식 1에서, Cw는 대조군의 평균 종양 무게이고, Tw는 처리군의 평균 종양 무게이다)
또한, 시험예 3의 추출물 대신에 멸균 PBS만 투여한 군을 대조군으로 하여 측정 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
종양 성장 저해율(%)
대조군 0.8±1.2
실시예 1 생두 22.1±1.3
실시예 1 로스팅 22.5±1.2
실시예 2 생두 23.2±1.3
실시예 2 로스팅 23.5±1.3
실시예 3 생두 25.1±1.1
실시예 3 로스팅 25.2±1.3
실시예 4 생두 15.1±1.1
실시예 4 로스팅 15.5±1.3
실시예 5 생두 15.9±1.2
실시예 5 로스팅 15.9±1.4
실시예 6 생두 15.2±1.3
실시예 6 로스팅 15.3±1.2
실시예 7 생두 15.1±1.2
실시예 7 로스팅 15.9±1.3
실시예 8 생두 15.4±1.3
실시예 8 로스팅 15.9±1.2
실시예 9 생두 17.1±1.2
실시예 9 로스팅 17.7±1.3
실시예 10 생두 17.4±1.2
실시예 10 로스팅 17.9±1.2
실시예 11 생두 17.4±1.3
실시예 11 로스팅 17.8±1.1
실시예 12 생두 19.5±1.3
실시예 12 로스팅 20.2±1.1
실시예 13 생두 20.1±1.1
실시예 13 로스팅 19.5±1.2
상기 표 4의 결과를 보면 대조군과 비교하여 본 발명의 추출물에서 종양 성장 억제율이 15% 내지 25% 이르는 것을 확인할 수 있었으며, 복합 종균을 사용할수록 효과가 증가함을 알 수 있었다. 상기 시험 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 추출물의 종양 성장 억제효과가 우수함을 알 수 있다.
<시험예 5: 세포주를 이용한 면역기능 증강 효과>
상기 시험예 1의 면역 기능 증강 효과를 검토하기 위하여 선천성 면역과 후천성 면역의 두반응 모두에 관여하는 면역세포로 특히 비 특이적 면역에 있어 중추적인 역할을 담당하는 대식세포의 활성화를 측정하였다.
본 시험에서는 U937 세포(미국 종균협회 ATCC사로부터 입수)를 사용하여 리소좀성 효소(lysosomal enzyme)의 활성 증가를 산 포스파타아제 분석법(acid phosphatase assay: APL)로 측정하였다.
시험예 3의 추출물 처리하지 않았을 때의 산 포스파타아제의 활성도를 1로 하여, 처리 농도를 200㎍/㎖로 하였을 때 산 포스파타아제의 활성도를 상대비율을 측정하여 그 결과를 표 5에 나타냈으며, 대조군은 아무 처리도 하지 않은 건조 생두 추출물과 동일한 조건으로 저온 로스팅한 커피 원두 추출물로 하였다.
산 포스파타아제 활성도 상대비율
대조군 생두 0.3
대조군 로스팅 원두 0.3
실시예 1 생두 1.7
실시예 1 로스팅 1.7
실시예 2 생두 1.6
실시예 2 로스팅 1.8
실시예 3 생두 2.1
실시예 3 로스팅 2.0
실시예 4 생두 1.1
실시예 4 로스팅 1.3
실시예 5 생두 1.2
실시예 5 로스팅 1.2
실시예 6 생두 1.3
실시예 6 로스팅 1.2
실시예 7 생두 1.2
실시예 7 로스팅 1.3
실시예 8 생두 1.3
실시예 8 로스팅 1.2
실시예 9 생두 1.4
실시예 9 로스팅 1.5
실시예 10 생두 1.5
실시예 10 로스팅 1.5
실시예 11 생두 1.4
실시예 11 로스팅 1.5
실시예 12 생두 1.5
실시예 12 로스팅 1.4
실시예 13 생두 1.4
실시예 13 로스팅 1.3
상기 표 5의 결과를 보면 결과를 보면 대조군과 비교하여 본 발명의 추출물에서 면역기능 증강 효과가 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 복합 종균을 사용할수록 효과는 더욱 증가한다.상기 시험 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 추출물의 면역기능 증강 효과가 우수함을 알 수 있다.
<시험예 6: 시험동물을 이용한 면역기능 증강 효과>
상기 시험예 3 추출물의 면역 기능 증강 효과를 시험동물 단계에서 검토하였다.
시험동물은 생후 5주된 25~30g의 웅성 Balb/c 마우스를 대한 바이오 링크사로부터 구입하여 사용하였다. 시험 기간 동안 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물 시험실의 온도는 22± 1℃, 습도 55± 5%로 유지하였다.
또한, 12시간 마다 낮과 밤이 반복되도록 시험실내 명암주기(light-dark cycle)를 조절하였다.
시료는 멸균된 생리식염수를 사용하여 조제하였으며 투여량은 마우스 ㎏당, 20㎎으로 하였으며, 투여하지 않을 때는 냉장실에 보관하면서 사용하였다.
시험동물을 각 군당 5마리씩으로 하여 시험실에서 전처리한 시료를 600㎕(1㎎/㎖)씩 매일 복강 주사하였다. 30시간 경과 후 마우스를 단두하여 혈액을 얻고 대식세포는 복강 세척으로 획득하여 시험에 적용하였다.
생쥐 복강에서 회수한 대식세포 수가 1× 106개/㎖ 이 되도록 RPMI-1640 배지에 재분산시키고, 이 분산액을 96-웰 플레이트 각 웰에 200㎕씩 분주한 다음 37℃에서 2시간 동안 CO2 배양하여 대식세포를 웰에 고정시킨 후 각 웰에 RPMI1640 완전배지(with 10% FBS)를 가하여 24시간 동안 배양시킨 후 활성화된 대식세포의 단일층에 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 첨가하여 세포막을 용해시켜 이때 분비되는 리소좀성 포스파타아제의 양을 ELISA 판독기(ELISA reader)로 405nm에서 흡광도를 측정하여 대식세포의 활성능 정도를 평가하여 그 결과를 표 6에 나타냈으며, 식염수(saline)를 투여한 군을 대조군으로 하였다.
대식세포의 활성능
대조군 100±1.2
실시예 1 생두 122.2±1.3
실시예 1 로스팅 121.5±1.2
실시예 2 생두 123.5±1.3
실시예 2 로스팅 123.1±1.3
실시예 3 생두 125.1±1.1
실시예 3 로스팅 125.2±1.3
실시예 4 생두 115.4±1.1
실시예 4 로스팅 115.1±1.3
실시예 5 생두 115.6±1.2
실시예 5 로스팅 115.6±1.4
실시예 6 생두 115.2±1.3
실시예 6 로스팅 115.3±1.2
실시예 7 생두 115.1±1.2
실시예 7 로스팅 115.9±1.3
실시예 8 생두 115.4±1.3
실시예 8 로스팅 115.9±1.2
실시예 9 생두 117.1±1.2
실시예 9 로스팅 117.7±1.3
실시예 10 생두 117.4±1.2
실시예 10 로스팅 117.9±1.2
실시예 11 생두 117.4±1.3
실시예 11 로스팅 117.8±1.1
실시예 12 생두 119.5±1.3
실시예 12 로스팅 120.2±1.1
실시예 13 생두 120.1±1.1
실시예 13 로스팅 119.5±1.2
상기 표 6의 결과를 보면 대조군과 비교하여 본 발명의 추출물에서 대식세포의 활성능 증강 효과가 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 복합 종균을 사용할수록 효과는 더욱 증가한다.상기 시험 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 추출물의 면역기능 증강 효과가 우수함을 알 수 있다.
<시험예 7: 시험 동물을 이용한 체중감소 효과>
시험동물은 3주령 스프래그 다우리(Sprague-Dawley)종 숫컷 흰쥐를 구입하여 정상 식이 군과 고지방 식이 군 두 군으로 나누었다.
정상 식이 군은 AIN-76A 식이 #100000 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)로 식이 총 열량의 11.7%를 지방으로 공급하였고, 고지방 식이 군은 지방 급원으로 우지(beef tallow)를 사용하여 AIN-76 고지방 식이 #100496 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)으로 총 열량의 40%를 지방으로 공급하여 사육하였다.
시험동물 4주령부터 10주령까지 6주간 정상 식이와 고지방 식이를 각각 공급하였으며, 10주령부터 4주간 고지방식이에 시험예 추출물을 각각 식이 무게의 3%를 함유한 식이를 공급하여 효과를 관찰하였다.
시험동물은 한 마리씩 분리하여 사육하였고, 물과 식이는 제한없이 공급하였다. 시험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 일주일에 2회 측정하였다. 식이 효율 (Food Efficiency Ratio: FER)은 시험 식이 공급일로부터 희생일까지를 총 시험기간으로 하여 시험기간 동안의 체중 증가량을 시험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하여 그 결과를 표 7에 나타냈다.
식이 효율
정상 식이 8.14
고지방 식이 12.10
실시예 1 생두 8.04
실시예 1 로스팅 8.04
실시예 2 생두 7.98
실시예 2 로스팅 8.01
실시예 3 생두 7.52
실시예 3 로스팅 7.68
실시예 4 생두 8.42
실시예 4 로스팅 8.41
실시예 5 생두 8.43
실시예 5 로스팅 8.41
실시예 6 생두 8.43
실시예 6 로스팅 8.43
실시예 7 생두 8.43
실시예 7 로스팅 8.45
실시예 8 생두 8.43
실시예 8 로스팅 8.46
실시예 9 생두 8.17
실시예 9 로스팅 8.17
실시예 10 생두 8.18
실시예 10 로스팅 8.20
실시예 11 생두 8.19
실시예 11 로스팅 8.21
실시예 12 생두 8.15
실시예 12 로스팅 8.16
실시예 13 생두 8.15
실시예 13 로스팅 8.15
상기 표 7의 결과를 보면, 본 발명의 추출물은 대조군의 고지방 식이 보다는 현저하게 체중 증가가 이루어지지 않았으며 거의 대조군의 정상 식이와 유사하였으며, 특히 5종 복합 종균을 사용하는 경우에는 대조군 정상 식이 보다 더 체중이 감소한 결과를 확인할 수 있었다.상기 결과로부터 본 발명 추출물의 현저한 체중 감소 효과를 확인하였다.
<시험예 8: 시험 동물을 이용한 지방세포 크기 감소 효과>
시험예 7의 각 시험군에서 16주령이 될 때 각 4마리씩 무작위 추출하여 희생시켜 혈액과 장기를 채취하였다.
지방세포의 평균 크기는 적출한 부고환 지방조직을 가위로 약 30번 정도 자른 후, 4%(wt/vol) 알부민과 1.5 mg/ml 콜라지나제(collagenase)(Sigma, USA)를 함유한 배지 199 (Gibco BRL)에서 37℃에서 60분동안 균질화시킨 후, 현미경을 사용하여 약 30개 세포의 직경을 측정하여 결과값을 구하였으며, 이 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
지방세포 크기(㎛)
정상 식이 10.73±3.03
고지방 식이 18.72±4.11
실시예 1 생두 8.46±1.15
실시예 1 로스팅 8.44±1.14
실시예 2 생두 8.27±1.13
실시예 2 로스팅 8.34±1.11
실시예 3 생두 8.07±1.15
실시예 3 로스팅 8.11±1.13
실시예 4 생두 10.17±1.15
실시예 4 로스팅 10.13±1.14
실시예 5 생두 10.21±1.15
실시예 5 로스팅 10.17±1.17
실시예 6 생두 10.20±1.15
실시예 6 로스팅 10.19±1.14
실시예 7 생두 10.19±1.14
실시예 7 로스팅 10.22±1.15
실시예 8 생두 10.22±1.15
실시예 8 로스팅 10.22±1.16
실시예 9 생두 9.75±1.12
실시예 9 로스팅 9.74±1.11
실시예 10 생두 9.81±1.13
실시예 10 로스팅 9.90±1.11
실시예 11 생두 9.89±1.11
실시예 11 로스팅 9.84±1.12
실시예 12 생두 9.32±1.11
실시예 12 로스팅 9.34±1.12
실시예 13 생두 9.30±1.11
실시예 13 로스팅 9.32±1.11
상기 표 8의 결과를 보면, 본 발명의 추출물은 대조군의 고지방 식이 보다는 현저하게 지방세포 크기가 감소하였으며 거의 대조군의 정상 식이와 유사하였으며, 특히 5종 복합 종균을 사용하는 경우에는 대조군 정상 식이 보다 더 감소한 결과를 확인할 수 있었다.상기 결과로부터 본 발명 추출물의 현저한 지방세포 크기 감소 효과를 확인하였다.
<시험예 9 : 혈중 콜레스테롤 함량 변화>
시험예 8에서 채취한 혈액을 이용하여 콜레스테롤의 함량을 키트(Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO))를 이용한 효소비색법으로 측정하여 그 결과를 표 9에 나타냈다.
총 콜레스테롤(mg/dl)
정상 식이 60.71±1.21
고지방 식이 73.10±1.11
실시예 1 생두 61.24±1.15
실시예 1 로스팅 61.18±1.14
실시예 2 생두 60.29±1.13
실시예 2 로스팅 60.17±1.11
실시예 3 생두 58.14±1.15
실시예 3 로스팅 58.29±1.13
실시예 4 생두 67.17±1.15
실시예 4 로스팅 67.13±1.14
실시예 5 생두 67.21±1.15
실시예 5 로스팅 67.17±1.17
실시예 6 생두 67.20±1.15
실시예 6 로스팅 67.31±1.14
실시예 7 생두 66.19±1.14
실시예 7 로스팅 66.58±1.15
실시예 8 생두 66.25±1.15
실시예 8 로스팅 66.22±1.16
실시예 9 생두 65.75±1.12
실시예 9 로스팅 65.74±1.11
실시예 10 생두 64.81±1.13
실시예 10 로스팅 64.90±1.11
실시예 11 생두 64.89±1.11
실시예 11 로스팅 64.84±1.12
실시예 12 생두 63.12±1.11
실시예 12 로스팅 63.19±1.12
실시예 13 생두 63.30±1.11
실시예 13 로스팅 63.32±1.11
상기 표 9의 결과를 보면, 본 발명의 추출물은 대조군의 고지방 식이 보다는 현저하게 총 콜레스테롤 함량이 감소하였으며 거의 대조군의 정상 식이와 유사하였으며, 특히 5종 복합 종균을 사용하는 경우에는 대조군 정상 식이 보다 더 감소한 결과를 확인할 수 있었다.
또한, 침전시약인 덱스트란 설페이트(dextran sulfate) MgCl2 를 이용하여서 LDL과 VLDL을 침전시킨 후 상등액의 콜레스테롤 함량을 키트(Sigma, USA)를 이용하여 비색정량하여 HDL 콜레스테롤을 측정한 본 결과 고지방 식이 군과 실시예 추출물 식이 군에서 차이가 없어 상기 표 9에서의 콜레스테롤 함량 감소는 LDL 콜레스테롤의 감소 따른 것이다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 종균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종 발효하여 코디세핀이 현저하게 증진된 커피 생두를 제조한 다음 이 생두를 추출하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코디세핀을 함유하는 추출물을 제조할 수 있으며, 기본 베이스가 커피이기 때문에 코디세핀을 함유하는 음료 형태로 공급이 가능하여 산업화 및 상업화에 매우 유용하다.
본 발명에 따른 조성물을 복용하는 경우 함량이 증진된 코디세핀에 의해 인간 정상 세포의 면역기능을 활성화하여 암세포의 증식과 재발을 억제하고 혈소판 응집 억제를 통한 항혈전, 항균, 항진균 효과를 얻을 수 있으며, 부수적으로 부드러운 초콜릿 향에 돋보이는 카카오향, 연하고 깊고 풍부한 맛과 향을 느낄 수 있는 장점이 있다.

Claims (10)

  1. 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종하여 발효시키는 단계; 및
    용매를 물 또는 에탄올로 하여 상기 발효 생두를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 커피와 버섯 균주를 활용한 신규한 코디세핀 함유 추출물 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 커피 생두는 발아시킨 것임을 특징으로 하는 코디세핀 함유 추출물 제조방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균은 효모균에 접종을 한 후에 20 내지 40℃에서 70 내지 170시간 배양한 것임을 특징으로 하는 코디세핀 함유 추출물 제조방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발효는 상기 발효는 온도 20 내지 45℃, 습도 35 내지 70%에서 12 내지 120시간 동안 상기 커피 생두에 접종된 복합 종균을 배양하는 것임을 특징으로 하는 코디세핀 함유 추출물 제조방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추출단계 전에 상기 커피 생두를 로스팅하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 코디세핀 함유 추출물 제조방법.
  6. 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균이 접종 발효되어 코디세핀 함량이 증진된 커피 생두.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 커피 생두는 발아시킨 것임을 특징으로 하는 코디세핀 함량이 증진된 커피 생두.
  8. 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균이 접종 발효되어 커피 생두를 로스팅하여 제조된 코디세핀 함량이 증진된 커피 원두.
  9. 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종하여 발효시키는 단계; 및
    용매를 물로 하여 상기 발효 생두를 추출하는 단계를 통하여 제조된 추출물을 활성성분으로 포함하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코피세핀을 함유하는 조성물.
  10. 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 종균을 커피 생두에 접종하여 발효시키는 단계;
    상기 발효 커피 생두를 로스팅하여 커피 원두를 제조하는 단계: 및
    용매를 물 또는 에탄올로 하여 상기 커피 원두를 추출하는 단계를 통하여 제조된 추출물을 활성성분으로 포함하여 항균, 항진균, 면역증강, 항암, 항혈전 효과를 보이는 코피세핀을 함유하는 조성물.
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