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KR20230006037A - 암 치료를 위한 변형된 항체-알부민 나노입자 복합체 - Google Patents

암 치료를 위한 변형된 항체-알부민 나노입자 복합체 Download PDF

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KR20230006037A
KR20230006037A KR1020227045346A KR20227045346A KR20230006037A KR 20230006037 A KR20230006037 A KR 20230006037A KR 1020227045346 A KR1020227045346 A KR 1020227045346A KR 20227045346 A KR20227045346 A KR 20227045346A KR 20230006037 A KR20230006037 A KR 20230006037A
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KR
South Korea
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seq
antibody
albumin
carrier protein
binding motif
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227045346A
Other languages
English (en)
Inventor
스베토미르 엔. 마르코빅
웬디 케이. 네발라
존 토마스 버터필드
다니엘 조셉 크나우어
Original Assignee
메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 filed Critical 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
Publication of KR20230006037A publication Critical patent/KR20230006037A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본원에는 변형된 결합제 및 변형된 운반체 단백질의 조성물뿐만 아니라 변형된 결합제 및 변형된 운반체 단백질을 임의로 적어도 하나의 치료제와 함께 포함하는 나노입자 복합체, 및 이를 제조하는 방법, 및 특히, 암 치료제로서 이를 사용하는 방법이 기재된다.

Description

암 치료를 위한 변형된 항체-알부민 나노입자 복합체 {MODIFIED ANTIBODY-ALBUMIN NANOPARTICLE COMPLEXES FOR CANCER TREATMENT}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 8월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/371,668; 및 2016년 10월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/409,830을 우선권 주장하며, 이들 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
화학요법은 흑색종을 포함한 많은 유형의 암에 대한 주요 전신 요법으로 남아 있다. 대부분의 화학요법제는 종양 세포에 대해 약간만 선택적이며, 건강하게 증식하는 세포에 대한 독성이 높을 수 있어 (문헌 [Allen TM. (2002) Cancer 2:750-763]), 투여량을 줄여야 하고 심지어는 치료를 중단해야 할 수도 있다. 이론적으로, 화학요법 독성 문제를 극복할 뿐만 아니라 약물 효능을 개선시키는 한 가지 방식은, 종양 세포에 의해 선택적으로 발현되는 (또는 과다발현되는) 단백질에 대해 특이적인 항체를 사용하여 화학요법 약물을 종양에 표적화함으로써, 화학요법제의 생체 분포를 변경하고 종양에 더 많은 약물이 들어가게 하고 건강한 조직에는 덜 영향을 미치게 하는 것이다. 그러나, 30년 간의 연구에도 불구하고, 특이적 표적화는 치료 맥락에서 거의 성공하지 못하고 있다.
통상적인 항체 의존성 화학요법 (ADC)은 합성 프로테아제 절단 가능한 링커를 통해 표적화 항체에 연결된 독성 작용제를 이용하여 설계되었다. 이러한 ADC 요법의 효능은 표적 세포의 항체에 대한 결합능, 절단되는 링커, 표적 세포 내로의 독성 작용제의 흡수에 의존적이다 (Schrama, D. et al. (2006) Nature reviews. Drug discovery 5:147-159).
항체 표적화된 화학요법은 표적화 능력, 다수의 세포독성 작용제 및 잠재적으로 덜 독성을 수반한 개선된 치료 능력의 조합을 제공하기 때문에 통상적인 요법에 비해 이점을 보장하였다. 광범위한 연구에도 불구하고, 임상적으로 유효한 항체 표적화된 화학요법은 아직 찾기 어려우며; 주요 장애물은 항체와 화학요법 약물 사이의 링커의 불안정성, 항체와 결합될 때 화학요법제의 감소된 종양 독성, 및 접합체가 종양 세포와 결합하고 이에 진입될 수 없다는 것을 포함한다. 또한, 이들 요법은 항체-약물 접합체의 크기에 대한 제어를 허용하지 않았다.
종래의 치료제에 비해 신뢰성 있고 개선된 항-종양 효능을 제공하기 위해 표적화된 약물 전달에 대한 세포독성 효과를 보유하고 있는 항체-기반 암 치료제가 관련 기술분야에 여전히 필요하다.
치료 항체와 알부민-결합된 파클리탁셀 나노입자 (알부민-결합된 파클리탁셀로서 공지되기도 함; 예를 들어, 아브락산(ABRAXANE)®, ABX)의 제조의 독특한 측면으로 인해, 베바시주맙(bevacizumab), 트라스투주맙(trastuzumab) 및 리툭시맙(rituximab)을 포함한 인간화 치료용 모노클로날 항체가 ABX와 높은 친화도로 결합함으로써, ABX 내의 화학요법제인 파클리탁셀이 종양을 특이적으로 표적화할 수 있는 능력이 부여된다. 더우기, 베바시주맙-코팅된 ABX (AB160)는 인간 흑색종의 마우스 모델에서 ABX 단독보다 더 효과적이었다.
그러나, 모든 항체가 알부민 (또는 ABX)과 원하는 정도로 결합하여 나노입자를 형성하지는 않을 것으로 고려된다. 따라서, 본 개시내용의 한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 알부민-결합 모티프를 함유하도록 변형되는, 알부민-결합 모티프를 함유하지 않은 (예를 들어, 알부민 및/또는 알부민-결합된 파클리탁셀 나노입자와 복합체를 형성하지 않거나 또는 원하는 정도로 복합체를 형성하지 않는) 항체에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 알부민-결합 모티프를 함유하고, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 알부민-결합 모티프를 함유하도록 변형되는 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 베바시주맙, 및 무로모납(muromonab)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 알부민-결합 모티프를 함유하도록 변형되는 변형된 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항체-결합 모티프를 함유하도록 변형되는, 항체-결합 모티프를 함유하지 않은 (예를 들어, 나노입자 복합체를 형성하기 위해 항체와 복합체를 형성하지 않거나 또는 원하는 정도로 복합체를 형성하지 않는) 운반체 단백질에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 항체-결합 모티프를 함유하고, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 항체-결합 모티프를 함유하도록 변형되는 운반체 단백질 (예를 들어, 알부민)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항체-결합 모티프를 함유하도록 변형되는 변형된 운반체 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한, 바람직하게 파클리탁셀을 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 항체 및/또는 운반체 단백질을 함유하는 나노입자 복합체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 측면은 상기 나노입자 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 상기 나노입자 복합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 파클리탁셀과 알부민과의 상호 작용이 알부민에 대한 항체의 친화성을 증가시키고 나노입자 복합체의 형성을 허용하는 것으로 여겨진다. 파클리탁셀을 수반하지 않은, 운반체 단백질과 항체의 나노입자가 암 및 다른 질환의 치료에 유익할 수 있다. 따라서, 본 설명은 파클리탁셀을 수반하지 않고, 부가의 치료제를 수반하거나 또는 수반하지 않는, 변형된 운반체 단백질 및/또는 항체 (또는 다른 항원 결합제, 예를 들어, 융합 단백질)를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 임의의 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 항체-결합 모티프를 운반체 단백질에 부가하고/하거나 알부민-결합 모티프를 항체 (또는 결합제)에 부가하는 것이 운반체 단백질-항체 결합을 증가시켜, 파클리탁셀의 부재하에 나노입자 형성을 허용할 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질; 각각 항원 결합 도메인을 갖는 항체; 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 알부민; 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체 또는 융합 단백질 (여기서, 이러한 항체 또는 융합 단백질은 항원 결합 도메인을 갖는다); 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질; 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체 또는 융합 단백질 (여기서, 이러한 항체 또는 융합 단백질은 항원 결합 도메인을 갖는다); 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 (SEQ ID NO) 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, ㄱ또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다.
한 실시양태에서, 복합체는 1 μm 미만의 평균 크기를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 800 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 400 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 200 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 800 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 400 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 200 nm를 갖는다.
한 실시양태에서, 알부민-치료제 대 항체의 비는 10:1 내지 10:30이다. 한 실시양태에서, 각각의 나노입자 복합체는 약 100개 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 나노입자 복합체는 약 100개 내지 약 800개의 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민이다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다.
한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 동결건조된다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체를 포함하는 조성물은 동결건조된다. 한 실시양태에서, 동결건조된 나노입자 복합체 또는 조성물은 수용액에서의 재구성 시, 생체내에서 항원과 여전히 결합할 수 있는 (인식할 수 있는) 나노입자 복합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민이다. 한 실시양태에서, 알부민은 추가의 항체-결합 모티프를 함유하도록 변형된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 비-공유 결합을 통해 운반체 단백질과 연합(associate)된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체-결합 모티프 및/또는 알부민-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 연합된다. 한 실시양태에서, 파클리탁셀은 비-공유 결합을 통해 운반체 단백질과 연합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 비-공유적으로 연합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 알부민-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 비-공유적으로 연합된다.
한 실시양태에서, 적어도 변형된 운반체 단백질의 서브세트는 1개 초과의 항체-결합 모티프를 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 변형된 항체 또는 융합 단백질의 서브세트는 1개 초과의 알부민-결합 모티프를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 항체는 변형되지 않은 폴리펩티드 서열을 갖는 항체보다 알부민에 대해 더 높은 친화성을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 운반체 단백질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 운반체 단백질은 변형되지 않은 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질보다 항체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 알부민을, 나노입자 복합체를 형성하기 위한 조건 하에, 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체와 조합하는 것을 포함하는, 나노입자 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 나노입자 복합체는 치료제와 조합된다. 한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다.
한 측면에는 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질을 항체와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 나노입자 복합체를 제조하는 방법이 개시된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 나노입자 복합체는 치료제와 조합된다. 한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다. 한 측면에서, 항체는 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 항체이다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에는 폴리펩티드 서열을 갖는 항체를 제공하고, 상기 폴리펩티드 서열을 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시키는 것을 포함하는, 변형된 항체를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 변형된 항체는 변형 전의 항체보다 알부민에 대한 결합에 있어 더 높은 친화성을 갖는다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 변형 이전에는 알부민-결합 모티프를 포함하지 않았다.
한 측면에는 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질을 제공하고, 상기 폴리펩티드 서열을 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시키는 것을 포함하는, 변형된 운반체 단백질을 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 변형된 운반체 단백질은 변형 전의 운반체 단백질보다 항체에 대한 결합에 있어 더 높은 친화성을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 변형 이전에는 항체-결합 모티프를 포함하지 않았다.
한 측면에는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 항체 및/또는 변형된 운반체 단백질을 포함하는 나노입자 복합체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법이 개시되며, 여기서 암은 항원을 발현한다. 한 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 종양 내로의 직접적인 주사 또는 관류를 통해 투여된다.
도 1a는 형광 표지된 리툭시맙 (그린)을 아브락산®와 공동 인큐베이션한 후 형성된 나노입자의 이미지스트림(ImageStream®) 영상을 도시한다.
도 1b는 비표지된 리툭시맙 및 비표지된 아브락산® (ABX) (왼쪽 패널); 형광 표지된 (*) 리툭시맙 및 비표지된 ABX (중간 패널); 또는 형광 표지된 리툭시맙 및 형광 표지된 ABX (오른쪽 패널)를 이용하여 만들어진 AR160의 유동 세포계수 분석을 도시한다.
도 1c는 미립자 분획으로의 분리 후 AR160 (AR160; 블루), 100 킬로달톤 (KD) 초과의 단백질 (>100 KD; 레드), 및 100 KD 미만의 단백질 (< 100 KD; 그린)의 각각의 분획에 존재하는 파클리탁셀의 양을 나타내는 그래프이다. 각각의 분획 중의 파클리탁셀 농도는 HPLC에 의해 결정되었고, 파클리탁셀의 약 69.2%가 미립자 내에 있고 나머지 파클리탁셀은 100 kD 초과의 단백질 중에 있다 (30.5%). 웨스턴 블롯은 100 kD 초과의 분획에서 수행되었으며, 리툭시맙, 파클리탁셀 및 알부민은 대략 200 kD의 밴드에서 공동 국재화되었다.
도 2a는 PE 항-인간 CD19와 함께 (왼쪽 패널), 형광 AR160과 함께 (중간 패널), 또는 둘 다와 함께 (오른쪽 패널) 인큐베이션된 다우디(Daudi) 세포의 유동 세포계수 분석을 도시한다. 다우디 세포는 CD19, AR160 또는 둘 다에 대해 약 75% 양성이었다. 도 2b는 CD19 (레드)와 형광 AR160 (그린) 둘 다로 표지된, 도 2a와 동일한 실험으로부터의 다우디 세포의 이미지스트림 영상을 도시한다.
도 2c는 10 mg ABX를 지시된 양의 리툭시맙 (RIT)과 함께 인큐베이션하고 나노사이트(NanoSight) [맬번 인스트루먼트 리미티드 (Malvern Instruments Ltd; 영국 우스터셔)]에 의해 크기 분포에 관하여 분석한 경우, 각각의 크기의 입자 농도를 나타내는 그래프이다. 표는 크기 분포도 (평균, 10번째 백분위수, 50번째 백분위수, 및 90번째 백분위수)를 나타낸다.
도 3은 정맥내 주입을 위한 정상 식염수 중의 AR160의 시험관내 안정성을 나타내는 그래프이다. AR160의 임상 등급 프렙은 정상 식염수 중에서 상이한 지속 기간 (0h, 1h, 2h, 4h, 6h 및 24h) 동안 실온하에 노출시켰다. 각각의 인큐베이션이 끝날 무렵, 입자의 나노사이트 분석을 수행하여 입자 수 뿐만 아니라 그의 크기 분포도 (평균, 10번째 백분위수, 50번째 백분위수, 및 90번째 백분위수)를 평가하였다. ABX 단독은 대조군으로서 각각의 시점에서 분석하였다.
도 4a는 인간 AB 혈청 중에서의 ABX의 안정성을 나타내는 그래프이다. 30x108개 입자를 인간 AB 혈청에 부가하고 60분 동안 인큐베이션하였다. AB 혈청에 부가된 후 5, 15, 30, 및 60분에 입자 크기 및 수를 결정하였다. 식염수 중의 ABX가 대조군으로서 사용되었다.
도 4b는 인간 AB 혈청 중에서의 AR160의 안정성을 나타내는 그래프이다. 30x108개 입자를 인간 AB 혈청에 부가하고 60분 동안 인큐베이션하였다. AB 혈청에 부가된 후 5, 15, 30, 및 60분에 입자 크기 및 수를 결정하였다. 식염수 중의 ABX가 대조군으로서 사용되었다.
도 4c는 AB 혈청에서의 인큐베이션 후 AR160 (실선)과 비교한 ABX (점선)의 입자 수를 나타내는 그래프이다.
도 5a-5f는 이소형 대조군 항체 (도 5a), 처리 없음 (도 5b), 리툭시맙 (도 5c), 아브락산® (도 5d), AR160 (도 5e), 또는 24시간 동안 식염수에서 인큐베이션시킨 AR160 (도 5f)으로 사전처리시킨 다음, 형광 표지된 항-인간 CD20 항체로 표지시킨 다우디 세포의 유동 세포계수 분석을 나타낸다.
도 6은 지시된 파클리탁셀 농도에서, EdU와 ABX, AR160, 24시간 동안 식염수에서 인큐베이션시킨 AR160 (AR160 24시간), 또는 리툭시맙으로 밤새 처리한 후 다우디 세포의 증식 수준을 나타내는 그래프이다. 증식 수준은 세포를 FITC 표지된 항-EdU로 염색함으로써 결정되었다. 증식 지수는 비처리된 양성 대조군에 대해 정규화함으로써 계산되었다.
도 7a-7g는 식염수 (도 7a), 12 mg/kg (도 7b) 또는 18 mg/kg (도 7c) 하의 리툭시맙, 30 mg/kg (도 7d) 또는 45 mg/kg (도 7e) 하의 아브락산®, 또는 30 mg/kg (도 7f) 또는 45 mg/kg (도 7g) 하의 AR160으로 처리된 마우스에서 시간 경과에 따른 종양 용적을 나타낸다. ABX 및 AR160에 대한 투여량은 파클리탁셀에 근거한다. 도 7h는 도 7a-7g로부터의 데이터에 근거한, 기준선 종양 용적에 있어서의 퍼센트 변화를 나타낸다.
도 8은 도 7a-7h에 나타낸 실험으로부터의 마우스의 생존율을 보여주는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 나타낸다. 표는 각각의 코호트에서의 마우스에 대한 중앙 생존 시간 (일)을 제공한다.
도 9a는 형광 표지된 ABX 단독, 대조군 항체를 수반한 ABX (AB IgG), 또는 AR160으로 처리된 마우스의 종양에서의 약물 침착을 보여주는 IVIS 스펙트럼 형광 오버레이를 수반한 사진이다. ABX는 알렉사플루오르(AlexaFluor) 750으로 표지시킨 다음, 이를 음성 대조군으로서의 IVIG 또는 리툭시맙 (AR160) 중 하나와 결합시키고, IVIS 스펙트럼 [펄킨 엘머(Perkin Elmer)]을 이용하여 각각의 종양 중의 ABX의 농도를 형광에 의해 정량화하였다. 도 9b는 도 9a에 도시된 동물의 종양으로부터의 형광을 나타내는 그래프이다. 관심 영역 (ROI)은 종양에 대해 만들었고 (도 9a에서 불규칙적으로 규정된 부위), 배경으로서 각각의 마우스의 등 위에 있는 원위 부위 (도 9a에서 원형)에 대해 만들었다. 각각의 마우스에 대한 배경 ROI를 종양 ROI로부터 차감하였고, 그로써 생성된 복사 효율을 그래프로 나타냈다.
도 9c는 AR160으로 처리하기 전 24시간에 1%, 10% 또는 100% 용량의 리툭시맙으로 사전처리시킨 마우스의 종양에서의 약물 침착을 보여주는 IVIS 스펙트럼 형광 오버레이를 수반한 사진이다. 도 9d는 도 9c에 도시된 동물의 종양으로부터의 형광을 나타내는 그래프이다. 관심 영역 (ROI)은 종양에 대해 만들었고 (도 9c에서 불규칙적으로 규정된 부위), 배경으로서 각각의 마우스의 등 위에 있는 원위 부위 (도 9a에서 원형)에 대해 만들었다. 각각의 마우스에 대한 배경 ROI를 종양 ROI로부터 차감하였고, 그로써 생성된 복사 효율을 그래프로 나타냈다.
도 10은 조제실에서 제조된 3개의 배치 (AR160 p1, p2, 또는 p3)와 비교한 실험실에서 제조된 AR160 (AR160)의 크기 분석을 나타내는 그래프이다. 크기 (직경; nm)는 평균 크기, 10번째 백분위수, d(0.1); 50번째 백분위수, d(0.5); 및 90번째 백분위수, d(0.9)로서 나타낸다. 각각의 프렙에서의 입자의 수가 또한 결정되었다 (x108개/mL).
도 11a-11h는 이소형 대조군 항체 (도 11a), 사전처리하지 않음 (도 11b), 아브락산® (도 11c), 리툭시맙 (도 11d), 실험실에서 제조된 AR160 (도 11e), 또는 조제실에서 제조된 3개의 AR160 배치 각각 (도 11f-11h)으로 사전처리시킨 다음, 형광 표지된 항-인간 CD20 항체로 표지시킨 다우디 세포의 유동 세포계수 분석을 나타낸다.
도 11i는 지시된 파클리탁셀 농도에서, EdU와 ABX, AR160, 또는 조제실에서 제조된 3개의 AR160 배치 각각으로 밤새 처리한 후 다우디 세포의 증식 수준을 나타내는 그래프이다. 증식 수준은 세포를 FITC 표지된 항-EdU로 염색함으로써 결정되었다. 증식 지수는 비처리된 양성 대조군에 대해 정규화함으로써 계산되었다.
도 12a는 HSA 펩티드 4 (서열번호 3)에 대한 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®)의 결합을 나타낸다. 도 12b는 HSA 펩티드 4에 대한 무로모납 (무로모납-CD3 또는 AKT3으로 지칭되기도 함; 오르토클론(ORTHOCLONE) OKT3®)의 결합을 나타낸다. 도 12c는 HSA 펩티드 4에 대한 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®)의 결합을 나타낸다.
도 12d는 HSA 펩티드 13 (서열번호 4)에 대한 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®)의 결합을 나타낸다. 도 12e는 HSA 펩티드 13에 대한 트라스투주맙의 결합을 나타낸다. 도 12f는 HSA 펩티드 13에 대한 리툭시맙의 결합을 나타낸다.
도 12g는 HSA 펩티드 40 (HSA 아미노산 455-472; 서열번호 5)에 대한 베바시주맙의 결합을 나타낸다. 도 12h는 HSA 펩티드 40에 대한 트라스투주맙의 결합을 나타낸다. 도 12i는 HSA 펩티드 40에 대한 무로모납의 결합을 나타낸다. 도 12j는 HSA 펩티드 40에 대한 리툭시맙의 결합을 나타낸다.
도 12k는 각각의 HSA 펩티드의 아미노산 서열뿐만 아니라 각각의 HSA 펩티드에 대한 각각의 항체의 친화도를 제공한다.
도 13a는 HSA 펩티드 40에 대한 베바시주맙 펩티드 (BEV 펩티드 1; 아미노산 111-125; 서열번호 7)의 결합을 나타낸다. 도 13b는 HSA에 대한 베바시주맙 가변 펩티드 1 (서열번호 7)의 결합을 나타낸다. 도 13c는 HSA에 대한 베바시주맙 가변 펩티드 2 (서열번호 6)의 결합을 나타낸다. 도 13d는 HSA에 대한 리툭시맙 가변 펩티드 1 (서열번호 9)의 결합을 나타낸다. 도 13e는 HSA에 대한 트라스투주맙 가변 펩티드 1 (서열번호 11)의 결합을 나타낸다.
도 13f는 항체를 나타내는 도면이다. 작은 블루 박스는 알부민-파클리탁셀 복합체 중의 알부민과 결합하여 나노입자를 형성하는 베바시주맙과 리툭시맙 상에서의 대략적인 위치를 표시한다. 큰 박스는 베바시주맙 (서열번호 1) 및 리툭시맙 (서열번호 2)에 대한 가변 서열을 제공한다. 각각의 알부민 결합 서열에 밑줄이 그어져 있고 블루 (베바시주맙; 서열번호 8) 및 레드 (리툭시맙; 서열번호 10)로 제시된다. 도 13g는 베바시주맙과 비교한 단일 아미노산 변화의 분석 (레드) 및 예상된 베타 시트 구조 (밑줄친)를 포함한, 도 13a-13e에 사용된 펩티드 중 몇 가지의 서열을 제공한다.
도 14a는 리툭시맙과의 나노입자 형성에 대한 HSA 펩티드 40 경쟁의 효과를 나타낸다. ABX (5 mg/mL)를 리툭시맙 (2 mg/mL)과 함께 인큐베이션하고, 펩티드 없이 (레드 막대), 대조군 펩티드 (HSA 펩티드 10; 그린 막대), 또는 HSA 펩티드 40 (퍼플 막대) 중 하나와 함께 인큐베이션하였다. 펩티드는 항체와 비교해서 10배 몰 과량으로 부가되었다. 직경은 1:200 희석 하에 맬번 나노사이저를 사용하여 측정되었다.
도 14b는 베바시주맙과의 나노입자 형성에 대한 HSA 펩티드 40 경쟁의 효과를 나타낸다. ABX (10 mg/mL)를 베바시주맙 (4 mg/mL)과 함께 인큐베이션하고, 펩티드 없이 (레드 막대), 대조군 펩티드 (HSA 펩티드 10; 그린 막대), HSA 펩티드 13 (퍼플 막대), HSA 펩티드 40 (블루 막대), 또는 BEV 펩티드 12 (오렌지 막대) 중 하나와 함께 인큐베이션하였다. 펩티드는 항체와 비교해서 10배 몰 과량으로 부가되었다. 직경은 1:200 희석 하에 맬번 나노사이저를 사용하여 측정되었다.
도 14c는 리툭시맙과 ABX 간의 복합체 형성에 대한 HSA 펩티드 4 경쟁의 효과를 도시한다. 이로써 생성된 평균 입자 크기는 96 nm (+/- 23 nm)였다. 도 14d는 리툭시맙과 ABX 간의 복합체 형성에 대한 HSA 펩티드 13 경쟁의 효과를 도시한다. 이로써 생성된 평균 입자 크기는 180 nm (+/- 26 nm)였다.
본 설명을 일독한 후, 다양한 대체 실시양태 및 대안적인 적용에 있어서 본 발명을 구현하는 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 다양한 실시양태 모두가 본원에 기재되지는 않을 것이다. 여기에 제시된 실시양태는 단지 한 예로서 제시된 것이며 제한적이 아닌 것으로 이해될 것이다. 따라서, 다양한 대체 실시양태의 이러한 상세한 설명은 하기에 제시된 바와 같은 본 발명의 범위 또는 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
본 발명이 개시되고 기재되기 전에, 하기에 기재되는 측면은 특이적 조성물, 이러한 조성물을 제조하는 방법, 또는 그의 용도로만 제한되지 않으므로, 물론 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 특별한 측면만을 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 상세한 설명은 독자의 편의를 위해서만 여러 섹션으로 나뉘며, 임의의 섹션에서 발견되는 개시내용은 다른 섹션에서의 개시내용과 조합될 수 있다. 본 발명의 범위에 영향을 주지 않는, 독자의 편의를 위해 명세서에 제목 또는 부제를 사용할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 이하의 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의되는 수많은 용어가 언급될 것이다:
본원에 사용된 용어는 단지 특별한 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하고자 한다.
"임의적" 또는 "임의로"는 후속 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 발생할 수 없다는 것을 의미하며, 그러한 설명은 그 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않은 경우를 포함한다.
수 명칭, 예를 들어, 온도, 시간, 양, 농도 및 범위 앞에 사용되는 경우의 용어 "약"은 (+) 또는 (-) 10%, 5%, 1% 또는 그 사이에 있는 임의의 하위 범위 또는 하위 값만큼 다양할 수 있는 근사치를 표시한다. 바람직하게, 용량의 양과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "약"은 그 용량이 +/- 10 % 만큼 다양할 수 있다는 것을 의미한다.
"포함하는" 또는 "포함한다"는 것은 조성물 및 방법이 나열된 요소를 포함하나, 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 "본질적으로 이루어진다"는 것은 명시된 목적을 위해 그 조합에 대한 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 발명의 기본 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "이루어지는" 것은 다른 성분의 미량 이상의 요소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이들 과도기 용어 각각에 의해 정의된 실시양태가 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "나노입자"는 5마이크로미터 미만의 적어도 하나의 치수를 수반한 입자를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 예컨대 정맥내 투여의 경우, 나노입자는 1마이크로미터 미만이다. 직접 투여의 경우에는, 나노입자가 더 크다. 훨씬 더 큰 입자도 본 발명에 의해 명백하게 고려된다.
입자 집단에서는, 개별 입자의 크기가 평균 주위에 분포한다. 따라서 집단의 입자 크기는 평균 및 또한 백분위수로써 나타낼 수 있다. D50은 입자의 50% 미만이 속하는 입자 크기이다. 입자의 10%는 D10 값보다 더 작고 입자의 90%는 D90보다 더 작다. 명확하지 않은 경우, "평균" 크기는 D50과 같다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "운반체 단백질"은 항체 또는 융합 단백질을 수송하는 기능을 하는 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 항체 또는 융합 단백질은 운반체 단백질과 가역적으로 결합할 수 있다. 운반체 단백질의 비-제한적 예가 하기에 보다 상세히 논의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "코어"는 운반체 단백질, 운반체 단백질과 치료제, 또는 다른 작용제 또는 작용제의 조합으로 구성될 수 있는 나노입자의 중앙 또는 내부 부분을 지칭한다.
용어 "완충제"는 동결건조에 앞서 용액 pH를 허용되는 범위로 유지시켜 주는 작용제를 포괄하며, 숙시네이트 (나트륨 또는 칼륨), 히스티딘, 인산염 (나트륨 또는 칼륨), 트리스 (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 디에탄올아민, 시트레이트 (나트륨) 등을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 완충제는 약 5.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 가지며; 바람직하게 약 6.0의 pH를 갖는다. pH를 이러한 범위로 제어하게 될 완충제의 예는 숙시네이트 (예컨대 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.
용어 "제약 제형"은 활성 성분이 유효하도록 해줄 수 있는 형태이며, 제형이 투여될 대상체에게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는" 부형제 (비히클, 첨가제)는 이용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상체 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료제"는 치료상 유용한 작용제, 예를 들어, 질환 상태, 생리학적 병태, 증상 또는 병인적 요인의 치료, 차도 또는 약화를 위하거나 또는 그의 평가 또는 진단을 위한 작용제를 의미한다. 치료제는 비-제한적 예로써, 시각화를 위한 방사성 동위원소 또는 다른 분자; 또는 항암제, 예를 들어, 화학요법제 또는 방사선 요법제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치료제 또는 작용제의 유형이 상기 조성물로부터 명백하게 배제될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체(들)"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분 (즉, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자)을 지칭한다. 상기 용어는 또한, 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄뿐만 아니라 완전한 길이의 항체 및 그의 일부분을 포함한 각종 형태로 구성된 항체를 지칭하고; 예를 들어, 면역글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-그래프트된 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디술피드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체 (dAb), 디아바디, 다중특이적 항체, 이중 특이적 항체, 항-이디오타입 항체, 이중특이적 항체, 그의 기능적으로 활성인 에피토프 결합 단편, 이관능성 혼성체 항체 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]) 및 단일 쇄 (예를 들어, 문헌 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)] 및 [Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)]; 본원에 참조로 포함된다)를 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984); Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)] 참조; 본원에 참조로 포함된다). 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD)의 것일 수 있다. 바람직하게, 항체는 IgG이다. 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스, 염소, 또는 임의의 다른 동물로부터의 것), 완전한 인간, 인간화, 또는 키메라일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 적어도 2개의 도메인을 함유하는 단백질을 지칭하며, 여기서 1개의 도메인은 하나의 단백질로부터 유래되고, 다른 도메인은 상이한 단백질로부터 유래된다. 아플리베르셉트 (잘트랩(ZALTRAP)®)는 결장직장암의 치료를 위하여 FDA에 의해 승인된 융합 단백질이다. 트레바나빕(trebanabib) [AMG386; 암젠(Amgen)] 및 APG 101 [APOCEPT; 아포제닉스(Apogenix)]을 포함한, 암의 치료를 위한 다른 융합 단백질들이 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 Fc-융합 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동결건조된", "동결건조" 등은 건조될 물질 (예를 들어, 나노입자)을 먼저, 동결시킨 다음, 진공 환경에서 승화시킴으로써 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 프로세스를 지칭한다. 부형제가 동결건조 전 제형에 포함되어, 저장 시 동결건조된 산물의 안정성을 증강시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 운반체 단백질, 항체 또는 융합 단백질, 및/또는 치료제는 별도로 동결건조된다. 다른 실시양태에서, 운반체 단백질, 항체 또는 융합 단백질, 및/또는 치료제는 먼저, 조합된 다음, 동결건조된다. 동결건조된 샘플은 추가의 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 항체-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 동결건조는, 예를 들어, U.S. 9,446,148 (그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 사람에서 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 치료를 포괄하며, (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 그의 발생을 저지하는 것; (ii) 질환 또는 장애를 경감시키는 것, 즉 질환 또는 장애의 퇴행을 유발시키는 것; (iii) 질환 또는 장애의 진행을 느리게 하는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 한 가지 이상의 증상의 진행을 억제, 경감 또는 느리게 하는 것을 포함한다.
특정 세포/세포 집단과 관련하여 용어 "사멸"은 그러한 세포/세포 집단의 사멸을 초래하게 될 임의의 유형의 조작을 포함하는 것에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 나노입자 코어를 지칭하는 경우의 용어 "외부 표면"은 코어의 외부에 있는 코어의 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 결합제, 예를 들어 항체 또는 융합 단백질이 외부 표면과 연합된다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체 특이성은 유지하면서"라는 표현은 알부민과 연합된 항체가, 표적화되는 에피토프를 지속적으로 인식 (이와 결합)한다는 것을 나타낸다. 항체 특이성은 큰 나노입자의 맥락에서 및/또는 생체내에서 나노입자의 해리 또는 부분적 해리 후에 보유될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일성" 또는 "유사성"은 두 개의 펩티드 또는 두개의 핵산 분자 간의 서열 유사성을 지칭한다. 참조 폴리펩티드 서열과 관련한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입하며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있는 다양한 방식, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리언(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 비교되는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 또 다른 서열과의 특정의 백분율 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성" 또는 "유사성"을 갖는다는 것은, 정렬될 때, 그러한 백분율의 염기 (또는 아미노산)가 두 서열을 비교하는 데 있어서 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 퍼센트 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 생물학적으로 등가인 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 명시된 퍼센트 서열 동일성을 가지며 동일하거나 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다.
본원에 기재된 변형된 운반체 단백질 또는 변형된 결합제 (예를 들어, 항체)를 지칭하는 경우의 용어 "변형된"은 지시된 폴리펩티드 서열이 단백질 (또는 다른 분자)에 부가되는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변형된 항체는 변형되지 않은 항체에는 존재하지 않았던 알부민-결합 모티프를 함유하도록 변형 (조작, 변경, 돌연변이)시켰거나 또는 이미 존재한 것 이외에 알부민-결합 모티프를 함유하도록 변형시킨 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 모티프는 단백질에 존재하는 아미노산을 변화 (돌연변이)시킴으로써 부가될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 모티프는 모티프 서열을 단백질 (또는 다른 분자) 내로 삽입함으로써 부가될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 모티프는 모티프 서열을 단백질 (또는 다른 분자)과 공유적으로 결합시킴으로써 부가될 수 있다.
부가적으로, 본 명세서에 사용된 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의된다.
변형된 결합제
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 항체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 항체는 알부민과 결합한다 (알부민과 결합할 수 있다). 한 실시양태에서, 변형된 항체는 변형되지 않은 폴리펩티드 서열을 갖는 항체보다 알부민에 대해 더 높은 친화성을 갖는다.
한 측면에는 폴리펩티드 서열을 갖는 항체를 제공하고, 폴리펩티드 서열을 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시키는 것을 포함하는, 변형된 항체를 제조하는 방법이 개시된다. 한 실시양태에서, 변형된 항체는 변형 전의 항체보다 알부민 대한 결합에 있어 더 높은 친화성을 갖는다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 변형 이전에는 알부민-결합 모티프를 포함하지 않았다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 6의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 7의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 8의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 9의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 9의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 10의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 10의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 11의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 11의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 12의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 측면에서, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 알부민-결합 모티프는 참조 서열과 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유한다. 일부 실시양태에서, 그러한 서열을 포함하는 알부민-결합 모티프는 알부민과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 서열을 포함하는 알부민-결합 모티프는 이러한 모티프가 결합제 (예를 들어, 항체 또는 융합 단백질) 내로 삽입될 때 알부민과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
알부민-결합 모티프(들)는 항체의 임의의 영역에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 Fc 부분에 부가된다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 Fab 부분에 부가된다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 하나 또는 둘 다의 중쇄에 부가된다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 하나 또는 둘 다의 가변 영역에 부가된다. 일부 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 하나 또는 둘 다의 경쇄에 부가된다. 바람직하게, 알부민-결합 모티프는 항체의 3차 또는 4차 구조에 실질적으로 영향을 미치지 않을 항체의 특정 영역에 부가된다. 보다 바람직하게, 알부민-결합 모티프는 항체의 항원 결합 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않을 항체의 특정 영역에 부가된다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 아미노 말단 영역에 부가된다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 항체의 카르복시 말단 영역에 부가된다.
한 실시양태에서, 다수의 알부민-결합 모티프가 결합제의 동일한 영역 (예를 들어, 서로 인접하거나 또는 서로 약 1개 내지 약 30개 아미노산 이내)에 부가된다. 한 실시양태에서, 다수의 알부민-결합 모티프가 결합제의 상이한 영역 (예를 들어, 서로로부터 약 30개 초과의 아미노산 및/또는 상이한 폴리펩티드 상)에 부가된다.
바람직하게, 상기 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 비-치료성 및 비-내인성 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 비-내인성 인간 항체, 인간화 항체, 또는 비-인간 항체이다. 항체는 본원에 추가로 정의된다.
한 실시양태에서, 항체는 공지된 치료 항체이다. 본 발명에서 변형되고 사용되는 것으로 고려되는 항체는 리툭시맙, 트라스투주맙, 베바시주맙, 알렘투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이브리투모맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 젬투주맙, 토시투모맙, 무로모납, 또는 그의 임의의 바이오시밀러를 제한 없이 포함한다. 알부민-결합 부위를 함유하는 항체의 경우, 하나 이상의 부가의 알부민-결합 모티프가 변형된 항체를 형성하기 위해 부가될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 단리된 알부민-결합 모티프에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 단리된 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 알부민-결합 모티프는 알부민과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 알부민-결합 모티프는 항체-결합 모티프와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 알부민-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 갖는 펩티드, 또는 그의 변이체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 알부민과 결합하는 결합제 또는 다른 분자를 제조하기 위한, 상기 단리된 알부민-결합 모티프 또는 그의 변이체의 용도에 관한 것이다.
항체를 포함한 펩티드 서열의 변형 및 생산은 현재 공지되어 있거나 또는 앞으로 개발될 것을 포함한, 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용은 추가로, 본원에 기재된 변형된 항체의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 (예를 들어, CHO 또는 HEK 세포) 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스)에 관한 것이다.
변형된 운반체 단백질
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 운반체 단백질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 운반체 단백질은 변형되지 않은 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질보다 항체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다.
한 측면에는 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질을 제공하고, 폴리펩티드 서열을 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시키는 것을 포함하는, 변형된 운반체 단백질을 제조하는 방법이 개시된다. 한 실시양태에서, 변형된 운반체 단백질은 변형 전의 운반체 단백질보다 항체에 대한 결합에 있어 더 높은 친화성을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 변형 이전에는 항체-결합 모티프를 포함하지 않았다.
일부 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민, 젤라틴, 엘라스틴 (토포엘라스틴 포함) 또는 엘라스틴 유래 폴리펩티드 (예를 들어, α-엘라스틴 및 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (ELP)), 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질 (예를 들어, 대두 단백질 단리물 (SPI)), 우유 단백질 (예를 들어, β-락토글로불린 (BLG) 및 카세인), 또는 유장 단백질 (예를 들어, 유장 단백질 농축물 (WPC) 및 유장 단백질 단리물 (WPI))일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민이다. 바람직한 실시양태에서, 알부민은 난백 (오브알부민), 소 혈청 알부민 (BSA) 등이다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 운반체 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일부 실시양태에서, 운반체 단백질은 재조합 단백질 (예를 들어, 재조합 HSA)이다. 일부 실시양태에서, 운반체 단백질은 미국 식품 의약국 (FDA)에 의해 승인된, 일반적으로 안전한 것으로 간주된 (GRAS) 부형제이다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 3의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 4의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 4의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호 5의 말단절단된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 측면에서, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 항체-결합 모티프는 참조 서열과 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유한다. 일부 실시양태에서, 그러한 서열을 포함하는 항체-결합 모티프는 항체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 서열을 포함하는 항체-결합 모티프는 이러한 모티프가 운반체 단백질 내로 삽입될 때 항체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
항체-결합 모티프는 운반체 단백질의 임의의 영역에 부가될 수 있다. 바람직하게, 항체-결합 모티프는 운반체 단백질의 3차 또는 4차 구조에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 운반체 단백질의 아미노 말단 영역에 부가된다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 운반체 단백질의 카르복시 말단 영역에 부가된다.
한 실시양태에서, 다수의 항체-결합 모티프가 운반체 단백질의 동일한 영역 (예를 들어, 서로 인접하거나 또는 서로 약 1개 내지 약 30개 아미노산 이내)에 부가된다. 한 실시양태에서, 다수의 항체-결합 모티프가 운반체 단백질의 상이한 영역 (예를 들어, 서로로부터 약 30개 초과의 아미노산)에 부가된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 항체-결합 모티프에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 항체-결합 모티프는 항체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 항체-결합 모티프는 알부민-결합 모티프와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 항체-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 펩티드, 또는 그의 변이체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 항체와 결합하는 운반체 단백질 또는 다른 분자를 제조하기 위한, 상기 단리된 항체-결합 모티프 또는 그의 변이체의 용도에 관한 것이다.
운반체 단백질을 포함한 펩티드 서열의 변형 및 생산은 현재 공지되어 있는 것 또는 앞으로 개발될 것을 포함한, 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 개시내용은 추가로, 본원에 기재된 변형된 운반체 단백질의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 (예를 들어, CHO 또는 HEK 세포) 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스)에 관한 것이다.
펩티드 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체-결합 모티프 및 알부민-결합 모티프의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 모티프 (또는 이러한 모티프를 함유하는 단백질)의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 모티프의 아미노산 서열 변이체는 이러한 모티프를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 상기 모티프의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 그러한 아미노산 서열 내로의 삽입 및/또는 그러한 아미노산 서열 내의 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합을 만들어 최종 구축물에 도달할 수 있는데, 단 최종 구축물은 원하는 특징, 예를 들어, 항체-결합 또는 알부민-결합 특징을 보유해야 한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"의 표제하에 표 1에 제시된다. 보다 실질적인 치환이 "예시적인 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 관심 항체 내로 도입될 수 있고, 그 산물을 대상으로 하여, 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 관하여 스크리닝할 수 있다.
<표 1>
Figure pat00001
아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라서 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 이러한 변경이 항체 (항체-결합 모티프의 경우) 또는 알부민 (알부민-결합 모티프의 경우)과 결합할 수 있는 모티프의 능력을 실질적으로 저하시키지 않는 한은 모티프 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 저하시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 변이체는 소정의 위치에서 1개 내지 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체는 소정의 위치에서 1개 내지 5개의 아미노산 결실을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체는 소정의 위치에서 1개 내지 10개의 아미노산 삽입을 갖는다. 한 실시양태에서, 변이체는 카르복시 말단 영역 및/또는 아미노 말단 영역에 부가된 적어도 1개, 예를 들어 1개 내지 200개의 아미노산을 갖는다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프 변이체는 알부민과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프 변이체는 항체-결합 모티프와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프 변이체는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열을 갖는 펩티드, 또는 그의 변이체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프 변이체는 항체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프 변이체는 알부민-결합 모티프와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프 변이체는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 펩티드, 또는 그의 변이체와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
돌연변이 유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 지칭된 것이다. 이러한 방법에서는, 특정 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)을 확인하고, 이를 중성 또는 음 전하를 띤 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 페닐알라닌)으로 대체시켜, 항체와 항원과의 상호 작용에 영향을 미치는 지의 여부를 결정한다. 추가의 치환을 아미노산 위치에 도입하여 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 명확하게 보여줄 수 있다. 또 다른 한편으론, 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 사용하여, 항체와 항원 간의 접촉점을 확인한다. 알부민-항체 복합체의 결정 구조를 유사하게 사용하여, 항체와 알부민 간의 접촉점을 확인할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체가 원하는 특성을 함유하는 지의 여부를 결정하기 위해 상기 변이체를 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다.
변형된 나노입자 복합체
본 개시내용은 항체-결합 모티프를 함유하는 운반체 단백질, 알부민-결합 모티프를 함유하는 항체 또는 다른 단백질, 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체 및 나노입자 조성물에 관한 것이다. 상기 운반체 단백질과 항체 중 하나 또는 둘 다는 항체-결합 모티프 및/또는 알부민-결합 모티프 중 하나 이상을 함유하도록 변형된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질; 각각 항원 결합 도메인을 갖는 항체; 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 알부민; 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체 또는 융합 단백질 (여기서, 이러한 항체 또는 융합 단백질은 항원 결합 도메인을 갖는다); 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질; 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체 또는 융합 단백질 (여기서, 이러한 항체 또는 융합 단백질은 항원 결합 도메인을 갖는다); 및 임의로 치료제를 포함하는 나노입자 복합체에 관한 것이며; 여기서 이러한 나노입자 복합체는 생체내에서 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-결합 모티프는 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 알부민-결합 모티프는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다.
한 실시양태에서, 상기 복합체는 1 μm 미만의 평균 크기를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 800 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 400 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 90 nm 내지 약 200 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 800 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 400 nm를 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 평균 크기 약 100 nm 내지 약 200 nm를 갖는다. 그 크기는 종말점을 포함한, 이들 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
한 실시양태에서, 알부민-치료제 대 항체의 비는 10:1 내지 10:30이다. 그 비는 종말점을 포함한, 이러한 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 나노입자 복합체는 약 100개 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 각각의 나노입자 복합체는 약 100개 내지 약 800개의 항체를 포함한다. 항체의 수는 종말점을 포함한, 이들 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위일 수 있다.
한 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민이다. 한 실시양태에서, 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다.
한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 동결건조된다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체를 포함하는 조성물이 동결건조된다. 한 실시양태에서, 동결건조된 나노입자 복합체 또는 조성물은 수용액에서의 재구성 시, 생체내에서 항원과 여전히 결합할 수 있는 (인식/결합할 수 있는) 나노입자 복합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민이다. 한 실시양태에서, 알부민은 추가의 항체-결합 모티프를 함유하도록 변형된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 비-공유 결합을 통해 운반체 단백질과 연합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체-결합 모티프 및/또는 알부민-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 연합된다. 한 실시양태에서, 파클리탁셀은 비-공유 결합을 통해 운반체 단백질과 연합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 항체-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 비-공유적으로 연합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 융합 단백질은 알부민-결합 모티프를 통해 운반체 단백질과 비-공유적으로 연합된다.
한 실시양태에서, 적어도 변형된 운반체 단백질의 서브세트는 1개 초과의 항체-결합 모티프를 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 변형된 항체 또는 융합 단백질의 서브세트는 1개 초과의 알부민-결합 모티프를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 운반체 단백질과 연합된다. 일부 실시양태에서, 복합체는 치료량 이하의 양의 파클리탁셀을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학요법제의 유효량은 화학요법 약물의 약 100 mg/m2, 약 105 mg/m2, 약 110 mg/m2, 약 115 mg/m2, 약 120 mg/m2, 약 125 mg/m2, 약 130 mg/m2, 약 135 mg/m2, 약 140 mg/m2, 약 145 mg/m2, 약 150 mg/m2, 약 155 mg/m2, 약 160 mg/m2, 약 165 mg/m2, 약 170 mg/m2, 약 175 mg/m2, 약 180 mg/m2, 약 185 mg/m2, 약 190 mg/m2, 약 195 mg/m2, 또는 약 200 mg/m2로 이루어진 양으로부터 선택된다.
치료제 (즉, 화학요법제)가 나노입자 내부, 나노입자의 외부 표면 상, 또는 둘 다에 위치할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 나노입자는 2개 이상의 상이한 치료제, 예를 들어, 2개의 치료제, 3개의 치료제, 4개의 치료제, 5개의 치료제, 또는 그 초과의 치료제를 함유할 수 있다. 더욱이, 나노입자는 이러한 나노입자의 내부 및 외부에 동일하거나 또는 상이한 치료제를 함유할 수 있다.
한 측면에서, 나노입자 중의 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀의 양은 나노입자의 형성을 허용하기에 충분하다. 항체-알부민 나노입자 복합체의 형성을 위하여 파클리탁셀의 치료량 이하의 양을 사용하는 것이, 예를 들어, 2016년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/384,119 (이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 나노입자 복합체에 존재하는 파클리탁셀의 양은 나노입자 복합체에 안정성을 제공할 수 있는 최소량 이상이다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체에 존재하는 파클리탁셀의 양은 단백질 운반체에 대한 적어도 하나의 치료제의 친화성을 제공할 수 있는 최소량 이상이다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체에 존재하는 파클리탁셀의 양은 적어도 하나의 치료제와 단백질 운반체의 복합체 형성을 촉진시킬 수 있는 최소량 이상이다. 한 실시양태에서, 나노입자 복합체의 운반체 단백질과 파클리탁셀의 중량 비는 약 9:1 초과이다. 한 실시양태에서, 상기 중량 비는 약 10:1, 또는 11:1, 또는 12:1, 또는 13:1, 또는 14:1, 또는 15:1, 또는 약 16:1, 또는 약 17:1, 또는 약 18:1, 또는 약 19:1, 또는 약 20:1, 또는 약 21:1, 또는 약 22:1, 또는 약 23:1, 또는 약 24:1, 또는 약 25:1, 또는 약 26:1, 또는 약 27:1, 또는 약 28:1, 또는 약 29:1, 또는 약 30:1 초과이다. 한 실시양태에서, 파클리탁셀의 양은 나노입자 복합체에 안정성을 제공할 수 있는 최소량이다. 한 실시양태에서, 파클리탁셀의 양은 단백질 운반체에 대한 적어도 하나의 치료제의 친화성을 제공할 수 있는 최소량 이상이다. 한 실시양태에서, 파클리탁셀의 양은 적어도 하나의 치료제와 단백질 운반체의 복합체 형성을 촉진시킬 수 있는 최소량 이상이다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, 파클리탁셀의 양은 파클리탁셀에 대한 치료량 미만일 수 있다. 다시 말해서, 그 양은 치료 이익을 제공하기 위해 제공되거나 또는 제공하는 것으로 고려되는 양, 예컨대 예를 들어, 암을 효과적으로 치료하기 위한 화학요법제의 양보다 적을 수 있다.
한 실시양태에서, 나노입자 조성물에 존재하는 파클리탁셀의 양은 수용액과의 재구성 시 약 5 mg/mL 미만이다. 한 실시양태에서, 나노입자 조성물에 존재하는 파클리탁셀의 양은 수용액과의 재구성 시 약 4.54 mg/mL, 또는 약 4.16 mg/mL, 또는 약 3.57 mg/mL, 또는 약 3.33 mg/mL, 또는 약 3.12 mg/mL, 또는 약 2.94 mg/mL, 또는 약 2.78 mg/mL, 또는 약 2.63 mg/mL, 또는 약 2.5 mg/mL, 또는 약 2.38 mg/mL, 또는 약 2.27 mg/mL, 또는 약 2.17 mg/mL, 또는 약 2.08 mg/mL, 또는 약 2 mg/mL, 또는 약 1.92 mg/mL, 또는 약 1.85 mg/mL, 또는 약 1.78 mg/mL, 또는 약 1.72 mg/mL, 또는 약 1.67 mg/mL 미만이다.
일부 실시양태에서 임의의 항체, 앱타머, 치료제, 또는 그의 임의의 조합이 명백하게 배제된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 복합체는 1 μm 미만인 평균 직경을 갖도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 1 μm 미만인 평균 직경을 갖는 복합체가 형성되도록 하는데 적절한 농도의 운반체 단백질 및 항체 (또는 다른 결합제)가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 복합체는 0.1 μm 내지 1 μm (예를 들어, 0.1 μm 내지 0.95 μm, 0.1 μm 내지 0.9 μm, 0.1 μm 내지 0.8 μm, 0.1 μm 내지 0.7 μm, 0.1 μm 내지 0.6 μm, 0.1 μm 내지 0.5 μm, 0.1 μm 내지 0.4 μm, 0.1 μm 내지 0.3 μm, 0.1 μm 내지 0.2 μm, 0.2 μm 내지 1 μm, 0.3 μm 내지 1 μm, 0.4 μm 내지 1 μm, 0.5 μm 내지 1 μm, 0.2 μm 내지 0.6 μm, 0.3 μm 내지 0.6 μm, 0.2 μm 내지 0.5 μm, 또는 0.3 μm 내지 0.5 μm)인 평균 직경을 가질 수 있다. 0.1 μm 내지 0.9 μm인 평균 직경을 갖는 본원에 제공된 복합체는 포유동물의 체내에 위치한 암 또는 다른 질환을 치료하기 위해 전신으로 (예를 들어, 정맥내로) 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 복합체는 0.1 μm 내지 0.9 μm (예를 들어, 0.1 μm 내지 0.95 μm, 0.1 μm 내지 0.9 μm, 0.1 μm 내지 0.8 μm, 0.1 μm 내지 0.7 μm, 0.1 μm 내지 0.6 μm, 0.1 μm 내지 0.5 μm, 0.1 μm 내지 0.4 μm, 0.1 μm 내지 0.3 μm, 0.1 μm 내지 0.2 μm, 0.2 μm 내지 1 μm, 0.3 μm 내지 1 μm, 0.4 μm 내지 1 μm, 0.5 μm 내지 1 μm, 0.2 μm 내지 0.6 μm, 0.3 μm 내지 0.6 μm, 0.2 μm 내지 0.5 μm, 또는 0.3 μm 내지 0.5 μm)인 직경을 갖는 복합체를 60 퍼센트 초과 (예를 들어, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 또는 99 퍼센트 초과)하여 가질 수 있다. 0.1 μm 내지 0.9 μm인 직경을 갖는 복합체를 60 퍼센트 초과 (예를 들어, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 또는 99 퍼센트 초과)하여 갖는 본원에 제공된 복합체는 포유동물의 체내에 위치한 관련 항원을 발현하는 암 또는 다른 질환을 치료하기 위해 전신으로 (예를 들어, 정맥내로) 투여될 수 있다.
한 측면에서, 나노입자 조성물 중에서의 평균 입자 크기는 약 1 μm 미만이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중에서의 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 1 μm, 예컨대 약 90 nm 내지 약 800 nm, 약 90 nm 내지 약 700 nm, 약 90 nm 내지 약 600 nm, 약 90 nm 내지 약 500 nm, 약 90 nm 내지 약 400nm, 약 90 nm 내지 약 300 nm, 약 90 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 180 nm이다. 고려되는 값은 종말점을 포함한, 상기 나열된 범위 중 임의의 것 이내의 임의의 값, 하위 범위, 또는 범위를 포함한다.
바람직한 측면에서, 본원에 나열된 크기 및 크기 범위는 재구성된 동결건조된 나노입자 조성물의 입자 크기에 관한 것이다. 즉, 동결건조된 나노입자가 수용액 (예를 들어, 물, PBS, 다른 제약상 허용되는 부형제, 완충제 등)에 재현탁된 후, 입자 크기 또는 평균 입자 크기는 본원에 나열된 범위 이내이다.
한 측면에서, 나노입자의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%가 단일 나노입자로서 상기 재구성된 조성물에 존재한다. 즉, 나노입자의 약 50%, 40%, 30% 미만 등이 이량체화 또는 올리고머화된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물 중의 나노입자는 수 이량체화에 기준하여 20% 미만, 수 이량체화에 기준하여 10% 미만 및 바람직하게 수 이량체화에 기준하여 5% 미만을 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자의 크기는 결합제에 대한 운반체 단백질의 양 (예를 들어, 비율)을 조정함으로써 제어될 수 있다. 나노입자의 크기, 및 크기 분포도가 또한 중요하다. 본 발명의 나노입자는 그의 크기에 따라서 상이하게 행동할 수 있다. 큰 크기에서는, 응집이 혈관을 차단시킬 수 있다. 따라서, 나노입자의 응집이 조성물의 성능과 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 한편으로는, 더 큰 입자가 특정의 조건 (예를 들어, 정맥내로 투여되지 않은 경우)하에 더 치료적일 수 있다.
한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 100개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 200개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 300개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 400개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 500개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 600개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 200개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 300개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자 복합체는 나노입자의 표면과 비-공유적으로 결합된 약 400개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 고려되는 값은 종말점을 포함한, 상기 나열된 범위 중 임의의 것 이내의 임의의 값 또는 하위 범위를 포함한다.
한 실시양태에서, 결합제는 종양 항원과 결합한다 (종양 항원에 대해 특이적이다). 한 실시양태에서, 결합제는 알파페토프로테인 (AFP), 암배아 항원 (CEA), CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원 (ETA), 흑색종 관련 항원 (MAGE), 티로시나제, HER2, HER3, CD3, CD19, CD20, CD33, CD47, CD274, CD279, CD30, CD52, PD-1, PD-L1, CTLA4, GD2, VEGF, BCR-ABL, NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, SSX2, 멜란(Melan)-A, EGFR, CD38, 또는 RANK 리간드와 결합한다. 이들은 단지 항원의 예이고, 제한적이지 않다.
변형된 나노입자 복합체를 제조하는 방법
한 측면에서, 본 발명은 알부민을, 나노입자 복합체를 형성하기 위한 조건 하에, 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 항체와 조합하는 것을 포함하는, 나노입자 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 나노입자 복합체는 치료제와 조합된다. 한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다.
한 측면에는 적어도 하나의 항체-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질을 항체와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 나노입자 복합체를 제조하는 방법이 개시된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질은 알부민이다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 나노입자 복합체는 치료제와 조합된다. 한 실시양태에서, 치료제는 파클리탁셀이다. 한 측면에서, 항체는 적어도 하나의 알부민-결합 모티프를 포함하도록 변형시킨 변형된 폴리펩티드 서열을 갖는 변형된 항체이다.
한 측면에서, 나노입자 복합체는 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자와 결합제를, 운반체 단백질 입자 또는 운반체 단백질-치료제 입자 대 결합제의 약 10:1 내지 약 10:30의 비로 접촉시킴으로써 형성된다. 한 실시양태에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 10:25이다. 한 실시양태에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 1:1이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 10:6이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 비는 약 10:4이다. 고려되는 값은 종말점을 포함한, 상기 나열된 범위 중 임의의 것 이내의 임의의 값, 하위 범위, 또는 범위를 포함한다.
한 실시양태에서, 나노입자를 형성하기 위해 이용된 용액 또는 다른 액체 배지의 양이 특히 중요하다. 운반체 단백질 (또는 운반체 단백질-치료제) 및 항체의 과도하게 희석된 용액에서는 나노입자가 형성되지 않는다. 과도하게 농축된 용액은 비구조화 응집체를 생성할 것이다. 일부 실시양태에서, 이용된 용액 (예를 들어, 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수)의 양은 약 0.5 mL의 용액 내지 약 20 mL의 용액이다. 일부 실시양태에서, 운반체 단백질의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 결합제의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 운반체 단백질:결합제:용액의 비는 1 mL의 용액 (예를 들어, 식염수) 중의 대략 9 mg의 운반체 단백질 (예를 들어, 알부민) 대 4 mg의 결합제, 예를 들어, 항체 (예를 들어, BEV)이다. 치료제 (예를 들어, 탁솔)의 특정 양이 운반체 단백질에 부가될 수도 있다. 예를 들어, 1 mg의 탁솔이 1 mL의 용액 중에서, 9 mg의 운반체 단백질 (10 mg 운반체 단백질-치료제) 및 4 mg의 결합제, 예를 들어, 항체, Fc 융합 분자, 또는 앱타머에 부가될 수 있다. 예를 들어, 대략 1리터의 용액을 수반한 전형적인 정맥내 봉지를 사용하는 경우에는, 1 mL에서 사용되는 것과 비교해서 1000x 양의 운반체 단백질/운반체 단백질-치료제 및 항체를 사용하는 것이 필요할 것이다. 따라서, 표준 정맥내 봉지에서는 본 발명의 나노입자를 형성할 수 없다. 더욱이, 상기 성분들을 본 발명의 치료량으로 표준 정맥내 봉지에 부가하는 경우, 상기 조성물은 나노입자를 형성하도록 자기 어셈블리되지 않는다.
한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 4 내지 약 8을 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 4를 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 5를 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 6을 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 7을 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 8을 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다. 바람직한 실시양태에서, 운반체 단백질 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 pH 약 5 내지 약 7을 갖는 용액 중에서 결합제와 접촉된다.
한 실시양태에서, 운반체 단백질 입자 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도, 또는 종말점을 포함한 상기 범위 이내의 임의의 범위, 하위 범위, 또는 값에서 결합제와 함께 인큐베이션된다. 바람직한 실시양태에서, 운반체 단백질 입자 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 약 23℃ 내지 약 60℃의 온도에서 결합제와 함께 인큐베이션된다. 한 실시양태에서, 운반체 단백질 입자 또는 운반체 단백질-치료제 입자는 실온에서 결합제와 함께 인큐베이션된다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 나노입자 복합체의 안정성은 적어도 부분적으로는, 나노입자 복합체가 형성되는 온도 및/또는 pH뿐만 아니라 용액 중의 성분 (즉, 운반체 단백질, 결합제, 및 임의로 치료제)의 농도에 의존적인 것으로 여겨진다.
일반적으로, 운반체 단백질, 화학요법제, 및 결합제의 임의의 적절한 조합이 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 양의 운반체 단백질 (예를 들어, 화학요법제를 수반함)과, 적절한 양의 결합제가 동일한 용기에서 함께 혼합될 수 있다. 이러한 혼합물은 암 환자에게 투여되기 전에, 일정 기간 (예를 들어, 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 60분, 약 5분 내지 약 45분, 약 15분 내지 약 60분, 약 15분 내지 약 45분, 약 20분 내지 약 400분, 또는 약 25분 내지 약 35분) 동안 적절한 온도 (예를 들어, 실온, 5℃ 내지 60℃, 23℃ 내지 60℃, 15℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 25℃, 20℃ 내지 30℃, 또는 20℃ 내지 25℃)에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 경우에, 화학요법제를 포함하는 운반체 단백질 나노입자는 결합제와 접촉시켜 복합체를 형성할 수 있는데, 이는 환자에게 투여하기 전에 저장된다. 예를 들어, 조성물이 본원에 기재된 바와 같이 형성될 수 있고, 이를 환자에게 투여하기 전에 일정 기간 (예를 들어, 수일 또는 수주) 동안 저장할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법 약물은 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 제피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아브락산®과, 다른 화학요법제를 포함하는 알부민 입자 둘 다가 미국 특허 번호 7,758,891; 7,820,788; 7,923,536; 8,034,375; 8,138,229; 8,268,348; 8,314,156; 8,853,260; 및 9,101,543 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 의해 개시된다. 또한, 운반체 단백질, 화학요법 약물, 항체 접합체, 또는 그의 조합이 PCT/US2015/054295 및 미국 공개 번호 2014/0178486 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 의해 개시된다.
동결건조
본 발명의 동결건조된 조성물은 안정화제, 완충제 등의 존재를 이용하거나 또는 이용하지 않으면서 표준 동결건조 기술에 의해 제조된다. 놀랍게도, 이들 조건은 나노입자의 비교적 깨지기 쉬운 구조를 변경시키지 못한다. 더욱이, 기껏해야, 이들 나노입자는 동결건조 시 그들의 크기 분포도를 유지하며, 더 중요하게는, 새로이 제조된 것과 실질적으로 동일한 형태 및 비로 생체내 투여 (예를 들어, 정맥내 전달)를 위해 재구성될 수 있다.
제형
한 측면에서, 나노입자 조성물은 전신 전달, 예를 들어, 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
한 측면에서, 나노입자 조성물은 종양 내로의 직접적인 주사를 위해 제형화된다. 직접적인 주사는 종양 부위 내로 또는 종양 부위 근처로의 주사, 종양 내로의 관류 등을 포함한다. 나노입자 조성물은 전신으로 투여되지 않기 때문에, 종양 내로의 직접적인 주사를 위해 제형화되는 나노입자 조성물은 임의의 평균 입자 크기를 포함할 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 보다 큰 입자 (예를 들어, 500 nm 초과, 1 μm 초과 등)가 종양 내에서 고정화될 가능성이 더 높으며, 이로 인해 더 나은 유익한 효과가 있는 것으로 여겨지는 것이 제공되는 것으로 생각된다.
또 다른 측면에서, 본원에는 본원에 제공된 화합물, 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
일반적으로, 본원에 제공된 화합물은 허용되는 투여 방식 중 임의의 것에 의해 환자에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 관련 기술분야에서 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.]을 참조할 수 있다.
일반적으로, 본원에 제공된 화합물은 하기 경로 중 어느 하나에 의해 제약 조성물로서 투여될 것이다: 경구, 전신 (예를 들어, 경피, 비내 또는 좌제에 의해), 또는 비경구 (예를 들어, 근육내, 정맥내 또는 피하) 투여.
상기 조성물은, 일반적으로, 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제와 조합되는 본 발명의 화합물로 구성된다. 허용되는 부형제는 무독성이고, 투여를 도와주며, 청구된 화합물의 치료 이익에 불리한 영향을 미치지 않는다. 이러한 부형제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이용 가능한, 임의의 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로솔 조성물의 경우에는, 기체상 부형제일 수 있다.
고체 제약 부형제는 전분, 셀룰로스, 탈크, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조된 탈지 분유 등을 포함한다. 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 페트로리움, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함한 다양한 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등으로부터 선택될 수 있다. 특히 주사 가능한 용액에 대한 바람직한 액체 담체는 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 및 글리콜을 포함한다. 다른 적합한 제약 부형제 및 그의 제형화는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)]에 기재되어 있다.
본 조성물은 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유하는 팩 또는 디스펜서 장치에 존재할 수 있다. 이러한 팩 또는 장치는, 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 플리스터 팩, 또는 유리, 및 예컨대 바이알 내의 고무 마개를 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 관한 설명서를 수반할 수 있다. 화합성 제약 담체에서 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물이 또한 제조될 수 있고, 이를 적절한 용기 내에 놓아둘 수 있으며, 지시된 병태의 치료에 관하여 표지될 수 있다.
변형된 나노입자 복합체를 사용하는 방법
본원에 기재된 바와 같은 나노입자 복합체는 포유동물에서 암세포 및/또는 종양을 치료하는 데 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간 (즉, 인간 환자)이다. 바람직하게, 동결건조된 나노입자 조성물은 투여하기 전에 재구성된다 (수성 부형제에 현탁된다).
한 측면에는 암세포를, 이러한 암세포를 치료하는 데 유효한 양의 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 복합체 및 면역요법제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포를 치료하는 방법이 제공된다. 암세포의 치료는 암세포의 증식을 저하시키는 것, 암세포를 사멸시키는 것, 암세포의 전이를 방지시키는 것 등을 제한 없이 포함한다.
임의의 적절한 방법이 본원에 기재된 바와 같은 복합체를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 포유동물에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 운반체 단백질/결합제/화학요법제 복합체를 함유하는 조성물은 주사 (예를 들어, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사, 또는 척추강내 주사)를 통하여 투여될 수 있다.
본원에 기재된 나노입자 복합체, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암 또는 종양은 담관암; 교모세포종 및 수모세포종을 포함한 뇌암; 유방암; 자궁암; 난관암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 방광암; 자궁내막암; 질암; 외음부암; 식도암; 구강암; 위암; 신장암; 급성 림프구성 및 골수성 백혈병을 포함한 혈액학적 신생물; 다발성 골수종; AIDS 관련 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병 림프종; 보웬병(Bowen's disease) 및 파제트병(Paget's disease)을 포함한 상피내 신생물; 간암 (간암종); 폐암; 두경부암 또는 구강암 (입, 인후, 식도, 비인두, 턱, 편도선, 비강, 입술, 타액선, 혀 등); 호지킨병 및 림프구성 림프종을 포함한 림프종; 신경모세포종; 신경내분비 종양; 편평 세포 암종을 포함한 구강암; 부신암; 항문암; 혈관 육종; 충수암; 담관암; 뼈암; 카르시노이드 종양; 연질 조직 육종; 횡문근육종; 안암; 상피 세포, 간질 세포, 배아 세포 및 중간엽 세포로부터 발생되는 것을 포함한 난소암, 및 난관암; 담낭암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종 및 골육종을 포함한 육종; 흑색종, 카포시 육종, 기저 세포암 및 편평 세포암을 포함한 피부암; 배아 종양 (정상피종, 비-정상피종 [기형종, 융모막암종]), 간질 종양 및 생식 세포 종양을 포함한 고환암; 음경암; 혈관내피종; 위장암; 요관암; 요도암; 척수암; 뇌하수체암; 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종; 갑상선 선암종 및 수질 암종을 포함한 갑상선암; 및 선암종 및 윌름스(Wilms) 종양을 포함한 신암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 중요한 실시양태에서, 암 또는 종양은 유방암, 전립선암, 결장직장암, 림프종, 다발성 골수종, 및 흑색종을 포함한다.
본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물을 포유동물에게 투여하기 전에, 이러한 포유동물이 관련 항원을 발현하는 암 또는 질환을 갖고 있는지의 여부를 결정하기 위해 상기 포유동물을 평가할 수 있다. 포유동물이 관련 항원을 발현하는 암 또는 질환을 갖고 있는지의 여부를 결정하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간)은 표준 진단 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 경우에, 조직 생검을 수집한 다음, 포유동물이 상기 항원을 발현하는 암 또는 질환을 갖고 있는지의 여부를 결정하기 위해 이를 분석할 수 있다.
포유동물이 상기 질환 또는 암을 갖고 있는 것으로서 확인한 후, 그러한 포유동물에게 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물을 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합체를 함유하는 조성물은 종양의 외과적 절제술 이전에 투여되거나 또는 외과적 절제술 대신 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물은 종양의 절제술 이후에 투여될 수 있다.
특별한 포유동물이 특별한 양에 반응하지 못하는 경우에는, 그 양을, 예를 들어, 2배만큼 증가시킬 수 있다. 이러한 더 높은 농도를 투여한 후, 그 포유동물을 대상으로 하여 치료에 대한 반응성과 독성 증상 둘 다에 관하여 모니터링할 수 있고, 이에 따라 조정할 수 있다. 유효량은 일정하게 유지될 수 있거나 또는 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라서 슬라이딩 스케일 또는 가변 용량으로서 조정될 수 있다. 다양한 요인이 특별한 적용을 위해 사용된 실제 유효량에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도, 치료의 지속 기간, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 암 또는 질환의 중증도가, 투여된 실제 유효량에 있어서의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물은 원하는 성과 (예를 들어, 질환 진행이 없는 생존율을 증가시키기 위함)를 달성하는 데 유효한 임의의 적절한 양으로, 임의의 적절한 빈도로 및 임의의 적절한 지속 기간 동안 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 조성물은 특정 암 또는 질환의 진행 속도를 5, 10, 25, 50, 75, 100퍼센트 또는 그 초과만큼 저하시키기 위해 상기 암 또는 질환이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 진행 속도는 부가의 암 진행이 검출되지 않는 정도로 저하될 수 있다.
암의 진행 속도가 저하되는 지의 여부를 결정하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 암의 진행 속도는 조직을 상이한 시점에서 영상화하고 존재하는 암세포의 양을 결정함으로써 평가될 수 있다. 상이한 시간에 조직 내에서 결정된 암세포의 양을 비교하여 진행 속도를 결정할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 치료한 후, 진행 속도는 또 다른 시간 간격에 걸쳐 다시 결정될 수 있다. 일부 경우에, 치료 후의 암의 병기가 결정될 수 있고, 이를 치료 전의 병기와 비교하여 진행 속도가 저하되었는지의 여부를 결정할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 조성물은 질환 진행이 없는 생존율이, 치료되지 않은 암이 있는 상응하는 포유동물의 질환 진행이 없는 중앙 생존율과 비교 시, 또는 투여 이전에 복합체를 형성하지 않으면서 운반체 단백질, 화학요법제 및 결합제로 치료받은 암이 있는 상응하는 포유동물의 질환 진행이 없는 중앙 생존율과 비교 시 증가되는 (예를 들어, 5, 10, 25, 50, 75, 100퍼센트, 또는 그 초과만큼 증가되는) 조건 하에, 암이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 조성물은 암이 있고 운반체 단백질, 화학요법제, 운반체 단백질/화학요법제 나노입자 (결합제를 수반하지 않음), 또는 결합제 단독을 받은 상응하는 포유동물의 질환 진행이 없는 중앙 생존율과 비교 시, 질환 진행이 없는 생존율을 5, 10, 25, 50, 75, 100퍼센트 또는 그 초과만큼 증가시키기 위해 암이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 질환 진행이 없는 생존율은 임의의 기간 (예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상)에 걸쳐 측정될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물은 특정 포유동물 집단에 대한 8주의 질환 진행이 없는 생존율이, 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물을 받지 않은 유사한 포유동물의 집단에서 관찰된 것보다 65% 이상 (예를 들어, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 또는 그 초과)인 조건 하에, 암이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 상기 조성물은 특정 포유동물 집단에 대한 진행까지의 중앙 시간이 적어도 150일 (예를 들어, 적어도 155, 160, 163, 165, 또는 170일)인 조건 하에 암이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 복합체를 함유하는 조성물의 유효량은 결합제에 의해 인식된 항원을 발현하는 암 또는 질환의 진행 속도를 저하시키거나, 질환 진행이 없는 생존율을 증가시키거나, 또는 포유동물에게 상당한 독성을 유발시키지 않으면서 진행까지의 중앙 시간을 증가시키는 임의의 양일 수 있다. 특별한 포유동물이 특별한 양에 반응하지 못하는 경우에는, 그 양을, 예를 들어, 2배만큼 증가시킬 수 있다. 이러한 더 높은 농도를 투여한 후, 그 포유동물을 대상으로 하여 치료에 대한 반응성과 독성 증상 둘 다에 관하여 모니터링할 수 있고, 이에 따라 조정할 수 있다. 유효량은 일정하게 유지될 수 있거나 또는 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라서 슬라이딩 스케일 또는 가변 용량으로서 조정될 수 있다. 다양한 요인이 특별한 적용을 위해 사용된 실제 유효량에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도, 치료의 지속 기간, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 암 또는 질환의 중증도가, 투여된 실제 유효량에 있어서의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
투여 빈도는 암 또는 질환의 진행 속도를 저하시키거나, 질환 진행이 없는 생존율을 증가시키거나, 또는 포유동물에게 상당한 독성을 유발시키지 않으면서 진행까지의 중앙 시간을 증가시키는 임의의 빈도일 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 1개월에 약 1회 내지 1개월에 약 3회, 또는 1개월에 약 2회 내지 1개월에 약 6회, 또는 2개월마다 약 1회 내지 2개월마다 약 3회일 수 있다. 투여 빈도는 일정하게 유지될 수 있거나 또는 치료 지속 기간 동안 가변적일 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 조성물을 이용한 치료 과정은 휴식 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 2주 기간에 걸쳐 투여한 다음, 2주 휴식 기간을 거치며, 이러한 요법을 여러 차례 반복할 수 있다. 유효량과 같이, 다양한 요인이 특별한 적용을 위해 사용된 실제 투여 빈도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효량, 치료의 지속 기간, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 암 또는 질환의 중증도가, 투여 빈도에 있어서의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
본원에 제공된 조성물을 투여하는 데 유효한 지속 기간은 암 또는 질환의 진행 속도를 저하시키거나, 질환 진행이 없는 생존율을 증가시키거나, 또는 포유동물에게 상당한 독성을 유발시키지 않으면서 진행까지의 중앙 시간을 증가시키는 임의의 지속 기간일 수 있다. 따라서, 유효한 지속 기간은 수일 내지 수주, 수개월 또는 수년으로 다양할 수 있다. 일반적으로, 암 또는 질환의 치료에 유효한 지속 기간은 수주 내지 수개월의 지속 기간의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 개별 포유동물이 살이 있는 한은 유효 지속 기간일 수 있다. 다수의 요인이 특별한 치료를 위해 사용된 실제 유효 지속 기간에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효 지속 기간은 투여 빈도, 유효량, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 암 또는 질환의 중증도에 따라서 다양할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 운반체 단백질/화학요법제/결합제 복합체를 함유하는 조성물은 임의의 적절한 형태일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 조성물은 주사 가능한 현탁액을 만들기 위한 희석제를 수반하거나 또는 수반하지 않은 용액 또는 분말의 형태일 수 있다. 조성물은 또한, 제약상 허용되는 비히클을 제한 없이 포함한 부가의 성분을 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 비히클은, 예를 들어, 식염수, 물, 락트산, 만니톨, 또는 그의 조합일 수 있다.
본원에 제공된 조성물을 포유동물에게 투여한 후, 그 포유동물을 대상으로 하여 암 또는 질환이 치료됐는지의 여부를 결정하기 위해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 암 또는 질환의 진행 속도가 저하 (예를 들어, 중단)되었는지의 여부를 결정하기 위해 치료 후에 포유동물을 평가할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 방법이 진행 속도 및 생존율을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 연계해서 기재되었지만, 전술된 설명은 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위 (이는 첨부된 청구범위의 범위로써 규정된다)를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
실시예
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 입자를 제조하고 사용하는 것에 관한 설명이 단지 예시 목적이고, 본 개시내용이 이러한 예시로써 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 임의의 약어는 일반적인 과학적 의미를 갖는다. 모든 온도는 달리 언급되지 않는 한은 ℃이다. 본원에서, 하기 용어는 달리 정의되지 않는 한은 하기 의미를 갖는다:
Figure pat00002
실시예 1. 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 제조 및 특징 규명
AR160 나노입자 복합체를 제조하기 위해, 아브락산® [ABX; 셀진 (Celgene; 미국 뉴저지주 서밋)]와 리툭시맙 [제넨테크 (Genentech; 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)]을 각각 10 mg/mL와 4 mg/mL로 혼합하고 (달리 나타내지 않는 한), 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
리툭시맙은 피코몰 범위의 해리 상수를 수반하면서, 높은 친화도로 아브락산® (ABX)와 결합한다. 4 mg/mL의 리툭시맙을 10 mg/mL ABX와 혼합하면, 160 nm 나노입자 AR160이 형성된다. AR160 나노입자를 시각화하기 위해, 리툭시맙을 알렉사플루오르 488로 표지시키고 10 mg/mL ABX와 함께 인큐베이션하였다. 표지된 리툭시맙을 함유하는 AR160 나노입자는 암니스(Amnis) 이미지스트림 유동 세포계수기를 사용하여 시각화하였다 (도 1a).
ABX에 대한 리툭시맙 결합을 결정하기 위해, 유동 세포계수 분석을 AR160 분자 상에서 수행하였다. ABX 및 리툭시맙을 제조업자의 프로토콜에 따라서 알렉사-플루오르 488 [써모 사이언티픽 (Thermo Scientific; 미국 일리노이주 록퍼드)]로 표지시켰다. 알렉사-플루오르 488을 실온에서 60분 동안 1 mg의 단백질과 함께 인큐베이션하였고, 결합되지 않은 표지는 크기 배제 칼럼에 의해 표지된 단백질로부터 분리시켰다. AR160 복합체는 비표지된 ABX 및 리툭시맙, 비표지된 ABX 및 표지된 리툭시맙, 또는 표지된 ABX 및 리툭시맙을 사용하여, 상기 언급된 바와 같이 제조하였다. 유동 세포계수 데이터가 도 1b에 제시되고, 이는 ABX와 리툭시맙 간의 상호 작용을 나타낸다.
방사된 미립자를 포함한 AR160 분획, 100 kD 초과 단백질 및 100 kD 미만 단백질의 파클리탁셀 함량을 정량화하였다. AR160은 상기 언급된 바와 같이 제조되었다. 미립자는 10,000 rpm 하에 두 원심분리 단계를 이용하여 침강시켰다. 파클리탁셀의 약 70%가 여전히 AR160 미립자를 수반하였고, 나머지 30%의 대부분이 100 kD 초과 단백질을 수반하였으며; 파클리탁셀의 매우 작은 백분율 (0.3%)이 100 kD 미만 단백질 분획에 존재하였다 (도 1c, 왼쪽 패널).
100 kD 초과 단백질 분획의 함량을 확인하기 위해, 파클리탁셀, 리툭시맙 및 인간 알부민에 대하여 염색함으로써 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 상등액 중의 단백질 복합체를 변성시킨 다음, SDS-PAGE 겔 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 이어서, 상기 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 1:10,000 희석 하의 토끼 항-인간 알부민 [셀 시그널링 (Cell Signaling; 미국 매사추세츠주 댄버스)]으로 알부민에 대하여 웨스턴 블롯팅하고, 1:10,000 희석 하의 토끼 항-탁솔 [압캠 (AbCam; 미국 매사추세츠주 케임브리지)]로 파클리탁셀에 대하여 웨스턴 블롯팅하며, 1:500 희석 하의 래트 항-리툭시맙 HRP [바이오-래드 (Bio-rad; 미국 캘리포니아주 헤라클레스)]로 리툭시맙에 대하여 웨스턴 블롯팅하였다. 1:2000의 희석 하의 염소 항-토끼 IgG HRP (셀 시그널링; 미국 매사추세츠주 댄버스)를 알부민 및 탁솔에 대한 2차 항체로서 사용하였다. 상기 단백질은 ECL 기질 (써모 사이언티픽; 미국 일리노이주 록퍼드)에 의해 시각화되었다.
알부민, 항체, 및 파클리탁셀이 대략 200 kD인 밴드에서 공동 국재화되는데 (도 1c, 오른쪽 패널), 이는 160 nm 입자가, 항체로의 종양 표적화 능력을 갖는 기능성 단위로 해리되고 200 kD 거대 분자 종 내에 세포독성제를 보유하고 있다는 것을 암시한다.
실시예 2. 막 결합된 CD20에 대한 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 결합
AR160이 막 결합된 CD20과 결합하는 지의 여부를 결정하기 위해, 다우디 세포를 PE-항-인간 CD19 및 AR160으로 염색하였으며, 여기서 ABX는 알렉사 플루오르 488로 표지시켰고 리툭시맙으로 코팅시켰다. 산포도는 PE 항-인간 CD19로 염색될 때 75% 양성이고, 형광 태그부착된 AR160으로 염색될 때 75% 양성이며, PE 항-인간 CD19와 알렉사 플루오르 488 태그부착된 AR160 둘 다로 염색될 때 약 74% 이중 양성인 다우디 세포 집단을 나타내는데, 이는 AR160이 다우디 세포와 결합한다는 것을 암시한다 (도 2a). 염색된 다우디 세포는 또한, 암니스 이미지스트림으로 유동 세포계수법을 영상화함으로써 시각화하였다 (도 2b).
PE 항-인간 CD19 및 CD20은 BD 파밍엔 (BD Pharmingen; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)으로부터 구입하였다. 다우디 세포를 4℃ 하에 알렉사-플루오르 488 AR160, PE 항-인간 CD19 및 PE 항-인간 CD20과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 FACS 완충액 (1x PBS; 및 0.1% Na아지드를 수반한 0.5% BSA)에서 2회 세척하였다. 상기 세포를 가동시키고, 데이터를 구아바(Guava) 유동 세포계수기 [밀리포어 (Millipore; 미국 매사추세츠주 빌러리카)] 상에 수집하였다. 유동 세포계수 데이터는 구아바소프트 소프트웨어 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 사용하여 분석하였고, AR160+, CD19+ 및 CD20+ 세포의 백분율을 계산하였다. 알렉사-플루오르 488 표지된 ABX 및 PE 항-인간 CD19/알렉사-플루오르 488 AR160 표지된 다우디 세포의 공초점 사진을 위하여, 암니스 이미지스트림 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)을 이용하였다. 인스파이어(Inspire) 소프트웨어 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 사용하여 데이터를 분석하고 사진을 수집하였다.
실시예 3. 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 크기 및 안정성
상이한 양의 리툭시맙을 사용하여 형성된 나노입자 복합체의 크기를 결정하기 위해, 10 mg ABX를 0, 2, 4, 6, 8, 또는 10 mg 리툭시맙과 함께 인큐베이션하였다. 맬번 나노사이트 (맬번; 영국 우스터셔)를 크기 결정에 활용하였다. 입자를 1:200으로 희석시키고, 9의 카메라 수준 및 16의 포착 검출 한계치를 사용하여 입자 크기 및 수를 결정하였다. 나노사이트는 입자 크기 및 농도를 수득하기 위해 광 산란과 브라운 운동을 이용한다. 이로써 생성된 크기가 도 2c에 제공된다.
입자 형성에 대한 인큐베이션 동안의 pH 수준의 효과를 결정하기 위해, 3, 7 또는 9의 인큐베이션 pH에서 실시예 1에 나타낸 바와 같이 AR160 나노입자를 형성하였고, 해리 상수 (Kd)를 결정하였다. pH 3에서 형성된 나노입자 복합체의 Kd는 4.4 x 10-10였고; pH 7에서 형성된 나노입자 복합체의 Kd는 3.9 x 10-9였으며; pH 9에서 형성된 나노입자 복합체의 Kd는 2.5 x 10-8이었다. 이들 데이터는 상기 혼합 조건의 pH를 변화시키는 것이 ABX/리툭시맙 결합의 강도에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
ABX 단독과 비교한 AR160의 안정성은 나노사이트 기술을 사용하여 평가되었다. ABX 및 AR160은 언급된 바와 같이 제조되었고, 0 내지 6시간 및 24시간 동안 식염수 중에서 실온 하에 정치시켜 두었으며, 입자 수량과 크기는 각각의 시점에서 측정되었다 (도 3). ABX 단독의 입자 수는 0 내지 24시간에서 19.1 내지 23.5 x 108개 입자의 범위를 가진 AR160과 비교해서 4.23 x 108개였다. ABX의 평균 크기는 0 내지 24시간에서 90 nm였고, 이는 127-133 nm의 평균 크기를 갖는 AR160보다 훨씬 더 작았다. 부가적으로, AR160의 크기는 24시간 내내 안정적이었는데, 이는 입자의 수와 크기가 인큐베이션 시간 전반에 걸쳐 동일하게 유지되었다는 것으로써 암시된 바와 같다. ABX는 인큐베이션 시간 동안 불안정하게 되었으며; ABX 입자 크기와 수의 측정에 있어서의 곤란으로 인해, 시간 0만이 제시된다 (도 3).
혈청 중의 ABX와 비교한 AR160의 안정성을 평가하기 위해, ABX 및 AR160의 등가 수 (30 x 108개)의 입자를 인간 AB 혈청에 부가하였다. 실온에서 5, 15, 30 및 60분의 인큐베이션 하에 남아있는 입자의 수를 정량화하였다 (도 4a 및 4b). 각각의 시점에서, 5, 15, 30, 및 60분 각각에서 ABX 단독 (11, 6.6, 4.2, 및 5.2 x 108)과 비교하여 더 많은 AR160 입자가 측정되었다 (19, 16, 11 및 10 x 108) (도 4c). 더욱이, ABX 입자 수는 단지 15분 인큐베이션 후의 혈청과 비교하여 기준선으로 되돌아갔지만, AR160 입자 수는 혈청 단독에서보다 60분 인큐베이션 내내 더 높게 유지되었다 (도 4c).
실시예 4. 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체는 다우디 세포에 대한 항-CD20 항체의 결합을 방지시킨다
AR160 복합체 내의 리툭시맙의 리간드 결합 능력을 평가하였다. CD20+ 다우디 세포를 리툭시맙 (도 5c), ABX (도 5d), AR160 (도 5e), 또는 24시간생 AR160 (도 5f)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상기 세포를 세척하고 PE-마우스 항-인간 CD20으로 염색시키며, 유동 세포계수법에 의해 계산하였다. 이소형 대조군 (6.2% 양성; 도 5a) 및 PE-마우스 항-인간 CD20 (83.6% 양성; 도 5b)을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 그 결과는 리툭시맙 및 AR160이 항-인간 CD20 항체의 후속 결합을 금지시킨다는 것을 나타내는데, 이는 리툭시맙이 단독으로 및 AR160 복합체의 맥락에서 CD20과 결합함으로써, 항-CD20 항체의 결합을 억제한다는 것을 암시한다. ABX 단독은 상기 항체의 결합을 억제하지 못하였는데, 이는 AR160 입자 내의 리툭시맙이 특이적 방식으로 그의 리간드 결합 특성을 보유하고 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5. 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 독성
AR160 내의 파클리탁셀이 그의 항증식 능력을 유지하였다는 것을 보장하기 위해, ABX 및 리툭시맙 단독, AR160, 및 시험하기 전 24시간에 만들었던 AR160을, CD20+ 다우디 세포를 이용하여 시험관내 독성 검정으로 시험하였다. 세포 증식은 티미딘 유사체인 EdU를 이용하여 측정하였는데, 이는 FITC 접합된 항-EdU를 이용하여 검출되었고 유동 세포계수법에 의해 계산되었다. 파클리탁셀 함유 약물 모두의 IC50은 약 25 μg/mL인 반면, 리툭시맙 단독은 독성이 아니었고 (도 6); 따라서, 파클리탁셀 독성은 AR160의 맥락에서 손상되지 않는다.
인간 B-세포 림프종 계열인 다우디 (ATCC; 미국 버지니아주 머내서스)를, 1% 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민 (PSG) 및 10% FBS를 수반한 RPMI에서 배양하였다. 세포를 수거하고, 24 웰 플레이트에 웰당 0.2 x 106개 세포로 플레이팅하였다. 세포를 파클리탁셀 농도 0 내지 200 μg/mL 하에 밤새 ABX 단독 또는 AR160에 노출시키거나, 또는 37℃ 및 5% CO2 하에 리툭시맙 (0-200 μg/mL)에 노출시켰다. 증식을 측정하기 위해, 클릭(Click)-iT EdU [몰레쿨라 프로브 (Molecular Probes; 미국 오리건주 유진)] 키트를 활용하였다. 간략하게 언급하면, 10 mM EdU를 상기 웰에 부가하고, 상기 세포 및 ABX, 리툭시맙 또는 AR160과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 상기 세포를 1% 사포닌으로 투과시키고, 삽입된 EdU를 FITC-접합된 항체로 표지시켰다. 증식 지수는 각각의 처리로부터의 FITC 양성 세포를, 처리되지 않은 EdU 표지된 세포의 최대 증식으로 나눔으로써 결정되었다.
실시예 6. 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체의 생체내 시험
종양 효능을 시험하기 위해, 5 x 106개의 다우디 인간 림프종 세포를 무흉선 누드 마우스 [할란 스프라그 돌리 (Harlan Sprague Dawley; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)]의 오른쪽 옆구리 내로 체내 이식하였다. 종양의 크기가 약 800 mm3에 도달할 때, 마우스를 무작위로 나누고, 마우스 등쪽 꼬리 정맥에 100 μl 정맥내 주사함으로써 식염수, RIT (12 mg/kg; Rit 12), RIT (18 mg/kg; Rit 18), ABX (30 mg/kg; ABX 30), ABX (45 mg/kg; ABX 45); 또는 12 mg/kg RIT와 30 mg/kg ABX를 함유한 AR160 (AR160 30) 또는 18 mg/kg RIT와 45 mg/kg ABX를 함유한 AR160 (AR160 45)으로 처리하였다. 종양 크기는 매주 2 내지 3회 모니터링되었고, 종양 용적은 하기 방정식을 이용하여 계산되었다: (길이 * 폭2)/2. 종양 크기가 마우스 체중의 10%와 같거나 또는 그 크기가 약 2500 mm3가 되면, 마우스를 희생시켰다. 기준선으로부터의 제10일 퍼센트 변화가 하기와 같이 계산되었다: [(처리일의 종양 크기 - 제10일의 종양 크기)/처리일의 종양 크기]*100. 카플란 마이어 곡선을 생성시켰고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 [그래프패드 소프트웨어, 인크. (GraphPad Software, Inc.; 미국 캘리포니아주 라 졸라)]를 사용하여 중앙 생존율을 계산하였다.
제10일까지는, AR160 45 처리된 군 내의 모든 마우스 (17/17)가 종양 반응을 나타냈지만, 94.1% (16/17)는 AR160 30, ABX 45, ABX 30, RIT 18, RIT 12, 및 식염수 군 각각에서 반응을 나타낸 마우스 7/14 (50%), 3/7 (42.8%), 1/4 (25%), 0/7 (0%) 및 0/5 (0%)와 비교해서 완전한 종양 반응을 나타냈다 (도 7a-7g). 각각의 군에서 제10일에 살아있는 마우스의 백분율은 식염수, RIT 12, RIT 18, ABX 30, ABX 45, AR160 30, 및 AR160 45 군에 대하여 각각 0%, 12%, 38%, 43%, 71%, 92% 및 100%였다 (도 7h). 다른 군 모두와 비교해서 AR160 45 군에서의 기준선 종양 크기로부터의 퍼센트 변화는 유의적이었다: 식염수 및 RIT 12의 경우 p<0.0001, RIT 18의 경우 p=0.0003, ABX 30의 경우 p=0.0054, ABX 45의 경우 p=0.0098 및 AB160 30의 경우 p=0.003. AR160 45로 처리된 마우스의 중앙 생존율은 식염수, RIT 12, RIT 18, ABX 30, ABX 45 및 AB160 30으로 각각 처리된 마우스에 대한 9, 8, 10.5, 12, 16 및 53.5일과 비교해서, 모든 마우스를 희생시킨 90일에서도 규정되지 않은 채로 있었다 (도 8). AR160 45 군에 대한 중앙 생존율은 식염수, RIT 12, RIT 18, ABX 30, ABX 45 (p<0.0001) 군 내에서의 마우스보다 유의적으로 더 높았지만, 두 AR160 군 간의 차이는 유의적이지 않았다 (p=0.0715).
생체내 영상화를 위하여, 아브락산(Abraxane) 입자를 SAIVI 항체 표지화 키트 (써모 사이언티픽; 미국 일리노이주 록퍼드)로부터의 프로토콜에 따라서 알렉사플루오르 750 염료로 표지시켰다. 염료와 입자 용액을 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 정제 칼럼으로 직행하여 결합되지 않은 표지를 제거하였다. 표지된 입자는 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리용 필터 (밀리포어; 미국 매사추세츠주 빌러리카)를 사용하여 농축시켜 14.54 mg 파클리탁셀/mL의 농도가 되도록 하였다. 아브락산을 각각 10 mg/mL 및 4 mg/mL의 농도 하의 IVIG [CSL 베링 (CSL Berhing; 미국 펜실베니아주 킹 오브 프러시아)] 또는 리툭시맙 (제넨테크; 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 입자 크기는 맬번 나노사이트 (맬번; 영국 우스터셔) 상에서 검사하여 AR160 형성을 확증하였다. 마우스에게 2 mg/mL의 표지된 아브락산, IgG와 함께 인큐베이션된 아브락산 (ABIgG), 또는 AR160 100 μL를 주사하였다. 주사 후 6, 24, 48, 및 72시간에 펄킨 엘머 IVIS 스펙트럼 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 마우스를 영상화하였다. 710/760의 여기/방출 스펙트럼 하에 형광 영상화를 수행하고, 현재 사용되는 영상 소프트웨어 (펄킨 엘머; 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 관심 영역 (ROI)을 적용하였다. 종양 전달은 세트 ROI에 의해 결정된, 종양 부위 내에서의 평균 복사 효율의 측정치로써 결정되었다. 아브락산, Abx + IgG, 및 AR160의 비교에서, 배경 ROI를 사용하여 측정시 입자 안정성을 증가시킨 임의의 효과를 제외시켰다. 배경 형광은 마우스 등 위의 관심 영역 (ROI)을 사용하여 측정되었고, 이를 종양 ROI에서의 형광 측정치로부터 차감하였다.
배경을 각각의 마우스에 대하여 차감한 후, ABX 단독 및 ABX 결합된 IgG와 비교해서 AR160이 제공된 마우스에서 19.1% 증가가 검출되었는데 (도 9a 및 9b), 이는 림프종 표적화 항체인 리툭시맙을 부가하는 것이, 화학요법제를 종양 부위에 침착시키는 것을 증가시켰다는 것을 암시한다. 부가적으로, AR160 처리된 마우스에서의 ABX의 증가된 종양 침착이 항체-리간드 매개되었다는 것을 보여주기 위해, 형광 표지된 AR160을 주사하기 이전 24시간에 AR160 내의 리툭시맙 투여량의 1% (0.12 mg/kg), 10% (1.2 mg/kg) 및 100% (12 mg/kg)로 마우스를 사전처리하였다. AR160 주사 후 24시간에 마우스를 영상화하였다 (도 9c). AR160 단독이 주사된 마우스는 종양 내에 높은 수준의 형광 표지된 AR160을 갖고 있었지만, 증가하는 양의 리툭시맙으로 사전처리하면, 종양 내의 표지된 AR160의 양이 감소된 것으로 나타났다 (도 9d). 취합해 보면, 이들 데이터는 ABX 단독과 비교하여 종양 부위에는 증가된 수준의 표지된 AR160이 존재하며, 종양 내에서의 이러한 약물 침착의 증가는 리툭시맙의 CD20 리간드 특이성에 의해 매개된다는 것을 암시한다.
실시예 7. 조제실에서 제조된 리툭시맙-알부민-파클리탁셀 나노입자 복합체와 실험실에서 제조된 복합체의 비교
AR160의 3개의 배치는 실험실에서 결정된 조건 하에 조제실에 의해 제조되었다 (AR160 p1, p2 및 p3). 이들을 ABX 단독 및 실험실에서 제조된 AR160 (AR160)과 비교하고 나노사이트에 의한 크기 분포도뿐만 아니라 각각의 제조에서의 입자 수에 관하여 분석하였다 (도 10). AR160 크기와 입자 수는 제조와 상관없이 유사하였다.
AR160 복합체 내의 리툭시맙의 리간드 결합 능력은 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가되었다. 각각의 조제실에서 제조된 배치는 실험실에서 제조된 AR160과 유사한 방식으로 다우디 세포에 대한 항-CD20 항체 결합을 방지시켰다 (도 11a-i).
실시예 8. 인간 혈청 알부민의 항체-결합 모티프의 결정
비아코어 표면 플라스몬 공명 기술을 활용하여, 다양한 항체 (리툭시맙, 트라스투주맙, 베바시주맙, 및 무로모납)와 알부민 간의 결합 부위가 위치한 곳을 결정하였다. 각각 6개의 아미노산 중복을 함유하는 18개 아미노산 펩티드를 이용하여 알부민 펩티드 라이브러리를 구축하였고, 각각의 알부민 펩티드는 CM5 칩 상에 고정된 리툭시맙에 대항하여 실행되었다. 펩티드는 HBS-EP가 플러스된 실행 완충액에서 5 내지 10 mg/mL로 현탁시켰다. 수 불용성 펩티드를 10% DMSO [시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스)]에 용해시켰다. 리툭시맙은 아민 커플링을 통해 비아코어 CM5 [GE 헬스케어 (GE Healthcare; 미국 일리노이주 시카고)] 칩 상으로 고정화시켰다. 비아코어 X-100 (GE 헬스케어; 미국 일리노이주 시카고)을 사용하여, 고정화된 리툭시맙 상으로 알부민 펩티드 라이브러리를 스크리닝하였다. 펩티드를 120초의 노출 시간으로 1 내지 50 μg/mL에서 스크리닝하였다. 비아코어 X100 소프트웨어를 사용하여 결합 동역학을 결정하였다.
펩티드는 HBS 실행 완충액 중에서 50, 25, 10, 5, 2.5, 1.25 μg/mL 하에 실행되었다. 해리 상수는 비아코어 평가 소프트웨어에 의해 결정되었다. 3개의 알부민 펩티드가 항체와 결합하는 것으로 밝혀졌다: HSA 펩티드 4 (서열번호 3), HSA 펩티드 13 (서열번호 4), 및 HSA 펩티드 40 (서열번호 5) (도 12a-12j). 해리 상수 (Kd)는 도 12k에 제공된다. 흥미롭게도, 펩티드 40은 많은 약물과 결합하는 것으로 공지된 소수성 결합 부위인, 널리 규명된 수드로우(Sudlow) II 부위와 매핑된다 (Diana, F.J., Veronich, K. & Kapoor, A.L. Binding of nonsteroidal anti-inflammatory agents and their effect on binding of racemic warfarin and its enantiomers to human serum albumin. J Pharm Sci 78, 195-199 (1989); Sudlow, G., Birkett, D.J. & Wade, D.N. The characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin. Mol Pharmacol 11, 824-832 (1975)].
실시예 9. 다수의 항체의 알부민-결합 모티프의 결정
비아코어 표면 플라스몬 공명 기술을 또한 활용하여, HSA 펩티드 4, 13, 또는 40과 결합하는 리툭시맙, 트라스투주맙, 베바시주맙 또는 무로모납 상의 부위를 결정하였다 (도 13a-13e). 결합 부위가 위치하는 중쇄의 가변 영역의 서열이 베바시주맙 (서열번호 1)과 리툭시맙 (서열번호 2) 둘 다에 대하여 도 13f에 제공된다. 관심 19-AA 영역이 베바시주맙 (서열번호 8 - WYFDVWGQGTLVTVSSAST) 및 리툭시맙 (서열번호 10 - WYFNVWGAGTTVTVSAAST)에 대해 밑줄이 그어져 있으며, 약 80% 동일성을 공유한다. 도 13g는 HSA와 결합하는 각각의 항체로부터의 서열을 제공한다. 흥미롭게도, 무로모납이 HSA 펩티드 4 및 40과 결합하였지만, 무로모납 펩티드는 완전한 HSA 단백질과 결합하지 않았다.
상기 논의된 바와 같이, 4 mg/mL 리툭시맙을 10 mg/mL의 ABX와 함께 공동 인큐베이션하면, 나노사이트에 의해 결정된 바와 같이 80 nm ABX 단독의 크기가, 리툭시맙이 ABX와 결합될 때 대략 110 nM으로 변화된다. 알부민-결합 펩티드를 경쟁 검정에 사용하여, 그들이 AR160의 형성을 방해할 것인지를 알아 보았다. 간략하게 언급하면, 10 mg/ml의 ABX를 4 mg/mL의 리툭시맙, 및 10몰 과량의 대조군 펩티드 (HSA 10), HSA 펩티드 40, 또는 펩티드 없음 (AR160 대조군)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 입자 크기 설정 및 계산을 위해 인큐베이션 후, 맬번 나노사이트 (맬번; 영국 우스터셔)를 활용하였다. 입자를 1:200으로 희석시키고, 9의 카메라 수준 및 16의 포착 검출 한계치를 사용하여 입자 크기 및 수를 결정하였다.
ABX 단독은 77 nm의 크기를 가졌지만, ABX와 결합하는 리툭시맙은 100 nm 입자를 산출시켰다. 알부민-결합 펩티드 (펩티드 40)가 ABX와 리툭시맙의 인큐베이션에 부가될 때, 이로써 생성되는 나노입자는 70 nm였는데, 이는 ABX 단독의 크기인 반면, 비-결합 대조군 펩티드는 100 nm 입자를 생성시켰는데, 이는 본 실험에서 AR160의 크기 (109 nm)였다 (도 14a). 이들 데이터는 HSA 펩티드 40이 AR160의 형성을 효과적으로 억제하였다는 것을 암시한다. 결합 펩티드 4 및 13을 이용한 결과는 더 이질적인 나노입자 집단을 명확하게 보여주는데, 이는 리툭시맙에 대한 친화성이 덜한 이들 2개의 알부민 펩티드가 AR160의 형성을 불완전하게 차단시켰다는 것을 암시한다 (도 14c 및 14d).
유사한 실험이 베바시주맙을 사용하여 수행되었다 (도 14b). 그 결과는 HSA 펩티드 40 또는 Bev 펩티드 1 (서열번호 7)을 부가하는 것이, ABX와의 항체 복합체 형성의 지표인 입자 크기 상의 30 nm 증가를 방지시킨다는 것을 보여주는데, 이는 두 펩티드가 항체-알부민 결합을 방해한다는 것을 나타낸다.
서열 목록
서열번호 1 - 베바시주맙 가변 서열
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSAST
서열번호 2 - 리툭시맙 가변 서열
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAAST
서열번호 3 - HSA 펩티드 4
DLGEENFKALVLIAFAQY
서열번호 4 - HSA 펩티드 13
DVMCTAFHDNEETFLKKY
서열번호 5 - HSA 펩티드 40
VVLNQLCVLHEKTPVSDR
서열번호 6 - 베바시주맙 가변 펩티드 2
SHWYFDVWGQGTLVTVSSAST
서열번호 7 - 베바시주맙 가변 펩티드 1
DTAVYYCAKYPHYYGSSHWYF
서열번호 8 - 베바시주맙 알부민 결합 서열
WYFDVWGQGTLVTVSSAST
서열번호 9 - 리툭시맙 알부민 결합 서열
YCARSTYYGGDWYFNVWGAG
서열번호 10 - 리툭시맙 가변 펩티드 2
WYFNVWGAGTTVTVSAAST
서열번호 11 - 트라스투주맙 가변 펩티드 1
YYCSRWGGDGFYAMDYWGQG
서열번호 12 - 무로모납 가변 펩티드 1
DDHYCLDYWGQGTTLTVSSA
SEQUENCE LISTING <110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH <120> MODIFIED ANTIBODY-ALBUMIN NANOPARTICLE COMPLEXES FOR CANCER TREATMENT <130> 111393-3010 <140> PCT/US2017/045643 <141> 2017-08-04 <150> 62/409,830 <151> 2016-10-18 <150> 62/371,668 <151> 2016-08-05 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr 115 120 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala 1 5 10 15 Gln Tyr <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 1 5 10 15 Lys Tyr <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 1 5 10 15 Asp Arg <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Thr 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Ser His Trp Tyr Phe 20 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 Ala Ser Thr <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 9 Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 15 Trp Gly Ala Gly 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Thr <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 11 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Gly 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 1 5 10 15 Val Ser Ser Ala 20

Claims (24)

  1. 암을 치료하기 위한, 외부 표면을 갖는 나노입자 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 나노입자 복합체는
    서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 항체-결합 모티프가 삽입되어진 운반체 단백질;
    각각 항원 결합 도메인을 갖는 항체 또는 융합 단백질; 및
    파클리탁셀
    을 포함하고;
    여기서 상기 항체 또는 융합 단백질은 상기 나노입자 복합체의 외부 표면 상에 배열되고, 상기 암은 상기 항원을 발현하며, 상기 나노입자 복합체는 생체내에서 상기 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 것인, 조성물.
  2. 암을 치료하기 위한, 외부 표면을 갖는 나노입자 복합체를 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 나노입자 복합체는
    서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 항체-결합 모티프가 삽입되어진 운반체 단백질;
    서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 알부민-결합 모티프가 삽입되어진, 항원 결합 도메인을 갖는 항체 또는 융합 단백질; 및
    파클리탁셀
    을 포함하고;
    여기서 상기 항체 또는 융합 단백질은 상기 나노입자 복합체의 외부 표면 상에 배열되고, 상기 암은 상기 항원을 발현하며, 상기 나노입자 복합체는 생체내에서 상기 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 것인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노입자 복합체가 약 0.1 μm 내지 약 1 μm 의 평균 크기를 갖는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 나노입자 복합체가 평균 크기 약 100 nm 내지 약 800 nm를 갖는 것인, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 운반체 단백질 및 파클리탁셀 대 항체 또는 융합 단백질의 비가 10:1 내지 10:30인, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노입자 복합체 각각이 약 100개 내지 약 1000개의 항체를 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 동결건조된 것인, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 운반체 단백질이 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질인, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 운반체 단백질이 알부민인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 알부민이 인간 혈청 알부민인, 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 융합 단백질이 비-공유 결합을 통해 상기 운반체 단백질에 결합되는 것인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 융합 단백질이 상기 항체-결합 모티프를 통해 상기 운반체 단백질에 결합되는 것인, 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파클리탁셀이 비-공유 결합을 통해 상기 운반체 단백질에 결합되는 것인, 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 상기 변형된 운반체 단백질의 서브세트가 1개 초과의 항체-결합 모티프를 포함하는 것인, 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  16. 나노입자 복합체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 항체-결합 모티프가 삽입되어진 운반체 단백질을 인큐베이트함을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 운반체 단백질이 알부민인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 운반체 단백질 또는 상기 나노입자 복합체가 파클리탁셀과 조합되는 것인, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 알부민-결합 모티프가 삽입되어진 항체인, 방법.
  20. 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 항체-결합 모티프가 삽입되어진 운반체 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 변형되지 않은 폴리펩티드 서열을 갖는 운반체 단백질 보다 항체에 대해 더 높은 친화성을 갖는, 운반체 단백질.
  22. 변형된 운반체 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 적어도 하나의 항체-결합 모티프가 삽입되어진 운반체 단백질을 제공함을 포함하고, 여기서 상기 변형된 운반체 단백질은 변형되기 전의 운반체 단백질 보다 항체에 대해 더 높은 친화성을 갖는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 운반체 단백질이 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 엘라스틴 유래 폴리펩티드, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 유장 단백질인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드 서열이 변형 이전에는 상기 항체-결합 모티프를 포함하지 않았던 것인, 방법.
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