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KR20230004597A - 신경퇴행성질환 치료제에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

신경퇴행성질환 치료제에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20230004597A
KR20230004597A KR1020227039465A KR20227039465A KR20230004597A KR 20230004597 A KR20230004597 A KR 20230004597A KR 1020227039465 A KR1020227039465 A KR 1020227039465A KR 20227039465 A KR20227039465 A KR 20227039465A KR 20230004597 A KR20230004597 A KR 20230004597A
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KR
South Korea
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mek
inhibitor
treatment
concentration
biomarkers
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227039465A
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English (en)
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한성호
김미연
천윤선
김형태
박진아
Original Assignee
주식회사 지뉴브
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 신경퇴행성질환으로 진단받은 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하는 방법 및 그러한 방법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명의 방법은 신경퇴행성질환 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 오스테오폰틴(osteopontin), 시냅토태그민-1(synaptotagmin-1), 아포지단백-E(apolipoprotein-E), 카텝신 B(cathepsin B), HLA-DOB (HLA 클래스 II 조직적합성 항원 DO 베타 체인), 및 미세신경섬유 경쇄(neurofilament light chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 본 발명에 의하면, 신경퇴행성질환으로 진단받은 개체에게서 MEK 1/2 억제제에 대한 반응을 모니터링하여, 치료 효과의 가능성을 조기에 판단하고 약물 치료를 지속할 것인지 용량의 조절이 필요한 지를 판단하는 등 개체의 관리에 유용한 정보를 얻을 수 있다.

Description

신경퇴행성질환 치료제에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 조성물
본 발명은 신경퇴행성질환으로 진단받은 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 그러한 방법에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
바이오마커는 특정 질병에서 정상 또는 병적인 상태를 구분하거나 또는 약물에 대한 치료 반응을 예측하거나 객관적으로 측정할 수 있는 생체 지표이다. 바이오마커는 그 활용에 따라 병의 유무를 검출하여 진단하기 위한 진단 바이오마커(diagnostic biomarker), 환자에게서 특정한 임상 사건의 발생, 질병의 재발 또는 진행을 예상하기 위한 예후 바이오마커(prognostic biomarker), 환자에게서 치료 반응을 예측하기 위한 예측 바이오마커(predictive biomarker), 치료제를 투여한 환자에게서 생물학적 반응이 일어났음을 보여주는 약력학 또는 반응 바이오마커(Pharmacodynamic/Response biomarker) 등으로 구분할 수 있다.
특히 성공 가능성이 매우 낮은 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료제를 개발함에 있어서는 임상시험 단계에서부터 시험 대상자 선별, 후보 약물이 타깃에 작용하는 지의 증명, 질병이 근본적으로 치료되었음을 뒷받침하는 증거 생성, 부작용의 모니터링 등에 사용할 수 있는 바이오마커에 대한 요구가 크며, 이를 통해 치료제 개발의 성공 가능성을 높이기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.
트라메티닙(trametinib)은 MAPK/ERK 신호전달경로 중 ERK의 상위단계 분자인 MEK1과 MEK2를 모두 억제하는 MEK1/2 억제제로서, 상품명 MEKINIST®, 매큐셀®로 흑색종 및 비소세포암 등에 항암제로 사용되고 있다. 최근 트라메티닙이 알츠하이머병, 근위축성측삭경화증(ALS) 등을 비롯한 신경퇴행성질환의 효과적인 치료제 후보 물질로서 제시된 바 있다(PCT/KR2017/013444, PCT/KR2020/006680, US16/880894). 구체적으로, 트라메티닙은 신경줄기세포를 신경세포로 분화시켜서 신경세포의 신생을 유도하고 신경독성 물질이 존재하는 환경에서 오토파지-라이소좀(autophagic lysosome) 기능의 활성화를 통해 신경세포를 보호한다. 알츠하이머 모델 마우스인 5XFAD와 ALS 모델 마우스인 SOD1-G93A (B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J)에서도 그 효과가 확인되었다.
트라메티닙을 비롯한 MEK 1/2 억제제를 신경퇴행성질환 치료제로 적용함에 있어서, 개체의 체내에서 약물에 대한 노출에 반응하여 변화되는 바이오마커가 존재한다면 치료 효과의 가능성을 조기에 판단하고, 약물 치료를 지속할 것인지 용량의 조절이 필요한 지를 판단하는 등 개체의 관리에 유용한 정보를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명자들은 알츠하이머병 모델 마우스인 5XFAD에서 트라메티닙 투여에 따라 민감하게 변화하는 생물지표를 발굴하여 MEK 1/2 억제제를 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성질환 치료제에 의한 치료에 있어서 사용할 수 있는 예측 바이오마커 또는 약력학 또는 반응 바이오마커를 개발하고자 하였다.
본 발명은 신경퇴행성질환으로 진단받은 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 치료 동안 또는 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 신경퇴행성질환 개체의 생물학적 시료에서 오스테오폰틴(osteopontin), 시냅토태그민-1(synaptotagmin-1), 아포지단백-E(apolipoprotein-E), 카텝신 B(cathepsin B), HLA-DOB (HLA 클래스 II 조직적합성 항원 DO 베타 체인), 및 미세신경섬유 경쇄(neurofilament light chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 상기 바이오마커의 농도 수준이나 그 변동으로부터 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 정보를 얻을 수 있다. 상기 측정된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료 및/또는 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교할 수 있다. MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료 또는 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비한, MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도 변화 또는 차이가 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 개체의 반응을 나타낸다. 상기 방법에서 제공되는 상기 정보는 MEK 1/2 억제제의 추후 투약 용량이나 기간을 결정하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법에서 제공되는 상기 정보는 추후 MEK 1/2 억제제의 투약을 지속하거나 중단하는 것을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 치료 동안 또는 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 신경퇴행성질환 개체의 생물학적 시료에서 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 바이오마커의 농도를 기초로 상기 개체의 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하는 단계를 포함한다. 상기 바이오마커의 농도 수준이나 그 변동으로부터 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가할 수 있다. 상기 방법은 MEK 1/2 억제제의 추후 투약 용량이나 기간을 결정하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 추후 MEK 1/2 억제제의 투약을 지속하거나 중단하는 것을 결정하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 치료에 대한 반응의 평가는 MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하여, MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도에서 변화를 보이는 경우, 상기 개체를 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대해 반응을 나타내는 것으로 결정하는 것을 포함한다. 상기 치료에 대한 반응의 평가는 MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도를 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하는 것을 더 포함할 수 있다. 비교 결과 MEK 1/2 억제제로의 치료 전과 비교하여 치료 동안 또는 치료 후에 상기 건강한 개체에서의 바이오마커 농도와의 차이가 적어지는 경우, MEK 1/2 억제제로의 치료에 유익한 반응을 나타내는 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 신경퇴행성질환 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도에 변화를 유도하는 1일 유효 용량으로 MEK 1/2 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에서 생물학적 시료는 MEK 1/2 억제제의 투여 후에 얻어진다. 일 측면에서, 생물학적 시료는 MEK 1/2 억제제의 투여 시작 후 여러 시점에서 얻어진다. 일 측면에서 본 발명의 방법은 MEK 1/2 억제제를 투여하기 전에 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 상기 바이오마커의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 일 측면에서, MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응의 평가는 (a) MEK 1/2 억제제의 투여 후에 얻은 개체의 생물학적 시료로부터 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하고, (b) 그 농도를 투여 전에 얻은 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하거나, 또는 (c) 그 농도를 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하는데 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브(probe)를 포함한다. 상기 프로브는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer), 펩타이드, 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명에 따르면 신경퇴행성질환으로 진단받은 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하여, 치료 효과의 가능성을 조기에 판단하고 약물 치료를 지속할 것인지 용량의 조절이 필요한 지를 판단하는 등 개체의 관리에 유용한 정보를 얻을 수 있다.
도면에서 “Veh”는 비히클 투여군, “Tra 0.05”, “Tra 0.1”, “Tra 0.2”는 각각 트라메티닙 0.05, 0.1 및 0.2 mg/kg/일 투여군, “Don”은 도네페질 투여군, “Don+Tra0.1”은 도네페질과 트라메티닙 0.1 mg/kg/일 병용 투여군을 의미한다.
도 1은 야생형 및 8 개월령 5XFAD 마우스 대뇌피질과 13 개월령 5XFAD 마우스 뇌에서 트라메티닙 투여에 따른 Spp1의 mRNA 발현 수준을 비교한 것이다(n=2~3/군).
도 2는 야생형, 8 개월령 5XFAD 마우스 및 13 개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 트라메티닙 및/또는 도네페질의 투여에 따른 오스테오폰틴 농도의 변화를 나타낸 것이다. P<0.05: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.1, n=6~7/군.
도 3은 야생형 및 8 개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 트라메티닙 및/또는 도네페질의 투여에 따른 시냅토태그민-1의 농도 변화를 나타낸 것이다. *P<0.05: 5XFAD-Veh vs. Don+Tra0.1, n=6~7/군.
도 4는 야생형 및 8 개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 트라메티닙 및/또는 도네페질의 투여에 따른 아포지단백-E의 농도 변화를 나타낸 것이다. **P<0.01: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.2; *P<0.05: 5XFAD-Veh vs. Don+Tra0.1, n=6~7/군.
도 5는 야생형과 8 개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 트라메티닙 또는 도네페질 투여에 따른 카텝신 B의 농도 변화를 나타낸 것이다. *P<0.05: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.1, 5XFAD-Veh vs. Don, n=6~7/군.
도 6은 13 개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 트라메티닙 투여에 따른 카텝신 B의 농도 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 야생형, 8 개월령 5XFAD 마우스 및 13 개월령 5XFAD 마우스 혈장에서 트라메티닙 투여에 따른 미세신경섬유 경쇄 농도의 변화를 나타낸 것이다. *P<0.05: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.1, n=6~7/군.
도 8은 야생형 및 8개월령 5XFAD 마우스 대뇌피질에서 트라메티닙 및/또는 도네페질의 투여에 의한 덴드라이트(dendrite) 길이의 변화를 나타내는 것으로서, 덴드라이트 마커인 Map2에 대한 항체를 이용한 면역형광염색 결과의 사진이다.
도 9는 도 8에서 덴드라이트의 길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. ***p<0.005: WT-Veh vs. 5XFAD-Veh, #p<0.005: 5XFAD-Veh vs. Don, ##p<0.005: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.05, ###p<0.001: 5XFAD-Veh vs. Tra 0.1, Tra 0.2 또는 Don+Tra 0.1, n=3/군.
도 10은 7주령의 일반 마우스 대뇌피질에서 트라메티닙 0.1mg/kg/일 투여에 따라 1, 2, 3, 4주차에서의 발현변화를 보이는 유전자들을 나타낸 것이다.
도 11은 야생형과 8 개월령 5XFAD 마우스의 대뇌피질에서 트라메티닙 투여에 따른 H2-Ob의 mRNA 발현 수준을 비교한 것이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있다.
정의
본 발명에서 “MEK 1/2 억제제”는 Ras-Raf-MEK-ERK의 순서로 이어지는 MAP 키나아제(Mitogen Activated Protein Kinase; MAPK) 신호전달 경로('MAPK/ERK 경로'라고도 함)의 일원인 MEK (mitogen-activated protein kinase kinase; MAP2K 또는 MAPKK라고도 불림)의 서브타입 중 MEK1과 MEK2를 모두 억제하는 물질을 의미한다. MEK 1/2 억제제는 바람직하게는 nM 수준의 IC50를 나타내고, MEK1에 대한 IC50와 MEK2에 대한 IC50의 차이가 바람직하게는 10배 이하, 더욱 바람직하게는 5배 이하인 물질이다. 예를 들어 MEK 1/2 억제제는 트라메티닙(trametinib), 피마설팁(pimasertib, AS703026), AZD8330, 비니메티닙(binimetinib, MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), 레파메티닙(refametinib, RDEA119, Bay 86-9766), PD318088, PD0325901, RO5126766이다.
MEK 1/2 억제제는 바람직하게는 하기 [화학식 1]로 표시되는 트라메티닙(trametinib; GSK-1120212, GSK1120212, JTP74057, 또는 JTP-74057)이다. 트라메티닙의 화학명은 N-(3-{3-사이클로프로필-5-[(2-플루오로-4-아이오도페닐)아미노]-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소-3,4,6,7-테트라하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-1(2H)-일}페닐)아세트아미드 (N-(3-{3-Cyclopropyl-5-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahydropyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl}phenyl)acetamide)이다. 본 발명에서 [화학식 1]의 화합물은 유리 염기, 또는 제약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 형태로 사용될 수 있다. 용매화물은 예를 들어 수화물, 또는 디메틸술폭시드, 아세트산, 에탄올, 니트로메탄, 클로로벤젠, 1-펜탄올, 이소프로필 알콜, 에틸렌 글리콜 및 3-메틸-1-부탄올 등의 용매화물일 수 있다.
[화학식 1]
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오스테오폰틴(osteopontin; OPN)은 SPP1 유전자에 의해 암호화되는 단백질로써, secreted acidic proteins에 속한다. 뼈의 리모델링에도 중요한 인자로 작용하지만, 특히 마크로파지, 호중구, 수지상세포, 소교세포(microglia), T/B 세포와 같은 면역 세포에서 많이 발현한다. 면역 조절자로서의 작용을 한다고 알려져 있으며, 화학주성의 성질을 가지고 있다. 알츠하이머 병 환자의 뇌척수액과 혈장 혹은 혈청에서 OPN의 양이 증가되고, 특히 병의 진행정도가 심해짐에 따라 OPN의 양이 증가한다는 보고가 있다(Sun et al. Elevated osteopontin levels in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Mediators Inflamm. 2013: 615745 (2013)). 건강한 성인의 혈장에서 보고된 오스테오폰틴의 농도는 측정 방법에 따라 31 ng/mL 내지 200 ng/mL 또는 그 이상으로 상이할 수 있는데(Salem et al. Clinical Significance of Plasma Osteopontin Level as a Biomarker of Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology Res. 2013 Oct; 6(5): 191-199), 최근에는 평균 330 ng/ml로 보고한 논문이 있다(Nourkami-Tutdibi et al. Plasma levels of osteopontin from birth to adulthood, Pediatr Blood Cancer. 2020; 67: e28272).
시냅토태그민(Synaptotagmin)은 N-말단 막횡단 영역(N-terminal transmembrane region), 가변적 링커, 두 개의 C-말단 C2 도메인(C2A 및 C2B)을 갖는 것을 특징으로 하는 막-이송(membrane-trafficking) 단백질이다. 포유류 시냅토태그민 패밀리에는 17개의 동형단백질이 존재한다. 시냅토태그민-1(Syt1)은 시냅스 세포외유출(synaptic exocytosis)에 중요한 역할을 하는 시냅스이전소포(presynaptic vesicle) 상의 단백질로서, 알츠하이머 병증이 진행되고 시냅스가 손상됨에 따라 두뇌 피질 영역에서 그 양이 감소하는 것으로 보고되었다(Blennow et al. (2018) Biomarkers for Alzheimer's disease: current status and prospects for the future. J Intern Med 284, 643-663). 1990년대에 뇌척수액에서 Syt1가 검출된 이래로 알츠하이머병 환자의 뇌척수액에서 Syt1이 높은 농도로 나타나는 것이 보고되어, 시냅토태그민의 알츠하이머병 바이오마커로서의 가능성이 제시되었다(Ohrfelt et al. (2016) The presynaptic vesicle protein synaptotagmin is a novel biomarker for Alzheimer's disease, Alzheimers Res Ther 8, 41).
아포지단백-E(Apolipoprotein-E)는 지질 대사에 관여하는 다기능적 단백질로서, 다양한 신경퇴행성질환에서 아포지단백-E의 변형이 보고되어 있다. 특히 아포지단백-E의 ε4 대립유전자(ApoE4)는 알츠하이머병의 주요한 유전적 위험 인자로 알려져 있다. ApoE4 유전자와 알츠하이머병 사이의 상관관계로 인하여 뇌척수액과 혈장 ApoE 농도를 측정하여 알츠하이머병의 바이오마커로 개발하려는 많은 연구가 진행되어 왔다.
카텝신 B는 30 kDa의 라이소좀 시스테인 프로테아제로서, 세포내이입(endocytosis) 또는 식세포작용(phagocytosis)를 통해 세포 밖으로부터 라이소좀 시스템으로 들어온 단백질을 분해하는 작용을 한다. 알츠하이머병 환자의 혈장 및 뇌척수액에서 카텝신 B의 농도가 상승되어 있다는 보고가 있다(Morena et al. (2017) A comparison of lysosomal enzymes expression levels in peripheral blood of mild- and severe-Alzheimer's disease and MCI patients: Implications for regenerative medicine approaches. Int J Mol Sci 18(8): 1806; Sundelof et al. (2010) Higher cathepsin B levels in plasma in Alzheimer's disease compared to healthy controls. Journal of Alzheimer's Disease 22: 1223-1230; Zhang et al. Quantitative proteomics of cerebrospinal fluid from patients with Alzheimer disease. J Alzheimers Dis. 2005; 7(2):125-33).
HLA-DOB는 HLA (Human Leukocyte Antigen) 클래스 II 조직적합성 항원 DO 베타 체인(HLA Class II histocompatibility antigen, DO beta chain)으로서, 인간 HLA-DOB 유전자에 의해 코딩되며 (마우스 ortholog는 H2-Ob이다), HLA 클래스 II 베타 체인 파라로그에 속한다. 이 클래스 II 분자는 막에 부착되어 있는 알파 체인(DOA)과 베타 체인(DOB)로 구성되는 헤테로다이머(heterodimer)로서 세포내 소포에 위치해 있다. 클래스 II 분자들은 항원제시세포(B 림프구, 수지상세포, 마크로파지)에서 발현된다. HLA-DOB는 B 세포에서 HLA-DM과 상호작용을 함으로써 HLA 클래스 II 제한적 항원 제시 경로에서 중요한 조절자의 역할을 하며, HLA-DM의 펩티드 교환 활성을 변경시킨다.
미세신경섬유(neurofilaments)는 뉴론의 세포질에서 발견되는 타입 IV 중간 필라멘트로 분류되는 것으로서 직경이 10 nm 정도이고 길이가 수 마이크로미터인 단백질 폴리머이다. 미세소관(~25 nm) 및 미세필라멘트(7 nm)와 함께 뉴런의 세포골격을 형성한다. 포유류 미세신경섬유는 단백질 L (NfL), M (NfM), H (NfH), 인터넥신-알파(internexin-alpha) 및 페리페린(peripherin)의 조합으로 이루어진 헤테로폴리머의 형태로 되어 있다. 이 중 미세신경섬유 경쇄(neurofilament light chain; NfL)는 알츠하이머병 환자에서 질병의 진행을 확인할 수 있는 유망한 체액 바이오마커로 알려져 있다. 알츠하이머병 환자의 뇌척수액과 혈장 혹은 혈청에서 NfL의 양이 증가되어 있다는 보고가 있다(Lewczuk et al. (2018) Plasma neurofilament light as a potential biomarker of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther 10(1):71). 액손에 손상이 일어나면 뉴론의 신경돌기를 구성하는 미세신경섬유 경쇄 등이 세포 밖 공간으로 내보내지고, 결과적으로 뇌척수액 또는 혈장과 같은 체액에 NfL 등이 분비된다.
신경퇴행성질환은 신경세포의 기능 감소 또는 소실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상이 일어나는 질환을 말하는 것으로서, 예를 들면 치매, 알츠하이머병, 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체치매, 다계통위축증, 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 진행성핵상마비, 헌팅턴병, 근위축성측삭경화증(루게릭병, ALS), 원발성측삭경화증, 척수근육위축병, 진행성 연수마비(progressive bulbar palsy; PBP), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy; PMA), 가성연수마비(pseudobulbar palsy), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia; HSP), 소뇌성 운동실조증, 파킨슨병, 다발성경화증 (MS), 경도인지장애(MCI) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 신경퇴행성질환은 바람직하게는 알츠하이머병이다.
일 예에서, 신경퇴행성질환은 MAPK/ERK 경로의 비정상적 활성화를 수반한다. 일 예에서 신경퇴행성질환은 비정상적 오토파지-라이소좀 기능이 수반된다.
본 발명에서, 용어 “치료” 또는 “치료 반응”은 MEK 1/2 억제제의 투여에 의해 신경퇴행성질환의 의심 및 발병 개체에서 증상의 호전, 질환의 진행 지연, 신경 손상의 회복 등 질환의 의심 및 발병 개체를 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “개체”는 특별히 제한되지 않으며 MEK 1/2 억제제로의 치료가 수행될 수 있는 모든 개체일 수 있다.
본 발명에서 "프로브 (probe)"는 시료 내의 검출하고자 하는 표적 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 목적하는 분자에 특이적으로 부착되어 목적 분자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 특별히 제한되지 않는다.
투여량
트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제는 치료적 유효량으로 투여된다. 본 발명에서 치료적 유효량은 개체의 신경퇴행성질환을 치료 또는 완화하거나 질병의 진행을 지연시키기에 효과적인 용량이다. 일 예에서, 치료적 유효량은 알츠하이머병을 치료 또는 완화하거나 질병의 진행을 지연시키기에 효과적인 용량이다.
일 예에서, 치료적 유효량은 신경 분화를 유도하기에 충분한 용량이다. 일 예에서, 치료적 유효량은 신경 재생을 유도하기에 충분한 용량이다. 일 예에서, 치료적 유효량은 오토파지-라이소좀 활성을 유도하기에 충분한 용량이다. 일 예에서, 치료적 유효량은 오토파고좀-라이소좀 융합을 증진시키기에 충분한 용량이다.
일 예에서, 치료적 유효량은 하나 이상의 바이오마커 농도 변화를 유도하기에 충분한 용량이다. 일 예에서, 치료적 유효량은 개체에게서 얻은 생물학적 시료에서 하나 이상의 바이오마커의 농도 변화를 유도하기에 충분한 용량이다. 일 예에서, 바이오마커는 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된다. 바이오마커는 트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제에 대한 반응을 평가하기 위하여 사용된다.
일 예에서, MEK 1/2 억제제는 개체의 생물학적 시료에서 하나 이상의 바이오마커의 농도가 MEK 1/2 억제제 투여 전 또는 투여하지 않았을 때에 비하여 0.5% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 2.5% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 증가하거나 감소하게 되는 용량으로 투여한다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제는 하나 이상의 바이오마커의 농도가 해당 질병이 없는 건강한 개체의 수준으로 유지되는 용량으로 투여한다.
일 예에서, 트라메티닙은 0.1 내지 2 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 0.2 내지 1.5 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 0.25 내지 1 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 0.25 내지 0.5 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 0.5 내지 1 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 1 내지 2 mg/일의 용량으로 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 0.1 mg/일, 0.125 mg/일, 0.2 mg/일, 0.25 mg/일, 0.3 mg/일, 0.4 mg/일, 0.5 mg/일, 0.6 mg/일, 0.7 mg/일, 0.75 mg/일, 0.8 mg/일, 0.9 mg/일, 1 mg/일, 1.5 mg/일, 또는 2 mg/일의 용량으로 투여된다.
투여 기간
일 예에서, MEK 1/2 억제제는 신경 분화를 유도하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제는 신경 재생을 유도하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제는 오토파지-라이소좀 활성을 유도하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제는 오토파고좀-라이소좀 융합을 증진시키기에 충분한 기간 동안 투여된다.
일 예에서, MEK 1/2 억제제는 개체에게서 얻은 생물학적 시료에서 하나 이상의 바이오마커의 농도 변화를 유도하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일 예에서, 바이오마커는 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된다. 일 예에서, 바이오마커는 트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제에 대한 반응을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
일 예에서, MEK 1/2 억제제는 하나 이상의 바이오마커의 농도가 MEK 1/2 억제제 투여 전 또는 투여하지 않았을 때에 비하여 0.5% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 2.5% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 증가하거나 감소하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제는 하나 이상의 바이오마커의 농도가 해당 질병이 없는 건강한 개체의 수준으로 회복되기에 충분한 기간 동안 투여된다.
일 예에서, 개체들은 치료적 유효량의 트라메티닙을 4 주 이상 투여 받는다. 일 예에서, 트라메티닙은 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상 동안 투여된다. 일 예에서, 트라메티닙은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상 동안 투여된다.
바이오마커의 검출
본 발명의 한 측면은 트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 신경퇴행성질환 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 상기 바이오마커의 농도 수준이나 그 변동으로부터 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 정보를 얻을 수 있다. 상기 방법에서 제공되는 상기 정보는 MEK 1/2 억제제의 추후 투약 용량이나 기간을 결정하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법에서 제공되는 상기 정보는 추후 MEK 1/2 억제제의 투약을 지속하거나 중단하는 것을 결정하는 데 사용될 수 있다.
일 예에서, 본 발명은 개체에게서 얻은 생물학적 시료에서 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 단계를 포함한다. 바이오마커의 농도 측정은 해당 기술분야에 알려진 다양한 단백질 분석법을 사용하여 할 수 있다. 예를 들면, 시료를 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체와 항체-마커 복합체가 형성되기에 충분한 조건에서 접촉시키고, 상기 복합체를 검출함으로써 측정할 수 있다. 바이오마커의 존재는 여러 가지 방법으로 검출할 수 있는데, 웨스턴 블로팅, 효소결합면역흡착검사(ELISA), 면역전기영동법, 단백질 면역침강법, 단백질 면역염색법, 2차원 SDS-PAGE, 형광 활성화 세포 선별(FACS), 유세포분석, 공초점 이미징(confocal imaging), 질량분석법(Mass Spectrometry) 등을 포함한다.
본 발명의 일 예에서, 시료 중의 바이오마커의 농도는 고상 샌드위치 ELISA 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 표적 바이오마커 단백질에 특이적이고 민감하게 결합하는 제1 고정 항체를 마이크로플레이트의 웰에 코팅한 후 시료를 웰에 추가하여, 시료 중의 표적 바이오마커를 고정 항체에 부착시킨다. 제2의 검출 항체를 웰에 추가하여 표적 바이오마커에 부착시킴으로써 제1 고정 항체와 제2 검출 항체 사이에 표적 바이오마커가 샌드위치 구조가 되게 한다. 제2 검출 항체에 컨쥬게이트된 효소를 통한 효소-기질 반응에 의해 표적 바이오마커를 검출할 수 있다.
일 예에서, ELISA 방법이 민감도가 떨어지는 경우에는 다른 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미세신경섬유 경쇄는 Simoa® (Single molecule array; Quanterix, Lexington, MA, USA) 기술을 사용하여 검출할 수 있다. 또한 뇌척수액 분석과 같이 높은 민감도, 특이도, 일관성 유지가 필요한 경우에는 전기화학발광 면역분석법(ECLIA)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 뇌척수액 중의 시냅토태그민-1은 문헌(Ohrfelt et al. The pre-synaptic vesicle protein synaptotagmin is a novel biomarker for Alzheimer's disease. Alzheimer's Research & Therapy (2016) 8:41)에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
일 예에서, 각 바이오마커의 농도는 시판 ELISA 키트를 이용하여 측정할 수 있다. 일 예에서, 생물학적 시료 중의 오스테오폰틴 농도는 시판 Human Osteopontin ELISA kit (Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd, Gumma, Japan 또는 Assay Designs, Inc. Ann Arbor, MI, USA 등)을 이용하여 제조자의 지시서에 따라 측정할 수 있다. 예를 들어, 혈청과 뇌척수액 시료를 키트에 포함된 Assay Buffer를 이용하여 각각 1:20 및 1:50의 비율로 희석하고, 폴리클로날 N-말단 캡쳐 안티-OPN 항체(Assay Designs)로 미리 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 그 후, 플레이트를 세척하고 웰을 horseradish peroxidase로 라벨된 OPN-특이적 모노클로날 항체(Assay Designs)와 함께 4 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 웰을 테트라메틸벤지딘-H2O2 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션한다. 1N 황산을 함유하는 용액을 첨가하여 발색 반응을 중단시킨다. 450 nm에서 광학 밀도를 측정한다. 제조자가 제공하는 인간 재조합 OPN의 표준 커브를 이용하여 OPN 농도를 계산한다.
일 예에서, 바이오마커의 농도는 질량분석법으로 측정할 수 있다. 질량분석법을 이용한 단백질이나 펩티드의 정량은 예를 들어, TMT (tandem mass tags), iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification), MRM (Multiple Reaction Monitoring), AQUA (Absolute QUAntification of proteins), SWATH (Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra)와 같은 방법을 사용할 수 있다. 특정 표적 단백질의 절대적 농도는 heavy isotope로 라벨된 기지 농도의 참조 펩타이드 또는 단백질을 시료에 첨가(spiking-in)하는 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어 문헌[Edfors et al. Screening a Resource of Recombinant Protein Fragments for Targeted Proteomics. J. Proteome Res. 2019, 18, 2706-2718]에서와 같이 단백질 단편의 대형 라이브러리에서 적절한 표준물질을 선택하거나, SISCAPA (stable isotope standards and capture by anti-peptide antibodies) 방법을 사용한 예에서(Anderson et al. Multiplexed measurement of protein biomarkers in high-frequency longitudinal dried blood spot (DBS) samples: characterization of inflammatory responses. bioRxiv 2019, DOI: 10.1101/643239) 이 개념의 유용성이 입증되었다.
바이오마커의 농도는 다양한 시점에서 측정될 수 있고, 상이한 시점에서 측정된 양을 서로 비교할 수 있다. 시간의 경과에 따른 하나 이상의 바이오마커의 농도 변화는 개체에게서 MEK 1/2 억제제의 치료 효과 및/또는 치료 반응성을 결정, 모니터링 또는 예측하는 데 사용될 수 있다.
일 예에서, 바이오마커의 농도는 트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제를 투여한 후에 얻은 시료에서 측정한다. 시료는 MEK 1/2 억제제의 투여 시작 후에 1 이상의 다수의 시점에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 시료는 MEK 1/2 억제제의 투여를 시작한 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 또는 15주 후에 1 이상의 다양한 시점에 얻을 수 있다. 일 예에서, 시료는 MEK 1/2 억제제의 투여를 시작한 후 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 9개월 또는 12개월 이후에 1 이상의 다수의 시점에서 얻을 수 있다.
일 예에서, MEK 1/2 억제제의 투여 시작 전에 얻은 대조 시료에서 바이오마커의 농도를 측정한다. 일 예에서, 해당 질병이 없는 건강한 개체로부터 얻은 시료에서 바이오마커의 농도를 측정한다. 일 예에서, MEK 1/2 억제제의 투여 후에 얻은 시료와 투여 시작 전에 얻은 대조 시료(또는 건강한 개체로부터 얻은 시료) 각각에서 측정한 바이오마커의 농도를 비교한다. 바이오마커의 농도 비교로부터 얻은 차이 및/또는 변동에 관한 정보는 MEK 1/2 억제제 치료에 대한 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일 예에서, 바이오마커의 농도는 원하는 치료 또는 질병의 지연 효과를 달성하는 데 적절한 MEK 1/2 억제제 투여의 용량과 기간을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일 예에서, 시간의 경과에 따른 바이오마커의 분석을 수행한다. 일 예에서, 바이오마커의 농도는 추후 MEK 1/2 억제제 투여 방법을 결정하기 위하여, 예를 들어 MEK 1/2 억제제의 투여 기간과 용량을 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 일 예에서, 바이오마커의 농도는 MEK 1/2 억제제 투여 후에 유익한 효과를 얻을 가능성이 높은 개체를 선별하기 위하여 사용될 수 있다.
바이오마커를 테스트하기 위한 생물학적 시료는 해당 기술분야에 잘 알려진 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어 생물학적 시료는 개체의 체액이나 분비물, 예를 들면 혈액, 뇌척수액, 요, 체 분비액, 타액, 대변, 흉수, 림프액, 객담, 복수, 전립선액, 또는 기타 다른 분비물 또는 그의 파생물을 포함한다. 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 말초혈액단핵세포(PBMC), 또는 혈액의 임의의 구성성분에서 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 바이오마커를 특이적으로 검출할 수 있는 프로브(probe)를 유효 성분으로 포함하는, 트라메티닙과 같은 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 조성물 또는 키트가 제공된다. 일 예에서, 바이오마커 단백질을 검출할 수 있는 프로브는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer), 펩타이드, 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 이들은 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체의 단편은 scFv, Fab, Fab' 및 F(ab)'으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용할 수 있도록 구획된 캐리어를 포함할 수 있고, 각 용기는 본 발명에서 사용되는 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 예를 들면, 용기 중 하나는 검출가능하게 라벨링될 수 있는 또는 라벨되어 있는 프로브를 포함한다. 프로브는 단백질 또는 mRNA에 특이적인 항체, 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트는 전형적으로 위와 같은 용기를 포함하고, 상업적 및 사용자의 관점에서 필요한 물질들, 예를 들어 버퍼, 희석제, 필터, 주사바늘, 주사기 및 사용을 위한 지시가 기재되어 있는 포장 삽입물을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함한다. 용기에 라벨이 부착되어 조성물이 사용되는 특수한 용도를 나타내거나 생체내 또는 시험관내 용도에 대한 지시를 나타낼 수도 있다.
예를 들어 키트는 용기, 상기 키트 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 들어 있는 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 단백질 바이오마커에 결합하는 제1 항체를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 시료 중의 표적 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있음을 나타내고, 키트는 특정 형태의 시료 중의 표적 단백질을 검출하기 위하여 항체를 사용하는 것에 대한 지시서를 포함한다. 키트는 시료 제조 및 시료를 항체에 적용하는 데 필요한 물질 및 지시서를 더 포함할 수 있다. 키트는 1차 및 2차 항체를 모두 포함할 수 있고, 2차 항체는 발색 표지나 효소 등에 접합되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
발명의 실시를 위한 형태
[실시예 1]
실험동물 및 약물 투여
5개월령 5XFAD 마우스 B6SJL-Tg (APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)에 2.5개월간 비히클 또는 트라메티닙(micronized)을 0.05 mg/kg/일, 0.1 mg/kg/일 또는 0.2 mg/kg/일의 용량으로 매일 경구 투여하였다(투약 완료시 8개월령이 됨. 이하 “8개월령 5XFAD 마우스”라 함). 도네페질은 2 mg/kg/일의 용량으로 2.5 개월간 매일 복강내 주사하였다. 연령을 매칭한 야생형(WT) 마우스에게는 2.5 개월간 비히클을 경구 투여하였다. 투여 종료 후 8개월령에 모든 마우스로부터 혈액을 채취하고, EDTA 튜브에 채취한 혈액을 원심분리하여 혈장을 확보하였다. 이 후 perfusion 방법으로 마우스 희생 후 뇌에서 대뇌피질을 적출하여 즉시 동결하였다.
12개월령 5XFAD 마우스에 1개월간 트라메티닙(corn oil based)을 0.1 mg/kg/일의 용량으로 또는 비히클을 매일 경구 투여하였다(투약 완료시 13개월령이 됨. 이하 “13개월령 5XFAD 마우스”라 함). 투여 종료 후 13개월령에 혈액을 채취하고, EDTA 튜브에 채취한 혈액을 원심분리하여 혈장을 확보하였다. 이 후 마우스 희생 후 뇌를 적출하고 PBS로 잘 씻어준 후 즉시 동결하였다.
전세포 RNA 시퀀싱(Whole cell RNA sequencing) 연구를 위해서는 6개월령 C57BL/6 마우스(n=3/군)에게 트라메티닙(4% DMSO + 96% corn oil)을 0.1 mg/kg/일의 용량으로 매일 경구투여하였다. 투여 시작 후 1, 2, 3, 또는 4주에 마우스를 희생하고, 전뇌(whole brain)를 적출하였다.
[실시예 2]
단일 세포 RNA-시퀀싱 분석 (single cell RNA sequencing)
8개월령 5XFAD 마우스 및 야생형 마우스의 대뇌 피질 시료에 대해 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석을 실시하였다. 피질을 HABG (B27 보충제와 글루타민을 포함하는 Hibernate A 완충액) 매질 내에서 미세절단하고(microdissect), 파파인 용액으로 37°C에서 20분 동안 처리하였다(Brewer et al. (2007). Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc 2, 1490-1498). 처리된 피질을 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄하였다. OptiPreP (Sigma-Aldrich, D1556)을 사용하여 밀도구배 방법으로 세포를 분리하였다. 세포 현탁액을 Drop-seq 버퍼로 희석하고, Chromium™ Single Cell 3' v2 Reagent Kit를 사용하여 Drop-seq을 수행하였다(Campbell et al. (2017) A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nat Neurosci 20, 484-496). Illumina HiSeq X Ten에서 라이브러리를 시퀀싱하였고, Read 1은 16 bp였다(10x™ Barcode and 10 bp UMI). mRNA 함량이 너무 낮거나 높은 세포(200 < gene number < 3,000만 포함시킴) 또는 미토콘드리아 코딩 전사체 비율이 높은 세포(> 20%)는 제외시켰다. 20,056개의 세포를 사용하여 미가공 시퀀스 데이터를 마우스 (mm10) 게놈에 정렬시켰고, Cell Ranger Single-Cell 소프트웨어를 이용하여 PCA, t-SNE 및 그래프-기반 클러스터링을 비롯한 분석을 수행하였다.
8개월령 5XFAD 마우스 피질 시료에서 소교세포(microglia)의 수가 야생형(WT)-비히클 처리그룹에 비하여 5XFAD-비히클 처리그룹에서 현저하게 증가되어 있음을 확인하였고, 0.1 mg/kg/일 용량의 트라메티닙 투여군(5XFAD-Tra0.1 그룹)에서는 5XFAD-비히클 처리 그룹에 비하여 다시 소교세포의 수가 감소됨을 확인하였다(표 1).
소교세포 클러스터에서 각 그룹 간 발현에 변화가 있는 유전자들을 확인하였을 때, 야생형-비히클 투여군 보다 5XFAD-비히클 투여군에서 그 발현이 2배 이상 증가한 유전자는 Cst7, Spp1, Apoe, Lpl, Fabp5, Mif, Syngr1, Ctsl이었으며 1.5배 이상 감소한 유전자는 Malat1, Cebpb가 있었다. 5XFAD-비히클 투여군에 비하여 5XFAD-Tra0.1 그룹에서 1.5배 이상 발현이 증가한 유전자는 Ptgds, Rpl10-ps3, Rpl9-ps6, Acta2이며, 1.5배 이상 발현이 감소한 유전자는 Wfdc17, Spp1 이었다.
특히 Spp1은 야생형에 비하여 5XFAD-비히클 그룹에서 그 발현이 증가하였다가 5XFAD-Tra 0.1 투여 그룹에서 그 발현이 감소하였다.
분석된 단일 세포의 수
세포의 종류 5XFAD-Tra0.1 5XFAD-비히클 WT-비히클
Astrocyte 48 3 10
Endothelial 1150 892 263
M. Neuron (mature neuron) 43 53 34
M1 (microglia) 2952 9324 57
ODC (oligodendrocyte) 457 249 269
Pericyte 141 186 30
SMC (smooth muscle cell) 1588 1310 997
소교세포 클러스터에서 각 투여군 사이에 다르게 발현된 유전자
5XFAD-비히클 vs. WT-비히클 5XFAD-Tra0.1 vs. 5XFAD-비히클
유전자 Fold change 유전자 Fold change
Cst7 12.1871 Ptgds 1.70411
Spp1 5.00804 Rpl10-ps3 1.63168
Apoe 3.50348 Rpl9-ps6 1.59081
Lpl 3.16689 Acta2 1.513
Fabp5 2.98236 Cst7 -1.1315
Mif 2.90452 Wfdc17 -1.5194
Syngr1 2.77546 Spp1 -1.5648
Ctsl 2.75453
Malat1 -1.97444
Cebpb -2.5319
소교세포 뿐만 아니라 다른 뇌세포에서도 각 투여군 사이에 다르게 발현되는 유전자들을 조사하였다. 야생형에 비해 5XFAD-비히클 군에서의 발현이 증가 또는 감소(Fold change 5XFAD-비히클 vs. 야생형 > 1.3) 하고, 트라메티닙 0.1 mg/kg/일 처리에 의해 5XFAD에서의 발현이 야생형 마우스의 동일 뇌세포에서의 수준으로 되돌아 가는 유전자(Fold change 5XFAD-Tra 0.1 vs. 야생형 ≒ 1)를 검토한 결과 다음 유전자를 선정하였다.
Gene Log2(5XFAD-Veh/WT) Log2(5XFAD-Tra0.1/5XFAD-Veh) Cell Protein
Syt1 -1.60980888 1.127259139 M. Neu Synaptotagmin-1
Dbi 3.110758452 -1.719467503 M. Neu Acyl-CoA-binding protein
Spp1 2.324246313 -0.645960417 M Osteopontin (OPN)
CTSE 0.949084768 -0.542999502 M Cathepsin E
CTSB 1.148084892 0.818183775 Endo Cathepsin B
ApoE 1.17527371 -0.517716873 Astro Apolipoprotein E
M. Neu: mature neuron; M: microglia, Astro: Astrocyte, Endo: Endothelial
[실시예 3]
5XFAD 마우스의 뇌조직 및 혈장에서 바이오마커의 변화
5XFAD 마우스 혈장에서 바이오마커의 농도 변화를 검출하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 각 바이오마커에 대해서는 다음의 ELISA 키트를 사용하였다.
- 미세신경섬유-경쇄(NfL): Cloud-Clone, SEE038Mu
- 카텝신 B(CTSB): Novus, NBP2-67254
- 오스테오폰틴(OPN): LS bio, LS-F26046-1
- 시냅토태그민-1 (Syt1): LS bio, LS-F30963-1
- 아포지단백-E (ApoE): Novus, NBP2-66739
NfL, CTSB 및 ApoE는 비색정량법(colorimetric methods)으로 검출하고, OPN 및 Syt1는 화학발광법(chemiluminescent methods)으로 검출하였다. ELISA 분석은 각 ELISA 키트의 제조자 지시서에 따라 수행하였다.
또한 qRT-PCR을 수행하여 각 동물의 뇌 조직에서 각 유전자의 mRNA 발현을 측정하였다. 각 시료로부터 TRIzol (Invitrogen, 15596026)을 이용하여 총 RNA를 추출하고, M-MLV 역전사효소(Invitrogen, 28025013)를 사용하여 역전사를 수행한 후, SYBRTM Green PCR master mix (Thermo, 4367659)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 qRT-PCR을 수행하였다. 결과는 하우스키핑 유전자인 GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)에 대한 상대적 수치로 표시하였다.
면역조직화학적 분석을 위해서 뇌 조직을 4% 포름알데히드(PFA)로 고정하고, 파라핀에 담그고 5 μm의 두께로 시상면 방향으로 잘랐다. 준비된 절편에서 파라핀을 제거하고 10 mM 소듐 시트레이트 버퍼(Tri-sodium citrate, pH 6.0) (Sigma-Aldrich, S4641)에 담궈 antigen retrieval 과정을 거쳤다. 절편을 anti-Map2 항체 (Millipore, Mab3418)와 함께 인큐베이션하여 면역염색을 수행하였다. 그 후, Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse (Thermo, a21121), IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 절편들을 DAPI로 counterstain하였다. 면역형광 이미지는 LSM700 Laser-Scanning confocal microscope (Carl Zeiss)로 촬영하였다.
오스테오폰틴
8개월령 5XFAD 마우스 대뇌피질에서 Spp1의 발현 수준을 비교하였을 때, 야생형-비히클 군에 비하여 5XFAD-비히클 군에서 Spp1의 발현 수준이 증가하는 경향을, 5XFAD-Tra 0.1 그룹에서는 5XFAD-비히클 군에 비하여 감소하는 경향을 보였다(도 1a). 13개월령 5XFAD 마우스 뇌에서 Spp1의 발현 수준을 비교하였을 때, 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 5XFAD-Tra 0.1 그룹에서 감소하는 경향을 보였다(도 1b).
8개월령 5XFAD 마우스 혈장에서의 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 확인하였을 때, 트라메티닙 0.05 및 0.1 mg/kg/일로 투여된 마우스에서 OPN의 수준이 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 감소하는 경향을 보였다 (도 2a, 각각 40%, 43.9% 감소). 도네페질과 트라메티닙 0.1 mg/kg/일을 같이 처리한 그룹에서는 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 통계적으로 유의하게 OPN의 수준이 44.6% 감소됨을 확인하였다(도 2a). 13개월령의 5XFAD 마우스 혈장에서는 OPN의 수준이 트라메티닙 0.1 mg/kg/일 투여군에서 비히클 투여군에 비하여 통계적으로 유의하게 61.5% 감소함을 확인하였다(도 2b).
시냅토태그민-1
8개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 시냅토태그민(Syt1)의 수준을 확인하였을 때 트라메티닙 0.05 및 0.1 mg/kg/일 투여군에서 Syt1 수준이 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 감소하는 경향을 보였다(각각 26.2%, 41.0% 감소). 도네페질과 트라메티닙 0.1 mg/kg/일 병용 투여군에서는 5XFAD-비히클 투여군과 비교하여 Syt1 수준이 통계적으로 유의하게 50.7% 감소하였다(도 3).
아포지단백-E
8개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 아포지단백-E(APOE)의 수준을 확인하였을 때 5XFAD 비히클 투여군과 비교하여 트라메티닙 0.1mg/kg/일 투여군에서 APOE 수준이 감소하는 경향을 보였고(34.3% 감소) 트라메티닙 0.2 mg/kg 군에서 통계적으로 유의한 58.9% 감소 수준에 도달하였다. 도네페질과 트라메티닙 0.1 mg/kg/일 병용 투여군에서도 5XFAD-비히클 투여군과 비교하여 APOE 수준이 통계적으로 유의하게 47.3% 감소하였다(도 4).
카텝신 B
8개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 카텝신 B의 수준을 확인하였을 때, 0.05 및 0.1 mg/kg/일로 투여된 마우스에서 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 카텝신 B의 수준이 감소하는 경향을 보였고(각각 62.4%, 99% 감소), 특히 0.1 mg/kg/일 투여군에서 통계적으로 유의하게 감소하였다. 도네페질을 투여한 그룹도 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 통계적으로 유의하게 카텝신 B의 수준이 97.6% 감소하였다(도 5). 13개월령의 5XFAD 마우스 혈장에서 측정한 카텝신 B의 수준은 비히클 투여군에 비하여 감소하는 경향을 보였다(35% 감소, 도 6).
미세신경섬유 경쇄
8개월령 5XFAD 마우스의 혈장에서 미세신경섬유 경쇄(NfL)의 수준을 확인하였을 때, 0.1 mg/kg/일로 투여된 마우스에서 5XFAD-비히클 그룹에 비하여 통계적으로 유의하게 NfL의 수준이 47.4% 감소됨을 확인하였다(도 7a). 13개월령 5XFAD 마우스의 혈장 시료에서는 비히클 투여군과 트라메티닙 투여군 사이에 차이를 보이지 않았다(도 7b).
8개월령 트라메티닙 투여 5XFAD 마우스 혈장에서의 NfL 감소는 트라메티닙에 의한 뇌에서의 뉴론의 신경돌기(neurite) 보호 효과와 관련이 있을 것으로 생각되며, 실제로 8개월령 5XFAD 마우스의 뇌 조직에서 신경돌기 마커인 Map2가 트라메티닙 투여에 의해 증가되어 있음이 면역조직화학 분석 방법으로 확인되었다(도 8, 9).
HLA-DOB
C57BL/6 마우스에 트라메티닙을 0.1 mg/kg/일의 용량으로 투여하면서 1, 2, 3, 4주차 후 각각 마우스를 희생하여 전뇌(whole brain)를 얻어 전세포 RNA 시퀀싱(whole cell RNA sequencing) 분석을 수행함으로써 투여한 기간 동안의 뇌에서의 유전자 변화를 관찰하였다.
전세포 RNA 시퀀싱은 하기와 같이 수행하였다. 마우스 전뇌(whole brain)로부터 RNA를 추출하고, TruSeq Stranded mRNA Prep Kit (Illumina, San Diego, CA)을 사용하여 제조자의 지시서에 따라 RNA 시퀀싱을 위한 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리를 Illumina Nextseq500 platform으로 시퀀싱하고 Tophat v2.0.13을 사용하여 reference Mouse mm10 게놈에 대하여 리드(read)를 매핑하였다. 리드 매핑 후 StringTie 프로그램을 통해 transcript assembly 작업을 진행하고, 각 샘플별로 발현 profile 값을 얻어, 전사체/유전자를 기준으로 RPKM(Read per Kilobase per million mapped reads) 값을 정리하였다. 이 값을 이용하여 각 실험군의 유전자 발현값을 비교하기 위해 DESeq2를 이용하여 DEG (Differentially Expressed Genes)를 분석하였다. 분석 결과 적어도 한 개의 비교조합에서 |fc|>=2, p value <0.05 조건을 만족하는 유전자 196개를 추출하였다. 추출된 유전자 정보를 KEGG 데이터베이스(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)를 이용하여 어떤 pathway에 해당하는 유전자인지를 확인하고, 해당 pathway에서 2배 이상 발현이 증가된 유전자는 볼드체로, 2배이상 발현이 감소된 유전자는 이탤릭체로 히트맵 오른쪽에 표시하였다(도 10). 특히 H2-Ob는 투여 후 3, 4주차에 발현이 현저히 증가하였다.
1, 2 주차 발현이 증가한 유전자 Oprm1, Glp1r, Grin2a, Grin2b, Glra3, Glra1, Cnr2, Grin3b, Gabrr2, Ksr2, Cdh1, Tead4, Ctnna3, PDE11a, Nt5cla
1, 2 주차 발현이 감소한 유전자 Pla2g4c, C1s2
3, 4 주차 발현이 증가한 유전자 Plin4, H2-Ob, Hspa1l, HSPa1b, Hnrnpa1, Nos2, Rab5c
3, 4 주차 발현이 감소한 유전자 Efna4, Scd4, Cd36, Ppp3r2
8개월령 5XFAD 마우스 대뇌피질에서 H2-Ob의 mRNA 발현 수준을 비교하였을 때, 야생형-비히클 투여군에 비하여 5XFAD-비히클 투여군에서 H2-Ob의 발현 수준이 감소하는 경향을, 0.1 mg/kg/일로 트라메티닙을 투여한 5XFAD 군에서 H2-Ob의 발현이 5XFAD 비히클 군에 비하여 현저히 증가함을 확인하였다(도 11). 마우스의 H2-Ob는 인간에서 HLA-DOB에 상응한다.

Claims (16)

  1. MEK (mitogen-activated protein kinase kinase) 1 및 2를 모두 억제하는 화합물(MEK 1/2 억제제)로의 치료 동안 또는 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 신경퇴행성질환 개체의 생물학적 시료에서 오스테오폰틴(osteopontin), 시냅토태그민-1(synaptotagmin-1), 아포지단백-E(apolipoprotein-E), 카텝신 B(cathepsin B), HLA-DOB(HLA 클래스 II 조직적합성 항원 DO 베타 체인), 및 미세신경섬유 경쇄(neurofilament light chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 측정된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 기초로 상기 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 정보를 얻는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 측정된 하나 이상의 바이오마커의 농도를, MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료 또는 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료 또는 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도에 비한, MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도 변화 또는 차이가 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 개체의 반응을 나타내는 것인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정보는 MEK 1/2 억제제의 추후 투약 용량 또는 기간을 결정하거나, MEK 1/2 억제제의 투약을 지속하거나 중단하는 것을 결정하는 데 사용되는 것인 방법.
  6. MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 신경퇴행성질환 개체의 생물학적 시료에서 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 하나 이상의 바이오마커의 농도를 기초로 상기 신경퇴행성질환 개체의 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 예측하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 평가하는 단계가,
    MEK 1/2 억제제로의 치료 전에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 비교하여, MEK 1/2 억제제로의 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도에서 변화를 보이는 경우, 상기 개체를 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대해 반응을 나타내는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 평가하는 단계가,
    MEK 1/2 억제제로의 치료 전과, 치료 동안 또는 치료 후에 얻은 상기 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도를 해당 신경퇴행성질환이 없는 건강한 개체의 생물학적 시료에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와 각각 비교하여 차이를 구하고, 치료 동안 또는 치료 후에 치료 전과 비교하여 상기 건강한 개체에서의 상기 하나 이상의 바이오마커의 농도와의 차이가 적어진 경우, MEK 1/2 억제제로의 치료에 유익한 반응을 나타낸 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 혈액 또는 뇌척수액인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈액이 전혈, 혈장, 혈청, 또는 말초혈액단핵세포(PBMC)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 치매, 알츠하이머병, 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체치매, 다계통위축증, 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 진행성핵상마비, 헌팅턴병, 근위축성측삭경화증(루게릭병, ALS), 원발성측삭경화증, 척수근육위축병, 진행성 연수마비(progressive bulbar palsy; PBP), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy; PMA), 가성연수마비(pseudobulbar palsy), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia; HSP), 소뇌성 운동실조증, 파킨슨병, 다발성경화증 (MS), 및 경도인지장애(MCI)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 1/2 억제제가 트라메티닙인 방법.
  13. 오스테오폰틴, 시냅토태그민-1, 아포지단백-E, 카텝신 B, HLA-DOB, 및 미세신경섬유 경쇄로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브(probe)를 포함하는, 신경퇴행성질환 개체에게서 MEK 1/2 억제제로의 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브가 상기 하나 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer), 펩타이드, 항체 또는 그의 단편인 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 치매, 알츠하이머병, 혈관성치매, 전두측두엽치매, 루이소체치매, 다계통위축증, 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 진행성핵상마비, 헌팅턴병, 근위축성측삭경화증(루게릭병, ALS), 원발성측삭경화증, 척수근육위축병, 진행성 연수마비(progressive bulbar palsy; PBP), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy; PMA), 가성연수마비(pseudobulbar palsy), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia; HSP), 소뇌성 운동실조증, 파킨슨병, 다발성경화증 (MS), 및 경도인지장애(MCI)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, MEK 1/2 억제제가 트라메티닙인 조성물.
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