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KR20220160640A - 조절 t-세포 에피토프 - Google Patents

조절 t-세포 에피토프 Download PDF

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KR20220160640A
KR20220160640A KR1020227037494A KR20227037494A KR20220160640A KR 20220160640 A KR20220160640 A KR 20220160640A KR 1020227037494 A KR1020227037494 A KR 1020227037494A KR 20227037494 A KR20227037494 A KR 20227037494A KR 20220160640 A KR20220160640 A KR 20220160640A
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KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
regulatory
seq
cells
nos
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227037494A
Other languages
English (en)
Inventor
그루트 앤 드
윌리엄 마틴
Original Assignee
에피백스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에피백스, 인크. filed Critical 에피백스, 인크.
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Abstract

본 발명은 조절 T-세포 에피토프를 포함하는 조성물로서, 상기 에피토프는 서열번호: 1-124 (및/또는 그의 단편 및 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 그를 생산하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

조절 T-세포 에피토프
이 출원은 2020년 3월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/000,630호 및 2020년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/077,253에 의존하고 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록이 함유되어 있으며 전체 내용이 참조로 포함된다. 2021년 3월 24일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 EPV0007_ST25.txt이고 크기는 70 KB이다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 신규한 부류의 조절 T 세포 에피토프("트레지토프(Tregitope)"로 지칭됨)에 관한 것이다. 본 개시내용은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (이는 본원에서 "Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프", "트레지토프 펩티드" 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"로 지칭될 수 있음) including 을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는 폴리펩티드 of 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 (및/또는 그의 단편 및 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프 화합물 및 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형, 뿐만 아니라 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
자가 면역, 이식, 알러지 및 다른 질환에 대한 요법의 목표는 자가 또는 외래 항원에 대한 관용(tolerance)의 인공 유도이다. 자가 및 비-자가 치료 단백질을 표적으로 하는 면역 반응은 종종 임상 효능을 제한한다. 치료 단백질 조성물에 대한 관용을 유도하는 면역 조절 치료는 임상 결과를 개선하는 항-약물 항체(ADA)의 형성을 감소시킬 수 있다. 최근까지 치료 관용 유도는 광범위한 면역 세포 고갈 요법에 의존하였다. 이러한 광범위한 접근법은 일반적으로 면역계를 약화시키고 많은 대상체를 기회 감염, 자가 면역 공격 및 암에 취약하게 만든다. 면역 관용의 유도에 대한 덜 공격적이고 보다 표적화된 접근이 당업계에 필요하다.
면역 관용은 항원 제시 세포(APC), T 세포, B 세포, 사이토카인, 케모카인 및 표면 수용체 간의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다. 초기 자기/비-자가 구별은 수질 상피 세포가 미성숙 T 세포에 대한 특정 자가 단백질 에피토프를 발현하는 신생아 발달 동안 흉선에서 발생한다. 친화도가 높은 자가 항원을 인식하는 T 세포는 결실되지만, 중간 정도의 친화도를 갖는 자가반응 T 세포는 때때로 결실을 피하고 '천연' 조절 T-세포(TReg) 세포로 전환될 수 있다. 이 천연 TReg 세포는 말초로 내보내지며 잠재된 자가면역 반응을 제어하는 데 도움이 된다.
제2 형태의 관용이 말초에서 발생한다. 이 경우 활성화된 T 세포는 특정 면역-억제성 사이토카인 및 케모카인 예컨대 IL 10, TGF-β, 및 CCL19의 작용을 통해 '적응' TReg 표현형으로 전환된다. 이러한 '적응' TReg 세포의 가능한 역할에는 침입한 병원체를 성공적으로 제거한 후, 면역 반응을 약화시키는 것, 알러지 반응으로 인한 과도한 염증을 제어하는 것, 낮은 수준 또는 만성 감염으로 인한 과도한 염증을 제어하는 것, 또는 유익한 공생 박테리아를 표적으로 하는 염증 반응을 제어하는 것을 포함한다.
천연 발생 TReg(천연 TReg 및 적응성 TReg 모두 포함)는 말초의 면역 조절의 중요한 구성 요소이다. 예를 들어, TCR을 통해 천연 TReg가 활성화되면 천연 TReg는 면역 조절 사이토카인 및 케모카인을 발현한다. 활성화된 천연 TReg는 접촉 의존적이고 독립적인 메커니즘을 통해 근처의 효과기 T 세포를 억제할 수 있다. 또한, IL-10 및 TGF-β를 포함하나 이에 제한되지 않는 이들 세포에 의해 방출되는 사이토카인은 항원 특이적 적응성 TReg를 유도할 수 있다. 광범위한 노력에도 불구하고 몇 가지 예외를 제외하고는 천연 TReg의 항원 특이성, 그리고 더 중요하게는 임상적으로 상당한 부피로 순환하는 천연 TReg의 항원 특이성은 여전히 알려져 있지 않다.
통상적인 자가 단백질("트레지토프")에 함유된 조절 T-세포 에피토프의 확인, 이러한 트레지토프를 함유하는 조성물, 및 그의 제조 및 사용과 관련된 방법이 필요하다.
따라서, 본 개시내용은 신규한 치료 조절 T 세포 에피토프 화합물 및 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 (및/또는 그의 단편 및 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는 폴리펩티드 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (이는 본원에서 "Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프", "트레지토프 펩티드" 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"로 지칭될 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 중 하나 이상; 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형, 뿐만 아니라 예들 들어 예를 들어, 신체의 면역 반응을 억제하거나 더 구체적으로 의학적 상태를 치료하기 위한 치료제의 투여에 의해 야기되는 신체의 면역 반응을 억제하기 위한 그의 제조 및 사용 방법을 포함한다.
본원에 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물 및 트레지토프-항원 화합물 및 조성물의 사용을 통한 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함)의 선택적 관여 및 활성화는 원치 않는 면역 반응의 존재로 표시되는 임의의 질환 또는 병태에 대한 치료 수단으로서 치료학적으로 가치가 있다. 그러한 원치 않는 면역 반응의 예는 다음을 포함한다: 자가면역 질환 예컨대 1형 당뇨병, MS, 루푸스, 및 RA; 이식 관련된 장애 예컨대 이식편대숙주 질환 (GVHD) 및 숙주대이식편 질환 (HVGD); 알러지성 반응; 생물학적 의약 예컨대 단클론성 항체의 면역 거부; 대체 단백질을 표적으로 하는 면역 반응; 치료적 독소 예컨대 보툴리눔 독소를 표적으로 하는 면역 반응; 및 급성이든 만성이든 감염성 질환에 대한 면역 반응. 양태에서, 본 개시내용은 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함), 및 특정 양태에서, 말초에서 외래 및 자가 단백질에 대한 면역 반응을 이미 조절하는 세포(기존 또는 천연 TReg)를 활용한다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 공유 결합, 비공유 결합, 또는 특정 표적 항원과의 혼합물일 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 본원에 개시된 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열, 또는 그의 단편 및 변이체를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 문구는 서열번호: 1-124 중 어느 하나에 따른 서열 또는 그의 단편 또는 변이체에 추가하여, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 MHC 리간드로 기능하는 펩티드의 일부를 반드시 형성할 필요는 없고 트레지토프로서 기능하는 펩티드의 활성을 실질적으로 손상시키지 않는 한 펩티드의 말단 및/또는 측쇄의 말단에 존재할 수 있는 추가의 아미노산 또는 잔기를 함유함을 의미하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 폴리펩티드는 단리, 합성 및/또는 재조합일 수 있고, 글리코실화, 첨가된 화학기 등과 같은 전사후 변형을 포함할 수 있다. 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 트레지토프는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 및 변이체)을 갖고, 선택적으로 핵심 아미노산 서열의 C-말단 및/또는 N-말단 상에 1 내지 12개의 아미노산의 확장을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 핵심 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이들 측접 아미노산의 전체 수는 1 내지 12, 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 6, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 12, 5 내지 10, 5 내지 8, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 10, 6 내지 8, 7 내지 12, 7 내지 10, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 10, 9 내지 12, 9 내지 10, 또는 10 내지 12이고, 측접 아미노산은 C-말단 및 N-말단에 임의의 비율로 분포될 수 있다(예를 들어, 모든 측접 아미노산은 하나의 말단에 첨가될 수 있거나, 아미노산은 양쪽 말단에 또는 임의의 다른 비율로 동일하게 첨가될 수 있음). 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 및 변이체)을 갖고, 선택적으로 C-말단 및/또는 N-말단 상에 1 내지 12개의 아미노산의 확장을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 핵심 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이들 측접 아미노산의 전체 수는 1 내지 12, 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 6, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 12, 5 내지 10, 5 내지 8, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 10, 6 내지 8, 7 내지 12, 7 내지 10, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 10, 9 내지 12, 9 내지 10, 또는 10 내지 12이고, 측접 아미노산은 C-말단 및 N-말단에 임의의 비율로 분포될 수 있고(예를 들어, 모든 측접 아미노산은 하나의 말단에 첨가될 수 있거나, 아미노산은 양쪽 말단에 또는 임의의 다른 비율로 동일하게 첨가될 수 있음), 단, 측접 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 상기 측접 아미노산 없이 상기 폴리펩티드 핵심 서열과 동일한 HLA 분자에 여전히 결합할 수 있다(즉, MHC 결합 성향을 유지함). 양태에서, 측접 아미노산을 갖는 상기 폴리펩티드는 여전히 동일한 HLA 분자에 결합할 수 있고/있거나(즉, MHC 결합 성향을 유지함), 상기 측접 아미노산이 없는 상기 폴리펩티드 핵심 서열과 동일한 TCR 특이성을 유지할 수 있다. 양태에서, 측접 아미노산을 갖는 상기 폴리펩티드는 여전히 동일한 HLA 분자에 결합할 수 있고/있거나(즉, MHC 결합 성향을 유지함), 상기 측접 아미노산이 없는 상기 폴리펩티드 핵심 서열과 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 트레지토프 활성을 유지할 수 있다. 양태에서, 상기 측접 아미노산 서열은 또한 천연 발생 단백질에서 그 안에 포함된 펩티드 또는 폴리펩티드에 측접하는 것들이다. 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 상기 측접 아미노산 서열은 MHC 안정화 영역으로서 작용할 수 있다. 양태에서, 더 긴 펩티드의 사용은 환자 세포에 의한 내인성 처리를 허용할 수 있고 T 세포 반응의 보다 효과적인 항원 제시 및 유도를 유도할 수 있다. 양태에서, 확장(들)은 펩티드 또는 폴리펩티드의 생화학적 특성(예를 들어, 용해도 또는 안정성을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 개선하거나 펩티드의 효율적인 프로테아좀 처리 가능성을 개선하는 역할을 할 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 단리, 합성 및/또는 재조합일 수 있고, 글리코실화, 첨가된 화학기 등과 같은 전사후 변형을 포함할 수 있다. 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 펩티드 또는 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 c-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드 함께 연결되거나, 융합되거나, 또는 결합된 (예를 들어, 융합된 프레임내, 화학적으로 연결된, 또는 다르게는 결합된) 본 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체)을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산이지만으로 제한되지 않음) 중 하나 이상을 포함하는 연쇄체 폴리펩티드 또는 펩티드에 관한 것이다. 이러한 추가 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 중 하나 이상일 수 있거나, 또는 관심의 추가 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 양태에서, 연쇄체 펩티드는 본 개시된 펩티드 또는 폴리펩티드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 6개 이상 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상으로 이루어진다. 다른 양태에서, 연쇄체 펩티드 또는 폴리펩티드는 1000개 이상, 1000개 이하, 900개 이하, 500개 이하, 100개 이하, 75개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 또는 10개 이하의 펩티드 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연쇄체 펩티드는 3-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 65-100, 70-100, 75-100, 80-100, 90-100, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 100-150, 100-200, 100-300, 100-400, 100-500, 50-500, 50-800, 50-1,000, 또는 100-1,000개의 본 개시된 펩티드 또는 폴리펩티드가 함께 연결, 융합 또는 결합되어 있다. 연쇄체 폴리펩티드의 각 펩티드 또는 폴리펩티드는 선택적으로 N-말단 및/또는 C-말단 말단에 인접한 절단 민감 부위일 수 있는 하나 이상의 링커를 선택적으로 가질 수 있다. 이러한 연쇄체 펩티드에서, 2개 이상의 펩티드 에피토프는 그들 사이에 절단 민감 부위를 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 펩티드 에피토프는 서로 직접 연결되거나 절단 민감 부위가 아닌 링커를 통해 연결될 수 있다. 양태에서, 본 개시된 연쇄체 폴리펩티드 또는 펩티드 서열은 천연 발생 서열에 상응하지 않고, 즉 본 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않음) 중 하나 이상 각각은 전체 연쇄체 폴리펩티드가 천연 발생 IgG 서열에 상응하지 않는 방식으로 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드 (이는 본 개시된 펩티드 중 하나 이상일 수 있음)에 함께 연결되거나, 융합되거나, 또는 결합된다 (예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 또는 다르게는 결합된다). 양태에서, 본 개시내용의 연쇄체 폴리펩티드는 단리, 합성 및/또는 재조합일 수 있고, 글리코실화, 첨가된 화학기 등과 같은 전사후 변형을 포함할 수 있다. 양태에서, 연쇄체 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 연쇄체 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 c-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 연쇄체 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않음)는 이종성 폴리펩티드에 결합되거나, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 삽입될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 연쇄체 폴리펩티드는 전체적으로 이종성 폴리펩티드에 결합, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그 내로 삽입될 수 있지만, 이종성 폴리펩티드의 측접 아미노산과 함께 아미노산 서열에 결합되거나, 연결된(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨) 및/또는 그 내에 삽입된 것으로 구성될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이고, 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에 천연적으로 포함되지 않고/않거나 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에서 그의 천연 위치에 있다. 양태에서, 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프 (이는 양태에서, 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)는, 트레지토프가 항체 또는 그의 단편 내에서 그의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 또는 그의 단편이 그러한 트레지토프가 없는 경우 (예를 들어, 특정 항체 또는 그의 단편에는 해당 섹션이 돌연변이되거나 누락되는 경우)에서와 같이 또한 항체 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로(예를 들어, 부위 지향 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 국한되지 않음) 삽입될 수 있다. 양태에서, 하기에 추가로 기재되는 본 개시내용의 이러한 폴리펩티드는 단리, 합성 및/또는 재조합될 수 있고, 글리코실화, 첨가된 화학기 등과 같은 전사후 변형을 포함할 수 있다. 양태에서, 이러한 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 c-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 경우, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124(및 단편 또는 변이체) 중 상기 하나 이상은 이의), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산, 및 111-124는 항체 중쇄 가변 영역에서 그의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술과 같은 면역 공학 기술을 사용하지만 이에 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 하나 이상을 포함하는 서열, (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 경우, 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 상기 하나 이상 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산은, 항체 중쇄 불변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술과 같은 면역 공학 기술을 사용하지만 이에 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드 (이는 단리되거나, 합성, 또는 재조합될 수 있음)는 서열번호: 12를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 경우, 상기 서열번호: 12 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산은, 항체 경쇄 가변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 12를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 면역 공학 기술 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용으로 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드(이는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)는 서열번호: 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 경쇄 불변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 경우, 서열번호: 13 및 101-110 중 상기 하나 이상 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 항체 경쇄 불변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 면역 공학 기술 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용으로 제한되지 않음).
양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 연쇄체 펩티드를 포함하는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 화합물 또는 조성물(이는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용의 키메라 또는 융합 폴리펩티드 화합물 또는 조성물은 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 연쇄체 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 이종성 폴리펩티드에 결합되고, 연결되고/되거나 (예를 들어, 프레임 내에서 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 또는 다르게는 결합된), 그에 삽입된 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산) 을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드)를 포함한다. 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 연쇄체 펩티드는 이종성 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있고, 이종성 폴리펩티드의 C-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 첨가될 수 있고/있거나 이종성 폴리펩티드의 N-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 첨가될 수 있다. 본 개시된 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 연쇄체 펩티드는 전체적으로 이종성 폴리펩티드에 결합, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그 내로 삽입될 수 있지만, 이종성 폴리펩티드의 측접 아미노산과 함께 아미노산 서열에 결합되거나, 연결된(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨) 및/또는 그 내에 삽입된 것으로 구성될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 연쇄체 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 연쇄체 펩티드는 이종성 폴리펩티드에 자연적으로 포함되지 않고/않거나 이종성 폴리펩티드의 천연 위치에 위치하지 않는 서열을 갖는다. 상기 기재된 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있다. 본 개시된 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 이종성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 양태에서, 생물학적 활성 분자는 면역원성 분자, T 세포 에피토프, 바이러스 단백질, 및 박테리아 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 중 하나 이상은 소분자, 약물, 또는 약물 단편에 결합되거나 연결될 수 있다(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨). 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 mRNA 포함 RNA)에 관한 것이다. 예를 들어, 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터, 예컨대 발현 벡터에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포 또는 백신에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
양태에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물에 관한 것이고, 약제학적 조성물은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포) 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및/또는 애주번트(adjuvant)를 포함한다. 양태에서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 DNA, RNA, 또는 mRNA이다. 상기 기재된 약제학적 조성물의 양태에서, 조성물은 그 사이의 모든 값 또는 범위를 포함하여 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 또는 적어도 1000개의, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 연쇄체 펩티드를 포함한다
양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 필요로 하는 대상체에서 조절 T-세포(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함하는 천연 발생 TReg)를 자극, 유도 및/또는 확장하고/하거나 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 대상체는 인간이다.
양태에서, 본 개시내용은 필요로 하는 대상체에서 의학적 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)을 투여하는 것을 포함한다. 양태에서, 의학적 상태는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알러지, 자가면역 질환, 이식 관련된 장애, 이식편대숙주 질환, 응혈 장애, 효소 또는 단백질 결핍 장애, 지혈 장애, 암, 불임; 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염. 또 다른 구현예에서, 의학적 상태는 혈우병 A, B, 또는 C이다. 양태에서, 대상체는 인간이다.
양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 필요로 하는 대상체 면역 반응을 억제하기 위해 조절 T-세포(예를 들어, 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함))를 자극, 유도 및/또는 확장하는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 면역 반응은 적어도 하나의 치료 단백질에 의한 적어도 하나의 요법적 치료, 백신에 의한 치료 또는 적어도 하나의 항원에 의한 치료의 결과이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로 이동시키고, 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시키고, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현을 감소시킨다.
양태에서, 본 개시내용은 조절 T 세포의 집단을 확장시키는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하는 단계; (c) T-조절 세포의 수가 증가하여 확장된 조절 T-세포 조성물을 생성함으로써 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 확장시키는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 유효량과 접촉시키는 단계; 및 추가로, (d) 치료를 필요로 하는 대상체에게 샘플을 반환하는 단계.
양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 조절 T 세포를 자극하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하는 단계; (c) T-조절 세포가 자극되어 하나 이상의 생물학적 기능을 변경함으로써 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 자극하는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 유효량과 접촉시키는 단계; 및 추가로, (d) 치료를 필요로 하는 대상체에게 세포를 반환하는 단계.
양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 저지/억제하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 선천성 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 적응성 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 효과기 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 기억 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 헬퍼 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 B 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 NKT 세포(자연 살해 T 세포) 반응을 저지/억제한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로 이동시키고, 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시키고, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현을 감소시킨다.
양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)의 치료적 유효량의 투여를 통해 대상체에서 면역 반응, 구체적으로 항원 특이적 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 트레지토프 화합물 또는 조성물은 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/ 또는 적응성 TReg, 양태에서, CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포 포함)를 활성화하거나, CD4+ T-세포의 활성화, CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 증식을 억제하고/하거나 β-세포 또는 NKT 세포의 활성화 또는 증식을 억제한다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 공유 결합, 비공유 결합, 또는 특정 표적 항원과의 혼합물일 수 있다. 양태에서, 공유 결합되거나, 비-공유 결합되거나, 또는 특정 표적 항원과의 혼합인 투여된 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 표적 항원에 대한 면역 반응의 감소를 초래한다.
양태에서, 표적 항원은 자가 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 양태에서, 표적 항원은 알러지항원일 수 있다. 양태에서, 표적 항원은 동종이형 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 양태에서, 표적 항원은 생물학적 의약 또는 그의 단편일 수 있다. 양태에서, 억제 효과는 천연 TReg에 의해 매개된다. 양태에서, 억제 효과는 적응성 TReg에 의해 매개된다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)에 포함된 하나 이상의 트레지토프는 효과기 T 세포 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 선천성 면역 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 적응성 면역 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 헬퍼 T 세포 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 기억 T 세포 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 B 세포 반응을 억제한다. 양태에서, 현재 개시된 트레지토프 화합물 및 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 NKT 세포 반응을 억제한다.
양태에서, 본 개시내용은 의학적 상태를 예방 또는 치료하기 위한, 특히 대상체에서 면역 반응의 억제를 위한 키트에 관한 것이고, 키트는 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)를 포함한다. 양태에서, 키트는 대체 단백질 또는 펩티드와 같은 유효량의 항원 또는 알러지항원 또는 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프를 항체 또는 그의 단편과 같은 폴리펩티드로부터 또는 그로의 제거 또는 삽입을 포함하는 면역 조작 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 양태에서, 본 개시내용은 항체 또는 그의 단편을 포함하는 화합물 또는 조성물의 면역원성을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 이는 항체 또는 그의 단편이 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포에 대한 항원 표적화를 위한 백신 전달 벡터로서 역할을 하는 경우 특히 유용할 수 있다. 양태에서, 상기 방법은 상기 항체 또는 그의 단편으로부터 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산)의 확인 및 제거를 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 본원(예를 들어, 예시의 섹션 (1))에 기재된 것과 같은 EpiMatrix 및 JanusMatrix 분석에 의해 확인된다. 양태에서, 항체 (또는 그의 단편) 백신 전달 벡터의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 전달된 항원에 대한 항원 특이적 면역 반응을 억제할 수 있고, 상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 제거는 전달된 항원에 대한 강한 항원 특이적 면역 반응의 관용성 및 자극의 축소를 허용할 수 있다. 양태에서, 백신 전달 벡터로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 전부 또는 일부의 결실을 포함한다. 양태에서, 백신 전달 벡터로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 중 일부 또는 전부의 결실 및 조절 T-세포 에피토프 아미노산의 결실 부위에 하나 이상의 아미노산을 부가하는 것을 포함한다. 양태에서, 백신 전달 벡터로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프를 돌연변이시키는 것을 포함한다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의해 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프에 하나 이상의 점 돌연변이를 도입하는 것이 있으나, 이에 제한되지 않음). 양태에서, 백신 전달 벡터로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프 서열 내로 도입하는 것을 포함하며, 이는 양태에서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 파괴하여 서열의 이전 관용성이 제거되도록 한다. 양태에서, 제거 부위에서 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 기존의 조절 T-세포 에피토프 아미노산으로부터 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 백신 전달 벡터 또는 백신 전달 비히클 또는 표적 항원의 면역원성을 향상시킨다. 양태에서, 백신 전달 벡터로부터 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 제거는 백신 전달 벡터 또는 백신 전달 비히클 또는 벡터의 표적 항원에 대한 항원 특이적 면역 반응을 증가시킨다. 양태에서, 백신 전달 벡터는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 항체-약물 접합체, 서브클래스의 상이한 클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA), 또는 그의 단편 또는 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체를 포함한다. 양태에서, 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 서열을 갖는다.
추가로, 본 개시내용은 항체 또는 그의 단편이 치료 단백질로서 역할을 할 경우 특히 유용할 수 있는, 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시키고/시키거나 관용원성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드)를 상기 항체 또는 그의 단편에 삽입하는 것을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 단편의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 항체 또는 그의 단편에 대한 항원 특이적 면역 반응을 억제한다. 양태에서, 상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 트레지토프가 항체 또는 그의 단편 내에서 그의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 또는 그의 단편이 그러한 트레지토프가 없는 경우 (예를 들어, 특정 항체 또는 그의 단편에는 해당 섹션이 돌연변이되거나 누락되는 경우)에서와 같이 또한 항체 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로(예를 들어, 부위 지향 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 국한되지 않음) 삽입될 수 있다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 전부 또는 일부의 삽입을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 중 일부 또는 전부의 삽입 및 조절 T-세포 에피토프 아미노산의 삽입의 부위에서 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프를 포함하도록 항체 또는 그의 단편의 서열을 돌연변이시키는 것을 포함한다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의해 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 점 돌연변이 도입이 있으나, 이에 제한되지 않음). 양태에서, 항체 또는 단편으로의 상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 양태에서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 도입하여 서열의 이전 면역원성은 감소되고 새로운 서열의 관용원성은 향상될 것이다. 양태에서, 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 삽입 부위에서 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 항체 또는 그의 단편의 서열로부터 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 관용원성을 증가시킨다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 내부 서열로서 Fc 도메인에 통합될 수 있다. 이러한 내부 서열은 삽입(즉, 기존의 Fc 도메인의 아미노산 사이) 또는 기존의 Fc 도메인 내의 아미노산 교체(즉, 기존의 Fc 도메인 내의 아미노산 제거 및 펩티드 아미노산의 추가)에 의해 첨가될 수 있다. 후자의 경우, 첨가된 펩티드 아미노산의 수는 기존의 Fc 도메인으로부터 제거된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없고; 예를 들어, 양태에서, 조성물은 천연 Fc 도메인으로부터 제거된 1 내지 21개의 아미노산의 서열과 함께 9 내지 15개의 아미노산의 추가된 내부 서열을 포함할 수 있다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편은 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 항체-약물 접합체, 서브클래스의 상이한 클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA), 또는 분자 단편 또는 그의 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하지만 이에 제한되지 않을 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 서열을 갖는다.
예를 들어, 양태에서, 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산) 을 갖는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프는, 트레지토프가 인간 IgG 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 인간 IgG 또는 그의 단편 (예컨대 대상체 자신의 인간 IgG 또는 그의 단편)에는 이러한 트레지토프가 누락된 경우 (예를 들어, 특정 인간 IgG 또는 그의 단편에 해당 섹션이 돌연변이되거나 누락된 경우)와 같이 인간 IgG 또는 그의 단편에 융합되거나 내부적으로 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 제한되지 않음) 삽입될 수 있다. 이전에 기재된 바와 같이, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에서, 폴리펩티드가 인간 IgG 중쇄 가변 영역(예컨대, 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 상기 하나 이상은 트레지토프가 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 제한되지 않음). 양태에서, 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에서, 폴리펩티드가 인간 IgG 중쇄 불변 영역(예컨대, 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 상기 하나 이상은 트레지토프가 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 제한되지 않음). 양태에서, 서열번호: 12 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에서, 폴리펩티드가 인간 IgG 경쇄 가변 영역(예컨대, 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 서열번호: 12 중 상기 하나 이상은 트레지토프가 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 제한되지 않음). 양태에서, 서열번호: 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG 경쇄 불변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에서, 폴리펩티드가 인간 IgG 경쇄 불변 영역(예컨대, 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 서열번호: 13 및 101-110 중 상기 하나 이상은 트레지토프가 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 제한되지 않음).
본 개시내용은 하기 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 HLA DRB1 경쟁 결합 곡선을 보고하는 일련의 그래프이다. 특히, 트레지토프(서열번호: 14)에 대한 HLA 결합 결과의 요약이 도 1a에 제시되어 있다. EpiMatriTM 예측, 계산된 IC50 값 및 결과 분류가 각 HLA 대립유전자에 대해 보고된다. 도 1b 및 도 1c는 선택된 클래스 II HLA 대립유전자에 대한 트레지토프(서열번호: 14)에 대한 결합 곡선을 보여준다. 도 1b는 HLA DRB1 *0801 검정에 대한 결과를 요약한 반면, 도 1c는 HLA DRB1 *1501 검정에 대한 결과를 요약한다.
도 2a 내지 도 2c는 개시된 파상풍 톡소이드(TT) 검정에서 고도로 활성화된 조절 T-세포 및 효과기 CD4+ T 세포에 대한 게이팅 전략을 나타낸다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 세포를 먼저 게이팅하여 응집체 및 죽은 세포를 제거하고, 생존 세포를 CD4+ T 세포에 대해 게이팅하고, 모든 후속 분석을 이 집단에 대해 수행하였다. CD4+ T 세포는 상승된 CD25, FoxP3 및 낮은 CFSE(증식)에 대해 게이팅된다(도 2b). 도 2b는 0.5 μg/ml TT를 사용한 대표적인 검정(우측)의, TT가 첨가되지 않은 대표적인 검정(좌측)의 결과를 보여준다. 도 2c는 이러한 검정의 대표적인 결과를 보여주고, 증식 및 활성화된 CD4+ T 세포 집단이 고도로 상관관계가 있음을 도시한다.
도 3은 파상풍 톡소이드(TT)로 자극하고 펩티드 서열번호: 7에 의한 억제 시 CD4+ T 세포의 증식(왼쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 뺀 절대값 표시) 및 활성화(오른쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 뺀 절대값 표시)를 도시한다. 트레지토프 서열번호: 7 자극에 대한 억제 실험에서 수집된 데이터를 집계하고 여러 농도(0, 8, 16, 24 μg/mL)에서 트레지토프로 처리한 후 남아 있는 CD4 증식 또는 활성화의 %로 표시하였다. 표시된 플롯은 절대값(± Std.dev)이다. 이 분석은 트레지토프 서열번호: 7 자극에 의한 억제에 대한 개별 공여자의 감수성을 나타낸다.
도 4는 파상풍 톡소이드(TT)로 자극하고 펩티드 서열번호: 7에 의한 억제 시 CD4+ T 세포의 증식(왼쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 뺀 정규화 값 표시) 및 활성화(오른쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 뺀 정규화 값 표시)를 도시한다. 트레지토프 서열번호: 7 자극에 대한 억제 실험에서 수집된 데이터를 집계하고 여러 농도(0, 8, 16, 24 μg/mL)에서 트레지토프로 처리한 후 남아 있는 CD4 증식 또는 활성화의 %로 표시하였다. 정규화된 값이 사용된다. 플롯은 정규화된 값(± Std.dev)으로 제시된다. 이 분석은 트레지토프 서열번호: 7 자극에 의한 억제에 대한 개별 공여자의 감수성을 나타낸다.
도 5는 파상풍 톡소이드(TT)로 자극하고 펩티드 서열번호: 7에 의한 억제 시 CD4+ T 세포의 증식(왼쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 빼지 않은 절대값 표시) 및 활성화(오른쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 빼지 않은 절대값 표시)를 도시한다. 트레지토프 서열번호: 7 자극에 대한 억제 실험에서 수집된 데이터를 집계하고 여러 농도(0, 8, 16, 24 μg/mL)에서 트레지토프로 처리한 후 남아 있는 CD4 증식 또는 활성화의 %로 표시하였다. 표시된 플롯은 절대값(± Std.dev)이다. 이 분석은 트레지토프 서열번호: 7 자극에 의한 억제에 대한 개별 공여자의 감수성을 나타낸다. 배지는 표의 각 공여자에 대한 평균 배지 막대 및 지정된 배지 %로 표시되는 것처럼 무시할 수 있는 수준의 증식 및 활성화에만 기여한다.
도 6은 파상풍 톡소이드(TT)로 자극하고 펩티드 서열번호: 7에 의한 억제 시 CD4+ T 세포의 증식(왼쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 빼지 않은 정규화 값 표시) 및 활성화(오른쪽 패널 - 배지 단독 대조군을 빼지 않은 정규화 값 표시)를 도시한다. 트레지토프 서열번호: 7 자극에 대한 억제 실험에서 수집된 데이터를 집계하고 여러 농도(0, 8, 16, 24 μg/mL)에서 트레지토프로 처리한 후 남아 있는 CD4 증식 또는 활성화의 %로 표시하였다. 정규화된 값이 사용된다. 상기 플롯은 정규화된 값(± Std.dev)으로 제시된다. 이 분석은 트레지토프 서열번호: 7 자극에 의한 억제에 대한 개별 공여자의 감수성을 나타낸다. 배지는 표의 각 공여자에 대한 평균 배지 % 및 지정된 배지 %로 표시되는 것처럼 무시할 수 있는 수준의 증식 및 활성화에만 기여한다.
도 7은 EpiBar를 함유하는 면역원성 인플루엔자 HA 펩티드의 예 및 난잡한 인플루엔자 에피토프의 EpiMatrix 분석을 도시한다. 인플루엔자 HA 펩티드는 EpiMatrix의 8개 대립유전자 모두에 대해 매우 높은 점수를 받았으며 클러스터 점수는 18이다. 클러스터 점수 10은 유의미한 것으로 간주된다. 밴드 유사 EpiBar 패턴은 난잡한 에피토프의 특징이다. PRYVKQNTL(서열번호: 125), RYVKQNTLK(서열번호: 126), YVKQNTLKL(서열번호: 127), VKQNTLKLA(서열번호: 128) 및 KQNTLKLAT(서열번호: 129)에 대한 결과가 표시된다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임의 가능성을 나타낸다. 상위 5%의 모든 점수는 "적중"으로 간주되는 반면, 10% 미만의 비적중(*)은 단순화를 위해 도 7에서 마스킹된다.
도 8은 서열번호: 7의 EpiMatrix 분석을 도시한다. KTLYLQMNS(서열번호: 16), TLYLQMNSL(서열번호: 17), LYLQMNSLR(서열번호: 18), YLQMNSLRA(서열번호: 19), LQMNSLRAE(서열번호: 20), QMNSLRAED(서열번호: 21), MNSLRAEDT(서열번호: 22), NSLRAEDTA(서열번호: 23), SLRAEDTAK(서열번호: 24), 및 LRAEDTAKH(서열번호: 25)에 대한 결과가 표시된다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임의 가능성을 나타낸다. 상위 5%의 모든 점수는 "적중"으로 간주되는 반면, 10% 미만의 비적중(*)은 단순화를 위해 도 8에서 마스킹된다.
도 9는 서열번호: 14의 EpiMatrix 분석을 도시한다. ETLYLQMNS (서열번호: 111), TLYLQMNSL (서열번호: 112), LYLQMNSLR (서열번호: 113), YLQMNSLRA (서열번호: 114), LQMNSLRAE (서열번호: 115), QMNSLRAED (서열번호: 116), MNSLRAEDT (서열번호: 117), NSLRAEDTA (서열번호: 118), SLRAEDTAV (서열번호: 119), 및 LRAEDTAVY (서열번호: 120)에 대한 결과가 표시된다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임의 가능성을 나타낸다. 상위 5%의 모든 점수는 "적중"으로 간주되는 반면, 10% 미만의 비적중(*)은 단순화를 위해 도 9에서 마스킹된다.
도 10은 트레지토프-알부민 전달 비히클의 효능을 평가하는 TTBSA 검정에 대한 실험 설계를 보여준다.
도 11은 본 개시내용의 서열번호: 1-15의 확인된 트레지토프에 대한 JanusMatrix 결과의 개요이다.
도 12는 서열번호: 1의 트레지토프 및 서열번호: 16-28을 포함하는 서열번호: 1에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 13은 서열번호: 10의 트레지토프 및 서열번호: 87-93을 포함하는 서열번호: 10에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 14는 서열번호: 11의 트레지토프 및 서열번호: 94-100을 포함하는 서열번호: 11에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 15는 서열번호: 12의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 16은 서열번호: 13의 트레지토프 및 서열번호: 101-110을 포함하는 서열번호: 13에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 17은 서열번호: 14의 트레지토프 및 서열번호: 111-120을 포함하는 서열번호: 14에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 18은 서열번호: 15의 트레지토프 및 서열번호: 121-124를 포함하는 서열번호: 15에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 19는 서열번호: 2의 트레지토프 및 서열번호: 29-41을 포함하는 서열번호: 2에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 20은 서열번호: 3의 트레지토프 및 서열번호: 42-48을 포함하는 서열번호: 3에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 21은 서열번호: 4의 트레지토프 및 서열번호: 49-50을 포함하는 서열번호: 4에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 22는 서열번호: 50의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 23은 서열번호: 6의 트레지토프 및 서열번호: 51-57을 포함하는 서열번호: 6에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 24은 서열번호: 7의 트레지토프 및 서열번호: 58-67을 포함하는 서열번호: 7에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 25은 서열번호: 8의 트레지토프 및 서열번호: 68-74를 포함하는 서열번호: 8에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
도 26은 서열번호: 9의 트레지토프 및 서열번호: 87-93을 포함하는 서열번호: 9에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다.
일반론
적응성 면역 캐스케이드는 가용성 단백질 항원이 항원 제시 세포(APC)에 의해 흡수되고 클래스 II 항원 제시 경로를 통해 처리될 때 시작된다. 클래스 II 제시 경로 내의 단백질 항원은 소포체에서 발견되는 다양한 프로테아제에 의해 분해된다. 생성된 단백질 단편 중 일부는 클래스 II MHC 분자에 결합된다. 펩티드가 로딩된 MHC 분자는 CD4+ T 세포에 의해 조사되는 세포 표면으로 수송된다. MHC 분자에 결합할 수 있고 APC와 순환 T 세포 사이의 세포 대 세포 상호작용을 매개할 수 있는 펩티드 단편을 T-세포 에피토프라고 한다. CD4+ T 세포에 의한 이러한 펩티드-MHC 복합체의 인식은 반응하는 T 세포의 표현형 및 국소 사이토카인/케모카인 환경에 기초한 면역 활성화 또는 면역 억제 반응을 유발할 수 있다. 일반적으로, MHC/펩티드 복합체와 T 효과기 세포의 T 세포 수용체(TCR) 사이의 관여는 IL-4 및 IFN-γ과 같은 염증유발 사이토카인의 활성화 및 후속 분비로 이어진다. 다른 한편으로, 천연 T 조절 세포(TReg)의 활성화는 면역 억제 사이토카인 IL-10 및 TGF-β의 발현을 유도한다(Shevach E, (2002), Nat Rev Immunol, 2(6):389 -400). 이러한 사이토카인은 근처의 효과기 T 세포에 직접 작용하여 어떤 경우에는 무력(anergy) 또는 세포자멸사를 유발한다. 다른 경우에, 조절 사이토카인 및 케모카인은 효과기 T 세포를 T 조절 표현형으로 전환하고; 이 과정을 여기에서 "유도성" 또는 "적응성" 관용이라고 한다. MHC 분자에 결합할 수 있고 순환 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함)에 결합 및/또는 활성화할 수 있는 T-세포 에피토프를 "트레지토프"라고 한다. 양태에서, 본 개시된 트레지토프는 다중 MHC 대립유전자 및 다중 TCR에 결합할 수 있는 에피토프인 T-세포 에피토프 클러스터이다.
초기 자기/비-자가 구별은 피질 및 수질 상피 세포가 미성숙 T 세포에 대한 특정 자가 단백질 에피토프를 발현하는 신생아 발달 동안 흉선에서 발생한다. 친화도가 높은 자가 항원을 인식하는 T 세포는 결실되지만, 중간 정도의 친화도를 갖는 자가반응 T 세포는 때때로 결실을 피하고 '천연' 조절 T-세포(TReg) 세포로 전환될 수 있다. 이 천연 TReg 세포는 말초로 내보내지며 잠재된 자가면역 반응을 제어하는 데 도움이 된다. 천연 조절 T-세포는 면역 조절과 자기 관용의 중요한 구성 요소이다.
자가 관용은 T 세포, B 세포, 사이토카인 및 표면 수용체 간의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다. T 조절 면역 반응은 단백질 항원에 대한 T 효과기 면역 반응을 상쇄한다(자체 또는 외부). 자가반응 T 효과기 세포의 수 또는 기능을 증가시키거나 T 조절 세포의 수 또는 기능을 감소시킴으로써 자가반응 쪽으로 균형이 기울어지는 것이 자가면역으로 나타난다.
관용의 제2 형태는 주변부에서 발생하며, 여기서 성숙한 T 세포는 일반적으로 방관자 T 조절 세포에 의해 공급되는 IL-10 및 TGF-β의 존재 하에 T 세포 수용체를 통해 활성화될 때 '적응' TReg 표현형으로 전환된다. 이러한 '적응' TReg 세포의 가능한 역할에는 침입한 병원체를 성공적으로 제거한 후, 면역 반응을 약화시키는 것, 알러지 반응으로 인한 과도한 염증을 제어하는 것, 낮은 수준 또는 만성 감염으로 인한 과도한 염증을 제어하는 것, 또는 유익한 공생 박테리아 및 바이러스를 표적으로 하는 염증 반응을 제어하는 것을 포함한다. '적응' TReg는 또한 체세포 과돌연변이를 겪은 인간 항체를 표적으로 하는 면역 반응을 억제하는 역할을 할 수 있다(Chaudhry A 등, (2011), Immunity, 34(4):566-78).
TReg 세포는 또한 B 세포 관용에 중요한 역할을 한다. B 세포는 세포 표면에서 단일 저친화성 Fc 수용체인 FcyRIIB를 발현한다(Ravetch JV 등, (1986), Science, 234(4777):718-25). 이 수용체는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 서열(ITIM)을 함유한다. 면역 복합체에 의한 FcyRIIB와 B-세포 수용체(BCR)의 공동 결찰은 ITIM의 티로신 인산화를 유발하여, MAP 키나제의 활성화를 방해하여 BCR에 의한 증식을 억제하고 칼슘이 세포로 유입되는 것을 억제하는 세포막에서 Burton의 티로신 키나제(Btk)를 분리하여 포식작용을 차단하는 이노시톨 포스파타제, SHIP의 동원을 유발한다. FcyRIIB는 또한 ITIM과 무관하게 세포자멸사를 유도할 수 있다. IC에 의한 FcRIIB의 호모-응집(homo-aggregation) 시, Btk와 세포막의 결합이 강화되어 세포자멸사 반응을 유발한다(Pearse R, 등, (1999), Immunity, 10(6):753-60). FcyRIIB의 발현은 매우 가변적이며 사이토카인 의존적이다. 활성화된 Th2 및 TReg 세포에 의해 발현되는 IL-4 및 IL-10은 상승적으로 작용하여 FcyRIIB 발현을 향상시키는 것으로 나타났다(Joshi T 등, (2006), Mol Immuno., 43(7):839- 50), 따라서 체액 반응의 억제를 돕는다.
트레지토프 특이적 TReg 세포를 활용하여 원치 않는 면역 반응을 억제하고 또한 동시 전달된 단백질에 적응성 TReg를 유도할 수 있다. 이 발견은 이식, 단백질 치료제, 알러지, 만성 감염, 자가면역 및 백신 설계를 위한 치료적 레지멘 및 항원 특이적 요법의 설계에 영향을 미친다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)을 포함하는 트레지토프와 함께 약물, 단백질 또는 알러지항원의 투여는 효과기 면역 반응을 억제할 수 있다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물을 포함하는 트레지토프는 관용에 대한 면역계를 의도적으로 조작하는데 사용될 수 있다.
본 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)은 조절 T 세포의 선택적 관여 및 활성화에 유용하다. 특정 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함)가 전신 및 제한된 질환 특이적 맥락 모두에서 원치 않는 면역 반응의 억제에 관여, 활성화 및/또는 적용될 수 있음이 본원에서 입증되었다.
광범위한 노력에도 불구하고 몇 가지 예외를 제외하고는 천연 TReg의 항원 특이성, 그리고 더 중요하게는 임상적으로 상당한 부피로 순환하는 천연 TReg의 항원 특이성은 알려져 있지 않다. 인간 면역글로불린이 조절 T-세포(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함)의 천연 발생 집단과 관련된 T-세포 에피토프를 함유한다는 입증이 본원에 제시된다. 정상적인 면역 감시 과정에서, 이러한 단백질은 수지상 세포나 대식세포와 같은 전문 APC에 의해 흡수되어 분해된다. 분해 과정에서, 이러한 단백질에 함유된 에피토프 중 일부는 MHC 분자에 결합되어 조절 T-세포에 제시된 세포 표면으로 수송된다. APC에 의해 활성화되면 이들 세포는 사이토카인과 케모카인을 방출하여 세포외 단백질의 기능을 방해할 수 있는 자가면역 반응을 억제하는 데 도움이 된다.
자연 발생 TRegs (양태에서, 천연 TRegs 및/또는 적응성 TRegs 포함)을 선택적으로 활성화하기 위해 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)을 사용하여, 본 개시내용의 트레지토프 조성물이 다양한 원치 않는 면역 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있음이 본원에서 제시된다. 가장 간단한 형태로, 본 개시내용의 트레지토프 조성물의 전신 적용은 예를 들어 MS 발적, 알레르기 반응, 이식 반응 또는 감염에 대한 통제되지 않는 반응과 같은 심각한 자가면역 반응을 조절하는데 유용한 일반화된 면역 억제제로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 류마티스 관절염(RA)에 의해 영향을 받는 관절에 국소적으로 적용되는 보다 제어된 적용에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 폴리펩티드 ((예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형 중 하나 이상 포함)은 국소화된 자가면역 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정 다른 T-세포 에피토프에 대한 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 융합, 결합 또는 혼합을 통해 달성될 수 있는 것과 같은 표적 적용에서, 트레지토프 화합물 및 조성물은 면역계의 균형을 온전하게 유지하면서 융합, 결합 또는 혼합 T 세포 에피토프에 대한 고도로 특이적인 면역 반응을 억제할 수 있다. 예를 들어, 자가면역 항원 예컨대 인슐린, 알러지항원 예컨대 브라질 너트(Brazil nut) 항원, 또는 항원성 단백질 예컨대 항체 (이는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자 또는 그의 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드 연결된 scfv, 디아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않음)일 수 있음) 또는 대체 효소에 융합된 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 전달을 통해, 면역계는 예를 들어 천연 발생 TReg((양태에서, 천연 TRegs 및/또는 적응성 TRegs 포함)를 유도하고/하거나 반응하는 효과기 T 세포의 표현형을 적응성 조절 T 세포로 전환하여 공동 전달된 항원을 "허용"하도록 훈련될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 트레지토프는 순환하는 세포외 단백질, 특히 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 유용하려면, 이러한 트레지토프가 진정한 T-세포 에피토프여야 한다(즉, MHC 분자와 TCR 모두에 결합할 수 있음). 양태에서, 트레지토프는 치료 효과를 갖기에 충분히 큰 기존의 조절 T-세포 집단과 관련되어야 한다. 여러 MHC 대립유전자 및 여러 TCR에 결합할 수 있는 에피토프인 T-세포 에피토프 클러스터는 이 후자의 자격을 충족하는 데 중요하다.
본 개시된 치료법은 다음과 같은 이점을 제공한다:
1. 본 개시내용의 트레지토프 조성물에 의한 치료는 항원 특이적이다(예를 들어, 트레지토프 조성물에 의한 치료는 예를 들어, 고도의 항원 특이적 방식으로 천연 발생 TReg 집단(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함))을 확장 및/또는 자극할 수 있다);
2. 빈번한 고용량 항원 제제로 연장된 기간에 걸쳐 환자를 치료하는 현재의 항원 특이적 요법과 비교할 때 효율적이고 저렴한 치료 레지멘; 및
3. 고용량 요법을 통한 관용 유도가 치료받은 환자에서 면역 관용을 유도하지 못하는 경우의 2차 방어선.
양태에서, 본 개시내용은 자가면역 반응을 받은 환자에게 안전하게 투여되는 치료적 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)에 관한 것이다. 청구된 트레지토프 화합물 및 조성물의 작용 기전은 천연적이며 그 효능과 안전성을 뒷받침한다.
양태에서, 본 개시내용은 표 1에 개시된 조절 트레지토프, 뿐만 아니라 그의 단편, 그의 변이체, 및 이러한 변이체의 단편 중 하 이상을 포함하는 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 하기 중 하나 이상: 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 세포; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)에 관한 것이고, 단, 상기 단편 및/또는 변이체는 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성을 유지하고/하거나 억제 또는 조절 T 세포 활성을 유지한다. 특정 양태에서, 트레지토프는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
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정의
본 발명의 이해를 더욱 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 하기에 정의된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어(기술적, 과학적 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 관련 기술 및 본 개시내용의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 명시적으로 정의되지 않는 한 이상화되거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 25의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위 범위 뿐만 아니라 상기 언급된 정수들 사이의 모든 중간 소수 값, 예를 들어, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9를 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 어느 한 끝점에서 확장되는 "내재된(nested) 하위 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 1에서 25까지의 예시적인 범위의 내재된 하위 범위는 한 방향으로 1에서 5, 1에서 10, 1에서 15, 및 1에서 20, 또는 다른 방향으로 25에서 20, 25에서 15, 25에서 10, 및 25에서 5을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 유기체로부터의 조직, 세포 또는 분비물의 임의의 샘플을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이식(transplantation)"은 "이식물(transplant)" 또는 "이식편(graft)"이라고 하는 세포, 조직 또는 기관을 한 대상체로부터 채취하여 (일반적으로) 다른 대상체에 배치하는 과정을 의미한다. 이식을 제공하는 대상체를 "공여자"라고 하고, 이식을 받은 대상체를 "수령자"라고 한다. 동일한 종의 유전적으로 다른 두 개체 사이에 이식된 장기 또는 이식편을 "동종 이식편"이라고 한다. 상이한 종의 대상체 사이에 이식된 이식편을 "이종이식편"이라고 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "의학적 상태"는 치료 및/또는 예방이 바람직한 하나 이상의 신체적 및/또는 심리적 증상으로 나타나는 임의의 병태 또는 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 이전 및 새로 확인된 질환 및 다른 장애를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 암성 세포, 전이성 종양 세포, 악성 흑색종, 침입 병원체(바이러스 포함), 병원체에 감염된 세포 또는 조직의 선택적 손상, 파괴 또는 인체로부터의 제거, 또는 자가면역 또는 병리적 염증, 정상 인간 세포 또는 조직의 경우에서 일어나는 림프구, 항원 제시 세포, 식균 세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간에서 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 협력 작용을 의미한다. 양태에서, 면역 반응은 측정가능한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응(예를 들어, 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 바이러스에 대한) 또는 측정가능한 B 세포 반응, 예컨대 항체의 생산(예를 들어, 면역원성 폴리펩티드에 대한)을 포함한다. 당업자는 본원의 실시예에 개시된 바와 같은 실험 및 검정의 사용을 포함하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 관련 조성물에 대한 면역 반응이 생성되었는지 여부를 결정하기 위한 다양한 검정을 알고 있을 것이다. 다양한 B 림프구 및 T 림프구 검정, 예컨대 ELISA, EliSpot 검정, 세포독성 T 림프구 CTL 검정, 예컨대 크로뮴 방출 검정, 말초 혈액 림프구 (PBL)를 사용하는 증식 검정, 사량체 검정, 및 다른 사이토카인 생산 검정이 잘 알려져 있다. 문헌[Benjamini 등]을 참조하고, 이는 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 트레지토프 조성물 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 (본원에서 "Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프", "트레지토프 펩티드", 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"로 지칭될 수 있는) 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 중 하나 이상 포함); 핵산, 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포 (이들 모두는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 (이는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형)을 포함하는 조성물의 용어 "유효량", "치료적 유효량" 등은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 치료되는 질환과 관련된 증상의 예방 또는 감소를 초래하는 양이다. 대상체에게 투여되는 본 개시내용의 조성물의 양은 질환의 유형 및 중증도 및 개체의 특성, 예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물 관용에 따라 달라질 것이다. 또한 질환의 정도, 중증도 및 유형에 따라 다르다. 당업자는 이러한 요인 및 다른 요인에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물은 또한 서로 조합하여 또는 하나 이상의 추가 치료 화합물과 함께 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 T-세포", "Treg" 등은 세포-세포 접촉 및 억제 사이토카인 생산을 포함한 다양한 다른 메커니즘을 통해 CD4+ 및/또는 CD8+ 효과기 T 세포 (Teff) 유도, 증식, 및/또는 사이토카인 생산의 억제 또는 하향 조절을 포함하는 면역 효과기 기능을 억제하는 T 세포의 하위집단을 의미한다. 양태에서, CD4+ Treg는 CD4, CD25 및 FoxP3를 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 세포 표면 마커의 존재를 특징으로 한다. 양태에서, 활성화 시, CD4+ 조절 T-세포는 IL-10 및/또는 TGFβ를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 억제 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. CD4+ Treg는 또한 그란자임 B 및 페르포린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과기 분자의 활성화 시 발현을 특징으로 하는 표적 세포의 직접적인 사멸을 통해 면역 억제 효과를 발휘할 수 있다. 양태에서, CD8+ Treg는 CD8, CD25 및 활성화 시 FoxP3를 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 세포 표면 마커의 존재를 특징으로 한다. 양태에서, 활성화 시, 조절 CD8+ T 세포는 IFNγ, IL-10 및/또는 TGFβ를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 억제 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. 양태에서, CD8+ Treg는 또한 그란자임 B 및/또는 페르포린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과기 분자의 활성화 시 발현을 특징으로 하는 표적 세포의 직접 사멸을 통해 면역 억제 효과를 발휘할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T-세포 에피토프"는 길이가 7 내지 30개의 아미노산이고 인간 백혈구 항원(HLA) 분자에 특이적으로 결합할 수 있고 특정 T 세포 수용체(TCR)와 상호작용할 수 있는 MHC 리간드 또는 단백질 결정인자를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, T 세포에 관여하는 것으로 알려져 있거나 결정된(예를 들어, 예측된) T 세포 에피토프의 맥락에서, 용어 "관여하다", "관여" 등은 MHC 분자(예를 들어, 인간 백혈구 항원(HLA) 분자)에 결합될 때, T-세포 에피토프는 T 세포의 TCR과 상호작용하고 T 세포를 활성화할 수 있음을 의미한다. 일반적으로 T-세포 에피토프는 선형이며 특정 3차원적 특성을 나타내지 않다. T-세포 에피토프는 변성 용매의 존재에 영향을 받지 않는다. T-세포 에피토프와 상호작용하는 능력은 인실리코 방법에 의해 예측될 수 있다(문헌[De Groot AS 등, (1997), AIDS Res Hum Retroviruses, 13(7):539-41; Schafer JR 등, (1998), Vaccine, 16(19):1880-4; De Groot AS 등, (2001), Vaccine, 19(31):4385-95; De Groot AR 등,(2003), Vaccine, 21(27-30):4486-504], 이들 모두는 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T-세포 에피토프 클러스터"는 약 4 내지 약 40개의 MHC 결합 모티프를 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 구현예에서, T-세포 에피토프 클러스터는 약 5 내지 약 35개의 MHC 결합 모티프, 약 8 내지 약 30개의 MHC 결합 모티프; 및 약 10 내지 20개의 MHC 결합 모티프를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 T-세포 에피토프"("트레지토프")는 관용원성 반응을 유발하고(Weber CA 등, (2009), Adv Drug Deliv, 61(11): 965-76), MHC 분자에 결합할 수 있고 순환 천연 발생 Treg(양태에서, 천연 Treg 및/또는 적응성 Treg 포함)에 관여(즉, 상호작용 및 활성화)할 수 있는 "T-세포 에피토프"를 의미한다. 양태에서, 활성화 시, CD4+ 조절 T-세포는 IL-10 및/또는 TGFβ를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 억제 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. CD4+ Treg는 또한 그란자임 B 및 페르포린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과기 분자의 활성화 시 발현을 특징으로 하는 표적 세포의 직접적인 사멸을 통해 면역 억제 효과를 발휘할 수 있고, 이는 IL-10 및 TGF-
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및 TNF-α를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 억제 사이토카인의 발현을 유도한다. 양태에서, 활성화 시, 조절 CD8+ T 세포는 IFNγ, IL-10 및/또는 TGFβ를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 억제 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. 양태에서, CD8+ Treg는 또한 그란자임 B 및/또는 페르포린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효과기 분자의 활성화 시 발현을 특징으로 하는 표적 세포의 직접 사멸을 통해 면역 억제 효과를 발휘할 수 있다. 양태에서, 본 개시된 트레지토프는 다중 MHC 대립유전자 및 다중 TCR에 결합할 수 있는 에피토프인 T-세포 에피토프 클러스터이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 자극 T-세포 에피토프 폴리펩티드"는 면역 반응, 예를 들어 체액성, T 세포 기반, 또는 선천성 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "B 세포 에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. B 세포 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화로 구성되며 통상적으로 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가지고 있다. 형태적 및 비-형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합이 손실되지 않고 후자에 대한 결합이 손실된다는 점에서 구별된다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도되는 임의의 살아있는 유기체를 지칭한다. 대상체이라는 용어는 인간, 비인간 영장류 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 양, 피그, 염소 및 말; 가정용 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 설치료 포함 실험실 동물 설치류 예컨대 마우스, 랫트 및 기니아 피그 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 성인 및 신생 대상체뿐만 아니라 남성이든 여성이든 태아를 대상으로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "주요 조직적합성 복합체(MHC)", "MHC 분자", "MHC 단백질" 또는 "HLA 단백질"은 특히, 단백질 항원의 단백분해 절단으로부터 생성된 펩티드에 결합하고 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타내고, 이를 세포 표면으로 수송하고 이를 특정 세포, 특히 세포독성 T-림프구 또는 T-헬퍼 세포에 제시할 수 있는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 게놈 내의 주요 조직적합성 복합체는 세포 표면 상에 발현된 유전자 산물이 내인성 및/또는 외래 항원을 결합하고 제시하여 면역학적 과정을 조절하는 데 중요한 유전자 영역을 포함한다. 주요 조직적합성 복합체는 상이한 단백질을 인코딩하는 두 개의 유전자 그룹, 즉 MHC 클래스 I의 분자와 MHC 클래스 II의 분자로 분류된다. 두 MHC 클래스의 분자는 상이한 항원 공급원에 대해 특화되어 있다. MHC 클래스 I의 분자는 내인성 합성 항원, 예를 들어 바이러스 단백질 및 종양 항원을 제시한다. MHC 클래스 II의 분자는 외인성 공급원, 예를 들어 박테리아 생성물에서 유래한 단백질 항원을 제시한다. 두 MHC 클래스의 세포 생물학 및 발현 패턴은 이러한 상이한 역할에 맞게 조정된다. 클래스 I의 MHC 분자는 중쇄와 경쇄로 구성되며 약 8 내지 11개의 아미노산의 펩티드에 결합할 수 있지만, 이 펩티드에 적절한 결합 모티프가 있는 경우 통상적으로 9개 또는 10개의 아미노산을 결합하고 이를 세포독성 T-림프구에 제시한다. 클래스 I의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 내인성 단백질 항원에서 유래한다. 클래스 I의 MHC 분자의 중쇄는 바람직하게는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 모노머이고, 경쇄는 β-2-마이크로글로불린이다. 클래스 II의 MHC 분자는 α-사슬과 β-사슬로 구성되며, 이 펩티드가 적절한 결합 모티프를 가지고 있다면 약 12 내지 25개의 아미노산의 펩티드에 결합할 수 있고, 이를 T-헬퍼 세포에 제시할 수 있다. 클래스 II의 MHC 분자에 의해 결합된 펩티드는 일반적으로 외인성 단백질 항원의 세포외에서 유래한다. α-사슬 및 β-사슬은 특히 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 모노머이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MHC 복합체"는 HLA 리간드로 공지된 폴리펩티드의 특정 레퍼토리와 결합할 수 있고 상기 리간드를 세포 표면으로 수송할 수 있는 단백질 복합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MHC 리간드"는 하나 이상의 특이적 MHC 대립유전자에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "HLA 리간드"는 "MHC 리간드"라는 용어와 상호교환가능하다. 표면에 MHC/리간드 복합체를 발현하는 세포를 "항원 제시 세포"(APC)라고 한다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MHC 결합 펩티드"는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드와 관련이 있다. MHC 클래스 I/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 일반적으로 길이가 약 8 내지 약 10개의 아미노산이지만 더 길거나 더 짧은 펩타이드가 효과적일 수 있다. MHC 클래스 II/펩티드 복합체의 경우, 결합 펩티드는 전형적으로 길이가 10 내지 25개의 아미노산이고 특히 길이가 13 내지 18개의 아미노산인 반면, 더 길고 더 짧은 펩티드도 효과적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 제시 세포(APC)와 같은 세포의 표면에 제시되는 MHC/리간드 복합체의 특정 레퍼토리에 관여할 수 있는 T 세포에 의해 발현되는 단백질 복합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MHC 결합 모티프"는 특정 MHC 대립유전자에 대한 결합을 예측하는 단백질 서열 내의 아미노산 패턴을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "EpiBarTM"는 적어도 4개의 상이한 HLA 대립유전자에 반응성인 것으로 예측되는 9-mer 펩티드를 지칭한다. EpiBarTM를 함유하는 면역원성 펩티드의 대표적인 예를 도 7에 나타내었다. 도 7은 난잡한 인플루엔자 에피토프의 EpiBar 및 EpiMatrix 분석의 예를 도시한다. 난잡하게 면역원성이 있는 것으로 알려진 에피토프인 인플루엔자 HA 펩티드를 고려한다. EpiMatrix의 8개 대립유전자 모두에 대해 매우 높은 점수를 받았다. 클러스터 점수는 18이다. 클러스터 점수가 10보다 높으면 유의미한 것으로 간주된다. 밴드 유사 EpiBar 패턴은 난잡한 에피토프의 특징이다. PRYVKQNTL(서열번호: 125), RYVKQNTLK(서열번호: 126), YVKQNTLKL(서열번호: 127), VKQNTLKLA(서열번호: 128) 및 KQNTLKLAT(서열번호: 129)에 대한 결과를 도 7에 나타내었다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임의 가능성을 나타낸다. 상위 5%의 모든 점수는 "적중"으로 간주되는 반면, 10% 미만의 비적중(*)은 단순화를 위해 도 7에서 마스킹된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 Fc"는 펩티드 서열이 루프 영역에 삽입 또는 교체에 의해 추가될 수 있는 단량체 또는 다량체 형태이든 간에 전체 항체의 소화로부터 생성된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 천연 Fc의 원래 면역글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원이고 임의의 IgG1 및 IgG2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역글로불린일 수 있다. 천연 Fc는 공유(즉, 이황화물 결합) 및 비공유 결합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체성 폴리펩티드로 구성된다. 천연 Fc 분자의 단위체 서브유닛 사이의 분자간 이황화물 결합의 수는 클래스(예를 들어, IgG, IgA, IgE) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2)에 따라 1 내지 4의 범위이다. 천연 Fc의 한 예는 IgG의 파파인 소화로부터 생성된 이황화물 결합 이량체이다 (문헌[Ellison 등 (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9] 참조). 본 명세서에 사용된 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태가 일반적이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 시냅스"는 주어진 T-세포 에피토프가 세포 표면 MHC 복합체 및 TCR 둘 모두에 동시에 관여함으로써 형성된 단백질 복합체를 의미한다.
용어 "폴리펩티드"는 특정 길이가 아닌 아미노산의 폴리머를 지칭하고, 따라서 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드는 재조합 및 비-재조합 세포로부터 단리될 때 세포 물질이 실질적으로 없을 때 "분리된" 또는 "정제된" 것으로 언급되고, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 것으로 언급된다. 그러나 폴리펩티드 (예를 들어, 양태에서, 단리되거나 합성 또는 재조합일 수 있는 서열번호: 1-124 중 하나 이상 또는 변이체 및 그의 단편을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드)는, 세포에서 정상적으로 결합되지 않고 여전히 "단리" 또는 "정제"되는 다른 폴리펩티드(예를 들어, 이종성 폴리펩티드)에 결합, 연결 또는 삽입될 수 있다. 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성 폴리펩티드"는 하나 이상의 트레지토프가 이종성 폴리펩티드에 이종성이거나 이종성 폴리펩티드에 자연적으로 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프 (및/또는 하나 이상의 다른 트레지토프, 예컨대 전체적으로 본원에 포함된 미국 특허 제7.884,184호에 개시된 추가의 IgG 유래 트레지토프)는 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 (이는 양태에서 단클론성, 다클론성, 마우스, 인간, 인간화, 단일특이적, 이중특이적, 글리코실화 (예를 들어, 당 사슬-변형된), Fc-변형된 또는 항체-약물 접합체; 또는 그의 항체 단편 (예를 들어, Fab, scFv, 디아바디, sdAb, 또는 탠덤 scFv); 또는 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체(예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA)일 수 있음)로 제한되지 않음)에 연결되고/되거나(예를 들어, 프레임 내에서 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 또는 다르게는 결합됨), 삽입될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프는 다른 폴리펩티드에 접합되거나, 연결되거나, 삽입될 수 있으며, 여기서 본 개시내용의 상기 하나 이상의 트레지토프는 폴리펩타이드에 천연적으로 포함되지 않고/하거나 본 개시내용의 상기 하나 이상의 트레지토프는 폴리펩타이드 내의 그의 천연 위치에 위치하지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인 내의 아미노산으로 삽입되거나 이를 대체할 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제8,008,453호, 미국 특허 제9,114,175호 및/또는 미국 특허 제10,188,740호(이들 각각은 그 전체가 참고로 여기에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인의 하나 이상의 내부 접합 부위(들)에 공유 결합될 수 있다. 폴리펩티드가 재조합적으로 생산되는 경우, 또한 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있으며, 예를 들어 배양 배지는 폴리펩티드 제제의 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "연속체(concatemeric)" 펩티드 또는 폴리펩티드는 함께 연결된 적어도 2개의 펩티드 또는 폴리펩티드의 시리즈를 지칭한다. 이러한 연결은 비드 스트링(string-of-bead) 디자인의 형태일 수 있다. 양태에서, 연쇄체 폴리펩티드의 펩티드 또는 폴리펩티드 각각은 하나 이상의 링커에 의해 선택적으로 이격될 수 있고, 추가 양태에서, 중성 링커에 의해 이격될 수 있다. 용어 "링커"는 상기 펩티드 도메인을 연결하기 위해 에피토프 또는 백신 서열과 같은 2개의 펩티드 도메인 사이에 첨가된 펩티드를 지칭할 수 있다. 양태에서, 링커 서열은 본 개시내용의 각각의 하나 이상의 확인된 펩티드 사이의 입체 장애를 감소시키기 위해 사용되고, 잘 번역되고, 본 개시내용의 각각의 하나 이상의 확인된 폴리펩티드의 프로세싱을 지지하거나 허용한다. 양태에서, 링커는 면역원성 서열 요소가 거의 또는 전혀 없어야 한다. 양태에서, 연쇄체 폴리펩티드의 각 펩티드 또는 폴리펩티드는 선택적으로 N 및/또는 C 말단 말단에 인접한 절단 민감 부위일 수 있는 하나 이상의 링커를 선택적으로 가질 수 있다. 이러한 연쇄체 펩티드에서, 2개 이상의 펩티드는 그들 사이에 절단 민감 부위를 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 펩티드는 서로 직접 연결되거나 절단 민감 부위가 아닌 링커를 통해 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있거나 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제"는 제제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 이의 약리 활성을 파괴하지 않고, 제제의 치료량을 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 부형제, 담체 또는 희석제를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유리 티올"은 선택적으로 폴리펩티드 및/또는 단백질에서 아미노산의 티올 측쇄를 나타내며, 여기서 티올은 설프하이드릴 기를 함유한다. 예를 들어, 유리 티올은 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 통해 다른 아미노산의 측쇄에 결합되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작용기"는 이동성 및 고정 단백질을 포함한 혈액 성분 상의 기로서 변형된 치료적 펩티드의 반응성기가 반응하여 공유 결합을 형성한다. 작용기는 일반적으로 에스테르 반응기에 결합하기 위한 하이드록실 기, 말레이미드, 이미데이트 및 티오에스테르기에 결합하기 위한 티올 기; 활성화된 카복실, 포스포릴 또는 반응성 기 상의 다른 아실 기에 결합하기 위한 아미노 기를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "혈액 성분"은 고정되거나 이동될 수 있다. 고정 혈액 성분은 움직이지 않는 혈액 성분이며 조직, 막 수용체, 사이질 단백질, 피브린 단백질, 콜라겐, 혈소판, 내피 세포, 상피 세포 및 그것의 연관된 막 및 막성 수용체, 체세포 바디 세포, 골격 및 평활근 세포, 뉴런 성분, 골세포 및 파골세포 및 모든 신체 조직, 특히 순환 및 림프계와 연관된 것들을 포함한다. 이동 혈액 성분은 일반적으로 5분을 초과하지 않고 일반적으로 1분을 초과하지 않는 장기간 동안 고정된 위치를 갖지 않는 혈액 성분이다. 이러한 혈액 성분은 막과 연관되지 않고 연장된 기간 동안 혈액에 존재하며 최소 0.1 μg/ml의 농도로 존재한다. 이동 혈액 성분에는 혈청 알부민, 트랜스페린, 페리틴 및 면역글로불린 예컨대 IgM 및 IgG가 포함된다. 이동 혈액 성분의 반감기는 적어도 약 12시간일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특별히 만들어진 컴퓨터 프로그램"은 특정 목적을 수행하도록 설계된 컴퓨터 프로그램을 의미하고; 전형적으로 특정 원시 데이터 세트를 분석하고 특정 과학적 질문에 답한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 'z-점수'는 요소가 평균에서 얼마나 많은 표준 편차를 가지고 있는지 나타낸다. z-점수는 다음 공식으로 계산할 수 있다: z = (X - μ) / σ, 여기서 z는 z-점수이고, X는 요소의 값이고, μ는 모집단 평균이고, σ는 표준 편차이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 "적어도 하나"를 포함하는 복수형을 포함하는 것으로 의도된다. "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는" 및 "하나 이상"은 관련된 나열된 항목의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 예를 들어, "본 개시내용의 서열번호: 1-124 중 하나 이상"과 관련하여 용어 "하나 이상"은 서열번호: 1-124의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 용어 "또는 이들의 조합"은 전술한 구성요소 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 의미한다.
다음 약어 및/또는 머리글자가 이 본원 전체에서 사용된다.
APC 항원 제시 세포
CEF 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바 바이러스 및 인플루엔자 바이러스
CFSE 염료 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 염료
DMSO 디메틸 설폭사이드
DR 항체 항원 D 관련 항체
ELISA 효소 결합 면역흡착 검정
FACS 형광 활성화 세포 분류
Fmoc 9-플루오로닐 메톡시 카보닐
FV 인간 응고 인자 V
FVIII 인간 응고 인자 VIII
HLA 인간 백혈구 항원
HPLC 고성능 액체 크로마토그래프 (UPLC)
IVIG 정맥내 정제 면역글로불린 G 항체
MFI 평균 형광 지수
MHC 주요 조직적합성 복합체
PBMC 말초 혈액 단핵 세포
PI 증식 지수
RPMI 로스웰 파크 기념 연구소 매체
Teff 효과기 T 세포
TReg 조절 T 세포
TT 파상풍 톡소이드
UV 자외선
본원에 사용된 "변이체" 펩티드 또는 폴리펩티드(변이체 트레지토프 포함)는 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합 및 말단절단 또는 이들 중 임의의 것의 조합에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 양태에서, 변이체 펩티드 또는 폴리펩티드(변이체 T-세포 에피토프 포함)는 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합, 및 말단절단 또는 이들 중 임의의 것의 조합에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있거나, 단, 상기 변이체는 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성, 및/또는 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 보유한다.
본원에 사용된 "항체"는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태를 취할 수 있다: 단클론성 또는 다클론성; 마우스, 인간 또는 인간화; 단일특이성 또는 이중특이성; 글리코실화; Fc-변형; 항체-약물 접합체; 상이한 클래스 또는 서브플래스의 항체, 예컨대 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA; 및/또는 항체 단편 또는 그의 유도체 (예를 들어, Fab, scFv, 디아바디, sdAb, 또는 탠덤 sccFv.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 트레지토프의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 트레지토프의 변이체의 단편을 포괄하며, 단 상기 단편 및/또는 변이체는 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성, 및/또는 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 적.어도 부분적으로 보유한다.
본 개시내용은 또한 본 개시된 트레지토프 중 하나 이상이 그의 일부인 키메라 또는 융합 폴리펩티드 (이는 양태에서, 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)을 제공한다. 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 모노 특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 또는 항체-약물 접합체; 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체(예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자) 또는 그의 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드 연결된 scFv, 디아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 제한되지 않음)에 연결된 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 (Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)을 포함한다. 이전에 언급된 바와 같이, 용어 "이종성 폴리펩티드"는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프(예를 들어, 서열번호: 1-124 중 하나 이상)가 이종성 폴리펩티드에 이종성이거나 이종성 폴리펩티드에 자연적으로 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 (예를 들어, 돌연변이유발 또는 당업계에 공지된 다른 수단을 통해) 이종성 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있고, 이종성 폴리펩티드의 C-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 첨가될 수 있고/있거나 이종성 폴리펩티드의 N-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 첨가될 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인 내의 아미노산으로 삽입되거나 이를 대체할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발에 의한 단백질 조작은 부위 지정 돌연변이유발 기술 또는 당업계에 알려진 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson., 2002, Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. 등, 2012, Protein Engineering Methods and Applications, intechopen.com]를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프를 포함한다. "작동적으로 연결된"은 폴리펩티드 (예를 들어, 본 개시내용의 하나 이상의 Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드) 및 이종 단백질이 프레임 내 융합되거나 화학적으로 연결되거나 달리 결합됨을 나타낸다. 예를 들어, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제8,008,453호, 미국 특허 제9,114,175호 및/또는 미국 특허 제10,188,740호(이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인의 하나 이상의 내부 접합 부위(들)에 공유 결합될 수 있다. 양태에서, 단리된, 합성, 또는 재조합 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 본 개시내용의 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열을 가지며, 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에 천연적으로 포함되지 않고/않거나 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에서 그의 천연 위치에 있다. 양태에서, 본 개시내용의 서열번호: 1-124 중 하나 이상은 폴리펩티드에 결합되고, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그에 삽입될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 서열번호: 1-124 중 하나 이상은 소분자, 예를 들어 한정된 HLA에 높은 친화도로 결합하는 약물 또는 약물 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 약물, 또는 약물 단편에 결합되거나 연결될 수 있다 (예를 들어, 프레임 내에서 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 또는 다르게는 결합된다). 상기 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 (Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)는 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는다.
"단리된" 폴리펩티드 (예를 들어, 단리된 Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드) 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 그것을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제되거나, 이를 발현하도록 변형된 세포로부터 정제되거나(재조합), 공지된 단백질 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 한 구현예에서, 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 트레지토프를 인코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터로 클로닝되고, 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되고 폴리펩티드는 숙주 세포에서 발현된다. 그 다음, 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 계획에 의해 트레지토프를 세포로부터 단리할 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 예를 들어, 변형된 형태의 자연 발생 아미노산 예컨대 D-입체이성질체, 비-자연 발생 아미노산; 아미노산 유사체; 및 모방체를 포함할 수 있다. 추가로, 양태에서, 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 본 개시내용의 본 개시된 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드의 레트로-인버소 펩티드를 포함할 수 있다, 단, 상기 본 개시내용의 레트로-인버소 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 적어도 부분적으로 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성, 및/또는 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 보유한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재되어 있다. 본 개시내용의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수형은 복수의 지시대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드
양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 (Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드, 이는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포 (이들 모두는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 단리된, 합성, 또는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 포함하는 트레지토프 화합물 및 조성물; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형을 제공한다. 양태에서, 트레지토프 조성물은 표 1의 조절 트레지토프(그의 단편, 그의 변이체, 및 그의 이러한 변이체의 단편을 포함하되, 단, 상기 단편 및/또는 변이체는 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성, 및/또는 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 적어도 부분적으로 보유함) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 양태에서, 트레지토프는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
한 양태에서, 본 개시내용은 '트레지토프'로 지칭되는 신규한 부류의 T-세포 에피토프(이는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)를 제공하며, 이는 일반적인 인간 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 개시내용의 트레지토프는 그의 공급원 단백질의 공지된 변이체 중에서 고도로 보존되어 있다(예를 들어, 공지된 변이체의 10% 초과로 존재). 본 개시내용의 트레지토프는 EpiMatrixTM 분석에 의해 확인된 바와 같은 적어도 하나의 추정 T-세포 에피토프를 포함한다. EpiMatrixTM는 추정 T-세포 에피토프의 존재에 대해 단백질 서열을 스크리닝하는 데 사용되는 EpiVax(Providence, Rhode Island)에서 개발한 독점 컴퓨터 알고리즘이다. 입력 서열은 각 프레임이 마지막 8개의 아미노산과 중첩되는 중첩 9-mer 프레임으로 분석된다. 각 결과적인 프레임은 8개의 공통 클래스 II HLA 대립유전자(DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301, 및 DRB1*1501)의 패널과 관련하여 예측된 결합 친화도에 대해 점수화된다. 원 점수는 무작위로 생성된 펩티드의 큰 샘플 점수에 대해 정규화된다. 결과적인 "Z" 점수가 보고된다. 양태에서, 대립유전자 특이적 EpiMatrixTM Z-점수가 1.64를 초과하는 임의의 9-mer 펩티드, 이론적으로 임의의 주어진 샘플의 상위 5%는 추정 T-세포 에피토프로 간주된다.
추정되는 T-세포 에피토프의 클러스터를 포함하는 펩티드는 시험관 내 및 생체 내 검정의 검증에서 양성으로 테스트될 가능성이 더 높다. 초기 EpiMatrixTM 분석 결과는 ClustimerTM 알고리즘으로 알려진 제2 독점 알고리즘을 사용하여 추정 T-세포 에피토프 "클러스터"의 존재에 대해 추가로 스크리닝된다. ClustimerTM 알고리즘은 통계적으로 비정상적으로 많은 수의 추정 T-세포 에피토프를 함유하는 임의의 주어진 아미노산 서열 내에 함유된 하위 영역을 식별한다. 전형적인 T-세포 에피토프 "클러스터"는 길이가 약 9 내지 대략 30개의 아미노산 범위이며, 다중 대립유전자에 대한 친화성 및 다중 9-mer 프레임 전반에 걸쳐 고려하면, 약 4 내지 약 40개의 추정 T-세포 에피토프를 함유할 수 있다. 확인된 각 에피토프 클러스터는 추정 T-세포 에피토프의 점수를 합산하고 후보 에피토프 클러스터의 길이와 동일한 길이의 무작위로 생성된 클러스터의 예상 점수를 기반으로 한 보정 인자를 빼서 집계 EpiMatrixTM 점수를 계산한다. +10을 초과하는 EpiMatrixTM 클러스터 점수는 유의미한 것으로 간주된다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프는 T-세포 에피토프 클러스터로 알려진 패턴을 형성하는 여러 추정 T-세포 에피토프를 함유한다. 도 7 내지 도 9는 예시적인 EpiMatrix 보고서를 보여준다.
가장 반응성이 높은 T-세포 에피토프 클러스터 중 다수는 "EpiBarTM"라고 하는 특징을 함유한다. 이전에 기재된 바와 같이, EpiBarTM는 최소 4개의 다른 HLA 대립유전자에 반응하는 것으로 예측되는 단일 9-mer 프레임이다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프는 하나 이상의 EpiBarsTM를 포함할 수 있다.
JanusMatrix 시스템(EpiVax, Providence, Rhode Island)은 숙주 단백체와의 교차 보존을 위해 펩티드 서열을 스크리닝하는 데 유용하다. JanusMatrix는 추정되는 MHC 리간드에서 TCR-대면 잔기의 보존을 기반으로 하여 펩티드 클러스터와 숙주 게놈 또는 단백체 간의 교차 반응성 가능성을 예측하는 알고리즘이다. JanusMatrix 알고리즘은 먼저 주어진 단백질 서열에 함유된 모든 예측 에피토프를 고려하고 각 예측 에피토프를 구성요소 아그레토프와 에피토프로 나눈다. 그런 다음 각 서열은 숙주 단백질 데이터베이스에 대해 스크리닝된다. 양립가능한 MHC 대면 아그레토프(즉, 입력 펩티드와 숙주 상대방 모두의 아그레토프가 동일한 MHC 대립유전자에 결합할 것으로 예측됨)와 정확히 동일한 TCR 대면 에피토프가 있는 펩티드가 반환된다. JanusMatrix 상동성 점수는 면역 관용에 대한 편향을 시사한다. 치료 단백질의 경우, 자가 인간 에피토프와 치료제의 에피토프 간의 교차 보존은 이러한 후보가 인간 면역계에 의해 용인될 가능성을 증가시킬 수 있다. 백신의 경우, 인간 에피토프와 항원성 에피토프 사이의 교차 보존은 그러한 후보가 면역 위장을 활용하여 면역 반응을 회피하고 효과없는 백신을 만든다는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 숙주가 인간인 경우, 펩티드 클러스터는 추정 HLA 리간드에서 TCR-대면 잔기의 보존을 기반으로 인간 게놈 및 단백체에 대해 스크리닝된다. 그런 다음 JanusMatrix 상동성 점수를 사용하여 펩티드를 점수화한다. 양태에서, 3.0 초과의 JanusMatrix 상동성 점수를 갖는 펩티드는 높은 관용원성 가능성을 나타내며, 그 자체로 본 개시내용의 매우 유용한 트레지토프일 수 있다.
도 11은 본 개시내용의 서열번호: 1-15의 확인된 트레지토프에 대한 JanusMatrix 결과의 개요이다. 도 12는 서열번호: 1의 트레지토프 및 서열번호: 16-28을 포함하는 서열번호: 1에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 13은 서열번호: 10의 트레지토프 및 서열번호: 87-93을 포함하는 서열번호: 10에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 14는 서열번호: 11의 트레지토프 및 서열번호: 94-100을 포함하는 서열번호: 11에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 15는 서열번호: 12의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 보고서이다. *검색 데이터베이스에서 찾은 HUMAN JanusMatrix 일치의 카운트. 도 16은 서열번호: 13의 트레지토프 및 서열번호: 101-110을 포함하는 서열번호: 13에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 17은 서열번호: 4의 트레지토프 및 서열번호: 111-120을 포함하는 서열번호: 14에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. *검색 데이터베이스에서 찾은 HUMAN JanusMatrix 일치의 카운트. 도 18은 서열번호: 15의 트레지토프 및 서열번호: 121-124를 포함하는 서열번호: 15에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 19는 서열번호: 10의 트레지토프 및 서열번호: 29-41을 포함하는 서열번호: 2에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. *검색 데이터베이스에서 찾은 HUMAN JanusMatrix 일치의 카운트. 도 20은 서열번호: 3의 트레지토프 및 서열번호: 42-48을 포함하는 서열번호: 3에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 21는 서열번호: 4의 트레지토프 및 서열번호: 49-50을 포함하는 서열번호: 4에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. *검색 데이터베이스에서 찾은 HUMAN JanusMatrix 일치의 카운트. 도 22는 서열번호: 50의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 23은 서열번호: 6의 트레지토프 및 서열번호: 51-57을 포함하는 서열번호: 6에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 24은 서열번호: 7의 트레지토프 및 서열번호: 58-67을 포함하는 서열번호: 7에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 25은 서열번호: 8의 트레지토프 및 서열번호: 68-74를 포함하는 서열번호: 8에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 26은 서열번호: 9의 트레지토프 및 서열번호: 87-93을 포함하는 서열번호: 9에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 보고서이다. 도 11 내지 도 26 각각에 대해, *는 검색 데이터베이스에서 찾은 HUMAN JanusMatrix 일치의 카운트이다. 주어진 EpiMatrix Hit(특정 대립유전자에 결합할 것으로 예상되는 입력 서열 내에 포함된 9-mer)와 관련하여, Janus Matrix 일치는 EpiMatrix Hit와 동일한 대립유전자에 결합할 것으로 예상되며 EpiMatrix Hit와 접촉하는 TCR을 공유하는 검색 데이터베이스(예를 들어, 인간 게놈)에서 유래된 9-mer이다. 또한 Janus 상동성 점수**는 입력 서열의 각 EpiMatrix 히트에 대한 검색 데이터베이스의 커버리지의 평균 깊이를 나타낸다. 예를 들어, 검색 데이터베이스에서 하나의 일치 항목이 있는 8개의 EpiMatrix 히트가 있는 입력 펩티드의 Janus 상동성 점수는 1이다. 검색 데이터베이스에서 2개의 일치 항목이 있는 4개의 EpiMatrix 히트가 있는 입력 펩티드의 Janus 상동성 점는 2이다. JanusMatrix 상동성 점수는 측면을 포함하여 주어진 펩티드의 모든 구성성분 9-mer를 고려한다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프는 적어도 1개, 바람직하게는 2개 이상의 공통 HLA 클래스 II 분자에 적어도 적당한 친화도(예를 들어, 양태에서, 가용성 HLA 분자를 기반으로 한 HLA 결합 검정에서 <1000 μM IC50, <500 μM IC50, <400 μM IC50, <300 μM IC50 또는 <200 μM IC50)로 결합한다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프는 HLA의 적어도 하나 및 다른 양태에서, 둘 이상의 대립유전자의 맥락에서 APC에 의해 세포 표면에 제시될 수 있다. 이러한 맥락에서 트레지토프-HLA 복합체는 트레지토프-HLA 복합체에 특이적이고 정상 대조 대상체에서 순환하는 TCR을 갖는 천연 발생 TReg(양태에서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg 포함)에 의해 인식될 수 있다. 양태에서, 트레지토프-HLA 복합체의 인식은 일치하는 조절 T-세포가 활성화되고 조절 사이토카인과 케모카인을 분비하도록 할 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열 (및 그의 단편 및 변이체)을 갖는 폴리펩티드 (이는 "Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프", "트레지토프 펩티드", 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"로 지칭될 수 있음)에 관한 것이다. "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 문구는 서열번호: 1-124 중 어느 하나에 따른 서열 또는 변이체에 추가하여, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드가 MHC 리간드로 기능하는 펩티드의 일부를 반드시 형성할 필요는 없고 트레지토프로서 기능하는 펩티드의 활성을 실질적으로 손상시키지 않는 한 펩티드의 말단 및/또는 측쇄의 말단에 존재할 수 있는 추가의 아미노산 또는 잔기를 함유함을 의미하는 것으로 의도된다. 양태에서, 본 개시내용의 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열을 갖고, 선택적으로 핵심 아미노산 서열의 C-말단 및/또는 N-말단 상에 1 내지 12개의 아미노산의 확장을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 핵심 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이들 측접 아미노산의 전체 수는 1 내지 12, 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 6, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 12, 5 내지 10, 5 내지 8, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 10, 6 내지 8, 7 내지 12, 7 내지 10, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 10, 9 내지 12, 9 내지 10, 또는 10 내지 12이고, 측접 아미노산은 C-말단 및 N-말단에 임의의 비율로 분포될 수 있다(예를 들어, 모든 측접 아미노산은 하나의 말단에 첨가될 수 있거나, 아미노산은 양쪽 말단에 또는 임의의 다른 비율로 동일하게 첨가될 수 있음). 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 및 변이체)을 갖고, 선택적으로 C-말단 및/또는 N-말단 상에 1 내지 12개의 아미노산의 확장을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 핵심 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이들 측접 아미노산의 전체 수는 1 내지 12, 1 내지 3, 2 내지 4, 3 내지 6, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 3 내지 12, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 12, 5 내지 10, 5 내지 8, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 10, 6 내지 8, 7 내지 12, 7 내지 10, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 10, 9 내지 12, 9 내지 10, 또는 10 내지 12이고, 측접 아미노산은 C-말단 및 N-말단에 임의의 비율로 분포될 수 있고(예를 들어, 모든 측접 아미노산은 하나의 말단에 첨가될 수 있거나, 아미노산은 양쪽 말단에 또는 임의의 다른 비율로 동일하게 첨가될 수 있음), 단, 측접 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 상기 측접 아미노산 없이 상기 폴리펩티드 핵심 서열과 동일한 HLA 분자에 여전히 결합할 수 있다(즉, MHC 결합 성향을 유지함). 양태에서, 측접 아미노산을 갖는 상기 폴리펩티드는 여전히 동일한 HLA 분자에 결합할 수 있고/있거나(즉, MHC 결합 성향을 유지함), 상기 측접 아미노산이 없는 상기 폴리펩티드 핵심 서열과 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지할 수 있다. 양태에서, 상기 측접 아미노산 서열은 또한 예를 들어, IgG 항체에서 천연 발생 단백질에서 그 안에 포함된 펩티드 또는 폴리펩티드에 측접하는 것들이다. 양태에서, 확장(들)은 펩티드 또는 폴리펩티드의 생화학적 특성(예를 들어, 용해도 또는 안정성을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 개선하거나 펩티드의 효율적인 프로테아좀 처리 가능성을 개선하는 역할을 하거나 설계될 수 있다. 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 상기 측접 아미노산 서열은 MHC 안정화 영역으로서 작용할 수 있다. 더 긴 펩티드의 사용은 환자 세포에 의한 내인성 처리를 허용할 수 있고 T 세포 반응의 보다 효과적인 항원 제시 및 유도를 유도할 수 있다. 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 이러한 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편)을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 여전히 동일한 HLA 분자 (즉, MHC 결합 경향을 유지함)에 결합하고/하거나 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지할 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드 함께 연결되거나, 융합되거나, 또는 결합된 (예를 들어, 융합된 프레임내, 화학적으로 연결된, 또는 다르게는 결합된) 본 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체)을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산이지만으로 제한되지 않음) 중 하나 이상을 포함하는 연쇄체 폴리펩티드 또는 펩티드에 관한 것이다. 이러한 추가 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 개시된 폴리펩티드 또는 펩티드 중 하나 이상일 수 있거나, 또는 관심의 추가 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 양태에서, 연쇄체 펩티드는 본 개시된 펩티드 또는 폴리펩티드 중 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 6개 이상 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상으로 이루어진다. 다른 양태에서, 연쇄체 펩티드 또는 폴리펩티드는 1000개 이상, 1000개 이하, 900개 이하, 500개 이하, 100개 이하, 75개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 또는 100개 이하의 펩티드 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 연쇄체 펩티드는 3-100, 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 65-100, 70-100, 75-100, 80-100, 90-100, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50, 100-150, 100-200, 100-300, 100-400, 100-500, 50-500, 50-800, 50-1,000, 또는 100-1,000개의 본 개시된 펩티드 또는 폴리펩티드가 함께 연결, 융합 또는 결합되어 있다. 본 개시내용은 또한 이러한 연쇄체 펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, RNA mRNA, DNA, cDNA)에 관한 것임을 이해해야 한다. 연쇄체 폴리펩티드의 각 펩티드 또는 폴리펩티드는 선택적으로 N 및/또는 C 말단 말단에 인접한 절단 민감 부위일 수 있는 하나 이상의 링커를 선택적으로 가질 수 있다. AAY 절단 모티프 또는 C-말단 요소의 N 말단에 포함될 수 있는 폴리 GS 링커를 포함하는 이러한 적합한 링커 및 절단 민감 부위는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 연쇄체 펩티드에서, 2개 이상의 펩티드 에피토프는 그들 사이에 절단 민감 부위를 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 펩티드 에피토프는 서로 직접 연결되거나 절단 민감 부위가 아닌 링커를 통해 연결될 수 있다. 양태에서, 이러한 링커는 항원성으로 중성이고, 라이커(liker)는 바람직하게는 선형으로 배열된 9개의 아미노산의 펩티딜 백본의 길이보다 짧다. 양태에서, 링커 길이는 선형으로 배열된 2개 내지 8개의 아미노산의 펩티딜 백본의 길이이다. 양태에서, 스페이서는 강화 하이브리드 펩티드의 다른 별개의 요소에 임의의 공간적으로 별개의 방식으로 수소 결합할 수 없다.
양태에서, 그리고 항원성으로 중성인 링커 요소와 관련하여, 다양한 화학 기가 아미노산 대신 링커로서 혼입될 수 있다. 예는 미국 특허 제5,910,300호에 기술되어 있으며, 그 내용은 참고로 본원에 포함된다. 양태에서, 링커는 헤테로원자, 예를 들어 C2-C6 알킬렌, 또는 〓N―(CH2)2-6―N〓에 의해 최적으로 중단된 지방족 사슬로 구성될 수 있다. 대안적으로, 스페이서는 예를 들어 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자에 의해 선택적으로 중단된 소수성, 친유성, 지방족 및 아릴-지방족 서열의 교대 단위로 구성될 수 있다. 스페이서의 이러한 성분은 바람직하게는 화합물의 다음 부류로부터 선택된다: 스테롤, 알킬 알코올, 다양한 알킬 기를 갖는 폴리글리세리드, 알킬-페놀, 알킬-아민, 아미드, 소수성 폴리옥시알킬렌 등. 다른 예로는 소수성 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리하이드록시산, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리글리콜산 폴리하이드록시-부티르산이 있다. 링커는 또한 산소 원자에 의해 분리된 폴리프로필렌, 이소프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌, 펜타메틸렌 등과 같은 반복되는 짧은 지방족 사슬을 함유할 수 있다.
가능한 링커로서 사용될 수 있는 추가 펩티딜 서열은 미국 특허 제5,856,456호에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 한 구현예에서, 링커는 절단될 수 있는 통합된 화학 기를 갖는다. 제한 없이, 이러한 화학 기는 프로테아제, 화학 기, 또는 촉매 단클론성 항체에 의해 촉매되는 절단을 위해 설계될 수 있다. 프로테아제 민감성 화학 기의 경우 트립신 표적(양이온 측쇄가 있는 2개의 아미노산), 키모트립신 표적(소수성 측쇄 포함) 및 카텝신 민감성(B, D 또는 S)이 바람직하다. 용어 '트립신 표적'은 트립신 및 트립신 유사 효소에 의해 인식되는 아미노산의 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 '키모트립신 표적'은 키모트립신 및 키모트립신 유사 효소에 의해 인식되는 아미노산의 서열을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 또한, 촉매적 단클론성 항체의 화학적 표적 및 다른 화학적으로 절단된 기는 일반적으로 펩티드 합성, 효소 촉매 작용 및 유기 화학 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 일상적인 실험 방법을 사용하여 하이브리드 구조로 설계하고 합성할 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 연쇄체 폴리펩티드는 EpiAssembler 시스템(EpiVax)을 사용하여 생성된다. EpiAssembler 시스템은 면역원성 공통 서열 (ICS)에 겹치는 에피토프를 조립하는 데 유용하다. EpiAssembler는 병원체와 집단 커버리지 사이의 균형을 최적화하는 알고리즘이다. EpiAssembler는 Conservatrix 및 EpiMatrix에서 생성된 서열의 정보를 사용하여 면역원성이 높은 공통 서열을 형성한다.
상기 기재된 연쇄체 펩티드 또는 폴리펩티드의 양태에서, 연쇄체 펩티드 또는 폴리펩티드는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있다. 양태에서, 연쇄체 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 연쇄체 폴리펩티드는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열이 적어도 약 45-55%, 전형적으로 적어도 약 70-75%, 더욱 전형적으로 적어도 약 80-85%, 더욱 전형적으로 약 90% 초과, 및 더욱 전형적으로 95% 초과 또는 그 이상으로 상동이거나 동일할 때 2개의 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 영역)는 실질적으로 상동이거나 동일하다. 2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 상동성 또는 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 다른 폴리펩티드 또는 핵산 분자와의 최적의 정렬을 위해 하나의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 서열에 도입될 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 한 서열의 위치가 다른 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동이다. 당업계에 알려진 바와 같이, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 폴리펩티드에 대한 서열 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다. 양태에서, 2개의 서열 사이의 퍼센트 상동성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(예를 들어, 퍼센트 상동성은 동일한 위치의 수/위치의 총 수 Х 100과 같다).
양태에서, 본 개시내용은 또한 낮은 정도의 동일성을 갖지만 본 개시내용의 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호: 1-124 중 하나 이상 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드)에 의해 수행되는 동일한 기능 중 하나 이상을 수행하기에 충분한 유사성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다 유사성은 보존된 아미노산 치환에 의해 결정된다. 이러한 치환은 폴리펩티드의 주어진 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보수적 치환은 표현형으로 침묵할 가능성이 있다. 전형적으로 보존적 치환으로 볼 수 있는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu, Met 및 Ile 중에서 서로를 대체; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 간의 치환, 염기성 잔기 His, Lys 및 Arg의 교환, 및 방향족 잔기 Trp, Phe 및 Tyr 중의 치환이다. 어떤 아미노산 변화가 표현형으로 침묵할 가능성이 있는지에 관한 지침이 발견된다(Bowie JU 등, (1990), Science, 247(4948):130610, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
양태에서, 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합 및 말단절단 또는 이들 중 임의의 것의 조합에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 완전히 기능적일 수 있거나(예를 들어, MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 유지함), 하나 이상의 활성에서 기능이 결여될 수 있다. 완전 기능성 변이체는 전형적으로 비-임계 잔기 또는 비-임계 영역에서 보존적 변이 또는 변이만을 포함하고; 이 경우, 전형적으로 MHC 결합이 제공되는 MHC 접촉 잔기가 보존된다. 기능적 변이체는 기능에 변화가 없거나 미미한 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수도 있다(예를 들어, MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 유지함). 대안적으로, 그러한 치환은 어느 정도 기능에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있다. 비-기능적 변이체는 전형적으로 임계 잔기 또는 임계 영역에서 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위, 또는 말단절단 또는 치환, 삽입, 역위, 또는 결실; 이 경우 전형적으로 TCR 접촉 잔기를 함유한다. 양태에서, 변이체 및/또는 상동성 폴리펩티드는 본 개시내용의 원하는 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다. 대안적으로, 그러한 치환은 어느 정도 기능에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있다. 비-기능적 변이체는 전형적으로 임계 잔기 또는 임계 영역에서 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위, 또는 말단절단 또는 치환, 삽입, 역위, 또는 결실; 이 경우 전형적으로 TCR 접촉 잔기를 함유한다. 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열(또는 핵심 서열)을 갖는 폴리펩티드의 기능적 변이체는 하나 이상의 보존적 치환, 및 양태에서 본 개시된 폴리펩티드의 기능에 필수적인 것으로 여겨지지 않는 아미노산 잔기에서 하나 이상의 비보존적 치환을 함유할 수 있다 (아미노산 잔기는 예를 들어, MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 유지하는 것을 포함하여 기능에 필수적인 것으로 간주된다). 예를 들어, 양태에서, 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상, 또는 그의 단편을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열 (또는 핵심 서열)을 갖는 변이체 폴리펩티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드는, 하나 이상의 HLA 접촉 잔기 하나 이상의 보존적 치환 (및 양태에서, 비보존적 치환)을 함유할 수 있고, 단, HLA 결합은 보존된다 MHC 결합 검정은 당업계에 잘 알려져 있다. 양태에서, 이러한 검정은 시험관내 결합 검정에서 MHC 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자에 대한 결합 친화도의 테스트를 포함할 수 있으며, 이러한 결합 검정은 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 예를 들어, 미국 특허 제7,884,184호 또는 PCT/US2020/020089호에 개시된 가용성 결합 검정을 포함하며, 이들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 추가로, 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열(또는 핵심 서열)을 갖는 완전 기능적 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 임계 잔기 또는 영역, 예컨대 TCR 접촉 잔기에서 돌연변이를 함유하지 않는다.
양태에서, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 TCR 결합 에피토프 (이는 TCR 결합 잔기, TCR 대면 에피토프, TCR 대면 잔기, 또는 TCR 접촉으로 지칭될 수 있음)는 확인된 에피토프의 위치 2, 3, 5, 7, 및 8에 있고, 한편 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 MHC 결합 아그레토프 (이는 MHC 접촉, MHC 대면 잔기, MHC 결합 잔기, 또는 MHC-결합면으로 지칭될 수 있음)는 위치 1, 4, 6, 및 9에 있고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
양태에서, MHC 클래스 I 분자에 결합하는9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 TCR 결합 에피토프는 확인된 에피토프의 위치 4, 5, 6, 7, 및 8에 있고, 한편 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 MHC 결합 아그레토프는 위치 1, 2, 3, 및 9에 있고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
양태에서, MHC 클래스 I 분자에 결합하는 10-mer 확인된 에피토프에 대한 TCR 결합 에피토프는 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 10-mer 단편, 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 10-mer 단편, 또는 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer를 함유하는 10-mer 펩티드일 수 있음)의 위치 4, 5, 6, 7, 8, 및 9에 있고, 한편 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 10-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 10-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 10-mer 단편, 또는 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer를 함유하는 10-mer 펩티드일 수 있음)에 대한 MHC 결합 아그레토프는 위치 1, 2, 3, 9, 및 10에 있고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
양태에서, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 TCR 결합 에피토프는 확인된 에피토프의 위치 2, 3, 5, 7, 및 8 (예를 들어, 그러나 에 제한되지 않는다, 위치 3, 5, 7 및 8; 위치 2, 5, 7, 및 8; 위치 2, 3, 5, 및 7, 등)에서 잔기의 임의의 조합에 있고, 한편 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 MHC 결합 아그레토프는 TCR 대면 잔기에 상보적인 면이고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
양태에서, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 TCR 결합 에피토프는 확인된 에피토프의 위치 4, 5, 6, 7, 및 8; 1, 4, 5, 6, 7 및 8; 또는 1, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8에 있고, 한편 9-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 9-mer 단편일 수 있음)에 대한 MHC 결합 아그레토프는 TCR 대면 잔기에 상보적인 면이고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
양태에서, MHC 클래스 I 분자에 결합하는 10-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 10-mer 단편, 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 10-mer 단편, 또는 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer를 함유하는 10-mer 펩티드일 수 있음)에 대한 TCR 결합 에피토프는 확인된 에피토프의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9에서 잔기의 임의의 조합에 있고, 한편 10-mer 확인된 에피토프 (이는 본원에 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 10-mer 단편 또는 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드의 10-mer 단편, 또는 서열번호: 1-124 중 하나 이상의 9-mer를 함유하는 10-mer 펩티드일 수 있음) 에 대한 MHC 결합 아그레토프는 TCR 대면 잔기에 상보적인 면이고, 둘 모두는 아미노 말단으로부터 계수된다.
상기에 기초하여, 하나 이상의 9-mer 및/또는 10-mer 에피토프가 더 긴 폴리펩티드 내에 포함되고 하나 이상의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자에 결합할 것으로 예측되고 천연 발생 서열(예를 들어, 결합 9-mer 및/또는 10-mer의 각 쌍의 위치 1이 예를 들어, 서로의 3개의 아미노산 내에 있음)에서 서로 매우 근접하게 발생하는 양태에서, 이러한 에피토프는 조합되어 에피토프 클러스터를 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 주어진 클러스터에서, 임의의 주어진 아미노산은 주어진 9-mer 에피토프 또는 10-mer 에피토프에 대해 MHC 대면 및 또 다른 9-mer 에피토프에 대해 TCR 대면일 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시된 폴리펩티드 및 연쇄체 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 개시된 폴리펩티드 및 연쇄체 폴리펩티드의 변이체의 단편을 포함한다. 양태에서, 본원에 사용된 단편은 적어도 약 9개의 인접 아미노산을 포함한다. 양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 T-세포 에피토프의 변이체의 단편을 포함한다. 유용한 단편 (및 본원에 기재된 폴리펩티드 및 연쇄체 폴리펩티드의 변이체 단편)은 생물학적 활성, 특히: MHC 결합 경향 및/또는 TCR 특이성 중 하나 이상을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지하는 것을 포함한다. 생물학적 활성 단편은 예를 들어, 그 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여 약 9, 10, 11, 12, 1, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 개의 아미노산 길이이다. 단편은 별개일 수 있거나(다른 아미노산 또는 폴리펩티드에 융합되지 않음) 더 큰 폴리펩티드 내에 있을 수 있다. 여러 단편이 하나의 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 양태에서, 숙주에서의 발현을 위해 설계된 단편은 폴리펩티드 단편의 아미노 말단에 융합된 이종성 프리- 및 프로-폴리펩티드 영역 및 단편의 카복실 말단에 융합된 추가 영역을 가질 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 본 개시된 폴리펩티드 및 연쇄체 폴리펩티드는 대립유전자 또는 서열 변이체("돌연변이체") 또는 그의 유사체를 포함할 수 있거나, 화학적 변형(예를 들어, 페길화, 글리코실화)을 포함할 수 있다. 양태에서, 돌연변이체는 동일한 기능, 특히 MHC 결합 성향 및/또는 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다. 양태에서, 돌연변이체는 MHC 분자에 대한 향상된 결합을 제공할 수 있다. 양태에서, 돌연변이체는 TCR에 대한 결합을 향상시킬 수 있다. 다른 예에서, 돌연변이체는 MHC 분자 및/또는 TCR에 대한 결합의 감소시킬 수 있다. 또한 결합하지만 TCR을 통한 신호전달을 허용하지 않는 돌연변이체가 고려된다.
본 개시내용의 폴리펩티드를 생산하는 방식은 분자를 구성하는 다양한 요소의 성질에 따라 광범위하게 변할 것이다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그것을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제되거나, 이를 발현하도록 변형된 세포로부터 정제되거나(재조합), 공지된 단백질 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 합성 절차는 간단하고 높은 수율을 제공하며 고도로 정제된 안정한 생성물을 허용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드는 본원에 개시된 핵산으로부터, 또는 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 재조합 기술, 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지된 다른 수단의 사용에 의해 생성될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 그것을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제되거나, 이를 발현하도록 변형된 세포로부터 정제되거나(재조합), 공지된 단백질 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생성된다. 양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드는 적절한 숙주 세포에서 본 개시내용의 재조합 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 발현 카세트 또는 발현 벡터, 숙주 세포에 도입된 발현 카세트 또는 발현 벡터 및 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드로 클로닝된다. 그 다음, 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 계획에 의해 폴리펩티드를 세포로부터 단리할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 프로테아제 소화 및 정제와 같은 생체 외 절차의 조합에 의해 생성될 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 폴리펩티드는 부위 지정 돌연변이유발 기술, 또는 당업계에 공지된 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[James A. Brannigan 및 Anthony J. Wilkinson., 2002, Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. 등, 2012, Protein Engineering Methods and Applications, intechopen.com]를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체)을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산, 뿐만 아니라 본원에 개시된 연쇄체 폴리펩티드로 제한되지 않음)은 이종성 폴리펩티드 (예를 들어 그러나 에 제한되지 않는다, 예를 들어 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 모노 특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 또는 항체-약물 접합체; 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자) 또는 그의 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scFv, 디아바디)로 제한되지 않음)로 제한되지 않음)에 결합되거나, 연결되고/되거나(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨), 그에 삽입될 수 있다. 이전에 설명된 바와 같이, 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프와 관련하여, 용어 "이종성 폴리펩티드"는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프가 이종성 폴리펩티드에 이종성이거나 이종성 폴리펩티드에 자연적으로 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 양태에서, 본 개시된 폴리펩티드(Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드) 중 하나 이상은 (예를 들어, 재조합 기술, 돌연변이유발 또는 당해 분야에서 공지된 다른 수단을 통해) 이종성 폴리펩티드에 삽입될 수 있고, C-말단에 추가될 수 있고/있거나(당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음), 이종성 폴리펩티드의 N-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 추가될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발에 의한 단백질 조작은 부위 지정 돌연변이유발 기술 또는 당업계에 알려진 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson., 2002, Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. 등, 2012, Protein Engineering Methods and Applications, intechopen.com]를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인 내의 아미노산으로 삽입되거나 이를 대체할 수 있다. 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 본 개시내용의 본 개시된 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함한다. "작동적으로 연결된"은 본 개시된 폴리펩티드 및 이종 단백질 중 하나 이상이 프레임 내 융합되거나 화학적으로 연결되거나 달리 결합됨을 나타낸다. 예를 들어, 양태에서, 본 개시된 폴리펩티드 중 하나 이상은 미국 특허 제8,008,453호, 미국 특허 제9,114,175호 및/또는 미국 특허 제10,188,740호(이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인의 하나 이상의 내부 접합 부위(들)에 공유 결합될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드,, 뿐만 아니라 본원에 개시된 연쇄체 폴리펩티드로 제한되지 않음)는 이종성 폴리펩티드에 결합되거나, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 삽입될 수 있지만, 이는 이종성 폴리펩티드의 측접 아미노산과 함께 아미노산 서열에 결합되거나, 연결되고/되거나(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨) 삽입되도록 구성될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드는 소분자 (예를 들어, 알부민 또는 다른 알려진 캐리어 및 단백질), 예를 들어 한정된 HLA에 높은 친화도로 결합하는 약물 또는 약물 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 약물, 또는 약물 단편에 결합되거나 연결될 수 있다 (예를 들어, 프레임 내에서 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 또는 다르게는 결합된다). 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 n-말단 아세틸 및/또는 c-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 폴리펩티드(이는 양태에서, 단리, 합성 또는 재조합일 수 있음)에 관한 것이고, 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에 천연적으로 포함되지 않고/않거나 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에서 그의 천연 위치에 있다. 양태에서, 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프는, 트레지토프가 항체예를 들어, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA), 또는 항체-약물 접합체로 제한되지 않음) 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab scFv, 디아바디, sdAb, 탠덤 scFv로 제한되지 않음) 내에서 그의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 또는 그의 단편이 그러한 트레지토프가 없는 경우 (예를 들어, 특정 항체 또는 그의 단편에는 해당 섹션이 돌연변이되거나 누락되는 경우)에서와 같이 또한 항체 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로(예를 들어, 부위 지향 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 국한되지 않음) 삽입될 수 있다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 전부 또는 일부의 삽입(예를 들어, 트레지토프 또는 그의 단편의 전체 서열을 삽입함)을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 중 일부 또는 전부의 삽입 및 조절 T-세포 에피토프 아미노산의 삽입의 부위에서 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프를 포함하도록 항체 또는 그의 단편의 서열을 돌연변이시키는 것을 포함한다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의한 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 점 돌연변이의 도입이 있으나, 이에 제한되지 않음). 양태에서, 항체 또는 단편으로의 상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 양태에서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 도입하여 서열의 이전 면역원성은 감소되고 새로운 서열의 관용원성은 향상될 것이다. 양태에서, 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 삽입 부위에서 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 항체 또는 그의 단편의 서열로부터 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프가 트레지토프가 정상적으로 발견될 수 있는 상응하는 섹션이 돌연변이되거나 누락된 특정 항체(예를 들어, 인간 IgG 또는 그의 단편)에 삽입되거나 융합되는 양태에서, 상기 삽입 또는 융합은 트레지토프가 정상적으로 존재하는 항체 내 부위에 있다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 내부 서열로서 Fc 도메인에 통합된 하나 이상의 트레지토프를 포함한다. 이러한 내부 서열은 삽입(즉, 기존의 Fc 도메인의 아미노산 사이) 또는 기존의 Fc 도메인 내의 아미노산 교체(즉, 기존의 Fc 도메인 내의 아미노산 제거 및 펩티드 아미노산의 추가)에 의해 첨가될 수 있다. 후자의 경우, 첨가된 펩티드 아미노산의 수는 기존의 Fc 도메인으로부터 제거된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없고; 예를 들어 그리고 제한 없이, 양태에서, 조성물은 천연 Fc 도메인으로부터 제거된 1-21개의 아미노산의 서열과 함께 9-21개의 아미노산의 추가된 내부 서열을 포함할 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호에 개시된 바와 같이 Fc 도메인의 하나 이상의 바람직한 내부 부위에 삽입되거나 대체된다(예를 들어, 전체 또는 부분 대체).
예를 들어, 폴리펩티드는 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 경우, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124(및 단편 또는 변이체) 중 상기 하나 이상은 이의), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산, 및 111-124는 항체 중쇄 가변 영역에서 그의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술과 같은 면역 공학 기술을 사용하지만 이에 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 하나 이상을 포함하는 서열, (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 경우, 서열번호 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 상기 하나 이상 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산은, 항체 중쇄 불변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호 2, 9-11, 29-41, 및 75-100를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 2, 9-11, 29-41, 및 75-100의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술과 같은 면역 공학 기술을 사용하지만 이에 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드 (이는 단리되거나, 합성, 또는 재조합될 수 있음)는 서열번호: 12를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 경우, 상기 서열번호: 12 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산은, 항체 경쇄 가변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 12를 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 12의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 면역 공학 기술 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용으로 제한되지 않음).
양태에서, 폴리펩티드(이는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)는 서열번호: 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 상기 폴리펩티드는 항체 경쇄 불변 영역을 포함하지 않는다. 양태에서, 폴리펩티드가 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 경우, 서열번호: 13 및 101-110 중 상기 하나 이상 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 가지며, 항체 경쇄 불변 영역의 천연 위치에 위치하지 않는다. 양태에서, 서열번호: 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 13 및 101-110의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 트레지토프는, 또한 트레지토프가 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 누락되는 경우 (예를 들어, 특정 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 해당 섹션이 누락되는 경우)와 같이 항체 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편에 융합되거나 내부적으로 삽입될 수 있다(예를 들어, 면역 공학 기술 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술의 사용으로 제한되지 않음).
상기 예에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 전부 또는 일부의 삽입(예를 들어, 트레지토프 또는 그의 단편의 전체 서열을 삽입함)을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 아미노산 중 일부 또는 전부의 삽입 및 조절 T-세포 에피토프 아미노산의 삽입의 부위에서 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것을 포함한다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프를 포함하도록 항체 또는 그의 단편의 서열을 돌연변이시키는 것을 포함한다(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의한 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 점 돌연변이의 도입이 있으나, 이에 제한되지 않음). 양태에서, 항체 또는 단편으로의 상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 양태에서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 도입하여 서열의 이전 면역원성은 감소되고 새로운 서열의 관용원성은 향상될 것이다. 양태에서, 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 삽입 부위에서 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 항체 또는 그의 단편의 서열로부터 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프가 트레지토프가 정상적으로 발견될 수 있는 상응하는 섹션이 돌연변이되거나 누락된 특정 항체(예를 들어, 인간 IgG 또는 그의 단편)에 삽입되거나 융합되는 양태에서, 상기 삽입 또는 융합은 트레지토프가 정상적으로 존재하는 대상체 자신의 항체 내 부위에 있다. 양태에서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시킨다.
양태에서, 변형된 트레지토프 펩티드를 생성하기 위해 반응성 모이어티를 트레지토프 펩티드에 부착시킴으로 변형된 본원에 기재된 바와 같은 트레지토프 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않음)을 포함하고, 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티는 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호, 및 미국 특허 제7,307,148호 (이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이, 혈액 성분 상의 반응성 작용기와 결합을 형성할 수 있고, 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티와 혈액 성분 상의 반응성 작용기 사이의 결합 형성 시, 트레지토프-혈액 성분 접합체가 형성된다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 원래 생물학적 활성의 전부 또는 대부분을 유지한다. 양태에서, 하나 이상의 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티와 혈액 성분 사이에 형성된 결합은 공유 결합이다. 양태에서, 트레지토프 펩티드 서열은 서열번호: 1-124, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로부터 독립적으로 선택된다.
트레지토프-혈액 성분 접합체는 생체 내에서 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드의 반감기를 연장하고, 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드를 급격한 단백분해로부터 보호하고, 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드를 순환으로부터의 신속한 청소능 및/또는 신속한 신장 배출로부터 보호하고, 대상체의의 몸 전체에 트레지토프-혈액 성분 접합체의 광범위한 분포를 허용하고, 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드를 적절한 면역 세포(예를 들어, 대식세포 및 APC)로 전달하는 것을 돕고, 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 특정 면역 세포 (예컨대 대식세포 및 APC)의 세포내이입 경로에 의해 처리되도록 하고/하거나 상기 면역 세포에 의한 항원으로서 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드의 제시를 돕는다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체는 운반 단백질(예를 들어, 알부민)로서 작용하는 혈액 성분을 포함하고, 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 상기 변형된 폴리펩티드는 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프("트레지토프"로 지칭됨)를 포함한다. 변형된 폴리펩티드는 폴리펩티드에 부착된 반응성 모이어티를 포함하며, 반응성 모이어티는 혈액 성분 상의 반응성 작용기와 결합(예를 들어, 공유 결합)을 형성할 수 있다. 트레지토프-혈액 성분 접합체는 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호, 및 미국 특허 7,307,148호(이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 반응성 모이어티를 폴리펩티드에 부착하여 변형된 폴리펩티드를 생성한 다음, 혈액 성분 상의 반응성 작용기를 갖는 변형된 폴리펩티드의 반응성 모이어티 사이에 결합을 형성함으로써 트레지토프를 포함하는 폴리펩티드를 변형함으로써 형성될 수 있다. 전술한 트레지토프-혈액 성분 접합체 및 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드의 양태에서, 트레지토프를 포함하는 트레지토프-혈액 성분 접합체 및 변형된 폴리펩티드는 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 혈액 성분은 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이 고정되거나 이동될 수 있다. 고정 혈액 성분은 움직이지 않는 혈액 성분이며 조직, 막 수용체, 사이질 단백질, 피브린 단백질, 콜라겐, 혈소판, 내피 세포, 상피 세포 및 그것의 연관된 막 및 막성 수용체, 체세포 바디 세포, 골격 및 평활근 세포, 뉴런 성분, 골세포 및 파골세포 및 모든 신체 조직, 특히 순환 및 림프계와 연관된 것들을 포함한다. 이동 혈액 성분은 일반적으로 5분을 초과하지 않고 일반적으로 1분을 초과하지 않는 장기간 동안 고정된 위치를 갖지 않는 혈액 성분이다. 이러한 혈액 성분은 막과 연관되지 않고 연장된 기간 동안 혈액에 존재하며 최소 0.1 μg/ml의 농도로 존재한다. 이동 혈액 성분에는 혈청 알부민, 트랜스페린, 페리틴 및 면역글로불린 예컨대 IgM 및 IgG가 포함된다. 이동 혈액 성분의 반감기는 적어도 약 12시간이다. 트레지토프-혈액 성분 접합체의 양태에서, 혈액 성분은 알부민, 예컨대 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 알부민, 및 재조합 인간 혈청 알부민이다. 알부민은 트레지토프-알부민 접합체를 대식세포 및 APC와 같은 적절한 세포로 운반하는 Fc 신생아 결합 도메인을 포함하기 때문에 바람직한 혈액 성분이다. 또한, 알부민은 아미노산 34(Cys34)(인간 세린 알부민의 아미노산 서열에서 아미노산의 위치)에 시스테인을 함유하고, pKa가 약 5인 유리 티올을 함유하며, 이는 알부민의 바람직한 반응성 작용기로 역할을 할 수 있다. 알부민의 Cys34는 변형된 트레지토프 펩티드의 바람직한 반응성 모이어티인 말레이미도프로피온아미도(MPA)와 안정한 티오에스테르 결합을 형성할 수 있다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 혈액 성분 또는 본 개시된 변형된 폴리펩티드와 접합체를 형성할 수 있는 혈액 성분에 대한 반응성 작용기는 이동성 및 고정 단백질을 포함한 혈액 성분 상의 기로서 변형된 치료적 펩티드의 반응성기가 반응하여 공유 결합을 형성한다. 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이, 이러한 작용기는 일반적으로 에스테르 반응성 기에 결합하기 위한 하이드록실 기, 말레이미드, 이미데이트 및 티오에스테르기에 결합하기 위한 티올 기; 활성화된 카복실, 포스포릴 또는 반응성 기 상의 다른 아실 기에 결합하기 위한 아미노 기를 포함한다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 아미노 기, 하이드록실 기 또는 티올 기이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 폴리펩티드 및/또는 단백질 내의 아미노산 측면 기의 성분이고, 반응성 작용기는 폴리펩티드 및/또는 단백질의 표면 근처에 있다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 단백질성 혈액 성분의 유리 시스테인 잔기의 티올 기이다. 양태에서, 반응성 작용기는 세린 알부민의 아미노산 34(Cys34)에 있는 시스테인의 유리 티올 기이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 약 5의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 약 5.5의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 3 내지의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 티올레이트 음이온이다. 양태에서, 반응성 작용기는 세린 알부민의 아미노산 34(Cys34)에 있는 시스테인의 티올레이트 음이온이다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 변형된 폴리펩티드 및 트레지토프-혈액 성분 접합체를 형성하는 데 사용된 변형된 폴리펩티드는 폴리펩티드에 부착된 반응성 모이어티를 포함하며, 반응성 모이어티는 혈액 성분 상의 반응성 작용기와 결합(예를 들어, 공유 결합)을 형성할 수 있다. 양태에서, 반응성 기는 혈액 성분 상의 아미노 기, 하이드록실 기 또는 티올 기와 반응하여 이들과 공유 결합을 형성할 수 있다. 양태에서, 반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드가 혈액 성분에 결합될 때 변형된 펩티드가 모 화합물의 활성의 상당한 비율을 유지하도록 하는 부위에 배치된다. 양태에서, 반응성 모이어티는 석신이미딜 또는 말레이미도 기일 수 있다. 양태에서, 반응성 모이어티는 변형될 폴리펩티드의 아미노산의 덜 치료적으로 활성인 영역에 위치한 아미노산에 부착될 수 있다. 양태에서, 반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산에 부착된다. 양태에서, 반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 카복시 말단 아미노산에 부착된다. 양태에서, 반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산과 카복시 말단 아미노산 사이에 위치하는 아미노산에 부착된다. 양태에서, 반응성 기는 연결 기를 통해, 또는 선택적으로 연결 기를 사용하지 않고 폴리펩티드(변형될)에 부착될 수 있다. 추가로, 하나 이상의 추가 아미노산(예를 들어, 하나 이상의 라이신)이 반응성 기의 부착을 용이하게 하기 위해 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 연결 기는 혈액 성분의 반응성 기를 하나 이상의 트레지토프를 포함하는 폴리펩티드에 연결하거나 접속시키는 화학적 모이어티이다. 연결 기는 하나 이상의 알킬 기, 알콕시 기, 알케닐 기, 알키닐 그룹 또는 아미노 기를 포함할 수 있고, 이는 알킬 기, 사이클로알킬 기, 다환형 기, 아릴 기, 폴리아릴 기, 치환된 아릴 기, 복소환 기, 및 치환된 복소환 기에 의해 치환된다. 연결 기는 또한 폴리 에톡시 아미노산 예컨대 AEA ((2-아미노)에톡시 아세트산) 또는 바람직한 연결 기 AEEA ([2-(2-아미노)에톡시)]에톡시 아세트산)을 포함할 수 있다. 양태에서, 연결 기는 폴리에틸렌글리콜 링커(예를 들어, PEG2 또는 PEG12로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.
이해되어야 하는 바와 같이, 변형된 폴리펩티드는 혈액 성분과의 접합이 생체 내에서 일어나도록 생체 내 투여될 수 있거나, 또는 이들이 시험관내에서 혈액 성분에 먼저 접합되고 생성된 펩티다제-안정화 폴리펩티드가 생체 내 투여될 수 있다. 또한, 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이, 펩티다제-안정화 폴리펩티드는 연결 기가 있거나 없이 변형된 펩티드의 반응성 기와 혈액 성분의 작용기 사이에 형성된 공유 결합을 통해 혈액 성분에 접합되는 변형된 폴리펩티드이다. 이러한 반응은 바람직하게는 이동 혈액 단백질 예컨대 혈청 알부민 또는 IgG 상의 티올 기에 대한 말레이미드 연결 (예를 들어 GMBS, MPA 또는 다른 말레이미드로부터 제조됨)로 변형된 폴리펩티드의 공유 결합에 의해 확립된다. 펩티다제 안정화 폴리펩티드는 비 안정화 펩티드보다 생체 내 펩티다제의 존재하에서 더 안정하다. 펩티다제 안정화 치료적 펩티드는 일반적으로 동일한 서열의 비-안정화 펩티드와 비교하여 적어도 10-50%의 증가된 반감기를 갖는다. 펩티다제-안정성은 혈청 또는 혈액에서 변형되지 않은 치료적 펩티드의 반감기를 혈청 또는 혈액에서 변형된 대응 치료적 펩티드의 반감기와 비교함으로써 결정된다. 반감기는 변형된 펩티드와 비-변형된 펩티드를 투여한 후 혈청 또는 혈액을 샘플링하고 펩티드의 활성을 측정하여 결정한다. 활성을 결정하는 것 외에도, 치료적 펩티드의 길이도 측정할 수 있다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 변형된 폴리펩티드 및 트레지토프-혈액 성분 접합체를 형성하기 위해 사용된 변형된 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 트레지토프를 포함한다. 양태에서, 변형된 폴리펩티드의 하나 이상의 트레지토프는 본원에 본질적으로 개시된 바와 같은 서열번호: 1-124 중 하나 이상 (및 그의 단편 및 변이체)을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는다. 양태에서, 변형된 폴리펩티드의 하나 이상의 트레지토프는 N 및/또는 C 말단에 인접하여 선택적으로 절단 민감 부위일 수 있는 하나 이상의 링커를 선택적으로 가질 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩티드에서, 트레지토프 중 2개 이상이 그들 사이에 절단 민감 부위를 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 트레지토프는 서로 직접 연결되거나 절단 민감 부위가 아닌 링커를 통해 연결될 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프 및/또는 그 안에 함유된 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드는 중성(비하전) 또는 염 형태일 수 있고, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변형이 없거나 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 트레지토프 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 변형된 폴리펩티드는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다. 양태에서, 변형된 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 트레지토프는 N-말단 아세틸 및/또는 C-말단 아미노 기로 캡핑될 수 있다.
양태에서, 변형된 트레지토프와 트레지토프-혈액 성분 접합체를 형성하는 혈액 성분은 알부민이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 아미노 기, 하이드록실 기 또는 티올 기이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 폴리펩티드 및/또는 단백질 내의 아미노산 측면 기의 성분이고, 반응성 작용기는 폴리펩티드 및/또는 단백질의 표면 근처에 있다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 작용기는 단백질성 혈액 성분의 유리 시스테인 잔기의 티올 기이다. 양태에서, 반응성 작용기는 세린 알부민의 아미노산 34(Cys34)에 있는 시스테인의 유리 티올 기이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 약 5의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 약 5.5의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 혈장과 같은 생리학적 환경에서 3 내지의 pKa를 갖는 티올이다. 양태에서, 혈액 성분의 반응성 기능은 티올레이트 음이온이다. 양태에서, 반응성 작용기는 세린 알부민의 아미노산 34(Cys34)에 있는 시스테인의 티올레이트 음이온이다.
양태에서, 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티는 연성 친전자체이다. 양태에서, 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티는 티올에 대해 선택적인 친전자체이다. 바람직한 구체예에서, 변형된 트레지토프 펩티드를 생성하기 위해 트레지토프에 부착된 반응성 모이어티는 말레이미드이다. 양태에서, 반응성 모이어티는 말레이미드 프로피온산이다. 바람직한 구현예에서, 변형된 트레지토프 펩티드에 부착된 반응성 모이어티는 말레이미드이고, 혈액 성분은 알부민이며, 알부민 상의 반응성 작용기는 알부민의 Cys34의 유리 티올 또는 티올레이트 음이온이다. 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티가 말레이미드이고, 혈액 성분이 알부민이고, 알부민의 반응성 작용기가 알부민의 Cys34의 유리 티올 또는 티올레이트 음이온인 경우, 말레이미드 기와 설프하이드릴 사이에 안정한 티오에스테르 결합이 형성되고, 이 결합은 생리적 조건 하에 절단될 수 없다. 양태에서, 변형된 트레지토프 펩티드는 링커를 함유하고, 여기서 반응성 모이어티는 링커를 통해 트레지토프 펩티드에 부착된다. 양태에서, 변형된 트레지토프 펩티드는 1:1 몰비로 혈액 성분에 결합한다.
본 개시내용의 변형된 트레지토프 펩티드를 생산하는 방식은 분자를 구성하는 다양한 요소의 성질에 따라 광범위하게 변할 것이다. 합성 절차는 간단하고 높은 수율을 제공하며 고도로 정제된 안정한 생성물을 허용하도록 선택될 수 있다. 일반적으로 반응성 모이어티는 카복실 기와 함께 마지막 단계로 생성되며 활성 에스테르를 형성하기 위한 에스테르화는 합성의 마지막 단계가 된다.
양태에서, 본 개시내용은 또한 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이 변형된 트레지토프 펩티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 방법은 다음 단계를 포함한다. 제1 단계에서, 폴리펩티드의 하나 이상의 트레지토프 서열은 본질적으로 본원에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 제2 단계에서, 폴리펩티드가 시스테인을 함유하지 않는 경우, 폴리펩티드는 카복시 말단 아미노산으로부터 합성될 수 있고 반응성 모이어티는 카복시 말단 아미노산에 첨가된다. 대안적으로, 말단 라이신 (또는 하나 이상의 라이신)은 카복시 말단 아미노산에 첨가될 수 있고 반응성 모이어티는 말단 라이신에 첨가된다. 제3 단계에서, 폴리펩티드가 단 하나의 시스테인을 함유하는 경우, 폴리펩티드의 덜 치료적으로 활성인 영역의 아미노산에 반응성 모이어티를 첨가하기 전에 시스테인을 보호기와 반응시킨다. 제4 단계에서, 폴리펩티드가 이황화 가교로서 2개의 시스테인을 함유하는 경우, 2개의 시스테인이 산화되고 반응성 모이어티는 아미노 말단 아미노산, 카복시 말단 아미노산, 또는 폴리펩티드의 카복시 말단 아미노산 및 아미노 말단 아미노산 사이에 위치한 아미노산에 첨가된다. 제5 단계에서, 폴리펩티드가 이황화 가교로서 2개 이상의 시스테인을 함유하는 경우, 시스테인은 이황화 가교에서 순차적으로 산화되고 펩티드는 카복시 말단 아미노산에 반응성 모이어티을 첨가하기 전에 정제된다.
양태에서, 본 개시내용은 또한 트레지토프-혈액 성분 접합체를 합성하는 방법에 관한 것이다. 제1 단계에서, 반응성 말레이미도프로피온아미도(MPA)는 하나 이상의 트레지토프를 포함하는 폴리펩티드 상의 N-말단 라이신을 통해 첨가되어 변형된 폴리펩티드를 생성한다. 양태에서, 하나 이상의 라이신은 폴리펩티드의 N-말단에 존재하고, 선택적으로 본원에 개시된 서열번호: 1-124의 군으로부터 선택된 트레지토프 서열의 N-말단에 존재한다. 선택적으로, PEG2 또는 PEG12와 같은 폴리에틸렌글리콜 링커는 하나 이상의 라이신과 트레지토프 서열 사이, 또는 트레지토프 서열의 N-말단에 존재한다. 양태에서, 발린 및 시트룰린으로 선택적으로 이루어지는 (순차적으로 N-말단에서 C-말단으로) 카텝신 B 부위와 같은 리소좀 절단 부위가 PEG2 또는 PEG12 모이어티와 트레지토프 서열 사이에 존재한다. 리소좀 절단 부위(예를 들어, 카텝신 B 부위)는 리소좀 프로테아제 부위를 제공하기 위해 통합되어 트레지토프가 리소좀 구획으로 방출되도록 할 수 있다. 양태에서, 리소좀 절단 부위(예를 들어, 카텝신 B 부위)가 존재하여 리소좀 프로테아제 부위를 제공하여, 트레지토프가 세포 내로, 바람직하게는 초기 엔도좀 내로 방출되도록 한다. 바람직한 구현예에서, 리소좀 절단 부위(예를 들어, 카텝신 B 부위)가 존재하여 리소좀 프로테아제 부위를 제공하여, 트레지토프가 세포, 예를 들어 막으로 둘러싸인 소포(예를 들어, 초기 엔도좀, 후기 엔도솜 또는 리소좀)로 방출하여, 트레지토프가 항원 제시를 위해 처리될 수 있도록 한다. 양태에서, 트레지토프는 대식세포 또는 항원 제시 세포와 같은 면역 세포에 의해 항원으로 제시되며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 항원으로 제시된다. 양태에서, 발린 및 시트룰린으로 선택적으로 이루어지는 (순차적으로 N-말단에서 C-말단으로) 카텝신 B 부위와 같은 리소좀 절단 부위가 PEG12 모이어티와 트레지토프 서열 사이 및/또는 하나 이상의 트레지토프의 사이에 존재한다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프가 작제물 상에 존재할 수 있고, 선택적으로 링커보다 C-말단에 더 근접할 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 리소좀 절단 부위가 다중 트레지토프 사이에 존재한다(예를 들어, 단일 리소좀 절단 부위가 2개의 트레지토프를 분리하거나, 하나의 리소좀 절단 부위가 제1 및 제2 트레지토프 사이에 존재하고, 또 다른 리소좀 절단 부위는 제2와 제3 트레지토프 사이에 존재하는 하도록 한다). 양태에서, 노르류신(Nle) 잔기는 예를 들어 질량 분광분석에 의한 평가를 위해 최종 트레지토프-혈액 성분 접합체에 혼입된 트레지토프 펩티드의 양을 정량하기 위한 수단으로서 C-말단에 존재한다. 양태에서, 폴리펩티드의 C-말단은 c-말단 아미노 기로 캡핑된다. 제2 단계에서, 말레이미드 기반 화학은 변형된 폴리펩티드를 1:1 몰비로 혈액 성분, 바람직하게는 혈청 알부민에 공유적으로 연결하는 데 사용된다. 제2 단계는 하기 및 본 개시내용의 실시예에서 추가로 기재된 바와 같이 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 형성은 생체 내에 존재하는 경우, 펩티다제에 의한 신속한 분해, 순환으로부터의 신속한 청소능 및/또는 신속한 신장 배출로부터 트레지토프를 보호한다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 형성은 생체 내 트레지토프의 반감기를 상당히 연장시킨다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체의 형성은 대상체의 신체 전체에 걸쳐 트레지토프-혈액 성분 접합체의 광범위한 분포를 허용한다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체는 대상체의 혈장에 존재할 때 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않는다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체는 트레지토프를 대식세포 및/또는 항원 제시 세포(APC)와 같은 적절한 면역 세포로 전달하는 데 도움이 된다. 양태에서, 트레지토프가 대식세포 및/또는 APC와 같은 적절한 면역 세포에 전달되면, 트레지토프는 막 결합 소포, 바람직하게는 초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 리소좀과 같은 세포내이입 경로의 소포에 포괄된다. 양태에서, 트레지토프는, 대식세포 및/또는 APC와 같은 적절한 면역 세포에 의해 일단 처리되면 MHC 클래스 II 항원으로 제시된다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 최대 12시간의 생체 내 혈장 반감기를 갖는다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 최대 1일의 생체 내 혈장 반감기를 갖는다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 최대 40 내지 48시간의 생체 내 혈장 반감기를 갖는다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 최대 60시간의 생체 내 혈장 반감기를 갖는다. 양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체 내의 트레지토프는 최대 15일의 생체 내 혈장 반감기를 갖는다.
양태에서, 하나 이상의 트레지토프를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 대상체에게 투여되고, 여기서 투여시, 변형된 폴리펩티드는 생체 내에서 순환 혈액 성분의 반응성 작용기와 반응한다. 양태에서, 펩티드는 인간 대상체에게 투여되고, 혈액 성분은 인간 알부민, 바람직하게는 인간 대상체의 순환 알부민이다.
양태에서, 트레지토프-혈액 성분 접합체를 형성하기 위해 사용된 변형된 폴리펩티드는 생체 외에서 혈액 성분 상의 반응성 작용기와 결합을 형성할 수 있으며, 여기서 변형된 폴리펩티드의 반응성 모이어티와 혈액 성분 상의 반응성 작용기 사이의 결합 형성 시, 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이 트레지토프-혈액 성분 접합체가 형성된다. 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 폴리펩티드는 신체 외부의 혈액 성분의 반응성 작용기에 공유 부착되도록 구성된다. 양태에서, 혈액 성분은 알부민이다. 양태에서, 혈액 성분은 재조합 알부민, 인간 재조합 알부민, 및 게놈 공급원으로부터의 알부민의 군으로부터 선택된다.
양태에서, 본 개시내용은 또한 미국 특허 제6,849,714호, 미국 특허 제6,887,470호, 미국 특허 제7,256,253호 및 미국 특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이 변형된 트레지토프 펩티드 및 트레지토프-혈액 성분 접합체를 합성하는 방법에 관한 것이다. 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 폴리펩티드는 변형된 치료적 펩티드와 혈액 성분 사이의 공유 결합 형성을 허용하기 위해 인간 혈청 알부민을 함유하는 혈액, 혈청 또는 식염수에 첨가된다. 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 트레지토프를 포함하는 폴리펩티드는 말레이미드로 변형되고 이는 식염수에서 혈청 알부민과 반응한다. 양태에서, 일단 변형된 폴리펩티드가 혈액 성분과 반응하여 트레지토프-혈액 성분 접합체를 형성하면, 접합체가 대상체에게 투여될 수 있다. 양태에서, 변형된 폴리펩티드가 혈액 성분과 반응하여 접합체를 형성한 후, 그러나 접합체가 대상체에게 투여되기 전에, 접합체는 반응 혼합물에서 접합되지 않은 혈액 성분으로부터 분리될 수 있다. 양태에서, 접합체는 비하전 매트릭스에 고정된 소수성 리간드와의 소수성 상호작용의 다양한 강도에 기초하여 물질을 분리함으로써 반응 혼합물에서 비-접합 혈액 성분으로부터 분리될 수 있다. 양태에서, 비하전 매트릭스는 소수성 고체 지지체일 수 있으며, 여기서 지지체는 옥틸 세파로스, 페닐 세파로스 및 부틸 세파로스와 같은 소수성 수지를 함유하지만 이에 제한되지 않는 컬럼을 포함한다. 양태에서, 이 기술은 시작 완충액(염 촉진 흡착)에서 적당히 높은 농도의 염(
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1M)으로 수행될 수 있다. 용출은 염 농도의 선형 또는 단계적 감소에 의해 달성된다. 리간드 유형, 치환도, pH, 흡착 단계에서 사용되는 염의 유형 및 농도는 HIC 매트릭스 (소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스)의 전체 성능(예를 들어, 선택성 및 용량)에 중대한 영향을 미친다.
용매는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에서 용량과 선택성에 영향을 미치는 가장 중요한 파라미터 중 하나이다. 일반적으로 흡착 공정은 탈착 공정보다 선택성이 높다. 따라서 pH, 용매 유형, 염 유형 및 염 농도와 관련하여 시작 완충액을 최적화하는 것이 중요하다. 샘플에 다양한 "염석" 염을 추가하면 HIC에서 리간드-단백질 상호작용이 촉진된다. 염의 농도가 증가함에 따라, 결합된 단백질의 양이 단백질의 침전점까지 증가한다. 각 유형의 염은 소수성 상호작용을 촉진하는 능력이 다르다.
염석 효과를 높이면 소수성 상호 작용이 강화되고 무질서유발 효과가 증가하면 소수성 상호 작용이 약해진다. 염석 효과가 큰 염의 예는 염석 효과가 큰 것부터 염석 효과가 작은 것 순으로 나열하면 하기를 포함한다: PO4　3-, SO4　2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3　-, ClO4　-, I-, 및 SCN-. 무질서유발 효과가 큰 염의 예는 무질서유발 효과가 큰 것부터 무질서유발 효과가 작은 것 순으로 나열하면 하기를 포함한다: NH4　+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2 +, 및 Ba2 +. HIC에 가장 일반적으로 사용되는 염은 황산암모늄 ((NH4)2SO4), 황산나트륨 ((Na)2SO4)), 황산마그네슘 (MgSO4), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 및 아세트산암모늄 (CH3COONH4)이다.
HIC 흡착제에 대한 단백질 결합은 중간에서 높은 농도의 "염석" 염에 의해 촉진되며, 이들 대부분은 또한 천연 구형 단백질로부터 우선적으로 배제되기 때문에 단백질 구조에 안정화 영향을 미치고, 즉, 염과 단백질 표면 사이의 상호작용이 열역학적으로 불리하다. 염 농도는 리간드-단백질 상호작용을 촉진할 수 있을 만큼 충분히 높아야 하지만(예를 들어, 500-1000mM), 샘플에서 단백질의 침전을 유발하는 농도보다 낮아야 한다. 알부민의 경우, 염 농도는 3M(몰/리터) 미만으로 유지해야 한다. 염석의 원리 메커니즘은 염수로 인한 물의 표면 장력 증가로 구성된다(Melander 및 Horvath, 1977). 따라서 조밀한 구조는 더 작은 단백질-용액 계면 영역에 해당하므로 에너지적으로 더 유리하다. 이러한 조건, 예를 들어 SO4 2-, PO4 2-　또는 CH3COO-로 구성된 완충제와 임의의 반대 이온으로 구성된 완충액 하에, 이러한 염은 비-접합 알부민과 다른 방식으로 본질적으로 모든 접합 알부민(예를 들어, 시스테인으로 캡핑된 머캅트 알부민 및 알부민)에 대해 염석 효과를 나타내고, 따라서 접합 알부민 대 비-접합 알부민 간의 일관된 크로마토그래피 분리를 가능하게 한다. 따라서, 리간드와 비-접합 알부민 사이보다 리간드와 접합 알부민 사이의 상호작용을 촉진하기 위해 더 낮은 농도의 염이 필요하다. 이 크로마토그래피 분리는 본질적으로 (a) 알부민의 서열(예를 들어, 인간, 마우스, 쥐 등), (b) 알부민의 공급원(즉, 혈장 유래 또는 재조합), (c) 접합된 변형된 트레지토프의 분자량, (d) 분자 구조 내의 반응성 모이어티의 위치, (e) 분자의 펩티드 서열 또는 화학 구조, 및 (f) 접합된 분자의 3차원 구조(예를 들어, 선형 대 루프 구조)와 독립적이다.
양태에서, 수성 완충제의 염은 충분한 염석 효과를 갖는다. 양태에서, 충분한 염석 효과를 제공하기 위해, 염은 포스페이트, 설페이트 및 아세테이트일 수 있다. 양태에서, 완충제의 양이온의 선택은 NH4　+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2 +　및 Ba2 +로 이루어진 군으로부터 제한 없이 선택될 수 있다. 양태에서, 수성 완충제는 인산암모늄, 황산암모늄 및 인산마그네슘의 군으로부터 선택될 수 있다. 양태에서, 완충액 pH는 3.0 내지 9.0이고; 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 더욱 더 바람직하게는 pH는 7.0이다. 양태에서, 완충액 및 소수성 고체 지지체는 실온(약 25℃) 또는 4℃ 또는 그 사이에 있다.
양태에서, 본 개시내용은 또한 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 제공한다. 양태에서, 본 개시내용은 본 개시된 트레지토프 중 하나 이상이 그의 일부인 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물(이는 양태에서, 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)을 제공한다. 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, 이종성 항체 (이는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자 또는 그의 항원 특이적 항체 단편 (Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함하지만 이에 제한되지 않음)일 수 있음)로 제한되지 않음)에 결합되거나, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그에 삽입된 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 (Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)를 포함한다. 이전에 설명된 바와 같이, 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프와 관련하여, 용어 "이종성 폴리펩티드"는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프가 이종성 폴리펩티드에 이종성이거나 이종성 폴리펩티드에 자연적으로 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 양태에서, 본 개시된 폴리펩티드(Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드) 중 하나 이상은 (예를 들어, 재조합 기술, 돌연변이유발 또는 당해 분야에서 공지된 다른 수단을 통해) 이종성 폴리펩티드에 삽입될 수 있고, C-말단에 추가될 수 있고/있거나(당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음), 이종성 폴리펩티드의 N-말단 (당업계에 공지된 바와 같이 링커의 사용이 있거나 없음)에 추가될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발에 의한 단백질 조작은 부위 지정 돌연변이유발 기술 또는 당업계에 알려진 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[James A. Brannigan 및 Anthony J. Wilkinson., 2002, Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. 등, 2012, Protein Engineering Methods and Applications, intechopen.com]를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
상기 단리된, 합성, 또는 재조합 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드(Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)는 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 서열을 갖는다. 본 개시된 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드는 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진다. 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 트레지토프는 전체적으로 이종성 폴리펩티드에 결합, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그 내로 삽입될 수 있지만, 이종성 폴리펩티드의 측접 아미노산과 함께 아미노산 서열에 결합되거나, 연결된(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨) 및/또는 그 내에 삽입된 것으로 구성될 수 있다. 양태에서, 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 본 개시내용의 서열번호: 1-124 (및/또는 그의 단편 또는 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산) 중 하나 이상을 포함하는 서열을 가지며, 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에 천연적으로 포함되지 않고/않거나 서열번호: 1-124 중 상기 하나 이상은 폴리펩티드에서 그의 천연 위치에 있다. 양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프는 폴리펩티드에 결합되고, 연결(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨)되고/되거나 그에 삽입될 수 있다. 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 트레지토프에 실질적으로 상동이 아닌 아미노산 서열을 갖는 이종성 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 본 개시된 트레지토프 중 하나 이상을 포함한다. 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 트레지토프 그 자체의 기능에 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 트레지토프 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST-융합 폴리펩티드일 수 있다. 다른 유형의 융합 폴리펩티드는 효소적 융합 폴리펩티드, 예를 들어 베타-갈락토시다제 융합, 효모 2-하이브리드 GAL 융합, 폴리-His 융합 및 Ig 융합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 융합 폴리펩티드, 특히 폴리-His 융합 또는 친화성 태그 융합은 재조합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 할 수 있다. 특정 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 숙주 세포)에서, 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비는 이종 신호 서열을 사용함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 N-말단에 이종 신호 서열을 함유한다. 상기 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 이종성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 양태에서, 생물학적 활성 분자는 면역원성 분자, T 세포 에피토프, 바이러스 단백질, 및 박테리아 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 중 하나 이상은 소분자, 약물, 또는 약물 단편에 결합되거나 연결될 수 있다(예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합됨). 예를 들어, 본 개시내용의 서열번호: 1-124 중 하나 이상 (및/또는 그의 단편 또는 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산)은 HLA에 높은 친화도로 결합하는 약물 또는 약물 단편에 결합되거나 연결될 수 있다 (예를 들어, 프레임 내 융합되거나, 화학적으로 연결되거나, 달리 결합된다). 상기 기재된 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물의 양태에서, 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 재조합, 단리 및/또는 합성일 수 있다.
키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물은 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 단편은 통상적인 기술에 따라 인-프레임으로 함께 결찰될 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 단편의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 2개의 연속적인 핵산 단편 사이에 상보적인 오버행을 생성하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행할 수 있으며, 이는 후속적으로 어닐링되고 키메라 핵산 서열을 생성하기 위해 재증폭될 수 있다 (Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, (2ND, 1992), FM Asubel 등 (eds), Green Publication Associates, New York, NY (Publ), ISBN: 9780471566355, 그 전체가 참고로 본원에 포함됨). 추가로, 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드(Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)(예를 들어, 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 서열을 갖는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프)은 이종성 폴리펩티드 내로 삽입되거나, 폴리펩티드의 비-천연 발생 위치에 삽입되거나, 또는 재조합 기술, 합성 중합 기술, 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지된 다른 표준 기술을 통해 트레지토프를 포함하지 않는 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발에 의한 단백질 조작은 부위 지정 돌연변이유발 기술 또는 당업계에 알려진 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[James A. Brannigan 및 Anthony J. Wilkinson., 2002, Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 964-970; Turanli-Yildiz B. 등, 2012, Protein Engineering Methods and Applications, intechopen.com]를 참조하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 이전에 설명된 바와 같이, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제7,442,778호, 미국 특허 제7,645,861호, 미국 특허 제7,655,764호, 미국 특허 제7,655,765호 및/또는 미국 특허 제7,750,128호(각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인 내의 아미노산으로 삽입되거나 이를 대체할 수 있다. 양태에서, 하나 이상의 트레지토프는 미국 특허 제8,008,453호, 미국 특허 제9,114,175호 및/또는 미국 특허 제10,188,740호(이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인의 하나 이상의 내부 접합 부위(들)에 공유 결합될 수 있다.
양태에서, 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 균질하게 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 그러나, T-세포 에피토프 화합물 및 조성물이 균질하게 정제되지 않은 제제가 유용한 것으로 이해된다. 중요한 특징은 제제가 상당한 양의 다른 성분이 존재하는 경우에도 조성물의 원하는 기능을 허용한다는 것이다. 따라서, 본 개시내용은 다양한 정도의 순도를 포함한다. 한 구현예에서, "실질적으로 세포 물질이 없는"이라는 언어는 약 30% (건조 중량 기준) 미만의 다른 단백질 (예를 들어, 오염 단백질), 약 20% 미만의 다른 단백질, 약 10% 미만의 다른 단백질, 약 5% 미만의 다른 단백질, 약 4% 미만의 다른 단백질, 약 3% 미만의 다른 단백질, 약 2% 미만의 다른 단백질, 약 1% 미만의 다른 단백질, 또는 그 사이의 임의의 값 또는 범위를 갖는 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드의 제제를 포함한다.
양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드가 재조합적으로 생산되는 경우, 조성물은 또한 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있으며, 예를 들어 배양 배지는 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드 제제의 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만을 나타낸다. "화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"이라는 용어에는 T-세포 에피토프의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질로부터 단리된 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 키메라 또는 융합 폴리펩티드의 제제가 포함된다. 용어 "화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"은 예를 들어, 약 30%(건조 중량 기준) 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 20% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 10% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 5% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 4% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 3% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 약 2% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질, 또는 약 1% 미만의 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 갖는 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및 키메라 또는 융합 폴리펩티드의 제제를 포함할 수 있다
양태에서, 본 개시내용은 또한 조절 T-세포 에피토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 (이는 양태에서 단리되거나, 합성, 및/또는 재조합일 수 있음) 중 하나 이상을 포함)의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 염"은 약제학적으로 허용되고 모 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드)의 원하는 약리학적 활성을 유지하는 염을 의미한다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 개시된 폴리펩티드, 연쇄체 폴리펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드의 유도체를 말하며, 여기서 이러한 화합물은 그의 산 또는 염기 염을 만들어 변형된다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기 산 염 또는 유기 산 염, 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 통상적인 무독성 염 또는 예를 들어 무독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 모 화합물의 사차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 무독성 염은 [0001] 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시에탄 설폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 바이카본산, 카본산, 시트르산, 에데트산, 에탄 디설폰산, 1,2-에탄 설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 글리콜리아르사닐산, 헥실레조르신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토바이온산, 라우릴 설폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 나프사일릭산, 질산, 옥살산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리사이클릭산, 스테아르산, 서브아세트산, 석신산, 설팜산, 설파닐산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 톨루엔 설폰산, 및 통상적으로 발생 아민 산, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 아르기닌 등으로부터 선택된 무기 및 유기 산으로부터 유래된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산
양태에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같이 본 개시내용의 하나 이상의 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA (cDNA, RNA (예컨대, 비제한적으로 mRNA), 벡터, 바이러스, 또는 그의 하이브리드를 포함하며, 이들 모두가 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음)을 제공한다. 양태에서, 핵산은 발현 카세트, 플라스미드, 및 발현 벡터, 또는 재조합 바이러스를 추가로 포함하거나 이에 함유되며, 여기서 선택적으로 핵산, 또는 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터 또는 재조합 바이러스는 세포, 선택적으로 인간 세포 또는 비-인간 세포 내에 함유되며, 선택적으로 세포는 핵산, 또는 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 또는 재조합 바이러스로 형질전환된다. 양태에서, 세포는 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 단리된, 합성 또는 재조합 핵산, 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 또는 재조합 바이러스; 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 단리된, 합성, 또는 재조합 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 중 하나 이상 내에 함유되도록 형질도입되거나, 형질감염되거나, 또는 다르게는 조작된다. 양태에서, 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 효모 세포일 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 벡터 내로 삽입될 수 있고, 예를 들어 발현 벡터 또는 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들어 정맥내 주사, 국부 투여(미국 특허 제5,328,470호) 또는 정위 주사(Chen SH 등, (1994), Proc Natl Acad Sci USA, 91(8):3054-7, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용의 핵산 분자는 플라스미드 내로 삽입될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 약제학적 제제는 허용되는 희석제에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 비히클이 임베딩된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어 레트로바이러스 벡터로부터 온전하게 생성될 수 있는 경우, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩하는 상기 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 벡터, 바이러스 또는 그의 하이브리드)의 양태에서, 핵산은 상기에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 41-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않음; 뿐만 아니라 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드를 인코딩한다. 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 본 개시내용의 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 본 개시내용의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 양태에서, 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 효모 세포일 수 있다.
본 개시내용의 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA(cDNA를 포함하나 이에 제한되지 않음) 또는 RNA(mRNA를 포함하나 이에 제한되지 않음)일 수 있다. 핵산은 전형적으로 DNA 또는 RNA(mRNA 포함)이다. 핵산은 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 합성, 클로닝 또는 증폭; 세포막 어드레싱 서열을 인코딩하는 서열의 합성, 클로닝 또는 증폭; 적절한 벡터 및 세포에서 서열의 결찰 및 이들의 클로닝/증폭과 같은 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 인코딩하는 본 명세서에 제공된 핵산(RNA, DNA, 벡터, 바이러스 또는 그의 하이브리드)은 유전자 조작, 증폭, 합성 생산 및/또는 재조합으로 발현/생성된 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 이들 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드는 개별적으로 단리되거나 클로닝되고 원하는 활성에 대해 테스트될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내, 박테리아, 진균, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 포함하는 임의의 재조합 발현 시스템이 사용될 수 있다. 양태에서, 본원에 제공된 핵산은 잘 알려진 화학적 합성 기술에 의해 시험관 내에서 합성된다(예를 들어, 문헌[Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허 번호 4,458,066]에 기재됨, 이들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함됨). 또한, 예를 들어, 서브클로닝, 표지화 프로브(예를 들어, Klenow 중합효소를 사용한 랜덤-프라이머 라벨링, 틈(nick) 번역, 증폭), 시퀀싱, 혼성화 등과 같은 본원에 제공된 핵산의 조작을 위한 기술은 과학 분야 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있다(예를 들어 문헌[Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY and MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)]을 참조하고, 이들 모두는 전체적으로 본원에 참조로 포함됨).
본 개시내용의 추가 목적은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 시험관내 또는 생체 내에서 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 생산하거나, 표면 상에 폴리펩티드를 발현하는 세포를 생산하거나, 백신을 생산하는 데 사용될 수 있고, 활성제는 핵산 또는 핵산 함유 벡터이다. 핵산은 예를 들어 단일- 및/또는 이중-가닥의 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, 또는 당업계에 공지된 폴리뉴클레오티드의 천연 또는 안정화된 형태일 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 개시내용에 따른 핵산 분자는 원핵생물 또는 진핵생물 기원으로부터의 핵산 분자 자체 예컨대 네이키드 핵산 분자; 플라스미드, 벡터; 바이러스 또는 숙주 세포, 등의 형태로 제공될 수 있다. 벡터는 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 포함한다. 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상이한 세포 유형에 대한 발현 벡터는 당업계에 잘 알려져 있고 과도한 실험 없이 선택될 수 있다. 일반적으로, (예를 들어, cDNA 또는 mRNA 포함 RNA)는 발현을 위한 적절한 방향 및 정확한 해독틀로 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입된다. 필요한 경우, DNA(예를 들어, cDNA, 또는 mRNA 포함 RNA)는 원하는 숙주(예를 들어, 박테리아)에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 조절 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있지만, 이러한 조절은 일반적으로 발현 벡터에서 이용 가능하다. 그런 다음 벡터는 표준 기술을 사용하여 클로닝을 위해 숙주 박테리아에 도입된다. 본 발명의 벡터는 예를 들어 전사 프로모터, 및/또는 전사 종결자를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 핵산 분자와 작동적으로 연결되고, 핵산 분자는 전사 종결자와 작동적으로 연결된다. 본 개시내용의 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드는 단일 발현 벡터에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어 DNA/RNA 백신의 형태로 생체 내에서 이를 필요로 하는 대상체에게 펩티드/폴리펩티드를 전달하기 위한 비히클로서 작용할 수 있다.
양태에서, 벡터는 상기 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 상이한 유형의 바이러스, 예컨대, 돈두, 계두, 가성광견병, 아우제스키(Aujezky) 바이러스, 살모넬라, 백시니아 바이러스, BHV (소 헤르페스 바이러스), HVT (칠면조의 헤르페스 바이러스), 아데노바이러스, TGEV (전달가능 가스트로 엔테리티디스 코로나바이러스), 에리트로 바이러스, 및 SIV (유인원 면역결핍 바이러스)로부터 유래될 수 있다. 효모 세포에서 복제 및/또는 통합되는 플라스미드와 같은 다른 발현 시스템 및 벡터가 또한 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 및/또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 핵산 발현 및 폴리펩타이드 회수에 적합한 조건 하에서 상기 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 나타낸 바와 같이, 단백질 및 펩티드는 당업계에 그 자체로 공지된 기술에 따라 정제될 수 있다.
약제학적 조성물 및 제형
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 연쇄체 펩티드; 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물; 본원에 개시된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 연쇄체 펩티드, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산; 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 및 재조합 바이러스, 또는 세포 중 하나 이상을 포함함; 이후에 "본 개시내용의 T-세포 에피토프 화합물 및 조성물"로 지칭됨)은 약제학적 조성물 또는 제형에 포함될 수 있다. 양태에서, 본 개시된 약제학적 조성물 또는 제형은 일반적으로 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 애주번트를 포함한다. 양태에서, 본 개시된 약제학적 조성물 또는 제형은 투여 경로에 따라 희석제, 애주번트, 동결 건조 안정화제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 투여에 적합하다. 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 개시된 트레지토프 조성물을 투여하기 위한 다양한 적합한 약제학적 조성물 제형이 존재한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, (18TH Ed, 1990), Mack Publishing Co., Easton, PA Publ 참조). 양태에서, 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균되고 실질적으로 등장성이며 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다.
용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 내성되는" 및 이들의 문법적 변형은 조성물, 담체, 부형제 및 시약을 언급할 때 상호교환적으로 사용되며 물질이 조성물의 투여를 금지할 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성 없이 대상체에게 또는 대상체 상에 투여될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, "약제학적으로 허용되는 부형제"는 예를 들어 일반적으로 안전하고, 무독성이며 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 의미하며, 인간 약제학적 용도뿐만 아니라 수의학적 용도에도 허용되는 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우 기체일 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 특정 트레지토프 화합물 및 조성물에 대한 투여의 적절한 시기, 순서 및 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물의 투여량은 종, 품종, 연령, 크기, 치료 이력 및 치료될 동물(예를 들어, 인간)의 건강 상태, 뿐만 아니라 투여 경로, 예를 들어, 피하, 진피내, 경구 근육내 또는 정맥내 투여에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 단일 용량으로 또는 반복 용량으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 돼지 면역원성 또는 백신 조성물과 같은 하나 이상의 추가 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 조성물이 상이한 시간에 투여되는 경우, 투여는 서로 분리되거나 시간이 중복될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예는 탈무기질화 또는 증류 수; 식염수; 식물성 기초 오일 예컨대 땅콩 오일, 낙화생 오일, 잇꽃 오일, 올리브 오일, 면실유, 메이즈 오일, 참께 오일, 또는 코코넛 오일; 폴리실록산, 예컨대 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산을 포함하는 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 미네랄 오일 예컨대 경질 유동 파라핀 오일, 또는 무거운 유동 파라핀 오일; 스쿠알렌; 세포룰로스 유도체 예컨대 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 나트륨 염, 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올 또는 이소프로판올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르 예컨대 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레에이트; 폴리비닐피롤리돈; 한천; 카라기난; 트라가칸쓰검 또는 아카시아검; 및 바셀린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 백신 조성물의 중량의 10% 내지 99.9%를 형성할 것이고, 당업계에 공지된 시약, 예컨대 나트륨 수소 포스페이트, 나트륨 디하이드로젼 포스페이트, 칼륨 수소 포스페이트, 칼륨 디하이드로젼 포스페이트, 이들의 혼합물, 등을 사용하는 통상적인 방법에 의해 완충될 수 있다.
양태에서, 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 리포솜 및 고정유와 같은 비수성 비히클도 사용할 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 화합물이 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고 상기에 기재된 바와 같이, 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
애주번트의 예로는 수중유 에멀젼, 수산화알루미늄(명반), 면역자극 복합체, 비-이온성 블록 폴리머 또는 코폴리머, 사이토카인(예컨대 IL-1, IL-2, IL-7, IFN- α, IFN-β, IFN-γ 등), 사포닌, 모노포스포릴 지질 A(MLA), 뮤라밀 디펩티드(MDP) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 애주번트는 예를 들어 황산알루미늄 칼륨, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 콜레라 독소 또는 이의 B 서브유닛으로부터 분리된 열 불안정성 또는 열안정성 장독소, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 백일해 독소, 프로인트 불완전 또는 완전 애주번트 등를 포함한다. 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 백일해 독소와 같은 독소 기반 애주번트는 예를 들어 포름알데히드 처리에 의해 사용 전에 불활성화될 수 있다. 추가 애주번트는 폴리-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS 패치, ISS, ISCOMATRTX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 바이로좀 및 다른 바이러스 유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 및 Aquila QS21 자극제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신의 양태에서, 애쥬번트는 폴리-ICLC를 포함한다. TLR9 효능제 CpG 및 합성 이중 가닥 RNA(dsRNA) TLR3 리간드 폴리-ICLC는 현재 임상 개발 중인 가장 유망한 백신 애주번트 중 두 가지이다. 전임상 연구에서, 폴리-ICLC는 LPS 및 CpG와 비교할 때 가장 강력한 TLR 애주번트인 것으로 보인다. 이는 염증유발 사이토카인의 유도 및 IL-10의 자극 결여뿐만 아니라 DC에서 높은 수준의 공동자극 분자의 유지로 인해 나타난다. 폴리-ICLC는 폴리라이신과 카복시메틸셀룰로오스를 첨가하여 혈청 뉴클레아제에 의해 열변성 및 가수분해로 안정화된 평균 길이 약 5000 뉴클레오티드의 polyI 및 polyC 가닥으로 구성된 합성으로 제조된 이중 가닥 RNA이다. 이 화합물은 PAMP 계열의 두 구성원인 TLR3 및 MDA5의 RNA 헬리카제 도메인을 활성화하여 DC 및 자연 살해(NK) 세포 활성화 및 I형 인터페론, 사이토카인 및 케모카인의 혼합 생산을 유도한다.
동결 건조 안정제의 예는 예를 들어 탄수화물 예컨대 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란 또는 글루코스, 단백질 예컨대 알부민 또는 카세인, 및 그의 유도체일 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 진피내, 경피, 직장, 두개내, 척추강내, 복강내, 비강내로; 질로; 근육내 경로로 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 예를 들어, 두개내 주사와 같이 침착물이 축적된 특정 조직 내로 직접 주사될 수 있다. 다른 양태에서, 근육내 주사 또는 정맥내 주입이 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물의 투여에 사용될 수 있다. 일부 방법에서, 본 개시내용의 T-세포 에피토프 화합물 및 조성물은 MedipadTM 장치와 같으나 이에 제한되지 않는 지속 방출 조성물 또는 장치로서 투여된다. 양태에서, 본 개시내용의 T-세포 에피토프 화합물 및 조성물은 예를 들어 상업적 무바늘 고압 장치 예컨대 Pulse NeedleFree 기술에 의해 진피내로 투여된다 (Pulse 50TM Micro Dose Injection System, Pulse NeedleFree Systems; Lenexa, KS, USA). 양태에서, 상기 상업적 무바늘 고압 장치(예를 들어, Pulse NeedleFree 기술)는 다음 이점 중 하나 이상을 제공한다: 비침습성, 조직 외상 감소, 통증 감소, 대상체에 조성물을 침착시키기 위해 진피층에 더 작은 구멍이 필요함(예를 들어, 미세 피부 개방만 필요), 조성물의 즉각적인 분산, 조성물의 더 나은 흡수, 조성물에 대한 더 많은 진피 노출, 및/또는 날카로운 손상의 위험 감소.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 의학적 상태를 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 제제와 조합하여 선택적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 중추신경계로 투여하는 경우, 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 또한 혈액-뇌 장벽을 통한 본 발명의 제제의 통과를 증가시키는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다.
양태에서, 비경구, 진피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균 화합물 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅 화합물 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절용 화합물. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 부형제의 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 물, 에탄올, DMSO, 글리콜, 프로필렌, 탈지분유, 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
양태에서, 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
양태에서, 주사용으로 적합한 약제학적 조성물 또는 제형은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이고 용이한 주사기 가능성이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정적이며 미생물 예컨대 박테리아 및 진균류의 오염 작용에 대해 보존된다. 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물을 포함하는 제형은 응집체, 단편, 분해 생성물 및 번역후 변형을 포함할 수 있으며, 이러한 불순물이 HLA에 결합하고 동족 T 세포에 동일한 TCR 면을 나타내는 정도까지 순수한 트레지토프와 유사한 방식으로 기능할 것으로 예상된다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균 화합물에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 화합물, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 야기될 수 있다.
양태에서, 멸균 주사가능 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물을 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질과 상기에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 결합제를 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조이다. 또한, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 활성 성분의 지속 또는 박동 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.
양태에서, 경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함하고 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축될 수 있다. 양태에서, 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 결합제는 부형제와 혼입되고 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강청결제로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유체 담체 내의 화합물은 경구로 적용되고 헹구고 뱉어내거나 삼켜진다. 약제학적으로 양립가능한 결합 화합물 및/또는 애주번트 물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 양태에서, 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 하기 성분 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 세포룰로스, 트라가칸쓰검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해 화합물 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미 화합물 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미 화합물 예컨대 박하, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어, 기체 예컨대 이산화탄소, 또는 네뷸라이저를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여용 세제, 담즙산염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 달성할 수 있다. 경피 투여를 위해, 트레지토프 화합물 및 조성물은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화될 수 있고, 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 국소적으로 또는 경피 패치 기술을 통해 적용될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 또한 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제 사용) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 신속한 제거에 대해 트레지토프 화합물 및 조성물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 예를 들어 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론성 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)도 약제학적으로 허용되는 담체로 사용할 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(미국 특허 제4,522,811호, 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 원하는 부위로의 트레지토프 화합물 및 조성물의 느린 방출을 허용하는 바이오폴리머 고체 지지체 내에 이식되거나 이에 연결될 수 있다.
양태에서, 투여의 용이성과 복용량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 복용량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 복용량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 일체형 복용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 결합제의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 결합제의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 및 대상체의 치료를 위해 이러한 트레지토프 화합물 및 조성물을 배합하는 기술 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.
양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 트레지토프 화합물 및 조성물 중 하나 이상은 또한 트레지토프로 단리된 수지상 세포(DC)의 생체 외 펄싱에 의해 환자에게 투여될 수 있고, 이어서 펄스형 세포를 환자에게 재주입할 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(Butterfield, (2013), Front Immunol, 4:454 및 Dissanayake 등, (2014), PLoS One, 9(3)1-10). 이러한 재주입은 상기 방법 및 조성물에 의해 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 양태에서, 상기 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 본 개시된 펩티드 또는 폴리펩티드 (연쇄체 폴리펩티드 포함) 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드 (연쇄체 폴리펩티드 포함)를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양상에서, 약제학적 조성물은 서열번호: 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진, 그 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 펩티드 또는 폴리펩티드 (최대 40개의 펩티드 또는 폴리펩티드 포함); 및 본원에 기재된 바와 같은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 연쇄체 펩티드, 및/또는 그의 단편 및 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들어, RNA mRNA, DNA, cDNA)을 포함한다.
양태에서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이 서열번호: 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질저으로 이루어진 서열을 갖는 폴리펩티드 (이는 본원에서 "Treg 활성화 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프" 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"로 지칭될 수 있음)) 본원에 개시된 바와 같이; 핵산, 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포 (이들 모두는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 (이는 양태에서 단리되거나, 합성 또는 재조합일 수 있음); 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형 중 하나 이상 포함)은 항원, 알러지항원 또는 치료 단백질과 혼합물로 조합된다. 이러한 조성물은 필요로 하는 대상체에서 항원, 알러지항원 또는 치료 단백질에 대한 관용을 유도하는 방법에 유용하며, 항원 또는 알러지항원 또는 치료 단백질과의 혼합물의 국소 전달은 대상체에서 항원 또는 알러지항원에 대한 관용을 증가시키고 항원, 알레르겐 또는 치료 단백질에 대한 관용을 유도하는 적절한 부형제와 함께 전달된다. 이러한 조합은 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물과 함께 투여될 수 있거나, 또는 이들은 혼합물, 또는 분지형 또는 화학적 연결 제제로서 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 항원 또는 알러지항원 또는 치료 단백질에 대한 관용을 유도하는 방법에 유용하다. 예를 들어, 이러한 조성물은 항원 또는 알러지항원 또는 치료 단백질과의 혼합물의 국소 전달이 대상체에서 항원 또는 알러지항원 또는 치료 단백질에 대한 관용을 증가시키고 항원, 알레르겐 또는 치료 단백질에 대한 관용을 유도하는 적절한 부형제와 함께 전달된다.
사용 방법
(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 서열을 갖는 폴리펩티드 (이는 본원에서 일명 "Treg 활성 조절 T-세포 에피토프", "트레지토프(Tregitope)", 또는 "T-세포 에피토프 폴리펩티드"일 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 발현 카세트, 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 또는 세포 (이들 모두는 양태에 있어서 단리, 합성, 또는 재조합될 수 있음); 본원에 개시된 바와 같은 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 (이는 양태에 있어서 단리, 합성, 또는 재조합될 수 있음); 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형 중 하나 이상을 포함하는) 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물로 조절 T 세포를 자극하는 것은 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)을 자극하고, 유도하고 및/또는 증식시킬 수 있고, 양태에 있어서 다음의 사이토카인 및 케모카인: IL-10, IL-35, TGF-β, TNF-α 및 MCP1 중 하나 이상의 증가된 분비를 유발한다. 조절 사이토카인 및 케모카인의 이러한 증가된 분비는 조절 T　세포의 특징이다. 양태에 있어서, 자극은 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)에 의한 IL-2Rα의 증가된 발현 및 효과기 T 세포에 대한 IL-2의 결핍을 유발할 수 있다. 추가 양태에 있어서, 자극은 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)에 의한 증가된 페르포린 그란자임을 유발할 수 있고, 이는 이러한 Treg 집단이 T 효과기 세포 및 다른 면역 자극 세포를 사멸시킬 수 있게 한다. 다른 추가의 양태에 있어서, 이러한 자극은 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)에 의한 면역 억제성 아데노신의 생성을 유발할 수 있다. 다른 양태에 있어서, 이러한 자극은 수지상 세포 상의 공동자극 분자에의 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)의 결합 및 공동자극 분자의 제거를 유발하여 수지상 세포 기능의 억제를 일으킬 수 있다. 또한, 양태에 있어서, 이러한 자극은 상응하는 자연 발생 TReg 집단 (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)에 의한, 내피 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 세포 집단 및 수지상 세포 상의 체크포인트 분자의 TReg 유도 상향조절을 유발할 수 있다. 추가의 양태에 있어서, 이러한 자극은 B-조절 세포의 Treg 자극을 유발할 수 있다. B-조절 세포 ("B-reg")는 항-염증 효과와 관련된 세포이고, 이는 CD1d, CD5의 발현 및 IL-10의 분비를 특징으로 한다. B-reg는 또한 Tim-1의 발현에 의해 확인되며, Tim-1 결찰을 통해 유도되어 관용(tolerance)을 촉진할 수 있다. B-reg가 되는 능력은 톨(toll)-유사 수용체, CD40-리간드 등과 같은 다수의 자극 인자에 의해 유도되는 것을 나타내었다. 그러나, B-reg의 전체 특성화는 진행 중이다. B-reg는 또한 높은 수준의 CD25, CD86, 및 TGF-β를 발현한다. 조절 T 세포에 의한 이러한 조절 사이토카인 및 케모카인의 증가된 분비뿐만 아니라 상기 기재된 다른 활동은 조절 T　세포의 특징이다. 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물에 의해 활성화된 조절 T 세포는 CD4+CD25+FOXP3 표현형을 발현할 수 있다. 본 개시내용의 트레지토프 조성물에 의해 활성화된 조절 T 세포는 CD4+CD25+Foxp3+ 표현형을 발현할 수 있다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물에 의해 활성화된 조절 T 세포는 CFSE 희석 및/또는 세포용해 활성에 의해 측정되는 바와 같이 항원-특이적 T　효과기 세포의 감소된 증식 및/또는 효과기 기능에 의해 그리고 감소된 항원-특이적 Th1- 또는 Th2-연관된 사이토카인 수준, 주로 INF-γ, IL-4, 및 IL-5에 의해 측정되는 바와 같이, 생체외에서 T-효과기 면역 반응을 직접적으로 억제한다. 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물에 의해 활성화된 조절 T 세포는 감소된 항원-특이적 Th1- 또는 Th2-연관된 사이토카인 수준 (Elisa 검정에 의해 측정됨), 감소된 항원-특이적 T 효과기 세포 수준 (EliSpot 검정에 의해 측정됨), 단백질 항원에 대한 감소된 세포용해 활성, 및/또는 감소된 항체 역가에 의해 측정되는 바와 같이, 생체내에서 T　효과기 면역 반응을 직접적으로 억제한다.
양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물에 의해 활성화된 자연 조절 T 세포는 적응성 TReg 세포의 발달을 자극한다. 양태에 있어서, 항원의 존재 하에서의 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물과 함께 말초 T 세포를 공동-인큐베이션하는 것은 항원-특이적 CD4+/CD25+ T 세포의 증식을 유발하고, 이 세포에서의 Foxp3 유전자 또는 Foxp3 단백질의 발현을 상향조절하고, 시험관 내에서 항원-특이적 T 효과기 세포의 활성화를 억제한다. 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 T 조절 1형 (Tr1) 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발할 수 있다. Tr1 세포는 몇몇 면역-매개된 질환에서의 강한 면역억제 능력을 갖는다 (Roncarolo 및 Battaglia, 2007, Nat Rev Immunol 7, 585-598; Roncarolo 등, 2011, Immunol Rev 241, 145-163; Pot 등, 2011, Semin Immunol 23, 202-208). 높은 수준의 IL-10의 분비 및 그란자임 B를 통한 골수성 항원 제시 세포 (APC)의 사멸은 Tr1-매개된 억제의 주요 메커니즘이다 (Groux 등, 1997, Nature 389, 737-742; Magnani 등, 2011 Eur J Immunol 41, 1652-1662). Tr1 세포는 그것의 고유한 사이토카인 프로파일 및 조절 기능에 의해 T 헬퍼 (TH)1, TH2, 및 TH17 세포와 구별된다. Tr1 세포는 각각 TH2 및 TH17 세포의 특이 사이토카인인 IL-4 및 IL-17보다 더 높은 수준의 IL-10을 분비하는 것을 나타내었다. Tr1 세포는 또한 국소 사이토카인 환경에 따라 낮은 수준의 IL-2를 분비할 수 있고, 중요 TH1 사이토카인과 함께 가변 수준의 IFN-γ을 생성할 수 있다 (Roncarolo 등, 2011, Immunol Rev 241, 145-163). FOXP3는 활성화시 그것의 발현이 낮고 일시적이기 때문에 Tr1 세포에 대한 바이오마커가 아니다. IL-10-생성 Tr1 세포는 ICOS (Haringer 등, 2009, J Exp Med 206, 1009-1017) 및 PD-1 (Akdis 등, 2004, J Exp Med 199, 1567-1575)을 발현하지만 이들 마커는 특이적이지 않다 (Maynard 등, 2007, Nat Immunol 8, 931-941). 초-후기-활성화 항원(very-late-activation antigen) (VLA)-2의 α2 인테그린 서브유닛인 CD49b는 IL-10-생성 세포에 대한 마커로서 제시되었으나 (Charbonnier 등, 2006, J Immunol 177, 3806-3813); 이는 또한 인간 TH17 세포에 의해 발현된다 (Boisvert 등, 2010, Eur J Immunol 40, 2710-2719). 또한, 쥣과 CD49b+　T 세포는 IL-10을 분비하지만 (Charbonnier 등, 2006, J Immunol 177, 3806-3813), 또한 염증유발 사이토카인도 분비한다 (Kassiotis 등, 2006, J Immunol 177, 968-975). 높은 친화도로 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 CD4 동족체인 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)는 쥣과 IL-10-생성 CD4+　T 세포에 의해 발현되지만 (Okamura 등, 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106, 13974-13979), 또한 활성화된 효과기 T 세포 (Workman 및 Vignali, 2005, J Immunol 174, 688-695; Bettini 등, 2011, J Immunol 187, 3493-3498; Bruniquel 등, 1998, Immunogenetics 48, 116-124; Lee 등, 2012, Nat Immunol 13, 991-999) (Tregs) (Camisaschi 등, 2010, J Immunol 184, 6545-6551)에 의해 그리고 FOXP3+　조절 T 세포 (Treg) (Camisaschi 등, 2010, J Immunol 184, 6545-6551)에 의해 발현된다. 최근에 인간　Tr1 세포가 골수성 APC의 특이적 사멸에 관여하는 CD226 (DNAM-1)을 발현하는 것을 나타내었다 (Magnani 등, 2011 Eur J Immunol 41, 1652-1662). 추가 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 TGF-β 분비　Th3 세포, 조절 NKT 세포, 조절 CD8+　T 세포, 이중 음성 조절 T 세포의 활성화 및/또는 증식을 유발할 수 있다. "Th3 세포"는 다음의 표현형 CD4+FoxP3+을 갖고 활성화시 높은 수준의 TGF-β, 일정 양의 IL-4 및 IL-10을 분비할 수 있고 IFN-γ 또는 IL-2를 분비하지 않는 세포를 지칭한다. 이들 세포는 TGF-β 유도형이다. "조절 NKT 세포"는 다음의 표현형 휴지 CD161+CD56+CD16+ 및 Vα24/Vβ11 TCR을 갖는 세포를 지칭한다. "조절 CD8+ T 세포"는 다음의 표현형 휴지 CD8+CD122+를 갖고 활성화시 높은 수준의 IL-10을 분비할 수 있는 세포를 지칭한다. "이중 음성 조절 T 세포"는 다음의 표현형 휴지 TCRαβ+CD4-CD8-를 갖는 세포를 지칭한다.
양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 단클론성 항체, 단백질 치료제, 자가-항원을 촉진하는 자가면역 반응, 알러지항원, 이식된 조직에 대한 면역 반응을 조절하는데 유용하고 관용이 원하는 결과인 다른 응용분야에서 유용하다.
양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 MHC 클래스 II 분자에 결합되고, MHC 클래스 II 분자의 맥락에서 TCR에 관여하고, 자연 발생 TReg (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)를 활성화할 수 있다.
필요한 대상체에서의 면역 반응의 억제
양태에 있어서, 본 개시내용은 직접적으로 또는 이를 코딩하는 핵산의 도입 및 이의 전사 및 번역을 제공하거나 가능하게 하는 것을 통해 서열번호 1-124의 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 투여하거나 또는 주입하거나 또는 이와 접촉시키는 것에 의해 조절 T-세포를 자극하고, 유도하고, 및/또는 증식시키는 방법에 관한 것이다.
양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 그것이 필요한 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위해 조절 T-세포 (예를 들어, 자연 발생 TReg (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 포함함)를 자극하고, 유도하고, 및/또는 증식시키는 방법에 관한 것이다. 양태에 있어서, 면역 반응은 적어도 하나의 치료적 단백질로의 하나 이상의 요법적 치료, (특히, 백신접종으로부터 부작용이 일어나는 상황에서) 백신으로의 치료, 또는 적어도 하나의 항원으로의 치료의 결과이다. 다른 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로, 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 변화시키고, 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현을 감소시킨다.
양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 면역 반응을 저지/억제하기 위한 방법에 관한 것이며, 이는 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 트레지토프 화합물 또는 조성물은 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 선천적 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 적응성 면역 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 효과기 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 메모리 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 헬퍼 T 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 B 세포 반응을 저지/억제한다. 양태에 있어서, 트레지토프 화합물 또는 조성물은 NKT 세포 반응을 저지/억제한다.
양태에 있어서, 본 개시내용은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량의 투여를 통해 대상체에서 면역 반응, 구체적으로 항원-특이적 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 트레지토프 화합물 또는 조성물은 자연 발생 TReg (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg를 그리고 양태에 있어서 CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포를 포함함)를 활성화시키거나 또는 CD4+ T-세포의 활성화, CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 증식을 억제하거나, 및/또는 β-세포 또는 NKT 세포의 활성화 또는 증식을 억제한다. 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 특정 표적 항원와 공유 결합되거나, 비-공유 결합되거나, 또는 이와 혼합될 수 있다. 특정 양태에 있어서, 예를 들어, 폴리펩티드 (일 양태에서 단리, 합성, 또는 재조합될 수 있는 Treg 활성 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드) 및/또는 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 키메라 또는 융합 폴리펩티드 조성물 중 하나 이상이 특정 표적 항원와 공유 결합되거나, 비-공유 결합되거나, 또는 이와 혼합될 수 있다. 양태에 있어서, 특정 표적 항원와 공유 결합되거나, 비-공유 결합되거나, 또는 이와 혼합되는 투여된 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 표적 항원에 대한 면역 반응의 감소를 유발한다.
양태에 있어서, 표적 항원은 자가 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 양태에 있어서, 표적 항원은 알러지항원일 수 있다. 양태에 있어서, 표적 항원은 동종이형 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 양태에 있어서, 표적 항원은 생물학적 의약 또는 그의 단편일 수 있다. 양태에 있어서, 억제 효과는 천연 TReg에 의해 매개된다. 양태에 있어서, 억제 효과는 적응성 TReg에 의해 매개된다. 양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물에 포함된 하나 이상의 트레지토프는 효과기 T 세포 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 선천적 면역 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 적응성 면역 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 헬퍼 T 세포 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 메모리 T 세포 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 β 세포 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 본원에 개시된 트레지토프 화합물 또는 조성물의 하나 이상의 트레지토프는 NKT 세포 반응을 억제한다.
소분자 치료제 설계
일 양태에 있어서, 본 개시내용은 소분자 치료제를 설계하는 목적을 위해 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 일 양태에 있어서, 트레지토프-특이적 T 세포는 1　μg/ml의 농도의 소분자 혼합물의 풀(pool)로 3회, 2-주 간격으로 자가 수지상 세포 (DC)로 자극되고, 이후 이종성 DC 및 항원으로의 자극이 후속된다. T 세포 (1.25　Х　105) 및 DC (0.25　Х　105)는 둥근 바닥, 96-웰 플레이트에서의 웰마다 첨가된다. T 세포 배지는 500　ml의 RPMI 배지 1640에 50　ml의 FCS (HyClone Laboratories, Inc., 유타주 로건 소재), 페니실린, 및 스트렙토마이신 (GIBCO Laboratories, 메릴린드주 게이더스버그 소재); 20　mM Hepes (GIBCO); 및 4　ml 1　N NaOH 용액을 보충하여 제조된다. IL-2 농도는 초기에 0.1 nM이고, 자극의 후속 단계 동안 1 nM까지 점진적으로 증가된다. T 세포 클론은 2　nM IL-2를 함유하는 배지에서 피더 세포로서의 0.6　×　105 엡슈타인-바르 바이러스-형질전환된 B 세포 (100 Gray) 및 1.3 ×　105 이종성 말초 혈액 단핵 세포 (33 Gray) 및 1　μg/ml Difco™ 식물성혈구응집소 (Bacterius Ltd, 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용하는 것에 의한 제한 희석으로 유도된다. 트레지토프 특이적 T 세포를 자극하는 소분자 풀은 이후 개별 분자로서 시험된다.
T 세포 수용체 클로닝. 양태에 있어서, 본 개시내용은 T 세포 수용체 클로닝의 목적을 위해 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 트레지토프-특이적 T 세포의 클로닝은 당업자에게 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 단리된 PBMC는 20% HSA를 함유하는 10　μg/ml RPMI 배지에서의 트레지토프로 자극된다. IL-2는 5일째에 시작하여 격일로 첨가된다 (10　U/ml 최종 농도). T 세포는 11일 또는 12일째에 사량체 풀로 염색된다. 각 풀에 대해, 2-3×105 세포가 1 내지 2시간 동안 37℃에서 50　ml의 배양 배지 (10　mg/ml)에서 0.5　mg의 PE-표지된 사량체와 함께 인큐베이션되고, 그 다음 실온에서 15분 동안 항-CD4-FITC (BD PharMingen™, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 염색된다. 세포는 세척되고 Becton Dickinson FACSCalibur™ 유동 세포측정기 (Becton Dickinson, 캘리포니아주 새너제이 소재)로 분석된다. 상응하는 단일 펩티드가 로딩된 사량체는 양성 염색을 제공하는 이 풀에 대해 생성되고, 분석은 14 또는 15일째에 실시된다. 특정 사량체에 대해 양성인 세포는 동일자에 또는 다음 날에 Becton Dickinson FACSVantage™ (캘리포니아주 새너제이 소재)을 사용하여 96-웰 U-바닥 플레이트에서 분류된 단일 세포이다. 분류된 세포는 24시간 후에 첨가된 2.5　mg/ml PHA 및 10　U/ml IL-2와 함께 피더(feeder)로서의 웰당 1.5-3×105개의 일치되지 않은, 조사된 (5000 rad) PBMC로 증식된다. 클로닝된 T 세포의 특이성은 사량체 (동족 펩티드 또는 대조군 펩티드, HA307-319가 로딩됨)로의 염색 및 10　mg/ml의 특이적 펩티드로의 T 세포 증식 검정으로 확인된다 (Novak EJ 등, J Immunol, 166(11):6665-70). 양태에 있어서, 총 RNA는 상기에 기재된 바와 같이 생성된 트레지토프 특이적 T 세포주로부터의 RNeasy 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (Qiagene, 독일 힐덴 소재)로 추출된다. 1 마이크로그램의 총 RNA는 GeneRacer® 키트 (Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하는 cDNA 말단 (RACE) 방법의 급속 증폭에 의해 TCR cDNA를 클로닝하기 위해 사용된다. 단일-가닥 cDNA을 합성하기 전에, RNA는 5' RACE GeneRacer® 키트의 지침 매뉴얼에 따라 탈-인산화되고, 탈-캡핑되고, RNA 올리고뉴클레오티드로 결찰된다. SuperScript II RT® (Life Technologies Corp, 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 GeneRacer® Oligo-dT는 단일-가닥 cDNA로의 RNA 올리고-결찰된 mRNA의 역전사를 위해 사용된다. 5' RACE는 5' 프라이머로서 GeneRacer® 5' (GeneRacer® 키트) 그리고 각각 TCR α, β1, 또는 β2에 대한 3' 프라이머로서 유전자-특이적 프라이머 TCRCAR (5'-GTT AAC TAG TTC AGC TGG ACC ACA GCC GCA GC-3'; 서열번호 130) 또는 TCRCB1R (5'- CGG GTT AAC TAG TTC AGA AAT CCT TTC TCT TGA CCA TGG C -3'; 서열번호 131), 또는 TCRCBR2 (5'-CTA GCC TCT GGA ATC CTT TCT CTT G-3'; 서열번호 132)를 사용함으로써 수행된다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 생성물은 pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 클로닝되고 그 다음 One Shot TOP10 컴피턴트 에스케리치아 콜라이 (Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 형질전환된다. 플라스미드 DNA는 TCRα, β1, 및 β2 사슬에 대한 각각의 작제물로부터 96개의 개별 클론으로부터 제조된다. 모든 플라스미드의 전장 삽입물은 vα/vβ 사용을 결정하기 위해 시퀀싱된다 (Zhao Y 등, (2006), J Immunother, 29(4):398-406, 그 전문이 본원에 참조로 편입됨).
의학적 병태의 예방 또는 치료 방법
본 개시내용은 예를 들어 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 투여 단계 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 의학적 병태를 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 하나 이상의 의학적 병태를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 의학적 병태는 예를 들어 일째 면역결핍, 면역-매개된 혈소판감소증, 20년생 초과의 환자에서의 조혈 줄기 세포 이식, 만성 B-셀 림프구성 백혈병, 및 소아 HIV 1형 감염일 수 있다. 특정 예는 다음을 포함한다: (혈액학) 재생불량빈혈, 순수한 적혈구 무형성증, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 신생아 용혈성 질환, 후천성 VIII 인자 억제제, 후천성 폰빌레브란트병, 면역-매개된 호중구감소증, 혈소판 수혈 불응증, 신생아 동종면역/자가면역 혈소판감소증, 수혈후 자반병, 혈전성 혈소판감소증 자반병/용혈성 요독 증후군; 감염성 질환, 고체 장기 이식, 수술, 트라우마, 화상, 및 HIV 감염; (신경학) 간질 및 소아 난치성 길랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발성신경병증, 중증 근무력증, 람베르트-이튼 근무력증 증후군, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증; (산과) 반복 유산; (기도학) 천식, 만성 가슴 증상, 류마티스병, 류마티스성 관절염 (성인 및 소아), 전신 홍반성 낭창, 전신 혈관염, 피부근염, 다발성근염, 봉입체 근염, 베게너 육아종증; (기타) 부신백질이상증, 근위축 측삭 경화증, 베체트 증후군, 급성 심근병증, 만성 피로 증후군, 선천성 심장 차단, 낭포성 섬유증, 자가면역 물집 피부병, 진성 당뇨병, 급성 특발성 자율신경이상증, 급성 파종성 뇌척수염, 내독소혈증, 용혈성 수혈 반응, 혈구포식세포 증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 하부 운동 뉴런 증후군, 다발성 골수종, 인간 T-세포 림프친화성 바이러스-1-연관 골수증, 콩팥 증후군, 막성 신병증, 신장 증후군, 정상 갑상샘기능 안병증(euthyroid ophthalmopathy), 안간대-간대성근경련, 재발성 중이염, 방종양성 소뇌 퇴행증, 파라단백혈성 신경병증, 파보바이러스 감염증 (일반), 다발성신경병증, 장기비대, 내분비병증, M-단백질, 및 피부 병변 (POEMS) 증후군, 진행성 요천 신경총병증, 라임 근신경염(lyme radiculoneuritis), 라스뮤센 증후군, 라이터 증후군, 급성 신부전, 혈소판감소증 (비면역), 연쇄상구균 독소 충격 증후군, 포도막염, 및 포크트-고야나기-하라다 증후군.
특정 양태에 있어서, 본 개시내용은, 예를 들어, 알러지, 자가면역 질환, 이식-관련 장애 예컨대 이식편대숙주 질환, 효소 또는 단백질 결핍 장애, 지혈 장애 (예를 들어, A, B, 또는 C형 혈우병), 암 (특히 종양 연관된 자가면역), 불임, 또는 감염 (바이러스, 박테리아, 또는 기생충)을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 부작용을 감소시키거나 공동-투여된 화합물의 효능을 향상시키기 위해 의학적 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용되는 다른 단백질 또는 화합물과 결합하여 함께 사용될 수 있다.
알러지에 대한 응용
알러지항원-특이적 조절 T 세포는 알러지 및 천식의 발달을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. 자연 발생 TReg (양태에 있어서, 천연 TReg 및/또는 적응성 TReg, 및 양태에 있어서, CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포를 포함함)는 알러지성 질환과 관련되는 부적절한 면역 반응을 억제하는 것을 나타내었다. 다수의 최근 연구는 조절 T 세포가 취약한 개체뿐만 아니라 동물 모델에서, 그러나 또한 인간에서 T-헬퍼 2형 편향 면역 반응의 과발달을 제어하는 데 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. 최근 연구는 Treg가 또한 TGF-β 및 IL-10의 분비에 의한 T 세포 공동-자극을 억제하고, 이는 알러지성 장애의 조절에 있어서 Treg의 중요한 역할을 제시한다. 천연 또는 적응성 조절 T 세포의 손상된 증식은 알러지의 발달을 유발하고, 알러지항원-특이적 Treg를 유도하는 처리는 알러지 및 천식에 대한 치유적 요법을 제공할 것이다. 천식의 예방 및 요법 둘 모두에 대한 하나의 전략은 Treg의 유도이다. 동물은 Th1 또는 Treg 반응을 초래하는 면역 자극에 의해 천식을 발달시키는 것으로부터 예방될 수 있다. 이와 같이, 본 개시내용은 대상체에서의 알러지 및/또는 천식의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 알러지 및/또는 천식을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 알러지 및/또는 천식을 예방 또는 치료하는 단계를 포함한다.
이식에 대한 응용
본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 공여자 세포에 대한 면역 반응을 특이적으로 하향 조절하는 세포의 발달을 촉진함으로써 이식 과정 동안 관용을 유도하는 데 유용하다. 기관-특이적 자가면역을 치료하기 위한 Ag-특이적 TReg 세포의 유도는 일반화된 면역 억제를 피하는 중요한 치료적 개발이다. 골수 이식의 쥣과 모델에서, TReg는 유익한 이식편 대 종양 면역학적 효과를 해하지 않으면서 공여자 골수 생착을 촉진하고 이식편 대 숙주 질환의 발병률 및 중증도를 감소시킨다. 마우스 및 인간에서의 TReg가 표현형 및 기능적 특징을 공유한다는 관찰과 결합되는 이러한 발견은 인간 조혈 세포 이식과 연관된 합병증을 감소시키기 위한 이러한 세포의 사용에 대한 능동적 조사로 이어졌다. TReg와 효과기 T 세포의 불균형은 이식편 대 숙주 질환의 발달에 기여하지만, 면역 조절의 메커니즘, 특히 TReg의 동종 인식 특성, 다른 면역 세포에 대한 영향 및 이와의 상호 작용, 억제 활성의 이의 부위는 잘 이해되지 않는다.
인간 및 실험 동물 모델 둘 모두로부터의 축적된 증거는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 발달에 TReg가 관여한다는 것을 암시한다. TReg가 이식편 대 종양 (GVT) 활성으로부터 GVHD를 분리할 수 있다는 입증은 그것의 면역 억제 잠재력이 GVT 효과에 대한 해로운 결과 없이 GVHD를 감소시키도록 조작될 수 있다는 것을 시사한다. 억제 능력을 갖는 다양한 T 림프구가 보고되었지만, 2개의 최상의-특성화된 하위세트는 자연적으로 발생하는 흉선내-생성된 TReg (천연 TReg) 및 말초에서 생성된 유도성 TReg (유도성 TReg)이다. 따라서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 이식 과정 동안 관용을 유도하기 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서의 이식 과정 동안 관용을 유도하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본원의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서의 이식 과정 동안 관용을 유도하는 단계를 포함한다.
관용화제(Tolerizing Agent)로서의 응용 및 자가면역에 대한 응용
양태에 있어서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 면역원성 화합물 (단백질 치료제)에 대한 관용화제로서 사용될 수 있다 (Weber CA 등, (2009), Adv Drug Deliv, 61(11):965-76). 이러한 발견은 단백질 치료제의 설계에 대해 영항을 미친다. 따라서, 본 개시내용의 트레지토프 조성물과 결합되는 면역원성 화합물 (예를 들어, 단백질 치료제, 예컨대, 비제한적으로 항체 (예를 들어, 단클론성 항체), 자가 사이토카인, 또는 외래 단백질)의 투여는 부정적인 T 효과기 면역 반응을 억제한다. 생체내에서, TReg는 수지상 세포를 통해 작용하여 자가반응성 T-세포 활성화를 제한하는 역할을 하고 이에 따라 그것의 분화 및 효과기 기능의 획득을 방지한다. 활성화된 병원성 세포의 공급을 제한함으로써, TReg는 자가면역 질환의 진행을 예방하거나 둔화시킨다. 그러나, 이러한 예방 메커니즘은 자가면역 개체에서 불충분한 것으로 보이며, 이는 아마도 오랜 질환 과정에 걸친 TReg 세포의 부족 및/또는 TReg-저항성 병원성 T 세포의 발달 및 축적에 기인한다. 따라서, 이러한 환자에서의 자가-관용의 복원은 진행 중인 조직 손상을 제어하는 증가된 능력을 갖는 TReg의 주입에 따라 병원성 T 세포의 제거(purging)를 필요로 할 수 있다. 기관-특이적 자가면역 병태, 예컨대 갑상선염 및 인슐린-의존적 진성 당뇨병은 이러한 관용 메커니즘의 붕괴에 기인하였다 (Mudd PA 등, (2006), Scand J Immunol, 64(3):211-8). 따라서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 자가면역의 예방 또는 치료하기 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 자가면역을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 자가면역을 예방하고 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
당뇨병에의 적용. 1형 (소아) 당뇨병은 인슐린-생성 췌장 베타-세포의 파괴로부터 발생된 기관-특이적 자가면역 질환이다. 비-당뇨병에서, 소도 세포 항원-특이적 T 세포는 흉선 발달에서 결실되거나 소도 세포 항원에 대한 효과기 반응을 능동적으로 억제하는 T 조절 세포로 전환된다. 소아 당뇨병 및 소아 당뇨병의 NOD 마우스 모델에서, 이들 관용 메커니즘은 없다. 그것의 부재하에, 소도 세포 항원은 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 및 II 분자에 의해 제시되고, CD8(+) 및 CD4(+) 자가-반응성 T 세포에 의해 인식된다. 이들 자가-반응성 세포에 의한 소도 세포의 파괴는 포도당 과민증을 유발한다. 트레지토프 및 소도 세포 항원의 공동-투여는 자연 발생 T 조절 세포의 활성화 및 존재하는 항원 특이적 효과기 T 세포의 조절 표현형으로의 전환을 유발한다. 이러한 방식으로, 유해한 자가면역 반응은 재유도되어 항원-특이적 적응성 관용의 유도를 초래한다. 항원-특이적 관용의 유도에 의해 자가 에피토프에 대한 자가면역 반응의 조절은 진행 중인 베타-세포 파괴를 예방할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료하기 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 당뇨병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 당뇨병을 예방 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
간염 B ( HBV ) 감염에 대한 응용
만성 HBV는 통상적으로 (모체 태아 전파에 의해) 후천적이거나 성인에서 급성 HBV 감염의 희소한 결과일 수 있다. 만성 간염 B (CH-B)의 급성 악화는 간염 B 코어 및 e 항원 (HBcAg/HBeAg)에 대한 증가된 세포독성 T　세포 반응을 동반한다. 최근 연구에서, SYFPEITHI T 세포 에피토프 맵핑 시스템은 HBcAg 및 HbeAg로부터 MHC 클래스 II-제한된 에피토프 펩티드를 예측하기 위해 사용되었다 (Feng IC 등, (2007), J Biomed Sci, 14(1):43-57). 높은 점수의 펩티드를 사용하는 MHC 클래스 II 사량체를 작제하여 TReg 및 CTL 빈도를 측정하기 위해 사용하였다. 결과는 HBcAg에 대해 특이적인 TReg 세포는 HBcAg 펩티드-특이적 세포독성 T 세포의 증가를 동반하는 악화 동안 감소된 것을 나타내었다. 관용 단계 동안, FOXp3-발현 TReg 세포 클론이 확인되었다. 이들 데이터는 HbcAg TReg T 세포의 감소가 만성 B형 간염 바이러스 감염의 자연 경과(natural history)에 대한 자발적인 악화의 원인이 되는 것을 시사한다. 따라서, 본 개시내용의 트레지토프 화합물 및 조성물은 만성 간염 B 바이러스성 감염의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 바이러스성 감염 (예를 들어, HBV 감염)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의한 대상체에서 상기 바이러스성 감염을 예방 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
SLE에 대한 응용
전신 홍반성 낭창 (SLE) 또는 쇼그렌 증후군에서 역할을 하는 TReg 에피토프는 정의되었다. 이 펩티드는 스플라이세오좀 단백질의 잔기 131-151 (RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY; 서열번호 133)을 포함한다. 가용성 HLA 클래스 II 분자 및 분자 모델링 실험으로의 결합 검정은 에피토프가 비특이적 에피토프(promiscuous epitope)로서 거동하고, 인간 DR 분자의 큰 패널에 결합되는 것을 나타내었다. 정상 T 세포 및 비-루푸스 자가면역 환자로부터의 T 세포와 대조적으로, 무작위로 선택된 루푸스 환자의 40%로부터의 PBMC는 펩티드 131-151에 반응하여 증식되는 T 세포를 함유한다. 리간드의 변경은 T 세포 반응을 변형하였고, 이는 TReg 세포일 수 있는 것 중에서 이 펩티드에 반응하는 T 세포의 몇몇 집단이 존재하는 것을 제시한다. T 조절 에피토프는 또한 쇼그렌 증후군에서 정의되었다. 따라서, 서열번호 133과 조합하여 투여되는 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 SLE의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 SLE를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 서열번호 133과 조합하여 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 SLE를 예방 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
자가면역 갑상선염에의 응용
자가면역 갑상선염은 자가갑상선 과산화효소 및/또는 티로글로불린에 대한 항체가 발생할 때 일어나는 병태이고, 이는 갑상선에서의 소낭의 점진적인 파괴를 야기한다. HLA DR5는 상기 질환과 밀접하게 관련된다. 따라서, 갑상선 과산화효소 및/또는 티로글로불린 TSHR 또는 그의 부분과 조합하여 투여된 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물은 자가면역 갑상선염의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 자가면역 갑상선염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 갑상선 과산화효소 및/또는 티로글로불린 TSHR 또는 그의 부분과 조합하여 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 자가면역 갑상선염을 예방 및/또는 치료하는 방법에 유용하다. 추가 양태에 있어서, TSHR 또는 다른 그레이브스병 항원 또는 그의 부분과 조합하여 투여되는 본 개시내용의 트레지토프 조성물은 그레이브스병의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 그레이브스병은 갑상샘 기능 항진증을 초래하거나 갑상샘으로부터 호르몬이 비정상적으로 강력하게 방출되는 자가-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR)를 특징으로 하는 자가면역 장애이다. 몇몇 유전적 인자는 그레이브스병에 대한 취약성에 영향을 미칠 수 있다. 여성은 남성보다 질병에 걸릴 가능성이 훨씬 더 높고; 백인 및 아시아인 집단은 흑인 집단보다 위험이 더 높으며 HLA DRB1 0301은 이 질환과 밀접하게 연관된다. 이와 같이, 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체에서 그레이브스병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 TSHR 또는 다른 그레이브스병 항원 또는 그의 부분과 조합하여 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계, 및 상기 투여 단계에 의해 대상체에서 그레이브스병을 예방 및/또는 치료하는 단계를 포함한다.
트레지토프 조성물을 사용하는 T-조절 세포의 생체외 증식 및/또는 자극
양태에 있어서, 본 개시내용은 조절 T-세포의 증식을 위한 생체외 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 증식하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하는 단계; 및 T-조절 세포의 수가 증가하여 증식된 조절 T 세포를 생성하고 이에 의해 생물학적 샘플에서 조절 T 세포를 증식시키는 조건하에 단리된 조절 T-세포를 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계. 양태에 있어서, 본 방법은 추가로 대상체에 증식된 조절 T-세포의 투여 단계를 포함한다. 양태에 있어서, 증식된 조절 T-세포가 투여되는 대상체는 예를 들어 증식된 트레지토프의 자가 이식에 의한 것과 같이 원래 생물학적 샘플이 얻어진 동일한 개체이다 (Ruitenberg JJ 등, (2006), BMC Immunol, 7:11).
양태에 있어서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 조절 T-세포의 자극을 위한 생체외 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하는 단계; 및 T-조절 세포가 하나 이상의 생물학적 기능을 변경하기 위해 자극되고, 그에 따라 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 자극하는 조건하에 단리된 조절 T-세포를 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계. 양태에 있어서, 본 방법은 추가로 대상체에의 자극된 조절 T-세포의 투여 단계를 포함한다. 양태에 있어서, 자극된 조절 T-세포가 투여되는 대상체는 예를 들어 증식된 트레지토프의 자가 이식에 의한 것과 같이 원래 생물학적 샘플이 수득된 동일한 대상체이다.
트레지토프 조성물을 사용하는 항원 제시 세포의 생체외 펄싱. 양태에 있어서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서의 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포, 대식세포 등)을 위한 생체외 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 생물학적 샘플로부터 항원 제시 세포를 단리하는 단계; 및 항원 제시 세포가 하나 이상의 생물학적 기능을 변경하도록 (예를 들어, 트레지토프를 제공하고 및/또는 항원 제시 세포를 관용원성이 되게 휘어지게 하도록) 자극되는 조건 (양태에 있어서, 이는 이러한 관용원성 상태를 유도하기 위한 항원 제시 세포의 사이토카인 처리를 추가로 포함할 수 있는) 하에 제시된 단리된 항원을 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 유효량과 접촉시키고 이에 의해 생물학적 샘플에서 항원 제시 세포를 자극하는 단계. 양태에 있어서, 본 방법은 추가로 대상체에의 자극된 항원 제시 세포의 투여 단계를 포함한다. 양태에 있어서, 자극된 항원 제시 세포가 투여되는 대상체는 예를 들어 자극된 항원 제시 세포의 자가 이식에 의한 것과 같이 원래 생물학적 샘플이 수득된 동일한 대상체이다.
트레지토프 조성물의 시험관내 용도
양태에 있어서, 본 개시내용은 시험관내 연구 및 실험 모델에서에서 조절 T-세포 기능의 연구에 시약으로서의 본 개시내용의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 용도를 제공한다.
면역 조작 방법
양태에 있어서, 본 개시내용은 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 그의 단편으로부터 또는 그 안으로의 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프의 제거 또는 삽입을 포함하는 면역 조작의 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 양태에 있어서, 본 개시내용은 항체 또는 그의 단편이 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포에 대해 표적화되는 항원에 대한 백신 전달 벡터로서 역할을 할 때 특히 유용할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 화합물 또는 조성물의 면역원성을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 양태에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 (예를 들어, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)의 상기 항체 또는 그의 단편로부터의 확인 및 제거를 포함한다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 EpiMatrix 및 JanusMatrix 분석에 의해 확인되고, 이는 예컨대 본원에 (예를 들어, 실시예의 섹션 (1)에) 기재되어 있다. 양태에 있어서, 항체 (또는 그의 단편) 백신 전달 벡터 (예컨대 DEC-205)의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 전달된 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 억제할 수 있고, 상기 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 제거는 관용원성의 감소 및 전달된 항원에 대한 강한 항원-특이적 면역 반응의 자극을 가능하게 할 수 있다. 양태에 있어서, 상기 제거는 이들 트레지토프가 더 이상 MHC 분자에 결합하지 않거나, 더 이상 MHC 결합 경향을 유지하지 않고, 더 이상 동일한 TCR 특이성을 유지하지 않고, 및/또는 더 이상 트레지토프 또는 억제 활성을 유지하지 않도록 이들 트레지토프를 변형시키는 것을 포함한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 아미노산의 전부 또는 일부의 결실을 포함한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 아미노산의 일부 또는 모두의 결실 및 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 결실 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 첨가를 포함한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프를 돌연변이화시키는 것 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의한 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프로의 하나 이상의 점 돌연변이의 도입)을 포함한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 서열의 이전 관용원성이 제거되도록, 양태에 있어서 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 파괴시킬 것인 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열로 하나 이상의 아미노산을 도입하는 것을 포함한다. 양태에 있어서, 제거 부위에의 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 기존에 존재하는 조절 T 세포 에피토프 아미노산으로부터 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 백신 전달 비히클 또는 벡터의 백신 전달 벡터 또는 표적 항원의 면역원성의 향상을 유발한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터로부터의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 제거는 백신 전달 비히클 또는 벡터의 백신 전달 벡터 또는 표적 항원에 대한 고조된 항원-특이적 면역 반응을 유발한다. 양태에 있어서, 백신 전달 벡터는 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 항체-약물 접합체, 하위클래스 중 상이한 클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA), 또는 그의 단편 또는 항원-특이적 항체 단편 (비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함함)을 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 양태에 있어서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 서열번호 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는) 서열을 갖는다.
추가로, 본 개시내용은 면역원성을 감소시키고 및/또는 항체 또는 그의 단편이 치료적 단백질로서 역할을 할 때 특히 유용할 수 있는 항체 또는 그의 단편의 관용원성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 양태에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 (예를 들어, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 갖는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)의 상기 항체 또는 그의 단편으로의 삽입을 포함한다. 양태에 있어서, 항체 또는 단편의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 항체 또는 그의 단편에 대한 항원-특이적 면역 반응을 억제한다. 양태에 있어서, 상기 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 예컨대 트레지토프가 항체 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 항체 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 항체 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 항체 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 아미노산의 전부 또는 일부의 삽입을 포함한다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 아미노산의 전부 또는 일부의 삽입 및 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 삽입 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 제거를 포함한다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프를 포함하도록 항체 또는 그의 단편의 서열을 돌연이화시키는 것 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지정 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술에 의해 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 점 돌연변이의 도입)을 포함한다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 서열의 이전의 면역원성이 감소되고, 새로운 서열의 관용원성이 향상되도록, 양태에 있어서 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프 서열을 도입할 것이다. 양태에 있어서, 조절 T 세포 에피토프 아미노산의 삽입 부위에서의 상기 첨가된 하나 이상의 아미노산의 수는 항체 또는 그의 단편의 서열로부터의 결실된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 면역원성을 감소시키는 것을 유발한다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 상기 삽입은 항체 또는 그의 단편의 관용원성을 증가시키는 것을 유발한다. 양태에 있어서, 하나 이상의 트레지토프는 미국특허 제7,442,778호, 미국특허 제7,645,861호, 미국특허 제7,655,764호, 미국특허 제7,655,765호, 및/또는 미국특허 제7,750,128호 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc 도메인으로 내부 서열로서 혼입될 수 있다. 이러한 내부 서열은 (즉, 기존에 존재하는 Fc 도메인에서 아미노산 사이에서) 삽입에 의해 또는 기존에 존재하는 Fc 도메인에서의 아미노산의 대체에 의해 (즉, 기존에 존재하는 Fc 도메인에서의 아미노산을 제거하고 펩티드 아미노산을 첨가하여) 첨가될 수 있다. 후자의 경우, 첨가된 펩티드 아미노산의 수는 기존에 존재하는 Fc 도메인으로부터 제거된 아미노산의 수와 일치할 필요는 없고; 예를 들어, 양태에 있어서, 조성물은 천연 Fc 도메인로부터 제거된 1-21개의 아미노산의 서열과 함께 9-15개의 아미노산의 첨가된 내부 서열을 포함할 수 있다. 양태에 있어서, 항체 또는 그의 단편은 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 글리코실화된 항체, Fc-변형된 항체, 항체-약물 접합체, 예컨대 하위클래스 중 상이한 클래스의 항체 (예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, 또는 IgA) 분자, 또는 그의 항원-특이적 항체 단편 (비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함함)를 포함할 수 있다. 양태에 있어서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 서열번호 1-124 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 서열을 갖는다.
예를 들어, 양태에 있어서, 서열번호 1-124 중 하나 이상을 포함하는 서열 (및 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 갖는 본 개시내용의 하나 이상의 트레지토프는 예컨대 트레지토프가 인간 IgG 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 인간 IgG 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 인간 IgG 또는 그의 단편 (예컨대 대상체 자신의 인간 IgG 또는 그의 단편)이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 인간 IgG 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 앞서 기재된 바와 같이, 서열번호 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 폴리펩티드가 인간 IgG 중쇄 가변 영역 (예컨대 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 상기 서열번호 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124 중 하나 이상은 예컨대 트레지토프가 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 인간 IgG 중쇄 가변 영역 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 서열번호 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 폴리펩티드가 인간 IgG 중쇄 불변 영역 (예컨대 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 상기 서열번호 2, 9-11, 29-41, 및 75-100 중 하나 이상은 예컨대 트레지토프가 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 인간 IgG 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 서열번호 12의 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 IgG 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 폴리펩티드가 인간 IgG 경쇄 가변 영역 (예컨대 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 상기 서열번호 12의 하나 이상은 예컨대 트레지토프가 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 인간 IgG 경쇄 가변 영역 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 서열번호 13 및 101-110 중 하나 이상을 포함하는 트레지토프는 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 IgG 경쇄 불변 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다. 양태에 있어서, 폴리펩티드가 인간 IgG 경쇄 불변 영역 (예컨대 인간 IgG 항체 또는 그의 단편)을 포함하는 경우, 상기 서열번호 13 및 101-110 중 하나 이상은 예컨대 트레지토프가 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편 내에서 그것의 천연 위치에 위치하지 않거나 또는 (예를 들어, 특정 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편이 이러한 트레지토프가 없는 경우에 (예를 들어, 비제한적으로, 부위 지향된 돌연변이유발 또는 다른 재조합 기술로) 인간 IgG 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편에 융합되거나 또는 그 안에 내부적으로 삽입될 수 있다.
키트
본원에 기재된 방법은 예를 들어 본원에 기재된 의학적 병태의 증상 또는 가족력을 나타내는 대상체를 치료하기 위한 임상 설정에서, 예를 들어 편리하게 사용될 수 있는 본 개시내용의 적어도 하나의 트레지토프 화합물 또는 조성물을 포함하는 사전 포장된 키트를 이용함으로써 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 의학적 병태의 증상 또는 가족력을 나타내는 대상체를 치료하기 위한 본 개시내용의 적어도 하나의 트레지토프 화합물 또는 조성물의 사용을 위한 설명서를 추가로 포함한다.
양태
제1 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다.
제2 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다.
제3 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
제4 양태는 양태 1-3 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 관한 것이고, 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 상기 변이체 또는 단편은 MHC 결합 경향 및 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다.
제5 양태는 서열번호: 1-124 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 그의 단편으로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 MHC 결합 경향 및 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다.
제6 양태는 서열번호: 1-124 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 그의 단편으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 MHC 결합 경향 및 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다.
제7 양태는 서열번호: 1-124 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 MHC 결합 경향 및 동일한 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다.
제8 양태는 양태 1-7 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 보존적 치환을 갖는다.
제9 양태는 양태 8에 따른 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드는 MHC 결합 성향 및 TCR 특이성을 유지하고/하거나 조절 T-세포 자극 또는 억제 활성을 유지한다.
제10 양태는 이종성 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 T-세포 에피토프 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물에 관한 것이고, 여기서 T-세포 에피토프 폴리펩티드는 양태 1-9 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드이다.
제11 양태는 양태 10에 따른 폴리펩티드 조성물에 관한 것이고, T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 N-말단에 연결된다.
제12 양태는 양태 10 또는 11 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 조성물에 관한 것이고, T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 C-말단에 연결된다.
제13 양태는 양태 10-12 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 조성물에 관한 것이고, 이종성 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 생물학적 활성 분자는 면역원성 분자, T-세포 에피토프, 바이러스 단백질, 및 박테리아 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제14 양태는 양태 10-13 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 조성물에 관한 것이고, 이종성 폴리펩티드는 T-세포 에피토프 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다.
제15 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
제16 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
제17 양태는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
제18 양태는 양태 8-10 중 어느 하나의 핵산에 관한 것이고, 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상기 단편 또는 변이체는 조절 T 세포 자극 또는 억제 활성을 유지하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
제19 양태는 양태 15-18 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
제20 양태는 양태 15-18 중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
제21 양태는 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제22 양태는 양태 15-18 중 어느 하나에 따른 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제23 양태는 양태 19에 따른 플라스미드 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제24 양태는 제20 측면에 따른 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제25 양태는 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법에서 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물 중 하나 이상의 치료적 유효량 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제26 양태는 대상체에서 면역 반응을 억제하도록 조절 T-세포를 유도하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물 중 하나 이상의 치료적 유효량 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제27 양태는 필요로 하는 대상체에서 조절 T-세포를 자극하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물 중 하나 이상의 치료적 유효량 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제28 양태는 필요로 하는 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물 중 하나 이상의 치료적 유효량 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제29 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 트레지토프 조성물의 투여는 CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포를 활성화시킨다.
제30 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 트레지토프 조성물의 투여는 CD4+ T-세포의 활성화를 억제한다.
제31 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 트레지토프 조성물의 투여는 CD4+ 효과기 T-세포 및/또는 CD8+ 효과기 T-세포의 활성화 또는 증식을 억제한다.
제32 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 트레지토프 조성물의 투여는 B-세포의 활성화 또는 증식을 억제한다.
제33 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 대상체는 알러지, 자가면역 질환, 이식 관련 장애, 효소 또는 단백질 결핍 장애, 또는 혈액 응고 장애를 겪고 있다.
제34 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 면역 반응은 적어도 하나의 치료 단백질에 의한 치료, 백신에 의한 치료 및 적어도 하나의 항원에 의한 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 요법적 치료의 결과이다.
제35 양태는 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 약제학적 트레지토프 조성물의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제36 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제37 양태는 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 약제학적 트레지토프 조성물의 투여는 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제38 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 표현형은 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현의 감소를 특징으로 한다.
제39 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 T 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제40 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 CD4+ 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제41 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 CD8+ 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제42 양태는 양태 25-28 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이고, 조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 B 세포를 조절 표현형으로 이동시킨다.
제43 양태는 하기를 포함하는, 환자의 조절 T-세포의 집단을 확장하는 방법에 관한 것이다:
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
(b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하고; 그리고 T-조절 세포의 수가 증가하여 확장된 조절 T-세포 조성물을 생성하는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물의 유효량과 접촉시켜 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 확장시키는 단계; 및
(c) 상기 증가된 수의 조절 T-세포를 상기 환자에게 반환하는 단계.
제44 양태는 하기를 포함하는, 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 자극하는 방법에 관한 것이다:
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하고; 그리고 T-조절 세포가 자극되어 하나 이상의 생물학적 기능을 변경시키는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 양태 1-14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 양태 15 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산, 양태 19에 따른 플라스미드, 양태 20에 따른 벡터, 또는 양태 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물의 유효량과 접촉시켜 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 확장시키는 단계.
실례
하기 실시예는 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 개시내용에 비추어, 특허청구범위 내의 다수의 구현예는 당업자에게 자명할 것이다.
(1) 트레지토프 화합물 또는 조성물의 가상실험(In-silico) 확인
T 세포는 MHC (주요 조직적합성 복합체) 클래스 II 분자의 맥락에서 항원 제시 세포 (APC)에 의해 제시된 에피토프를 특이적으로 인식한다. 이러한 T-헬퍼 에피토프는 MHC 클래스 II 결합 홈에 맞는 7 내지 30개의 인접 아미노산을 포함하는 선형 서열로 제시될 수 있다. 다수의 컴퓨터 알고리즘이 개발되어 다양한 유래의 단백질 분자 내의 클래스 II 에피토프를 검출하기 위해 사용되었다 (De Groot AS 등, (1997), AIDS Res Hum Retroviruses,13(7):539-41; Schafer JR 등, (1998), Vaccine,16(19):1880-4; De Groot AS 등, (2001), Vaccine, 19(31):4385-95; De Groot AS 등, (2003), Vaccine, 21(27-30):4486-504). T-헬퍼 에피토프의 이러한 "가상실험" 예측은 백신의 설계 및 치료적 단백질, 예를 들어, 항체-기반 약물, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 골형성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 및 혈전용해제의 탈-면역화에 성공적으로 적용되었다 (Dimitrov DS, (2012), Methods Mol Biol, 899:1-26).
EpiMatrix™ 시스템 (EpiVax, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)은 클래스 I 및 클래스 II HLA 리간드 및 T 세포 에피토프를 예측하는 데 유용한 컴퓨터 프로그램으로 인코딩된 예측 알고리즘의 세트이다. EpiMatrix™ 시스템은 특이적 아미노산 (20)과 HLA 분자 (9) 내의 결합 위치 사이의 상호작용을 모델링하기 위해 20 x 9 계수 행렬을 사용한다. 임의의 주어진 입력 단백질 내에 잔류하는 추정 T 세포 에피토프를 확인하기 위해, EpiMatrix™ 시스템은 우선 입력 단백질을 중첩 9-mer 프레임의 세트로 분석하고, 여기서 각 프레임은 마지막 8개의 아미노산과 중첩된다. 각 프레임은 이후 인간 HLA 분자의 하나 이상의 공통 대립유전자: 전형적으로 DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301, 및 DRB1*1501에 대한 예측된 친화성에 대해 점수화된다 (Mack 등, (2013), Tiss Antig, 81(4):194-203). 간략하게는, 임의의 주어진 9-mer 펩티드에 대해 특정 아미노산 코드 (20개의 자연 발생 아미노산 각각에 대해 하나) 및 상대적 결합 위치 (1-9)를 사용하여 예측 행렬로부터 계수를 선택한다. 개개의 계수는 동일하지 않지만 Sturniolo에 의해 최초로 개발된 포켓 프로파일 방법과 유사한 전매 방법을 사용하여 유도된다 (Sturniolo T 등, 1999, Nat Biotechnol, 17(6):555-61). 개별 계수는 이후 합산되어 원시 점수를 생성한다. EpiMatrix™ 원시 점수는 이후 매우 큰 세트의 무작위적으로 발생된 펩티드 서열로부터 유도된 점수 분포에 대해 정규화된다. 생성된 "Z" 점수는 정규 분포되며 대립유전자에 대해 직접적으로 비교가능하다.
EpiMatrix ™ 펩티드 평점. EpiMatrix™ "Z" 규모 (임의의 주어진 펩티드 세트의 대략 상위 5%)에 대해 1.64 초과의 임의의 펩티드 평점은 이것이 예측된 MHC 분자에 결합하는 상당한 기회를 갖는 것으로 결정되었다. 규모 (상위 1%)에 대해 2.32 초과의 펩티드 평점은 결합할 가능성이 매우 높고; 대부분 공개된 T 세포 에피토프는 이러한 범위의 점수에 속한다. 종래의 연구는 또한 EpiMatrix™이 공개된 MHC 리간드 및 T 세포 에피토프를 정확하게 예측하는 것을 입증하였다.
비특이적 T 세포 에피토프 클러스터의 확인. 잠재적 T 세포 에피토프는 단백질 서열 전반에서 무작위적으로 분포되지 않으나, 대신 "클러스터되는" 경향이 있다. T 세포 에피토프 "클러스터"는 길이가 9 내지 대략 30개의 아미노산이고, 복수의 대립유전자에 대한 그것의 친화성을 고려하여 복수의 프레임에 걸쳐 어디든지 4 내지 40개의 결합 모티프를 함유한다. 에피토프 맵핑 후, EpiMatrix™ 알고리즘에 의해 생성된 결과 세트는 Clustimer™로 알려진 전매 알고리즘을 사용하여 T 세포 에피토프 클러스터 및 EpiBars™의 존재에 대해 스크리닝한다. 간략하게는, 분석된 각각의 9-mer 펩티드의 EpiMatrix™ 점수는 집계되고 통계적으로 유도된 역치 값에 대해 확인된다. 높은 평점의 9mer는 한번에 하나의 아미노산으로 확장된다. 확장된 서열의 점수는 이후 재집계되고 수정된 역치 값과 비교된다. 제안된 확장이 클러스터의 전체 점수를 더 이상 개선시키지 않을 때까지 상기 과정이 반복된다. 본 연구에서 확인된 트레지토프(들)은 Clustimer-™ 알고리즘에 의해 T 세포 에피토프 클러스터로서 확인되었다. 이는 MHC 결합 및 T 세포 반응성에 대한 높은 잠재력을 나타내는 많은 수의 추정 T 세포 에피토프 및 EpiBars™을 함유한다.
관용원성 T 세포 에피토프 클러스터의 확인. JanusMatrix 시스템 (EpiVax, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)은 호스트 단백체과의 교차-보존을 위한 펩티드 서열을 스크리닝하는 데 유용하다. JanusMatrix는 그것의 추정 MHC 리간드에서의 TCR-대향 잔기의 보존에 기초한 펩티드 클러스터와 호스트 게놈 또는 단백체 사이의 교차-반응성에 대한 잠재력을 예측하는 알고리즘이다. JanusMatrix 알고리즘은 우선 주어진 단백질 서열 내에 함유된 모든 예측된 에피토프를 고려하며 각각의 예측된 에피토프를 그것의 구성성분 아그레토프 및 에피토프로 구분한다. 각 서열은 이후 호스트 단백질의 데이터베이스에 대해 스크리닝된다. 양립가능한 MHC-대향 아그레토프 (즉, 입력 펩티드 및 그것의 호스트 대응물 둘 모두의 아그레토프는 동일한 MHC 대립유전자에 결합하는 것으로 예측됨) 및 정확히 동일한 TCR-대향 에피토프를 갖는 펩티드는 되돌려진다. JanusMatrix 상동성 점수는 면역 관용에 대한 편향을 시사한다. 치료적 단백질의 경우, 치료제에서 에피토프와 자가 인간 에피토프 사이의 교차-보존은 이러한 후보물질이 인간 면역계에 의해 관용될 것인 가능성을 증가시킬 수 있다. 백신의 경우, 인간 에피토프와 항원성 에피토프 사이의 교차-보존은 이러한 후보물질이 면역 위장을 이용하고, 이에 의해 면역 반응을 회피하고 비효과적인 백신을 만드는 것을 나타낼 수 있다. 호스트가 예를 들어 인간인 경우, 펩티드 클러스터는 그것의 추정 HLA 리간드에서의 TCR-대향 잔기의 보존에 기초하여 인간 게놈 및 단백체에 대해 스크리닝된다. 펩티드는 이후 JanusMatrix 상동성 점수를 사용하여 점수화된다. 양태에 있어서, 3.0 초과의 JanusMatrix 상동성 점수를 갖는 펩티드는 높은 관용원성 잠재력을 나타내고, 이에 따라 이는 본 개시내용의 매우 유용한 트레지토프일 수 있다.
실시예 1. 트레지토프 조성의 확인
앞서 기재된 바와 같은 방법을 사용하는 가상실험 분석의 결과는 서열번호 7 및 14에 대해 각각 도 8-9, 및 도 11-26에 제시된다.
도 8은 서열번호 7의 EpiMatrix 분석을 도시한다. 그 결과는 KTLYLQMNS (서열번호 16), TLYLQMNSL (서열번호 17), LYLQMNSLR (서열번호 18), YLQMNSLRA (서열번호 19), LQMNSLRAE (서열번호 20), QMNSLRAED (서열번호 21), MNSLRAEDT (서열번호 22), NSLRAEDTA (서열번호 23), SLRAEDTAK (서열번호 24), 및 LRAEDTAKH (서열번호 25)에 대해 나타난다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임에 대한 잠재력을 나타낸다. 상위 5%에서의 모든 점수는 "히트(hit)"로 간주되며, 한편 10% 미만의 비-히트(%)는 단순화를 위해 도 8에서 가려진다.
도 9는 서열번호 14의 EpiMatrix 분석을 도시한다. 그 결과는 ETLYLQMNS (서열번호 111), TLYLQMNSL (서열번호 112), LYLQMNSLR (서열번호 113), YLQMNSLRA (서열번호 114), LQMNSLRAE (서열번호 115), QMNSLRAED (서열번호 116), MNSLRAEDT (서열번호 117), NSLRAEDTA (서열번호 118), SLRAEDTAV (서열번호 119), 및 LRAEDTAVY (서열번호 120)에 대해 나타난다. Z 점수는 주어진 HLA 대립유전자에 결합하는 9-mer 프레임에 대한 잠재력을 나타낸다. 상위 5%에서의 모든 점수는 "히트"로 간주되며, 한편 10% 미만의 비-히트(%)는 단순화를 위해 도 9에서 가려진다.
도 11은 본 개시내용의 서열번호 1-15의 확인된 트레지토프에 대한 JanusMatrix 결과의 개요이다. 도 12는 서열번호 16-28을 포함하는, 서열번호 1의 트레지토프 및 서열번호 1에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 13은 서열번호 87-93을 포함하는, 서열번호 10의 트레지토프 및 서열번호 10에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 14는 서열번호 94-100을 포함하는, 서열번호 11의 트레지토프 및 서열번호 11에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 15는 서열번호 12의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 16은 서열번호 101-110을 포함하는, 서열번호 13의 트레지토프 및 서열번호 13에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 17은 서열번호 111-120을 포함하는, 서열번호 14의 트레지토프 및 서열번호 14에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 18은 서열번호 121-124를 포함하는, 서열번호 15의 트레지토프 및 서열번호 15에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 19는 서열번호 29-41를 포함하는, 서열번호 10의 트레지토프 및 서열번호 2에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 20은 서열번호 42-48을 포함하는, 서열번호 3의 트레지토프 및 서열번호 3에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 21은 서열번호 49-50을 포함하는, 서열번호 4의 트레지토프 및 서열번호 4에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. *HUMAN JanusMatrix 일치의 수는 연구 데이터베이스에서 발견된다. 도 22는 서열번호 50의 트레지토프에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 23은 서열번호 51-57을 포함하는, 서열번호 6의 트레지토프 및 서열번호 6에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 24는 서열번호 58-67을 포함하는, 서열번호 10의 트레지토프 및 서열번호 7에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 25는 서열번호 68-74를 포함하는, 서열번호 8의 트레지토프 및 서열번호 8에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 도 26은 서열번호 87-93을 포함하는, 서열번호 9의 트레지토프 및 서열번호 9에 함유된 9-mer에 대한 JanusMatrix 기록이다. 각각의 도 11-26에 대해, *는 연구 데이터베이스에서 발견된 HUMAN JanusMatrix 일치의 수이다. 주어진 EpiMatrix 히트 (특이적 대립유전자에 결합되는 것으로 예측된 입력 서열 내에 함유된 9-mer)에 대해, Janus Matrix 일치는 EpiMatrix 히트로서 동일한 대립유전자에 결합되고 EpiMatrix 히트와의 TCR 대향 접촉을 공유하는 것으로 예측되는 연구 데이터베이스 (예를 들어, 인간 게놈)으로부터 유도된 9-mer이다. 또한, Janus 상동성 점수**는 입력 서열에서의 각각의 EpiMatrix 히트에 대한 연구 데이터베이스의 평균 적용 범위를 나타낸다. 예를 들어, 이들 모두가 연구 데이터베이스에서 1개의 일치를 갖는 8개의 EpiMatrix 히트를 갖는 입력 펩티드는 1의 Janus 상동성 점수를 갖는다. 이들 모두가 연구 데이터베이스에서 2개의 일치를 갖는 4개의 EpiMatrix 히트를 갖는 입력 펩티드는 2의 Janus 상동성 점수를 갖는다. JanusMatrix 상동성 점수는 플랭크(flank)를 포함하여, 임의의 주어진 펩티드에서의 모든 구성성분 9-mer를 고려한다.
가용성 MHC를 결합하는 트레지토프의 평가 방법.
펩티드의 합성. 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)는 직접적인 화학적 합성에 의해 또는 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다 (J Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ED, 1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, NY (Publ)). 모든 펩티드는 순도, 질량 및 정확한 서열을 결정하기 위해 출시 전에 엄격한 품질 관리 특성화를 거친다. 펩티드는 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의해 순도에 대해 평가된다. 펩티드는 ≥90% 순도이고, 각각의 제제는 아미노산 분석을 거쳐 상이한 로트의 펩티드 간에 일관성 및 재현성을 위해 검정에서 동등한 몰량이 사용되는 것을 보장하고, 펩티드 효험 간에 신뢰할 수 있는 비교 연구를 가능하게 할 것이다. 펩티드는 또한 탠덤 질량 분광분석 및 MS CheckT 분석을 사용하여 질량 및 정확한 서열에 대해 평가된다. 특정 양태에 있어서, 트레지토프는 n-말단 아세틸 및/또는 c-말단 아미노 기로 캡핑된다. 선택된 트레지토프의 HPLC, 질량 분광분석 및 UV 스캔 (각각 순도, 질량 및 스펙트럼 보장) 분석은 > 80% 순도를 나타내었다.
HLA 결합 검정. 결합 활성은 EpiVax (로드아일랜드주 프로비던스 소재)로 분석되었고, 본원에 개시된 임의의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)에 대해 수행된다. 사용되는 결합 검정 (Steere AC 등, (2006), J Exp Med, 2003(4):961-71)은 펩티드-MHC 친화성의 간접적인 측정치를 산출한다. 가용성 HLA 분자는 비표지된 실험 트레지토프 및 표지된 대조군 펩티드가 있는 96-웰 플레이트 위에 로딩된다. 결합 혼합물이 (24시간에) 안정된 평형에 도달할 경우, HLA-트레지토프 복합체는 항-인간 DR 항체로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 포획되고 표지용 유로퓸-연결된 프로브 (PerkinElmer, 매사추세츠주 월섬 소재)로 검출된다. 결합된 표지된 대조군 펩티드를 측정하는 시간-분해 형광은 SpectraMax® M5 유닛 (Spectramax, 펜실베이니주 래드너 소재)에 의해 평가된다. 실험 트레지토프의 결합은 표지된 대조군 펩티드의 억제 백분율 (실험 형광/대조군 형광×100)으로 표현된다. (몰 농도의 범위에 걸친) 각 실험 트레지토프에 대한 억제 백분율 값은 표지된 대조군 트레지토프의 특이적 결합의 50%를 억제하는 농도, 트레지토프의 IC50를 계산하기 위해 사용된다.
선택된 실험 트레지토프 (예를 들어, 서열 번호 14)는 DMSO에서 용매화되었다. 희석된 트레지토프 (서열번호 14)는 이후 수성 완충 용액에서 결합 시약과 혼합되어 100,000 nM 내지 100 nM의 최종 농도의 범위가 산출되었다. 트레지토프 (서열번호 14)는 이후 8개의 공통 클래스 II HLA 대립유전자: DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301, 및 DRB1*1501의 패널에 대해 검정되었다. 각 농도에서의 표지된 대조군 펩티드의 억제 백분율로부터, IC50 값은 선형 회귀 분석을 사용하여 각 트레지토프 (서열번호 14)/대립유전자 조합에 대해 유도되었다.
이 검정에서, 실험 트레지토프는 100 nM 이하의 농도에서 대조군 펩티드 결합의 50%를 억제하는 경우 매우 높은 친화도로, 100 nM 내지 1,000 nM의 농도에서 대조군 펩티드 결합의 50%를 억제하는 경우 높은 친화도로, 그리고 1,000 nM 내지 10,000 nM의 농도에서 대조군 펩티드 결합의 50%를 억제하는 경우 중간 친화도로 결합하는 것으로 간주된다. 저친화도 펩티드는 10,000 nM 내지 100,000 nM의 농도에서 대조군 펩티드 결합의 50%를 억제한다. 100,000 nM 미만의 임의의 농도에서 대조군 펩티드 결합의 적어도 50%를 억제하지 못하고, 용량 반응을 나타내지 않는 펩티드는 비-결합제 (NB)로 간주된다.
실시예 2. HLA 클래스 II 분자에 대한 결합에 의한 펩티드 특성화
가용성 MHC 결합 검정은 본원에 개시된 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드) 중 임의의 것에 대해 수행된다. 가용성 MHC 결합 검정은 앞서 기재된 방법에 따라 본 개시내용의 선택된 트레지토프 (예를 들어 트레지토프 (서열번호 14))에 대해 수행되었다. IC50 값 (nM)은 6-포인트 억제 곡선으로부터 유도되었다. 트레지토프 (서열번호 14)에 대한 HLA 결합 결과의 요약은 도 1a에 제시되어 있다. EpiMatrix™ 예측, 계산된 IC50 값, 및 결과 분류는 각 트레지토프 및 HLA 대립유전자에 대해 기록된다. 도 1 b-c는 선택된 클래스 II HLA 대립유전자에 대한 특정 트레지토프에 관한 결합 곡선을 나타낸다. 도 1b는 HLA DRB1 *0801 검정에 대한 결과를 요약하며, 한편 도 1c는 HLA DRB1 *1501 검정에 대한 결과를 요약한다. 본 개시내용의 다른 트레지토프 (예를 들어, 서열번호 1-13 및 15-124)는 유사한 결과를 입증할 것으로 예측된다.
펩티드-노출된 APC의 표현형을 평가하기 위한 방법
전문 항원 제시 세포 (APC)에 의한 클래스 II HLA (HLA-DR) 및 CD86의 표면 발현은 APC가 T 세포 반응을 조절하는 하나의 방법이다. 클래스 II HLA 표면 마커의 발현은 트레지토프에 대해, 특히 대조군 트레지토프 167 (21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재)에 대한 반응에서의 하향-조절에 대해 입증되었다. 추가로, 표면 마커 CD86의 감소된 발현은 향상된 TReg 기능과 긍정적으로 상관된다 (Zheng Y 등, J Immunol, 2004, 172(5):2778-84). 이러한 검정에서, 선택된 트레지토프를 포함하는 후보물질 트레지토프는 전문 APC, 구체적으로 수지상 세포의 표면 상에서의 클래스 II HLA 및 공동자극 분자 CD86의 발현을 하향-조절하는 그것의 능력에 대해 시험된다.
본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)는 EpiVax (EpiVax, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)에서 이전에 개발된 전매 APC 표현형 검정을 사용하여 개별적으로 시험되었다. 이전에 수확된 및 냉동된 PBMC는 해동되고 종래의 수단에 의해 chRPMI에 현탁된다. HLA 유형화는 세포 물질의 작은 추출된 샘플에 대해 수행된다. 검정 0일째에, 0.5x106 세포가 추출되고, 표면 마커 CD11c (수지상 세포에 특이적인 마커)의 존재에 대해 스크리닝되고, 유동 세포측정에 의해 표면 마커 HLA-DR 및 CD86의 존재에 대해 분석된다. 나머지 세포는 (chRPMI + 800ul 배지에서 ml당 4.0x106 세포로) 플레이팅되고, 완충액 단독 (음성 대조군), 트레지토프 167 (양성 대조군) (21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재), Flu-HA 306-318 (음성 대조군) (21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재), 및 Ova 323-339 (음성 대조군) (21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재)을 포함하는 양성 및 음성 대조군 또는 선택된 펩티드 중 하나로 자극된다 (50 μg/mL). 플레이팅된 세포는 37℃에서 7일 동안 인큐베이션된다. 검정 7일째에, 인큐베이션된 세포는 표면 마커 CD11c의 존재에 대해 유동 세포측정에 의해 스크리닝된다. CD11c 양성 세포는 이후 표면 마커 HLA-DR 및 CD86의 존재에 대해 분석된다. 실험 펩티드는 5명의 상이한 인간 공여자로부터 추출된 샘플에서 시험된다.
백혈구 감소 필터는 건강한 공여자로부터 얻은 전혈에서 백혈구를 필터링하기 위해 로드 아일랜드 혈액 센터 (로드아일랜드주 프로비던스 소재)로부터 얻는다. 전혈이 필터를 통해 이동한 후, 필터는 반대 방향으로 플러싱되어 필터 밖으로 수집된 백혈구를 밀어낸다. 백혈구는 종래의 Ficoll™ 분리 구배 (GE Healthcare)를 사용하여 단리된다. 수집된 백혈구는 이후 향후 사용을 위해 냉동된다. 검정에 사용하기 위해 필요한 경우, 냉동된 백혈구는 종래의 방법을 사용하여 해동된다. 하기 논의된 GvHD 연구를 위해, PBMC는 (예를 들어, 캘리포니아주 반 누이스 소재의 HemaCare로부터) 얻고, 실험이 수행된다.
수지상 세포의 표현형의 추정 트레지토프에 대한 노출은 여러 수단에 의해 측정된다. 우선, 각 실험 조건에 대해, CD11c 및 HLA-DR의 표면 발현을 대조하는 도트-플롯이 생성된다. 모든 대조군 및 실험 펩티드에 대해 노출된 세포의 도트-플롯은 유일하게 배양 배지에 노출된 대조군 세포로부터 생성된 도트-플롯 상에서 중첩된다. 중첩은 트레지토프 자극된 그리고 미자극된 CD11c-고 세포(CD11c-high cell) (데이터 미도시) 사이의 HLA-DR 분포에서의 변동을 시각적으로 관측되는 효과적인 방법을 제공한다. HLA-DR의 분포에서의 관찰된 변동은 정성적 측정으로 기록된다. 다음으로, 각각의 도트-플롯의 CD11c-고 세그먼트에 대한 HLA-DR 발현의 강도의 변화가 계산된다. HLA-DR 발현의 강도의 백분율 변화는 펩티드 노출된 세포에 대한 HLA-DR 발현의 평균 형광 지수 (MFI)에서 배지 노출된 세포에 대한 HLA-DR 발현의 MFI를 차감하고 배지 노출된 세포에 대한 HLA-DR 발현의 MFI로 나눈 것에 100을 곱한 것과 동일하다 (HLA - DRMFI펩티드 - HLA - DRMFI배지 / HLA - DRMFI배지 * 100). 다음으로, CD11c 고 집단 중에 제공된 HLA-DR-저 세포 (HLA-DR-low cell)의 백분율의 백분율 변화는 배지 대조군에 상대적으로 각 펩티드에 대해 계산된다. HLA-DR-저 세포의 백분율의 백분율 변화가 계산되고, 펩티드 노출된 세포에 대한 HLA-DR-저의 백분율에서 배지 노출된 세포에 대한 HLA-DR-저의 백분율을 차감하고 배지 노출된 세포에 대한 HLA-DR-저의 백분율로 나눈 것에 100을 곱한 것과 동일하다 (HLA -DR- 저w%펩티드 - HLA -DR- 저%배지 / HLA -DR- 저%배지 * 100). 이 검정에서, CD11c-고 집단에 제공된 관찰된 HLA-DR MFI에서의 음의 변화 및 HLA-DR-저 세포의 백분율의 양의 변화는 HLA의 감소된 발현 및 조절 APC 표현형에 대한 변동을 나타낸다.
T 세포 활성화를 촉진하는 것으로 알려진 공동자극 분자인 CD86의 표면 발현에 대한 트레지토프 노출의 영향을 평가하기 위해 유사한 과정이 사용된다. 우선, 각 실험 조건에 대해, CD11c 및 CD86의 표면 발현을 대조하는 도트 플롯이 생성된다. 모든 대조군 및 실험 트레지토프에 노출된 세포의 도트 플롯은 배양 배지에만 노출된 대조군 세포로부터 생성된 도트 플롯 상에서 중첩된다. 중첩은 트레지토프 자극된 그리고 비-자극된 CD11c-고 세포 사이에서의 CD86 분포의 변동을 시각적으로 관찰하는 효과적인 방법을 제공한다. CD86의 분포의 관찰된 변동은 정성적 측정으로 기록된다. 다음으로, 각 도트 플롯의 CD11c-고 세그먼트에 대한 CD86-고 발현의 강도의 변화가 계산된다. CD86-고 발현의 강도의 백분율 변화는 펩티드 노출된 세포의 CD86 발현의 평균 형광 지수 (MFI)에서 배지 노출된 세포에 대한 CD86-고 발현의 MFI를 차감하고 배지 노출된 세포에 대한 CD86 발현의 MFI로 나눈 것에 100을 곱한 것과 동일하다 (CD86- 고MFI펩티드 - CD86- 고MFI배지 / CD86- highMFI배지 * 100). 다음으로, CD11c 고 집단 중에 제공된 CD86-저 세포의 백분율의 백분율 변화가 계산된다. CD86-고 세포의 백분율의 백분율 변화는 펩티드 노출된 세포에 대한 CD86-고의 백분율에서 배지 노출된 세포에 대한 CD86-고의 백분율을 차감하고 배지 노출된 세포에 대한 CD86-고의 백분율로 나눈 것에 100을 곱한 것과 동일하다 (CD86- 저%I펩티드 - CD86-저%배지 / CD86- 저%배지* 100). 이 검정에서, CD11c-고 집단에 제공된 관찰된 CD86 MFI의 음의 변화 및 CD86-저 세포의 백분율의 양의 변화는 CD86의 감소된 발현 및 조절 APC 표현형에 대한 변동을 나타낸다.
실시예 3. 펩티드 노출된 APC의 특성화
수지상 세포 표현형 검정을 앞서 기재된 방법에 따라 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)에 대해 수행된다.
다양한 펩티드 자극제의 존재하에 5개체의 공여자에 대한 검정 7일째에 분석된 CD11 대 HLA-DR의 표면 발현을 나타내는 도트 플롯이 준비된다. CD11c+/HLA-DR+ 집단의 하향 이동은 획득된 조절 표현형을 나타내는 배지 대조군과 비교하여 본 개시내용의 트레지토프로 처리된 샘플에서 명백한 것으로 예상된다.
도트 플롯은 다양한 펩티드 자극제의 존재하에 5개체의 공여자에 대한 검정 7일째에 분석된 CD11c 대 CD86의 표면 발현을 나타낸다. 배지 대조군과 비교하여 본 개시내용의 트레지토프로 처리된 샘플에 제공된 CD86-저 세포의 증가는 획득된 조절 표현형에 대한 변동을 나타내는 것으로 예상된다. 청구된 트레지토프에 대한 노출은 시험되는 모든 대상체에서의 HLA-DR의 감소된 발현을 유발하는 것으로 추가로 예상된다.
조절 T 세포의 증식에 대한 펩티드 효과를 평가하기 위한 방법
EpiVax (로드아일랜드주 프로비던스 소재)에 의해 수행된 이전의 연구는 양성 대조군 트레지토프 167 (서열번호 134, PAVLQSSGLYSLSLSSVVTVPSSSLGTQ, 21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재)을 포함하는 알려진 트레지토프에 노출된 후 조절 T 세포의 증가된 증식을 입증하였다. 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)는 CD4+CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포 중에서 증식을 유도하는 그것의 능력에 대해 시험된다. 이 검정에서, 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 서열번호 7)을 포함하는 후보물질 트레지토프는 CD4+CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포 중에서 증식을 유도하는 그것의 능력에 대해 시험된다. 이전에 수확된 및 냉동된 PBMC는 해동되고 종래의 수단에 의해 컨디셔닝된 chRPMI (3.3x106 세포/mL)에 현탁된다. 표 2는 평가된 공여자가 다양한 HLA DRB1 슈퍼타입을 나타낸다는 것을 보여준다. 세포는 CFSE (Cat#: 65-0850-84, Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 염색되고 웰당 300,000개 세포로 플레이팅된다. 플레이트는 밤새 (5% CO2 중 37℃에서) 인큐베이션된다. 각 웰은 200 μL의 배지를 함유한다. 예시적인 실험에서, 검정 1일째에, 서열번호 7은 멸균 DMSO에서 재구성되어 10 mg/mL의 최종 스톡 농도를 생성한다. EpiVax (EpiVax, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)에서 수행된 이전의 적정 실험은 0.5 μg/ml 테타누스독소증 톡소이드 (TT) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재)로의 자극이 건강한 대조군 공여자 (로드 아일랜드 혈액 센터, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)로부터 추출된 PBMC에서 측정가능한 CD4+ 효과기 메모리 T 세포 반응을 유도하는 것이 확립되었다. 테타누스독소증 톡소이드 스톡 (100 μg/mL) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재)은 컨디셔닝된 chRPMI에서 희석되어 1 ug/mL의 작업 농도 (2x 농도)를 산출한다. (100 μL 배지에서의) 플레이팅된 세포는 이후 100 μL의 컨디셔닝된 chRPMI (음성 대조군), 100 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 (2x 용액, 양성 대조군) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재), 2991 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 9 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액, 2997 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 3 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액, 또는 6998.2 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 1.8 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액으로 자극된다. 모든 플레이트는 이후 추가의 6일 동안 인큐베이션된다. 검정 5일째에, 100 μL의 상청액을 각 웰로부터 제거하고, 새롭게 컨디셔닝된 chRPMI (TT 대조군 웰 없음)로 대체되거나, 또는 원래 TT 단독으로 또는 TT+트레지토프와 함께 인큐베이션된 웰의 경우 2X TT (1 mg/mL)을 갖는 100 μl의 배지로 대체된다. 여분의 트레지토프가 첨가되지 않는다.
표 2: 공여자의 패널은 HLA 수퍼타입 DRB1 8010, * 0401, * 0701, * 0801, * 1101 및 * 1501을 포함한다.
Figure pct00007
상승된 수준의 FoxP3, CD25, 그란자임 B 및 증식을 나타내는 매우 활성화된 조절 T 세포가 선택된다. 고도로 활성화된 조절 T 세포 및 CD4+ 효과기 T 세포에 대한 게이팅 전략(gating strategy)을 도 2a-c에 나타낸다 (이는 대표적인 결과를 도시함). 도 2a에 나타난 바와 같이, 세포는 우선 게이팅되어 응집물 및 사멸 세포를 제거하고, 생존 세포는 CD4+ T 세포에 대해 게이팅되고, 모든 후속 분석은 이 집단에 대해 실시된다. CD4+ T 세포는 상승된 CD25, FoxP3, 및 낮은 CFSE (증식)에 대해 게이팅된다 (도 2b). 도 2b는 첨가된 TT (좌측)가 없는 대표적인 검정, 0.5 μg/ml TT (우측)가 없는 대표적인 검정의 결과를 보여준다. 도 2c는 이러한 검정의 대표적인 결과를 보여주고 증식되고 활성화된 CD4+ T 세포 집단이 매우 상관되는 것을 도시한다.
실시예 4. 트레지토프는 매우 증식성, 활성화된 조절 T 세포의 집단을 유도한다
조절 T 세포 증식 검정을 앞서 기재된 방법에 따라 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)에 대해 수행된다. 이러한 데이터는 본 개시내용의 트레지토프가 매우 증식성인 활성화된 조절 T 세포의 집단을 강하게 유도하는 것을 입증할 것으로 예상된다.
CD4+ 효과기 T 세포의 증식에 대한 펩티드 효과를 평가하기 위한 방법
PBMC 세포 집단에 함유된 CD4+ 효과기 메모리 T 세포는 알려진 T 세포 에피토프로의 자극에 대해 반응하여 증식되도록 유도될 수 있다.
이 실험의 목적은 직접적인 (TReg의 결합 및 활성화) 또는 간접적인 (APC 표현형의 조절) 수단에 의해 항원 자극된 CD4+ 효과기 메모리 T 세포의 증식을 억제하는 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)의 능력을 확립하는 것이다. 초기 및 예시적인 연구를 위해 서열번호 7을 시험하였다 (도 3-6).
EpiVax (로드아일랜드주 프로비던스 소재)에서 수행된 이전의 연구는 양성 대조군 트레지토프 167 (서열번호 134, 21st Century Biochemicals, 메사추세츠주 말버러 소재)을 포함하는 알려진 트레지토프에 대한 노출 후 조절 T 세포의 증가된 증식을 입증하였다. 이 검정에서, 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 서열번호 7)를 포함하는 후보물질 트레지토프는 CD4+CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포 중에서 증식을 유도하는 그것의 능력에 대해 시험된다. 이전에 수확된 및 냉동된 PBMC는 해동되고 종래의 수단에 의해 컨디셔닝된 chRPMI (3.3x106 세포/mL)에 현탁시켰다. 표 2는 평가된 공여자는 다양한 HLA DRB1 슈퍼타입을 나타내는 것을 보여준다. 세포는 CFSE (Cat#: 65-0850-84, Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 염색되고, 웰당 300,000개의 세포로 플레이팅된다. 플레이트는 밤새 (5% CO2 중 37℃에서) 인큐베이션된다. 각 웰은 200 μL의 배지를 함유한다. 검정 1일째에, 서열번호 7은 멸균 DMSO에서 재구성되어 10 mg/mL의 최종 스톡 농도를 생성한다. EpiVax (EpiVax, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)에서 수행된 이전의 적정 실험은 0.5 μg/ml 테타누스독소증 톡소이드 (TT) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재)로의 자극이 건강한 대조군 공여자 (로드 아일랜드 혈액 센터, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)로부터 추출된 PBMC에서 측정가능한 CD4+ 효과기 메모리 T 세포 반응을 유도하는 것이 확립되었다. 테타누스독소증 톡소이드 스톡 (100 μg/mL) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재)은 컨디셔닝된 chRPMI에서 희석되어 1 ug/mL의 작업 농도 (2x 농도)를 산출한다. (100 μL 배지에서의) 플레이팅된 세포는 이후 100 μL의 컨디셔닝된 chRPMI (음성 대조군), 100 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 (2x 용액, 양성 대조군) (Astarte Biologics, 워싱턴주 보셀 소재), 2991 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 9 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액, 2997 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 3 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액, 또는 6998.2 μL 테타누스독소증 톡소이드 용액 + 1.8 μL 서열번호 7 용액의 100 μL의 희석액으로 자극된다. 모든 플레이트는 이후 추가의 6일 동안 인큐베이션된다. 검정 5일째에, 100 μL의 상청액을 각 웰로부터 제거하고, 새롭게 컨디셔닝된 chRPMI (TT 대조군 웰 없음)로 대체되거나, 또는 원래 TT 단독으로 또는 TT+트레지토프와 함께 인큐베이션된 웰의 경우 2X TT (1 mg/mL)을 갖는 100 μl의 배지로 대체된다. 여분의 트레지토프가 첨가되지 않는다.
검정 7일째에, 세포는 인큐베이션으로부터 제거된다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 세포는 우선 게이팅되어 응집물 및 사멸 세포를 제거하고, 생존 세포는 CD4+ T 세포에 대해 게이팅되고, 모든 후속 분석은 이 집단에 대해 실시된다. CD4+ T 세포는 상승된 CD25, FoxP3, 및 낮은 CFSE (증식)에 대해 게이팅된다 (도 2b). 활성화된 T 효과기 집단은 CD4+/CD25-고/FoxP3-중간체 (CD4+/CD25hi/FoxP3int) (도 2b)로서 확인된다. CD4+/Foxp3-저/CD25-높은 (CD4+/Foxp3lo/CD25hi) T 세포의 증식은 CFSE 염색 (Cat#: 65-0850-84, Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)으로의 희석으로부터 추정되고, % 증식은 CFSE-저 (CFSElo) 집단에 의해 결정된다 (도 2c).
실시예 5. 펩티드 서열번호 7은 CD4+ 효과기 T 세포의 증식 및 활성화를 억제하였다.
증식 자극제 (테타누스독소증 톡소이드)가 서열번호 7과 함께 공동-전달되는 경우에 CD4+ 효과기 세포의 활성화의 변화 (도 3, 우측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감된 절대값을 나타냄; 도 4, 우측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감된 정규화된 값을 나타냄; 도 5, 우측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감되지 않은 절대값을 나타냄; 및 도 6, 우측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감되지 않은 정규화된 값을 나타냄) 및 증식 (도 3, 좌측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감된 절대값을 나타냄; 도 4, 좌측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감된 정규화된 값을 나타냄; 도 5, 좌측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감되지 않은 절대값을 나타냄; 및 도 6, 좌측 패널 - 배지 단독 대조군이 차감되지 않은 정규화된 값을 나타냄)가 측정되고, 주로 T 효과기 기억 세포로 구성되는 CD4+ T 세포의 증식성 반응이 특성화된다.
T 세포 증식 검정은 앞서 기재된 방법에 따라 본 개시내용의 트레지토프에 대해 수행된다. 도 3-6은 표 2에 개시된 다양한 공여자에서 펩티드 서열번호 7은 용량-의존 방식으로 테타누스독소증 톡소이드에 반응하는 활성화된 효과기 CD4+ T 세포 (CD4+/CD25-고/FoxP3-중간체, CD4+/CD25hi/FoxP3int로서 나타냄)의 집단을 강하게 억제한 것을 나타낸다.
CD8+ 효과기 T 세포에 대한 펩티드 효과를 평가하기 위한 방법.
본 발명자는 앞서 PBMC 세포 집단에 함유된 CD8+ 효과기 메모리 T 세포가 알려진 클래스 I T 세포 에피토프로의 자극에 반응하여 증식되도록 유도될 수 있음을 나타내었다. 이 검정의 결과는 직접적인 (TReg의 결합 및 활성화) 또는 간접적인 (APC 표현형의 조절) 수단에 의해 항원 자극된 CD8+ T 효과기 메모리 T 세포의 증식을 억제하는 본원에 개시된 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)의 능력을 확립한다.
T 세포 증식 검정은 앞서 기재된 방법에 따라 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)에 대해 수행된다. 2개체의 건강한 공여자로부터의 PBMC는 해동되고 종래의 수단에 의해 컨디셔닝된 chRPMI (3.3x106 세포/mL)에 현탁된다. 세포는 CFSE (Cat#: 65-0850-84, Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로 염색되고 웰당 300,000개 세포로 플레이팅된다. 플레이트는 밤새 (5% CO2 중 37℃에서) 인큐베이션된다. 검정 1일째에, 본 개시내용의 트레지토프는 멸균 DMSO에서 재구성되어 20 mg/mL의 최종 스톡 농도를 생성한다. chRPMI에서 최종 농도의 2배의 본 개시내용의 트레지토프의 중간체 용액은 앞서 기재된 바와 같이 제조된다. 본 개시내용의 트레지토프의 최종 농도는 2.5, 5, 10 및 20 μg/ml에서 시험된다. CD8+ 자극 항원으로서, 인간 사이토메갈로바이러스, 엡슈타인-바르 바이러스, 및 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 23 MHC 클래스 I 제한된 바이러스 에피토프로 구성된 CEF 펩티드 풀이 사용된다. CEF 펩티드는 0, 1, 2 또는 4 μg/ml의 세포 및 배지 (대조군) 또는 본 개시내용의 트레지토프를 웰 (2μg/mL에 대해 나타낸 데이터)에 첨가된다. 모든 플레이트는 추가의 6일 동안 인큐베이션된다. 검정 5일째에, 100 μL의 상청액이 각 웰로부터 제거되고, 새롭게 컨디셔닝된 chRPMI로 대체된다.
생존/사멸 마커, 세포외 마커 CD4, CD8α 및 CD25, CD127, CD45RA 및 CCR7, 및 세포내 마커 FoxP3에 대해 세포를 염색하기 위해 종래의 방법이 사용된다. FACS 분석 후, 세포는 게이팅되어 응집물 및 사멸 세포가 제거된다. 생존 세포 집단에 대해, CD8α 및 CD4 세포는 별도로 게이팅되고 각 집단은 앞서 설명한 바와 같이 증식 (CFSE 저 집단) 또는 활성화 (CD25-고/FoxP3 저/중간체, FoxP3int_lo CD25hi에 나타낸 바와 같음)에 대해 분석된다.
실시예 6. 본 개시내용의 트레지토프는 CD8+ 효과기 T 세포의 증식을 억제한다.
건강한 공여자로부터의 PBMC가 CEF 펩티드 혼합물로 자극되는 경우에 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)에 의한 CD8+ T 세포 반응의 잠재적 억제가 시험된다. 본 개시내용의 트레지토프는 용량-의존 방식으로 CEF 펩티드에 대한 CD8+ T 세포 증식성 반응뿐만 아니라 활성화를 강하게 억제하는 것으로 예상된다.
(7) 면역 반응 ( GvHD )에 대한 펩티드 효과를 평가하기 위한 방법
골수 이식은 건강하지 않은 골수가 증여된 건강한 골수로 대체되는 절차이다. 골수 이식은 백혈병 (Vincente D 등, (2007), Bone Marrow Transplant, 40(4):349-54)과 같은 생명을 위협하는 혈액암, 재생 불량 빈혈과 같은 골수 부전을 초래하는 질환 (Champlin RE 등, (2007), Blood, 109(10):4582-5), 및 다른 면역계 또는 유전적 질환 (Chinen J 및 Bucley RH, (2010), J Allergy Clin Immunol, 125(2 Suppl 2):S324-35)을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)은 골수 이식의 주요 합병증으로 알려져 있고, 발병 후 즉각적이고 높은 사망률을 특징으로 한다 (Lee SJ 등, (2003), Biol Blood Marrow Transplant, 9(4):215-33). GvHD에서, 심각한 조직 손상은 이식된 공여자 조직에서 HLA가 일치하지 않는 수령체 조직으로 이동하는 공여자 림프구에 의해 발생한다. 증상은 수령체에의 주입에 의해 발생하는 다양한 기관 예컨대 피부, 폐, 간 및 장의 심각한 손상을 포함한다 (Goker H 등, (2001), Exp Hematol, 29(3):259-77).
EpiVax (로드아일랜드주 프로비던스 소재)에 의해 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (류코팩(leukopak)으로부터 구함, (Hemacare, 캘리포니아주 반 누이스 소재))의 면역 결핍된 마우스로의 이식은 20-50 일까지의 사망을 일으키는 GvHD-유사 증후군을 유발하는 것이 이전에 관찰되었다. 이 모델에서, 이식된 PBMC 내에 함유된 T 세포는 호스트 마우스의 피부, 간, 장, 폐 및 신장으로 침윤되어 심각한 손상 및 궁극적으로 사망을 일으킨다. 면역결핍된 마우스 균주 NOD-scid　IL-2Rγnull　(NSG - Jax 스톡 # 005557) (The Jackson Laboratory, 메인주 바 하버 소재) 마우스 및 인간 PBMC의 이식을 사용하여 GvHD의 진행에 대해 본 개시내용의 트레지토프의 영향을 평가한다. 검정 -1일째에, 마우스는 중량에 의해 일치된 치료 및 대조군 그룹으로 그룹화되고, 이후 X-선 조사 공급원 (Lifespan Hospital, 로드아일랜드주 프로비던스 소재)으로부터 100 cGy로 조사된다. 6시간 조사 후, 마우스 대상체는 꼬리 정맥을 통해 IV로 1천만 hPBMC를 받는다. 일부 마우스는 조사를 받지만 PBMC를 받지 않는다 (표 3에서의 그룹 8). 검정 0일째로부터 시작하여 검정 25일까지 계속하여, 대상체 마우스에 표 2에 요약된 일정에 따라 투여한다.
체중 감소, 자세, 활동성, 및 털과 피부의 외관을 포함하는 임상적 관찰을 주당 3회 실시한다. 대상체 마우스는 개시일로부터 >20% 체중 감소를 나타내었거나 다음의 임상적 징후의 조합을 나타낸 경우 안락사된다: (i) 개시일로부터의 10-20% 체중 감소 (ii) 차가운 감촉 (iii) 구부정한 자세 및 지저분한 털과 함께 무기력함.
표 3: GVHD 연구를 위한 실험군 및 투여 스케줄
Figure pct00008
실시예 7. 본 개시내용의 트레지토프는 이종 GvHD 모델에서 GvHD의 발달을 억제한다.
면역결핍 마우스로의 인간 림프구의 이식 및 본 개시내용의 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)로의 후속 처리는 생체내 모델에서 면역 기능에 대한 본 개시내용의 트레지토프의 평가를 가능하게 한다. 본 개시내용의 트레지토프는 T-세포 활성화를 억제하고 이에 따라 질환의 진행을 지연시키는 것으로 예상된다. 평가하는 데 사용되는 주요 평가 기준은 시험 대상체의 생존이다. 본 개시내용의 트레지토프로 처리되는 그룹에 대한 GvHD의 발달의 지연은 카플란-마이어 생존 곡선에 의해 시사되는 바와 같이 관찰되는 것으로 예상된다. 본 개시내용의 트레지토프로의 처리는 음성 대조군 및 양성 대조군 IVIG에 비해 연장된 생존을 초래하는 것으로 예상된다.
실시예 8. FVIII-트레지토프 작제물의 생성.
트레지토프와 면역원성 단백질의 융합은 면역원성 단백질의 말초 관용의 유도를 초래할 수 있다. 응고 인자 VIII은 심각한 A형 혈우병을 가진 사람에서의 면역원성이다. 이러한 작제물을 생성하는 하나의 예시적인 방법에서, 트레지토프 및 인자 VIII의 코딩 서열로 이루어지는 키메라 작제물이 생성된다 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). 간략하게는, 카복시-말단 및/또는 아미노-말단에서 트레지토프에 융합된 인자 VIII 코딩 영역은 중첩 올리고를 어닐링함으로써 생성되고 발현 플라스미드로 서브클로닝된다. 트레지토프는 또한 예를 들어 돌연변이유발 (즉, 부위 지정 돌연변이유발)에 의해 인자 VIII로 삽입될 수 있다. 플라스미드는 DG44 CHO 세포 및 선택된 안정한 형질감염체로 형질감염된다. 키메라 단백질은 면역친화성 칼럼 상에서 정제되고 관용원성에 대해 평가된다. 표 3 및 4는 이러한 단백질 (예를 들어, 키메라 단백질)의 예시적인 구현예를 예시한다. 표 4 및 5는 서열번호 1과 융합된 인자 VIII를 도시하고, 이러한 작제물은 서열번호 1-124 중 하나 이상 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 서열을 갖는, 그 안에 포함된 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 (Treg 활성 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)를 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
표 4: 인자 VIII- 트레지토프 : 서열번호: 135 ( 트레지토프 굵은체 )
Figure pct00009
Figure pct00010
표 5: 인자 VIII- 트레지토프 : 서열번호: 136 ( 트레지토프 굵은체 )
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 9. 향상된 백신 전달 비히클의 생성
Fc 수용체에 대한 Fc 결합은 T 및 B 림프구에 제시되는 항원 제시 세포의 흡수를 향상시킨다. 서열번호 1-124의 트레지토프는 IgG 분자 내에 위치하고 억제 신호를 전달하도록 작용한다. 보다 구체적으로, 서열번호 1, 3-8, 14-15, 16-28, 42-74, 및 111-124는 인간 IgG 중쇄 가변 영역 내에 위치하고, 서열번호 2, 9-11, 29-41, 및 75-100은 인간 IgG 중쇄 불변 영역 내에 위치하고, 서열번호 12는 인간 IgG 경쇄 가변 영역 내에 위치하고, 서열번호 13 및 101-110은 인간 IgG 경쇄 불변 영역 내에 위치한다. IgG (또는 이의 항원-특이적 항체 단편 (비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함함))의 변형으로 그 안에 함유된 서열번호 1-124 중 하나 이상이 더 이상 MHC 분자 및/또는 조절 T 세포에 결합되지 않고, 이는 억제 효과를 회피하면서 백신 후보물질의 효율적인 표적화를 가능하게 한다. 트레지토프의 MHC 분자에 대한 결합을 감소시키는 변형은 유용하다. 표 6은 이러한 변형을 예시한다. 관심대상의 다양한 단백질 또는 에피토프 슈도-단백질 및 트레지토프 변형된 lgG Fc로 구성된 키메라 작제물이 설계된다 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). 간략하게는, 관심대상의 단백질 또는 에피토프 슈도-단백질은 중첩 올리고를 어닐링시킴으로써 생성되고, 트레지토프 변형된 Fc 융합 발현 플라스미드로 서브-클로닝된다. 플라스미드는 DG44 CHO 세포 및 선택된 안정한 감염체로 형질감염된다. 키메라 단백질 동종이량체는 단백질 A 칼럼 상에서 정제되며 면역원성에 대해 평가된다. 표 6은 키메라 단백질의 하나의 예시적인 구현예를 예시하며 여기서 관심대상의 슈도-단백질은 변형된 Fc 단백질에 융합된 일련의 면역원성 T 세포 에피토프 (본 실시예에서 엡슈타인 바르 바이러스 (EBV)로부터 유래됨)이고 이에서 트레지토프는 더 이상 MHC 클래스 II 분자에 결합하지 않도록 변형되었고 자연 조절 T 세포를 자극할 수 없다. 표 6에서의 EBV-트레지토프 변형된 Fc 서열 (Kb 신호 서열)은 밑줄 친 텍스트로 지정된다. 트레지토프는 굵은체 텍스트로 지정된다. 트레지토프 변형된 아미노산은 음영 처리된 텍스트로 지정된다. 인간 Fc 영역은 이탤릭체 텍스트로 지정된다. 표 4 및 5는 서열번호 1과 융합된 인자 VIII을 도시하는 한편, 이러한 작제물은 서열번호 1-124 중 하나 이상 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 서열을 갖는, 그 안에 포함된 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드 (Treg 활성 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)를 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
Figure pct00013
실시예 10. Fc로의 트레지토프의 삽입
서열번호 1-124의 하나 이상의 트레지토프의 삽입 또는 융합에 의한 IgG (또는 이의 항원-특이적 항체 단편 (비제한적으로 Fab, F(ab')2, Fv, 디설파이드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 폐쇄 입체형태 다중특이적 항체, 디설파이드-연결된 scfv, 디아바디를 포함함))의 변형으로 이에 의해 MHC 분자 및 조절 T 세포에의 변형된 IgG 또는 그의 단편의 결합을 향상시키고 이는 면역자극성 효과의 억제를 가능하게 한다. 서열번호 1-124 (및 그의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 트레지토프의 삽입 또는 융합에 의한, (예를 들어, 특정 항체 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 누락된 상응하는 구간을 갖는 경우와 같이) 항체, 예컨대 IgG 분자 또는 그의 단편의 변형은 유용하다. 표 7은 인간 IgG1 Fc 단백질에 삽입되거나 융합된 트레지토프(서열번호 29)의 하나의 예시적인 구현예를 예시한다. 트레지토프는 굵은체 텍스트로 지정된다. 인간 Fc 영역은 이탤릭체로 지정된다. 표 7은 서열번호 29의 삽입을 도시하고, 이러한 작제물은 서열번호 1-124 중 하나 이상 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에서 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지는 서열을 갖는, 그 안에 포함된 본 개시내용의 하나 이상의 폴리펩티드(Treg 활성 조절 T-세포 에피토프, 트레지토프, 트레지토프 펩티드, 또는 T-세포 에피토프 폴리펩티드)의 삽입을 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
Figure pct00014
(8) 트레지토프-혈액 성분 콘주게이트의 생성
트레지토프의 혈액 성분 콘주게이트 예컨대 알부민과의 융합은 트레지토프 페이로드를 위한 운반 단백질로서 유용하다. 트레지토프-혈액 성분 콘주게이트는 생체내 트레지토프의 반감기를 연장시키고, 신속한 단백질 분해로부터 트레지토프를 보호하고, 순환으로부터의 신속 제거 및/또는 신속한 신장 배출로부터 트레지토프를 보호할 수 있고, 이는 대상체 신체 전반에 걸쳐 트레지토프-혈액 성분 콘주게이트의 넓은 분포를 가능하게 하고, 적절한 면역 세포 (예컨대 대식세포 및 APC)로의 트레지토프의 전달을 보조하고, 특정 면역 세포 (예컨대 대식세포 및 APC)의 세포내 이입 경로에 의해 트레지토프가 처리되게 하고, 상기 면역 세포에 의한 항원으로서의 트레지토프의 제시를 보조한다.
트레지토프-혈액 성분 콘주게이트는 미국특허 제6,849,714호, 미국특허 제6,887,470호, 미국특허 제7,256,253호, 및 미국특허 제7,307,148호에 개시된 바와 같이 반응성 모이어티를 트레지토프 펩티드에 부착시켜 변형된 트레지토프 펩티드를 생성하고, 이후 혈액 성분 상의 반응성 작용기와 변형된 트레지토프 펩티드의 반응성 모이어티 사이에 결합을 형성함으로써, 본 개시내용의 트레지토프 펩티드 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드)를 변형시켜 형성될 수 있다. 알부민은 바람직한 혈액 성분이고 그 이유는 그것이 트레지토프-알부민 콘주게이트를 적절한 세포, 예컨대 대식세포 및 APC로 운반할 것인 Fc 신생아 결합 도메인을 함유하기 때문이다. 또한, 알부민은 아미노산 34 (Cys34) (인간 세린 알부민의 아미노산 서열 중의 아미노산의 위치)에서의 시스테인을 함유하고, 이는 대략 5의 pKa를 갖는 유리 티올을 함유하고, 이는 알부민의 바람직한 반응성 작용기로서 역할을 할 수 있다. 알부민의 Cys34는 변형된 트레지토프 펩티드의 바람직한 반응성 모이어티인 말레이미도프로피온아미도 (MPA)와의 안정한 티오에스테르 결합을 형성할 수 있다. 알부민과 MPA로 변형된 트레지토프 펩티드 사이의 안정한 티오에스테르 결합은 생리학적 조건하에 절단될 수 없다.
트레지토프 펩티드는 본원에 개시된 바와 같을 수 있고, 특정 양태에 있어서 바람직하게는 서열번호 1-124, 또는 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 선택된다. 하나 이상의 라이신은 트레지토프 펩티드의 N-말단 상에 존재할 수 있으며, 예컨대, 비제한적으로, 서열번호 1-124로부터 선택된 펩티드의 N-말단 상에 첨가될 수 있다. 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 링커 (예를 들어, PEG2 또는 PEG12)는 하나 이상의 라이신과 트레지토프 서열 사이에, 또는 트레지토프 서열의 N-말단 상에 존재한다. 양태에 있어서, 리소좀 절단 부위, 예컨대 (순차적으로 N-말단으로부터 C-말단까지) 발린 및 시트룰린로 이루어진 카텝신 B 부위는 PEG2 모이어티와 트레지토프 서열 사이에 존재한다. 말레이미드-기반 화학물질은 1:1 몰비로 혈액 성분, 바람직하게는 혈청 알부민에 대해 변형된 트레지토프 펩티드를 공유적으로 연결하기 위해 사용될 수 있다. 혈액 성분에 변형된 트레지토프 펩티드를 연결하는 것은 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
카텝신 B는 리소좀 시스테인 프로테아제의 계열의 첫 번째 기재된 구성원이다. 카텝신 B는 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 활성 둘 모두를 보유하며, 후자의 경우 펩티딜디펩티다제로서 역할을 한다. 카텝신 B는 이것이 항원 제시 세포 중의 리소좀 구획 내에 존재하는 경우 알루민으로부터 트레지토프의 적절한 절단을 용이하게 하는 트레지토프 펩티드 설계에 포함되었다. 발린-시트룰린이 종래에 성공적으로 사용된 카텝신 B 절단 부위이고, 항체 약물 접합체 (예를 들어, 약물 브렌툭시맙 베도틴에서의 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 콘주게이트)에서 FDA 승인을 받았다. 부위의 혼입에 대한 본 발명자의 관심은 그것이 APC에 존재하는 경우 효율적인 MHC 클래스 II 제시를 위해 인간 혈청 알부민으로부터 트레지토프의 적절한 절단을 허용하는 절단 부위를 제공하는 것이다. EpiVax는 카텝신 B 부위의 혼입이 트레지토프 조성물의 설계에 필수적인지 여부를 결정하는 것을 추구하였다.
실시예 11. 생체외 접합 에 의한 트레지토프 -알부민 콘주게이트의 생성
표준 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카보닐) 고체상 펩티드 합성 화학을 펩티드 합성을 위해 사용하였다. Intavis™ MultiPep™ 자동화 펩티드 합성기에서 합성을 수행하였다. 아미노산은 불용성 폴리스티렌 수지 지지체에 부착되면서 성장하는 펩티드 사슬에 (C-말단에서 N-말단으로; 우측에서 좌측으로) 단계적으로 첨가된다. 그것의 아미노 말단에서 Fmoc 기에 의해 보호되는 아미노산 빌딩 블록은 하나 이상의 축합 시약 (예를 들어, 헥사플루오로포스페이트 아자벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄 (HATU), O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU))을 통한 카복실산 말단의 활성화 후 성장하는 사슬에 커플링되었다. 각 첨가시의 반응 부산물은 용매 세척 (6X, 디메틸포름아미드　(DMF))으로 제거된다. 각 커플링 및 캡핑 단계 후, Fmoc는 펩티드 수지의 피페리딘 탈보호 (2x 수행; Asp 탈수를 억제하기 위해 0.1M HOBt와 함께 DMF 부피/부피 중의 20%)를 통해 제거되고, 수지는 DMF로 6x 세척되었고, 그 다음 아미노산이 첨가되었다. 카텝신 B 절단 부위는 트레지토프 서열의 N-말단에 혼입되었다.
PEG2 작제물 ("PEG2" 또는 "P2")의 경우, 원하는 트레지토프 펩티드가 완성된 후, PEG2 모이어티는 N-말단에 첨가되고, 이어서 N-말단에의 4개의 라이신의 첨가가 후속된다. PEG2 및 라이신은 혼입되어 카텝신 B에 대한 잠재적 도킹 영역을 제공하였다. 추가로, PEG2 및 라이신 (라이신 측쇄 상의 일째 아민에 의함)은 최종 작제물의 용해도를 증가시킬 것이다. PEG2 작제물의 조성은 (하기) 표 8에 나타낸다.
Figure pct00015
PEG12 작제물 ("PEG12" 또는 "P12")의 경우, PEG6의 2회 첨가가 트레지토프 펩티드 합성 후에 추가되었다. 이 경우에, 라이신은 첨가되지 않았다. PEG 길이를 증가시키는 것은 또한 카텝신 B에 대한 도킹 영역을 제공하였고, 트레지토프의 용해도를 개선하였다. PEG2 작제물의 조성은 (하기) 표 9에 나타낸다.
Figure pct00016
후속적으로, 소량의 펩티드 작제물은 수지로부터 제거되었고, 펩티드 샘플은 절단되고 TIS (트리이소프로필실란, 5%) 및 물 (2.5%)의 존재하에 트리플루오로아세트산 (TFA. 92.5% v/v)으로의 처리에 의해 탈보호되어 측쇄 보호기를 소거하였다. 각각의 미가공 선형, 펩티드 (~3-5 mg)는 20 mm x 50mm YMC C18, 5 μm, Hydrosphere 칼럼을 사용하는 분취 역상 HPLC (Gilson)에 의해 정제되었다. 펩티드는 >90% 순도 (분석적 HPLC를 통해 결정함)로 정제되었고, 질량은 카텝신 B 평가 전에 ABI-SCIEX QSTAR XL Pro Qo-TOF 질량 분광계를 이용하여 검증되었다. 나머지 펩티드 (PEG2-트레지토프 및 PEG12-트레지토프)는 이후 3-말레이미도프로프리오산 산 (MPA)의 첨가를 위해 수지 상에 두었다.
재조합 인간 카텝신 B (R&D 시스템™의 카탈로그 953-CY)를 사용하여 트레지토프 펩티드로 조작된 Val-Cit 부위의 절단을 평가하였다. 활성 검정 프로토콜은 0.01 μg의 rh카텝신 B 및 10uM의 펩티드 기질의 최종 검정 조건과 함께 R&D Systems™의 권장에 따라 사용되었다. (15분 동안 RT에서) 정제된 펩티드와 함께의 카텝신 B의 인큐베이션 이후. 펩티드는 Qstar XL Pro™을 사용하는 질량 분광계에 의해 평가되었다. PEG2 펩티드는 성공적인 절단을 가지지 않았고, 카텝신 B 프로토콜의 추가의 변형은 성공적인 절단을 이루지 않은 것으로 결정되었다. PEG12 생성물의 경우, 성공적인 절단은 입증되었다.
카텝신 B에 의한 Val-Cit 부위의 절단의 평가 후, 3-말레이미도프로프리오산 산 (MPA)의 반응성 모이어티는 PEG2 및 PEG12 펩티드의 N-말단에 첨가되었다. 아미노산 빌딩 블록에 유사하게, MPA는 Fmoc 기에 의해 보호되고, 카복실산 말단의 활성화 후 성장 사슬에 커플링된다. 최종 MPA-트레지토프 작제물은 수지로부터 제거되었고, 펩티드 샘플은 절단되고 TIS (트리이소프로필실란, 5%) 및 물 (2.5%)의 존재하에 트리플루오로아세트산 (TFA. 92.5% v/v)으로의 처리에 의해 탈보호되었다. 각각의 미가공 선형, 펩티드 (~20 mg)는 20 mm x 50mm YMC C18, 5 μm, Hydrosphere 칼럼을 사용하는 분취 역상 HPLC (Gilson™)에 의해 정제되었다. MPA-펩티드는 >90% 순도 (분석적 HPLC를 통해 결정함)로 정제되었고, 질량은 도 10-13에 나타난 바와 같이, ABI-SCIEX QSTAR XL Pro™ Qo-TOF 질량 분광계를 이용하여 검증되었다. 총 15mg의 MPA-P2 및 MPA-P12 트레지토프는 rHSA (Albucult-Novozyme™)에 대한 후속 접합에 사용되어 최종 사전형성된 HSA-트레지토프 콘주게이트를 구성하였다.
엘만(Ellman) 시약 (5,5'-디티오-비스-[2-니트로벤조산])이 사용되어 설프하이드릴-함유 화합물 예컨대 시스테인의 표준 곡선과 비교함으로써 샘플에서의 설프하이드릴기를 추정하였다. 엘만 시험은 복수의 농도로 rHSA (Sigma™, Albucult®)에 대해 수행되어 분석의 정확도를 보장하였다. 엘만 시약 (Sigma™), Sigma™ lot RF-009로부터의 rHSA는 말레이미드와의 접합을 위해 이용가능할 것인 유리 시스테인에 대해 평가되었다. 본 발명자는 rHSA의 78%가 (하기) 표 10에 나타난 바와 같이 이용가능한 유리 시스테인을 가지는 것으로 추정하였다.
표 10: rHSA 샘플 중 유리 시스테인의 예측
Figure pct00017
펩티드는 dH20에서 가용화되고, rHSA가 첨가되고 (15mg/ml), 100mM 인산염 완충액이 첨가되어 8의 최종 pH를 얻었다. 펩티드는 HSA에 10X 몰 과잉으로 첨가된다. 펩티드/HSA는 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되고 그 다음 대략 24-30 시간 동안 4℃에서 인큐베이션되었다.
접합 단계 후, HSA-콘주게이트는 이후 우선 실온에서 2시간 동안 PBS (pH 7.0)에 투석되고, 그 다음 4℃에서 18-24시간 동안 새로운 PBS에 대한 2번 변경이 후속되었다. 이러한 과정은 HSA 및 HSA-트레지토프 콘주게이트 제제로부터 과잉의 펩티드를 제거하였다.
엘만 시험은 각 콘주게이트에 대해 수행되어 rHSA 유리 시스테인을 통해 펩티드의 접합을 입증하였고, 반응에서의 콘주게이트의 효율을 결정하였다. HSA-접합 제제는 기존 제제에 내재하는 감소된 HSA(메르캅타부민) (HAS 프리-접합의 ~22%)을 제거하지 않았다. 나머지 미반응된 HSA는 HSA-MPA_P2-트레지토프 작제물에 대해 14%인 것으로 결정되었고, 이는 말레이미드-트레지토프와의 접합 후 유리 시스테인의 14%가 잔류하는 것을 의미한다. 따라서, 총 rHSA 제제의 ~64%는 MPA_P2-트레지토프 펩티드와 반응되었다.
(9) 면역 세포에 대한 트레지토프 -혈액 성분 콘주게이트의 효과를 평가하기 위한 방법
말레이미드-기반 화학물질은 트레지토프 (예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 1-124의 아미노산 서열 (및/또는 그의 단편 또는 변이체), 및 선택적으로 서열번호 1-124의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가의 아미노산)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어지는 펩티드 또는 폴리펩티드) 페이로드를 재조합 HSA (rHSA)에 1:1 화학양론으로 공유적으로 연결하기 위해 사용될 수 있다. 말레이미도-프로피온아미도 (MPA)는 HSA에서 이용가능한 유리 Cys34와 안정한 티올 에스테르 콘주게이트를 형성한다. HSA는 신생아 수용체 (FcRn) 재순환 경로를 활용하여 임의의 접합된 페이로드의 반감기를 증가시키고 잠재적으로 반복 투여의 필요성을 감소시킨다. rHSA는 또한 접합된 페이로드를 림프절에 전달하는 것으로 알려져 있고, FcRn을 발현하는 수지상 세포 및 다른 항원 제시 세포에 의해 세포내 이입된다.
EpiVax는 rHSA-트레지토프 콘주게이트가 트레지토프들 사이에 절단 부위를 함유하도록 설계하였다. 절단 부위는 트레지토프가 rHSA 분자로부터 방출되는 것을 가능하게 하는 조기 엔도좀 프로테아제에 특이적이고, 이는 세포 표면 상에의 MHC 클래스 II 제시의 효율을 증가시킨다. 이 FDA-승인된 rHSA 접합 화학 접근법의 장기간 입증된 이력뿐만 아니라 성공적인 제조 이력은 본 발명자의 T1D 페이로드의 전달을 위한 이의 선택을 지지한다.
트레지토프-혈액 성분 콘주게이트가 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 형성된 경우, 트레지토프-혈액 성분 콘주게이트는 예를 들어 트레지토프 펩티드 단독과 비교하여 효과기 T-세포 및 활성 조절 T-세포 및 그것의 증식을 억제하는 그것의 유효성에 대해 평가될 수 있다. 또한, 트레지토프-혈액 성분 콘주게이트는 특정 항원에 대해 면역 관용을 유도하는 그것의 수용력에 대해 평가될 수 있다.
실시예 12. 트레지토프-알부민 전달 비히클의 억제 효과의 평가
트레지토프 전달 비히클의 억제 효과를 결정하기 위해, 건강한 공여자 PBMC는 테타누스독소증 톡소이드 방관자 억제 검정 (TTBSA)에 사용되고, 분석을 CD4 T-세포 증식, T 세포의 활성화, T 효과기 및 T 조절 세포의 빈도에 대해 실시하여 도 10에 표시된 바와 같이 Treg/Teff의 비율을 결정한다.
클리닉으로의 번역을 위한 트레지토프의 최상의 조합을 최적화하기 위해, 시험관내에서 효과기 T-세포 반응을 상승적으로 억제하는 그것의 능력에 대한 트레지토프의 조합의 효과가 분석된다. 이러한 비교가 용이하도록, 고처리량 시험관내 검정은 인간 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 개발된다. 테타누스독소증 톡소이드 방관자 억제 검정 (TTBSA)로 지칭되는 이 검정은 테타누스독소증 톡소이드 (TT) 백신접종의 이력을 가진 개체들에서 유발되는 테타누스독소증에 특이적인 T 기억 세포를 억제하는 Treg의 능력을 이용한다.
0일째에, PBMC는 인큐베이션되고, 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 (CFSE) 염료로 염색된다. 1일째에, 세포는 배지, 테타누스독소증 톡소이드, 및 8, 6, 또는 24 μg/mL의 트레지토프; 또는 10, 40, 또는 100 μg/mL의 트레지토프-알부민 콘주게이트를 첨가함으로써 자극된다. 테타누스독소증 톡소이드는 0.5 μg/ml의 최종 농도로 사용되고, 여기서 농도는 체계적으로 적정되고 최적화되어 트레지토프의 억제 능력을 측정한다. 배지 단독을 포함하는 음성 대조군이 포함된다. 7일째에, L/D 세포 집단 마커, 세포외 염색, 및 세포내 염색이 세포에 첨가된다. 8일째에, 판독이 취해진다. 활성화 마커 (예를 들어, CFSE, CD25) 및 세포 집단 마커 (예를 들어, L/D, CD2c, CD4, 및 FoxP3)의 분석을 위한 세포 분류 검정이 수행된다.
TT와 함께의 공여자 PBMC의 인큐베이션은 T 효과기 세포의 증식을 자극한다. 트레지토프는 시험관내에서 TT와 함께 PBMC에 첨가되어 TT-특이적 T 효과기 세포의 증식을 억제하는 CD25hiFoxP3hi 조절 T 세포를 활성화시킨다. 트레지토프는 용량 의존 방식으로 CD4+ T 효과기 세포의 (CFSE 희석에 의해 측정되는 바와 같은) 증식 및 (CD25 발현에 의해 측정되는 바와 같은) 활성화를 상당하게 억제하고, 또한 Treg (CD25+/FoxP3+/CD127lo)를 약간 증식시키고, 이는 Treg/Teff 세포의 비율의 증가에 의해 제시된다. 효과기 T 세포 증식의 감소는 예를 들어 생체내 Treg의 유도에 의해 지지되는 바와 같은 T 조절 세포의 활성화 및/또는 TT-특이적 T 효과기의 Treg로의 전환의 직접적인 결과이다.
TTBSA를 사용하여, 이용가능한 다수의 트레지토프 각각은 개별적으로 그리고 쌍으로 조합하여 CD4+ T 세포 증식을 억제하는 그것의 잠재력에 대해 검사된다. 가장 유망한 IgG-트레지토프 펩티드는 추가의 시험을 위해 선택된다. 특정 트레지토프, 트레지토프 A는 다른 단일 트레지토프와 비교하여 TTBSA에서 가장 억제성인 활성이 있는 단일 트레지토프이다. 트레지토프 A를 트레지토프 C와 조합하는 것은 TT-특이적 T 세포 증식에 대한 훨씬 더 큰 억제 효과가 관찰된다. A+C를 rHSA에 접합하는 것은 시험관내 효능이 개선한다.
따라서, TTBSA를 사용하면, HSA-트레지토프 콘주게이트가 CD4+ T 세포 증식 및 활성화를 억제하고, Treg 세포 대 Teff 세포의 비율을 증가시키는 것을 나타낸다.
실시예 13. 사전형성된 콘주게이트 HSA - 트레지토프 치료제 및 말레이미드 -트레지토프 펩티드 치료제의 유효성의 평가
사전형성된 콘주게이트 HSA-트레지토프 치료제 및 유리-말레이미드-트레지토프 펩티드의 OVA 면역화에 대한 반응에 대한 효과가 평가된다. 후자의 유리-말레이미드 펩티드는 대상체의 내인성 HSA의 유리-Cys34에 대한 반응성 말레이미드기를 통한 주사 후 생체내에서 접합을 형성한다. 5 mg의 MPA-P2 및 MPA-P12는 유리-MPA-트레지토프로 사용되며, 샘플의 비접합 HSA는 접합된 HSA 대 접합되지 않은 HSA의 몰비를 계산하여 설명된다.
마우스 (암컷 C57BL/6)은 0 일째 (CFA) 및 14일째 (IFA)에 50 mg 난백알부민 (OVA)으로 피하 면역화된다. 사전형성된 HSA 콘주게이트 처리는 0일째에 CFA로 OVA가 투여된다. 시험 그룹은 OVA/HSA-P2-고 및 OCA/HSA-P2-저를 포함한다. 주사당 OVA는 50 μg이고, HSA는 800 μg이고, HSA-P2H(고) 접합은 825 μg (~20 μg 트레지토프)이다. HSA-P2L(저) 접합은 100 μg (~3.7 μg 트레지토프)이다. 4개의 대조군 그룹은 PBS 단독, PBS/OVA, HSA/OVA, 및 트레지토프/OVA를 포함한다. 유리 말레이미드 트레지토프 펩티드의 유용성을 평가하기 위해 마지막 아암이 포함되어 있으며 꼬리 정맥으로 IV로 투여된다. 그룹당 5마리의 마우스가 있다.
마우스는 17일째에 희생된다. 희생시, 심장이 출혈되고 비장이 각 동물에 대해 수확된다. IFNγ/IL2 플루오로스폿 검정, IFNγ/IL17 플루오로스폿 검정, CD4 T 세포 증식, 및 T 세포 특성화는 OVA으로 자극된 비장세포에 대해 수행된다. PHA는 비장 세포 검정을 위한 양성 대조군 자극으로 사용된다. PHA 자극에서 모든 웰은 합류된다. 자극 후 SFC (스폿 형성 세포)는 음성 대조군 (배지 웰)에 대해 50 스폿/106보다 커야 하며, 또한 2 초과의 자극 지수를 가져야 하는 허용 기준이 사용된다. IFNγ/IL2 플루오로스폿 및 IFNγ/IL17 플루오로스폿 검정 둘 모두에 따라, IFNγ 생산은 처리에 의해 억제되고, HSA-단독 대조군은 처리군에 비해 덜 억제된다.
T-세포 증식 및 특성화 검정의 경우, 비장세포 샘플은 CFSE 희석에 의한 (시험관내OVA 펩티드에 대한 반응에서) OVA 특이적 T 세포 증식의 억제에 대해 그리고 TCR Tg 세포에서의 FoxP3 발현의 유도에 대해 평가된다. FoxP3+　Treg를 검출하기 위해, 배출 림프절의 단일-세포 현탁액은 15분 동안 2.4G2 mAb (항-CD16/32, ATCC)와 함께 인큐베이션되어 FcR을 차단하고 이후 40분 동안 4℃에서 항 CD3, CD4, CD25 및 항-클론형 KJ1-26으로 염색된다. KJ1-26은 DO11.10 형질전환 마우스에 의해 발현된 클론형 TCR에 대해 특이적이다. 세포는 이후 투과화되고 FoxP3 핵 발현을 위해 염색되고 FACS 분석을 위해 Thermo Attune NxT Autosampler™에서 획득된다. CD4+CD25+FoxP3+KJ1-26+　생존 세포 게이트 집단은 PBS 또는 HSA 단독과 비교하여 OVA-특이적 T 조절 세포의 수 및 비율을 결정하기 위해 확립된다.
항원-특이적 T 세포 증식은 CFSE 희석에 의해 평가된다. 배출 림프절을 수확하여 세포 증식 염료 CFSE로 염색하여 단일-세포 현탁액을 2　x106　세포/mL로 준비한다. 세포는 10 μg/ml 농도의 OVA 323-339 (New England Peptide, 미국 매사추세츠주 가드너 소재)의 존재하에 웰당 100 μL로 96-웰 플레이트에 첨가된다. 세포는 72 시간 동안 자극되고 40분 동안 4℃에서 CD3α, CD4, CD8, CD54RA, CCR7, CD25, CD127, IFNγ HLA-II, CD69, CD154, IL-17, IL-21로의 염색을 위해 수확된다. 세포는 고정되고, 투과되고 FoxP3 발현을 위해 염색되고, 유동 세포측정에 의해 분석된다. rHSA로 처리된 마우스와 비교하여 유리 말레이미드-트레지토프 및 HSA-트레지토프 콘주게이트로 처리된 마우스에서의 OVA-특이적 KJ1-26+CD4+CD25+FoxP3+ 적응성 (전환된) T 조절 세포의 증가가 관찰된다. 유리 말레이미드-트레지토프 및 HSA-트레지토프 콘주게이트는 rHSA 단독과 비교하여 KJ1-26+　CD4+ T 효과기 세포의 OVA-특이적 증식을 더 효과적으로 감소시킨다.
17일째에 수확한 혈액으로부터의 혈청 내 항-OVA 항체는 항체 농도를 결정하기 위한 연속 희석액 플롯 및 표준 ELISA를 포함하는 ELISA에 의해 혈청에서 평가된다. HSA-콘주게이트 및 유리 말레이미드로 처리된 마우스는 상이한 희석액에서의 흡광도 및 표준 곡선에 대한 흡광도의 비교에 의해 표시되는 바와 같이 비처리와 비교하여 더 낮은 혈청 항체 적정농도를 갖는다.
균등물
본 개시내용이 이의 특정 구현예와 관련하여 기재되지만, 이는 추가로 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되거나 관례적인 관행 내에 있고 첨부된 특허청구범위의 범위에 속하는 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포함하여 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 조정을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EpiVax, Inc. <120> REGULATORY T CELL EPITOPES <130> EPV0007 <150> US 63/000630 <151> 2020-03-27 <150> US 63/077,253 <151> 2020-09-11 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 1 5 10 15 Lys His Tyr Cys Ala 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 1 5 10 15 Leu His Gln Asp Trp 20 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Thr 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Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu 130 135 140 Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr 145 150 155 160 Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe Leu Ala Phe Phe Leu Asp Leu Ile 165 170 175 Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu 180 185 190 Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met 195 200 205 Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His His Asp Asp Ser 210 215 220 Leu Pro His Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val 225 230 235 240 Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile Gly Cys Lys Gly Pro Gly 245 250 255 Pro Gly Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val 260 265 270 Glu Arg Thr Gly Pro Gly Pro Gly Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 275 280 285 Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 290 295 300 Gly Pro Gly Pro Gly Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala 305 310 315 320 Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Gly Pro 325 330 335 Gly Pro Gly Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln 340 345 350 Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Gly Pro Gly Pro Gly Ala Ile Lys 355 360 365 Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Gly 370 375 380 Pro Gly Pro Gly Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg 385 390 395 400 Gly Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 405 410 415 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 420 425 430 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 435 440 445 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 450 455 460 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asn Asn Ser 465 470 475 480 Thr Asn Arg Ala Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 485 490 495 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 500 505 510 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 515 520 525 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 530 535 540 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 545 550 555 560 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 565 570 575 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 580 585 590 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 595 600 605 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 610 615 620 Leu Ser Pro Gly 625 <210> 138 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 138 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Gln Asp Trp Leu Asn 65 70 75 80 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Glu Gln Tyr 115 120 125 Gln Ser Thr Tyr Arg Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220

Claims (88)

  1. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드.
  2. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드.
  3. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  5. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어진 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  6. 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제7항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  9. 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법으로서,
    서열번호: 1-124, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단리된 조절 T-세포 에피토프의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    면역 반응은 적어도 하나의 치료 단백질에 의한 적어도 하나 이상의 요법적 치료, 백신에 의한 치료 또는 적어도 하나의 항원에 의한 치료의 결과인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조절 T-세포 에피토프는 생체 외에서 단리된 수지상 세포에 투여되고, 상기 수지상 세포는 대상체에 재도입되는, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    조절 표현형은 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현의 감소를 특징으로 하는, 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 T 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 CD4+ T 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 CD8+ T 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프의 투여는 하나 이상의 B 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  19. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 투여는 CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포를 활성화시키는, 방법.
  20. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 투여는 CD4+ T-세포의 활성화를 억제하는, 방법.
  21. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 투여는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 활성화 또는 증식을 억제하는, 방법.
  22. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 투여는 B-세포의 활성화 또는 증식을 억제하는, 방법.
  23. 제9항에 있어서,
    하나 이상의 조절 T-세포 에피토프의 투여는 선천성 면역 반응, 적응성 면역 반응, 효과기 T 세포 반응, 기억 T 세포 반응, 헬퍼 T 세포 반응, B 세포 반응, ηκT 세포 반응, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 반응을 억제하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 조절 T-세포 에피토프 및/또는 그의 단편 및 변이체의 유효량 및 하나 이상의 면역 자극 T-세포 에피토프 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물은 상기 면역 자극 T-세포 에피토프 폴리펩티드에 의해 활성화된 면역 반응을 억제하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 하나 이상의 면역 자극 T-세포 에피토프 폴리펩티드는 적어도 하나의 치료 단백질, 백신에 의한 치료 또는 적어도 하나의 항원에 의한 치료인, 조성물.
  26. 인간에서 면역 반응을 억제하는데 효과적인 하나 이상의 단리된 조절 T-세포 에피토프(트레지토프)를 포함하는 약제학적 조성물로서,
    적어도 하나의 단리된 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    적어도 하나의의 조절 T-세포 에피토프 펩티드는 서열번호: 7의 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  28. 제26항에 따른 트레지토프 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 필요로 하는 대상체에서 조절 T-세포를 자극하는 방법으로서,
    제26항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  30. 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법으로서,
    제26항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 필요로 하는 대상체에서 항원 특이적 면역 반응을 억제하는 방법으로서,
    제26항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    대상체는 알러지, 자가면역 질환, 이식 관련 장애, 효소 또는 단백질 결핍 장애, 지혈 장애, 암, 불임; 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염 또는 혈액 응고 장애를 겪고 있는, 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    면역 반응은 적어도 하나의 치료 단백질에 의한 치료, 백신에 의한 치료 및 적어도 하나의 항원에 의한 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 요법적 치료의 결과인, 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    약제학적 트레지토프 조성물의 투여는 하나 이상의 항원 제시 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  35. 제31항에 있어서,
    약제학적 트레지토프 조성물의 투여는 하나 이상의 수지상 세포를 조절 표현형으로 이동시키는, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    조절 표현형은 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에서 CD11c 및 HLA-DR 발현의 감소를 특징으로 하는, 방법.
  37. 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법으로서,
    하나 이상의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 트레지토프 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 단리된 폴리펩티드는 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어지는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    트레지토프 조성물의 투여는 CD4+/CD25+/FoxP3+ 조절 T-세포를 활성화시키는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    트레지토프 조성물의 투여는 CD4+ 효과기 T-세포의 활성화를 억제하는, 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    트레지토프 조성물의 투여는 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 활성화 또는 증식을 억제하는, 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    트레지토프 조성물의 투여는 B-세포의 활성화 또는 증식을 억제하는, 방법.
  42. 제38항에 있어서,
    대상체는 알러지, 자가면역 질환, 이식 관련 장애, 효소 또는 단백질 결핍 장애, 또는 혈액 응고 장애를 겪고 있는, 방법.
  43. 제38항에 있어서,
    면역 반응은 적어도 하나의 치료 단백질에 의한 치료, 백신에 의한 치료 및 적어도 하나의 항원에 의한 치료로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 요법적 치료의 결과인, 방법.
  44. 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위한 키트로서,
    제26항에 따른 조성물을 포함하는, 키트.
  45. 제44항에 있어서,
    유효량의 항원 또는 알러지항원을 추가로 포함하는, 키트.
  46. 환자의 조절 T-세포 집단을 확장하는 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하고; T-조절 세포의 수가 증가하여 확장된 조절 T-세포 조성물을 생성하는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 제26항의 트레지토프 조성물의 유효량과 접촉시켜 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 확장시키는 단계; 및
    (c) 상기 증가된 수의 조절 T-세포를 상기 환자에게 반환하는 단계.
  47. 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 자극하는 방법으로서, 하기를 포함하는, 방법:
    (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    (b) 생물학적 샘플로부터 조절 T-세포를 단리하고; T-조절 세포가 자극되어 하나 이상의 생물학적 기능을 변경시키는 조건 하에, 단리된 조절 T-세포를 제26항의 트레지토프 조성물의 유효량과 접촉시켜 생물학적 샘플에서 조절 T-세포를 자극하는 단계.
  48. 제26항에 있어서,
    조절 T-세포 에피토프는 공유 결합, 비공유 결합 또는 표적 항원에 대한 면역 반응의 축소에 사용하기 위한 특정 표적 항원과 혼합되어 있는 것인, 조성물.
  49. 제48항에 있어서,
    억제 효과는 천연 TReg 또는 적응성 TReg 또는 천연 TReg의 바이러스 동족체에 의해 매개되는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서,
    효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 B 세포 중 어느 하나는 조절 T-세포 에피토프의 억제 효과를 받는 것인, 조성물.
  51. IgG 항체 또는 그의 단편을 포함하는 면역글로불린-G (IgG) 함유 분자의 면역원성을 향상시키는 방법으로서,
    IgG 항체 또는 그의 단편으로부터 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 확인 및 제거를 포함하고,
    하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조절 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 분자 및/또는 조절 T 세포에 더 이상 결합하지 않도록 변형되는, 방법.
  52. IgG 항체 또는 그의 단편을 포함하는 면역글로불린-G (IgG) 함유 분자의 면역원성을 감소시키는 방법으로서,
    IgG 항체 또는 그의 단편으로의 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프의 삽입을 포함하고,
    하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 서열번호: 1-124의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    삽입된 조절 T-세포 에피토프는 IgG 항체 또는 그의 단편 내의 천연 위치에 위치하지 않거나, 또는 IgG 항체 또는 그의 단편은 상기 삽입 단계 전에 이러한 트레지토프가 누락된 것인, 방법.
  54. 이종성 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 T-세포 에피토프 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물로서,
    T-세포 에피토프 폴리펩티드는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어지는, 폴리펩티드 조성물.
  55. 제54항에 있어서,
    T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 N-말단에 연결된 것인, 폴리펩티드 조성물.
  56. 제54항에 있어서,
    T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 C-말단에 연결된 것인, 폴리펩티드 조성물.
  57. 제54항에 있어서,
    이종성 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 생물학적 활성 분자는 면역원성 분자, T-세포 에피토프, 바이러스 단백질, 및 박테리아 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 조성물.
  58. 제54항에 있어서,
    이종성 폴리펩티드는 T-세포 에피토프 폴리펩티드에 작동적으로 연결된 것인, 폴리펩티드 조성물.
  59. 대상체에서 면역 반응을 억제하기 위해 조절 T-세포를 유도하는 방법으로서,
    대상체에게 치료적 유효량의 폴리펩티드 조성물을 투여하는 것을 포함하고,
    폴리펩티드 조성물은 이종성 폴리펩티드에 연결된 하나 이상의 T-세포 에피토프 폴리펩티드를 포함하며,
    하나 이상의 T-세포 에피토프 폴리펩티드는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 N-말단에 융합되는, 방법.
  61. 제59항에 있어서,
    T-세포 에피토프 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는, 방법.
  62. 제59항에 있어서,
    이종성 폴리펩티드는 생물학적 활성 분자를 포함하고, 생물학적 활성 분자는 면역원성 분자, T-세포 에피토프, 바이러스 단백질, 및 박테리아 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  63. 제59항에 있어서,
    폴리펩티드 조성물은 유효량의 하나 이상의 항원 및/또는 알러지항원을 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제59항에 있어서,
    면역 억제 효과는 천연 조절 T-세포에 의해 매개되는, 방법.
  65. 제59항에 있어서,
    면역 억제 효과는 적응성 조절 T-세포에 의해 매개되는, 방법.
  66. 제59항에 있어서,
    T-세포 에피토프 조성물은 효과기 T-세포 반응을 억제하는, 방법.
  67. 제59항에 있어서,
    T-세포 에피토프 조성물은 헬퍼 T-세포 반응을 억제하는, 방법.
  68. 제59항에 있어서,
    T-세포 에피토프 조성물은 헬퍼 B-세포 반응을 억제하는, 방법.
  69. 제66항에 있어서,
    T-세포 에피토프 조성물은 효과기 T-세포의 사이토카인 분비를 억제하는, 방법.
  70. 변형된 폴리펩티드에 연결된 혈액 성분을 포함하는, 트레지토프-혈액 성분 접합체로서,
    상기 변형된 폴리펩티드는 그에 부착된 반응성 모이어티를 갖고,
    상기 변형된 폴리펩티드는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프를 포함하며,
    상기 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어지는,
    트레지토프-혈액 성분 접합체.
  71. 제70항에 있어서,
    상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어지는, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  72. 제70항에 있어서,
    상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 성분은 알부민인, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 성분은 인간 혈청 알부민인, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산에 부착되는, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  76. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 카복시 말단 아미노산에 부착되는, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산과 카복시 말단 아미노산 사이에 위치하는 아미노산에 부착되는, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  78. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 석신이미딜 또는 말레이미도 기인, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 3-말레이미도프로프리오산 모이어티인, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  80. 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액 성분과 변형된 폴리펩티드 사이의 접합은 말레이미드 연결인, 트레지토프-혈액 성분 접합체.
  81. 변형된 폴리펩티드로서,
    부착된 반응성 모이어티를 가지며, 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 이루어지는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산으로 본질적으로 이루어지는, 변형된 폴리펩티드.
  83. 제82항에 있어서,
    상기 하나 이상의 조절 T-세포 에피토프는 서열번호: 1-124로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 및/또는 그의 단편 및 변이체, 및 선택적으로 서열번호: 1-124의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C-말단 상에 임의의 비율로 분포된 1 내지 12개의 추가 아미노산을 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
  84. 제82항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산에 부착되는, 변형된 폴리펩티드.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 카복시 말단 아미노산에 부착되는, 변형된 폴리펩티드.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 변형된 폴리펩티드의 아미노 말단 아미노산과 카복시 말단 아미노산 사이에 위치하는 아미노산에 부착되는, 변형된 폴리펩티드.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 석신이미딜 또는 말레이미도 기인, 변형된 폴리펩티드.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응성 모이어티는 3-말레이미도프로프리오산 모이어티인, 변형된 폴리펩티드.
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