KR20220151522A

KR20220151522A - Tie2 작용제 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220151522A
Application number: KR1020210093451A
Authority: KR
Inventors: 김호민; 고규영; 조경희; 배점일
Original assignee: 기초과학연구원; 한국과학기술원
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2022-11-15
Also published as: CN117999283A

Abstract

본 발명은 인간 Tie2의 Ig3 Fn3 도메인에 결합하는 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체의 결합에 의해, 호모이합체 (homodimer) Tie2가 다각형 조립체 (polygonal assembly)를 형성하여, 클러스터링 (clustering) 및 활성화될 수 있다.

Description

Tie2 작용제 항체 및 이의 용도 {Tie2 Agonistic Antibodies and Uses Thereof}

본 발명은 인간 Tie2의 Ig3 Fn3 (membrane proximal fibronectin type III) 도메인에 결합하는 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체의 결합에 의해, 호모이합체 (homodimer) Tie2가 다각형 조립체 (polygonal assembly)를 형성하여, 클러스터링 (clustering) 및 활성화될 수 있다.

혈관신생은 개체의 발생, 성장, 보존 및 항상성 유지 과정에서 다양한 조절 인자에 의해 역동적으로 발생한다. 이 과정에서 새롭게 형성된 혈관은 주위 세포에 영양소, 산소, 호르몬 등의 다양한 생체 재료를 위한 운송 채널의 역할을 한다. 기능 및 구조적으로 비정상적인 혈관은 다양한 질환의 발병 및 진행의 직간접적인 원인이 된다. 종양 혈관은 기능 및 구조 결함으로 저산소증을 악화시켜, 종양의 진행 및 다른 조직으로의 전이를 초래하고, 종양 조직의 중심에 항암제가 잘 전달되지 않도록 한다. 결함이 있는 혈관은 암 이외에도 다른 각종 질병이나 질환에서 확인될 수 있다. 그 예로는 다양한 안과 질환 (예를 들어, 당뇨병성 황반 부종, 노인성 황반변성), 바이러스 감염 및 패혈증 등의 급성 염증 반응을 들 수 있다. 따라서, 병리적 혈관을 정상화할 수 있는 치료제가 존재한다면, 혈관 이상을 가진 다양한 환자의 치료에 적용할 수 있다.

비정상적인 혈관신생을 억제하고 혈관 투과성을 감소시키기 위해, 직접 Tie2를 활성화시키는 방안이 고려되고 있다. Tie2 수용체에 직접 결합하여 Tie2의 인산화 및 활성화를 유도하는 재조합 단백질도 개발되고 있고, 다수의 전임상 암 및 안구 모델에서 그 치료효과가 시험되고 있다. COMP-Angl 및 Vasculotide가 그 대표적인 예다. 이들 제제는 항-혈관신생 활성과 항-침투 활성을 나타냈지만, 매우 짧은 반감기 및 불안정한 물리화학적 성질을 가지는 단점이 있다. 또한, 소분자 화합물 (AKB - 9778)이 탈인산화효소 VE-PTP의 저해제로 개발되었다. VE-PTP는 인산화된 Tie2에서 인산기를 제거하여 Tie2을 불활성화시키는 역할을 한다. 이러한 화합물은 다른 수용체도 비특이적으로 활성화시킨다는 단점이 있지만, VE-PTP를 저해함으로써 Tie2 활성을 간접적으로 증가시키는 작용을 한다. 또한, Tie2 활성화 항체가 개발되어 있다 (US6365154B1, US20170174789A1). 이러한 항체는 혈관내피세포의 생존율을 높여 혈관 누출을 억제했다. 흥미롭게도, 식물 추출물중 하나가 Tie2 활성을 유도하는 것으로 나타나, 스킨 케어 화장품으로 사용될 수 있음이 청구되어 있다 (예를 들어, JP2011102273A, JP2018043949A, JP2015168656A).

이와 같이, Tie2는 혈관의 성장과 안정성을 촉진하는 내피세포 특이적 수용체 티로신 키나제이고, 허혈성 및 염증성 혈관 질환의 매력적인 치료 대상이 될 수 있다. Tie2 작용제 항체 및 올리고머 안지오포이틴 (Angpt1) 변이체는 잠재적인 치료제로 개발되어 왔다. 다만, Tie2의 클러스터화 및 활성화에서 역할에 대한 기본 메커니즘은 명확하게 확인되지 않았다. 또한, Angpt1 변이체는 생산과 보관에 어려움을 수반한다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 Tie2 작용제 항체를 개발하기 위하여 노력한 결과, 인간 Tie2 작용제 항체를 개발하고, Tie2의 Fn3 도메인에 특이적으로 결합하여 Tie2 호모이합체가 다각형의 조립체 (polygonal assembly)로 연결되어 클러스터화 및 활성화될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 항체는 인간 Tie2의 Ig3 Fn3 (membrane proximal fibronectin type III) 도메인에 결합하고, 상기 항체의 결합에 의해, 호모이합체 (homodimer) Tie2가 다각형 조립체 (polygonal assembly)를 형성하여, 클러스터링 (clustering) 및 활성화되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 도메인 (VH), 서열번호 3의 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인 (CH), 서열번호 2의 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 도메인 (VL) 및 서열번호 4의 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인 (CL))을 포함하는 Fab을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물을 제공한다.

본 출원의 발명자들은 Tie2 Fn (membrane proximal fibronectin type III) 도메인을 타겟으로 하는 인간 Tie2 작용제 항체 hTAAB 및 이의 인간화 항체를 개발하였다. Tie2/hTAAB 복합체 구조는 Tie2 클러스터링의 새로운 모드를 통해 작동한다. hTAAB가 Tie2/hTAAB 복합체 구조를 형성하여 Tie2 클러스터링의 신규 모드로 작동하고, Tie2 Fn3 도메인에 특이적으로 결합하여 Tie2 호모이합체가 다각형의 조립체 (polygonal assembly)로 연결됨을 확인하였다. hTAAB에 의해 유발되는 Tie2 다각형 조립체에 대한 Fn3 매개 Tie2 호모이량체화의 중요성을 확인하고 Tie2 작용제가 Tie2의 클러스터화 및 활성화를 어떻게 유도하는지 이해할 수 있다. 또한, hTAAB의 구조 기반 인간화 항체를 제작함으로써, 잠재적인 임상 적용가능성을 확인하였다.

도 1a 내지 도 1e는 Tie2 활성화 마우스 단클론 항체의 생성을 나타낸 것이다.
a. Tie2 수용체의 개략적 도메인 구조 및 하이브리도마 기술에 의한 단클론 항체 생성 전략. Ig 면역글로불린 유사 도메인; EGF 표피성장인자 유사 도메인; Fn, fibronectin type III 도메인.
b. SPR 및 BLI 분석에 의해 각각 결정된 인간 (왼쪽) 또는 마우스 (오른쪽) Tie2 대한 hTAAB의 결합 동태. 평형해리상수 (KD, M)는 오프-속도와 온-속도 비율 (koff / kon)으로 계산되었다. 속도론적 파라미터는 1 : 1 결합 모델을 사용하여 Biacore Insight EvaluationSoftware의 글로벌 피팅 기능으로 결정되었다.
도 2a 내지 도 2d는 Tie2 Fn2-3의 구조 비교 결과를 나타낸 것이다.
a. 키메라 hTAAB Fab 단독 (검은 선)과 Tie2 ECD 변이체 (Ig3-Fn3, 마젠타 선; Fn1-3 파란색 선; 및 Fn2-3 노란색 선) 복합체의 크기 배제 크로마토그래피 (왼쪽) . 용출 분획은 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석되었다 (오른쪽).
b. 키메라 hTAAB Fab 결합 Tie2 Fn2-3 모노머 (검정)와 이전에 보고된 Tie2 Fn2-3 (빨강, PDB : 5MYB 체인 A) 및 Fn1-3 (녹색, PDB : 5UTK 체인 A)의 단량체 구조 비교. 구조는 리본 그림으로 표시.
c. 키메라 hTAAB Fab 결합 Tie2 Fn2-3 이합체 (검정)와 이전에 보고된 Tie2 Fn2-3 이합체 구조 (빨강, PDB : 5MYB)와 비교.
d. 키메라 hTAAB Fab 결합 Tie2Fn2-3 이합체 (검정)과 이전에 보고된 Tie2 Fn1-3 이합체 구조 (PDB : 5UTK)와 비교. 결정 격자 내의 2 개의 비대칭 단위 Tie2Fn1-3 이합체는 각각 녹색과 청록색으로 착색되어 있다.
도 3a 내지 도 3d는 Tie2 Fn2-3와 복합체 형성한 hTAAB Fab의 전반적 구조를 나타낸 것이다.
a. 2 : 2 hTie2 Fn2-3/키메라 hTAABFab 복합체의 전체 구조. 이량체 복합체의 2배축은 검은 타원으로 표시되어 있다. 키메라 hTAABFab의 중쇄 및 경쇄는 각각 진한 오렌지색과 연한 오렌지색으로 표시되어 있다. hTie2 Fn2-3 이합체는 연록색 및 청록색으로 표시되어 있다.
b. 인간 및 마우스 Tie2Fn2-3 도메인의 서열 비교. 마우스 Tie2 서열에서 점은 인간 Tie2와 동일한 잔기임을 보여준다.
c. 표면 표현은 Tie2 Fn2-3 (위)와 키메라 hTAAB Fab (아래)의 상호작용 인터페이스를 보여주는 오픈북 뷰이다. hTie2Fn2-3와 키메라 hTAABFab의 색상은 도 3a의 색상과 동일하지만 각각의 결합면에 반전하고 있다. 키메라 hTAABFab 6 개의 CDR 루프는 다른 색의 선으로 표시되어 있다 (아래).
d. hTAAB의 중쇄 (위) 및 경쇄 (아래)의 가변영역과 가장 가까운 인간 및 마우스 가변영역 생식세포계열 유전자 서열 비교. 마우스 및 인간의 생식 세포 계열 서열 중 점은 hTAAB와 동일한 잔기를 보여준다. (b-d) 키메라 hTAAB Fab의 중쇄 및 경쇄와 상호작용하는 hTie2 잔기는 각각 진한 오렌지색과 연한 주황색으로 표시되며, 중쇄 및 경쇄 모두와 상호작용하는 V730은 빨간색으로 강조 표시된다 (b와 c 위). hTie2 Fn3와 상호작용하는 키메라 hTAABFab 잔기는 청록색으로 표시되어 있다 (c 아래, d).
도 4a 내지 도 4d는 키메라 hTAAB Fab과 hTie2 Fn3 사이의 결합 인터페이스에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
a, 주요 분자 상호작용 (A, B, C 영역)의 확대도. hTie2 Fn3/키메라 hTAAB Fab 상호작용 (빨간색, 녹색 및 파란색 상자) 및 hTie2 이량체화 (검정색 상자)에 관여하는 잔기는 스틱으로 표시되고 레이블되어 있다. 수소 결합 및 정전기 상호작용은 점선으로 표시되어 있다.
b, hTAAB 결합에 관여하는 A, B, C 영역의 주요 아미노산 잔기. hTAAB 상호작용 잔기는 왼쪽에 나열되어 있으며, Tie2의 대응하는 상호작용 잔기는 오른쪽에 나열되어 있다. 잔기 파트너 간의 상호작용은 빨강 (이온 상호작용), 블랙 (수소 결합), 파랑 (소수성 상호작용)으로 표시된다.
c, PyMOL의 Poisson-Boltzmann 방정식에 따라 계산된 hTie2 Fn2-3/키메라 hTAABFab 복합체의 정전기 전위. 구조는 정전기 특성 (파랑: 양전하로 대전, 빨강: 음전하로 대전)을 반영한 컬러지도와 함께, 오픈북뷰 및 표면 표현으로 표시된다. 상호작용하는 영역은 노란색 선으로 강조 표시된다.
d, hTie2Fn2-3 및 키메라 hTAABFab의 소수성 잔기가 표면에 나타나고 상호작용 인터페이스는 검은 선으로 표시되어 있다.
도 5a 내지 도 5d는 Tie2, Tie1 Fn2-Fn3 도메인 및 키메라 hTAAB Fab의 서열 얼라인먼트(sequence alignments) 결과를 나타낸 것이다.
a. 인간 (H. sapiens, UniProt : Q02763) 마우스 (M. musculus, UniProt : Q02858), 쥐 (R. norvegicus, UniProt : D3ZCD0), 원숭이 (M. fascicularis, UniProt : A0A2K5VRI3), 소 (B. taurus, UniProt : Q06807)과 개 (C.familiaris, UniProt : F1P8U6) Tie2Fn2-3 서열 정렬.
b. 인간 (H. sapiens, UniProt : Q02763)와 마우스 (M. musculus, UniProt : Q02858) Tie2 Fn2-3 및 인간 (H. sapiens, UniProt : P35590)와 마우스 (M. musculus, UniProt Q06806) Tie1 Fn2-3의 서열 정렬.
c. 키메라 hTAAB의 중쇄 가변영역과 가장 가까운 마우스 및 인간 생식세포계열 유전자의 서열 정렬 (위) 및 키메라 hTAAB의 중쇄 감마 1 불변영역 (hIGHV1 * 01)과 가장 가까운 마우스 생식세포계열 유전자 서열 정렬 (아래).d. 키메라 hTAAB의 경쇄 가변영역과 가장 가까운 마우스 및 인간 생식세포계열 유전자의 서열 정렬 (위) 및 키메라 hTAAB의 경쇄 카파 불변영역 (hIGKC1 * 01)과 가장 가까운 마우스 생식세포계열 유전자 서열 정렬 (아래).
(a-d) 파란색 사각형은 키메라 hTAABFab 중쇄와 hTie2Fn3 인터페이스에서 상호작용하는 잔기들을 나타낸다. 흰색 사각형은 키메라 hTAABFab 경쇄와 hTie2Fn3 사이의 상호작용 잔기들을 나타낸다. 빨간색 동그라미는 hTie2 잔기 V730을 나타내고 있어 중쇄 및 경쇄 모두와 상호작용한다. 회색의 원형은 키메라 hTAAB Fab의 중쇄 및 경쇄 사이의 상호작용에 관여하는 잔기를 보여준다. Tie2의 Fn3 도메인과 Fn3 도메인 사이의 이합체 상호작용에 관여하는 잔기들은 주황색 삼각형으로 표시되어 있다. 빨간색 상자는 완전한 서열 보존을 나타내며, 노란색 상자는 물리화학적 특성에 따라 70 % 이상의 유사성을 갖는 잔기를 나타낸다. 이차적 구조 구성들은 화살표 (β 스탠드) 및 나선 (α-헬릭스)의 정렬로 표시되어 있다. 서열 정렬은 T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat)와 ESPript 서버 (http://espript.ibcp.fr)를 사용하여 작성되었다.
도 6은 hTAAB IgG 결합이 Tie2 이합체의 다각형 조립체 중개함을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
a. HUVEC을 키메라 hTAAB Fab 또는 hTAAB 마우스 IgG1 (1 및 10μg / ml)으로 처리한 후 Tie2의 상대적 인산화 비율에 대한 면역염색 분석 (왼쪽). p-Tie2 / Tie2 비율의 비중계 분석 (오른쪽; 평균 ± SD n = 3; *** p <0.001 대 대조군).
b. 키메라 hTAABFab 또는 hTAABIgG1 (1 및 10μg / ml)으로 HUVEC를 처리 한 후 Akt의 상대 인산화 비율에 대한 면역염색 분석 (왼쪽). p-Akt / Akt 비율 비중계 분석 (오른쪽; 평균 ± SD n = 3; * p <0.05, *** p <0.001 대 대조군).
c. hTie2 Fn2-3, hTie2 ECD, hTAAB / hTie2 Fn2-3 복합체 및 hTAAB / hTie2 ECD 복합체의 크기 배제 크로마토그래피 - SEC-MALS (multiangle light scattering) 분석. 샘플은 3 mg / ml (hTie2 Fn2-3) 또는 1 mg / ml (이외 모든 기타)의 단백질 농도에서 0.5 ml / min의 PBS 중 Superdex200 증가 10 / 300GL 컬럼에서 분석했다. 분자량 (kDa) 및 280 nm에서의 흡광도를 용출 부피 (ml)에 대하여 그래프로 표시하였다.
d. Tie2 이합체 변이 디자인. Fn3 도메인 간 역평행 β시트 상호작용 인터페이스의 양 말단에서의 잔기 D682 및 N691 (노란색)을 시스테인으로 변화시켜 2 개의 이황화 결합을 형성할 수 있도록 함으로써, 구성 Tie2Ig3-Fn3 이합체를 생성했다.
e. 정제된 hTie2 Ig3-Fn3 D682C / N691C는 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석되었다.
f. hTAABIgG1과 복합체를 형성한 hTie2Ig3-Fn3 D682C / N691C의 크기 배제 크로마토그래피. 정제한 hTie2Ig3-Fn3 D682C / N691C를 hTAABIgG1과 2 : 1의 몰비 (Tie2 모노머 : hTAAB IgG1)에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 크기 배제 크로마토그래피에 적용했다. 음성 염색 EM 및 2D 클래스 평균에 사용되는 분획은 EM 분석으로 표시된다.
g. Tie2 이합체 변이체/hTAABIgG1 복합체의 대표적인 2D 클래스 평균 (위). 4 대 4, 5 대 5 및 6 대 6 조립체 중 Tie2 다이머 / hTAAB IgG1 복합체의 주기적고차 구조는 Tie2 Fn2-3 / 키메라 hTAABFab 복합체, Tie2 Ig1-Fn1 (PDB : 4K0V) 및 인간 IgG1의 Fc 단편 (PDB : 5VGP)의 결정 구조를 사용하여, 사각형, 오각형 및 육각형 각각의 폐쇄링 구조에 대한 2D 클래스 평균에 기반하여 모델링되었다 (아래). 스케일 바, 20nm.
h. 음성 염색 EM 그리드에서 관찰된 Tie2 다이머 / hTAABIgG1 복합체 중 다각형 5 대 5 조립체의 3D 모델. 비대칭 단위의 결정 중 2 : 2 Tie2 Fn2-3 / 키메라 hTAABFab 복합체는 빨간 선으로 표시되어 있다.
도 7은 Tie2 이합체 돌연변이/hTAABIgG1 복합체의 음성 염색 EM 분석결과를 나타낸 것이다.
a. hTAAB IgG1과 복합체를 형성한 정제된 hTie2Ig3-Fn3 N691C/D682C 음성 염색 EM 분석의 대표적인 현미경 사진 (왼쪽; 스케일 바, 100 nm). 정방 정계, 오각형, 육각형의 閉環 구조의 대표적인 입자 이미지 (오른쪽; 스케일 바, 20 nm).
b. hTie2 Ig3-Fn3 N691C/D682C 및 hTAABIgG1 복합체의 크기 배제 크로마토 그래피에서의 응집 피크의 음성 염색 EM 분석의 대표적인 현미경 사진, 스케일 바, 100nm.
도 8은 리간드 독립적 Tie2의 이량체화는 hTAAB을 통한 Tie2의 클러스터링과 활성화에 필수적임을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
a. Tie2 단량체 변이 디자인. Fn3-Fn3' 이량체 계면의 잔기 V685, V687 및 K700 (노란색)은 전하 반발을 통해 Fn3-Fn3' 이합체 계면을 파괴하기 위해, 음전하 잔기 (V685D / V687D / K700E)로 변이되어, 구성적 Tie2 모노머를 생산했다 (왼쪽). 전장 Tie2-GFPWT 및 HEK293T 세포에서의 라이브 셀 이미징 및 Tie2 활성화 분석에 사용된 구성적 Tie2 이합체 및 단위체 변이에 대한 개략도 (오른쪽).
b. hTAAB 및 COMP-Ang1로 처리한 후 HEK293T 세포에서 Tie2 (전장 Tie2 WT, Tie2 이합체 변이 (D682C / N691C) 또는 모노머 변이 (V685D / V687D / K700E))에 대한 공초점 시간 경과 사진. 이미지는 60 배의 배율로 표시된다. 스케일 바, 10μm.
c 및 d. COMP-Angpt1 (1μg / ml) 또는 hTAAB IgG1 (10μg / ml)로 1시간 동안 처리한 후 WT Tie2, 구성적 이량체 Tie2 변이 (D682C / N691C) 또는 구성적 단량체 Tie2 변이 (V685D / V687D / K700E)를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포에서 Tie2와 Akt의 상대적 인산화 비율에 대한 면역블롯분석 (c). p-Tie2 / Tie2 및 p-Akt / Akt 비율에 대한 비중계 분석 (d)이 표시되어 있음 (평균 ± SD n = 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001 vs. 대조군).
e. 세포막에서 hTAAB을 통한 Tie2 활성화 모델. hTAAB IgG는 Tie2 호모이합체의 Fn3 도메인에 결합하여, 리간드 독립성 Tie2 이합체를 고차원의 원형 조립체로 클러스터화하도록 유도한다. Tie2 클러스터링은 인접한 이합체 사이의 자기 인산화에 가장 적합한 방식으로 불활성화 키나아제 이합체를 구성한다.
도 9는 hTAAB의 구조 기반 인간화를 나타낸 것이다.
a. IgG1, IgG2 및 IgG4 서브 클래스 형태 중 키메라 hTAAB 항체의 개략도. 사슬간 이황화 결합은 검은 선으로 표시되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 진한 오렌지색과 연한 오렌지색으로 되어 있다. 중쇄와 경쇄의 불변영역은 각각 녹색과 파랑 색으로되어 있다.
B 및 c. 마우스 IgG1 또는 인간 키메라 IgG1, IgG2 또는 IgG4 (1 및 10μg / ml) 형태의 hTAAB로 HUVEC를 처리한 후 Tie2와 Akt의 상대적 인산화 비율에 대한 면역염색 분석 (b). p-Tie2 / Tie2 및 p-Akt / Akt 비율에 대한 비중계 분석 (c)가 표시되어 있다 (평균 ± SD n = 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001 vs. 대조군).
d, hTAAB 및 인간화 TAAB (hzTAAB)의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 서열과 가장 가까운 인간 생식세포계열 유전자와 정렬. 인간 생식세포계열 및 hzTAAB 서열에서 점은 모항체 hTAAB와 동일한 잔기를 나타낸다. hTAAB의 CDR 및 hzTAAB의 그라프트 CDR은 파란색으로 표시된다. 모항체 hTAAB에서 역변이된 잔기는 녹색으로 표시되고 녹색 삼각형으로 표시된다. 이차구조 구성 (β 가닥)은 화살표로 나와 있다.
e-h. Tie2 Fn2-Fn3 / 키메라 hTAABFab 복합체의 결정 구조에서 채용된 키메라 hTAAB Fv 구조에 중첩된 hzTAAB-H1L1 Fv의 상동성 모델 구조. 키메라 hTAAB의 중쇄 및 경쇄는 각각 진한 오렌지색과 밝은 오렌지색으로 표시되고 hzTAAB-H1L1의 중쇄 및 경쇄는 보라색과 분홍색으로 표시되어 있다.
f-h. Tie2 활성화 항체의 구조 기반의 인간화에 대한 이론적 설명. VH-VL 페어링 및 CDR 컨포메이션 (f) 및 Tie2 Fn3 (g)에 대한 친화력을 유지하기 위해 중요한 경쇄 잔기는 마우스 hTAAB 서열로 역변이했다. CDR 컨포메이션 을 유지하기 위해 중요한 중쇄 잔기는 마우스 hTAAB 서열로 역변이했다 (h). 변이는 화살표로 표시되고, 잔기들은 (e)에서와 같은 색으로 표시된다.
i, SPR 분석에 의해 측정 된 hTie2 ECD에 대한 인간화 TAAB (hzTAAB-H1L1, hzTAAB-H2L1, hzTAAB-H1L2 및 hzTAAB-H2L2 및 이전에 보고된 인간화 구조 3H7H12G4)의 결합 동태. 평형 해리 상수 (KD, M)는 오프 속도와 온 속도 비율 (koff / kon)로 계산되었다. 속도론적 파라미터는 1 : 1 결합 모델을 사용하여 Biacore Insight EvaluationSoftware의 글로벌 피팅 기능으로 결정되었다. 수직 점선은 해리 단계의 시작을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10c는 인간화 Tie2 활성화 항체를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
a. IgG1 기반 인간화 Tie2 활성화 항체 (hzTAAB H1L1, H1L2, H2L1 및 H2L2)의 크기 배제 크로마토그래피.
b. hzTAAB의 용출 분획을 농축하여, 환원 (왼쪽) 및 비환원 (오른쪽) 조건 하에서 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석했다.
c. BLI (biolayer interferometry) 분석에 의해 측정된 mTie2Ig3-Fn3 대한 hzTAAB의 결합 키네틱. 옥텟 RED96 기기를 사용하여 얻어진 센서 그램으로 확인된 mTie2 Ig3-Fn3의 결합 (A) 및 해리 (D). 표시된 항체를 항-인간 IgG Fc 캡처 (AHC) 바이오센서에 고정화한 후, 바이오센서를 마우스 Tie2 Ig3-Fn3의 1600nM 용액을 포함하는 웰에 담구어 결합을 측정한 다음, 역학 버퍼로 세척하고 해리를 측정했다.
도 11은 인간화 TAAB이 HUVEC에서 Tie2와 그 하류 신호를 활성화함을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
a 및 b. 다른 농도 (0.02,0.1,0.5,2.5,12.5 및 50μg / ml) hTAAB (a) 또는 3H7H12G4 (b)로 HUVEC을 처리한 후 Tie2의 상대적 인산화 비율에 대한 면역염색 분석. ABTAA (2.5μg / ml) + Angpt2을 양성대조군으로 사용했다. p-Tie2 / Tie2 비율 비중계 분석을 나타낸다 (오른쪽).
c 및 d. 다른 농도 (1 및 10μg / ml) 인간화 TAAB (hzTAAB-H1L1, H1L2, H2L1, H2L2) 또는 hTAAB (c)로 HUVEC를 처리한 후 Tie2와 Akt의 상대적 인산화 비율에 대한 면역염색 분석. p-Tie2 / Tie2 및 p-Akt / Akt 비율 비중계 분석 (d)이 표시되어 있다 (평균 ± SD n = 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001 vs. 대조군).
e 및 f. 3H7H12G4 또는 hzTAAB-H2L2 다른 농도 (0.1,0.5,2.5 및 12.5μg / ml)로 HUVEC를 처리한 후 Tie2와 Akt의 상대적 인산화 비율에 대한 면역염색 분석. p-Tie2 / Tie2 및 p-Akt / Akt 비율 비중계 분석 (f)이 표시되어 있다.
g 및 h. HUVEC에서 hzTAAB-H2L2의 생물학적 효과. HUVEC의 혈청 결핍 유도 세포사멸에 대한 hzTAAB-H2L2 효과 (위). HUVEC은 10μg/ml의 hzTAA-H2L2, hTAAB 또는 1μg/ml의 COMP-Angpt1을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하였다. 이동 활성은 modified Boyden chamber assay (중앙)를 사용하여 측정되었다. HUVEC는 8μm 공극 막의 상층에 파종되었다. 10μg/ml의 hzTAA-H2L2, hTAAB 또는 1μg/ml의 COMP-Angpt1을 포함하는 무혈청 배지를 하부 챔버에 추가했다. 이동된 세포를 고정하고 9 시간 배양 후 염색했다. HUVEC를 Matrigel-coated wells 에 플레이팅하여 10μg / ml의 hzTAA-H2L2, hTAAB 또는 1μg / ml의 COMP-Angpt1을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하였다. 위상차 현미경 이미지는 처리 7 시간 후에 수득하였다. 관-형성 활성은 관의 길이 (아래)로 측정되었다. 스케일 바, 100μm. TUNEL 양성 세포, 이동한 HUVEC 및 (g) 생성 세포의 정량화 (h) (평균 ± SD n = 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. 대조군).
i 세포간 접촉에 대한 hzTAAB-H2L2 유도 Tie2 전위 및 FOXO1의 hzTAAB-H2L2 유도 핵 제거를 나타내는 HUVEC의 공초점 이미지. 혈청 기아 HUVEC을 hTAAB-H2L2 (10μg / ml) 또는 COMP-Angpt1 (1μg / ml)로 30 분간 처리 하였다. 대조군으로 미처리군은 사용되지 않았다. 염소 항-인간 Tie2 및 AlexaFluor 488 결합 당나귀 항-염소 항체를 Tie2 시각화에 사용하고 토끼 항- FOXO1 및 Alexa Fluor594 결합 당나귀 항-토끼 항체를 FOXO1 시각화에 사용했다. 스케일 바, 20μm. DAPI 4 ', 6 -디아미디노 -2- 페닐인돌.
도 12a 내지 도 12d는 전장 Tie2 클러스트링의 모델을 나타낸 것이다.
a. 키메라 hTAAB Fab / Tie2Fn2-3 복합체들 사이의 결정 패킹 상호작용에 대한 모식도. 키메라 hTAABFab 및 Tie2Fn2-3의 색에 대한 설명은 도 3a에 기재됨. 결정 패킹에 의해 도입된 Fn2 도메인 사이의 수평 방향의 상호작용은 검정 박스로 표시되어 있다.
b. (A) 검정 박스로 표시된 결정 패킹 상호작용의 확대도. 결정 패킹에 의해 매개되는 중요한 결합 잔기가 표시되어 있다. 수소 결합 및 정전기 상호작용은 점선으로 표시되어 있다.
c. hTAAB을 통해 Tie2 클러스터링 제안 모델. Tie2 Fn2-3/키메라 hTAABFab, 인간 IgG1의 Fc 단편 (PDB : 5VGP)의 결정 구조및 이전에 보고된 Tie2 구조 : Tie2 Ig1-Fn1 (PDB : 4K0V), Tie2 Fn1-3 (PDB : 5MYA) 및 Tie2 티로신 키나제 도메인 (PDB : 6MWE)를 사용하여 오각형의 폐쇄 링 구조의 2D 클래스 평균을 기준으로 5 대 5 조립체 중 전장 Tie2 다이머/hTAAB IgG1 복합체의 주기적 고차 구조를 모델링했다. 막 관통 도메인은 이전에 보고된 EGFR의 이량체화 모티프의 NMR 구조 (PDB : 5LV6)에서 채택되었다.
d. COMP-Ang1을 통한 Tie2 클러스터링 제안 모델. Tie2s (C) 및 Ang1 FLD/Tie2 Ig1-Fn1 복합체 (PDB: 4K0V)과 COMP coiled-coil 도메인 (PDB : 1VDF) (C와 D)의 모델 구조를 사용하여 hTAAB 매개 전장 Tie2 클러스터링 (C)의 모델에 따라, 전체 길이 Tie2 이합체와 COMP-Ang1 복합체의 5: 1 조립체의 환상 복합체를 모델링했다. Angpt FLD 결합 Tie2 Ig2 도메인은 노란색으로 표시된다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 출원의 발명자들은 Tie2 Fn (membrane proximal fibronectin type III) 도메인을 타겟으로 하는 인간 Tie2 작용제 항체 hTAAB을 개발하였다. Tie2/hTAAB 복합체 구조는 Tie2 클러스터링의 새로운 모드를 통해 작동한다.

인간 Tie2 작용제 항체인 hTAAB가 Tie2/hTAAB 복합체 구조를 형성하여 Tie2 클러스터링의 신규 모드로 작동하고, Tie2 Fn3 도메인에 특이적으로 결합하여 Tie2 호모이합체가 다각형의 조립체 (polygonal assembly)로 연결된다. 이러한 구조는 이전 결정 격자에서 관찰된 측면 Tie2 어레이와는 대조적이다. 또한, Fn3-Fn3' 이합체 인터페이스 파괴는 hTAAB 의해 유발되는 Tie2의 클러스터화 신호를 비활성화시켰다. 이러한 결과는 hTAAB에 의해 유발되는 Tie2 다각형 조립체에 대한 Fn3 매개 Tie2 호모이량체화의 중요성을 강조하고 Tie2 작용제가 Tie2의 클러스터화 및 활성화를 어떻게 유도하는지에 대한 이해를 제공한다. 또한, hTAAB의 구조 기반 인간화 항체의 제작 성공은 잠재적인 임상 가능성을 만들어낸다.

이러한 관점에서, 본 발명은 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 항체는 인간 Tie2의 Ig3 Fn3 (membrane proximal fibronectin type III) 도메인에 결합하고, 상기 항체의 결합에 의해, 호모이합체 (homodimer) Tie2가 다각형 조립체 (polygonal assembly)를 형성하여, 클러스터링 (clustering) 및 활성화되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 Tie2에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 Tie2에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 하나 이상의 비-인간 항체(공여체 또는 공급원 항체)로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들어, CDR 서열)을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 인간화를 위해 수용자 인간 항체의 가변 영역의 하나 이상의 프레임워크 도메인 (framework domain, FR) 내의 잔기가 비-인간 종 공여체 항체부터 상응하는 잔기로 대체될 수 있다. 이를 통해 그래프팅된 CDR(들)의 적절한 3차원 구성을 유지하도록 돕고, 이로써 친화성 및 항체 안정성을 개선시킬 수 있다. 인간화된 항체는, 예를 들어, 항체 성능을 추가로 세밀화하기 위해, 추가의 수용자 항체 또는 공여체 항체에서 나타나지 않는 새로운 잔기를 포함할 수 있다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.

"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

Tie2 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중 쇄를 포함한다. 기능적으로, Tie2 항체의 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, Tie2 항체의 결합 친화성은 10^-6M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9M 내지 10^-10 M, 10^-5M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

본 출원의 구체적 실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 도메인 (VH), 서열번호 3의 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인 (CH), 서열번호 2의 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 도메인 (VL) 및 서열번호 4의 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인 (CL))을 포함하는 Fab일 수 있다.

본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 인간화 항체 hzTAAB 예를 들어, hzTAAB-H1과 hzTAAB-L1를 제작하였다. 상기 인간화 항체 hzTAAB는 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

구체적으로, 제3항에 있어서,

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;

서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는

서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 Tie2을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-Tie2 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체가 가지는 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 서열번호 9 내지 14로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 혈관신생은 이전에 존재한 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성 또는 성장을 의미하며, "혈관신생 관련 질환(angiogenesis-related disease)"은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 관련 질환의 예로는 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기에 사용된 용어 "예방(prevention or prophylaxis)"은 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 시작을 억제 또는 지연하게 하는 모든 조치를 가리킨다. 용어 "치료(treatment or therapy)"는 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여하여 관심 질환의 증상이 개선되거나 증상이 호전되게 하는 모든 조치를 가리킨다.

본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이고, 본 분야에서 전형적으로 사용되는 적절한 비히클, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물은 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제, 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽, 멸균수용액, 비수용액, 서스펜션, 동결건조물(lyophilizates) 및 좌약과 같은 다양한 경구 또는 비경구 복용형태일 수 있다. 관련하여 본 발명의 약학적 조성물은 필러, 증점제, 바인더, 습윤제, 정제분해물질(disintegrant), 계면활성제 등과 같은 희석제 또는 부형제로 조합하여 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 조제는 정제, 알약, 분말, 과립제, 캡슐제 등과 같은 형태일 수 있다. 이들 고상제와 관련하여 본 발명의 화합물은 녹말, 칼슘 카보네이트, 수크로즈, 락토오즈, 또는 젤라틴과 같은 하나 이상의 부형제를 조합하여 제형화될 수 있다. 간단한 부형제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제를 추가로 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 조제는 서스펜션, 내복용액, 에멀젼, 시럽 등일 수 있다. 물 또는 액체 파라핀과 같은 간단한 희석제, 습윤제, 감미제, 방향족, 방부제 등과 같은 다양한 부형제를 액체 조제 내에 포함시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균수용액, 비수용성 용매, 서스펜션, 에멀젼, 동결건조물, 좌약 등과 같은 비경구 복용 형태일 수 있다. 주입가능한 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름 및 에틸 올레에이트와 같은 에스테르가 비수용성 용매 및 서스펜션에 적합할 수 있다. 좌약의 기본 물질은 위텝졸(Witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 61(Tween 61), 카카오버터(cacao butter), 라우린버터(laurin butter) 및 글리세로젤라틴(glycerogelatin)을 포함한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 여기에 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양(pharmaceutically effective amount)"은 모든 의학적 치료에 적용가능한 합당한 이익과 위험 비율(benefit/risk ratio)로 충분한 질환 치료용 약학적 조성물의 양을 가리킨다. 유효량은 치료해야 할 질환의 중증도, 환자의 나이 및 성별, 질환의 종류, 약제의 활성도, 약제에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 분비속도, 치료기간, 약제의 공투여 및 본 분야에서 알려진 다른 파라미터를 포함한 다양한 요인에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 같은 경우에, 종래의 치료법과 함께 순서대로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 1회량 또는 다회 용량으로 나누어서 투여될 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경된다. 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 랫, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법, 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 혈관신생의 억제를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫, 닭 및 인간과 같은 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적 조성물은 비경구적으로(parenterally), 피하로(subcutaneously), 복강내로(intraperitoneally), 폐내로(intrapulmonarily) 또는 코내로(intranasally), 필요하다면, 국소치료를 위해 병변내(intralesional) 투여를 포함하는 적절한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 복용량은 개체의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변하며, 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 상기 항체 또는 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 용어 '항체', '예방' 및 '치료'는 상기에 언급한 바와 같다.

본 발명의 항체로 치료 가능하다면, 암은 제한되지 않는다. 상세하게는 본 발명의 항체는 혈관신생을 억제함으로써 암의 발생 또는 진행을 예방할 수 있다. 암의 예로는 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), `고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항체는 다른 항체 또는 생물학적 활성제 또는 다양한 목적을 위한 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 이러한 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.

상기 다른 혈관신생 질환 치료제는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다. 이를 통해 서로의 저항성을 극복시키고 효능을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에서 다른 혈관신생 질환 치료제와 병용 투여되는 경우 Tie2 항체와 다른 혈관신생 질환 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 대상체에게 투여한 후, 활성 성분으로서 Tie2에 대한 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하거나, 상기 조성물을 대상체에게 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 상기 대상체에게 투여한다. 경우에 따라서, 상기 조성물을 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물과 동시에 대상체에게 투여할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. Tie2 활성화 마우스 단클론 항체의 생성

1.1 재조합 단백질의 발현 및 정제

마우스 면역을 위한 재조합 Tie2 단백질은 hTie2 Ig3-Fn3 (인간 Tie2 잔기 349-738, GenBank accession number: AAH35514.2)을 코딩하는 유전자를 pFuse-hIgG1-Fc 벡터 (pFuse-hg1fc1, InvivoGen)에 클로닝하고, Expi293F 세포에서 일시적으로 발현하여 생성되었다.

Human Tie2 Ig3-Fn3 (349T-738P)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 19)

TPKIVDLPDHIEVNSGKFNPICKASGWPLPTNEEMTLVKPDGTVLHPKDFNHTDHFSVAIFTIHRILPPDSGVWVCSVNTVAGMVEKPFNISVKVLPKPLNAPNVIDTGHNFAVINISSEPYFGDGPIKSKKLLYKPVNHYEAWQHIQVTNEIVTLNYLEPRTEYELCVQLVRRGEGGEGHPGPVRRFTTASIGLPPPRGLNLLPKSQTTLNLTWQPIFPSSEDDFYVEVERRSVQKSDQQNIKVPGNLTSVLLNNLHPREQYVVRARVNTKAQGEWSEDLTAWTLSDILPPQPENIKISNITHSSAVISWTILDGYSISSITIRYKVQGKNEDQHVDVKIKNATITQYQLKGLEPETAYQVDIFAENNIGSSNPAFSHELVTLPESQAP

DNA sequence (SEQ ID NO: 20)

ACCCCAAAGATAGTGGATTTGCCAGATCATATAGAAGTAAACAGTGGTAAATTTAATCCCATTTGCAAAGCTTCTGGCTGGCCGCTACCTACTAATGAAGAAATGACCCTGGTGAAGCCGGATGGGACAGTGCTCCATCCAAAAGACTTTAACCATACGGATCATTTCTCAGTAGCCATATTCACCATCCACCGGATCCTCCCCCCTGACTCAGGAGTTTGGGTCTGCAGTGTGAACACAGTGGCTGGGATGGTGGAAAAGCCCTTCAACATTTCTGTTAAAGTTCTTCCAAAGCCCCTGAATGCCCCAAACGTGATTGACACTGGACATAACTTTGCTGTCATCAACATCAGCTCTGAGCCTTACTTTGGGGATGGACCAATCAAATCCAAGAAGCTTCTATACAAACCCGTTAATCACTATGAGGCTTGGCAACATATTCAAGTGACAAATGAGATTGTTACACTCAACTATTTGGAACCTCGGACAGAATATGAACTCTGTGTGCAACTGGTCCGTCGTGGAGAGGGTGGGGAAGGGCATCCTGGACCTGTGAGACGCTTCACAACAGCTTCTATCGGACTCCCTCCTCCAAGAGGTCTAAATCTCCTGCCTAAAAGTCAGACCACTCTAAATTTGACCTGGCAACCAATATTTCCAAGCTCGGAAGATGACTTTTATGTTGAAGTGGAGAGAAGGTCTGTGCAAAAAAGTGATCAGCAGAATATTAAAGTTCCAGGCAACTTGACTTCGGTGCTACTTAACAACTTACATCCCAGGGAGCAGTACGTGGTCCGAGCTAGAGTCAACACCAAGGCCCAGGGGGAATGGAGTGAAGATCTCACTGCTTGGACCCTTAGTGACATTCTTCCTCCTCAACCAGAAAACATCAAGATTTCCAACATTACACACTCCTCGGCTGTGATTTCTTGGACAATATTGGATGGCTATTCTATTTCTTCTATTACTATCCGTTACAAGGTTCAAGGCAAGAATGAAGACCAGCACGTTGATGTGAAGATAAAGAATGCCACCATCACTCAGTATCAGCTCAAGGGCCTAGAGCCTGAAACAGCATACCAGGTGGACATTTTTGCAGAGAACAACATAGGGTCAAGCAACCCAGCCTTTTCTCATGAACTGGTGACCCTCCCAGAATCTCAAGCACCA

구체적으로는 Expi293F 세포 (2 X 10⁶ 세포/ml)을 Expi293 발현 배지 (A1435103, ThermoFisher)에서 배양하고, hTie2 Ig3-Fn3을 코딩하는 플라스미드를 ExpiFectamine293 형질감염 키트 (A14524, ThermoFisher)를 사용하여 Expi293F 세포에 형질감염 하였다. 세포를 진탕 배양기 (궤도 쉐이크, 125rpm)에서 8 % CO2, 37℃에서 5일간 배양했다. 원심분리하여 세포를 제거한 후, 분비된 hTie2 Ig3-Fn3-Fc 융합단백질을 포함하는 배양 상등액을 HiTrap MabSelect SuRe 친화도 컬럼 (11003494, GE Healthcare)을 갖춘 AKTA 정제 시스템 (GE Healthcare)에서 정제했다. 정제한 hTie2Ig3-Fn3-Fc 융합단백질을 Amicon Ultra 원심필터 (UFC8030, Millipore)를 사용하여 농축하고, 버퍼를 PBS로 교체했다. 융합단백질의 Fc 태그는 22ㅀC에서 18시간 동안 트롬빈 절단 (27-0846-01, GE Healthcare)에 의해 제거되었다. hTie2 Ig3-Fn3 단백질은 HiTrap MabSelect SuRe 친화도 컬럼에서 절단된 Fc 태그를 제거하여 추가로 정제하였다.

결정화를 위한 인간 Tie2을 준비하기 위해, hTie2 Fn2-3 (잔기 541-735)을 코딩하는 유전자 (다음에 기재)를 pET-28a (69864, Novagen)에 클로닝하여 E.coli BL21 (DE3) RIL (230240, Agilent Technologies)에서 발현시켰다.

Human Tie2 Fn2-3 (541I-735S)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 21)

IGLPPPRGLNLLPKSQTTLNLTWQPIFPSSEDDFYVEVERRSVQKSDQQNIKVPGNLTSVLLNNLHPREQYVVRARVNTKAQGEWSEDLTAWTLSDILPPQPENIKISNITHSSAVISWTILDGYSISSITIRYKVQGKNEDQHVDVKIKNATITQYQLKGLEPETAYQVDIFAENNIGSSNPAFSHELVTLPES

DNA sequence (SEQ ID NO: 22)

ATCGGACTCCCTCCTCCAAGAGGTCTAAATCTCCTGCCTAAAAGTCAGACCACTCTAAATTTGACCTGGCAACCAATATTTCCAAGCTCGGAAGATGACTTTTATGTTGAAGTGGAGAGAAGGTCTGTGCAAAAAAGTGATCAGCAGAATATTAAAGTTCCAGGCAACTTGACTTCGGTGCTACTTAACAACTTACATCCCAGGGAGCAGTACGTGGTCCGAGCTAGAGTCAACACCAAGGCCCAGGGGGAATGGAGTGAAGATCTCACTGCTTGGACCCTTAGTGACATTCTTCCTCCTCAACCAGAAAACATCAAGATTTCCAACATTACACACTCCTCGGCTGTGATTTCTTGGACAATATTGGATGGCTATTCTATTTCTTCTATTACTATCCGTTACAAGGTTCAAGGCAAGAATGAAGACCAGCACGTTGATGTGAAGATAAAGAATGCCACCATCACTCAGTATCAGCTCAAGGGCCTAGAGCCTGAAACAGCATACCAGGTGGACATTTTTGCAGAGAACAACATAGGGTCAAGCAACCCAGCCTTTTCTCATGAACTGGTGACCCTCCCAGAATCT

세포는 50μg/ml 카나마이신을 첨가한 LB 배지 중 37℃에서 OD600이 0.4가 될 때까지 증식시켰다. 0.05 mM IPTG (isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)에서 단백질 발현을 유도하고 18℃에서 15시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 용해 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5,200 mM NaCl)에 다시 현탁하여 아이스 중에서 초음파 처리하여 용해했다. 원심분리 (13,000 X g, 4ㅀC에서 0.5 시간)에 의해 세포 파편을 제거한 후 상등액을 Ni-NTA 아가로스 친화성 컬럼 (30210, QIAGEN)에 적용했다. 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 mM 이미다졸)로 세척한 후 단백질을 용출 버퍼 (20 mM HEPES, pH 7.5,200 mM NaCl 400 mM 이미다졸)로 용출하고 20 mM HEPES pH7.5 및 200mM NaCl에서 평형화한 HiLoad16/600 Superdex 200 pg 컬럼 (28-9893-35, GE Healthcare)을 사용하여 크기-배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 결정화를 위한 키메라 hTAAB Fab을 준비하기 위해, 키메라 hTAAB Fab에 대한 합성된 중쇄 및 경쇄를 세포질 분비에 대한 변형 pBAD 발현 벡터에 클로닝하였다. E.coli Top10F (Invitrogen) 세포를 플라스미드 pBAD-Fab로 형질전환한 다음, 100μg/ml 암피실린을 첨가한 LB 배지 중 37℃에서 증식시켰다. OD600 1.0에서 0.2% 아라비노스로 단백질 발현을 유도하고 세포를 30℃에서 15시간 동안 증식시켰다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 용해 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5,200 mM NaCl)에 다시 현탁하여 얼음 중 초음파 처리하여 용해하였다. 원심분리 (13,000 X g, 4ㅀC에서 30분간)에 의해 세포 파편을 제거한 후 가용성 키메라 hTAAB Fab를 포함하는 상등액을 Ni-NTA 아가로스 친화성 크로마토그래피 컬럼 (QIAGEN)에 적용하고, 컬럼의 5배 세척 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.5,200 mM NaCl, 50 mM 이미다졸)로 세척하였다. 단백질을 용출 버퍼 (20 mM HEPE pH 7.5,200 mM NaCl 400 mM 이미다졸)로 용출하고 20 mM HEPES pH7.5 및 200 mMNaCl에서 평형화한 HiLoad16/600 Superdex 200pg 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 더욱 정제했다. 정제한 단백질과 항체를 분주 -80 ℃에서 저장하였다.

1.2 B 세포 하이브리도마의 면역화 및 생성

5 주령의 BALB / c 마우스를 정제된 hTie2-Ig3-Fn3 (100μg/주사)를 보조제와 혼합하여 주 2회 6 주 면역했다. 면역화된 마우스의 혈청에서 항 Tie2 항체는 hTie2 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 평가되었다. 항체 (1 : 5000 희석)이 적절하게 증가하면 (OD> 1.0) 면역한 마우스의 비장에서 B 림프구를 분리하고 배양 골수종 세포 (SP2/0)와 융합시켰다. 융합 세포를 HAT (hypoxanthine, aminopterin 및 thymidine) 배지에서 배양하여 융합 골수종 세포와 B 림프구만으로 하이브리도마 세포를 선택하여 배양하였다.

B세포 하이브리도마는 10% 소태아혈청 (FBS), 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 mg/ml)을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 유지되었다. B세포 하이브리도마에서 항-Tie2 항체를 생산하기 위해, 세포를 PBS로 세척하고, 혈청 미포함 배지 (SFM, 12045-076, Gibco)에서 3일간 배양하였다.

살아남은 하이브리도마 세포를 96 웰 플레이트에 분주하여 배양 상등액을 hTie2 ELISA로 테스트하였다. 한계 희석에 의한 클론 선택을 위해 +신호를 보여주는 하이브리도마 풀을 선택했다.

1.3 단클론 항체를 코딩하는 DNA의 서열 결정

하이브리도마 세포 (2 X 10⁶ 세포/ml)를 10% FBS 함유 DMEM에서 배양한 후 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 취득했다. RNA 농도를 측정하여 cDNA를 역전사(RT)에 의해 합성했다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 Mouse Ig-Primer 세트 (Novagen) 및 합성된 cDNA를 템플릿으로 사용하는 PCR에 의해 94ㅀC에서 5 분 동안 이후 94ㅀC에서 1 분 동안, 50ㅀC에서 1 분 동안, 72ㅀC에서 2 분 후 72ㅀC에서 6분 동안 4ㅀC까지 서서히 냉각하는 과정을 35주기로 수행하였다. 각 반응에서 얻어진 PCR 산물을 TA 벡터에 클로닝하고 DNA 서열을 결정하여, 각 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성했다.

1.4 Tie2 활성화 마우스 단클론 항체의 생성

Tie2의 ECD는 리간드 결합에 관계없이 막 근위 Fn3을 통해 이합체를 형성한다. 리간드 결합 도메인 (ligand-binding domains: LBD)에 결합하는 다량체 Angpt1은 Tie2의 활성화 및 다운스트림 신호 전달을 위해 이러한 사전에 형성된 Tie2 이합체를 더욱 고차원의 올리고머 또는 "Tie2 클러스터"로 가교한다. 그러나, LBD를 타겟으로 하는 단일 항체에 대한 Tie2 클러스터링을 유도하려면 사전에 형성된 Tie2 호모이합체의 LBD는 너무 멀리 있다 (~260ㅕ). 이러한 개념을 바탕으로 우리는 막 근위 Tie2 Fn 도메인에 결합하는 항 Tie2 항체가 다량체의 Angpt1와 같이 Tie2 올리고머화 및 활성화를 유도할 수 있다고 가정했다.

mTie2가 아니라 hTie2의 Ig3-Fn3을 타겟하는 hTie2 활성화 마우스 단클론 항체인 hTAAB를 생성하였다.

실시예 2. 결정 구조를 통해 V 자형의 Tie2 이량체에 결합된 2개의 hTAAB Fab 확인

마우스 hTAAB의 중쇄가변영역 (VH) 또는 경쇄 가변영역 (VL)을 인간 중쇄 불변영역 (CH) 또는 경쇄 불변영역 (CL) 각각을 발현하는 백본 벡터에 클로닝하여 Tie2 활성화 항체 hTAAB의 인간-마우스 키메라 IgG1, IgG2 및 IgG4 항체가 생성되었다. 마우스 hTAAB의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 단편을 서열 "EcoRV- 신호 서열 -VH-NheI"로 합성하였다 (Bioneer, Inc). 합성된 DNA 단편을 EcoRV 및 NheI로 절단하고 pFUSE-CHIg-hG1 (IgG1 동종형) 및 pFUSE-CHIg-hG2 (IgG2 동종형) 벡터에 각각 클로닝하였다 (InvivoGen). 인간 IgG4 키메라 항체를 제작하기 위해 마우스 hTAAB의 중쇄 가변영역 (VH)을 코딩하는 DNA를 클로닝을 위해 EcoRI 및 NheI 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 다음으로, PCR 산물을 인간 IgG4 항체의 중쇄 불변영역 (CH)을 발현하는 변형 pOptiVEC-TOPO 벡터에 서브클로닝 하였다. 키메라 경쇄 발현 벡터는 EcoRI 및 BsiWI 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 마우스 hTAAB의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 단편을 PCR 증폭하여 구축되었다.

Human IgG1 heavy chain constant region (CH1~CH3)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 23)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

DNA sequence(SEQ ID NO: 24)

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

Human IgG2 heavy chain constant region (CH1~CH3)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 25)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

DNA sequence (SEQ ID NO: 26)

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

Human IgG4 heavy chain constant region (CH1~CH3)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 27)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

DNA sequence (SEQ ID NO: 28)

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA

다음으로, PCR 산물을 인간 카파 경쇄의 불변영역을 발현하는 변형 pcDNA3.3-TOPO 벡터에 서브클로닝 하였다.

Human Kappa light chain constant region (GenBank accession number: AAA58989.1)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 29)

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

DNA sequence (SEQ ID NO: 30)

ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

Expi293 발현 시스템 (ThermoFisher)을 사용하여 키메라 항체를 제조하였다. Expi293F 세포를 ExpiFectamine 293 형질감염 키트 (A14524, ThermoFisher)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공동 형질감염한 다음 형질감염한 세포를 Expi293 발현 배지에서 5 일간 배양했다. 배양 상등액을 0.45μm 필터로 여과하고 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼 (11003494, GE Healthcare)을 갖춘 AKTA 정제 장치 (GE Healthcare)을 사용하여 항체를 정제하였다.

hTAAB 결합의 에피토프를 확인하기 위해 hTAAB 결합의 Tie2의 최소 도메인을 확인했다. hTie2 Ig3-Fn3를 사용하여 항체 생성을 위한 마우스 면역화하였기 때문에 먼저 hTie2의 Ig3-Fn3, Fn1-3 또는 Fn2-3을 포함한 3가지 재조합 단백질을 제작하였다 (도 1, Tie2 구조 참조). 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 hTAAB 중쇄 가변 영역과 인간 γ1 불변영역 및 경쇄 가변영역과 인간 κ 불변영역의 융합에서 구축된 재조합 키메라 hTAAB Fab에 결합을 테스트했다. 영역. 키메라 hTAAB Fab만의 크로마토그래피 프로필은 키메라 hTAAB Fab을 hTie2Ig3-Fn3, Fn1-3 또는 Fn2-3와 혼합하면 앞으로 이동하는 단일 피크를 보여주었다 (도 2a). 또한 키메라 hTAAB Fab과 이러한 hTie2 도메인은 공동 용출했다. 이러한 결과는 hTie2 Fn2-3이 hTAAB 결합에 충분하며 hTie2 Fn2-3와 키메라 hTAAB Fab이 안정된 복합체를 형성할 수 있음을 보여준다 (도 2a, 노랑).

검색 모델로 Durvalumab Fab (PDB : 5X8M)과 Tie2 Fn2-3 구조 (PDB : 5MYA 체인 B를 사용하여 분자 치환을 통해 2.1 ㅕ 해상도 (표 1)에서 hTie2 Fn2.3/키메라 hTAABFab 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 결정학적 비대칭 유닛은 2회 대칭의 이종 사량체 hTie2 Fn2.3/키메라 hTAABFab 복합체 (2 : 2 화학양론적)가 포함되어 있었다.

[표 1]

두 키메라 hTAAB Fab는 2배 축에 수직인 평면에 대하여 약 15ㅀ의 기울기로 각 hTie2 Fn3 도메인의 측면에 결합했다 (도 3a 오른쪽). 이러한 결정 구조는 hTAAB 결합 Fn3 도메인에 대한 2개의 주요 에피토프를 밝혔고, 이들은 중쇄 결합의 경우 진한 오렌지색에서 경쇄 결합의 경우 밝은 주황색으로 표시되었다 (도 3b 및 c 상단). 이종 사량체 hTie2Fn2-3/키메라 hTAAB Fab 복합체 중 두 개의 hTie2 Fn2-3 단량체는 동일한 전체 구조를 공유하고 이전에 보고된 Tie2 Fn2-3 (PDB : 5MYB; 빨강) 및 Fn1-3 (PDB : 5UTK; 녹색)의 결정 구조와 유사한 것을 알 수 있었으며, Fn2과 Fn3 사이의 견고한 결합을 나타낸다 (도 2b; Cα 제곱 평균 제곱근 편차는 각 hTie2 Fn2-3 모노머 사이에 약 1.050ㅕ, 5MYB에서 1.506ㅕ 및 5UTK에서 1.999ㅕ이다). 주목할 것은, hTie2 Fn2-3/키메라 hTAAB Fab 복합체 중 hTie2 이합체 사이의 구성과 인터페이스도 이전의 연구 (5MYB과 5UTK의 이합체 2 모델) (도 2c, d)에서 발견된 것과 일치했다.

이러한 결과는 hTAAB 결합이 hTie2 호모이합체의 컨포메이션 변화를 일으키지 않았다는 것을 보여준다. 키메라 hTAAB Fab 4개의 도메인 (중쇄 가변영역 도메인 (VH), 중쇄 불변 도메인 (CH), 경쇄 가변영역 도메인 (VL) 및 경쇄 불변 도메인 (CL))는 β 시트의 쌍으로 이루어진 전형적인 Ig 도메인 폴드를 채용했다. 중쇄 CDR (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) CDR은 hTie2 Fn3 도메인과의 접촉에 관여했다 (도 3c 하단). 6 개의 CDR 이외에 경쇄 프레임 워크 영역 (FR) 잔기 R46, Y49, S53 및 R66도 hTie2 Fn3 도메인과 상호작용했다 (도 3d). 정리하면, 결정 구조에 관한 발견은 두 hTAAB Fab이 V 자형 Tie2 이합체의 측면, 특히 Fn3 도메인에 결합하는 것을 분명히 했다.

실시예 3. Tie2 Fn3와 hTAAB의 상호작용 및 동형 Fn3 상호작용

키메라 hTAAB Fab은 약 57%의 중쇄 접촉 (512.8ㅕ2; 진한 오렌지)과 43%의 경쇄 접촉 (384.7ㅕ2; 가벼운)로 이루어진 897.5ㅕ2의 총 매몰 표면적을 가진 큰 상호작용 인터페이스를 통해 hTie2Fn3에 결합한다. 오렌지) (도 3c). 키메라 hTAAB Fab과 hTie2 Fn3 사이의 결합 인터페이스는 A, B, C 영역의 3 가지 영역으로 나눌 수 있다 (도 4a, b 및 도 5).

A 영역의 상호작용은 주로 hTAAB 중쇄 (HCDR1 및 HCDR2)와 hTie2 Fn3 도메인 사이의 이온 상호작용과 수소 결합에 의해 매개된다. hTAAB HCDR1 (S28, T30, S31 및 W33) 및 HCDR2 (H52, D55 및 E57)의 잔기들은 hTie2Fn3 βA [E643, N644, I645 (주쇄), K646, I647 (주쇄)] 및 βG (H727) 잔기들과 여러 상호작용을 형성한다 (도 4a 상단 왼쪽 및 하단 왼쪽 및 4c).

B 영역에서는 hTAAB의 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 소수성 상호작용에 의해 hTie2 Fn3의 넓은 표면을 커버하고, 총 매몰 표면적은 413.5A이다. hTie2 Fn3의 잔기들 I647, I650, A707, V730 및 L732은 HCDR3 잔기들 L100 및 Y101 및 LCDR의 I31, Y49, A50, Y91 및 A92과 소수성 코어 상호작용의 네트워크를 형성한다 (도 4a, 하단 왼쪽 및 4d). 이러한 소수성 상호작용은 hTie2 Fn3 잔기 (Q677, E705 및 E728)과 hTAAB 경쇄 잔기 (S53, R66 및 R46) 사이의 수소 결합 및 정전기 상호작용을 각각 포함하는 인접한 C 영역 상호작용에 의해 안정화된다 (도 4a 하단 중앙 및 4c).

흥미롭게도, C 영역의 상호작용에 관여하는 hTAAB 경쇄 잔기는 CDR 루프가 아닌 FR의 β 가닥 (βC'의 R46, βC'의 S53 및 βD의 R66)에 있다. hTAAB 상호작용에 관여하는 대부분의 hTie2 Fn3 잔기들은 다양한 종류간에 고도로 보존되어 있으나 (도 5a), hTAAB 결합 계면의 중심에 있는 hTie2의 소수성 발린 (V730)은 마우스 및 쥐에서 길고 하전된 측쇄 (아르기닌)로 치환되어 있으며 (도 3b 및 도 5a), hTAAB가 마우스 Tie2에 결합할 수 없는 이유를 설명하고 있다 (도 1e 오른쪽). 그러나 hTAAB의 모든 에피토프는 인간과 원숭이의 Tie2 사이에 저장되어 있으며, hTAAB이 원숭이의 Tie2과 교차 반응을 나타내는 것을 시사하고 있다 (도 5a). 또한 Tie2와 Tie1의 Fn2-3 도메인, 특히 hTAAB 상호작용에 관여하는 잔기 사이의 서열 유사성이 낮기 때문에 hTAAB이 Tie1에 결합할 가능성은 낮다 (도 5b).

이전 Tie2 아포 구조 (5MYB 및 5UTK의 Dimer2 모델)와 일치하도록 Fn3-Fn3' 인터페이스는 동형 Fn3βC'(D682~K690)의 주쇄 원자 사이의 수소 결합으로 구성되어 있으며, 연속적 역평행 β 시트를 형성한다 (도 4a 오른쪽). 이합체 계면은 V685과 V687이 참여하는 소수성 상호작용 및 상호 정전 상호작용, 특히 D682-N691 ', D682'-N691, Y697-Q683', Y697'-Q683, K700-E703 '및 K700'-E703 (도 4a, 오른쪽 아래)에 의해 더욱 안정화된다. Fn3-Fn3 '사이의 넓은 매몰 계면 (704ㅕ2) - 4.7 kcal/mol 낮은 용해화 자유 에너지 수득 (Pisa 서버 분석) 및 hTAAB의 존재에 관계없이 Tie2 호모이합체의 일관된 V 자형 구성을 통해, 동형 막 근위 Fn3 도메인 사이의 특정 상호작용은 리간드 독립성 Tie2 호모이합체 형성에 기여함을 의미한다.

결정 구조 및 Fn2 변이체를 이용한 기능 분석에 따르면, 사전에 형성된 Tie2 이합체의 측면 클러스터에 Fn2 상호작용이 필수적이라고 제시되어 왔다. 놀랍게도, 구조에 Tie2 Fn2-3 / hTAAB Fab 복합체가 포함되어 있고, 단백질 결정의 공간 군이 두 구조 사이에서 다른 경우에도 결정 패킹에서 인접한 호모이합체의 Fn2 도메인간에 동일한 상호작용이 관찰되었다 (도 12a, b). 그러나, 결정 패킹 격자에서 Tie2 Fn3에 결합된 Fab 및 Fab*는 서로 거의 평행이기 때문에 (* 표시는 Tie2 Fn2-3 / hTAAB Fab 복합체 중 대칭 메이트 중 도메인 또는 잔기를 나타내는 데 사용함) 하나의 IgG1 중 2 개의 Fab 암 사이의 가능한 각도 (115-148ㅀ)에서 일탈하고 있다. 따라서 hTAAB IgG1이 사전에 형성된 Tie2 이합체의 Fn2 매개 측면 클러스터링에 관여할 가능성은 낮지만, 이러한 유형의 Tie2 클러스터링은 더 높은 차원의 Angpt1에서 발생할 수 있다.

실시예 4. hTAAB IgG 결합을 통해 Tie2 이합체의 다각형 조립체를 유도함

인간 제대 정맥 내피세포 (HUVEC; C2519A, Lonza)를 EGM-2 내피 증식 배지 (CC-3162; Lonza)에서 유지하고 가습 5% CO2 배양기 중 37℃에서 배양하였다. Expi293F 세포 (A14527, ThermoFisher)을 Expi293 발현 배지 (A1435102, ThermoFisher)에 유지하고 37ㅀC, 8% CO2 가습 진탕 배양기에서 배양하였다.

다량체 Angpt1 또는 COMP-Angpt1은 Tie2의 고차 클러스터링을 유발할 가능성이 있으며, 이것은 혈관 안정화를 위해 EC에서 Tie2와 그 하류신호를 활성화하기 위한 열쇠이다. Tie2 수용체의 주요 하위 신호 전달 단백질인 Akt 인산화의 수준을 immunoblotting 기법으로 측정하였다. 흥미롭게도, hTAAB Fab 뿐 아니라 hTAAB IgG1도 일차 배양 HUVEC에서 Tie2와 Akt의 농도 의존성 활성화를 유도하였다 (도 6a 및 6b). 이 결과는 hTAAB Fab의 Tie2 자체에 결합이 Tie2의 클러스터화와 활성화를 유도하기에 충분하다는 것을 의미했다. 즉, hTAAB IgG1는 2가 Fab 암(arm)을 통해 Tie2 클러스터링을 촉진할 수 있다. 그러나 이종 사량체 hTie2 Fn2-3/키메라 hTAAB Fab 복합체 중 Fab 중쇄의 2개 C 말단 사이의 거리는 170ㅕ보다 큰 것을 알 수 있고 (도 3a), 동형 Tie2 이합체에 결합하는 2개의 Fab는 두 가지 다른 IgG 분자에서 유래한다. 이종 사량체 hTie2Fn2-3/키메라 hTAABFab 복합체의 결정 구조와는 달리, SEC-다각도 광산란 (MALS) 분석을 통해 hTie2 Fn2-3 및 hTie2 ECD가 용액 중에서 단량체인 것이 밝혀졌다. 또한, hTie2Fn2-3 또는 hTie2 ECD에 결합하는 hTAAB은 올리고머화를 유도할 수 없었다 (도 6c). 우리의 데이터와 이전의 보고들은 용액 중 재조합 Tie2 외부 도메인의 다량체 상태에 대하여 모순되었다. 그러나, 리간드에 의존하지 않는 Tie2의 이량체화는 전장 Tie2에 의해 부과되는 공간적 제약을 통해 생리적 조건하에서 세포막에서 발생할 수 있다. 이러한 이량체화는 결정 구조에서 보여지는 동형의 Fn3-Fn3' 상호작용과 함께, 세포 내 키나아제 도메인 중 촉매 루프와 활성화 루프 사이의 YIA 서열을 통해 특히 발생할 수 있다.

생리학적 세포막에서 리간드 독립적인 Tie2 이량체를 모방하기 위해 구성적 Tie2 이량체를 인위적으로 생성했다. 동형 Fn3-Fn3' 상호작용에 관여하는 두 개의 잔기 D682와 N691을 시스테인 (D682C 및 N691C)으로 돌연변이시켜 이황화 결합을 도입했다 (도 6d, e). 그런 다음 정제된 hTie2 Ig3-Fn3 D682C/N691C 이량체를 hTAAB IgG1과 1 : 1 비율로 배양하여 전장 hTAAB IgG1이 미리 형성된 Tie2 이량체의 클러스터링을 어떻게 유도하는지 조사했다. SEC에 의해 응집체를 제거한 후, 네거티브 염색 전자 현미경 (EM)을 사용하여 생성된 복합체 (어깨의 피크)의 구조적 서열을 조사했다 (도 6f 및 도 7). 놀랍게도, 네거티브 염색 EM 입자의 2D 분류는 전장 hTAAB IgG1가 hTie2 Ig3-Fn3 D682C/N691C 이량체의 정방형, 오각형 및 육각형 고차 조립체에 교차결합하는 것으로 나타났다 (도 6g). 이러한 다각형 조립체는 각 정점에서 IgG1의 Fc 도메인 및 Fab 암 중 하나에 결합하여 2 개의 IgG1을 연결하는 하나의 Tie2 이량체를 특징으로 한다. Ig3와 Fn1 도메인 사이 루프의 유연성으로 인해 Ig3 도메인이 네거티브 염색 EM의 2D 평균에서 확산된 것처럼 보였지만, 다각형 측면을 가로지르는 hTie2 Ig3-Fn3 D682C/N691C 이량체의 단단한 Fn1-3 도메인은 구별되었다. 네거티브 염색 EM에서 관찰된 결과와 hTie2 Fn2-3/키메라 hTAAB Fab 복합체의 결정 구조를 기반으로 오각형 조립체의 3D 모델 (5 ~ 5 hTAAB IgG 및 hTie2 Ig3-Fn3 D682C/N691C 이합체)을 생성할 수 있다 (도 6h).

실시예 5. 리간드 독립적 Tie2의 이량체화는 hTAAB 매개 Tie2의 클러스터링과 활성화에 필수적임

세포막 중 Tie2/hTAAB 다각형 조립체의 생물학적 관련성과 중요성을 평가했다. Tie2 이합체 (D682C/N691C)를 사용하여 Fn3-Fn3 '이합체 인터페이스 (도 8a)을 파괴함으로써, 전장 Tie2-GFP구조체와 함께 Tie2 모노머 (V685D/V687D/K700E)을 만들었다. 이러한 구조를 사용하여 Tie2를 내생적으로 발현하지 않는 HEK293T 세포를 일시적으로 형질감염 시켰다. 세포에서 전장 Tie2-GFP 야생형 (WT)과 지속적 이량체 및 단량체 Tie2 변이체의 적절한 원형질막 발현을 확인한 후 (도 8b), GFP 태그 Tie2 WT 및 변이체의 클러스터를 모니터했다. 라이브 셀 이미징에서 WT Tie2와 Tie2 이합체 클러스터가 hTAAB 또는 COMP-Angpt1의 첨가 후 세포 표면에 형성되었지만 Tie2 단량체는 클러스터를 형성할 수 없었다 (도 8b). 다음은 동일한 조건에서 Tie2와 Akt의 인산화를 모니터링함으로써 HTAABIgG1 또는 COMP-Angpt1이 Tie2의 활성화에 미치는 영향을 조사했다. Fn3-Fn3 이합체 인터페이스의 파괴 (Tie2 단량체 구축)에 의해 hTAAB 및 COMP-Angpt1 의해 유도된 Tie2와 Akt의 인산화를 제거했지만, WT Tie2 및 이량체 Tie2는 두 Tie2 작용제에 의해 비슷하게 활성화되었다 (도 8c, d). 이러한 결과는 WT Tie2가 원형질막에 동형이합체로 존재하고 Fn3 도메인 사이의 분자간 상호작용에 기인하는 리간드 독립성 동형 Tie2 이량체화가 hTAAB을 통해 Tie2의 클러스터링과 활성화에 필수적임을 보여준다.

실시예 6. 인간화 TAAB은 HUVEC에서 Tie2와 그 하류 신호를 활성화함

6.1 인간화 항체 제조

마우스 hTAAB의 Fv 영역은 Tie2 Fn2-3/키메라 hTAAB Fab 복합체 구조 및 IGHV1-46*01 and IGKV1-17*01 복합체의 모델 구조에 따라 인간화되었다.

International ImmunoGeneTics 정보 시스템 (IMGT)의 IMGT/DomainGapAlign 온라인 툴을 사용하여 마우스 hTAABFv 서열을 인간 생식 세포 계열 유전자의 서열과 비교했다 (http://www.imgt.org). 마우스 hTAAB의 중쇄 및 경쇄 가변영역에 각각에 가장 높은 서열 상동성을 보이는 IGHV1-46 * 01 및 IGKV1-17 * 01을 인간 프레임워크 (FR) 공여자로 선택했다. IGHV1-46 * 01 및 IGKV1-17 * 01의 CDR (IMGT 넘버링으로 정의)을 마우스 hTAAB에서 대응하는 것으로 대체하여, hzTAAB-H1 및 hzTAAB-L1을 생성하였다. VH-VL 페어링, CDR 컨포메이션 및 Tie2 Fn3에 대한 친화도 유지를 위해 중요한 선택 잔기들을 hzTAAB-H1 및 hzTAAB-L1에 추가로 치환하여, hzTAAB-H2 및 hzTAAB-L2를 생성했다. 얻어진 인간화 Fv 유전자 (hzTAAB-H1, hzTAAB-H2, hzTAAB-L1, hzTAAB-L2)를 합성하였고 (Bioneer), 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화되었다. 인간 면역글로불린 카파의 경쇄 불변영역 (GenBank accession number: AAA58989.1) 및 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변영역 (GenBank accession number: AWK57454.1)을 먼저 pOptiVEC-TOPO 및 pcDNA3.3-TOPO 벡터에 클로닝하였고, 여기에 합성된 인간화 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 (hzTAAB-H1, hzTAAB-H2, hzTAAB-L1 또는 hzTAAB-L2)을 연속적으로 클로닝하였다.

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 31)

DNA sequence (SEQ ID NO: 32)

Human IgG1 heavy chain constant region (CH1~CH3) (GenBank accession number: AWK57454.1)

Amino acid sequence (SEQ ID NO: 33)

DNA sequence (SEQ ID NO: 34)

인간화 경쇄 및 중쇄를 포함한 플라스미드를 ExpiFectamine 293 형질감염 키트 (A14524, ThermoFisher)를 사용하여 Expi293F 세포에 형질감염 했다. 세포를 진탕 배양기 (orbital shaker, 125rpm)에서 8% CO₂ 중 37 ℃에서 5 일간 배양했다. 수득한 배양 상등액을 원심분리하여 세포를 제거하고 PBS로 평형화한 ProA 컬럼 (Amicogen)에서 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 분리했다. 결합된 항체를 0.1M 글리신-HCl, pH 2.7에서 용출하고 1 M Tris-Cl, pH9.0로 중화했다. 용출된 항체는 PBS로 평형화된 Superdex 200 Gain 10/300 GL 열 (28-9909-44, GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되었다. 항체의 순도는 환원 및 비환원 SDS-PAGE를 사용하여 평가하고 정제한 항체를 분주하여 -80℃에서 저장하였다.

6.2 인간화 Tie2 활성화 항체의 상동성 모델링

SWISS-MODEL 상동성 모델링은 Tie2 Fn2-3/chimeric hTAAB Fab 복합체 구조 중 hTAAB Fv의 구조를 템플레이트로 사용하여 hTAAB CDR을 그래프팅한 인간 생식세포 계열 IGHV1- 46*01 및 IGKV1-17*01의 서열을 사용하여 수행되었다. 가장 높은 QMEAN-Z (Qualitative Model Energy ANalysis-Z) 점수 (-0.37)를 가진 결과 모델은 추가 구조 기반의 인간화를 위해 hTAABFv 구조와 정렬하였다.

hTAAB 강력한 Tie2 작용제 활성은 혈관 질환의 임상 응용에서 유망하다. 따라서 Tie2에 결합하여 활성화할 수 있는 능력을 유지하면서 마우스의 기원으로 인한 면역원성을 최소화할 수 있도록 마우스 hTAAB을 인간화 하고자 하였다. Fab 도메인과 Fc 도메인 사이의 힌지에서 이황화 결합의 길이, 서열 및 개수가 다르기 때문에 IgG 서브클래스의 힌지 유연성은 약간 변동적일 수 있고, 각각의 서브클래스에 대한 Fc 도메인과 관련된 Fab-Fab 각도 및 Fab 배향도 변동될 수 있다.

hTAAB의 Fab-Fab 각도와 Fab 배향이 Tie2의 다각형 조립체의 중요한 결정 요인이 될 수 있음을 고려하여 힌지의 유연성이 Tie2의 활성화에 영향을 미치는지 여부를 조사했다. 이를 위해 hTAAB의 가변영역을 포함 키메라 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 제작하였고 (도 9a), 그 Tie2 작용제 활성을 모항체 마우스 hTAAB의 활성과 비교했다. Tie2와 Akt의 인산화는 IgG 서브 클래스 힌지의 유연성과 상관있었다 (IgG1> IgG4> IgG2). 가장 단단한 쇄를 가진 IgG2 동종형은 가장 낮은 Tie2 작용제 활성을 나타냈다 (도 9b, c). 이러한 결과는 hTAAB에 의한 공간으로 잘 배치된 Tie2 클러스터의 형성이 Tie2 활성화에 중요하다는 것을 보여준다. 이러한 관찰을 바탕으로 hTAAB 인간화는 IgG1 형식을 선택했다.

IMGT (International ImmunoGeneTics information system) (http://www.imgt.org)의 IMGT/Domain Gap Align 툴을 사용하여, CDR의 경계를 정의하고 마우스 hTAAB의 중쇄 가변영역 (66%) 및 경쇄 가변영역 (68%)에 가장 높은 서열 상동을 나타내므로 인간 생식세포계 유전자 IGHV1-46 * 01 및 IGKV1- 17 * 01를 인간 FR 공여자로 선택했다 (도 9d 및 도 5C-D).

인간 Tie2에 대한 마우스 hTAAB 및 인간화 IgG1의 결합 동태는 인증 등급 CM5 시리즈 S 센서 칩 (BR100399, GE Healthcare)을 갖춘 Biacore T200 시스템을 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. 3 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)와 0.05 % (v/v) P20 제제 (HBS-EP +)를 포함 HEPES 버퍼 생리식염수 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl)을 반응 및 러닝 버퍼 (BR100669, GE Healthcare )로 사용했다. 인간 Tie2 ECD (사내 제조; 인간 Tie2의 잔기 23-735, GenBank accession number: AAH35514.2)은 pH5.5 10 mM 아세트산염을 사용한 아민 커플링을 통해 CM5 센서 칩의 표면에 고정화 되었다. 그 후, HBS-EP + 버퍼로 희석한 마우스 hTAAB 및 인간화 IgG1을 7 가지 다른 농도 (0,2,4,8,16,32 및 64 nM)의 항원 고정화 센서 칩에 300초 동안 30μl/분의 유동 속도로 적용하였다. 센서칩에 결합한 분석 대상물은 HBS-EP + 런닝 버퍼로 300 초간 세척하여 해리했다. 결합 (k_on M^-1s^-1) 및 해리 (koff, s^-1) 상수는 모두 300초 간격으로 측정되었다. 평형 해리 상수 (KD, M)는 오프 속도와 온 속도 비율 (koff / kon)으로 계산되었다. 속도론적 파라미터는 1 : 1 결합 모델을 사용하여 Biacore Insight Evaluation Software의 글로벌 피팅 기능으로 결정되었다.

마우스 Tie2에 대한 마우스 hTAAB와 인간화 IgG1의 결합 동태는 Octet 시스템 (ForteBio)를 사용한 BLI (Biolayer Interferometry)에 의해 측정되었다. 분석은 30 ℃에서 실시했다. 동태 버퍼 (0.01 % 독소 미포함 BSA 0.002 % Tween-20, PBS에 0.005% NaN₃)에서 10 분간 수화한 후 마우스 hTAAB (각 10μg/ml)을 항 마우스 IgG Fc 캡처 (AMC) 바이오 센서 (ForteBio)에 로드했다. Ab 코팅된 센서를 마우스 Tie2Ig3-Fn3 (잔기 349-737)의 1600 nM 용액과 인큐베이션하여 결합 곡선을 600 초 동안 기록했다. 해리는 반응 속도 버퍼에서 600초 동안 측정했다.

선택된 인간 생식세포계 FR 공여자의 CDR 부분을 하이브리도마 마우스 항체 hTAAB의 대응하는 CDR로 단순히 대체하여 기존의 CDR을 그라프팅하였다. hTAAB HCDR2의 컨포메이션을 유지하기 위해 S59을 인간화 항체 hTAAB 중쇄의 HCDR2에 인접한 R59 잔기로 대체했다. 인간화 Tie2 활성화 항체 (hzTAAB)의 중쇄 및 경쇄 (hzTAAB-H1 및 hzTAAB-L1)의 CDR이 이식될 가변영역을 인간 Igγ1 중쇄사슬의 불변영역 (GenBank accession number: AWK57454.1)를 포함하는 pOptiVEC-TOPO 벡터에 및 인간 Igκ 경쇄의 불변영역(GenBank accession number: AAA58989.1)을 포함하는 pcDNA3.3-TOPO 벡터에 각각 클로닝하였다. HEK293F 세포에서 hzTAAB-H1과 hzTAAB-L1을 공동 발현시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 SEC에 의해 전장 IgG1로 균일성에 대한 항체를 정제한 후 (도 10a, b), SPR을 사용하여 hTie2 ECD에 대한 hzTAAB-H1L1의 결합 동태를 평가했다. hTie2에 결합하는 hzTAAB-H1L1은 모항체 hTAAB에 비해 훨씬 낮은 친화력과 빠른 분해 속도 (kon = 2.5 X 105 M-1s-1; koff = 5.6 X 10-3 s-1; KD = 2.2 X 10-8 M)를 나타내며 (도 9f) 기존의 CDR 그라프팅으로는 hTie2에 대한 hTAAB의 결합 친화력을 유지하기에 불충분하다는 것을 보여준다.

hTAAB 구조 기반의 인간화와 관련하여, 결정 구조의 모항체 hTAAB의 Fv (가변 단편) 구조를 템플릿으로 사용하여, hzTAAB-H1과 hzTAAB-L1의 상동 모델링을 수행했다. 모항체 hTAAB Fv 구조를 제작된 hzTAAB-H1L1Fv 모델에 두고, VH-VL 페어링, CDR의 컨포메이션 및 hTie2에 결합 친화력을 유지하기 위해 중요한 FR 잔기를 확인했다 (도 9e). hzTAAB-H1L1와 모항체 hTAAB의 VH-VL 인터페이스 비교 분석을 통해 LFR2의 hTAAB 경쇄 잔기인 N34 및 L36 (hzTAAB-L1에서 G34 및 Y36)는 HCDR3의 Y101을 안정화하고 HFR4의 W105에 입체 장애 효과 (steric hindrance)를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, LFR3에 hTAAB 경쇄 잔기 D55 (hzTAAB-L1의 Q55)는 LFR2에서 R46와 상호작용함으로써 LCDR2 헤어핀 루프의 컨포메이션을 유지하기 위해 중요하다 (도 9e의 f 참조). LFR3에 hTAAB 경쇄 잔기 R66 (hzTAAB-L1의 G66)도 hTie2의 E705와 전하 상호작용을 통해 Tie2에 결합하는데 중요하다 (도 9e의 g 참조). 이러한 근거에 따라, hzTAAB-L1의 선택된 잔기를 대응되는 마우스 hTAAB 잔기 (G34N, Y36L, Q55D 및 G66R)로 역변이시킴으로써 hzTAAB-L2를 생성했다 (도 9d). 중쇄 (hzTAAB-H2)에 대하여, hzTAAB-H1의 HFR3에서 R72과 T74을 모항체 hTAAB 잔기 V72과 K74로 변이시켰고, HCDR2의 P53와 S54과 상호작용함으로써 HCDR2의 컨포메이션을 안정시킬 수 있다 (도 9e의 h 참조).

hzTAAB-H1L1에 이어, HEK293F 세포에서의 전장 IgG1으로 중쇄와 경쇄의 다양한 조합에 따라 다른 3 개의 hzTAAB (hzTAAB-H1L2, hzTAAB-H2L1 및 hzTAAB-H2L2)을 생산하였다 (도 10a, b). 정제 후, SPR을 사용하여 얻어진 항체 hTie2 ECD에 결합 키네틱을 평가했다. hzTAAB-H2L1의 결합 친화력 (kon = 2.8 X 105 M-1s-1; koff = 3.3 X 10-3 s-1; KD = 1.1 X 10-8 M)은 hzTAAB-H1L1 (kon = 2.5 X 105 M-1s-1; koff = 5.6 X 10-3 s-1; KD = 2.2 X 10-8 M) 보다 약간 높지만, 그 해리 속도는 모항체 hTAAB (kon = 1.4 X 105 M-1s-1; koff = 6.0 X 10-4 s-1; KD = 4.2 X 10-9 M) 보다 훨씬 높았다 (도 9i). 그러나, 경쇄 역변이는 hzTAAB-H1L2 (kon = 1.1 X 105 M-1s-1; koff = 9.6 X 10-4 s-1; KD = 8.5 X 10-9 M) 및 hzTAAB H2L2 (kon = 1.4 X 105 M-1s-1; koff = 7.3 X 10-4 s-1; KD = 5.2 X 10-9 M)의 hTie2 ECD에 대한 친화도를 대폭 개선시켰다 (도 9i). 얻어진 인간화 항체 (hzTAAB-H1L2 및 hzTAAB-H2L2)의 친화도는 모항체 hTAAB의 친화도에 필적할만하고, 주로 해리 속도가 대폭적으로 감소하였다. 또한, Tie2 결합 친화력을 이전에 보고된 3H7H12G4라는 인간화 항체 3H7과 비교하면 hzTAAB-H2L2는 3H7H12G4보다 4,700배 더 높은 친화력을 나타내고, 이는 구조 기반 hTAAB 인간화 과정에서의 개선을 제안하고 있다 (도 9i). 모항체 hTAAB와 마찬가지로 인간화 항체는 모두 mTie2에 결합하지 않았다 (도 10c).

이후, hzTAAB 처리시 Tie2와 Akt의 인산화를 조사하고, hTAAB 또는 3H7H12G4 처리 후 인산화와 비교했다. Tie2 결합 친화도와 일치되게, 이전에 개발된 3H7H12G4는 hTAAB에 비해 훨씬 낮은 Tie2 작용제 활성을 나타냈다 (도 11a, b). 4 개의 hzTAAB에서 hzTAAB-H2L2은 HUVEC에서 Tie2와 Akt의 인산화를 가장 강력하게 유도했다 (도 11c, d). 이것은 hTAAB의 Tie2 작용제 활성에 필적합니다. 또한 hzTAAB-H2L2과 3H7H12G4을 비교하면 hzTAAB-H2L2는 뛰어난 Tie2 작용제 활성을 나타냈다 (도 11e, f).

따라서, hzTAAB-H2L2는 COMP-Angpt1 및 모항체 hTAAB과 유사한 정도로, EC의 생존, 이동, 관 형성 및 세포 간 접촉 부위로 Tie2 전위 (translocation) 및 핵에서 세포질 졸로 FOXO1 전위를 강력하게 유도한다 (도 11g-i). 종합하면, 구조 기반의 인간화 전략은 모항체 hTAAB의 결합 친화도 및 Tie2 작용제 활성을 성공적으로 보유하도록 한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Institute for Basic Science korea advanced institute of science and technology <120> Tie2 Agonistic Antibodies and Uses Thereof <130> P21-B117 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTAAB VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Tyr Gly Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTAAB VL <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser 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tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgc 318 <210> 31 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Kappa light chain constant region <400> 31 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 32 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Kappa light chain constant region <400> 32 acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgc 318 <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 heavy chain constant region <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 heavy chain constant region <400> 34 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 35 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTAAB heavy chain constant region <400> 35 Gly Cys Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys 1 5 10 15 Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala 35 40 45 Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala 50 55 60 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Thr Gly 65 70 75 80 Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Cys Gly Gly Thr Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly 115 120 125 Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Cys 145 150 155 160 Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly 165 170 175 Cys Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Thr 180 185 190 Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly 195 200 205 Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Gly 210 215 220 Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly 225 230 235 240 Ala Cys Thr Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys 245 250 255 Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr 290 295 300 Gly Thr Gly Gly Cys 305 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTAAB light chain constant region <400> 36 cgcgctgatg ccgctcctac cgtctccata tttccgccct cctcagagca gctcacatca 60 ggtggggcgt ccgtggtgtg ctttctgaat aatttctatc cgaaggatat taacgtcaaa 120 tggaaaattg acggctcgga acgtcaaaac ggtgttctga actcctggac cgaccaggat 180 tctaaggata gtacttatag tatgagtagc acattgacac ttactaaaga cgaatatgag 240 cgtcacaata gctacacctg tgaggccacc cataaaacga gcacctcgcc gatcgttaag 300 agctttaatc gcaatgaatg c 321

Claims

Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합단편으로,
상기 항체는 인간 Tie2의 Ig3 Fn3 (membrane proximal fibronectin type III) 도메인에 결합하고,
상기 항체의 결합에 의해, 호모이합체 (homodimer) Tie2가 다각형 조립체 (polygonal assembly)를 형성하여, 클러스터링 (clustering) 및 활성화되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 도메인 (VH), 서열번호 3의 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인 (CH), 서열번호 2의 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 도메인 (VL) 및 서열번호 4의 서열을 포함하는 경쇄 불변 도메인 (CL))을 포함하는 Fab인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서,
서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
제3항에 있어서,
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
제5항에 있어서, 서열번호 9 내지 14로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제5항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
제7항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
다음 단계를 포함하는 Tie2 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
(a) 제8항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 혈관신생 질환은 암, 전이(metastasis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성 (macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 다른 혈관신생 질환 치료제와의 병용투여용 조성물.