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KR20220130150A - 망막 신경절 세포의 재생 - Google Patents

망막 신경절 세포의 재생 Download PDF

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KR20220130150A
KR20220130150A KR1020227027252A KR20227027252A KR20220130150A KR 20220130150 A KR20220130150 A KR 20220130150A KR 1020227027252 A KR1020227027252 A KR 1020227027252A KR 20227027252 A KR20227027252 A KR 20227027252A KR 20220130150 A KR20220130150 A KR 20220130150A
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KR
South Korea
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ala
ser
gly
leu
pro
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227027252A
Other languages
English (en)
Inventor
홍쥔 리우
샤오후 웨이
나 차오
Original Assignee
상하이테크 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이테크 유니버시티 filed Critical 상하이테크 유니버시티
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Abstract

본 명세서는 전사 인자 예컨대 Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 또는 Ils1 중 하나 이상을 활성화시켜서 망막 신경 세포로부터 망막 신경절 세포 (RGC)를 재생시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 망막 신경 세포는 사이뉴런 세포, 예컨대 아마크린 세포, 수평 세포, 및 양극 세포일 수 있다. 재생된 RGC는 축삭을 개별 피질하 뇌 영역으로 돌출시킬 수 있고 망막-뇌 연결을 확립할 수 있다. 그들은 시각 자극에 반응할 수 있고 전기 신호를 뇌에 전달할 수 있다. 그러므로, 재생된 RGC는 손상되거나 또는 퇴화된 RGC를 교체할 수 있어서, 시각 장애 또는 실명을 치료할 수 있다. 유사하게, 방법은 퇴화되거나, 손상되거나, 또는 노화된 RGC에 적용가능하여, 그들이 기능성 축삭을 재성장시키도록 자극시켜서, 이들 RGC를 재활력화시킬 수 있다.

Description

망막 신경절 세포의 재생
본 발명은 2020년 1월 16일 출원된, 202010047628.2의 우선권을 청구하고, 이의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
망막 신경절 세포 (RGC)는 시각 정보를 처리하고 이것을 별개 뇌 시각 영역으로 전달하여 시각을 형성하는 망막의 최종 출력 뉴런이다. RGC의 상실은 녹내장을 포함한, 시신경병증, 유전성 시신경병증, 및 독소, 영양적 결함, 및 외상으로 초래된 장애로서 광범위하게 분류되는 질환 그룹에서 실명의 주요 원인이다. 이들 환자에서 시력 상실은 비가역적인데 인간 및 모든 포유동물은 성인기에 RGC를 생성시키는 능력이 결여되기 때문이다. 이러한 환자에서 상실된 시력을 회복하기 위한 재생 요법을 개발하는데 큰 관심이 있다.
시신경병증에 대한 재생 요법을 개발하는 한가지 매력적인 접근법은 상실된 신경절 세포를 대체하고 내생성 세포를 사용하여 망막을 뇌에 재연결하는 것이다. 망막 줄기/전구체 세포를 확인하고, 망막 뉴런이 다양한 모델 유기체에서 어떻게 생성되는 가를 이해하기 위해 엄청난 노력이 기울여져 왔다. 이전 연구들은 어류 및 양서류같은 하등 척추동물이 손상 후에 그들 망막을 기능적으로 재생하고, 뮐러 신경교세포는 재생된 망막 뉴런의 세포 공급원이라는 것을 입증하였다. 대조적으로, 포유동물에서 뮐러 신경교세포는 이러한 능력을 갖지 않고 인간을 포함한 포유동물은 또한 성인 단계에서 망막 뉴런을 재생시키도록 유지된 망막 줄기/전구체 세포의 다른 저장소를 갖지 않는다. 현재 합의는 성숙한 포유동물 망막에서 뉴런의 지속적인 첨가는 정상적으로 거의 내지 전혀없다는 것이다.
이들 질환 및 병태를 치료하고 환자의 시력을 회복시키고자 하는 강력한 요구가 존재한다.
본 개시는 망막 신경절 세포 (RGC)가 전사 인자 예컨대 Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 또는 Ils1 중 하나 이상을 활성화시켜서 망막 뉴런으로부터 재생될 수 있다는 발견을 보고한다. 재생된 RGC는 축삭을 별개 피질하 뇌 영역으로 돌출시킬 수 있고 망막-뇌 연결을 확립할 수 있다. 그들은 시각 자극에 반응할 수 있고 전기 신호를 뇌에 전달할 수 있다. 그러므로, 재생된 RGC는 손상되거나 또는 퇴화된 RGC를 대체하여, 시각 장애 또는 실명을 치료할 수 있다.
다른 예상치 않은 발견에서, 이들 전사 인자의 활성화는 또한 퇴화되거나, 손상되거나, 또는 노화된 RGC를 재활성화할 수 있어서 그들은 기능성 축삭을 재성장시킬 수 있게 된다. 따라서, 이들 전사 인자를 활성화시킬 수 있는 치료제가 대상체에게 투여될 때, 그들은 퇴화되거나, 손상되거나, 또는 노화된 RGC를 재활력화 (rejuvenation)시킬 수 있고, 동시에 근처 사이뉴런 세포를 재생된 RGC로 재프로그램밍할 수 있다. 이들 작용제의 이러한 이중 효과는 바람직한 치료적 효과를 달성하는데 보다 효과적일 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 따라서, POU 클래스 4 호메오박스 2 (Brn3B), SRY-박스 전사 인자 4 (Sox4), 아토날 BHLH 전사 인자 7 (Atoh7), SRY-박스 전사 인자 11 (Sox11), 및 ISL LIM 호메오박스 1 (Ils1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의, 생물학적 활성을 망막 신경 세포에서 증가시키는 단계를 포함하는, 시각 신호에 반응성인 포유동물 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 Brn3B 및 Sox4를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 Atoh7을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 망막 신경 세포는 사이뉴런 세포, 예컨대 아마크린 세포, 수평 세포, 또는 양극 세포이다. 일부 구현예에서, 망막 신경 세포는 퇴화되거나, 손상되거나, 또는 노화된 망막 신경절 세포 (RGC)이다. 일부 구현예에서, 망막 신경 세포는 Lgr5+ 아마크린 세포이다. 일부 구현예에서, 망막 신경 세포는 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 퇴화되거나, 손상되거나, 노화되거나, 또는 개선된 기능이 바람직한, 정상/건강한 망막 신경절 세포 (RGC)의 기능을 개선시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 RGC에서 증가시키는 단계를 수반한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터로 제공될 수 있는, cDNA 같은, 유전자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계를 포함한다.
또한 Brn3B, Sox4, Atoh7, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 작용제를, 대상체의 망막에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 시각 장애 또는 실명을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 시각 장애 또는 실명은 퇴화된 망막 신경절 세포 (RGC)에 의해 초래된다. 일부 구현예에서, 시각 장애 또는 실명은 녹내장을 포함하는, 시신경병증, 유전성 시신경병증, 및 독소, 영양적 결함 및 외상으로 초래된 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태와 연관된다.
또한, 일 구현예에서, Brn3B 및 Sox4 단백질을 코딩하는 코딩 서열, 및 각 코딩 서열과 연관된 프로모터를 포함하는 핵산 구성체를 제공하고, 각각의 프로모터는 망막 신경 세포에서 활성이 있다.
다른 구현예는 핵산 구성체가 형질감염된 세포를 제공한다. 또 다른 구현예는 본 명세서에 개시된 방법을 통해서 제조된, 시각 신호에 반응성인 세포를 제공한다.
이들 및 다른 구현예는 하기 본문에 더욱 기술된다.
도 1. Lgr5 + 아마크린 사이뉴런은 성체 마우스에서 다른 뉴런 아형으로 전환분화된다. a, 내부 핵층에서 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런을 보여주는 망막 단면의 이미지. b, c, Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 망막 단면의 이미지이다. 화살표는 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런으로부터 양극 (b) 및 수평 (c) 세포의 생성을 강조한다. d, 망막 신경절 세포 층에 집중된, 평면-고정된 망막 샘플의 이미지. 내부 핵층으로부터 신경절 세포 층으로 이동된 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런은 녹색으로 표시된다. e, 전체 시야 섬광에 반응한 Lgr5+ 아마크린 세포의 대표적인 막 전위. 삽도: 염료 충전 이후에 기록된 세포의 형광 이미지. f, 전체 시야 섬광에 반응한 Lgr5+ 아마크린 세포의 대표적인 흥분성 시냅스후 전류 (EPSC, 파란색) 및 억제성 시냅스후 전류 (IPSC, 붉은색). 전체로, 6개 기록된 세포 중 5개는 전체 시약 LED 빛 자극에 대한 반응을 보여주었다. 패널 e 및 f의 화살표: 자극 아티팩트. ONL: 외부 핵층; OPL: 외부 망상층; INL: 내부 핵층; IPL: 내부 망상층; GCL: 신경절 세포 층. 스케일바 = 패널 a, b, 및 c에서 30 ㎛, = 패널 d에서 200 ㎛, 및 = 패널 e에서 10 ㎛.
도 2. Lgr5 + 아마크린 사이뉴런을 생체내에서 RGC로 재프로그래밍한다. a, 생체내 뉴런 재프로그래밍의 전략. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스는 먼저 타목시펜 (TM)이 5회 (-11일 (D-11) 내지 -7일 (D-7)) 공급되었고 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런이 Rosa26-tdTomato 리포터로 표지되어 정체 추적을 보조하였다. 1주 이후에, 마우스는 Cre-의존적 전사 인자를 발현하는 AAV가 D1에 유리체내 주사되었고, 이후에 D3 내지 D7에 TM 공급이 후속되어서 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런에서 특이적으로 AAV-전달된 유전자를 활성화시켰다. 마우스는 바이러스 주사 이후 6주에 분석을 위해 희생되었다. b, Cre-의존적 방향-반전 오픈 리딩 프레임 (DIO) 시스템을 사용한 AAV 발현 벡터의 다이아그램. c, 단일 및 다양한 조합의 전사 인자의 재프로그래밍 효율. 표시된 데이터는 시신경의 tdTomato+ 축삭의 수이다 (각 그룹의 4마리로부터 n = 8). tdTomato+ 축삭은 AAV-DIO-EGFP가 주사된 마우스의 시신경에서 검출되지 않았다. (D-F) 망막 신경절 세포 층에 집중된, 실험 마우스로부터의 평면-장착된 망막 샘플의 이미지. e, 패널 D의 영역의 고-배율 사진으로서, 화살표는 재생된 RGC의 tdTomato+ 축삭을 표시한다. f, 단일 재생된 RGC의 하이라이트. g-i, RPBMS에 특이적인 항체로 재생된 RGC의 면역조직학적 염색 (g), Brn3A (h) 및 CART (i). **P < 0.001; NS, 유의하지 않음. 패널 c에서의 요약: B = Brn3B, S4 = Sox4, BS4 = Brn3B+Sox4, ABS4 = Atoh7+Brn3B+Sox4, ABS4S11Is = Atoh7+Brn3B+Sox4+Sox11+Isl1. 스케일바 = 패널 d에서 200 ㎛, = 패널 e에서 150 ㎛, = 패널 f에서 50 ㎛, 및 = 패널 g, h 및 i에서 40 ㎛.
도 3. 재생된 RGC는 축삭을 뇌로 돌출시킨다. a, 시신경 내에서 재생된 RGC의 축삭의 공초점 이미지. b-f, 배측 및 등측 슬상 핵 (dLGN 및 vLGN, 각각 패널 b 및 c), 올리브형 개막전 핵 (OPN, 패널 d), 및 상구체 (SC, 패널 e 및 f)에서 tdTomato+ 축삭 말단을 보여주는, 뇌 시각 영역에서의 재생된 RGC 축삭의 돌출. 패널 f 의 화살표는 SC 영역 중 재생된 RGC 축삭 말단 상의 부톤-유사 구조를 강조한다. g-i, SC 뇌 절편의 PSD-95 염색. tdTomato+ 정맥류는 PSD-95 염색부와 가까이 병치되지만 중복되지 않는다. 3마리 상이한 동물로부터의 뇌 샘플은 동일한 염색 패턴을 갖는다. 스케일바 = 패널 a 내지 e에서 200 ㎛ , = 패널 f에서 40 ㎛, 및 = 패널 g 및 h에서 10 ㎛.
도 4. Prokr2 + 전위된 아마크린 사이뉴런을 RGC로 재프로그래밍한다. a, Prokr2 CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 평면-장착된 망막 샘플의 공초점 이미지. tdTomato+ 전위된 아마크린 세포는 붉은색으로 표시된다. Prokr2-tdTomao+ 전위된 아마크린 세포는 평면-장착된 망막 샘플 상에 임의 축삭을 갖지 않는다. b, 패널 a의 영역의 하이라이트. c, 전사 인자 및 EGFP를 공-발현하는 AAV가 주사된 Prokr2CreERT2 마우스로부터의 평면-장착 망막 샘플의 공초점 이미지. 재생된 RGC는 축삭을 시신경 원판으로 확장시킨다. d, 패널 c의 영역의 하이라이트. e, 시신경 내 재생된 RGC의 축삭. f-k, dLGN 및 vLGN (f), OPN (g), 및 SC 영역의 상부층 (패널 h 및 i) 및 하부층 (패널 j 및 k)을 포함한, 다양한 뇌 레티노수용체 영역으로 재생된 RGC 축삭의 돌출. 패널 i 및 k 의 이미지는 고-배율 사진이다. 스케일바 = 패널 a 및 c에서 1000 ㎛, = 패널 e 내지 g, 및 패널 j에서 200 ㎛, = 패널 h에서 100 ㎛, 및 = 패널 i 및 k에서 40 ㎛.
도 5. 재생된 RGC는 시각 정보를 뇌에 전달하고 시냅스후 뉴런과 기능적 연결을 확립한다. a, 상이한 방향의 표류 격자에 반응한 3개 예의 축삭 말단의 칼슘 신호의 흔적. 시안색 패치는 자극 존재 기간을 표시하고, 하단의 값은 자극 방향을 표시한다. 이 패널에 표시된 3개 말단은 강력한 "켜짐" 반응을 갖는다는 것을 주목한다. b, 여기서 보여주는 말단은 강력한 "꺼짐" 반응을 갖는 것을 제외하고 패널 A와 동일한 그래프이다. c, d, 배향 선택성 (c) 및 방향 선택성 (d)을 갖는 3개 축삭 말단의 칼슘 신호의 흔적. e, SC 뉴런에서 빛-유발된 시냅스후 AMPA 수용체 반응의 대표적인 EPSC. 화살표는 다수-시냅스전 입력의 시냅스후 반응을 표시한다. f, SC 뉴런에서 빛-유발된 시냅스후 NMDA 수용체 반응의 대표적인 EPSC. g, SC 뉴런에서 빛-유발된 시냅스후 활동 전위의 예. h, i, 빛-유발된 AMPA 수용체 반응의 EPSC 진폭 (h) 및 피크 개수 (i) (7마리 동물로부터 n=11). j, 빛-유발된 NMDA 수용체 반응의 EPSC 진폭의 요약 (3마리 동물로부터 n=3). 데이터는 평균 ± sem이다.
도 6. 녹내장의 마우스 모델에서 기능성 RGC를 재생한다. a-d. 망막 샘플의 공초점 이미지. a, 정상 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스의 망막. b, 7일 전 안내압 상승 (IPI)을 통해 손상된 마우스의 망막. c, 7일 전 IPI에 의해 손상되고 매일 리파수딜 처치를 받은 마우스의 망막. d, IPI로 손상되었지만 리파수딜 처치 및 RGC 운명-특정 전사 인자 발현 AAV (AAV-DIO-TF)의 주사를 받은 마우스의 망막. 마우스는 AAV 주사 이후 6주에 희생되었다. e, f, AAV-DIO-EGFP (e) 및 AAV-DIO-TF (f)를 받은 눈으로부터의 시신경의 공초점 이미지. g-k, 왼쪽 눈에 AAV-DIO-EGFP 및 오른쪽 눈에 AAV-DIO-TF의 주사를 받은 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 뇌 절편의 공초점 이미지. 재생된 RGC 축삭의 대부분은 뇌의 대측성 (좌) 측면으로 돌출되었고, 소량이 동측성 (우) 측면으로 돌출되었다. 표시된 뇌 시각 영역은 시신경 교차 직후의 시신경로 (g), 시신경로 (h), dLGN, vLGN 및 개막전 영역으로의 돌출부 (i), dLGN (j), 및 SC (k) 이다. l-n, AMPA 수용체-매개된 EPSC (l), NMDA 수용체-매개 EPSC (n), 및 활동 전위 (n)를 포함한, SC 뉴런의 빛-유발된 시냅스후 반응. 스케일바 = 패널 d, j 및 k에서 100 ㎛, = 패널 e 및 f에서 200 ㎛, = 패널 g에서 400 ㎛, 및 = 패널 h 및 i에서 600 ㎛.
도 7. Lgr5 + 아마크린 사이뉴런의 형상 및 신경절 세포 층으로 그들 이동. a-c, Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 tdTomato 리포터로 희소 표지된 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런의 공초점 이미지. tdTomato 리포터로 Lgr5+ 아마크린 세포의 희소 표지화는 타목시펜을 오직 1회 마우스에게 공급하여 획득되었다. 이미지는 Lgr5+ 아마크린 세포가 국재화된 내부 핵층에 집중된, 평면-장착 망막 샘플로부터 얻었다. d, Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터 망막 단편의 공초점 이미지. 화살표는 tdTomato 리포터로 표지된 Lgr5+ 아마크린 세포를 강조한다. 이 세포의 수지상 돌기는 신경절 세포 층에 도달한다. e-g, 신경절 세포 층에 집중된, Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 마우스로부터의 평면-장착 망막 샘플의 공초점 이미지. 화살표는 신경절 세포 층에서 Lgr5+ 아마크린 세포의 존재를 강조한다. g, 20개월령 마우스의 신경절 세포 층에서 Lgr5+ 아마크린 세포의 그룹. h, 망막 당 신경절 세포 층에서 Lgr5+ 아마크린 세포의 개수. 신경절 세포 층에서 Lgr5+ 아마크린 세포의 연령-의존적 증가가 존재하여서, 이들 세포가 내부 핵층으로부터 신경절 세포 층으로 이동할 수 있음을 시사한다. 스케일바 = 패널 a 내지 c에서 20 ㎛, = 패널 d에서 30 ㎛, 및 = 패널 e 내지 f에서 50 ㎛.
도 8. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 뉴런 정체 재프로그래밍. a, b, AAV-DIO-EGFP 주사된 마우스로부터의 평면-장착된 망막 샘플 (a) 및 시신경 (b)의 대표적인 이미지. tdTomato+ 축삭이 이들 마우스에서 검출되지 않았다. c-e, 고용량의 AAV-DIO-EGFP (7x1012 pfu, 2 ㎕)가 주사된 마우스로부터의 시신경의 대표적인 이미지. DNA 증폭 및 바이러스 벡터 생산 동안 AAV-DIO 플라스미드 자가-재조합 (플리핑된 벡터)에 기인하여, 소량 (1자릿수 내)의 본래 RGC 및 그들 축삭은 대량의 AAV 입자가 주사되었을 때, Cre-독립적 이식유전자 발현을 통해서 주사된 AAV-DIO-EGFP로 표지될 수 있었다. 그러나, 이들 EGFP+ 축삭은 tdTomato를 발현하지 않아서, 그들이 재생된 RGC로부터 유래되지 않는다는 것을 시사한다. f-h, Lgr5-EGFP 및 tdTomato 이중 양성 세포의 하이라이트가 내부 망상층 (IPL)에 존재하여서, Lgr5+ 아마크린 세포의 내부 핵층 (INL)으로부터 망막 신경절 층 (RGL)으로의 이동을 촉발한다는 것을 시사한다. i-l, 알파-RGC 마커 SMI-32를 발현하는 재생된 RGC의 공초점 이미지. m-r, AAV 전달된 유전자 발현의 특이성 및 효율을 조사하기 위해 AAV-DIO-tdTomato가 주사된 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 마우스 유리체내로부터의 망막 단편의 공초점 이미지. 5회 타목시펜 공급 이후로, AAV-전달된 tdTomato 유전자는 Lgr5+ 아마크린 세포를 특이적으로 표지화한다. p-r, 패널 m 내지 o의 동일 눈으로부터 찍은 더 높은 배율 이미지. s, 패널 m 내지 r의 EGFP+/tdTomato+ 세포의 통계학. 이러한 발현 시스템을 사용하여, 약 21.3% Lgr5+ 아마크린 세포는 AAV 전달된 tdTomato에 의해 표지될 수 있었다. t, AAV-DIO-Brn3B 및 AAV-DIO-Sox4가 유리체내 주사된 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 Brn3B 및 Sox4 발현 수준의 통계학. Brn3B 및 Sox4 발현은 정량적 PCR을 통해서 측정되었고 AAV-DIO-EGFP가 유리체내 주사된 대조군 마우스에서 1로 정규화되었다. 스케일바 = 패널 a에서 150 ㎛, = 패널 b에서 200 ㎛, = 패널 c 내지 e에서 300 ㎛, = 패널 f 내지 l에서 40 ㎛, = 패널 o에서 400 ㎛, 및 = 패널 r에서 50 ㎛.
도 9. 재생된 RGC가 축삭을 별개 뇌 시각 영역으로 성장시키는데 소요된 시간. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스는 AAV-DIO-Brn3B 및 AAV-DIO-Sox4가 한쪽 눈에서 유리체내로 주사되었고, 이후에 타목시펜이 5회 공급되어 유전자 발현을 활성화시켰다. 마우스는 뇌 슬라이스 제조를 위해 상이한 시점에 희생되었고, tdTomato+ 축삭의 존재는 공초점 현미경으로 조사되었다. a, 바이러스 주사 이후 30일에 희생된 마우스로부터의 뇌 슬라이스의 공초점 이미지. 대측성 뇌 측면에서 tdTomato+ 축삭 (사진의 좌측)은 측면 슬상 핵을 통과하였다. tdTomato+ 축삭은 동일 뇌 슬라이드의 동측성 측면 상에서 검출되지 않았다. b, 패널 a와 동일한 마우스로부터의 상구체 (SC) 영역의 공초점 이미지. tdTomato+ 축삭은 이 시점에 SC에 도달하지 않았다. c, 바이러스 주사 이후 35일에 희생된 마우스로부터의 뇌 슬라이드의 공초점 이미지. 대측성 뇌 측면 (도면의 좌측)에서 SC의 앞쪽 및 LGN (측면 슬상 핵)의 뒷쪽의 영역이 강조되어 있다. tdTomato+ 축삭은 또한 동측성 뇌 측면에서 검출될 수 있었지만, 개수는 급격하게 낮았다. d, 재생된 RGC의 축삭 돌출의 시간 경과. 재생된 RGC 축삭이 OC (시신경 교차), LGN 및 SC에 도달하는데 소요된 시간은 재생된 RGC 축삭이 바이러스 주사 이후에 이들 위치에서 최초로 관찰되었을 때 시간을 계측하여 결정하였다. 재생된 RGC 축삭은 대략 18일에 OC에 도달하였고, 28일에 LGN, 및 35일에 SC에 도달한다 (각 그룹에서 n = 8).
도 10. Prokr2 녹-인 마우스 품종의 구축 및 Prokr2 + 전위된 아마크린 사이뉴런의 생체내에서 RGC로의 재프로그래밍. a, Prokr2 CreERT2 마우스 품종을 만들기 위한 표적화 전략의 다이아그램. CreERT2 코딩 영역은 Prokr2 유전자좌의 출발 코돈에 녹-인된다. 5' 팔부 및 CreERT2 영역을 표적화하는 서던 블롯팅 프로브의 위치가 표시되었다. b, 5' 팔부 프로브 (위) 및 CreERT2 프로브 (아래)를 사용한 서던 블롯팅 막의 이미지. 파운더 1, 2, 3 및 4는 올바른 게놈 표적화를 갖고, 추가 교배에 사용되었다. c-e, 항-RBPMS 항체를 사용한 Prokr2 CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 망막 단면의 면역-조직학적 염색. Prokr2-tdTomato+ 세포는 RGC 마커 RBPMS를 발현하지 않는다. f-h, Prokr2 CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스의 뇌 관상면 (f), 상구체 (g) 및 시신경 (h)의 공초점 이미지. Prokr2-tdTomato+ 세포는 뇌 및 시신경에 존재한다. i, j, AAV-DIO-EGFP가 유리체내 주사된 Prokr2 CreERT2 마우스의 이미지. DNA 증폭 및 바이러스 벡터 생산 동안 AAV-DIO 플라스미드 자가-재조합 덕분에, 플리핑된 AAV-DIO-EGFP 벡터는 매우 소수의 본래 망막 신경절 세포 (i) 및 그들 축삭 (j)을 표지한다. k, Prokr2 CreERT2 마우스에서 재프로그래밍 전략 및 AAV 발현 벡터의 다이아그램. 마우스는 AAV가 1일 (D1)에 유리체내 주사되었고, 이후에 타목시펜 (TM)이 공급되어서 D3 내지 D7에 Cre-의존적 AAV-DIO 시스템에 의해 전달된 유전자의 발현을 활성화시켰다. 마우스는 D42 또는 그 이후에 분석을 위해 희생되었다. l, 전사 인자 조합의 재프로그래밍 효율. 대조군 그룹에서, 플리핑된 AAV-DIO-EGFP 라벨은 매우 소수의 내생성 RGC를 표지한다. 스케일바 = 패널 d에서 40 ㎛, = 패널 f에서 800 ㎛, = 패널 g에서 200 ㎛, = 패널 h에서 100 ㎛, = 패널 i에서 1000 ㎛, 및 = 패널 j에서 100 ㎛.
도 11. RGC의 칼슘 이미지화 및 광유전학적 분석. a, 생체내 칼슘 이미지화 설정의 다이아그램. b, SC 영역 중 재생된 RGC 말단의 대표적인 이미지. c, 3마리 마우스에서 기록된 모든 반응성 말단의 배향 선택 지수 (selective index)(OSI)의 히스토그램 분포. d, 패널 c에 표시된 모든 말단 데이터에 대한 OSI의 누적 백분율 그래프. e, f, 그의 RGC가 ChR2로 표지화된 C57B6/J 마우스로부터의 SC 뉴런에서 빛-유발 시냅스후 AMPA 수용체 반응 (e) 및 시냅스후 활동 전위 (f)의 대표적인 EPSC. 스케일바 = 10 ㎛.
도 12. 본래 RGC 손상 후 생체내 재프로그래밍. Pvalb는 RGC의 일부 아형에서 발현되므로, Pvalb CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스가 안내압 증가 (IPI)-초래 손상 RGC 및 그들 축삭의 상태를 확립시키는데 사용된다. a, Pvalb CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 시신경의 공초점 이미지. Pvalb-tdTomato + RGC의 축삭은 온전하다. b, 안내압 증가 (IPI)-초래 손상 이후 7일에 Pvalb CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 시신경의 공초점 이미지. 모든 축삭이 IPI로 인해 손상되었다. c-e, Pvalb CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스로부터의 평면-장착 망막 샘플의 공초점 이미지. Pvalb-tdTomato는 미손상된 정상 마우스에서 RGC 및 그들 축삭을 표시한다 (c). 안내압 증가 (IPI)-초래 손상 이후 7일에, 마우스의 망막에서 Pvalb-tdTomato + RGC의 급격한 상실이 존재한다 (d). 리파수딜 처치는 Pvalb-tdTomato + RGC의 퇴화를 둔화시키지만, 생존된 RGC는 여전히 온전한 축삭을 갖지 않는다 (e). f, IPI에 의한 본래 RGC 손상 이후 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 생체내 뉴런 재프로그래밍의 다이아그램. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스는 먼저 타목시펜 (TM)이 5회 (-11일 (D-11) 내지 -7일 (D-7)) 공급되어 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런이 Rosa26-tdTomato 리포터로 표지화되어서 정체 추적을 보조하였다. 1주 후에, 마우스의 RGC 및 그들 축삭은 D1에 안내압의 증가에 의해 손상되었다. 마우스는 D7에 Cre-의존적 전사 인자를 발현하는 AAV의 유리체내 주사를 받았고, 타목시펜 (TM)이 D9 내지 D13에 공급되어서 유전자 발현이 활성화되었다. 마우스는 분석을 위해서 D49 또는 그 이후에 희생되었다. Lgr5+ 아마크린 사이뉴런 및 다른 망막 뉴런을 보호하기 위해서, 마우스는 리파수딜 점안액이 D1 내지 D49에 매일 처치되었다. 스케일바 = 100 ㎛.
도 13. 평면-장착 망막 샘플 및 시신경의 공초점 이미지. a) PV-CreERT2; Rosa26-tdTomato 마우스의 평면-장착 망막에서 파발부민 (PV) 양성 RGC 및 그들 축삭. b) 안내압 증가 이후에, 많은 RGC가 사멸되고 그들 축삭이 퇴화된다. c) 생존된 RGC에서 Atoh7+Brn3B+Sox4 발현은 이들 세포가 축삭을 재성장/재생시키게 한다. d) PV-CreERT2; Rosa26-tdTomato 마우스의 시신경에서 PV-양성 RGC 축삭. e) 안내압 증가-초래 RGC 손상 이후에, RGC의 축삭은 시신경 내에서 퇴화된다. F) 생존된 RGC에서 Atoh7+Brn3B+Sox4의 과발현 이후에 시신경 내에서 재생된 RGC 축삭.
도 14. 뇌 시각 영역으로 재생된 RGC 축삭의 돌출. a) 배측 및 등측 슬상 핵에서 재생된 RGC 축삭. b) 상구체 핵에서 재생된 RGC 축삭.
정의
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 하기 용어들은 달리 명시하지 않으면 하기 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 실시에서 사용될 수 있다. 하기 정의는 본 명세서에서 빈번하게 사용되는 일정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공되고 본 개시의 범주를 제한하려는 의미가 아니다. 본 명세서에서 참조되는 모든 참조는 그들 전체로 참조하여 편입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 구성요소를 포함하지만, 나머지를 배제하지는 않는다는 것을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 조합에 대한 임의의 본질적으로 중요한 다른 구성요소의 배제를 의미할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같은 구성요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 본 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 구성요소를 배제하지 않는다. "이루어지는"은 열거되는 미량을 초과하는 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미하게 된다. 각각의 이들 전환 용어에 의해 정의된 구현예는 본 발명의 범주 내에 있다.
용어 "약"은 소정 값 또는 범위의 ±10%, ±5% 또는 ±1% 이내를 의미한다. 일 구현예에서, 약은 소정 값 또는 범위의 ±10%를 의미한다. 다른 구현예에서, 약은 소정 값 또는 범위의 ±5%를 의미한다. 다른 구현예에서, 약은 소정 값 또는 범위의 ±1%를 의미한다.
"발현 제어 서열"은 작동적으로 연결되는 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 발현 제어 서열이 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절할 때 뉴클레오티드 서열에 "작동적으로 연결된다". 따라서, 발현 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 전사 종결자, 단백질-코딩 유전자 앞의 출발 코돈, 인트론의 스플라이싱 신호, 및 중지 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "발현 제어 서열"은 최소로, 그의 존재가 발현에 영향을 미치도록 디자인된 서열을 포함하고자 하고, 또한 추가적인 유리한 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열은 발현 제어 서열이다. 이 용어는 또한 프레임의 안 및 밖에서 바람직하지 않은, 잠재적인 개시 코돈이 서열로부터 제거되도록 하는 핵산 서열의 디자인을 포함한다. 또한 이것은 바람직하지 않은 잠재적인 스플라이스 부위가 제거되도록 하는 핵산 서열의 디자인을 포함할 수 있다. 폴리A 꼬리부의 첨가를 유도하는 서열 또는 폴리아데닐화 서열 (pA), 즉, 폴리A 서열이라고 할 수 있는, mRNA의 3'-말단에서의 아데닌 잔기의 스트링을 포함한다. 또한 mRNA 안정성을 증강시키도록 디자인될 수 있다. 곤충 세포에서 사용에 적합한, 전사 및 번역 안정성에 영향을 미치는 발현 제어 서열, 예를 들어, 프로모터를 비롯하여, 번역에 영향을 미치는 서열, 예를 들어, 코작 (Kozak) 서열은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 발현 제어 서열은 더 낮은 발현 수준 또는 더 높은 발현 수준이 획득되도록 작동적으로 연결되는 뉴클레오티드 서열을 조절하게 하는 성질일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하고, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사의 방향에 대해서 상류에 위치하고, DNA-의존적 RNA 중합효소를 위한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 제한없이 전사 인자 결합 부위, 억제인자 및 활성인자 단백질 결합 부위를 포함한 임의의 다른 DNA 서열, 및 예를 들어, 어테뉴에이터 또는 인핸서뿐만 아니라, 사일렌서를 포함한, 프로모터로부터의 전사량을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하도록 작용하는 당업자에게 공지된 임의의 다른 뉴클레오티드의 서열의 존재에 의해서 구조적으로 확인되는, 핵산 단편을 의미한다. "항상성" 프로모터는 대부분의 생리적 및 발생 조건 하에서 대부분의 조직에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 예를 들어, 화학적 유도인자의 적용을 통해서, 생리적으로 또는 발생적으로 조절되는 프로모터이다. "조직 특이적" 프로모터는 조직 또는 세포의 특이적 유형에서만 활성이다.
"벡터"는 패신저 핵산 서열 (즉, DNA 또는 RNA)을 숙주 세포로 전달하는데 제공되는 핵산 분자 (전형적으로, DNA 또는 RNA)이다. 3개 일반 유형의 벡터는 플라스미드, 파지, 및 바이러스를 포함한다. 바람직하게, 벡터는 바이러스이다. 폴리뉴클레오티드가 작동적으로 연결될 수 있는 클로닝 부위 및 프로모터 둘 모두를 함유하는 벡터는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사시킬 수 있고, Stratagene (La Jolla, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.) 같은 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해서, 여분의, 잠재적인 부적절한 대안적 번역 개시 코돈, 또는 전사 또는 번역의 수준에서 발현을 방해할 수 있거나 또는 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거하기 위해서 클론의 5' 및/또는 3' 비번역 부분을 제거, 첨가 또는 변경시키는데 유용할 수 있다. 대안적으로, 공통 리보솜 결합 부위는 발현을 증강시키도록 출발 코돈의 5'에 바로 삽입될 수 있다.
"바이러스 벡터"는 하기 중 일부 또는 전부를 포함하는 벡터를 의미한다: 유전자 생성물을 코딩하는 바이러스 유전자, 제어 서열 및 바이러스 패키징 서열. "파보바이러스 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서, 숙주 세포에게로 전달하려는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합적으로 생산된 파보바이러스 또는 파보바이러스 입자로서 정의된다. 파보바이러스 벡터의 예는 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함한다. 여기서, 파보바이러스 벡터 구성체는 바이러스 게놈 또는 이의 일부분, 및 이식유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "투여"는 작용제를 환자에게 도입하는 것을 의미한다. 치료 의사 등이 결정할 수 있는, 유효량이 투여될 수 있다. 화합물 또는 정제와 연관되어 사용될 때 관련 용어 및 어구 "투여하는" 및 "∼의 투여" (및 문법적 균등어)는 의료 전문가가 환자에게 투여할 수 있거나 또는 환자가 자가-투여할 수 있는, 직접 투여를 모두 의미한다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 병태를 앓는 환자에게 본 명세서에 기술된 약학 조성물을 통해서 국소적으로 투여될 때, 의도되는 치료적 효과, 예를 들어, 환자에서 병태의 하나 이상의 증상의 경감, 완화, 일시적 완화 또는 제거를 가질 수 있는, 약물 또는 작용제의 양을 의미한다. 전체 치료적 효과는 반드시 즉시 일어나지 않고 치료적 유효량이 일정 시간 기간 동안 연속적으로 전달된 이후에만 발생될 수 있다. 지연 방출 또는 제어 방출 제제의 경우에, "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 질환 부위에 약물의 유효량을 일정하게 제공하는, 확인할 수 있고 제어가능한 방출 속도로 질환 부위에 전달 비히클로부터 서서히 방출되는, 일정 기간 동안 유효한 총량을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 소정 시간 기간에, 예를 들어, 1일 당, 질환 부위로 방출되는 양을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 일반적으로 인간 투여를 위해 안전하고 유독하지 않은 것을 의미한다.
"치료", "치료하는", 및 "치료하다"는 질환, 장애, 또는 병태 및/또는 이의 증상의 유해하거나 또는 임의의 다른 바람직하지 않은 효과를 감소시키거나 또는 완화시키기 위해서 작용제를 사용해 질환, 장애, 또는 병태에 대해 작용하는 것으로 정의된다.
다른 망막 신경 세포로부터 망막 신경절 세포 (RGC)의 재생
망막 신경절 세포 (RGC) 및 그들 축삭의 퇴화는 녹내장 및 다양한 시신경병증에서 시력 상실의 원인이 된다. 이들 질환이 발병된 환자에서 상실된 시력을 회복시키는데 이용가능한 치료가 현재 없다. RGC의 재생 및 뇌로 망막의 재연결은 이상적인 치료 전략을 의미하지만, 포유동물은 성인기에 새로운 뉴런을 생산하게 하는 망막 줄기/전구체 세포의 저장소를 갖지 않는다.
수반된 실험 예에서, RGC는 망막 뉴런의 직접 계통 재프로그래밍을 통해서 재생될 수 있다는 것을 입증한다. 아마크린 및 전위된 아마크린 사이뉴런은 RGC로 성공적으로 전환되어서, 축삭을 뇌 레티노수용 영역으로 돌출시켰다. 그들은 본래 RGC가 상승된 안내압으로 인해 손상된 녹내장의 동물 모델 및 정상 동물 둘 모두에서, 시각 자극에 반응하여 시각 정보를 뇌에 전달하였고, 전시 신호를 시냅스후 뉴런으로 전달할 수 있었다.
그러므로, 본 개시의 일 구현예에 따라서, 시각 신호에 반응성이 되도록 비-RGC 뉴런 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 재프로그래밍은 비-RGC 신경 세포에서 하나 이상의 전사 인자의 활성화 (또는 생물학적 활성의 증가)를 수반한다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 전신경 전사 인자이다.
전사 인자의 예에는 POU-도메인 전사 인자, 예컨대 Brn3B이다. Brn3B (POU 클래스 4 호메오박스 2, 또는 POU4F2, BRN3.2, 또는 Brn-3b)는 POU-도메인 전사 인자 패밀리의 구성원이고 망막에서 시각계 뉴런을 유지시키는데 관여한다. 인간의 대표적인 Brn3B 유전자는 NP_004566.2의 단백질 서열 및 NM_004575.3의 mRNA 서열을 갖는다. 마우스의 대표적인 Brn3B 유전자는 NP_620394.2의 단백질 서열 및 NM_138944.3의 mRNA 서열을 갖는다.
다른 예의 전사 인자는 SOX (SRY-관련 HMG-박스) 전사 인자, 예컨대 Sox4이다. Sox4 (SRY-박스 전사 인자 4, 또는 CSS10 또는 EVI16)는 SOX (SRY-관련 HMG-박스) 전사 인자 패밀리의 구성원이고 배아 발생의 조절 및 세포 운명의 결정에 관여한다. 인간의 대표적인 Sox4 유전자는 NP_003098.1의 단백질 서열 및 NM_003107.3의 mRNA 서열을 갖는다. 마우스의 대표적인 Sox4 유전자는 NP_033264.2의 단백질 서열 및 NM_009238.3의 mRNA 서열을 갖는다.
SOX (SRY-관련 HMG-박스) 전사 인자 패밀리의 다른 예의 구성원은 Sox11이다. Sox11 (SRY-박스 전사 인자 11, 또는 CSS9 또는 MRD27)은 SOX (SRY-관련 HMG-박스) 전사 인자 패밀리의 구성원이고 배아 발생의 조절 및 세포 운명의 결정에 관여한다. 인간의 대표적인 Sox11 유전자는 NP_003099.1의 단백질 서열 및 NM_003108.4의 mRNA 서열을 갖는다. 마우스의 대표적인 Sox11 유전자는 NP_033260.4의 단백질 서열 및 NM_009234.6의 mRNA 서열을 갖는다.
다른 예의 전사 인자는 기본 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자, 예컨대 Atoh7이다. Atoh7 (아토날 bHLH 전사 인자 7, 또는 Math5, NCRNA, RNANC, PHPVAR, 또는 bHLHa13)은 기본 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자 패밀리의 구성원이고 광수용체 발생을 제어한다. 이러한 유전자는 망막 신경절 세포 및 시신경 형성에서 중심 역할을 한다. 인간의 대표적인 Atoh7 유전자는 NP_660161.1의 단백질 서열 및 NM_145178.4의 mRNA 서열을 갖는다. 마우스의 대표적인 Atoh7 유전자는 NP_058560.1 또는 NP_001351577.1의 단백질 서열 및 NM_016864.3 또는 NM_001364648.2의 mRNA 서열을 갖는다.
다른 예의 전사 인자는 LIM/호메오도메인 전사 인자, 예컨대 Ils1이다. Ils1 (ISL LIM 호메오박스 1, 또는 Isl-1 또는 ISLET1)은 전사 인자의 LIM/호메오도메인 패밀리의 구성원이고 특히, 인슐린 유전자의 인핸서 영역에 결합하여, 인슐린 유전자 발현의 조절에서 중요한 역할을 할 수 있다. Ils1은 췌장 세포 계통의 발생에 중심이 되고, 운동 뉴런 생성에 필수적이다. 인간의 대표적인 Ils1 유전자는 NP_002193.2의 단백질 서열 및 NM_002202.3의 mRNA 서열을 갖는다. 마우스의 대표적인 Ils1 유전자는 NP_067434.3의 단백질 서열 및 NM_021459.4의 mRNA 서열을 갖는다.
이들 예의 전사 인자의 단백질 및 핵산 서열의 예가 하기 표 1에 제공된다.
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유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 증가된 생물학적 활성은 단백질의 증가된 발현 또는 단백질의 증가된 기능, 또는 둘 모두일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 하나는 세포에서 활성화된다. 일 구현예에서, Brn3B의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Sox4의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Atoh7의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Sox11의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Ils1의 생물학적 활성이 증가된다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 2종의 생물학적 활성이 증가된다. 둘은 Brn3B 및 Sox4, Brn3B 및 Atoh7, Brn3B 및 Sox11, Brn3B 및 Ils1, Sox4 및 Atoh7, Sox4 및 Sox11, Sox4 및 Ils1, Atoh7 및 Sox11, Atoh7 및 Ils1, 또는 Sox11 및 Ils1일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 3종의 생물학적 활성이 증가된다. 3종은 제한없이, Brn3B, Sox4 및 Atoh7, Brn3B, Sox4 및 Sox11, 또는 Brn3B, Sox4 및 Ils1일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 4종의 생물학적 활성이 증가된다. 일부 구현예에서, 5종의 모든 전사 인자의 생물학적 활성이 증가된다.
내생성 전사 인자의 활성화
일례에서, 상응하는 내생성 유전자의 발현이 활성화되거나 또는 증강된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터 (CMV라고 함)는 높은 전사 활성을 갖는 천연 포유동물 프로모터이다. CMV 인핸서는 다양한 포유동물 세포에서 강력한 인핸서이고, 광범위한 포유동물 세포에서 다양한 유전자의 이소성 발현을 구동시키고, 유전자이식 동물의 광범위 조직에서 외생성 유전자의 이소성 발현을 구동시키기 위해 널리 사용되어 왔다. 일부 예에서, CMV 인핸서의 전사 활성은 천연 NF-κB 결합 부위를 높은 결합 친화성을 갖는 인공적으로 선택된 NF-κB 결합 서열로 변화시켜서 더욱 개선시킬 수 있다 (Wang et al., Protein Expression and Purification 142:16-24, 2018). 미국 특허 제10329595호는 또한 2종의 개선된 CMV 프로모터 (SEQ ID NO:26 및 27)의 생성을 보고한다. 다른 유용한 유전자 프로모터 및 인핸서가 또한 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 프로모터 또는 인핸서는 뉴런에서 일정하게 발현되는 유전자의 발현을 조절하는 것이다. 뉴런, 예컨대 아마크린 세포에서 발현되는 유전자의 예에는 Pax6, Tcfap2b, Gad1, GlyT1, RBPMS, 및 Prox1이 포함된다. 유전자의 다른 예는 시냅신 1이다. 프로모터/인핸서의 예는 표 2에 제공된다.
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유전자 발현 프로모터 또는 인핸서는 통상의 녹-인 기술, 또는 CRISRP 방법을 통해서 표적 유전자에 도입될 수 있다.
또한 CRISPR을 기반으로 유전자 활성화를 위한 많은 기술들이 존재한다. 일례에서, 불활성 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 적절한 전사 이펙터 도메인에 융합시킨다. 통상적으로 사용되는 전사 활성인자 도메인은 VP64, NF-κB의 p65 도메인, 엡스테인 바 바이러스 R 트랜스활성인자 (Rta), 및 열충격 인자 1 (HSF1)의 활성인자 도메인을 포함한다. 내생성 상황에서, 다수의 전사 인자 및 보조인자가 유전자 전사를 자극하기 위해 동시에 작용한다. 실제로, 프로모터로 다수의 고유한 전사 활성인자를 동원하는 CRISPR 도구는 단일 전사 활성인자 도메인 또는 동일 이펙터의 중복 카피를 보유하는 것들보다 훨씬 우수하다. 동일 프로모터 상의 다수 부위의 표적화가 또한 CRISPR에 의해 유전자 활성화를 증가시킨다. 가장 효과적인 CRISPR 이펙터 중 하나는 CRISPR 상승적 활성화 매개인자 (Synergistic Activation Mediator) (SAM) 복합체로서, 3종의 고유한 전사 활성인자 도메인을 표적화된 유전자 프로모터에 동원시킨다. 이러한 시스템에서, 한 전사 활성인자 VP64 (VP16의 다량체 형태)는 dCas9에 직접 융합된다.
다른 예에서, dCas9-p300 CRISPR 유전자 활성인자 시스템 (Signa Aldrich, Hilton, Isaac B., et al. Nature Biotechnology (2015))은 인간 E1A-연관 단백질 p300의 촉매적 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 코어 도메인에 dCas9의 융합을 기반으로 한다. 이러한 접근법은 전사 출발 부위 (TSS)에 대해 근위 및 원위 위치 둘 모두에서 유전자를 활성화시킨다.
외생성 전사 인자의 도입
전사 인자의 생물학적 활성 (또는 발현)을 증가시키는 보다 통상적인 기술은 전사 인자를 코딩하는 외생성 서열, 또는 전사 인자 단백질을 도입시키는 것이다. 단백질은 비히클, 예컨대 리포솜에 단백질을 밀봉시켜서 세포에 도입될 수 있다. 전사 인자의 단백질 서열의 예는 표 1에 제공된다.
코딩 서열, 예컨대 cDNA 또는 mRNA가 또한 표적 세포에 도입될 수 있다. 전사 인자의 코딩 서열의 예가 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, 이들 전사 인자 중 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 핵산 구성체가 제조된다. 코딩 서열은 적합한 프로모터 또는 인핸서에 기능적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 또는 인핸서는 표적 세포, 예컨대 망막 사이뉴런에 특이적이다. 프로모터의 예는 표 2에 제공된다.
구성체는 플라스미드, 또는 바람직하게 바이러스 벡터일 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 및 AAV 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 "재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터" (또는 "rAAV 벡터")는 적어도 하나의 파보바이러스 또는 AAV 반전 말단 반복 서열 (ITR)이 측접되는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 서열, 관심 유전자 생산물, 관심 유전자 또는 "이식유전자"를 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 rAAV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자 생산물 (즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 곤충 숙주 세포에 존재할 때 복제되어 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 핵산 구성체 (예를 들어, 염색체 또는 다른 벡터 예컨대 클로닝 또는 형질감염에 사용되는 플라스미드 또는 배큘로바이러스)에 통합되면, rAAV 벡터는 전형적으로 AAV 패키징 기능 및 필수 헬퍼 기능의 존재 하에서 복제 및 캡시드화를 통해서 "구제"될 수 있는 "프로-벡터"라고 한다. 바람직하게, 관심 유전자 생산물은 양쪽 측면 상에 AAV ITR이 측접된다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및/또는 AAV12로부터의 ITR을 포함하여, 임의의 AAV ITR이 본 발명의 구성체에 사용될 수 있다.
본 기술에서 사용을 위한 AAV 유전자 요법 벡터는 포유동물 세포 또는 곤충 세포에서 생산될 수 있다. 양쪽 기술이 당분야에서 설명되어 있다. 예를 들어, Grimm 등 (2003 Molecular Therapy 7(6):839-850)은 293T 세포로 오직 2개 플라스미드의 형질감염을 기반으로 하는, 헬퍼 바이러스 부재에서 광학적으로 제어가능한 방식으로 AAV 벡터를 생산하기 위한 전략을 개시한다. 그들은 AAV2 ITR 및 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 하이브리드 AAV 벡터의 생산 방법을 개시한다. 추가 정보는 또한 [Blits et al. (2010) (Journal of Neuroscience methods 185(2):257-263)]에서 확인할 수 있다. 용어 "하이브리드" 및 "위형"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 Rep 단백질, ITR 및/또는 캡시드 단백질이 상이한 혈청형의 것인 벡터를 표시하는데 사용된다. 예를 들어, ITR 및 Rep 단백질은 AAV2의 것이고 캡시드 단백질은 AAV5의 것이다. 용어 "키메라"는 단일 유전자, 예컨대, 예를 들어, 캡시드가 상이한 혈청형으로부터 유래되는 적어도 2개 서열로 구성된 것을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
AAV는 예를 들어, 하기 방법에 따라서 포유동물 세포에서 생산될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 벡터 게놈은 AAV 혈청형 2로부터 유래되는 2개의 반전 말단 반복부 (ITR)가 측접하는 이식유전자 발현 카세트를 함유한다. 바이러스 벡터 게놈의 총 길이는 효율적인 패키징 효율을 유지하기 위해서, 4.7 kB의 야생형 게놈 크기를 초과하지 않을 것이다. 단일 캡시드는 1:1:10의 비율로, VP1 (62 kDa), VP2 (73 kDa), 또는 VP3 (87 kDa)의 60 바이러스 단백질로 구성된다. AAV 벡터의 제조 과정은 롤러 병 (850 ㎠ 표면적)에서 인간 배아 신장 생산 세포 (HEK293)로 2개 플라스미드의 Ca(PO4)2 형질감염에 이어서 여과 및 크로마토그래피 기술을 통해 캡시드화된 벡터 게놈의 정제를 기반으로 한다. 제1 플라스미드는 바이러스 벡터 플라스미드이고 AAV2 ITR이 측접된 발현 구성체를 함유한다. 제2 플라스미드는 패키징 플라스미드이고 바람직한 혈청형의 AAV rep 2형 및 cap 5형 유전자 및 아데노바이러스 초기 헬퍼 유전자 E2A, VA, E4 (pDP5)를 코딩한다. 생산 세포주의 게놈은 헬퍼 기능을 제공하기 위한 아데노바이러스 E1을 포함한다. 10% 태아 소 혈청 (FCS)을 함유하는 Iscove의 변형 둘베코 배지 (IMDM) 중 2개 플라스미드로 공-형질감염 이후에, 세포는 벡터 생산이 일어나도록 허용하기 위해서 혈청-무함유 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 3일 동안 인큐베이션된다. 롤러 병에서 벡터 생산은 평균 세포 당 3Х103 벡터 게놈 또는 롤러 병 당 4Х1011 벡터 게놈의 산출량을 생산한다 (qPCR로 정량됨). 이후에, 세포 배양물은 Triton-X-100을 함유하는 완충액으로 용해시키고 세포 찌꺼기는 저속 원심분리를 통해 제거하였다. 청등화된 대부분은 AVB 세파로스 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고 400 kDa 중공 섬유 모듈 (예를 들어, Spectrum Laboratories)을 사용한 농축 및 정용여과를 통해서 PBS/5% 수크로스에 제제화된다.
곤충 세포에서 rAAV 벡터의 생산을 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 AAV ITR 및 Rep 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성의 게놈 서열을 갖는다. 이것은 본질적으로 물리적으로 기능적으로 동등한 비리온을 생산하기 위해 유전자 기능의 동일 세트를 제공한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 개요에 대해서, 예를 들어, 다음을 참조한다: GenBank 등록 번호 U89790; GenBank 등록 번호 J01901; GenBank 등록 번호 AF043303; GenBank 등록 번호 AF085716; Chiorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chiorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); 및 Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). rAAV 혈청형 1, 2, 3, 4 및 5는 본 발명의 상황에서 사용을 위한 AAV 뉴클레오티드 서열의 바람직한 공급원이다. 바람직하게, 본 발명의 상황에서 사용을 위한 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, 및/또는 AAV5로부터 유래된다. 보다 바람직하게, 본 발명에서 사용을 위한 ITR 서열은 AAV2 ITR이다. 유사하게, Rep (Rep78/68 및 Rep52/40) 코딩 서열은 바람직하게 AAV1, AAV2, 및/또는 AAV5, 보다 바람직하게 AAV2로부터 유래된다.
AAV Rep 및 ITR 서열은 대부분의 혈청형에서 특히 보존된다. 다양한 AAV 혈청형의 Rep78 단백질은 예를 들어, 89% 초과로 동일하고 AAV2, AAV3A, AAV3B, 및 AAV6 간에 게놈 수준에서 총 뉴클레오티드 서열 동일성은 대략 82%이다 (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). 게다가, 많은 AAV 혈청형의 Rep 서열 및 ITR은 포유동물 세포에서 AAV 입자의 생산 시 다른 혈청형으로부터의 상응하는 서열을 효율적으로 교차-보완 (즉, 기능적으로 치환)하는 것으로 알려져 있다. US2003148506은 AAV Rep 및 ITR 서열이 또한 곤충 세포에서 다른 AAV Rep 및 ITR 서열을 효율적으로 교차-보완한다고 보고한다.
AAV VP 단백질은 AAV 비리온의 세포 향성 (tropicity)을 결정하는 것으로 알려져 있다. VP 단백질-코딩 서열은 상이한 AAV 혈청형 중에서 Rep 단백질 및 유전자에 비해서 유의하게 덜 보존된다. 본 발명의 상황에서 사용을 위한 바이러스 단백질 (VP) VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 코딩하는 서열은 AAV5로부터 유래된다. 가장 바람직하게, VP1, VP2 및 VP3은 AAV5 VP1, VP2 및 VP3이다. 대안적으로, VP1, VP2 및 VP3은 야생형 AAV5 서열이다. 다른 혈청형의 상응하는 서열을 교차-보완하는 Rep 및 ITR 서열의 능력은 한 혈청형의 캡시드 단백질 및 다른 AAV 혈청형의 ITR 서열을 포함하는 위형 rAAV 입자의 생산을 허용한다. 이러한 위형 rAAV 입자는 본 발명의 일부이다.
AAV의 각 혈청형은 하나 이상의 특정 조직에 더 적합할 수 있다. 예를 들어, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 및 AAV8은 망막에 적합할 수 있고; AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7 및 AAV10은 뉴런에 적합할 수 있고; AAV2, AAV4, AAV8 및 AAV9는 뇌에 적합할 수 있고; AAV3, AAV5, AAV6, AAV9 및 AAV10은 폐에 적합할 수 있고; AAV1, AAV6, AAV9 및 AAV10은 심장에 적합할 수 있고; AAV2, AAV3 및 AAV6-10은 간에 적합할 수 있고; AAV5를 제외한 모든 혈청형은 근육 조직에 적합할 수 있고; AAV2 및 AAV10은 신장에 적합할 수 있고; AAV1, AAV7 및 AAV9는 췌장에 적합할 수 있다.
일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV2이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV3이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV4이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV5이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV7이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV8이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2의 항원성 영역의 변경 및 유리체내 투여 후 망막 세포를 효율적으로 형질도입시키는 능력을 일으키는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 표면 가변 영역 VIII (VR-VIII)에 10-아미노산 삽입을 갖는 조작된 캡시드인 AAV2.7m8 벡터이다 (Bennett et al., J Struct Biol, 2020 Feb 1;209(2):107433. doi: 10.1016/j.jsb.2019.107433. Epub 2019 Dec 16). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 8종의 상이한 야생형 천연 바이러스를 셔플링하여 조작된 AAV-DJ (2형/8형/9형 키메라)이다 (Katada Y, et al., 2019. PeerJ 7:e6317). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV7m8 벡터이다 (Ramachandran et al., Hum Gene Ther. 2017 Feb;28(2):154-167. doi: 10.1089/hum.2016.111. Epub 2016 Oct 17).
표적 세포
재프로그래밍은 망막의 비-RGC 세포, 예컨대 RGC가 아닌 임의의 망막 뉴런으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 망막 뉴런은 사이뉴런 세포이다. 사이뉴런 세포의 예에는 아마크린 세포, 양극 세포 및 수평 세포가 있다. 일부 구현예에서, 비-RGC 세포는 광수용체이다. 또한, 비-RGC 세포는, 일부 구현예에서, 뮐러 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 아마크린 세포는 Lgr5+ 아마크린 세포이다. 일부 구현예에서, 아마크린 세포는 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포이다. 일부 구현예에서, 아마크린 세포는 Lgr5+ 아마크린 세포이고, Brn3B 및 Sox4 둘 모두의 생물학적 활성 (발현)은 Lgr5+ 아마크린 세포에서 증가된다. 일부 구현예에서, 아마크린 세포는 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포이고, Brn3B 및 Sox4 둘 모두의 생물학적 활성 (발현)은 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포에서 증가된다. 일부 구현예에서, 아마크린 세포는 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포이고, Brn3B, Sox4 및 Atoh7의 생물학적 활성 (발현)은 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포에서 증가된다.
표적 세포는 시험관내 또는 생체내에서 재프로그래밍될 수 있다. 시험관내에서 재프로그래밍되어, 세포는 재생된 RGC로 전환되고, 이를 필요로 하는 대상체에게 이식될 수 있다. 생체내에서 재프로그래밍되면, 재생된 RGC는 손상되거나 또는 퇴화된 RGC를 대체할 수 있어서, 시각 장애 또는 실명을 치료할 수 있다.
망막 신경절 세포 (RGC)의 재활력화
다른 놀라운 발견에서, 본 발명은 본 개시의 전사 인자의 활성화가 손상된 RGC를 재활성화시키는데도 효과적이었음을 보여주었다 (실시예 2). 재활성화된 RGC는 시신경으로 돌출되고 뇌와 연결되는 기능성 축삭을 재성장시킬 수 있었다.
따라서, 본 개시의 다른 구현예는 망막 신경절 세포 (RGC)의 기능을 개선시키기 위한 방법을 제공한다. RGC는 퇴화되거나, 손상되거나, 노화되거나, 또는 심지어 개선된 기능이 바람직한 정상/건강한 RGC일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 RGC에서, Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계를 수반한다.
유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 증가된 생물학적 활성은 단백질의 증가된 발현 또는 단백질의 증가된 기능, 또는 둘 모두일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 하나가 세포에서 활성화된다. 일 구현예에서, Brn3B의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Sox4의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Atoh7의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Sox11의 생물학적 활성이 증가된다. 일 구현예에서, Ils1의 생물학적 활성이 증가된다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 2종의 생물학적 활성이 증가된다. 2종은 Brn3B 및 Sox4, Brn3B 및 Atoh7, Brn3B 및 Sox11, Brn3B 및 Ils1, Sox4 및 Atoh7, Sox4 및 Sox11, Sox4 및 Ils1, Atoh7 및 Sox11, Atoh7 및 Ils1, 또는 Sox11 및 Ils1일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 3종의 생물학적 활성이 증가된다. 3종은 제한없이, Brn3B, Sox4 및 Atoh7, Brn3B, Sox4 및 Sox11, 또는 Brn3B, Sox4 및 Ils1일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 4종의 생물학적 활성이 증가된다. 일부 구현예에서, 5종의 모든 전사 인자의 생물학적 활성이 증가된다.
내생성 전사 인자를 활성화시키고 외생성 전사 인자를 도입시키기 위한 방법은 상기에 보다 상세히 설명되어 있다. 방법은 시험관내 또는 생체내일 수 있다.
조성물 및 재생/재활력화된 세포
본 명세서에 개시된 기술의 구현을 용이하게 할 수 있는, 작용제, 시약, 및 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 또한, 본 기술에 의해 재생되거나 또는 재활성화되는 RGC 세포가 제공된다.
본 개시의 일 구현예는 세포의 바람직한 재프로그래밍을 위해 표적 세포로 도입될 수 있는 핵산 구성체를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 구성체는 본 명세서에 개시된 전사 인자 중 어느 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 전부를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 구성체는 Brn3B를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 구성체는 Sox4에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 구성체는 Atoh7에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 구성체는 Sox11에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 구성체는 Ils1에 대한 코딩 서열을 포함한다. 이들 전사 인자의 단백질 및 코딩 서열의 예는 표 1에 제공된다.
일 구현예에서, 핵산 구성체는 Brn3B 및 Sox4, Brn3B 및 Atoh7, Brn3B 및 Sox11, Brn3B 및 Ils1, Sox4 및 Ath7, Sox4 및 Sox11, Sox4 및 Ils1, Atoh7 및 Sox11, Atoh7 및 Ils1, 또는 Sox11 및 Ils1일 수 있는, 전사 인자 중 적어도 2종에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 구성체는 제한없이, Brn3B, Sox4 및 Atoh7, Brn3B, Sox4 및 Sox11, 또는 Brn3B, Sox4 및 Ils1일 수 있는, 전사 인자 중 적어도 3종에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 구성체는 전사 인자 중 적어도 4종에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 구성체는 5종의 모든 전사 인자에 대한 코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 구성체는 각 코딩 서열과 연관된 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 프로모터 또는 인핸서는 망막 사이뉴런 세포에서 활성이 있다. 비제한적인 예는 Pax6, Tcfap2b, Gad1, GlyT1, RBPMS, 및 Prox1의 프로모터, 또는 표 2에 제공된 것들이다. 특정 예에서, 프로모터는 시냅신 1 프로모터이다.
일부 예에서, 핵산 구성체는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터일 수 있는 발현 벡터를 포함한다. AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV2이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV3이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV4이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV5이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV7이다. 일 구현예에서, AAV는 혈청형 AAV8이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2의 항원성 영역의 변경 및 유리체내 투여 후 망막 세포를 효율적으로 형질도입시키는 능력을 일으키는, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 표면 가변 영역 VIII (VR-VIII)에 10-아미노산 삽입을 갖는 조작된 캡시드인 AAV2.7m8 벡터이다 (Bennett et al., J Struct Biol, 2020 Feb 1;209(2):107433. doi: 10.1016/j.jsb.2019.107433. Epub 2019 Dec 16). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 8종의 상이한 야생형 천연 바이러스를 셔플링하여 조작된 AAV-DJ (2형/8형/9형 키메라)이다 (Katada Y, et al., 2019. PeerJ 7:e6317). 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV7m8 벡터이다 (Ramachandran et al., Hum Gene Ther. 2017 Feb;28(2):154-167. doi: 10.1089/hum.2016.111. Epub 2016 Oct 17).
벡터가 형질감염된 세포, 및 본 기술에 의해 재프로그래밍 또는 재활력화된 세포가 또한 제공된다. 일 구현예에서, 시각 신호에 반응성인 포유동물 세포가 제공된다. 일 구현예에서, 세포는 망막 세포, 예컨대 망막 사이뉴런 세포, 또는 퇴화, 손상, 또는 노화된 RGC에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시켜서 제조된다. 망막 세포는, 다른 구현예에서, 뮐러 세포이다. 또 다른 구현예에서, 망막 세포는 광수용체이다. 일부 구현예에서, 재프로그래밍된 세포는 재생된 망막 신경절 세포 (RGC)이다. 일부 구현예에서, 재프로그래밍된 세포는 재활력화된 망막 신경절 세포 (RGC)이다.
일부 구현예에서, 재생되거나 또는 재활력화된 RGC는 축삭을 별개 피질하 뇌 영역으로 돌출시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재생되거나 또는 재활력화된 RGC는 망막-뇌 연결을 확립할 수 있다. 일부 구현예에서, 재생되거나 또는 재활력화된 RGC는 시각 자극에 반응하여 전기 신호를 뇌에 전달할 수 있다.
일부 구현예에서, 포유동물 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
치료 및 용도
RGC의 상실은 녹내장을 포함한, 시신경병증, 유전성 시신경병증, 및 독소, 영양적 결함 및 외상으로 초래된 장애로서 광범위하게 분류된 질환 그룹에서 실명의 주요한 원인이다. 그러므로, 본 기술은 시각 장애 또는 시력 상실 (실명)을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 또는 용도는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자, 예컨대 Brn3B, Sox4, Atoh7, Sox11, 및 Ils1의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 작용제를 환자에게 (예를 들어, 환자의 망막 또는 동공에) 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 2종의 생물학적 활성이 증가된다. 2종은 Brn3B 및 Sox4, Brn3B 및 Atoh7, Brn3B 및 Sox11, Brn3B 및 Ils1, Sox4 및 Atoh7, Sox4 및 Sox11, Sox4 및 Ils1, Atoh7 및 Sox11, Atoh7 및 Ils1, 또는 Sox11 및 Ils1일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 3종의 생물학적 활성이 증가된다. 3종은 제한없이, Brn3B, Sox4 및 Atoh7, Brn3B, Sox4 및 Sox11, 또는 Brn3B, Sox4 및 Ils1일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 인자 중 적어도 4종의 생물학적 활성이 증가된다. 일부 구현예에서, 5종의 모든 전사 인자의 생물학적 활성이 증가된다.
작용제의 예는 상기 기술되어 있는데, 예컨대 상응하는 내생성 전사 인자 (예를 들어, CRISPR 시스템) 중 하나 이상에 프로모터 또는 인핸서를 도입하는 핵산 구성체, 전사 인자 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 구성체, 및 전사 인자의 발현된 단백질이다.
투여는 제한없이, 국소 도포, 안과적 도포, 또는 유리체내 주사일 수 있다.
일부 구현예에서, 작용제는 AAV 벡터 또는 AAV 벡터를 포함하는 약학 조성물이다. 일부 구현예에서, 투여되는 AAV 벡터 또는 약학 조성물은 대상체의 체중 kg 당 1Х106 내지 1Х1020 게놈 카피 (gc)/kg, 또는 1Х107 내지 1Х1020, 또는 1Х108 내지 1Х1020, 또는 1Х108 내지 1Х1019, 또는 1Х109 내지 1Х1019, 또는 1Х109 내지 1Х1018, 또는 1Х1010 내지 1Х1018, 또는 1Х1011 내지 1Х1017, 또는 1Х1012 내지 1Х1017, 또는 1Х1013 내지 1Х1016, 2Х1013 내지 2Х1015, 8Х1013 내지 6Х1014 gc/kg일 수 있다. 용량 값은 경감시키려는 병태의 중증도에 따라서 가변적일 수 있다는 것을 유의해야 한다. 임의의 특정 대상체 경우에, 특별한 용량 용법은 개체 요구 및 조성물을 투여하거나 또는 조성물의 투여를 감독하는 전문가의 판단에 따라서 시간 경과에 따라 조정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 용량 범위는 단지 예시이고 의료 종사자가 선택할 수 있는 용량 범위를 제한하지 않는다.
일부 구현예에서, 치료는 본 명세서에 개시된 재프로그래밍된 망막 세포 (예를 들어, 재생된 RPC)를 환자의 눈에 이식하는 단계를 수반하고, 유지 세포는 시험관내에서 재프로그래밍된다.
실시예
실시예 1. 망막 사이뉴런 세포의 재프로그래밍
이 실시예는 다른 망막 뉴런이 망막 신경절 세포 재생을 위한 내생성 세포 공급원으로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다. RGC 분화에 중요한 전사 인자의 이소성 발현에 의해서, 아마크린 및 전위된 아마크린 사이뉴런은 RGC로 재프로그래밍될 수 있다. 재생된 RGC는 축삭을 별개 피질하 뇌 영역으로 돌출시킨다. 그들은, 본래 RGC가 증가된 안내압에 의해 손상된, 녹내장의 동물 모델 및 정상 상태 둘 모두에서, 시각 자극에 반응하여 전기 신호를 뇌로 전달할 수 있다.
방법
마우스 및 축산. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 녹-인 마우스 품종, Pvalb CreERT2 녹-인 마우스 품종, 및 Rosa26-tdTomato 리포터 마우스 품종은 Jackson laboratory에서 수득하였다. Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 마우스 및 Pvalb CreERT2 마우스를 Rosa26-tdTomato 마우스와 교배하여 각각 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스 및 Pvalb CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스를 생성시킨다.
Prokr2 CreERT2 마우스 품종은 CRISPR/Cas9 기술을 사용해 상동성 재조합을 통해 생성되었다. 간략하게, 시험관내 전사된 Cas9 mRNA, sgRNA 및 도너 벡터 플라스미드를 혼합하였고 C57BL/6J 마우스로부터의 수정란의 전핵에 주사하였다. 도너 벡터 플라스미드는 CreERT2의 코딩 영역에 이어서 폴리A 서열을 Prokr2 유전자좌의 ATG 출발 코돈에 삽입하도록 디자인되었다. 주사된 접합체는 3.5일까지 배반포기까지 배양되었고, 이후에 가임신 암컷의 자궁에 이식되었다. 올바른 게놈 표적화된 F0 마우스를 추가로 C57BL/6J 마우스와 교배하여 F1 Prokr2 CreERT2 마우스를 생성시켰다. Prokr2 CreERT2 마우스를 Rosa26-tdTomato 마우스와 교배하여 Prokr2 CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스를 생성시켰다. Prokr2 번역 출발 부위 주변 DNA 서열은 5'GCCCACCTGTAGCATCATCAAC AT GGGACCCCAGAACAGAAACACTAGCTTTG3' (SEQ ID NO:23)이다. 번역 출발 부위는 굵은체이고, 사용된 sgRNA의 표적 서열은 밑줄로 강조되어 있다. 도너 벡터 플라스미드는 In-Fusion 클로닝 방법으로 구축된, 5' 4kb-상동성 팔부, CreERT2 폴리A 카세트, 및 3' 4kb-상동성 팔부를 함유한다.
모든 마우스는 12시간 명/12시간 암 주기의 동물 시설에 수용하였다. 동물 실험은 8개월령 내지 12개월령의 숫컷 및 암컷 마우스에서 수행되었고, 모든 동물 실험 절차는 ShanghaiTech University의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
AAV 벡터의 구축 및 생산. 마우스 Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, Ils1 및 EGFP의 코딩 서열은 CAG-구동된 Cre-의존적 발현 벡터 (Addgene #22222)로 서브-클로닝되어서, 본래 Arch-GFP 서열을 대체하였다. 단일 AAV 벡터로부터의 EGFP 및 전사 인자를 공-발현하기 위해서, P2A 단편을 2개 코딩 서열 사이에 위치시켰다.
AAV 바이러스 입자 생산을 위해서, HEK293T 세포는 AAV 이식유전자 플라스미드, pAAV7m8 혈청형 플라스미드 및 pHelper 플라스미드로 PEI를 사용해 형질감염되었다. 세포는 48시간 내지 72시간 이후에 수집되었다. 바이러스 입자는 아이오딕사놀 밀도 구배 원심분리로 정제되어서,qPCR을 통해 적정되었다.
유리체내 AAV 주사. 마우스는 케타민 (80 mg/kg) 및 자일라진 (8 mg/kg)의 혼합물의 IP 주사를 통해 마취시켰고, 그들 동공은 페닐에페린 히드로클로라이드 점안액 (2.5%)의 국소 투여로 확장시켰다. 0.5% 프로파라카인 히드로클로라이드 점안액으로 간단 국소 마취 후에, 각막 천자를 하여 안내압을 감소시켰고, 1.5 ㎕의 AAV 바이러스 입자를 34-게이지 바늘을 사용해 유리체 공간에 주사하였다. AAV 혼합물의 주사를 위해서, 각 AAV는 혼합 전에 먼저 1x1012 입자/mL로 희석되었다.
녹내장 모델. 마우스 RGC는 임상에서 급성 폐쇄각 녹내장을 모방하는 안내압 증가 (IPI)-유도된 허혈/재관류 (I/R) 모델을 사용하여 손상되었다. 이전에 보고된 프로토콜을 약간 변형하여, 마우스의 안구 전방에 바늘로 고리를 만들어, 튜브를 통해서 상승 염수 (0.1% 헤파린 존재) 저장소에 연결시켰다. 눈 위 150 cm 까지 염수 저장소의 높이를 높혀서, 내부 망막 혈류를 중단시켰다 (허혈). 60분 이후에 순환 (재관류)을 설치하기 위해 바늘을 제거하였다. 이 프로토콜은 모든 RGC 축삭의 퇴화 및 다른 망막 뉴런의 사멸을 초래한다. 다른 망막 뉴런을 아폽토시스로부터 방지하기 위해서, Rock 억제제 리파수딜 히드로클로라이드 탈수물의 용액 (PBS 중 0.4%)을 1일 1회 마우스의 눈 표면에 투여하였다.
면역조직화학 및 이미지화. 염수 (ddH2O 중 0.9% NaCl) 및 이후에 4% PFA를 경심으로 관류한 이후에, 마우스의 눈, 시신경, 및 뇌를 수집하였고 24시간 동안 4% PFA에서 후-고정하였다. 눈 및 뇌 조직을 저온보호를 위해 30% 수크로스에 넣었고, 각각 10 ㎛ 및 30 ㎛ 두께로 마이크로톰 크리요스태트를 사용해 절편화하였다. 면역조직화학 염색은 표준 프로토콜에 따라서 수행하였다. 하기 항체들이 사용되었다: RGC 표지화를 위한 토끼-항-RBPMS (Abcam,1:400), RGC 표지화를 위한 마우스-항-Brn3a (Santa Cruz Biotechnology,1:200), α-RGC 표지화를 위한 토끼 항-SMI-32 (Abcam, 1:400), ipRGC 표지화를 위한 토끼 항-멜라놉신 (Abcam, 1:500), ON-OFF DSGC 표지화를 위한 토끼 항-CART (코카인- 및 암페타민-조절된 전사물) (Phoenix Peptide,1:2500), 시냅스후 세포막 표지화를 위한 마우스 항-PSD95 (Abcam, 1:400). 2차 검출을 위해서, Alexa Fluor 647 당나귀 항-토끼 (IFKine™,1:400), Alexa Fluor 647 당나귀 항-마우스 (IFKine™,1:400), 또는 Alexa Fluor 488 당나귀 항-토끼 (Abcam, 1:400)가 사용되었다. 면역-염색된 절편은 Zeiss LSM880 공초점 현미경, Nikon 스피닝 디스크 (CSU W1 Sora) 공초점 현미경 또는 STED SP8 현미경으로 이미지화되었다.
생체내 칼슘 이미지화. 수술을 위해서, 마우스는 우레탄 (1.5 g/kg)으로 마취시켰고, 안과용 연고로 눈을 덮고 정위 장치에 위치시켰다. 맞춤형 티타늄 헤드-플레이트는 마우스의 장축에 평행한, 대체로 람다에 집중된, 검은색 치과용 시멘트 (Fe3O4 가 블록 라이트에 첨가됨)를 사용해 두개골에 결합되었다. 3-mm 개두술이 후내측 SC 및 하구부 상에서 수행되었고, 이어서 3 mm 직경의 커버슬립을 경막 상에서 부드럽게 눌러주어서, 개두술을 검은색 치과용 시멘트로 봉합하였다. 기능적 2-양자 이미지화 동안 시각 자극으로 인한 빛 오염을 피하기 위해서 헤드-플레이트 상에 블랙-아웃 천 조각을 부착하였다.
시각 자극은 Matlab (Mathworks) 기능 Psychtoolbox를 사용해 생성시켰고 반대쪽 눈으로부터 15 cm에 위치된 보정된 17' LCD 모니터 (Dell, 1280 × 1024 픽셀, 75 Hz 재생률) 상에 표시하였다. 자극은 회색 균질 배경 (공간 주파수: 0.05 사이클/°, 시간 주파수: 2 Hz) 상에 존재하는 사인-파 표류 격자의 전체 스크린이었다. 격자는 1초 지속기간 및 1-2초 자극간 간격으로 5회 반복 동안 표시되었다. 자극은 45°의 규칙적인 간격으로 4개 배향에 직교하여 8개 방향으로 표류되었다.
축삭 말단으로부터의 형광의 2-광자 이미지화는 맞춤형 LotosScan 현미경 (LotosScan, Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology)으로 모니터링되었고 모드 잠금 Ti:Sa 레이저 (Chameleon VISION-S, Coherent)와 결합되었다. 여기 파장은 920 nm로 고정되었다. 이미지화는 40X, 0.8 NA 대물렌즈 (Nikon)를 사용해 수행되었다. 빔 크기는 40X 대물렌즈의 후면 조리개를 가득 채울만큼 충분하게 컸다. 이미지는 50 Hz의 프레임률 (480 x 240 픽셀, 0.225 ㎛/픽셀)에서 획득되었다.
이미지는 Matlab (Mathworks) 및 ImageJ (National Institutes of Health)에서 분석하였다. 이미지화 데이터에서 측면 움직임을 보정하기 위해서, Turboreg 소프트웨어 (ImageJ plugin)를 사용하여 프레임별 정렬을 기반으로 하는 강체 변환을 적용하였다. 터미널은 크기, 형상 및 밝기를 기반으로 손으로 확인하였다. 개별 터미널 시간 과정은 각 프레임의 터미널 마스크 내 픽셀 강도 값을 평균하여 추출하였다. 뇌 박동이 이미지화 동안에 분명하였으면, 이들 데이터는 사용하지 않았다. 신경망 신호는 이전에 보고된 방법40을 사용하여 차감하였다. 이러한 보정 이후에, 각 자극 존재에 대한 반응 (Ft)은 자극 개시 (F0) 직전 0.2초의 반응에 의해 정규화되었다. 각 자극의 경우에, 형광의 평균 변화 (ΔF/F)는 모든 자극 조건 및 시도에 대한 반응을 평균내어 계산되었다. 시각적으로 반응성인 세포는 공백 및 자극 제시 기간 전반에서 ANOVA에 의해 정의되었다 (P<0.05).
Lgr5 + 아마크린 사이뉴런의 전체-세포 패치 클램프 기록. 마우스는 안락사되기 전 2시간 동안 암-적응시켰다. 다음으로 적외선광 하에 126 mM NaCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM 포도당 및 26 mM NaHCO3 를 함유하는 인공 뇌척수액 (ACSF) 중에서 망막의 절개를 수행하였다. 망막 조각을 면도날을 사용하여 손으로 잘라서 필터지 조각에 부착시키고, 현미경 스테이지 상의 기록 챔버로 옮기고 산소화 (95% O2 / 5% CO2) ACSF로 관류시켰다. INL 중 Lgr5-tdTomato+ 세포는 2-광자 현미경을 사용해 확인하였고 적외선광 하에서 전체-세포 패치-클램프 기록을 목표로 하였다. 피펫 (4-7 MΩ)은 전압-클램프 기록을 위해 120 mM Cs-메탄술포네이트, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 5 mM QX314, 0.5 mM CaCl2, 4 mM ATP, 0.5 mM GTP, 또는 전류-클램프 기록을 위해 123 mM K-글루코네이트, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0.5 mM GTP를 함유하는 세포내 용액으로 채워졌다. 상기 사용된 모든 시약은 Sigma로부터 입수되었다. Alexa488 히드라지드 (0.2 mM, ThermoFisher)가 세포내 용액에 첨가되어서 기록된 세포의 형상을 시각화하였다. Multiclamp 700A 증폭기 및 pClamp 10 소프트웨어 제품군 (Molecular Devices)을 사용해 신호를 획득하고 처리하였다. 신호를 1kHz에서 필터링하였고 10kHz에서 샘플채취하였다 (Digidata 1440A, Molecular Devices). EPSC는 Cl- 의 역전위 (-67 mV)에서 기록되었고, IPSC는 0 mV에서 기록되었다. 기록 컴퓨터에 의해 제어되는 백색 LED 광을 사용하여 전체 시약 빛 자극을 전달하였다.
SC 뉴런의 시험관내 전체-세포 패치 클램프 기록. 깊이 마취된 마우스는 92 mM 콜린-클로라이드, 2.5 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 10 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2, 25 mM 포도당, 5 mM Na-아스코르베이트, 3 mM 소듐 피루베이트 및 2 mM 티오우레아를 함유하는 빙냉 산소화 (95% O2, 5% CO2) 절단 용액을 경심으로 관류하였다. 절단 용액의 pH 값은 진한 HCl을 첨가하여 7.3-7.4로 조정하였고, 삼투압은 310-315 mOsm로 조정하였다. 두개골로부터 제거한 후에, SC 영역을 함유하는 뇌 조직은 진동 블레이드 마이크로톰 (VT1200 S, Leica Biosystems)을 사용하여, 절단 용액 중에서, 300 ㎛ 관상 슬라이스로 절단하였다. 다음으로 슬라이스를 실온 산소화 유지 용액 (92 mM NaCl, 30 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 및 25 mM 포도당, 20 mM HEPES, 5 mM Na-아스코르베이트, 3 mM 소듐 피루베이트, 및 2 mM 티오우레아, 7.3-7.4의 pH 및 310-315 mOsm의 삼투압 농도값)을 함유하는 유지 챔버로 옮기기 전에, 15분 동안 31-32℃에서 동일한 절단 용액 중에 인큐베이션하였다. 1시간 동안 저장한 후에, 슬라이스를 실온 산소화 기록 용액 (119 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 및 12.5 mM 포도당)을 함유하는 기록 챔버로 옮겼다. SC 영역을 함유하는 3 내지 5개 슬라이스가 전형적으로 1마리 동물로부터 생성되었다. 중간 SC 영역을 함유하는 뇌 슬라이스로부터 기록을 수집하였다.
시냅스 반응의 전체-세포 패치 클램프 기록은 125 mM K-글루코네이트, 20 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES-NaOH, 10 mM P-크레아틴, 4 mM ATP-Mg, 및 0.3 mM GTP (pH 7.3)의 내부 용액이 존재하는 2-4 MΩ 유리 피펫을 사용하여 만들었다. 파란색 자극광은 470 nm LED (Thorlabs, 35 mW/㎟)를 통해 생성시켰고 40X 대물렌즈 (OLYMPUS)를 통해서 적용되었다. 5 ms에 자극 지속기간이 기록된 시냅스후 반응을 포화시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 뉴런은 1-5 GΩ 범위의 입력 저항 및 20 MΩ 미만의 직렬 저항을 가졌다. 기록은 하기 프로토콜에 따라 수행되었다: 막 전위를 먼저 -70 mV로 유지시켜서 빛-유발된 AMPA 수용체-매개 시냅스 전류 (NMDA 수용체는 아마도 이 유지 전위에서 마그네슘에 의해 차단되었을 것임)를 기록하였다. 다음을 막 유지 전위를 +55 mV로 전환하여서 AMPA 및 NMDA 수용체-매개 전류의 혼합물을 기록하였다. 이러한 조건 하에서, AMPA 수용체 길항제 CNQX (10 mM)를 기록 용액에 첨가하여 AMPA 수용체-매개 시냅스 전류를 차단하여서, NMDA 수용체-매개된 EPSC의 검출을 허용하였다. 다음으로, 기록을 전류 클램프 방식으로 전환하여 활동 전위를 검출하였다. AMPA 수용체 길항제 CNQX (Tocris) 및 NMDA 수용체 길항제 D-APV (Tocris)의 적용은 각각의 약물을 입욕 기록 용액에 첨가하여 수행되었다. 모든 기록은 Axon700B 증폭기를 사용해 만들어졌고 Digidata1440 analog-to-digital 보드를 사용해 디지털화되었다. 자극 및 데이터 획득은 pClamp 소프트웨어를 사용해 수행되었고 50 kHz에서 디지털화되었다. 모든 장비 및 소프트웨어는 Axon Instruments/Molecular Devices (Molecular Devices, CA)로부터 입수하였다.
통계학. 2개 그룹의 편차는 양측 스튜던트 t-검정을 사용해 비교하였다.
결과
Lgr5 + 아마크린 사이뉴런은 생체내에서 RGC로 재프로그래밍된다. 우리는 먼저 RGC가 아마크린 사이뉴런으로부터 재생될 수 있는지 여부를 시험하기 위해서 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스 품종을 사용하였다. Lgr5는 내부 핵층의 유리체 측면에 위치하는 망막 세포의 서브세트에서 발현된다 (도 1a). 이들 Lgr5+ 세포는 아마크린 사이뉴런의 전형적인 형상을 나타낼 뿐만 아니라 (도 1a-c 및 7a-d), 또한 빛 자극에 반응하여 활성 시냅스 연결을 갖는다 (도 1e, f). 그들은 표적화된 패치-클램프 기록에 의해 밝혀진 바와 같이, 흥분성 및 억제성 시냅스후 전류 (EPSC 및 IPSC) 둘 모두를 수용할 수 있었고 그들에 의해 탈분극 또는 과분극될 수 있어서 (도 1e, f), 그들이 실제로 성숙한 아마크린 사이뉴런임을 시사한다. 그러나, Lgr5+ 아마크린 사이뉴런을 tdTomato 리포터로 표지화하고 성체 마우스에서 계통을 추적했을 때, 매우 소수 (임의의 소정 시점에 망막 당 1개 세포 미만)의 tdTomato+ 양극 세포 및 수평 세포가 수 개월 이후에 검출되어서 (도 1b, c), 일부 Lgr5+ 아마크린 세포가 Lgr5 발현을 끌 수 있고, 제한된 재생 잠재성을 나타내는, 다른 망막 계통으로 전환분환된다는 것을 의미한다. 마우스가 노화되면서, 적은 수의 Lgr5+ 아마크린 세포가 망막 신경절 세포 층에서 검출되어서, 그들이 내부 핵층으로부터 망막 신경절 층으로 이동할 수 있다는 것을 시사한다 (도 1d 및 7e-g). 망막 신경절 세포층 내에서 Lgr5+ 세포의 개수는 나이가 들어가면서 증가되고 (도 7h), 이들 세포 중 일부는 Lgr5 발현을 꺼버리지만, 결코 RGC로 변하지 않는다
Lgr5+ 아마크린 사이뉴런이 RGC로 재프로그래밍될 수 있는지 여부를 조사하기 위해서, 우리는 생체내 계통 추적 및 재프로그래밍 전략을 고안하였다 (도 2a). 우리는 먼저 Lgr5+ 아마크린 뉴런을 Rosa26-tdTomato 리포터로 표지하였고, 아데노바이러스-연관 바이러스 (AAV)를 통해 전달되는 Cre-의존적 이중-플록스된 반전 오픈 리딩 프레임 (DIO) 발현 시스템을 사용하여, 이들 세포에서 특이적으로 RGC 운명 결정에 필수적인 유전자를 이소적으로 발현시켰다 (도 2b). 우리는 평면-장착 망막 샘플에서 RGC 형상을 갖는 tdTomato+ 세포의 존재, 및 이후 시점에 시신경에서 tdTomato+ 축삭의 존재를 조사함으로써 Lgr5+ 아마크린 세포로부터 RGC의 생성을 분석하였다.
우리는 평면-장착 망막 샘플 중 임의의 tdTomato+ RGC 세포 및 AAV-DIO-EGFP가 유리체내 주사된 대조군 마우스로부터의 시신경에서 tdTomato+ 축삭을 관찰하지 못하였다 (도 2c 및 8a-e). 그러나, RGC 형상을 갖는 tdTomato+ 세포가 RGC 운명 결정에 중요한 유전자 세트 (Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11 및 Isl1)를 발현하는, AAV가 주사된 마우스로부터의 망막 샘플에서 검출되었다. 유도된 유전자 발현 이후 6주에, RGC 형상을 갖는 tdTomato+ 세포가 망막 샘플에서 관찰되었다 (도 2d-f). 이들 세포는 축삭-유사 돌출부를 시신경 원판을 향해 돌출시켰고 시신경으로 확장시켰다 (도 3a). 그들 세포 몸체는 망막 신경절 세포 층에 위치되었고, RGC-특이적 마커 RBPMS 및 Brn3A로 염색될 수 있다 (도 2g, h). 그러므로, 이들 세포는 잠재적으로 새롭게 생성된 RGC로서 간주될 수 있다.
평균적으로, 망막 당 약 180개의 새로운 RGC가 바이러스 주사 이후 6주에 재생되었다 (도 2c). 이러한 개수는 생체내 재프로그래밍이 개시되었을 때 망막 신경절 층에 존재하는 Lgr5+ 아마크린 세포의 수 (2-3개월령 마우스의 망막 신경절 세포 층에 약 10-15 세포)에 비해 훨씬 더 높다 (도 7h). 이러한 결과는 Lgr5+ 아마크린 세포 중 RGC 운명-결정 인자의 이소성 발현이 이들 세포 중 일부의 내부 핵층에서 신경절 세포 층으로의 이동을 촉발시킬 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 개념을 뒷받침하도록, Lgr5-EGFP 발현 수준이 보다 낮은 tdTomato+ 세포가 내부 망상층에서 검출되었다 (도 8f-h).
우리는 단일 전사 인자 및 그들 조합의 재프로그래밍 활성을 시험하였고, 단일 전사 인자 (Brn3B 또는 Sox4)더라도 매우 낮은 효율이지만, Lgr5+ 아마크린 사이뉴런을 RGC로 재프로그래밍할 수 있다는 것을 발견하였다 (도 2c). Brn3B 및 Sox4의 조합은 재프로그래밍 활성을 극적으로 상승시켰다. Brn3B+Sox4 조합에 Atoh7의 첨가는 재프로그래밍 효율을 훨씬 더 개선시키지 않았다 (도 2c). 그러므로, 우리는 달리 언급하지 않으면, 나머지 실험에서 Brn3B+Sox4 조합을 사용하였다.
RGC는 별개 아형으로 분류될 수 있는 망막 뉴런의 이종 유형이다. 우리는 아형-특이적 항체를 사용하여 면역-조직학적 분석을 수행하였고, 재생된 RGC가 항-CART (켜짐 꺼짐 방향 선택적 신경절 세포 경우) 및 항-SMI-32 (α 신경절 세포 경우)를 사용해 확인할 수 있다는 것을 발견하였지만 (도 2i 및 8i-l), 임의의 멜라놉신-발현의 본질적 감광성 신경절 세포를 검출하지 못하였다. 종합하면, 이들 결과는 특이적 전사 인자의 이소성 발현이 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런을 RGC로 재프로그래밍할 수 있고, 재생된 RGC는 아형-특이적임을 시사한다.
재생된 RGC는 축삭을 뇌의 시각 핵으로 돌출시킨다. 재생된 RGC가 뇌에서 적절하게 재배선될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 우리는 망막 운동 경로를 따라서 재생된 RGC의 축삭 및 주요 뇌 레티노수용 영역으로 그들 돌출을 조사하였다. 바이러스 주사 이후 6주에, 재생된 RGC의 많은 축삭이 전체 시신경을 가로질려서, 시신경 교차를 통과하고, 배측 및 등측 슬상 핵 (dLGN 및 vLGN), 개막전 영역, 및 상구체 (SC)를 포함한, 뇌의 시각 핵으로 건너갔다 (도 3). 우리는 시각 경로와 관련없는 뇌 영역으로 재생된 RGC 축삭의 비정상적인 돌출을 관찰하지 못하였다. 레티노수용 영역 내에서, 재생된 RGC의 축삭 분지를 따라서 미크론-크기의 정맥류가 관찰된다. 이들 정맥류는 시냅스후 밀도 단백질 PSD-95에 대한 염색과 가까이 병치하여 (도 3g-i), 그들이 추정 시냅스전 부톤임을 시사한다.
우리는 3개의 중요한 뇌 시각 위치, 시신경 교차 (OC), LGN 및 SC로 재생된 RGC의 축삭 돌출의 시간 과정을 결정하였는데, 바이러스 주사 이후 뇌 슬라이스 상의 이들 영역에서 재생된 RGC 축상이 최초로 검출된 때를 분석하여, 결정하였다. 우리는 RGC 축삭이 OC에 도달하는데 대략 18일, LGN에 도달하는데 28일, 및 가장 먼 시각 표적 SC에 도달하는데 35일이 걸린다는 것을 발견하였다 (도 9). 종합하여, 이들 데이터는 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런-유래된 RGC가 축삭을 적절한 뇌 영역으로 돌출시켜서, 망막-뇌 연결을 확립할 수 있다는 것을 입증한다.
Prokr2 + 전위된 아마크린 사이뉴런을 RGC로 재프로그래밍한다. 우리는 다른 망막 뉴런이 역시 RGC로 재프로그래밍될 수 있는지 여부를 고려하였다. 전위된 아마크린 사이뉴런은 그들이 RGC 층에 위치하기 때문에, RGC 대체를 위한 훨씬 나은 세포 공급원으로서 제공될 수 있었다. 이러한 뉴런 아형이 RGC로 재프로그래밍될 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, 우리는 Prokr2 CreERT2 녹-인 마우스 계통을 생성시켰다 (도 10a, b). Prokr2 CreERT2 마우스는 전위된 아마크린 사이뉴런의 아군에서 발현되는, Prokr2 유전자의 내생성 전사 제어 하에서 타목시펜-유도성 CreERT2 리콤비나제를 발현한다. 예상대로, 타목시펜이 처치된 성체 Prokr2 CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서, tdTomato+ 세포는 망막 신경절 세포 층에 위치한다. 그들은 광학 투영이 없고, RGC 마커 RBPMS를 발현하지 않는다 (도 4a, b 및 도 10c-e).
망막에서 발현되는 것 이외에도, Prokr2는 또한 시신경 및 뇌의 세포에서도 발현된다 (도 10f-h). 이것은 재생된 RGC의 축삭을 추적하기 위해서 우리가 Rosa26-tdTomato 리포터를 사용하지 못하게 한다. 이러한 장애를 극복하기 위해서, 우리는 프로그래밍 동안 전사 인자와 EGFP를 공-발현시켜서 재생된 RGC를 표지하였다 (도 10k). 우리는 재프로그래밍을 위해 전사 인자의 2개 조합 (Brn3B+Sox4 및 Atoh7+Brn3B+Sox4)을 사용하였고, Prokr2+ 전위된 아마크린 사이뉴런을RGC로 효율적으로 재프로그래밍할 수 있다는 것을 발견하였다 (도 4c, d). 그러나, Lgr5+ 아마크린 사이뉴런과 달리, Brn3B+Sox4 조합에 Atoh7의 포함은 재프로그래밍 효율을 극적으로 증강시켰다 (도 10l). Prokr2+ 전위된 아마크린 사이뉴런-유래된 RGC는 또한 시신경 및 다양한 뇌 시각 표적으로 축삭 돌출을 연장시켰다 (도 4e-k). 따라서, 이들 결과는 RGC가 생체내에서 다수의 망막 뉴런 아형을 재프로그래밍하여 재생될 수 있다는 것을 입증하였다.
재생된 RGC는 시각 정보를 뇌로 운반한다. 재생된 RGC가 시각 자극에 반응하여 시각 정보를 뇌의 하류 표적으로 운반할 수 있는지 여부를 조사하기 위해서, 우리는 AAV-DIO-GCamp6f를 재프로그래밍된 칵테일에 첨가하여 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 마우스에서 칼슘 지시자 GCamp6f로 재생된 RGC를 표지하였다. 다음으로 우리는 바이러스 주사 이후 6주에 마취된 마우스의 SC를 노출시켰고, 재생된 RGC 축삭 말단의 시각적으로 유발된 칼슘 역학을 측정하기 위해 생체내 기능적 칼슘 이미지화에서 사용하였다 (도 11a).
마우스에게 표류 격자가 제공되었을 때, SC 중 축삭 분지를 따라서 개별 RGC 부톤은 자극-유발된 칼슘 신호를 나타내서 (도 11b), 재생된 RGC가 시각 자극에 반응하여 시각 신호를 뇌에 전달할 수 있다는 것을 의미한다. 시각적 반응성 부톤은 그들 반응 패턴을 기반으로 별개 범주로 분류할 수 있었다. 부톤은 자극의 켜짐 및 꺼짐뿐만 아니라, 표류 격자의 배향 및 방향에 차등적으로 반응하였다 (도 5a-d 및 11c, d). 종합하면, 이들 데이터는 재생된 RGC가 시각 정보를 뇌에 운반할 수 있고, 기능적으로 별개인 RGC 아형이 생체내 재프로그래밍을 통해서 생성될 수 있다는 것을 시사한다.
재생된 RGC는 시냅스후 뉴련과 기능적 시냅스 연결을 확립한다. 재생된 RGC가 뇌에서 뉴런 신호를 시냅스후 뉴런에 전달할 수 있는지 여부를 조사하기 위해서, 우리는 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 재생된 RGC에서 채널로돕신-2 (ChR2)를 발현시켰고, 바이러스 주사 이후 8주 내지 10주에 뇌 슬라이스 상에서 SC 뉴런의 빛-유발된 시냅스후 반응을 검출하기 위해 전체-세포 패치 기록을 사용하였다.
재생된 RGC의 축삭 말단이 빛으로 자극되었을 때, AMPA 수용체-매개된 흥분성 시냅스후 전류 (EPSC)가 SC 뉴런에서 검출되었다. 단일 빛 임펄스는 다수 피크를 갖는 AMPA 수용체-매개된 EPSC를 유발시켜서 (도 5e, h 및 i), 재생된 RGC 축삭이 SC 뉴런 및 활성화된 AMPA 글루타메이트성 수용체와 다수-입력 시냅스를 형성하였음을 시사한다. NMDA 수용체-매개된 EPSC 및 활동 전위가 또한 빛 자극 이후 시냅스후 SC 뉴런에서 검출되었다 (도 5f, g 및 j). 더 나아가서, 재생된 ChR2-발현 RGC에 대한 SC 뉴런의 반응은 ChR2를 발현하는 정상 RGC의 것과 비슷하다 (도 11e, f). 종합하면, 이들 결과는, 빛 자극에 반응하여, 재생된 RGC 축삭 말단이 신경전달물질로서 글루타메이트를 방출하고, SC 뉴런과 기능적 시냅스 연결을 확립한다는 것을 시사한다.
녹내장 마우스 모델에서 기능성 RGC를 재생한다. 다음으로 우리는 재생된 RGC가 질환 상태 하에서 시각 회로를 복구시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 우리는 특히 본래 RGC 및 그들 축삭이 퇴화를 겪었을 때, 재생된 RGC가 여전히 축삭을 적절한 뇌 표적으로 보낼 수 있고, 망막-뇌 연결을 재건할 수 있는지 여부를 결정하는데 관심이 있다.
우리는 RGC 및 그들 축삭을 손상시키도록 안내압 증가-유도된 녹내장 모델을 사용하였고, 시신경 내 모든 RGC 축삭의 퇴화 및 망막 내 RGC 세포체의 상당한 상실을 초래할 수 있는 상태를 최적화하였다 (도 12a-e). 그러나, 이러한 손상 상태는 또한 안내압 증가 이후 7일에 Lgr5+ 아마크린 세포의 급격한 상실을 초래하였다 (도 6b). 그러므로, 우리는 Lgr5+ 아마크린 세포를 보호할 수 있는 시약을 검색하였고, Rock 억제제 리파수딜이 Lgr5+ 아마크린 세포를 효율적으로 보존할 수 있다는 것을 발견하였다 (도 6c).
우리는 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스에서 새롭게 재생된 RGC가 손상된 시각 회로를 복구할 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, 생체내 재프로그래밍과 뉴런 보호를 조합한 프로토콜을 고안하였다 (도 12f). 우리는 tdTomato 리포터로 Lgr5+ 아마크린 세포를 표지하기 위해서 타목시펜을 공급받은 Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2 ; Rosa26-tdTomato 마우스의 양쪽 눈을 손상시켰다. 손상 이후에, 양쪽 눈에 1일 1회 리파수딜을 처치하였고, 7일 이후에, 좌측 눈에 대조군으로서 AAV-DIO-EGFP를 주사하였고, 반면 우측 눈은 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런을 재프로그래밍하기 위해서, Brn3B, Sox4 및 Atoh7을 포함한 전사 인자를 발현하는 AAV의 조합이 주사되었다. 바이러스 주사 후 6주에, 마우스는 분석을 위해 희생되었다. AAV-DIO-EGFP가 주사된 좌측 눈에서는, tdTomato+ RGC 축삭이 좌측 시신경에서 검출되지 않았으므로, RGC는 재생되지 않았다 (도 6e). 대조적으로, Brn3B, Sox4 및 Atoh7의 과발현은 Lgr5+ 아마크린 세포를 RGC로 재프로그래밍하였고, 재생된 RGC는 tdTomato+ 축삭을 시신경 및 대측성 측면의 다양한 뇌 시각 표적으로 돌출시켰다 (도 6f-k).
재생된 RGC는 질환 상태 하에서 시냅스후 뇌 뉴런과 기능성 시냅스 연결을 확립시켰다. 빛-유발된 시냅스후 반응이 뇌 슬라이스 상의 SC 뉴런에서 검출되었고, 여기서 모든 RGC 축삭 말단은 본래 것이 손상된 이후 재생된 RGC로부터 유래되었다 (도 6l-n). 종합하면, 이들 결과는 질환 상태 하에서도 재생된 RGC가 망막을 뇌에 재연결시킬 수 있고 시각 정보를 시냅스후 뉴런에 전달할 수 있다는 것을 입증한다.
이들 결과는 기능성 RGC는 완전하게 분화된 망막 사이뉴런의 생체내 재프로그래밍을 통해서 성체 포유동물에서 생성될 수 있다는 것을 입증한다. 필수 전사 인자의 이소성 발현에 의해서, 아마크린 및 전위된 아마크린 사이뉴런 둘 모두는 RGC를 정밀하게 재프로그래밍할 수 있고, 새롭게 생성된 RGC는 시각 회로에 통합되어서 시각 정보를 뇌에 전달한다. 생체내 뉴런 정체 재프로그래밍이 중추 신경계 (CNS)의 다른 영역에서 획득되었지만, 뉴런 아형 간 성공적인 전환은 생후 첫주에만 제한되었거나, 또는 화학 화합물 발프로산이 존재할 때 성체 마우스에서 제한적인 성공만 있었다. 대조적으로, 이 실시예는 화학적-자극제없이도, 망막 뉴런 정체 전환이 성체에서 획득될 수 있고, 성공적인 재프로그래밍이 내부 핵층에서 RGC 층으로 아마크린 사이뉴런의 이동을 촉발한다는 것을 입증하였다. 이들 결과는 놀랍게도 뉴런이 재생 목적을 위해 활용할 수 있는, 예상치 않은 정체 가소성을 나타낸다는 것을 보여준다.
Brn3B 및 Sox4의 조합은 Lgr5+ 아마크린 사이뉴런 및 Prokr2+ 전위된 아마크린 사이뉴런 둘 모두를 RGC로 효율적으로 재프로그래밍하여서, 이들 2종 전사 인자가 RGC 운명 결정에 충분하다는 것을 시사한다. Brn3B+Sox4 조합에 Atoh7의 포함은 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포로부터 RGC의 재생 효율을 유의하게 개선시켰지만, Lgr5+ 아마크린 세포 재프로그래밍을 개선시키지는 않았다. 이것은 직접 세포 계통 재프로그래밍이 공급 세포의 고유 성질에 의해 영향받는다는 것을 시사한다.
재생된 RGC는 본래 RGC 및 축삭이 손상된 동물에서도, 다양한 뇌 시각 영역으로 축삭의 먼-거리 돌출을 통해서 뇌에 망막을 연결한다. 이들 발견은 성체 포유동물 시각계가 신경 회로를 재연결하는 현저한 능력을 여전히 유지한다는 것을 밝혀준다.
실시예 2. 퇴화된 RGC의 재활력화
이 실시예는 퇴화된 RGC가 또한 기능성 축삭을 다시 성장시키도록 전사 인자에 의해 재활성화될 수 있다는 것을 보여준다.
이 실시예에서, PV-CreERT2; Rosa26-tdTomato 마우스에서, 안내압의 증가를 사용하여 망막 신경절 세포 (RGCs)의 아폽토시스를 촉발시켜 그들 축삭의 퇴화를 야기시켰다. 이 동물 모델에서, 생존된 RGC 중 3종 전사 인자 (Atoh7+Brn3B+Sox4)의 발현은 축삭을 재성장 (재생)시키도록 이들 세포를 자극시켰다 (도 13). 또한 중요하게, 재생된 RGC 축삭이 시신경으로 돌출되어서 뇌와 시각 영역에 도달하였다 (도 14).
그러므로, 결과는 전사 인자의 조합이 사이뉴런 세포를 재생된 RGC로 재프로그래밍할뿐만 아니라, 그들이 또한 퇴화되거나, 손상되거나, 상처입거나, 또는 노화된 RGC를 재활력화시킬 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 이들 전사 인자가 시각 복구, 회복, 또는 개선이 바람직한 대상체에게 투여될 때, 그들은 바람직한 치료적 효과를 획득하도록 사이뉴런과 RGC 둘 모두 상에서 협력하여 작용할 수 있다.
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본 개시가 개시된 구현예를 참조하여 설명되었지만, 당업자는 상기 상술된 특별한 예 및 연구들은 단지 본 개시의 예시라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 개시의 정신을 벗어나지 않고 다양한 변형이 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 개시는 오직 하기 청구항에 의해서만 제한된다는 것을 이해해야 한다.
<110> ShanghaiTech University <120> REGENERATION OF RETINAL GANGLION CELLS <130> P21401497WF <150> CN202010047628.2 <151> 2020-01-16 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Met Met Ser Leu Asn Ser Lys Gln Ala Phe Ser Met Pro His 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu His Val Glu Pro Lys Tyr Ser Ala Leu His Ser Thr 20 25 30 Ser Pro Gly Ser Ser Ala Pro Ile Ala Pro Ser Ala Ser Ser Pro Ser 35 40 45 Ser Ser Ser Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Glu Ala Met Arg Arg Ala Cys Leu Pro Thr Pro Pro 85 90 95 Ser Asn Ile Phe Gly Gly Leu Asp Glu Ser Leu Leu Ala Arg Ala Glu 100 105 110 Ala Leu Ala Ala Val Asp Ile Val Ser Gln Ser Lys Ser His His His 115 120 125 His Pro Pro His His Ser Pro Phe Lys Pro Asp Ala Thr Tyr His Thr 130 135 140 Met Asn Thr Ile Pro Cys Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Val Pro 145 150 155 160 Ile Ser His Pro Ser Ala 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Arg Arg Met Gln Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Arg Leu 50 55 60 Arg Arg Val Val Pro Gln Trp Gly Gln Asp Lys Lys Leu Ser Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Thr Leu Gln Met Ala Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Leu Thr Arg Ile 85 90 95 Leu Ala Glu Ala Glu Arg Asp Trp Val Gly Leu Arg Cys Glu Gln Arg 100 105 110 Gly Arg Asp His Pro Tyr Leu Pro Phe Pro Gly Ala Arg Leu Gln Val 115 120 125 Ser <210> 14 <211> 390 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 atgaagtcgg cctgcaaacc ccacggccct ccggcgggag ctcgcggcgc gcccccgtgc 60 gcgggcgcag ccgagcgcgc ggtctcgtgc gcggggcccg ggcggctgga gagcgcggcg 120 cgcaggcgtc tggcggccaa cgcgcgcgag cggcgccgca tgcaggggct gaacacggcg 180 ttcgaccggc tgcgcagggt ggtgccgcag tggggccagg acaagaagct gtccaagtac 240 gagacactgc agatggcgct cagctacatc atcgcgctca cccgcatcct agccgaagcc 300 gagcgggact gggtcgggct gcgctgcgag cagcggggcc gcgatcaccc ctacctccct 360 ttcccgggtg ctaggctcca ggtttcatga 390 <210> 15 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Val Gln Gln Ala Glu Ser Leu Glu Ala Glu Ser Asn Leu Pro Arg 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agctcccaga tacacccaac 1020 agcatggtag ccagtcctat tgaggcatga 1050 <210> 23 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 gcccacctgt agcatcatca acatgggacc ccagaacaga aacactagct ttg 53 <210> 24 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga 60 ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga 120 gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg 180 gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc 240 gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg 300 cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg 360 cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg 420 aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag 448 <210> 25 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc 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gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta gggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600 g 601 <210> 27 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 aggggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 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Claims (39)

  1. 시각 신호에 반응성인 포유동물 세포를 제조하기 위한 방법으로서, 망막 신경 세포에서,
    POU 클래스 4 호메오박스 2 (Brn3B)
    SRY-박스 전사 인자 4 (Sox4)
    아토날 BHLH 전사 인자 7 (Atoh7),
    SRY-박스 전사 인자 11 (Sox11), 및
    ISL LIM 호메오박스 1 (Ils1)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유전자는 Brn3B 및 Sox4를 포함하는 것인 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 유전자는 Atoh7을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 망막 신경 세포는 아마크린 세포, 수평 세포, 및 양극 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 사이뉴런 세포이거나, 또는 퇴화, 손상, 또는 노화된 망막 신경절 세포 (RGC)인 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 망막 신경 세포는 Lgr5+ 아마크린 세포인 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 망막 신경 세포는 Prokr2+ 전위된 아마크린 세포인 제조 방법.
  7. 망막 신경절 세포 (RGC)의 기능을 개선시키기 위한 방법으로서, RGC에서, Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 것인, 개선 방법.
  8. 제7항에 있어서, RGC는 퇴화, 손상, 노화되거나, 또는 정상인 망막 신경절 세포 (RGC)인 개선 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계는 망막 신경 세포에 유전자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 제공되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 mRNA인 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계는 망막 신경 세포에 상응하는 단백질을 도입시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전자의 생물학적 활성을 증가시키는 단계는 망막 신경 세포에서 내생성 유전자의 발현을 활성화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 망막 신경 세포는 시각 장애를 갖는 대상체에서 생체 내에 존재하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 망막 신경 세포는 시험관 내에 존재하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 시각 신호에 반응성인 제조된 포유동물 세포를 시각 장애를 갖는 대상체에게 이식하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 시각 장애 또는 실명을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한, Atoh7, Brn3B, Sox4, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 작용제의 용도.
  20. 치료를 필요로 하는 대상체에서 시각 장애 또는 실명을 치료하기 위한 방법으로서, 대상체의 망막에 Brn3B, Sox4, Atoh7, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 하나 이상의 유전자는 Brn3B 및 Sox4를 포함하는 것인 용도 또는 치료 방법.
  22. 제19항 내지 21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시각 장애 또는 실명은 퇴화된 망막 신경절 세포 (RGC)로 인해 초래되는 것인 용도 또는 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 시각 장애 또는 실명은 녹내장을 포함한, 시신경병증, 유전성 시신경병증, 및 독소, 영양적 결함 및 외상으로 초래된 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태와 연관되는 것인 용도 또는 치료 방법.
  24. 제22항에 있어서, 작용제는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 용도 또는 치료 방법.
  25. 제20항에 있어서, 투여는 유리체내 주사를 통한 것인 치료 방법.
  26. Brn3B 및 Sox4 단백질을 코딩하는 코딩 서열, 및 각 코딩 서열과 연관된 프로모터를 포함하는 핵산 구성체로서, 각 프로모터는 망막 신경 세포에서 활성인, 핵산 구성체.
  27. 제26항에 있어서, 프로모터 중 적어도 하나는 Pax6, Tcfap2b, Gad1, GlyT1, RBPMS, 또는 Prox1 유전자에 대한 프로모터인 핵산 구성체.
  28. 제26항에 있어서, 프로모터 중 적어도 하나는 시냅신 1 프로모터인 핵산 구성체.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 발현 벡터를 더 포함하는 것인 핵산 구성체.
  30. 제29항에 있어서, 발현 벡터는 AAV 벡터인 핵산 구성체.
  31. 제30항에 있어서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 구성체.
  32. 제30항에 있어서, AAV는 혈청형 AAV2인 핵산 구성체.
  33. 제30항에 있어서, AAV는 AAV2.7m8 또는 AAV7m8인 핵산 구성체.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 하나의 항의 핵산 구성체에 의해 형질감염된 세포.
  35. 제34항에 있어서, 망막 신경 세포인 세포.
  36. 제35항에 있어서, 시각 신호에 반응성인 세포.
  37. 망막 신경 세포에서 Brn3B, Sox4, Atoh7, Sox11, 및 Ils1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 생물학적 활성을 증가시켜서 제조된, 시각 신호에 반응성인 포유동물 세포.
  38. 제37항에 있어서, 시험관내에서 제조되는 것인 포유동물 세포.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 재생되거나 또는 재활력화된 망막 신경절 세포 (RGC)인 포유동물 세포.
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