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KR20220127749A - 체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 융합단백질 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 융합단백질 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220127749A
KR20220127749A KR1020220027823A KR20220027823A KR20220127749A KR 20220127749 A KR20220127749 A KR 20220127749A KR 1020220027823 A KR1020220027823 A KR 1020220027823A KR 20220027823 A KR20220027823 A KR 20220027823A KR 20220127749 A KR20220127749 A KR 20220127749A
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박주현
이재영
김만호
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 융합단백질 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 체세포에 동시에 처리하는 경우, Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 또는 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 단독으로 처리하는 경우와 비교하여 체세포로부터 조골세포(osteoblast)로의 직접교차분화를 증가시켜 조골세포의 생성량이 현저히 상승되는 효과가 있다.

Description

체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 융합단백질 제조 방법 및 이의 용도 {Method for producting recombinant proteins induced transdifferentiation into osteoblasts and use thereof}
본 발명은 체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 융합단백질 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
재생의학에서는 인간의 세포와 조직, 장기를 대체하거나 재생시켜 원래의 기능을 할 수 있도록 복원시키려는 연구가 계속되고 있다. 연구 소재로는 세포, 약물, 소재, 의료기기 등이 포함되며, 특히 면역 거부 현상을 해결하기 위한 관점에서 자가세포에 대한 연구가 집중되고 있다.
종래에는 목적으로 하는 세포를 수득하기 위하여 유도 만능 줄기세포를 이용한 연구가 주를 이루고 있다. 유도 만능 줄기세포는 비 만능 세포인 성체 체세포로부터 특정한 유전자를 인위적으로 발현 및 유도하여 인공적으로 만들어진 것이다. 체세포를 사용하기 때문에 배아의 사용을 필요로 하지 않고 만능줄기세포를 얻을 수 있으므로 유도 만능 줄기세포는 줄기세포 연구에 주로 인용되어 왔다. 그러나, 성체 체세포의 형질을 변형시키기 위하여 바이러스와 같은 매개체를 사용하면서 기형종(teratoma)의 생성 가능성이 높아지기 때문에 in vivo 시험에 사용하기 어렵고, 유도 만능 줄기세포를 생성하기 위해서는 리프로그래밍 및 재분화 단계를 반드시 거쳐야 한다.
이에, 점차 가속화되고 있는 고령화 사회에서 골, 연골, 골격근, 인대, 건 등과 같은 근골격계 관련 질환들에 대한 세포 치료로 유용하게 사용할 수 있는 제제에 대한 연구 및 시도가 이루어지고 있다.
따라서, 본 발명에서는 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 체세포에 동시에 처리하는 경우, Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 또는 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 단독으로 처리하는 경우와 비교하여 체세포로부터 조골세포(osteoblast)로의 직접교차분화를 증가시켜 조골세포의 생성량이 현저히 상승되는 효과를 확인하여 이를 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 목적은 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 포함하는 체세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 체세포로부터 조골세포 유도 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분화가 유도된 세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 포함하는 체세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
이어서, 본 발명은 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산이 도입된 벡터 중 1종 이상의 Oct4 발현 촉진 인자; 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 Cbfβ 발현 촉진 인자;를 체세포에 처리하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 조골세포 유도 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 분화가 유도된 세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 체세포에 동시에 처리하는 경우, Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 또는 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 단독으로 처리하는 경우와 비교하여 체세포로부터 조골세포(osteoblast)로의 직접교차분화를 증가시켜 조골세포의 생성량이 현저히 상승되는 효과가 있다.
도 1은 Oct4 및 Cbfβ 발현을 위한 플라스미드 벡터 지도를 나타낸 도이다; M, 단백질 마커; S, 가용성 분획; E, 용출된 분획.
도 2는 Oct4 재조합 단백질 및 Cbfβ 재조합 단백질의 고온 안정성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Oct4 재조합 단백질 및 Cbfβ 재조합 단백질의 생산 안정성 평가 결과를 나타낸 도이다; M, 단백질 마커; S, 가용성 분획; E, 용출된 분획; O,C, 정제된 단백질.
도 4는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19의 세포 투과성 및 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19가 처리된 체세포의 Alizarin Red S 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19가 처리된 체세포의 von Kossa 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19가 처리된 체세포의 osteoimage mineralization assay 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19로 유도된 조골세포의 전사체 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 EDC/NHS 가교 반응에 의한 젤라틴 cryogel 제작 및 생체 내 골 재생을 위한 재조합 단백질 유도 조골세포 이식 과정을 간단히 나타낸 개략도이다.
도 10은 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19로 유도된 조골세포의 골 재생 효과를 확인한 도이다.
도 11은 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19로 유도된 조골세포에 의해 재생된 골 조직의 조직학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 포함하는 체세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 단백질"은 POU5F1 단백질로도 알려져 있으며, POU5F1 유전자에 의하여 코딩된다. Oct4는 POU 패밀리의 호메오도메인(homeodomain) 전사 인자 중 하나이다.
상기 Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 "기능적 동등한 물질"이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Cbfβ(Core binding factor β) 단백질"은 조혈 및 골 형성의 유전적 조절에 관여하는 PEBP2/CBF 패밀리에 속하는 전사인자 중 하나이다.
상기 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있으며, 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 "기능적 동등한 물질"이란 뉴클레오티드의 치환 결손의 결과로 상기 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 갖는 유전자와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 유전자 또는 유전자 조합을 말한다.
또한, 상기 Oct4 단백질 및 Cbfβ 단백질은 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 융합된 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP)"는 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질에 융합되어 목적하는 세포 내부로 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질의 세포 통과를 가능하도록 기능하는 펩타이드로서, 그 의미는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. CPP는 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 서열을 다량 포함하고, 높은 양전하를 띄는 8 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 PTD(protein transduction domain)라는 특정 서열을 가진 펩티드일 수 있으나 이제 제한되지는 않는다.
또한, 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)는 30K 단백질, Antp(Penetratin), HSV-1, VP22, pep-1, PTD4, TAT PTD, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2 및 nona-arginine(R9)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 30K 단백질, 더욱 바람직하게는 30Kc19일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질에 컨쥬게이션 또는 융합되어 목적하는 세포 내부로 단백질의 통과를 가능하는 펩타이드라면 제한되지 않고 사용할 수 있다.
또한, 상기 30K 단백질은 누에 체액 내에 30KDa의 단백질 군을 지칭하며, 본 발명이 속하는 기술 분야(예컨대, 대한민국 공개특허 제10-2011-0003889호, 제10-2014-0111178호 또는 대한민국 등록특허 제10-1626343호)에 공지되어 있다. 상기 30K 단백질은 누에 체액으로부터 얻거나, 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균을 포함하는 박테리아, 식물 또는 식물 유래 세포, 효모, 균류, 곤충 세포 또는 척추동물 세포로부터 생산된 재조합 단백질일 수 있으며, Oct4 또는 Cbfβ의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.
이어서, 본 발명은 Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산이 도입된 벡터 중 1종 이상의 Oct4 발현 촉진 인자; 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 Cbfβ 발현 촉진 인자;를 체세포에 처리하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 조골세포 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 체세포로부터 조골세포 유도 방법은 상술한 Oct4 단백질 및 Cbfβ 단백질을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 상기 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질은 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질의 하나 이상의 아미노산이 유전학적 및/또는 화학적으로 변형되고 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질의 생물학적 활성을 보유한 Oct4 단백질 유사체 또는 Cbfβ 단백질 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단백질 융합체"란 목적 단백질의 생물학적 활성을 보유하면서 목적 단백질의 1종 이상의 아미노산에 펩타이드 등이 화학적으로 결합 또는 융합된 복합체를 의미한다. 본 발명에서 목적 단백질은 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질일 수 있다.
또한, Oct4 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된 Oct4 단백질 융합체이다. 일 실시양태에서, Oct4 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된, 세포투과성 펩타이드가 융합된 Oct4 단백질 융합체이다.
또한, Cbfβ 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된 Cbfβ 단백질 융합체이다. 일 실시양태에서, Cbfβ 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된, 세포투과성 펩타이드가 융합된 Oct4 단백질 융합체이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단백질 운반체"는 목적 단백질을 목적하는 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는, 목적 단백질 또는 그의 융합체를 포함하는 전달물질을 의미한다.
또한, 상기 Oct4 단백질 운반체 또는 Cbfβ 단백질 운반체는 Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질을 포함하는 나노입자, 리포좀, 마이셀, 또는 나노 에멀젼을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, Oct4 단백질 또는 Cbfβ 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달되거나, 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하거나 다른 세포 특이적인 타겟팅을 가능하게 하는 화학 물질 또는 펩타이드와 같은 생물학적 물질의 결합 등을 활용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 예컨대 DOTMA 또는 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명에서 벡터는 비-바이러스성 벡터일 수 있으며, 구체적으로 플라스미드일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 벡터는 직접교차분화를 유도하는 Oct4 유전자를포함하는 플라스미드 벡터, Cbfβ 유전자를 포함하는 플라스미스 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 방법은 체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "직접교차분화(Direct reprogramming, Direct conversion, Transdifferentiation)"는 전혀 다른　세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난)　세포간의 전환을 유도하는 과정이다. 직접교차분화 과정은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로　리프로그래밍하고 이를　재분화하여 목적하는　세포로 만들어야하는 과정과 달리,　유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는　세포로의 전환을 유도한다는 점에서 명확히 구별된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "체세포"는, 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 체세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 체세포는 섬유아세포, 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 혈관내피세포, 혈액세포, 성상교세포, 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 지방세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 체세포는 혈관내피세포, 중간엽 줄기세포, 지방세포, 및 섬유아세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 체세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 체세포를 배양하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 체세포 배양에 사용되는 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지이며, EGM-2 배지, MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), F12(Ham's F-12 medium) 배지, 혹은 DMEM과 F12를 혼합한 DMEM/F12 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 분화가 유도된 세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 Oct4 단백질 및 Cbfβ 단백질을 처리하여 체세포로부터 직접교차분화를 유도하여 생성된 조골세포는 골 질환 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골염(Osteitis) 및 골형성부전증(Osteogenesis Imperfecta)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "예방"은 병리학적 현상의 발생 빈도 또는 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 골다공증을 비롯한 골 질환 증상이 상기 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.
상기 "치료"는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 "개체"는 골다공증을 비롯한 골 질환을 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 인간을 포함하는 동물, 예를 들어 비-영장류(예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류(예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스(cynomolgous) 원숭이 및 침팬지)를 비롯한 포유동물을 나타낸다. 때에 따라서는 인간을 제외하는 개체일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 유효물질을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명의 유효물질은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유효물질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 소성물은 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것을 생각된다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다.
또한, 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다.
또한, 상기 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로 카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물의 환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 정맥에의 1회 내지 3회의 투여가 기본이지만 그 이상의 투여라도 좋다. 또, 투여 시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는, 주사제형, 경피투여형등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수있다.
또한, 본 발명의 유효물질의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 재조합 단백질 제조 방법
체세포에 Oct4 및 Cbfβ를 효과적으로 전달하기 위하여, 각각의 유전자에 세포투과성 펩타이드인 30Kc19을 결합하여 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19의 생산하였다.
구체적으로는, Oct4-30Kc19 단백질의 생산을 위해 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 Oct4 DNA sequence를 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 30Kc19 DNA sequence의 N-말단에 접합시키고 pET-23a 벡터에 삽입하여 6X Histidin tag를 가지는 재조합 벡터 pET-23a/Oct4-30Kc19를 제조하였다(도 1A 왼쪽).
Cbfβ-30Kc19 단백질의 생산을 위해서는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Cbfβ DNA sequence를 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 30Kc19 DNA sequence의 N-말단에 접합시키고 pET-23a 벡터에 삽입하여 6X Histidin tag를 가지는 재조합 벡터 pET-23a/Cbfβ-30Kc19를 제조하였다(도 1A 오른쪽).
Oct4-30Kc19 또는 Cbfβ-30Kc19은 EcoRI와 XhoI 사이에 삽입되었으며, 각각의 pET-23a 재조합 벡터는 Oct4 또는 Cbfβ 전사인자의 가용성 발현(soluble expression)을 위해 사용되었다.
E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI. USA)에 각 재조합 pET-23a 벡터를 전달하여 형질전환(transformation)을 유도한 후, 0.5mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG))가 포함된 Luria-Bertani(LB) 배지에서 25℃에서 16시간 동안 배양하여 재조합 전사인자 단백질의 발현을 유도하였다.
Oct4-30Kc19의 정제는 가용성 발현된 분획뿐 아니라 불용성 발현 후 재접힘 과정을 거쳐 다시 가용화된 분획에 대해서도 이뤄졌다. 가용성 Oct4-30Kc19 정제의 경우, 초음파 처리에 의해 용해된 세포를 원심분리하여 얻어낸 상층액을 히스티딘 태그(histidine-tag)-친화성 크로마토그래피(HisTrap HP, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 칼럼에 주입한 뒤 350mM imidazole이 포함된 완충액을 흘려주어 칼럼에 결합한 가용성 Oct4-30Kc19 융합단백질을 용출시킴으로써 이뤄졌다. 한편 불용성 Oct4-30Kc19 융합단백질의 경우, 세포 용해 후 원심분리하여 얻어낸 침전물을 6M 요소(urea)가 포함된 완충액으로 현탁하여 4℃에서 12시간 동안 보관하였다. 이를 다시 원심분리하여 얻어낸 상층액을 히스티딘 태그-친화성 크로마토그래피 칼럼에 주입 후, 완충액을 6M 요소가 포함된 완충액에서 요소가 포함되어 있지 않은 완충액으로 1시간에 걸쳐 지속하여 교환하였다(칼럼 상 재접힘, on-column refolding). 이후 마찬가지로 350mM imidazole이 포함된 완충액을 흘려 칼럼에 결합한 단백질을 용출시킴으로써 불용성 발현 후 재접힘(refolded)되어 다시 가용화된 Oct4-30Kc19 단백질을 정제할 수 있었다.
Cbfβ-30Kc19의 정제는 Oct4-30Kc19의 경우와 마찬가지로, 초음파 처리를 통해 세포를 용해 후, Cbfβ-30Kc19 융합 단백질을 Histidin tag-친화성 크로마토그래피 칼럼에 주입하였고 350mM imidazole이 포함된 완충액을 이용하여 칼럼에 결합한 Cbfβ-30Kc19를 용출시킴으로써 이뤄졌다.
정제된 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 재조합 단백질은 N-말단에는 단백질 발현량 증대를 위한 T7 태그(MASMTGGQQMG)가, C-말단에는 및 히스티딘 태그-친화성 크로마토그래피 정제를 위한 6X 히스티딘 태그(HHHHHH)가 결합되어 있다.
정제된 단백질을 최종적으로 무혈성 기본 배지인 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM, 대전, 웰전, 한국)에 대해 투석한 뒤, 분주하여 사용 시까지 -70℃에 보관하였다.
이와 같이 Oct4 및 Cbfβ의 C-말단에 30Kc19 단백질이 결합된 재조합 단백질인 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19을 정제하여 생산하였고 이를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분석하였다(도 1B).
염기서열 서열번호
Oct4 ATGGCGGGACACCTGGCTTCAGATTTTGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1
Cbfβ ATGCCGCGCGTCGTGCCCGACCAGAGAAGCAAGTTCGAGAACGAGGAGTTTTTTAGGAAGCTGAGCCGCGAGTGTGAGATTAAGTACACGGGCTTCAGGGACCGGCCCCACGAGGAACGCCAGGCACGCTTCCAGAACGCCTGCCGCGACGGCCGCTCGGAAATCGCTTTTGTGGCCACAGGAACCAATCTGTCTCTCCAGTTTTTTCCGGCCAGCTGGCAGGGAGAACAGCGACAAACACCTAGCCGAGAGTATGTCGACTTAGAAAGAGAAGCAGGCAAGGTATATTTGAAGGCTCCCATGATTCTGAATGGAGTCTGTGTTATCTGGAAAGGCTGGATTGATCTCCAAAGACTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTTTGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACAACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAAGGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGGAGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAGCTGCTGGCAGTAACTGGCAAGAAGACAACAAGACCC 2
30Kc19 GCAGATTCCGACGTCCCTAACGACATTCTGGAGGAGCAGCTTTACAATAGCGTCGTCGTCGCCGATTACGACAGTGCGGTTGAAAAGAGCAAGCATTTATACGGGGAGAAGAAGAGCGAAGTCATCACAAATGTCGTGAACAAACTGATACGAAGCAACAAGATGAACTGCATGGAGTACGCCTATCAACTTTGGCTCCAGGGCTCCAAGGACATCGTCCGGGATTGTTTCCCAGTTGAGTTCAGACTTATCTTCGCCGAAAACGCGATTAAGCTTATGTACAAGCGCGACGGTCTCGCTGTGACGCTGAGCAATGATGTTCAAGGCGACGATGGCAGACCTGCCTACGGCGACGGCAAGGACAAGACAAGCCCGAGAGTCAGCTGGAAGTTAATCGCTCTGTGGGAGAACAACAAGGTCTACTTCAAGATCTTGAACACTGAACGTAACCAATACTTGGTATTGGGAGTCGGCACTAACTGGAACGGCGACCATATGGCCTTCGGAGTCAACAGCGTCGATAGTTTCAGAGCCCAGTGGTACCTGCAGCCTGCTAAGTACGACAATGACGTCTTGTTCTACATCTACAACCGTGAATACAGCAAGGCTTTGACACTGTCGAGGACGGTTGAGCCCTCGGGTCACCGCATGGCCTGGGGACACAACGGCAGAGTAATCGGAAGTCCCGAACATTACGCTTGGGGTATAAAGGCTTTC 3
<실시예 2> 재조합 단백질의 안정성 평가
상기 실시예 1에서 생산된 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19의 안정성을 평가하였다.
구체적으로, DMEM에 용해된 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질을 37℃ 항온 수조에 두고 최대 48시간까지 보관하였다. 특정 시간이 지난 후 남아있는 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 뒤 Coomassie blue 염색을 통해 분해 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 이어서, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)의 직접적인 분화를 유도하기 위해 30Kc19을 이용하여 Oct4와 Cbfβ 단백질을 3회 연속 생산한 후 정제하였다. 정제된 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질의 농도는 BSA를 표준물질로 사용하여 측정하였으며, 단백질의 수율은 incubation sale과 total production에 의해 계산되었다.
그 결과 각각 Oct4 및 Cbfβ 재조합 단백질은 고온 조건(37℃)에서도 장기간 물리적 분해(physical degradation)가 일어나지 않았으며, 이를 통해 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19은 높은 고온 안정성을 가지는 것을 확인하였다(도 2). 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19의 수율은 각각 341.67 ± 28.87 μg /L, 5.125 ± 0.57 mg/L로 나타나 Oct4와 Cbfβ 전사인자의 생산을 향상시킬 수 있었다.
일반적으로 전사인자 단백질은 세포 내에서 공급이 계속되지 않아 전사인자 단백질 전달에 의한 체세포의 재프로그래밍을 유도하기 위해서는 재프로그래밍 유도 전사인자에 대한 반복적인 처리가 필요하다. 따라서 지속적으로 분화를 유도하려면 대량의 전사인자 단백질이 필요하지만, 전사인자 단백질은 다른 단백질과의 상호작용으로 인해 대량 생산이 어려운 것으로 알려져 있다.
Oct4 또는 Cbfβ 전사인자에 30Kc19을 결합하여 단백질을 생산하는 경우 가용성 발현뿐만 아니라 안정성도 증가하여 대량 생산이 가능하므로 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있다는 것을 확인하였다.
<실시예 3> Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19의 세포 투과성 및 세포 독성 평가
실시예 1에서 제조된 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19를 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 처리하여 세포 투과성 및 세포 독성을 평가하였다.
구체적으로 96-well plate에 HDF를 1×104 cells/cm2의 농도로 접종한 뒤 DEMM에 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin이 포함된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 phosphate-buffered saline(PBS)로 세포를 세척한 후, 각 농도의 Oct4-30Kc19와 Cbfβ-30Kc19 단백질이 포함된 DMEM을 세포에 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 살아있는 세포의 수를 추정하기 위해 500 μg/ml의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 용액을 처리함으로써 세포 내 미토콘드리아 활성에 따른 MTT formazan의 생성을 유도하였다. MTT 처리 후 4시간 뒤, 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 처리하여 불용성 formazan의 용해를 유도하였다. Formazan의 생성 정도는 spectrophotometer를 이용해 560nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였고 이를 단백질을 처리하지 않은 세포에서의 값과 비교해 세포 생존율을 표현하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Oct4-30Kc19와 Cbfβ-30Kc19 모두 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)에 처리하였을 때 세포 내부로 전달되는 것을 확인하였다. 또한, Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19은 각각 0~180 μg/ml 농도, 0~300 μg/ml 농도로 인간 피부 섬유아세포에 처리하였을 때 유의미한 세포 독성은 관찰되지 않았다.
<실시예 4> 체세포로부터 조골세포 직접교차분화 유도 방법
체세포에서 다능성을 유도하는 Oct4와 줄기세포에서 골형성을 촉진하는 Cbfβ 의 조합이 인간 피부 섬유아세포의 조골세포로의 직접적인 전환을 유도하는지 확인하기 위해, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)를 조골세포 분화유도 배지(osteogenic medium, O.M.)에 Oct4-30Kc19(최종 농도 60 μg/mL)과 Cbfβ-30Kc19(최종 농도 300 μg/mL)를 첨가하고 24시간씩 8번을 반복하여 처리하였다(도 4A 참조). 이후 O.M.을 이용하여 배양을 지속하였고 Oct4-30Kc19와 Cbfβ-30Kc19을 단독 또는 복합 처리한 지 21일 후, Alizarin Red S(ARS) 염색을 시행하여 조골세포 기능에 의한 칼슘 응집체 형성을 관찰하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Alizarin Red S 염색 결과, 단백질을 처리하지 않은 대조군(control) 뿐만 아니라, Oct4-30Kc19과 Cbfβ-30Kc19를 단일로 처리한 그룹에 비해 Oct4-30Kc19과 Cbfβ-30Kc19를 동시에 처리한 그룹에서 확연한 칼슘 침착 형성을 유의하게 유도하는 것으로 나타났다(도 5B, C). 또한, 상기 염색 정도를 정량적으로 분석한 결과, Oct4-30Kc19과 Cbfβ-30Kc19를 동시에 처리하는 경우 대조군과 비교하여 칼슘 침착물이 15배 많은 칼슘 침착물을 형성하였다(도 5D).
ARS는 이온 결합과 배위 공유 결합을 통해 Ca2+에 특이적으로 결합하기 때문에 조골세포에 형성된 칼슘 침착물을 분석할 수 있다. 따라서, 이러한 결과는 Oct4-30Kc19과 Cbfβ-30Kc19를 동시에 처리하는 경우 조골세포의 생성량이 현저히 증가한다는 것을 의미한다.
<실시예 5> Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19을 이용한 기능성 조골세포의 생성
이어서, Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 처리에 의해 생성된 칼슘 침착물을 시각화하기 위해 분화가 유도된 조골세포를 von Kossa 염색법으로 평가하였다. 구체적으로, 칼슘 침착물을 시각화하기 위해 실시예 4와 동일한 방법으로 배양된 세포(도 5A 참조)의 배양 24일 째에 인간 피부 섬유아세포로부터 분화가 유도된 조골세포를 PBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하였다. 그런 다음, 세포를 30분 동안 자외선에 노출시키면서 5% 질산은 용액에서 배양하였다. 배양된 세포는 DW로 3회 세척하고 5% 티오황산나트륨에서 3분 동안 다시 배양하여 미반응 질산은을 헹구고 DW로 다시 세척하였다. 마지막으로 시각화된 칼슘 침전물을 현미경으로 분석하였다. von Kossa 염색은 분산된 광물화를 회색으로, 칼슘 대량 퇴적물은 검은색으로 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Oct4-30Kc19 단독 처리는 분산된 칼슘 침착물을 형성한 반면, Oct4-30Kc19와 Cbfβ-30Kc19의 공동 처리는 인간 피부 섬유아세포의 직접 전환을 통해 대량 칼슘 침착을 유도하는 것으로 나타났다.
이어서, osteoimage mineralization assay kit(Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 분화가 유도된 조골세포의 광물화를 관찰하였다. 구체적으로, 세포를 PBS로 1회 세척하고 15분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 고정 후 각 웰을 DW로 2회 세척하고 염색 시약으로 암실에서 30 분간 염색하였다. 각 웰을 세척 완충액으로 세척하고 형광 현미경(Leica, Bensheim, Germany)을 사용하여 광물화된 부분을 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, von Kossa 염색 결과와 마찬가지로 Oct4-30Kc19와 Cbfβ-30Kc19 단백질을 공동으로 처리하였을 때 상당한 광물화가 관찰되었다(빨간색 화살표는 광물화된 부분을 나타낸다).
Runx2 전사 인자는 osteopontin, bone sialoprotein, collagen type I과 같은 조골세포 특이적 유전자의 발현을 조절하여 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 조골세포 분화를 유도한다. 또한, Runx2 전사인자와 Cbfβ 전사인자의 결합은 DNA 결합 친화도 증가 및 Runx2 단백질의 프로테아좀 분해 억제로 인해 Runx2 단백질의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, Oct4-30Kc19에 의해 다기능성이 회복된 인간 피부 섬유아세포는 Cbfβ-30Kc19에 의해 조골세포로의 분화를 유도했을 것으로 예상된다.
<실시예 6> Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19로 유도된 조골세포의 전사체 분석
Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질에 의해 유도된 조골세포 전사체의 변화를 확인하기 위해, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast), 1차 조골세포(primary osteoblast) 및 본 발명의 단백질에 의해 유도된 조골세포에 대한 mRNA 시퀀싱을 수행하였다.
mRNA 시퀀싱은 NucleoSpin RNA Plus RNA Isolation Kit(Macherey-Nagel, Allentown, PA, USA)를 사용하여 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질 처리 후 24일 동안 배양된 인간 피부 섬유아세포에서 total RNA를 분리하였다. Agilent 2100 bioanalyzer로 추출된 total RNA의 완전성(integrity)을 평가하였고, ND-2000 Spectrophotometer를 사용하여 RNA의 농도를 계산하였다. mRNA-seq 라이브러리는 QuantSeq 3’ mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen, Vienna, Austria)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 준비되었다. 준비된 라이브러리는 NextSeq 500 platform(Illumina, San Diego, CA., USA)에서 single-ended read를 사용하여 시퀀싱되었다.
QuantSeq 3’ mRNA-Seq read는 Bowtie2를 사용하여 homo sapiens reference genome에 해당되었다. Bowtie2 index는 게놈 및 전사체에 할당된 대표적인 게놈 어셈블리 시퀀스 또는 대표적인 전사 시퀀스에서 생성되었다. Alignment data는 전사체를 수집하고, mRNA 존재량(abundance)을 측정하고, 유전자의 차등 발현을 검출하는데 사용되었다. 차등 발현 유전자는 hierarchical heatmap을 통해 다양한 색상으로 시각화되었으며, Bedtools의 적용 범위를 사용하여 고유한 alignment 및 다중 alignment의 수를 기반으로 설정되었다. Read Count 파일은 Bioconductor를 이용한 R에서 EdgeR(R development Core Team, 2016)를 사용하여 quantile normalization방법에 따라 처리하였다. 유전자는 DAVID 및 Medline database를 기반으로 분류되었다.
그 결과, 1차 조골세포와 인간 피부 섬유아세포에서 완전히 다른 유전자 발현 패턴을 보였으며, Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질로 유도된 조골세포는 1차 조골세포와 유사한 유전자 발현 패턴을 보였다(도 8A).
또한, mRNA 시퀀싱에 의해 분석된 유전자 발현 경향은 principal component analysis(PCA)에 의해 시각화되었으며, 65%의 변이를 나타내는 첫 번째 주성분(PC1)은 단백질 유도 조골세포의 유전자 발현 경향이 1차 조골세포의 유전자 발현 경향에 더 가깝다는 것을 보여주었다(도 8B). 이러한 결과는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질의 세포 내 전달이 인간 피부 섬유아세포의 재프로그래밍을 통해 전사적 변화를 유도한다는 것을 나타낸다.
마지막으로, hierarchical heatmap을 통해 조골세포 특이적인 유전자의 발현 패턴을 분석한 결과 인간 피부 섬유아세포에 비해 1차 조골세포에서 상향 또는 하향 조절된 조골세포 특이적인 유전자는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질로 유도된 조골세포와 유사한 발현 패턴을 보였다(도 8C). 이러한 결과는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질의 조합이 인간 피부 섬유아세포의 전체 유전자 발현 패턴뿐만 아니라, 조골세포 특이적인 유전자 발현 패턴도 조절할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 7> Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 유도 조골세포의 골 재생
먼저, 효율적인 골 재생 및 단백질 유도 조골 세포의 전달을 위해 거대 다공성 젤라틴 크라이오겔이 제작되었으며(도 9A 참조), 8주령 수컷 BALB/c nude mice를 사용하여 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질 유도 조골 세포의 생체 내 골 재생을 평가하였다. 두개관(calvarial) 결손 모델에 사용된 쥐는 습도와 온도 조절이 가능한 방에 수용되었다. 이소플루란 흡입으로 마취된 mice를 절개하여 시상능(sagittal crest)을 노출시키고, dental handpiece(SAESHIN, Daegu, Korea)를 사용하여 직경 4mm를 제거하였다. 골 재생을 위해 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질이 처리된 인간 피부 섬유아세포를 젤라틴 크라이오겔에 5 X 105cells/cryogel의 밀도로 처리하고, 인간 피부 섬유아세포를 포함하는 크라이오겔을 결손 부위에 이식하였다(도 9B). 젤라틴 크라이오겔 이식 8주 후에 마우스의 두개골 조직을 수집하였다.
두개관(calvarial) 결손 모델의 골 재생을 정량화하기 위해, 수집된 두개골 조직을 Quantum-GX2-microCT를 사용하여 60 kV, 6.5 W, 0.5s의 노출시간으로 스캔하였다. 각 스캔 이미지는 Analyze 11.0 program(AnalyzeDirect)을 통해 재구성되었으며, 골 부피 및 섬유주 분리는 standard 3D morphometric parameter에 따라 결정되었다.
조직학적 분석은 Hematoxylin & Eosin staining kit(H&E, KPNT, Cheongju, Korea) 및 Masson's trichrome(MTC) staining kit(Newcomer Supply, Middleton WI, USA)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 두개골 조직을 염색하기 위해 채취한 조직 샘플을 10% 중성 완충 포르말린으로 24시간 동안 고정하고 0.5M ethylene-diamine-tetraacetic acid(EDTA, Santa Cruz, Dallas, TX, USA)을 사용하여 14일 동안 탈회하였다. 탈회된 샘플을 30% sucrose에서 24시간 동안 평형화하고 TissueTek O.C.T.(Sakura, Torrance, CA, USA)로 채워진 알루미늄 용기에 포매(embed)하였다. 동결 블록을 준비하기 위해 액체 질소를 사용하여 알루미늄 용기를 동결하고 조직 블록을 5 μm 두께로 절편하였다.
절편 슬라이드는 0.25% Triton-X100가 포함된 PBS로 15분 동안 투과화(permealbilized)한 후, PBS로 2회 세척하였다. 투과된 절편 슬라이드는 3% 소 혈청 알부민(BSA, Cytiva)에서 1시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 세척한 후 샘플을 1% BSA에서 OPN(Santa Cruz)(1:1000 희석) 또는 OCN(Santa Cruz)(1:1000 희석) 항체로 4°C에서 밤새 처리하였다. 그 후 항-마우스 이차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 1% BSA에서 25°C에서 1시간 동안 처리하였으며, 마지막으로 세포핵 염색을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma-Aldrich) 염색을 하여 형광현미경을 통해 형광영상을 얻었다.
그 결과, micro-CT 3D 영상에서 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19로 유도된 조골세포가 HDF에 비해 골 재생 효과가 있음을 보여주었다(도 10A). 또한 골 부피의 정량적 분석 결과 HDF와 비교하여 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 유도 조골 세포에서 우수한 골 재생이 관찰되었다(도 10B). micro-CT 3D 영상과 유사하게 두개관 결손 부위의 직경인 인 섬유주 분리(Trabecular separation)는 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 유도 조골세포에서 유의하게 감소하였다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이 MTC 염색 결과 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 유도 조골세포에서 대조군(인간 피부 섬유아세포, HDF)에 비해 조골세포에서 분비하는 콜라겐을 의미하는 청색이 더 많이 관찰되었으며, 노란색 화살표로 표시된 새로 형성된 뼈는 기존 뼈 조직과 유사한 조밀한 뼈 조직 재생을 보였다. 반면에 대조군에서는 H&E 염색이 전혀 되지 않아 MTC 염색에서 나타난 청색 부분은 콜라겐 가수분해에 의해 생성된 cell-loaded gelatin cryogel일 가능성을 보여주었다. 이를 통해 Oct4-30Kc19 및 Cbfβ-30Kc19 단백질의 처리는 생체 내에서 osteopontin, bone sialoprotein, osteocalcin과 같은 조골세포 특이적 단백질 발현을 통해 두개관(calvarial) 결손 모델 마우스에서 뼈 조직 재생을 촉진한다는 것을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질을 포함하는, 체세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Oct4 단백질 및 Cbfβ 단백질은 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 융합된 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 조골세포 분화 유도용 조성물.
  3. Oct4(OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산이 도입된 벡터 중 1종 이상의 Oct4 발현 촉진 인자; 및 Cbfβ(Core binding factor β) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 Cbfβ 발현 촉진 인자;를 체세포에 처리하는 단계;를 포함하는, 체세포로부터 조골세포 유도 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 방법은 체세포로부터 조골세포로 직접교차분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 조골세포 유도 방법.
  5. 제3항 또는 제4항의 방법으로 분화가 유도된 세포를 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골염(Osteitis) 및 골형성부전증(Osteogenesis Imperfecta)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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