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KR20220117267A - Tgf-베타-rii 결합 단백질 - Google Patents

Tgf-베타-rii 결합 단백질 Download PDF

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KR20220117267A
KR20220117267A KR1020227023748A KR20227023748A KR20220117267A KR 20220117267 A KR20220117267 A KR 20220117267A KR 1020227023748 A KR1020227023748 A KR 1020227023748A KR 20227023748 A KR20227023748 A KR 20227023748A KR 20220117267 A KR20220117267 A KR 20220117267A
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gly
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seq
amino acid
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KR1020227023748A
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마크 스로스비
Original Assignee
메뤼스 엔.페.
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Abstract

본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 생산하는 단리된 세포, 및 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

TGF-베타-RII 결합 단백질
본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환 성장 인자-베타 수용체 II (TGF-βRII)에 결합하는 단백질 및 인간의 치료, 특히 암의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
형질전환 성장 인자-β (TGF-β)는 TGF-β 슈퍼패밀리의 신호전달 분자 부분이다. 다양한 세포 기능을 조절하는 세 가지 TGF-β 리간드 (TGF-β1, 2 및 3)가 있다. TGF-β 신호전달은 정상 세포에서는 종양 억제 역할을 하지만 악성 세포에서는 종양 촉진 역할을 할 수 있다. 그들은 증식, 이동, 분화, 세포자멸사, 혈관신생 및 상피-중간엽 전이와 같은 과정에서 역할을 한다 (Bierie and Moses, 2006. Siegel and Massague, 2003). 이러한 신호는 TGF-β 수용체 유형 2 (TGF-βRII)에 대한 결합을 통해 매개되고, 이는 TGF-βRI과의 이량체화 및 인산화를 유도한다. 2개의 TGF-βRII와 2개의 TGF-βRI으로 구성된 이러한 이종사량체 복합체는 SMAD2 및 SMAD3를 모집하고 인산화하고, 이는 차례로 공동-SMAD 분자 SMAD4를 모집하고 결합하여 SMAD/공동-SMAD 복합체를 형성하고 핵으로 전위되어 여기서 TGF-β 표적 유전자의 전사를 조절한다 (Hata and Chen, 2016. Vander Ark, Cao et al., 2018).
높은 수준의 TGF-β 발현은 암의 나쁜 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다. TGF-β는 암세포의 이동과 전이를 촉진하는 상피-중간엽 전이를 유도할 수 있다. 유전자 발현 프로필은 TGF-β 신호전달이 결장직장암의 간 전이에서 중요한 경로임을 나타낸다 (Jung, Staudacher et al., 2017). 또한, 기질-상피 상호작용이 암 진행에 역할을 하는 것으로 보고되었다. 고형 종양에서 발견되는 풍부한 기질 세포 구성요소는 암 관련 섬유아세포 (CAF)로, 종양의 스캐폴드 역할을 할 수 있는 세포외 기질을 구축 및 리모델링하는 것뿐만 아니라 면역 회피에 기여하고 종양 발달 및 성장을 촉진한다 (Quail and Joyce, 2013). 종양 유래 TGF-β1은 친종양 형성 기질 환경을 촉진할 수 있는 TGFβRII에 결합하여 섬유아세포의 '활성화된' CAF로의 전환분화를 유도한다.
현재까지 CAF 및 종양의 비정상적인 TGF-β 신호전달 특성을 억제하기 위해 TGF-β 신호전달 경로를 표적으로 하는 기존 방식은 차선의 효능 및/또는 발달 부담을 갖는다. 하나의 항-TGF-βRII 단일클론 항체는 WO2010/053814에 개시된 LY3022859이고, 이는 TGF-βRII의 엑토도메인을 차단하는 것으로 보고되었다. 그러나 I 상에서의 용량 증량 연구는 사이토카인 방출 증후군을 유발했으며 진행성 고형 종양 환자에게 안전하지 않은 것으로 간주되었다. WO2012/093125에 개시된 또 다른 제제는 반감기가 더 짧은 항-TGF-βRII 단일 가변 도메인이고 이 분자의 정확한 작용 기전 또는 결합 도메인은 확립되어 있지 않는다. 현재까지 TGF-β 종양 조절의 복잡성과 다면적 특성으로 인해 약물 개발이 어려워 임상 시험을 성공적으로 거친 항-TGF-βRII 항체가 없었다 (Hao, Baker et al., 2019).
본원에서, 우리는 TGF-βRII에 결합할 수 있는 새로운 중쇄 가변 영역, 중쇄, Fab 및 전장 IgG 단일특이적 항체를 설명한다. 이들 항체 또는 이들 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 TGF-βRII의 새로운 위치를 표적으로 하고, 수용체와 리간드 사이의 상호작용을 차단하고, 이는 기존 항체에 비해 개선된 것이다.
본 발명의 목적은 인간 질병의 치료, 특히 암의 치료를 위한 새로운 약제를 제공하는 것이다. 이러한 목적은 본원에 기술되고 청구된 바와 같이, 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편, 및 특정 결합 도메인의 제공에 의해 충족된다.
제1 양태에서, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 동형(isoform) A의 위치 25 또는 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 50에 있는 페닐알라닌 (F)이 결합에 중요한 잔기인, 인간 TGF- βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다.
바람직하게는, 이러한 항체 또는 항체 단편은 TGF-βRII에 결합하고, 인간 TGF-β가 인간 TGF-βRII에 결합하는 것을 차단하거나 억제함으로써, 세포로의 신호 전달을 억제하고, TGF-βRII의 이종이량체화를 차단 또는 억제한다.
제2 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 생산하는 세포에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 암의 예방, 증상 진행 또는 재발의 억제 및/또는 치료용 약제에 관한 것이고, 상기 약제는 활성 성분으로서 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
제6 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
제7 양태에서, 본 발명은 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 세포에 제공하고 항체 또는 항체 단편이 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하는 것을 허용하여, 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단하는 단계를 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 세포의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합에 의해 유도된 세포로의 신호 전달을 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 제공하고 세포에 항체 또는 항체 단편이 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하는 것을 허용하여, 세포로의 신호 전달을 억제하는 단계를 포함한다.
제9 양태에서, 본 발명은 전이를 예방하거나 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 IGKV1-39 경쇄 가변 V 영역 (도 1a); IGKV1-39/jk1 경쇄 가변 영역 (도 1b); 및 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변 영역 (도 1c)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 CCD18Co 세포에서 내인성으로 발현된 TGF-βRII에 대한 항체 결합의 FACS 데이터를 나타낸다. 도 2a는 서열 번호 92 (음성 대조군); 서열 번호 93; 및 서열 번호 94를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 MFI PE를 나타낸다. 도 2b는 서열 번호 92 (음성 대조군); 서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 12; 서열 번호 95; 및 서열 번호 96을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 MFI PE를 나타낸다.
도 3은 서열 번호 92 (음성 대조군); 서열 번호 93; 및 서열 번호 94를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 (도 3a), 및 서열 번호 92 (음성 대조군); 서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 12; 서열 번호 95; 및 서열 번호 96을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 리간드 차단 활성의 ELISA 데이터를 나타낸다 (도 3b).
도 4는 서열 번호 10 (중간 정렬); 서열 번호 11 (하단 정렬); 및 서열 번호 12 (상단 정렬)와 각각의 친화도 성숙된 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄의 Vector NTI Program Advance 11.5.2 소프트웨어의 AlignX 응용프로그램을 사용하여 생성된 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 동일한 아미노산은 흰색 배경에 검은색 글자로 표시되고; 약하게 유사한 아미노산은 회색 배경에 흰색 글자로 표시되고; 보존적 변화는 회색 배경에 검은색 글자로 표시되고; 유사하지 않은 아미노산은 어두운 회색 배경에 흰색 글자로 표시된다.
도 5는 모 항체 (서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 12) 및 친화도 성숙 변이체 (서열 번호 10 변이체; 서열 번호 11 변이체; 서열 번호 12 변이체)의 결합 친화도를 나타낸다. ka = 1/Ms 단위의 온 레이트. kd = 1/s 단위의 오프 레이트.
도 6은 친화도 성숙 변이체의 루시페라아제 리포터 검정에서 얻은 데이터를 나타낸다. X축은 항체의 농도를 μg/ml 단위로 나타낸다. Y축은 TGF-β 신호전달 억제의 척도로서 Smad 복합체의 배수 유도를 나타낸다. 그래프 A-K는 각각 친화도 성숙 변이체의 활성을 대조군 항체 (서열 번호 97)와 비교한다. 기저 TGF-β는 세포의 TGF-β 자극의 대조군으로 포함된다.
도 7은 알라닌 스캔의 데이터를 나타낸다. 도 7a는 중요한 잔기를 식별하고 매핑하는 방법에 대한 개요를 나타낸다. 도 7b는 야생형과 비교한 백분율로서, 서열 번호 10; 서열 번호 12; 및 서열 번호 93의 평균 형광을 나타낸다. 도 7c는 야생형과 비교한 백분율로서, 서열 번호 10; 서열 번호 12; 서열 번호 93; 및 서열 번호 98 (대조군)의 결합 반응성을 나타낸 표이다. 결합에 중요한 잔기는 직사각형으로 표시된다. 도 7d는 TGFβRII에 대한 중요한 잔기의 매핑을 나타낸다.
도 8은 TGF-β 리포터 검정에서 본 발명의 TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는 다양한 이중특이적 항체를 선별한 결과를 나타낸다. X축은 항체의 농도를 μg/ml 단위로 나타낸다. Y축은 Smad 신호전달의 접힘 유도를 나타낸다. 그래프 A-E는 각각 단일 TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체의 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 TGF-βRII에 대한 리간드 결합을 차단하는 것으로 알려진 양성 대조군 항체 (+)와 비교한다. 기저 TGF-β는 세포의 TGF-β 자극의 대조군으로 포함된다.
A) △ 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; □ 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; ● 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인.
B) ○ 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; * 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; □ 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; ● 서열 번호 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; △ 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인.
C) * 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; ○ 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; ● 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; □ 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; △ 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인.
D) ● 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인; □ 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인.
E) ● 서열 번호 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인.
일반적으로, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 단백질, 특히 항체 또는 그의 항체 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체가 단리된다. 바람직하게는, 항체는 단일클론 항체이다. 보다 바람직하게는, 항체는 단리된 단일클론 항체이다.
"단리된 단일클론 항체"는 클론 세포에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 단리된 항체의 예는 친화도 정제된 항체, 시험관 내 하이브리도마 또는 다른 세포주에서 생산된 항체, 및 형질전환 비-인간 동물로부터 유래된 인간 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 가변 영역은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 및 4개의 프레임워크 영역 (FR)을 포함하고, 바람직하게는 인간 또는 인간화된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인으로 구성되고: CH1, CH2 및 CH3; 임의의 유기체, 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있다. 중쇄 불변 영역의 CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지 영역을 통해 연결된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 카파 (K) 또는 람다 (λ)의 두 가지 유형일 수 있고, VH와 마찬가지로 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 인간 또는 인간화된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인으로 구성되고: CL; 임의의 유기체, 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있다. 2개의 중쇄는 2개의 힌지 영역 사이의 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 CH1 및 CL 영역 사이의 이황화 결합에 의해 경쇄와 쌍을 이룬다. 통상적인 항체에서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄는 동일하여 항체에 2개의 동일한 항원 결합 부위를 제공한다.
항체 결합은 특이성 및 친화도를 포함하는 다양한 특성을 갖는다. 특이성은 항체 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 항원 또는 이의 에피토프를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합 강도에 대한 척도이다.
"인간" 항체는 모든 항체 도메인이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 인간 항체는 인간 항체를 생산하도록 형질전환된 마우스, 예를 들어, Humab 마우스, KM 마우스, Xeno 마우스, Tc 마우스, 또는 MeMo® 마우스 (WO2009/157771)를 사용하는 방법으로 생산될 수 있다. 인간 항체는 또한 인간 면역 세포가 면역화 시 인간 항체 반응이 일어나도록 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다.
"인간화" 항체 영역은 예를 들어, 마우스 또는 닭과 같은 인간 이외의 동물의 생식계열로부터 유래된 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 서열을 인간 항체의 인간 프레임워크 서열에 이식함으로써 제조된 항체를 지칭한다. 또한, 인간화 항체는 항체 생산 하이브리도마로부터 단리된 항체의 CDR 영역을 암호화하는 핵산을 공지된 방법을 사용하여 인간 유래 항체의 프레임워크 영역을 암호화하는 핵산에 연결함으로써 생산할 수 있다.
항체는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 특히 그의 특이적 CDR을 통해 항원에 결합할 수 있다. 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR은 항원의 "항원 결정기"라고도 하는 "에피토프"에 결합한다. 에피토프는 각각 선형 및 형태적 에피토프라고 하는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속적인 선형 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출되면 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리하면 형태가 손실된다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 구조에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있다.
"항원"은 일반적으로 숙주 유기체에서 면역 반응을 유도하여 항원에 대한 특이성을 갖는 항체를 생성할 수 있는 분자이다. 분자 수준에서, 항원은 항체의 항원 결합 부위에 결합되는 능력을 특징으로 한다. 항원은 항체의 항원 결합 부위에 결합되는 능력을 특징으로 한다, 항체의 항원 결합 부위는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 특히 그의 CDR에 의해 형성된다. 항원은 적어도 하나의 에피토프를 포함하지만 종종 더 많은 에피토프를 포함한다.
또한, 항원의 혼합물은 '항원'으로 간주될 수 있고, 통상의 기술자는 때때로 종양 세포의 용해물 또는 바이러스 입자가 '항원'으로 표시될 수 있는 반면 이러한 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자 제제는 많은 항원 결정기로 존재한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에서, 항원은 인간 TGF-βRII이다. 인간 TGF-βRII는 상이한 동형이 있는 막횡단 단백질이다. 인간 TGF-βRII 동형 A의 아미노산 서열은 서열 번호 101로 제공되고; 인간 TGF-βRII 동형 A의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 102로 제공된다. 인간 TGF-βRII 동형 B는 세포외 도메인의 삽입으로 인해 더 긴 동형을 암호화하는 스플라이스 변이체이다. 인간 TGF-βRII 동형 B의 아미노산 서열은 서열 번호 103으로 제공되고; 인간 TGF-βRII의 동형 B의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 104에 제시된 바와 같다.
TGF-βRII는 세린/트레오닌 단백질 키나제 계열 및 TGFB 수용체 하위 계열의 구성원이다. TGFBR2, AAT3, FAA3, LDS1B, LDS2, LDS2B, MFS2, RIIC, TAAD2, TGFR-2, TGF베타-RII, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2, 및 TBR-ii, TBRII를 비롯한, 다양한 동의어로 알려져 있다. TGF-βRII는 다른 수용체 단백질과 이종이량체 복합체를 형성하고, TGF-베타에 결합한다. 이 수용체/리간드 복합체는 단백질을 인산화한 다음, 핵으로 진입하고 세포 증식과 관련된 유전자 하위 집합의 전사를 조절한다.
항체는 특정 결합 친화도로 항원에 결합한다. "결합 친화도"는 하기 식에 의해 계산된 해리 상수 (KD): koff/kon에 의해 결정되고, 항체-항원 상호작용의 강도를 지칭한다. 원하는 생물학적 활성에 따라, 항체는 그의 높은 및/또는 낮은 kon 및/또는 koff 속도를 기반으로 선택될 수 있다.
"항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄의 기능적 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 기능적 단편은 항체 중쇄 또는 경쇄의 CDR로부터 유래되거나 이에 기초하여 합성된 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 항체 단편은 예를 들어 Fab, F(ab')2, scFv, 미니바디, 또는 sdAb일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. "항체 단편"은 항체의 기능적 부분을 포함하는 단백질성 모이어티를 추가로 지칭한다. 본 경우에, 본원에 기재된 적어도 중쇄 가변 영역, 또는 HCDR 중 하나 이상. 항체 단편은 단일 사슬 Fv, 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®), VHH, Anticalins®, Nanobodies®, BiTE®, Fab, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR 유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, MicroProteins, Fynomers®, Centyrins® 또는 KALBITOR®을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 결합제일 수 있다.
"Fab"는 전형적으로 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, CH1 및 CL 영역을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.
"F(ab')2"는 일반적으로 힌지 영역에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.
"단일 사슬 가변 단편" (scFv)은 일반적으로 링커, 예를 들어, 약 10 내지 약 25개 길이 아미노산의 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.
"미니바디(minibody)"는 전형적으로 2개의 scFv 및 CH3 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.
"단일 도메인 항체" (sdAb)는 전형적으로 항체의 VH 또는 VL 도메인만을 포함하는 결합 도메인을 의미하고, 일반적으로 Fc 영역의 일부에 융합되거나 그렇지 않으면 연결된 것이다. 전체 항체와 마찬가지로, 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단일 도메인 항체 단편은 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체에서 조작될 수 있다; 이들은 때때로 VHH 단편 (Nanobodies®)이라고 한다. 일부 어류는 또한 중쇄 단독 항체 (IgNAR, '면역글로불린 신규 항원 수용체')를 가지고 있으며, 이로부터 VNAR 단편이라고 하는 단일 도메인 항체 단편을 얻을 수 있다. 대안적인 접근법은 인간 또는 마우스의 일반적인 면역글로불린 G (IgG)의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 단일 도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 도메인을 기반으로 하지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디도 표적 에피토프에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 나노바디도 본 발명에 포함된다.
"항체 단편"은 또한 적어도 하나의 CDR을 지칭하고, 여기서 적어도 하나의 CDR은 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 작제물의 일부이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 CDR은 HCDR3이다. 한 구현예에서, 단백질 작제물은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단백질 작제물은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 단백질 작제물은 CH2 및/또는 CH3을 포함하는 Fc 영역의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 단백질 작제물은 또한 CH1 영역을 포함할 수 있다. CH1, CH2 및/또는 CH3 영역은 항원 결합 및/또는 효과기 기능과 관련하여 원하는 특성을 얻도록 조작될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 변이체를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 "변이체"는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 그의 유도체 또는 유사체의 적어도 기능적 부분을 포함한다. 이러한 기능적 부분, 유도체 또는 유사체는 본원에 기재된 바와 같은 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편의 적어도 결합 도메인을 포함한다. 변이체는 CDR 중 하나 이상에 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기는 보존적 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 변이체는 또한 하나 이상의 프레임워크 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변이체는 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 VH 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 영역을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 VL 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 영역을 포함한다.
본원에서 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭하는 "퍼센트(%) 동일성"은 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬한 후, 선택된 서열의 잔기와 동일한 후보 서열의 잔기의 백분율로 정의된다. 2개의 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위해 갭이 비교되는 2개의 서열 중 임의의 것에 도입될 수 있다. 이러한 정렬은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 대안적으로, 정렬은 더 짧은 길이, 예를 들어 약 20개, 약 50개, 약 100개 이상의 핵산/기반 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 서열 동일성은 보고된 정렬 영역에서 두 서열 간의 동일한 일치의 백분율이다.
서열 비교 및 두 서열 간의 서열 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 당업자는 2개의 서열을 정렬하고 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위해 여러 다른 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다는 사실을 알고 있을 것이다 (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1 -44 Addison Wesley).
특히, 2개의 핵산 서열 사이에 본 발명에 따른 퍼센트 서열 동일성은 기본 설정을 사용하여 Vector NTI Program Advance 11.5.2 소프트웨어의 AlignX 응용프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 수정된 ClustalW 알고리즘 (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680), swgapdnamt 점수 매트릭스, a15의 갭 개방 패널티 및 6.66의 갭 확장 패널티를 사용한다. 아미노산 서열은 기본 설정을 사용하여 Vector NTI Program Advance 11.5.2 소프트웨어의 AlignX 응용프로그램을 사용하여 정렬될 수 있고, 이는 수정된 ClustalW 알고리즘 (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994), blosum62mt2 점수 매트릭스, 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 확장 패널티를 사용한다.
변이체는 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 결합 특이성, 예를 들어 항원 특이성을 유지한다. 그러나, 변이체의 결합 친화도는 본 발명의 원래 항체 또는 항체 단편의 결합 친화도와 상이할 수 있다. 변이체는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편보다 더 낮거나 더 높은 Kon 및/또는 Koff 속도를 가질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 기능적 유도체는 항체 모방체, 폴리펩티드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 단백질 또는 압타머는 일반적으로 하나의 표적에 결합한다. 이들 항체, 항체 모방체, 폴리펩티드 및 압타머의 임의의 조합은 당업계에 공지된 방법에 의해 함께 연결될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 융합 단백질의 접합체 또는 일부이다.
항체 모방체는 항체와 마찬가지로, 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 구조적으로 항체와 관련이 없는 폴리펩티드이다. 항체 모방체는 일반적으로 몰 질량이 약 3 내지 20kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 어피바디 분자 (전형적으로 단백질 A의 Z 도메인 기반); 아필린 (일반적으로 감마-B 결정 또는 유비퀴틴 기반); 아피머 (전형적으로 시스타틴 기반); 아피틴 (전형적으로 설포로부스 아시도칼다리우스의 Sac7d 기반); 알파바디 (전형적으로 삼중 나선 이중 코일 기반); 칼날린 (전형적으로 리포칼린 기반); 아비머 (전형적으로 다양한 막 수용체의 A 도메인 기반); DARPin (전형적으로 키린 반복 모티프 기반); 파이노머 (전형적으로 Fyn 7의 SH3 도메인 기반); 쿠니츠 도메인 펩티드 (전형적으로 다양한 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인 기반); 및 모노바디 (전형적으로 피브로넥틴의 III형 도메인 기반)이다.
모노바디는 피브로넥틴 III형 도메인 (FN3)을 분자 스캐폴드로 사용하여 구성된 합성 결합 단백질이다. 모노바디는 표적 결합 단백질을 생성하기 위한 항체의 대안이다. 모노바디 및 다른 항체 모방체는 일반적으로 파지 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 효모 표면 디스플레이와 같은 분자 디스플레이 및 유도 진화 기술을 사용하여 스캐폴드의 일부가 다양화된 조합 라이브러리에서 생성된다.
압타머는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 앱타머는 일반적으로 대규모 무작위 시퀀스 풀에서 선택하여 생성되지만, 천연 앱타머는 리보스위치에도 존재한다. 압타머는 고분자로서 기초 연구와 임상 목적 모두에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 IgG 항체, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 가장 바람직하게는, 항체는 IgG1 항체이다. 이러한 전장 IgG 항체는 유리한 반감기 및 면역원성의 이유로 완전한 자가 (인간) 분자에 가깝게 유지하고자 하기 때문에 바람직하다. IgG1은 사람의 긴 순환 반감기를 기반으로 선호된다.
본 발명에 따른 용어 '전장 IgG' 또는 '전장 항체'는 본질적으로 완전한 IgG를 포함하는 것으로 정의되지만, 이는 온전한 IgG의 모든 기능을 반드시 가질 필요는 없다. 의심의 여지를 없애기 위해, 전체 길이의 IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 각 사슬은 불변 (C) 및 가변 (V) 영역을 포함하며, 이는 CH1, CH2, CH3, VH 및 CL, VL로 지정된 도메인으로 나눌 수 있다. IgG 항체는 Fab 부분에 포함된 가변 영역 도메인을 통해 항원에 결합하고, 결합 후에는 불변 도메인을 통해, 대부분 Fc 부분을 통해 면역계의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특징을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 IgG 분자를 포함한다.
전장 IgG는 상이한 중쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로부터의 단일특이적 또는 다중특이적 항체 생성을 위한 동종이량체화 또는 이종이량체화를 증가시키기 위해, 항체 의존성 세포독성 (ADCC), 또는 세포 의존성 세포독성 (CDC)을 포함하는, 이러한 기능을 증가 및 완화하는 효과기 기능을 조절하기 위해, 및 이러한 숙주 세포에 의해 생성된 항체 또는 항체 단편의 분리를 용이하게 하기 위해 불변 영역에 변이를 함유할 수 있다.
예를 들어, EU 넘버링 시스템에 따라 위치 235 류신이 글리신으로 치환될 수 있고/거나 EU 넘버링 시스템에 따라 위치 236 글리신이 아르기닌으로 치환될 수 있다. 이러한 변형(들)은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합이 제거되거나 감소되도록 한다. 당업계에서 동일한 효과를 내는 것으로 알려진 CH2 및 Fc 영역의 다른 변형도 본 발명에 포함된다.
전장 IgG는 영역의 상당 부분이 결실되어서는 안 된다. 그러나, 생성된 IgG 분자의 결합 특성을 본질적으로 변경하지 않으면서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실된 IgG 분자는 "전장 IgG"라는 용어에 포함된다. 예를 들어, 이러한 IgG 분자는 바람직하게는 비-CDR 영역에서 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 결실을 가질 수 있고, 여기서 결실된 아미노산은 IgG의 결합 특이성에 필수적이지 않다.
예를 들어, EU 넘버링 시스템에 따라 위치 447의 라이신이 결실될 수 있다. 이러한 결실은 항체의 이질성을 감소시킨다. 또한, IgG4 항체 분자의 맞교환을 억제하기 위해, EU 넘버링 시스템에 따라 위치 228의 힌지 영역에 위치한 세린을 프롤린으로 치환할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편에 사용하기에 적합한 경쇄는 동족 경쇄로 지칭되는, 항원에 의한 면역화에 반응하여 생성되는 경쇄, 또는 이에 기초하여 합성적으로 생성된 경쇄를 포함한다. 적합한 경쇄는 또한 기존 항체 라이브러리 (습식 라이브러리 또는 인실리코)에서 가장 일반적으로 사용되는 경쇄를 선별하여 식별할 수 있는 것과 같은 공통 경쇄 (cLC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 중쇄의 에피토프-결합 도메인의 친화도 및/또는 선택성과 실질적으로 간섭하지 않지만, 중쇄 어레이와 쌍을 이루는 데에도 적합하다. 공통 경쇄는 재배열되지만 체세포 과돌연변이를 겪지 않거나 최소한으로 겪는 V- 및 J 유전자 절편의 생식계열 서열에 의해 바람직하게 암호화된다. 예를 들어, 적합한 경쇄는 게놈에 통합된 공통 경쇄를 갖고 중쇄에서 다양성을 갖는 공통 경쇄 항체의 대형 패널을 생성하는 데 사용할 수 있고 상기 항원에 노출시 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 MeMo®와 같은 유전자도입 비인간 동물의 경쇄를 포함한다.
따라서 용어 "공통 경쇄"는 2개 이상의 상이한 중쇄와 회합될 수 있고 항원에 대한 결합 능력을 나타내는 경쇄를 지칭한다 (예를 들어 WO2009/157771, WO2019/190327 및 WO2014/051433 참조). 그러한 공통 경쇄에 대한 바람직한 경쇄 V 유전자는 IGKV1-39이다. 바람직한 경쇄 J 유전자는 jk1 및 jk5이다. 결합된 서열은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 표시되고; 대체 이름은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01이다 (imgt.org의 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법. 공통 경쇄의 바람직한 예는 인간 κ 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (IMGT 데이터베이스의 명명법) 생식계열 유전자 (이하, "IGVK1-39/JK1 공통 경쇄"로 약칭), 뿐만 아니라 IgVκ1-39*01/IGJκ5에 의해 암호화된 경쇄를 포함한다. 상기 언급한 다양한 MeMo® 형질전환 동물은 IGVK1-39/JK1 공통 경쇄를 포함한다.
본 발명에 따른 공통 경쇄는 또한 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 결합 특이성이 영향을 받지 않으면서 동일하거나 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 당업자는 "공통"이 또한 아미노산 서열이 동일하지 않은 경쇄의 기능적 등가물을 지칭한다는 것을 인식할 것이다. 기능적 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 모 공통 경쇄와 비교하여 변화가 존재하는 상기 경쇄의 변이체가 존재한다. 따라서 이러한 변이체는 또한 상이한 중쇄에 결합하고 기능적 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변화, 동족 사슬 등과 짝을 이룰 때 결합 특이성에 부분적으로만 기여하거나 기여하지 않는 영역 등에서 아미노산의 변화를 도입하고 시험함으로써 동일하지는 않지만 여전히 기능적으로 동등한 가변 경쇄를 제조하거나 찾는 것이 예를 들어 본원에 사용된 공통 경쇄의 정의 범위 내에서 가능하다. 따라서 이러한 변이체는 또한 상이한 동족 사슬에 결합하고 기능적 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 '공통 경쇄'는 중쇄와 짝을 이룬 후 생성된 항체의 결합 특이성을 유지하면서 동일하거나 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 특정 공통 경쇄 및 이러한 기능적으로 등가인 변이체의 조합은 "공통 경쇄"라는 용어에 포함된다. 공통 경쇄의 사용에 대한 상세한 설명은 WO 2004/009618, WO2019/190327 및 WO2009/157771을 참조한다. 바람직하게는, 생식계열 유사 경쇄, 보다 바람직하게는 생식계열 경쇄, 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄, 가장 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39/Jκ 또는 IGVκ3-20/Jκ인 공통 경쇄가 본 발명에서 사용된다.
항체 또는 항체 단편은 예를 들어 하이브리도마 방법을 사용하여 하이브리도마로부터 생산될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 항체 단편은 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 단편을 공동-발현하는 포유동물 세포로부터의 분비에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 비인간 동물을 면역화함으로써 생산된다. 이들 및 기타 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 생산하기 위해 적합하게 사용될 수 있다.
항체는 다양한 동물 종에서 생산될 수 있다. IGVK1-39/JK1 공통 경쇄를 포함하는 상기 언급된 MeMo® 유전자이식 동물이 적합하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자이식 마우스는 인간 표적 DNA 및/또는 단백질로 면역화한 후 면역 부스트를 수행함으로써 항원-특이적 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 생성한다. 면역화된 마우스로부터의 혈청 역가는 ELISA 및 FACS 분석에 의해 결정될 수 있다. 그런 다음 면역화된 마우스의 비장 및 배수 림프성 물질을 수집하고 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다. RNA는 단리될 수 있고 이러한 항체의 중쇄 및/또는 가변 영역을 암호화하는 cDNA가 합성될 수 있다. 그런 다음 VH 및/또는 VL-패밀리 특이적 PCR을 수행하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 그런 다음 예를 들어 Kingfisher 선택 로봇을 사용하여 인간 표적 단백질 결합 Fab를 선택할 수 있다. 표적 단백질에 결합하는 Fab의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
유전자이식 유기체의 면역화로 항체가 생성되는 경우가 있지만, 그러한 항체가 인간과 유전자이식 동물에 대해 교차 반응을 나타내지 않아 이러한 항체의 분석 및 시험의 효율성이 떨어지는 경우가 있다. 따라서, 가변 영역 및/또는 상보적 결정 영역 (CDR)을 함유하는 키메라 또는 인간화 결합 도메인 또는 항체를 비롯한 결합 도메인 또는 항체, 및 진화적으로 인간과 거리가 먼 종의 핵산을 기반으로 하거나 파생되거나 획득된 상기 가변 영역 또는 CDR을 암호화하는 핵산을 수득하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 가변 영역의 한 가지 잠재적인 공급원은 조류, 예를 들어 닭, 오리 또는 타조와 같은 가축일 수 있다. 조류, 예를 들어 닭, 오리 또는 타조의 면역화를 통해 생성된 항체 레퍼토리는 마우스 또는 인간과 진화적으로 가까운 다른 종 (예를 들어, 설치류 및 시노몰구스)의 면역화를 통해 생성된 항체와 비교할 때 독특한 에피토프를 식별할 수 있다.
1차 DNA 또는 단백질 면역화를 수행한 후 추가 면역화를 수행할 수 있다. IgY 항체는 수집된 계란의 난황 또는 면역화된 새의 혈청에서 단리될 수 있다. 표적 단백질에 대해 상당한 체액 반응을 보이는 새로부터 비장 및/또는 골수를 제거한다. 후속적으로 RNA가 단리될 수 있고 cDNA가 합성된다. 그런 다음 생성된 cDNA 샘플은 두 개의 프라이머를 사용하여 VH 및/또는 VL 유전자를 증폭 및 분해하는 템플릿으로 사용된다. 그런 다음 PCR 산물은 de Haard et al. (J Biol Chem. (1999), Vol. 274(26), pp. 18218-18230)에 기술된 바와 같이 본질적으로 파지 상의 Fab 단편의 표시를 위해 파지미드 벡터에 클로닝된다. VH 및/또는 VL 영역을 암호화하는 핵산은 벡터에 결찰되고 생성된 결찰된 벡터는 세포로 형질전환되어 라이브러리를 생성한다. 그런 다음 KingFisher Flex를 사용한 패닝 선택을 수행하여 대상 단백질에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선별은 인간 또는 마우스 표적 단백질을 발현하는 세포에 대해 FACS에 의해 수행될 수 있다. 인간 및/또는 마우스 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 클론의 VH 및/또는 VL 유전자가 시퀀싱된다. 표적 단백질에 결합하는 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
항체 단편은 당업계에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
scFv 항체는 하이브리도마 또는 포유동물 세포에서 mRNA를 단리하여 생산할 수 있고, 이는 PCR 증폭을 위해 cDNA로 역전사된다. 이는 다양한 범위의 VH 및 VL 항체 유전자를 함유하는 대형 라이브러리의 생성을 초래한다 (Marks and Hoogenboom, Journal of Molecular Biology (1991), Vol. 222, pp. 581-597). scFv를 구성하는 동안 도메인은 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH로 정렬될 수 있다 (Hu, O'Dwyer and Wall, Journal of Biotechnology (2005), Vol. 120, pp. 38-45). 링커의 예는 고전적인 (G4S)3 링커일 수 있다 (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988), Vol. 85, pp. 5879-5883). 미니바디의 경우, 힌지-CH3 도메인을 암호화하는 DNA 단편은 예를 들어 인간 IgG1의 서열에 기초할 수 있다 (Kim et al., PLOS One (2014), Vol. 9(12), e113442). scFv 및 힌지-CH3 영역은 XhoI 및 SALI에 의해 생성된 응집성 말단을 결찰하거나, PCR을 사용하여 scFv 생성물의 XhoI 제한 부위를 힌지와 함께 CH3의 NH2 말단으로 가져감으로써 조립될 수 있다 (Hu et al., Cancer Research (1996), Vol. 56, pp. 3055-3061). PCR 후, 항체의 V 도메인은 플라스미드 또는 파지미드에서 시험관 내 재조합을 통해 재조합될 수 있다 (Lilley et al., Journal of Immunological Methods (1994), Vol. 171, pp. 211-226. Hogrefe et al., Gene (1993), Vol. 128, pp. 119-126). 이 파지 디스플레이 기술은 항체 단편의 파지 마이너 코트 단백질 pIII 또는 그의 C-말단 도메인에 대한 융합에 의존한다 (Smith, Science (1985), Vol. 228, pp. 1315-1317. Hoogenboom, Nature Biotechnology (2005), Vol. 23, pp. 1105-1116). scFv 단편을 표시하는 것 외에도 파지 표시는 이제 Fab 단편을 표시하는 데에도 널리 사용된다 (Wieland et al., Veterinary Immunology and Immunopathology (2006), Vol. 110, pp. 129-140).
Fab 단편은 파파인 또는 펩신을 사용한 효소 분해를 통해 단일클론 항체로부터 생성될 수 있다. 항체의 파파인 소화는 3개의 별개의 단편을 생성한다: 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, Fab 단편 또는 영역이라고 하는 2개의 항원 결합 단편, 및 CH1 도메인 아래에서 절단함으로써 하나의 Fc 영역 (Porter, Biochem (1959), Vol. 73, pp. 119-126). 항체의 펩신 분해는 두 개의 단편을 생성한다: 힌지 영역의 이황화 가교를 통해 연결된 두 개의 항원 결합 영역을 포함하는 F(ab')2 단편 및 Fc 단편 (Valedkarimi et al., Human Antibodies (2018), Vol. 26, pp. 171-176). 이러한 Fab 및 F(ab')2 단편은 하기 기술의 조합을 통해 정제될 수 있다: 이온 교환, 단백질 A 또는 G 친화도, 항원 친화도 또는 겔 여과 크로마토그래피 (Mage and Lamoyi. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc, New York, 1987, pp. 79-97). F(ab')n 또는 (변형된 F(ab')n)은 본원에 기재된 본 발명과 관련하여 생성될 수 있고 임의의 적합한 효소적 절단 및/또는 소화 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 힌지 아래의 특정 부위에서 인간 IgG1을 절단하여 온전한 F(ab')n 항체 단편을 남기는 스트렙토코커스 피오게네스의 IgG-분해효소, IdeS 프로테아제로 절단함으로써 수득될 수 있고, 여기서 n은 IgG에 존재하는 항체 도메인의 수이고, 여기서 F(ab')n의 한쪽에 있는 중쇄는 각각의 C-말단에서 다른 쪽에 있는 중쇄와 쌍을 이루고, 여기서 쌍은 2개 이상의 이황화 가교를 포함한다. n = 2 이상인 이중특이성 및 다중특이성 항체의 생성 방법은 이전에 설명되었다. PCT/NL2019/050199; PCT/NL2013/050294; PCT/NL2013/050293을 참고하며, 이는 참조로 포함된다.
대안적으로, Fc 영역이 결여된 항체 단편은 힌지 (KSCDK / THTCPPC), 위의 특정 부위에서 인간 IgG1을 분해하여 온전한 Fab 및 Fc 단편을 생성하는 포르피오로모나스 진지발리스(Porphyoromonas gingivalis)의 시스테인 프로테아제를 사용하여 얻을 수 있다. 항체 단편은 가변 도메인 및 불변 도메인 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 포함하는 중쇄의 발현을 통해 이 기술을 통해 형성될 수 있고, 이는 본원에 기재된 링커를 통해 추가의 가변 도메인에 연결되거나, 본원에 기재된 링커를 통해 추가의 가변 도메인에 연결된 경쇄에 쌍을 이루고, 여기서 포르피오로모나스 진지발리스의 단백질 분해 효소가 상기 중쇄의 불변 도메인을 절단하여 온전한 절단된 항체 결합 단편을 남긴다.
sdAb의 생성은 파지 디스플레이를 통해 그리고 낙타과의 sdAb에서 인간 VH로의 가용화 잔기의 통합에 기초한 나이브 또는 합성 VH 또는 VL dAb의 레퍼토리를 사용하여 달성되었다 (Tanha et al., J. Biol. Chem (2001), Vol. 276, pp. 24774-24780. Davies and Riechmann, Biotechnology (1995), Vol. 13, pp. 475-479). 인간 sdAb는 또한 합성 인간 VH 파지 디스플레이 라이브러리로부터 다수의 VH를 초래한 가역적 전개 및 친화도 기준에 기초한 선택 방법을 통해 조작의 필요 없이 달성되었다 (Jespers at al, Nat. Biotechnol (2004), Vol. 337, pp. 893-903). 다른 파지 선택 방법을 사용하여 나이브 인간 VH 디스플레이 라이브러리로부터 독점적으로 비응집성 인간 VH 도메인을 수득할 수 있다 (To et al., J Biol Chem (2005), Vol. 280, pp. 41395-41403). 이와 동일한 기술을 수득된 VL에 적용할 수 있다 (Kim et al., Landes Bioscience (2014), Vol. 6:1, pp. 219-235).
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 암의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용되고 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 원숭이, 소, 말, 돼지 등 (예를 들어, 암을 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자)과 같은 포유류를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 질환 또는 그 증상을 치료 또는 개선하기 위한 목적으로 활성제 또는 활성제의 조합을 대상체에 대해 수행하거나 투여하는 임의의 유형의 개입 또는 과정을 지칭한다. 이는 질환과 관련된 증상, 합병증, 병태 또는 생화학적 징후를 역전, 완화, 개선, 억제 또는 늦추는 것뿐만 아니라 증상, 합병증, 병태 또는 질환과 관련된 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 예방하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "유효한 치료" 또는 "양성 치료 반응"은 유익한 효과, 예를 들어 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 하나 이상의 증상의 개선을 생성하는 치료를 지칭한다. 유익한 효과는 방법에 따라 치료를 시작하기 전에 이루어진 측정 또는 관찰에 대한 개선을 포함하여 기준선보다 개선된 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 유익한 효과는 질환의 임상적 또는 진단적 증상, 또는 암의 표지자의 감소 또는 제거로 입증되는, 모든 임상 단계에서 대상체의 암 진행을 늦추거나, 안정화하거나, 멈추거나, 역전시키는 형태를 취할 수 있다. 효과적인 치료는 예를 들어 종양 크기 감소, 순환 종양 세포의 존재 감소, 종양 전이 감소 또는 예방, 종양 성장 지연 또는 정지 및/또는 종양 재발 또는 재발 예방 또는 지연일 수 있다.
용어 "치료량" 또는 "유효량"은 원하는 생물학적, 치료적 및/또는 예방적 결과를 제공하는 작용제 또는 작용제의 조합의 양을 지칭한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인 중 하나 이상의 감소, 개선, 완화, 경감, 지연, 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료량은 종양 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 치료량은 종양 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다.
치료량의 약물 또는 조성물은 (i) 암세포의 수를 감소시킬 수 있고; (ii) 종양 크기를 감소시킬 수 있고; (iii) 말초 기관으로의 암세포 침윤을 억제, 지연, 어느 정도 느리게 하고 막을 수 있고; (iv) 종양 전이를 억제하고; (v) 종양 성장을 억제하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방하거나 지연시키거나; 및/또는 (vii) 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
치료량은 질환 상태, 연령, 성별 및 치료될 개체의 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 작용제 또는 작용제의 조합의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
치료량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
치료량은 또한 작용제 또는 작용제의 조합의 임의의 독성 또는 해로운 효과와 치료적으로 유익한 효과의 균형을 이루는 양을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 위치 25에서 페닐알라닌 (F)이 결합에 대한 중요한 잔기인 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다.
본 발명에 이르는 연구에서, 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 특정 에피토프에 결합하는 항체가 확인되었다. 이 에피토프는 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 위치 25에 적어도 아미노산 잔기를 포함한다. 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 102에 제시된 바와 같다. 이 서열의 위치 25에 있는 아미노산은 페닐알라닌 (F)(굵은 글씨 및 밑줄)이다. 인간 TGF-βRII 단백질 및 동형 A를 암호화하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 GenBank NM_001024847.2이다 (단백질 서열 참조는 NP_001020018.1임; 서열 번호 102). 세포외 도메인의 삽입으로 인해 더 긴 동형을 암호화하는 스플라이스 변이체는 동형 B이다. 세포외 도메인의 삽입으로 인해 더 긴 동형을 암호화하는 스플라이스 변이체는 동형 B이다 GenBank NM_003242.6이다 (단백질 서열 참조는 NP_003233.4임; 삽입에 밑줄이 그어진 서열 번호 103). 동형 A의 세포외 도메인의 위치 25에 있는 아미노산은 동형 B의 세포외 도메인의 위치 50에 있는 아미노산에 해당한다. 인간 TGF-βRII의 동형 B의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 104에 제시된 바와 같다. 이 서열의 위치 50에 있는 아미노산 페닐알라닌 (F)은 굵게 밑줄이 그어져 있다. 이러한 수탁 번호는 주로 TGF-βRII 단백질을 표적으로 식별하는 추가 방법을 제공하기 위해 제공되고, 항체에 의해 결합된 TGF-βRII 단백질의 실제 서열은 예를 들어 일부 암 등에서 발생하는 것과 같은 인코딩 유전자의 돌연변이로 인해 다를 수 있다.
본 명세서가 인간 TGF-βRII의 위치 25에 있는 아미노산을 언급하는 모든 곳에서, 이것은 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 위치 25에 있는 아미노산 뿐만 아니라 인간 TGF-βRII의 다른 동형의 상응하는 위치, 특히 동형 B의 50번 위치를 지칭한다. 본원에서 확인된 다른 아미노산 위치에도 동일하게 적용된다.
인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 위치 25에 있는 아미노산 잔기는 알라닌 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이 본 발명의 항체의 결합에 중요한 잔기인 것으로 밝혀졌다. 알라닌 스캐닝에서, 항원의 각 위치에 있는 아미노산, 이 경우에는 TGF-βRII가 알라닌으로 하나씩 치환된다. 이것이 변형되지 않은 항원에 결합하는 항체의 결합을 감소시키거나 유의하게 감소시키면, 이에 따라 치환된 아미노산이 결합에 기여하고 중요한 잔기로 간주된다. 따라서 항체 또는 항체 단편은 이러한 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 현재 맥락에서, 아미노산 잔기는 변형되지 않은 아미노산 서열과 비교하여 결합 활성 또는 반응성이 50% 이상 감소된 경우 중요한 잔기로 간주된다. 따라서 "상당히 감소된"은 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 비변형된 아미노산 서열과 비교하여 적어도 50% 이상 감소된 결합 활성 또는 반응성을 의미한다.
따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 야생형 서열이 서열번호 102에 기재된 바와 같은, 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에서 페닐알라닌 (F)이 알라닌 (A)으로 치환된 때, 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 50% 미만, 바람직하게는 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 2% 미만의 결합 활성 또는 반응성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 페닐알라닌 (F)을 포함하는 인간 TGF-βRII의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 이 에피토프에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합은 알라닌 스캐닝에 의해 결정되고, 여기서 이 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 알라닌 (A)이 존재할 때 상기 위치에 페닐알라닌 (F)이 존재하는 경우와 비교하여, 50% 미만, 바람직하게는 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 2% 미만의 결합 활성 또는 반응성을 갖는다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 정의하는 또 다른 방법은 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하고 야생형 서열이 서열번호 102에 기재된 바와 같은, 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 25에서 알라닌 (A)에 대한 페닐알라닌 (F) 잔기의 치환이 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98% 감소시킨다는 것이다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 정의될 수 있고, 여기서 에피토프는 위치 25에서 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된, 인간 TGF-βRII의 동형 A에 존재하는 페닐알라닌 (F) 잔기를 포함한다. 위치25의 중요 아미노산 잔기에 더하여, 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 에피토프의 위치 119의 아스파르테이트 (D)가 결합에 대한 추가의 중요한 잔기로 확인되었다. 동형 A의 위치 119에 있는 아미노산은 인간 TGF-βRII (서열 번호 104)의 동형 B의 세포외 도메인의 위치 144에 있는 아미노산에 해당한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 119에서 아스파르테이트 (D)가 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5%, 4%, 3%, 또는 2% 미만의 결합 반응성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 바람직하게는 하기를 갖는다:
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F)이 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 5% 미만, 바람직하게는 3% 미만의 결합 반응성;
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 119에 있는 아스파르테이트 (D)가 알라닌(A)으로 대체되는 경우, 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 5% 미만, 바람직하게는 3% 미만의 결합 반응성.
따라서, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 페닐알라닌 (F) 및 위치 119에 아스파르테이트 (D)를 포함하는 인간 TGF-βRII의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 에피토프에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합은 알라닌 스캐닝에 의해 결정되고, 여기서 이 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 페닐알라닌(F) 및 아스파르테이트(D)가 상기 각각의 위치에 존재할 때와 비교하여, 알라닌이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 존재할 때, 50% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 또는 3% 미만의 결합 활성 또는 반응성을 갖고, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 119에 존재할 때, 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 또는 3% 미만을 결합 활성 또는 반응성을 갖고, 여기서 각각의 변화는 분리되어 시험되고 야생형 세포외 도메인과 비교하여 두 가지 변화의 조합이 아니다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 정의하는 또 다른 방법은 이것이 하기의 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다는 것이다
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된 바와 같은, 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 97% 감소시키고; 그리고
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된 바와 같은, 인간 TGFβRII의 동형 A에서 119번 위치에 있는 아스파르테이트 (D) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 97% 감소시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로서 정의될 수 있고, 여기서 에피토프는 야생형 서열이 서열 번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGF-βRII의 동형 A에서 각각 위치 25 및 119에 존재하는 페닐알라닌 (F) 잔기 및 아스파르테이트 (D)잔기를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인 에피토프의 위치 52에 있는 트레오닌 (T)이 결합을 위한 추가의 중요한 잔기인 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다. 동형 A의 위치 52에 있는 아미노산은 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 77에 있는 아미노산에 해당한다. 이 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 바람직하게는 하기를 갖는다:
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F)이 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만의 결합 반응성;
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 52에 있는 트레오닌 (T)이 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 60% 미만, 바람직하게는 40% 또는 30% 미만, 보다 바람직하게는 20% 미만의 결합 반응성; 및
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 119에 있는 아스파르테이트 (D) 가 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 3% 미만의 결합 반응성.
따라서, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 페닐알라닌 (F), 위치 52에 트레오닌 (T), 및 위치 119에 아스파르테이트 (D)를 포함하는 인간 TGF-βRII의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 에피토프에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합은 알라닌 스캐닝에 의해 결정되고, 여기서 이 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 페닐알라닌 (F), 트레오닌 (T) 및 아스파르테이트 (D)가 각각의 위치에 존재할 때와 비교하여, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 존재할 때, 50% 미만, 바람직하게는 5%, 또는 2% 미만의 결합 활성 또는 반응성, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 52에 존재할 때, 60% 미만, 바람직하게는 40%, 30% 또는 20% 미만의 결합 활성 또는 반응성, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 119에 존재할 때, 10% 미만, 바람직하게는 3% 미만의 결합 활성 또는 반응성을 갖고, 여기서 각각의 변화는 야생형 세포외 도메인과 비교하여 분리되어 시험되고 두 가지 변화의 조합이 아니다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 정의하는 또 다른 방법은 이것이 하기의 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다는 것이다
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 95%, 또는 98% 감소시키고;
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 52에 있는 트레오닌 (T) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 또는 80% 감소시키고; 그리고
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 119에 있는 아스파르테이트 (D) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 97% 감소시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로서 정의될 수 있고, 여기서 에피토프는 야생형 서열이 서열번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGF-βRII의 동형 A에서 각각 위치 25, 52 및 119에 존재하는 페닐알라닌 (F) 잔기, 트레오닌 (T) 잔기 및 아스파르테이트 (D) 잔기를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 에피토프의 위치 54에 있는 이소류신 (I) 및 위치 120에 있는 글루타메이트 (E)가 결합에 대한 추가의 중요한 잔기인 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다. 동형 A의 위치 54 및 120의 아미노산은 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 79 및 145의 아미노산에 각각 해당한다. 이 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열과 비교하여, 바람직하게는 하기를 갖는다:
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F)이 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 10% 미만의 결합 반응성;
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 54에 있는 이소류신 (I)이 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 20% 미만의 결합 반응성;
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 119에 있는 아스파르테이트 (D)가 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 3% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만의 결합 반응성; 및
- 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 야생형 아미노산 서열의 위치 120에 있는 글루타메이트(E)가 알라닌 (A)으로 대체되는 경우, 80% 미만, 바람직하게는 70%, 60%, 50%, 40% 미만, 보다 바람직하게는 30% 미만, 가장 바람직하게는 10% 또는 5% 미만의 결합 반응성.
따라서, 본 발명은 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에서 페닐알라닌 (F), 위치 54에서 이소류신 (I), 위치 119에서 아스파르테이트 (D) 및 위치 120에서 글루타메이트 (E)를 포함하는 인간 TGF-βRII의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 이 에피토프에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합은 알라닌 스캐닝에 의해 결정되고, 여기서 이 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 페닐알라닌 (F), 트레오닌 (T), 아스파르테이트 (D), 및 글루타메이트 (E)가 각각의 위치에 존재할 때와 비교하여, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 25에 존재할 때, 50% 미만, 바람직하게는 10% 미만의 결합 활성 또는 반응성, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 아미노산 서열의 위치 54에 존재할 때, 20% 미만의 결합 활성 또는 반응성, 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 119에 존재할 때, 10% 미만, 바람직하게는 3%, 2% 또는 1% 미만의 결합 활성 또는 반응성, 및 알라닌 (A)이 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 아미노산 서열의 위치 120에 존재할 때, 80% 미만, 바람직하게는 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 10%, 또는 5% 미만의 결합 활성 또는 반응성을 갖고, 여기서 각각의 변화는 분리되어 시험되고 야생형 세포외 도메인과 비교하여 두 변화의 조합이 아니다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 정의하는 또 다른 방법은 이것이 하기의 인간 TGFβRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다는 것이다
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 제시된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 25에 있는 페닐알라닌 (F) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 90% 감소시키고;
- 야생형 서열이 서열 번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 54번 위치에 있는 이소류신 (I) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 80% 감소시키고;
야생형 서열이 서열 번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 119에 있는 아스파르테이트 (D) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 97%, 98%, 또는 99% 감소시키고; 그리고
- 야생형 서열이 서열번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGFβRII의 동형 A에서 위치 120에 있는 글루타메이트(E) 잔기의 알라닌 (A)의 치환은 항체 또는 항체 단편의 결합을 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 또는 95% 감소시킨다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 정의될 수 있고, 여기서 에피토프는 야생형 서열이 서열번호 102에 기재된 바와 같은 인간 TGF-βRII의 동형 A에서 각각 위치 25, 54, 119 및 120에 페닐알라닌 (F) 잔기, 이소류신 (I) 잔기, 아스파르테이트 (D) 잔기 및 글루타메이트 (E) 잔기를 포함한다.
본 발명자는 위치 25의 페닐알라닌 (F)이 결합에 중요한 세포외 TGF-β RII의 에피토프에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 다수의 항체를 확인하였다. 이러한 항체의 한 예는 다음을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고:
(a) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
(b) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
(c) 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3,
여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 임의의 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)에 따라 변할 수 있다. 이 항체는 본 발명에 포함된다.
이러한 항체의 또 다른 예는 다음을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고:
(a) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
(b) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
(c) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3,
여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 임의의 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)에 따라 변할 수 있다. 이 항체도 본 발명에 포함된다.
이러한 항체의 또 다른 예는 다음을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하고:
(a) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
(b) 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
(c) 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3,
여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 임의의 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)에 따라 변할 수 있다. 이 항체도 본 발명에 포함된다.
따라서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1, 4, 및 7에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1; 서열 번호 2, 5 및 8에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2; 및/또는 서열 번호 3, 6 및 9에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3을 포함할 수 있고; 여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 임의의 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)에 따라 변할 수 있다.
중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역은 임의의 적합한 프레임워크 영역으로부터 선택될 수 있다. 적합한 프레임워크 영역의 예는 인간 V 유전자 IGHV3-15 및 IGHV3-23에 의해 암호화되는 프레임워크 영역이다. 이들 생식계열 V 유전자는 하나 이상의 체세포 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 하기 아미노산 서열을 갖는 VH:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYRDIVGATDYWGQGTLVTVSS (서열 번호 10), 또는 그에 대한 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 하기 아미노산 서열을 갖는 VH:
QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTISGGATDFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRDYWGQGTLVTVSS (서열 번호 11), 또는 그에 대한 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 하기 아미노산 서열을 갖는 VH:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIAASGKNYFDPWGQGTLVTVSS (서열 번호 12), 또는 그에 대한 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대해 0-10개, 바람직하게는 0-5개의 아미노산 변이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대한 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 바람직하게는 0-3, 바람직하게는 0-2, 바람직하게는 0-1, 바람직하게는 0개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 CDR 이외의 위치에서 이들의 조합을 포함한다. 삽입, 부가, 결실 또는 치환의 조합은 정렬된 서열이 10개 이상, 바람직하게는 5개 이하의 위치에서 상이하지 않은 경우의 조합이다. 정렬된 서열 중 하나의 간격은 다른 서열에서 건너뛴 아미노산 수만큼 계산된다. 존재하는 경우 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 중쇄 가변 영역에서의 치환은 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR에서의 치환에 추가될 수 있다. 보존적 아미노산은 전하, 소수성, 친수성, 산성, 염기성, 크기 등의 특성에 따른 각 작용기의 유사성을 기반으로 당업계에 공지되어 있다.
아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 중쇄 및 경쇄의 결합 계면에서 이루어지지 않는다.
H/L 사슬 상호작용의 계면에서 아미노산이 변화하는 경우, 다른 사슬의 상응하는 아미노산이 변화를 수용하도록 변화되는 것이 바람직하다. 아미노산의 삽입 또는 첨가는 바람직하게는 프롤린의 삽입 또는 첨가를 수반하지 않는다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편의 변이체를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 특히 서열 번호 22-91 및 93 중 어느 하나를 갖는 VH, 즉 도 4에 나타낸 VH 서열 중 임의의 하나를 포함하는 항체 또는 항체 단편. 또한, 서열 번호 22-91 및 93 중 어느 하나의 적어도 HCDR3, 또는 모든 CDR을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 40; 43; 46; 47; 48 또는 54에 제시된 아미노산 서열을 가지거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이는 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 변이체이다. 다른 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 67; 70; 75; 76; 77; 78; 83; 84; 또는 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 이는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 변이체이다. 다른 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 24 또는 26에 제시된 아미노산 서열을 가지거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이는 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 변이체이다. 가장 바람직한 변이체는 서열 번호 40; 43; 46; 47; 48; 54; 67; 70; 75; 76; 77; 78; 83; 84; 또는 88에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 변이체이다.
이러한 변이체의 중쇄 가변 영역은 표시된 아미노산 서열에 대해 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산 변이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서 중쇄 가변 영역은 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 바람직하게는 0-3, 바람직하게는 0-2, 바람직하게는 0-1, 바람직하게는 0개의 표시된 아미노산 서열에 대한 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 CDR 이외의 위치에서 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 예를 들어 본원에 정의된 동족 경쇄 또는 공통 경쇄와 같은 임의의 적합한 경쇄를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 0-10, 바람직하게는 0-5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 추가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1b에 도시된 바와 같은 IgVκ1-39*01 유전자 세그먼트의 아미노산 서열을 포함한다. IgVκ1-39는 면역 글로불린 가변 카파 1-39 유전자의 약자이다. 유전자는 또한 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39로 알려져 있다. 유전자에 대한 외부 Id는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열은 도 1a에 주어진다. 이는 V-영역의 서열을 나열한다. V-영역은 5개의 J-영역 중 하나와 결합될 수 있다. 도 1b 및 1c는 J-영역과 조합된 IgVκ1-39에 대한 2개의 바람직한 서열을 기술한다. 결합된 서열은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 표시되며; 대체 이름은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01이다 (imgt.org의 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법).
경쇄 가변 영역을 포함하는 IgVκ1-39*01은 생식계열 서열인 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역을 포함하는 IGJκ1*01 또는 IGJκ5*01이 생식계열 서열인 것이 추가로 바람직하다. IGKV1-39/jk1 또는 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변 영역이 생식계열 서열인 것이 추가로 바람직하다.
경쇄가 있는 항체를 생산하는 성숙한 B-세포는 종종 생식계열 서열과 관련하여 하나 이상의 돌연변이를 겪은 경쇄를 생산하며, 이는 유기체의 비림프성 세포에서 정상적인 서열을 의미한다. 이러한 돌연변이를 담당하는 과정을 체세포 과돌연변이라고 한다. 생성된 경쇄는 친화도 성숙된 경쇄로 지칭된다. 생식계열 IgVκ1-39*01 서열에서 유래된 경우 이러한 경쇄는 IgVκ1-39*01 유래 경쇄이다. 본 명세서에서, 문구 "IgVκ1-39*01"은 IgVκ1-39*01-유래 경쇄를 포함할 것이다. 체세포 과돌연변이에 의해 경쇄를 암호화하는 핵산에 도입된 돌연변이는 실험실에서 인공적으로 도입될 수도 있다. 실험실에서는 또한 경쇄에 대한 다른 변형을 경쇄의 특성에 영향을 주지 않고 도입할 수 있다. 경쇄는 0-10개, 바람직하게는 0-5개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열을 포함하는 경우 적어도 IgVκ1-39*01 경쇄이다. 바람직하게는, IgVκ1-39*01 경쇄는 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열, 보다 바람직하게는 0-5, 바람직하게는 0-4, 0-3, 0-2, 0-1개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열, 훨씬 더 바람직하게는 0-3개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열, 훨씬 더욱 바람직하게는 0-2개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열, 훨씬 더욱 바람직하게는 0-1개 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 도 1a, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 서열, 및 가장 바람직하게는 0개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 포함하는 경쇄이다.
한 구현예에서, 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 결합 도메인은 하기를 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고:
(a) 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1,
(b) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 및
(c) 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3,
여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 아미노산 서열 CDR1 - QSISSY (서열 번호 13), CDR2 - AAS (서열 번호 14), CDR3 - QQSYSTPPT (서열 번호 15), 즉, IGKV1-39의 CDR (IMGT에 따름)을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하고, 표시된 아미노산 서열과 관련하여 0-5개의 아미노산 치환을 허용한다. 카밧(Kabat) 넘버링에 따르면 아미노산 서열은 다음과 같다: CDR1 - RASQSISSYLN (서열 번호 19), CDR2 - AASSLQS (서열 번호 20), CDR3 - QQSYSTPPT (서열 번호 21). 임의의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합은 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR3 영역에 없고, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2 영역에 존재하지 않는다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다.
특히, 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK (서열 번호 16), 또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 이는 0-5개의 아미노산 변이, 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 허용한다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다.
본 발명의 항체는 임의의 이소형(isotype)일 수 있다: IgA, IgM, IgG, IgD 또는 IgE. 바람직하게는, 항체는 IgG, 특히 IgG1 또는 IgG4이다. 가장 바람직하게는, 항체는 IgG1이다.
본 발명의 항체의 불변 영역은 바람직하게는 인간 불변 영역이지만, 임의의 동물일 수 있다. 마우스 또는 랫트 불변 영역일 수 있다. 항원에 반응하여 생성된 재조합 항체를 선택하기 위해 사용되는 선별 방법 또는 면역화된 숙주 유기체에 따라 마우스 불변 영역 또는 랫트 불변 영역이 유리하게 사용될 수 있다.
항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역은 통상적인 인간 항체의 불변 영역과 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다.
일부 항체는 예를 들어 Fc-수용체 상호작용을 감소시키거나 ADCC, C1q 결합 또는 다른 효과기 활성을 감소시키기 위해 CH2/하부 힌지 영역에서 변형된다. 본 발명의 항체는 Fc-감마 수용체에 대한 항체의 상호작용이 감소되도록 변이체 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체일 수 있다. 이러한 돌연변이체 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 위치 235 및/또는 236 (EU 넘버링)에 아미노 변이를 포함하고, 바람직하게는 다음 위치 235G 및/또는 236R에 잔기를 포함한다.
단리된 단일클론 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 위치 447의 라이신이 결실된 IgG1 항체의 2개의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체 또는 항체 단편은 표 1에 열거된 바와 같은 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR 조합을 포함한다.
Figure pct00001
표 1. 중쇄 가변 영역 CDR과 경쇄 가변 영역 CDR의 가능한 조합.
본 발명의 바람직한 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 10, 11, 12, 22-91 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 특히 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다. 이 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 불변 도메인을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 갖는 중쇄, 및 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 경쇄를 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 10의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 11의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 12의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 43의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 75의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 70의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 84의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 88의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 40의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 83의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 78의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 47의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편은 서열 번호 76의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음을 포함한다:
(A) 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
(B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
본 발명은 인간 TGF-βRII에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 추가로 제공하고, 여기서 결합 도메인은 다음을 포함하고:
하기로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 중 어느 하나:
(A) 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(B) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(C) 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(D) 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(E) 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(F) 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(G) 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(H) 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
(I) 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH; 및
(J) 서열 번호 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있다.
VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열은 본원에 제공된 서열 목록에서 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 번호 12, 26, 30, 40, 61, 65, 70, 76, 85 및 86으로부터 선택된 VH 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%의 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 결합 도메인은 1가 및 다가 형태로 유용한 것으로 밝혀져, 1가 분자 또는 2가 분자에서 다양한 적용을 제공하거나, 다중특이적 분자에 통합된 하나 이상의 결합 도메인으로서 제공된다. 1가 형태의 상기 결합 도메인은 1가 대조군 항체와 비교하여 우수한 TGF-βRII 차단 능력을 가지므로 상기 적용에 적합하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 1가 형태의 본 발명의 결합 도메인을 포함하는 항체, 바람직하게는 다중특이적 항체를 제공하고, 이 항체는 바람직하게는 동일한 분석에서 측정된 2가 단일특이적 대조군 항체와 비교할 때 등몰 농도에서 유사한 수용체 차단 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 대조군 항체는 서열 번호 97에 제시된 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 135에 제시된 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 검정은 TGF β 리포터 검정, 바람직하게는 실시예 5에 기재된 바와 같은 TGF β 리포터 검정이다. 특정 구현예에서, 비교 가능한 수용체 차단 활성은 대조군 항체의 수용체 차단 활성의 5 내지 2배, 바람직하게는 3배 편차를 포함한다.
예컨대 상기 구현예에 기재된 것과 같이 본원에 기재되고 청구된 항체 및 결합 도메인은 바람직하게는 단리된 항체 또는 결합 도메인이다. 바람직하게는 단일클론 항체이다. 보다 바람직하게는 단리된 단일클론 항체이다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 TGF-βRII에 대한 리간드 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3의 결합을 방해한다. 용어 "결합을 방해한다"는 항체 또는 항체 단편이 TGF-βRII의 에피토프에 대해 지시되고 TGF-βRII에 대한 결합에 대해 TGB-β1, TGB-β2 및/또는 TGB-β3과 경쟁한다는 것을 의미한다. 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 리간드 결합을 감소시킬 수 있고, 이것이 TGF-βRII에 이미 결합되어 있을 때 리간드 결합을 대체할 수 있거나, 예를 들어 입체 장애를 통해 리간드가 TGF-βRII에 결합하는 것을 적어도 부분적으로 방지할 수 있고/거나 TGF-βRI-TGF-βRII 복합체 형성을 방해하거나 방지할 수 있다. 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 TGF-βRI 및 TGF-βRII 복합체의 형성을 감소시킬 수 있고, 복합체가 이미 형성된 경우 이러한 복합체를 대체할 수 있거나, 예를 들어 입체 장애를 통해, TGF-βRI이 TGF-βRII와 복합체 형성을 적어도 부분적으로 방지할 수 있다. 용어 "결합을 방해한다"는 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인이 TGF-βRII에 대한 리간드 TGF-β1, TGF-β2, 및/또는 TGF-β3의 결합을 차단한다는 것을 의미한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 파지 핵산 또는 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포에서 복제할 수 있는 다른 핵산 분자를 포함한다. 벡터는 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터일 수 있다. 전형적인 발현 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 폴리뉴클레오티드의 발현 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
당업계에는 항체를 생산하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 항체는 일반적으로 항체를 암호화하는 핵산을 발현하는 세포에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 생산하고/거나 포함하는 단리된 세포 또는 조직 배양물 중의 세포를 제공한다. 일반적으로 이것은 시험관 내, 단리된 또는 재조합 세포이다. 이러한 세포는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산을 포함한다. 세포는 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 영장류 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 본 발명의 목적을 위해 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체를 포함하고 바람직하게는 생산할 수 있고/있거나 본 발명에 따른 핵산을 포함할 수 있는 임의의 세포이다. 바람직하게는, 세포는 하이브리도마 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포이다. 세포가 CHO 세포인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 세포주가 추가로 제공된다. 단백질 및 항체의 산업적 규모 생산을 위해 개발된 세포주는 본원에서 추가로 산업적 세포주로 지칭된다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 생산하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 세포를 배양하고 상기 배양물로부터 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 수확하는 것을 포함한다. 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 현탁액 성장에 적합하다. 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 바람직하게는 상기 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 친화도 정제된다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편이 점적 주입용 주사제 또는 수액제로 사용되도록 제제화되는 경우, 주사제 또는 수액제는 수용액, 현탁액 또는 유제의 임의의 형태일 수 있거나 약제가 사용 시 용매에 용해, 현탁 또는 유화되도록 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 고체 약제를 사용하여 제제화될 수 있다. 점적 주입용 주사제 또는 수액제에 사용되는 용매의 예는 주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 용액 및 등장액 (예를 들어, 여기서 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산 산, 붕사, 프로필렌 글리콜 등은 가용성임)을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 안정제, 가용화제, 현탁제, 유화제, 진정제, 완충제, 방부제, 살균제, pH 조절제 및 항산화제를 포함한다. 안정제로서, 각종 아미노산, 알부민, 글로불린, 젤라틴, 만니톨, 포도당, 덱스트란, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 아스코르브산, 아황산수소나트륨, 티오황산나트륨, 에데트산나트륨, 시트르산나트륨, 디부틸히드록시톨루엔 등을 사용할 수 있다. 가용화제로서, 알코올 (예를 들어, 에탄올), 폴리올 (예를 들어, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 (등록 상표), 폴리소르베이트 80 (등록 상표) 및 HCO-50) 등을 사용할 수 있다. 현탁제로서, 모노스테아르산글리세릴, 모노스테아르산알루미늄, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 라우릴황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 유화제로서, 아라비아검, 알긴산나트륨, 트라가칸트 등을 사용할 수 있다. 진정제로서, 벤질알코올, 클로로부탄올, 소르비톨 등을 사용할 수 있다. 완충제로서, 인산염 완충액, 아세트산 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액, 시트르산염 완충액, 트리스 완충액, 글루탐산 완충액, 엡실론 아미노카프로산 완충액 등을 사용할 수 있다. 방부제로서, 파라히드록시벤조산메틸, 파라히드록시벤조산에틸, 파라히드록시벤조산프로필, 파라히드록시벤조산부틸, 클로로부탄올, 벤질알코올, 염화벤잘코늄, 아세트산나트륨, 에데산나트륨, 붕산, 붕사 등을 사용할 수 있다. 살균제로서, 염화벤잘코늄, 파라히드록시벤조산, 클로로부탄올 등을 사용할 수 있다. pH 조절제로서, 염산, 수산화나트륨, 인산, 아세트산 등을 사용할 수 있다. 항산화제로서, (1) 아스코르브산, 염산시스테인, 황산수소나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등의 수성 항산화제, (2) 팔미트산아스코르빌, 부틸화히드록시아니솔, 부틸화히드록시톨루엔, 레시틴, 갈산프로필, 및 α-토코페롤의 유용성 항산화제, 또는 (3) 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 소르비톨, 타르타르산 및 인산과 같은 금속 킬레이트제가 사용될 수 있다.
점적 주입용 주사제 또는 수액제는 최종 공정에서 멸균 처리를 하거나, 무균 조작, 예를 들어 필터로 여과하여 멸균한 후 무균 용기에 충전하여 제조할 수 있다. 점적 주입용 주사제 또는 수액제는 진공 건조 또는 동결건조된 무균 분말 (약학적으로 허용 가능한 담체 분말을 포함할 수 있음)을 사용시에 적절한 용매에 용해시켜 사용할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 항체 또는 항체 단편, 결합 도메인, 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 대상체의 암 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 제공한다. 본 발명은 추가로 암의 예방, 증상 진행 또는 재발의 억제 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제를 제공하고, 여기서 약제는 활성 성분으로서 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 결합 도메인을 포함한다.
암 환자는 일반적으로 신체에서 제거해야 하는 이상 세포를 가지고 있다. 본원에 사용된 용어 '이상 세포'는 종양 세포, 보다 구체적으로 정상 TGF-βRII 발현보다 높은 것과 상관관계가 있는 암 유형과 관련된 모든 유형의 암 조직에 존재하는 종양 세포를 포함한다. 본원에서 이상 세포는 TGF-β의 증가된 발현 및/또는 TGF-β의 방출의 결과로 증가된 신호전달을 갖는 세포, 및 비정상적인 TGF-β 신호전달 및/또는 발현 또는 정상 TGF-β, TGF-βRI 및/또는 TGF-βRII 발현 및/또는 잠복 TGF-β의 정상 방출보다 높은 발현으로 인해 종양 면역의 효과를 감소시키는 억제 환경을 형성하는 세포를 추가로 지칭한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 예를 들어 정상 TGF-β 신호전달보다 높은, 특히 정상 TGF-βRII 발현보다 높은 것과 관련된 암 유형을 비롯한 여러 유형의 암 치료에 효과적일 것이다. 예는 유방암, 결장암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 경부암, 간세포암종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 흑색종, 골수이형성 증후군, 췌장암, 전립선암 및 신장암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단함으로써, TGF-βRII 신호전달을 억제한다. 이는 유해하거나 비정상적인 세포의 증식 감소 및/또는 종양 면역 및 기타 유익한 효과를 향상시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 세포 상에서 인간 TGF-β의 인간 TGF-βRII에 대한 결합을 차단하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 세포에 제공하고 항체 또는 항체 단편은 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하도록 허용하여, 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단하는 단계를 포함한다. 이것은 시험관 내 방법일 수 있다.
원하는 활성에 따라, 본 발명의 항체는 조절된 효과기 기능을 가질 수 있다. 항체 의존성 세포 매개 세포독성이라고도 하는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)은 면역계의 효과기 세포가 막 표면 항원이 특정 항체에 의해 결합된, 표적 세포를 적극적으로 용해시키는 세포 매개 면역 방어 기전이다. ADCC 효과기 기능은 일반적으로 Fc 수용체 (FcR)에 의해 매개된다. 수용체는 항체 매개 (체액) 면역 반응을 세포 효과기 기능에 연결하는 주요 면역 조절 수용체이다. FcγR (IgG), FcεRI (IgE), FcαRI (IgA), FcμR (IgM) 및 FcδR (IgD)을 포함한 모든 종류의 면역글로불린에 대한 수용체가 확인되었다. 백혈구에서 발견되는 인간 IgG에 대한 수용체에는 세 가지 부류가 있다: CD64 (FcγRI), CD32 (FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc) 및 CD16 (FcγRIIIa 및 FcγRIIIb). FcγRI은 고친화도 수용체 (나노몰 범위 KD)로 분류되는 반면 FcγRII 및 FcγRIII는 저 내지 중간 친화도 (마이크로몰 범위 KD)이다. 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서, 효과기 세포 (자연살해세포, 대식세포, 단핵구 및 호산구) 표면의 FcvR은 그 자체가 표적 세포와 결합하는 IgG의 Fc 영역에 결합한다. 결합 시, 표적 세포의 파괴를 매개하는 용해 효소, 퍼포린, 그랜자임 및 종양 괴사 인자와 같은 다양한 물질의 분비를 초래하는 신호 경로가 촉발된다. ADCC 효과기 기능의 수준은 인간 IgG 하위 유형에 따라 다르다. 이것은 단순한 용어로 알로타입(allotype) 및 특이적 FcvR에 의존하지만 ADCC 효과기 기능은 인간 IgG1 및 IgG3에 대해 높고 IgG2 및 IgG4에 대해 낮다. 항체 상의 FcvR의 결합 부위에 대한 지식은 ADCC 효과기 기능을 갖지 않는 조작된 항체를 초래하였다.
다른 유형의 효과기 기능은 효과기 세포에 독립적이며 보체 의존적 세포독성(CDC)이라고 한다. 이것은 IgG 및 IgM 항체의 효과기 기능이다. 이는 치료 항체 또는 항체 단편이 항종양 효과를 달성할 수 있는 또 다른 작용 기전이다. CDC는 고전적 보체 경로의 개시 성분인 C1q가 표적 결합 항체의 Fc 부분에 고정될 때 시작된다. 이것은 궁극적으로 항체 표시 세포의 용해를 초래할 수 있는 복합 보체 활성화 캐스케이드의 첫 번째 단계이다.
본 발명의 항체에서, ADCC 활성은 불변 영역을 약간 변형함으로써 상이한 기술에 의해 향상될 수 있고, 그 중 하나는 푸코스의 제거이다. 푸코스의 제거는 여러 생체 내 모델에서 항종양 활성을 증가시켰다 (Junttila et al., Cancer Research (2010), Vol. 70(22), pp. 4481-4489). 탈푸코실화(afucosylation) 기술을 적용하여, Fc 영역에서 N-연결된 탄수화물 구조의 푸코실화(fucosylation)를 방지할 수 있다.
본 발명의 항체에서, 효과기 기능은 또한 감소되거나 제거될 수 있다. 예를 들어, EU 넘버링 시스템에 따라 위치 235 류신이 글리신으로 치환될 수 있고/거나, EU 넘버링 시스템에 따라 위치 236 글리신이 아르기닌으로 치환될 수 있다. 이러한 변형(들)은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합이 제거되거나 감소되도록 한다. 동일한 효과에 대해 당업계에 공지된 다른 치환, 결실 또는 삽입도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 추가로 세포의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합에 의해 유도된 세포 내로의 신호 전달을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 세포에 제공하고 항체 또는 항체 단편이 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하도록 허용하여, 세포로의 신호 전달을 억제하는 단계를 포함한다. 이것은 시험관 내 방법일 수 있다.
본 발명은 또한 전이를 예방 또는 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 결합 도메인, 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인은 단일 요법으로서 암 치료에 사용될 수 있지만 다른 항암제와 조합될 수도 있다. 다른 항암제는 동일하거나 다른 종양 항원을 표적으로 하거나 면역계의 요소를 조절하는 치료 항체, 화학요법에 사용되는 제제 (예를 들어, 시클로포스파미드), 호르몬 요법 또는 종양 용해성 바이러스를 포함한 국소 투여와 관련된 적용에 사용되는 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인을 사용한 치료는 또한 예를 들어 수술 또는 방사선 요법과 같은 다른 항암 치료와 조합될 수 있다. 치료의 조합은 동시, 개별 또는 순차적일 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", "포함하다" 및 "갖는" 및 "포함하다", "포함하는", "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 단어는 문맥이 허용하는 경우 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 가능한 포함을 전달하기 위한 것이다.
관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 또는 적어도 하나)를 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미할 수 있다.
"복수"는 둘 또는 그 이상을 의미한다.
본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 항체 또는 항체 단편의 가변 영역에서 CDR 및 프레임워크에 할당된 아미노산 위치는 카밧의 넘버링에 따라 지정된다 (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991) 참조). 불변 영역의 아미노산은 카밧의 아미노산 위치를 기반으로 하는 EU 넘버링 시스템에 따라 표시된다 (Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242 참조).
수탁 번호는 주로 표적을 식별하는 추가 방법을 제공하기 위해 제공되고, 결합된 단백질의 실제 서열은 예를 들어 일부 암 등에서 발생하는 것과 같은 인코딩 유전자의 돌연변이로 인해 달라질 수 있다. 항원 결합 부위는 항원 및 일부 항원 양성 면역 세포 또는 종양 세포에 의해 발현되는 것과 같은 이의 다양한 변이체에 결합한다.
본원에서 유전자, 단백질이 언급될 때, 언급은 바람직하게는 유전자 또는 단백질의 인간 형태에 대한 것이다. 본원에서 유전자 또는 단백질이 언급될 때 언급은 천연 유전자 또는 단백질, 및 종양, 암 등에서 검출될 수 있는, 바람직하게는 인간 종양, 암 등에서 검출될 수 있는 바와 같은 유전자 또는 단백질의 변이형 형태를 의미한다.
HGNC는 HUGO 유전자 명명 위원회를 의미한다. 약어 뒤에 오는 숫자는 HGNC 데이터베이스에서 해당 유전자 및 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 정보를 검색할 수 있는 수탁 번호이다. Entrez Gene은 NCBI (미국국립생물공학정보센터) 데이터베이스에서 해당 유전자 또는 해당 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 정보를 검색할 수 있는 수탁 번호 또는 유전자 ID를 제공한다. Ensemble은 Ensemble 데이터베이스에서 해당 유전자 또는 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 정보를 얻을 수 있는 수탁 번호를 제공한다. Ensembl은 EMBL-EBI와 Wellcome Trust Sanger Institute 간의 공동 프로젝트로 선택된 진핵생물 게놈에 대한 자동 주석을 생성하고 유지하는 소프트웨어 시스템을 개발한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 항체 생산
공통 IGKV1-39 경쇄를 포함하는 형질전환 마우스 (MeMo® 마우스)를 인간 TGF-βRII (동형 A)로 면역화하여, 인간 항-TGF-βRII 특이적 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 발생시켰다. 면역화된 마우스의 림프 물질을 수집하고, 이로부터 핵산을 추출하고 이러한 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 cDNA의 합성에 사용하였다. cDNA를 선택되는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 데 사용하였고, 이로부터 인간 TGF-βRII 결합 Fab를 Kingfisher 선택 로봇을 사용하여 선택하였다.
Kingfisher 로봇을 사용하여 상이한 농도의 비오틴화된 재조합 단백질을 사용하여 두 라운드의 친화도 기반 선택을 수행하였다. 인간 TGF-βRII-Fc를 제조사의 프로토콜에 따라 EZ-Link™ 술포-NHS-비오틴 키트 (ThermoFisher; cat.no.21217)로 비오틴화하고, 분취하여 추가 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다. Kingfisher 로봇을 사용하여 바이오틴화된 인간 TGF-βRII-Fc로 용액 내 선택의 2회의 후속 라운드를 수행하였다. 첫 번째 선택 라운드에서, 세 가지 상이한 농도의 단백질이 사용되었다. 음성 대조군으로, 항원이 없는 선택이 포함되었다. 50 μg/ml의 총 인간 IgG (Sigma; cat.no.1456)를 Fc 결합제의 선택을 최소화하기 위해 모든 파지 라이브러리 배양 동안 용액에 첨가하였다. 세척 후, 결합된 파지를 트립신으로 용출시켰다. 파지 출력을 스폿 방법에 따라 결정하였고, 여기서 TG1 세포를 감염시키고 선별을 위한 단일 콜로니를 선택하기 위해 LB 한천 amp/glu 플레이트에 플레이팅하였다. 첫 번째 라운드의 출력으로 두 번째 라운드의 선택을 수행하였다. 두 번째 선택 라운드에서, TGF-βRII-Fc-비오틴을 각각의 첫 번째 선택 라운드 출력에 사용된 농도에서 시작하여 감소하는 양의 단백질로 사용하였다.
가용성 Fab를 함유하는 주변세포질 추출물의 제조를 위해 콜로니를 96-웰 플레이트에 집어넣었다. 수득된 Fab-함유 분획은 FACS를 사용하여 TGF-βRII 특이적 클론의 식별에 사용하였다.
인간 TGF-βRII 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 FACS 선별에 사용하였다. Fab 최종 농도는 0.5 내지 5 μg/ml였다. TGF-βRII에 결합하는 Fab는 염소 항-카파 경쇄 항체 (Ab0646; 5 μg/ml)에 이어 토끼 항염소 PE (Ab0330; 1/100 희석)로 검출되었다.
두 라운드의 면역화를 수행하여 추가 특성화를 위한 대규모 Fab 패널을 생성하였다. 두 번째 면역화 라운드에서 발현 수준을 증가시키기 위해 다른 벡터가 사용되었고 마우스는 인간 TGF-βRI과 공동 면역화되었다. 이것은 두 번째 면역화 라운드 동안 관찰된 마우스에서 생성된 더 높은 면역 반응에 기여했을 수 있다.
US 2010/0119516에서 얻은 정보를 기반으로 양성 대조군 항체를 생산하였다. 이 양성 대조군 항체는 본원에 기술된 mAb TGF1 (각각 서열 번호 97 및 서열 번호 135)의 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 가변 영역 및 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 TGF-βRII에 대한 리간드 결합을 차단하는 것으로 보고되어 있다.
RSV에 대한 음성 대조군 항체를 생성하였다. 이 음성 대조군 항체는 서열 번호 136에 제시된 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16에 기재된 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실시예 2 - 항체 특성화
실시예 1에서 확인된 TGF-βRII 결합 Fab의 VH 단편을 IgG 발현 형식으로 재클로닝하여 293T 자유형 세포로부터 IgG를 발현 및 정제하였다.
항원 결합
FACS를 사용하여 CCD18Co 세포에서 내인적으로 발현된 인간 TGF-βRII에 대한 결합에 대해 항체를 선별하였다. 결과는 도 2에 나타낸다. 시험된 모든 항체는 CCD18Co 세포에 대해 유사한 결합을 나타냈다.
첫 번째 라운드의 면역화로부터 수득된, 서열 번호 11에 제시된 아미노산을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab는 두 번째 라운드의 면역화로부터 수득된 Fab와 동일한 HCDR3 서열, 예를 들어 서열 번호 93에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 Fab를 포함한다. 이는 마우스에서 VDJ 유전자 절편의 재조합이 이 항원에 대한 반응으로 상당히 동일함을 나타낸다.
결합 친화도
서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 93 및 서열 번호 12로 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합 친화도를 SPR에 의해 측정하였다. 이를 위해, 항체를 TGFβRII에 대한 2가 IgG의 단일특이성으로 재포맷하였다.
항-TGF-βRII IgG 항체는 고정된 항-CH1 항체 (Ab0669; BD cat.no.BD555784)에 의해 CM5 센서 칩 표면에 포획되었고, 이어서 인간 재조합 TGF-βRII (R&D systems cat.no.241-R2/CF; 영역 Ile24-Aps195)를 첨가하였다. 측정은 25℃에서 수행되었다. 커플링은 pH 4.5에서 수행되었다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2 . TGF-βRII에 대한 선택된 항체의 결합 친화도.
리간드 차단
IgG 샘플의 리간드 차단 활성을 ELISA 분석을 사용하여 측정하였다.
ELISA 플레이트를 0.4 μg/ml의 TGF-β1로 코팅하였다. 인간 TGF-βRII-Fc (R&D; cat.no.341-BR)를 0.01 μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 항체는 10 μg/ml의 최종 농도에서 시작하여 3배 농도 범위에서 배양되었다. 서열 번호 92에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 파상풍 톡소이드에 특이적으로 결합하는 항체를 대조군으로 포함하였다. 인간 TGF-βRII-Fc에 결합하는 항체는 비오틴-접합된 항-인간 Fc 항체 (1:10.000) 및 스트렙타비딘-HRP (1:2000)로 검출되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 항체는 대조군 항체와 비교할 때 우수한 리간드 차단 활성을 나타낸다. 선택된 항체의 IC50 값은 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3. 선택된 항체의 IC50 값.
실시예 3 - 친화도 성숙
TGF-βRII에 특이적으로 결합하고 리간드 상호작용 및 TGF-βRII 및 TGF-βRI 이종이량체화를 차단하는, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함하는 변이체 중쇄의 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하여 항체가 더 높은 친화도로 생성될 수 있는지를 평가하였다. 라이브러리는 증가된 친화도를 갖고 일반적으로 3 내지 4개의 변이를 갖는 중쇄 가변 영역을 생성하도록 설계되었다: CDR1에 하나, CDR2에 하나, 및 CDR3에 하나 또는 2개, 특정 수의 변이체는 전체적으로 4개 초과의 변이를 가짐. 변이체의 개요는 도 4에서 서열 정렬로 제공된다.
비오틴화된 인간 TGF-βRII-Fc를 항원으로 사용하고, 둘 다 Kingfisher 선택 로봇을 사용하는 두 가지 다른 선택 방법을 사용하여 친화도가 더 높은 변이체를 선택하였다. 여러 선택 라운드가 수행되었다. 첫 번째 선택 라운드는 상이한 농도의 비오틴화된 TGF-βRII-Fc를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 친화도 기반 선택을 포함하였다. 명확한 농축을 나타내는 가장 낮은 항원 농도를 갖는 선택의 출력만이 이후에 두 개의 개별 선택 방법에 추가로 사용되었다. 첫 번째 선택 방법은 친화도 기반 선택의 두 번의 추가 라운드를 수반하지만, 이번에는 이전 선택 라운드에서 사용된 최적 항원 농도와 비교하여 항원 농도가 더 감소한다. 두 번째 선택 방법은 또한, 모두 항원의 농도 감소를 통한 친화도 기반 및 과량의 비오틴화되지 않은 항원의 존재하에 세척 단계를 포함하는, 오프-레이트 기반인 선택의 2회 추가 라운드를 수반한다.
50 μg/ml의 총 인간 IgG (Sigma; cat.no.I4506)를 Fc 결합제의 선택을 최소화하기 위해 모든 파지 라이브러리 배양 동안 용액에 첨가하였다. 세척 후, 결합된 파지를 트립신으로 용출시켰다. 파지 출력은 스팟 방법에 따라 결정되었고, 여기서 TG1 세포는 파지 출력의 연속 희석액으로 감염되었고 다음날 콜로니를 계수하기 위해 LB 한천 amp/glu 플레이트에 플레이팅되었다.
파지 출력은 박테리아 감염을 통해 구출되어 후속 선택을 위한 충분한 파지를 생성하고, 박테리아 콜로니가 있는 플레이트를 생성하였다. 항체 생산을 위해 콜로니를 96-웰 플레이트로 선택하였다. 생성된 항체는 가용성 Fab를 포함하는 주변 세포질 추출물의 제조에 사용되었다.
친화도 성숙 변이체는 TGFβRII에 대한 2가 IgG의 단일특이성으로 재포맷되었다. TGF-βRII에 대한 변이체의 친화도를 결정하기 위해 SPR 분석을 수행하였다. 결과는 표 4 및 도 5에 나타낸다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 4. 친화도 성숙 변이체 및 모 항체의 결합 친화도.
변이체의 리포터 검정
친화도 성숙된 변이체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 2가 IgG 형식으로 재포맷하였다. 얻어진 항체를 TGF-βRII 루시페라아제 기반 리포터 검정에 사용하여 수용체의 리간드 유도 활성화를 억제하는 항체의 능력을 시험하였다.
293F 자유형 세포를 리포터 CAGA12 루시페라아제로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음날, 형질감염된 세포를 플레이팅하고 항-TGF-βRII 항체의 6점, 세미-로그 연속 희석액의 존재/부재하에 1 ng/ml의 hTGF-β1으로 자극하였다. 항-TGF-βRII 항체를 동시에 첨가하였다. 항체의 출발 및 최고 농도는 10 μg/ml이었고, 최저 농도는 0.03 μg/ml이었다. 293F 자유형 세포, hTGF-β1 및 항-TGF-βRII 항체 혼합물을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 배양하였다. 각 플레이트 서열 번호 97을 갖는 중쇄 가변 영역 및 TGF-β를 함유하지 않는 하나의 웰을 포함하는 음성 경쟁 대조군의 적정. 판독 시, Steady-Glo 루시페라아제 검정 시스템 검출 시약을 첨가하였고 EnVision에서 5분 배양 후 루시페라아제를 측정하였다. 배수 응답은 다음과 같이 계산되었다:
Figure pct00007
결과는 도 6에 나타낸다. 이 데이터는 여러 변이체가 모 항체에 비해 향상된 리간드 차단 활성을 나타냄을 나타낸다. 선택된 항체의 IC50 값은 표 5에 나타낸다.
Figure pct00008
표 5. 선택된 친화도 성숙 변이체 및 모 항체의 IC50 값.
실시예 4 - 에피토프 매핑
여기에서 생성된 항체에 의해 결합된 에피토프의 일부인 TGF-βRII의 잔기를 확인하기 위해 표준 기술을 사용하여 샷건 돌연변이 유발 실험을 수행하였다 (Davidson and Doranz, 2014). 샷건 돌연변이유발 접근법에서 대조군으로서, 서열 번호 98을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 사용하였다. 이 항체는 수용체에 대한 리간드 결합을 차단할 수 없었고 모든 기능적 TGF-βRII 항체의 존재하에 수용체에 결합할 수 있었다. 결과는 도 7에 나타낸다.
실시예 5 -TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는 항체의 TGF-βRII 차단 활성
RSVxTGF-βRII 및 항원 AxTGF-βRII 항체를 TGFβ 리포터 검정에서 선별하였다.
본원에 기재된 바와 같은 항원 선택의 VH 영역을 포함하는 TGF-βRII에 결합하는 제1 결합 도메인 및 서열 번호 136에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 RSV에 결합하는 제2 결합 도메인, 또는 TGF-βRII (항원 A)와 동일한 세포에서 발현되는 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 생성되었다. 항원 A는 TGFβ와 반응하지 않거나 TGFβ 리포터 검정에서 시험된 신호 전달 캐스케이드에 영향을 미치지 않는 임의로 선택된 항원이다. 또한, 실시예 1에 기술된 바와 같은 양성 대조군 항체 및 음성 대조군 항체가 포함되었다.
TGFβ 리포터 검정은 SMAD3 및 SMAD4 결합 서열인 CAGA 박스의 12개 카피를 함유하는 CAGA12 루시페라아제 벡터를 사용한다 [Dennler et al, 1998]. TGFβ가 TGF-βRII에 결합하면 TGF-βRI이 인산화된다. TGF-βRI의 인산화는 SMAD2 및 SMAD3의 인산화 및 활성화를 유도하는 신호 캐스케이드를 개시하여, 그런 다음 SMAD4와 복합체를 형성한다. 그런 다음 SMAD 복합체는 핵으로 전위되고 핵의 SMAD 결합 요소(SBE)에 결합하여, TGFβ/ SMAD 반응성 유전자의 전사 및 발현을 유도한다. CAGA12 루시페라아제 리포터는 TGFβ에 의한 활성화를 모니터링하고 포유류 세포에서 리포터를 형질감염시킨 후 TGF-βRII 차단 항체를 선별하는 데 사용할 수 있다.
항원 A를 발현하도록 안정적으로 형질감염된 동결보존된 293FF 세포를 TGFβ 리포터로 일시적으로 형질감염시켰다. IgG를 10 μg/ml 내지 100 pg/ml의 최종 농도에서 시험하였다. IgG를 25 μl의 최종 부피로 첨가하였다 (4배 농축). 이어서, 25 μl의 hTGFβ1 (4배 농축)을 1 ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 50 μL 형질감염된 세포 현탁액 (5 x 104 세포)을 첨가하였다. 100 μL Steady-Glo™ 기질을 각 웰에 첨가하고 5분 동안 배양시켰다. EnVision에서 발광을 측정하고 Graphpad Prism을 사용하여 결과를 분석하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. TGF-βRII에 대한 1가 결합 도메인 및 RSV에 대한 대조군 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 뿐만 아니라 TGF-βRII 및 항원 A에 대한 1가 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 TGF-β와 TGF-βRII의 상호 작용을 차단한다. 서열 번호 76 및 70에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는, TGF-βRII 및 RSV를 표적으로 하는 이중특이적 항체는 2가 단일특이성 양성 대조군 항체만큼 강력하다. 서열 번호 70, 61, 86, 65, 12, 및 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는 TGF-βRII 및 항원 A를 표적으로 하는 이중특이적 항체는 2가 단일특이적 양성 대조군 항체보다 더 강력하다. 따라서, 본 개시내용의 항-TGF-βRII 결합 도메인은 1가 형태에서 필적할 만하고, 동등하며, 우수한 TGF-βRII 차단 능력을 나타내어, 1가 분자, 2가 분자, 또는 다중특이적 분자에 통합된 1 이상의 원자가로서 다양한 적용을 제공한다.
중쇄 가변 영역의 시퀀싱
인간 TGF-βRII에 결합하고 그의 리간드와의 상호 작용을 차단하는 것으로 확인된 선택된 항체의 VH 영역 암호화 핵산을 시퀀싱하였다. 서열 정보는 하기에 제공된다.
서열
서열 번호 1: 카밧에 따른 HCDR1
IYAMT
서열 번호 2: 카밧에 따른 HCDR2
VISGSGGTTYYADSVKG
서열 번호 3: 카밧에 따른 HCDR3
RGQYRDIVGATDY
서열 번호 4: 카밧에 따른 HCDR1
NAWMS
서열 번호 5: 카밧에 따른 HCDR2
RIKTTISGGATDFAAPVKG
서열 번호 6: 카밧에 따른 HCDR3
DLRDY
서열 번호 7: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 8: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRTHNTDSVKG
서열 번호 9: 카밧에 따른 HCDR3
GIAASGKNYFDP
서열 번호 10: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYRDIVGATDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 11: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTISGGATDFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 12: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFR RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDRTHNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GIAASGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 13: IMGT에 따른 LCDR1
QSISSY
서열 번호 14: IMGT에 따른 LCDR2
AAS
서열 번호 15: IMGT에 따른 LCDR3
QQSYSTPPT
서열 번호 16: 경쇄 가변 영역
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK
서열 번호 17: 중쇄 불변 영역
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 18: 경쇄 불변 영역
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 19: 카밧에 따른 LCDR1
RASQSISSYLN
서열 번호 20: 카밧에 따른 LCDR2
AASSLQS
서열 번호 21: 카밧에 따른 LCDR3
QQSYSTPPT
서열 번호 22: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 23: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 24: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 25: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRSQYRDKVGATDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 26: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFD INAMT WVRQAPGKGLEWVS VISGSGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RGQYREIAGATDY WGQGTLVTVSS
서열 번호 27: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 28: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 29: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 30: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFD IYAMT WVRQAPGKGLEWVS VISGSGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RGQYRRIVGATDY WGQGTLVTVSS
서열 번호 31: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 32: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 33: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 34: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 35: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYRHIAGATDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 36: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYRDIVGATDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 37: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDINAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYREIQGANDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 38: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 39: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSRAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTVSGGATAFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRAYWGQGTLVTVSS
서열 번호 40: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 41: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 42: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSRAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTISGGATDFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRAYWGQGTLVTVSS
서열 번호 43: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 44: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 45: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 46: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 47: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 48: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFANAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTYSGGATDFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRKYWGQGTLVTVSS
서열 번호 49: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 50: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 51: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 52: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 53: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 54: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 55: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 56: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 57: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 58: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 59: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIAKSGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 60: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 61: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 62: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 63: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 64: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIFASGKHYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 65: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFG RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDRHHNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GIAKSGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 66: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 67: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTLNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAARGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 68: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 69: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 70: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFS RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDRTKNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GTAAAGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 71: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 72: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTIRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSYISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTANSGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 73: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAARGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 74: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFERYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTQNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAASGRNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 75: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFEFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISAGGDRTANTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAARGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 76: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFAFR RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDRTQNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GTAASGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 77: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTLNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAARGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 78: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFEFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTDNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIARSGKNFFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 79: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFNFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVTGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGLAASGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 80: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFAFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISAHGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGTAASGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 81: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 82 중쇄 가변 영역
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서열 번호 83: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 84: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 85: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFKFR RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDYTHNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GIAKSGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 86: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFAFR RYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISASGDRTRNTDSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAK GIATSGKNYFDP WGQGTLVTVSS
서열 번호 87: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 88: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 89: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 90: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 91: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFRFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIAARGKNFFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 92: 중쇄 가변 영역
EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSS
서열 번호 93: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 94: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 95: 중쇄 가변 영역
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서열 번호 96: 중쇄 가변 영역
QVQLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINTSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGIAASGKNYFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 97: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSTKYSADSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKEGWSFDSSGYRSWFDSWGQGTLVTVSS
서열 번호 98: 중쇄 가변 영역
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSFRGGYTAFDVWGQGTLVTVSS
서열 번호 99: IGKV1-39
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
서열 번호 100: IGKV1-39/jk5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
서열 번호 101: 동형 A 인간 TGF-βRII MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVK F PQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK
서열 번호 102: 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVK F PQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
서열 번호 103: 동형 B 인간 TGFβRII
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK
서열 번호 104: 인간 TGF-βRII의 동형 B의 세포외 도메인
TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVK F PQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
서열 번호 105: 카밧에 따른 HCDR1
NAWMS
서열 번호 106: 카밧에 따른 HCDR2
RIKTTISGGATQFAAPVKG
서열 번호 107: 카밧에 따른 HCDR3
DLRDY
서열 번호 108: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 109: 카밧에 따른 HCDR2
AISAGGDRTANTDSVKG
서열 번호 110: 카밧에 따른 HCDR3
GTAARGKNYFDP
서열 번호 111: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 112: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRTKNTDSVKG
서열 번호 113: 카밧에 따른 HCDR3
GTAAAGKNYFDP
서열 번호 114: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 115: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRYHNTDSVKG
서열 번호 116: 카밧에 따른 HCDR3
GTAASGKNYFDP
서열 번호 117: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 118: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRTHNTDSVKG
서열 번호 119: 카밧에 따른 HCDR3
GTAARGKNYFDP
서열 번호 120: 카밧에 따른 HCDR1
NYWMS
서열 번호 121: 카밧에 따른 HCDR2
RIKTTYSGGATDFAAPVKG
서열 번호 122: 카밧에 따른 HCDR3
DLRDY
서열 번호 123: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 124: 카밧에 따른 HCDR2
SISASGDRTHNTDSVKG
서열 번호 125: 카밧에 따른 HCDR3
GLAASGKNYFDP
서열 번호 126: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 127: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRTDNTDSVKG
서열 번호 128: 카밧에 따른 HCDR3
GIARSGKNFFDP
서열 번호 129: 카밧에 따른 HCDR1
RAWMS
서열 번호 130: 카밧에 따른 HCDR2
RIKTTISGAATDFAAPVKG
서열 번호 131: 카밧에 따른 HCDR3
DLRDY
서열 번호 132: 카밧에 따른 HCDR1
RYAMS
서열 번호 133: 카밧에 따른 HCDR2
AISASGDRTLNTDSVKG
서열 번호 134: 카밧에 따른 HCDR3
GTAARGKNYFDP
서열 번호 135: 경쇄 가변 영역
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
서열 번호 136: 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSTKYSADSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAKEGWSFDSSGYRSWFDSWGQGTLVTVSS
SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> TGF-beta-RII BINDING PROTEINS <130> P125432PC00 <140> PCT/NL2020/050813 <141> 2020-12-22 <150> NL 2024576 <151> 2019-12-24 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 1 Ile Tyr Ala Met Thr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 2 Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 3 Arg Gly Gln Tyr Arg Asp Ile Val Gly Ala Thr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 4 Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 5 Arg Ile Lys Thr Thr Ile Ser Gly Gly Ala Thr Asp Phe Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<220> <223> amino acid sequence <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Thr Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ile Ala Ala Thr Gly Lys Asn Tyr Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Thr Ser Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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sequence <400> 97 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Trp Ser Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Arg Ser Trp Phe 100 105 110 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 98 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 98 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser 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Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn 180 185 190 Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys 195 200 205 Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg 210 215 220 Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu 225 230 235 240 Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala 245 250 255 Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu 260 265 270 Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys 275 280 285 Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile 290 295 300 Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln 305 310 315 320 Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr 325 330 335 Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys 355 360 365 Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn 370 375 380 Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser 405 410 415 Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser 420 425 430 Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr 435 440 445 Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val 450 455 460 Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu 465 470 475 480 His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly 485 490 495 Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met 500 505 510 Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg 515 520 525 Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu 530 535 540 Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp 545 550 555 560 Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 565 <210> 102 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 1 5 10 15 Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 20 25 30 Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 35 40 45 Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 50 55 60 Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 65 70 75 80 Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 85 90 95 Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 100 105 110 Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln 130 135 140 <210> 103 <211> 592 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 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Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys 245 250 255 Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp 260 265 270 Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu 275 280 285 Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe 290 295 300 Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser 305 310 315 320 Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu 325 330 335 Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe 340 345 350 His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser 355 360 365 Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala 370 375 380 His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile 385 390 395 400 Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu 405 410 415 Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr 420 425 430 Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg 435 440 445 Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val 450 455 460 Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp 465 470 475 480 Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu 485 490 495 Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met 500 505 510 Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe 515 520 525 Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu 530 535 540 Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala 545 550 555 560 Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser 565 570 575 Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 580 585 590 <210> 104 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu 20 25 30 Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 50 55 60 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 65 70 75 80 Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 85 90 95 Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 100 105 110 Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 115 120 125 Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 130 135 140 Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 145 150 155 160 Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln 165 <210> 105 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 105 Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 106 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 106 Arg Ile Lys Thr Thr Ile Ser Gly Gly Ala Thr Gln Phe Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 107 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 107 Asp Leu Arg Asp Tyr 1 5 <210> 108 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 108 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 109 Ala Ile Ser Ala Gly Gly Asp Arg Thr Ala Asn Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 110 Gly Thr Ala Ala Arg Gly Lys Asn Tyr Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 111 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 112 Ala Ile Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Lys Asn Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 113 Gly Thr Ala Ala Ala Gly Lys Asn Tyr Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 114 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 115 <211> 17 <212> PRT 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<400> 128 Gly Ile Ala Arg Ser Gly Lys Asn Phe Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 129 Arg Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 130 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 130 Arg Ile Lys Thr Thr Ile Ser Gly Ala Ala Thr Asp Phe Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 131 Asp Leu Arg Asp Tyr 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 132 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 133 Ala Ile Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Leu Asn Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 134 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence <400> 134 Gly Thr Ala Ala Arg Gly Lys Asn Tyr Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 135 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 135 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Ala Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Trp Ser Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Arg Ser Trp Phe 100 105 110 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims (40)

  1. 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-βRII의 동형(isoform) A의 위치 25, 또는 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 50에 있는 페닐알라닌 (F)이 결합에 중요한 잔기인 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인의 에피토프에 결합하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 에피토프의 위치 119, 또는 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 144에 있는 아스파르테이트 (D)가 결합에 대한 추가의 중요한 잔기인, 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 에피토프의 위치 52, 또는 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 77에 있는 트레오닌 (T)이 결합에 대한 추가의 중요한 잔기인, 항체 또는 항체 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 TGF-βRII의 동형 A의 세포외 도메인의 에피토프의 위치 54에 있는 이소류신 (I) 및 위치 120에 있는 글루타메이트 (E), 또는 인간 TGF-βRII의 동형 B의 위치 79 및 145에 있는 이소류신 (I) 및 글루타메이트 (E)가 결합에 대한 추가의 중요한 잔기인, 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 하기로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 중 어느 하나를 포함하고,
    (A) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;
    (B) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;
    (C) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3,
    여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있는, 항체 또는 항체 단편.
  6. 인간 TGF-βRII의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항체 단편은 하기로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 중 어느 하나를 포함하고,
    (A) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;
    (B) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;
    (C) 하기를 갖는 VH:
    (a) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1,
    (b) 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3,
    여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역이 체세포 돌연변이(들)를 포함할 수 있는 생식계열 V 유전자 IGHV3-15 및 IGHV3-23에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 상응하는 것인, 항체 또는 그의 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기로부터 선택된 VH 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항체 단편:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDIYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGQYRDIVGATDYWGQGTLVTVSS (서열 번호 10);
    QVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKTTISGGATDFAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDLRDYWGQGTLVTVSS (서열 번호 11);
    QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFRRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISASGDRTHNTDSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKGIAASGKNYFDPWGQGTLVTVSS (서열 번호 12),
    또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 22-91 중 어느 하나로부터 선택된 VH 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 하기를 갖는 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하고,
    (a) 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1,
    (b) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3,
    여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 VL 아미노산 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK (서열 번호 16),
    또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  12. 제1항 내지 제8항, 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 10, 11 또는 12의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 22-91 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  14. 제1항 내지 제8항 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 10의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역, 서열 번호 11의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 12의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호 22-91 중 어느 하나의 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체인, 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 항체 또는 IgG4 항체인, 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 항체인, 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 그의 항체 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 수용체에 대한 항체의 결합이 제거되거나 감소되는 것인, 항체.
  22. 인간 TGF-βRII에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 항체가 하기를 포함하는 항체:
    (A) 서열 번호 10-12 및 서열 번호 22-91로부터 선택된 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 중쇄; 및
    (B) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인, 항체 또는 그의 단편.
  24. 인간 TGF-βRII에 특이적으로 결합하는 결합 도메인으로서, 상기 결합 도메인은 하기로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 중 어느 하나를 포함하고:
    (A) 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (B) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (C) 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (D) 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (E) 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (F) 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (G) 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (H) 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    (I) 서열 번호 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH; 및
    (J) 서열 번호 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 갖는 VH;
    여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있는, 결합 도메인.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 결합 도메인이 서열 번호 12, 26, 30, 40, 61, 65, 70, 76, 85 및 86으로부터 선택된 VH 아미노산 서열,
    또는 그에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열
    을 포함하는, 결합 도메인.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인이 하기를 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하고,
    (a) 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1,
    (b) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, 및
    (c) 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3,
    여기서 1 내지 5개의 아미노산 잔기(들)는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3으로부터 선택된 CDR(들) 중 어느 하나 이상에서 그의 보존적 아미노산(들)으로 치환될 수 있는, 결합 도메인.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 결합 도메인이 VL 아미노산 서열:
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK (서열 번호 16),
    또는 이에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열
    을 포함하는, 결합 도메인.
  28. TGF-βRII에 결합하기 위한 1가 항체 또는 항체 단편으로서, 상기 항체 또는 항체 단편은, 동일한 분석에서, 서열 번호 97에 제시된 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 135에 제시된 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 2가 단일특이적 대조군 항체와 비교할 때, 등몰 농도에서 적어도 필적하거나 동일하거나 더 높은 수용체 차단 활성을 갖는 것인, 항체 또는 항체 단편.
  29. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 상기 청구항에 정의된 바와 같은 TGF-βRII 결합 도메인을 포함하는, 항체.
  30. 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  31. 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인을 생산하는 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포는 제30항에 청구된 벡터로 형질전환된 재조합 세포인 것인, 세포.
  33. 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  34. 암의 예방, 증상 진행 또는 재발의 억제 및/또는 치료에 사용하기 위한 약학 제제로서, 상기 약학 제제는 활성 성분으로서, 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 그의 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인을 포함하는 약학 제제.
  35. 제34항에 있어서, 암이 정상 TGF-β 신호전달보다 높은, 특히 정상 TGF-βRII 발현보다 높은 것과 상관관계가 있는 암 유형인, 약학 제제.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 경부암, 간세포암종, 비소세포폐암, 소세포 폐암, 흑색종, 골수이형성 증후군, 췌장암, 전립선암 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 제제.
  37. 유효량의 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인, 또는 제33항에 청구된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  38. 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인을 세포에 제공하는 단계, 및 상기 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인이 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하도록 하여 세포 상의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합을 차단하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 세포의 인간 TGF-βRII에 대한 인간 TGF-β의 결합에 의해 유도되는 세포로의 신호 전달을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인을 세포에 제공하는 단계, 및 상기 항체 또는 항체 단편, 또는 결합 도메인이 세포의 인간 TGF-βRII에 결합하도록 하여 세포로의 신호 전달을 억제하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 유효량의 제1항 내지 제23항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 청구된 항체 또는 항체 단편, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 청구된 결합 도메인, 또는 제33항에 청구된 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 전이를 예방 또는 억제하는 방법.
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