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KR20220116221A - Bcma를 표적화하는 단일 도메인 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

Bcma를 표적화하는 단일 도메인 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이들의 사용 방법 Download PDF

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Publication number
KR20220116221A
KR20220116221A KR1020227023638A KR20227023638A KR20220116221A KR 20220116221 A KR20220116221 A KR 20220116221A KR 1020227023638 A KR1020227023638 A KR 1020227023638A KR 20227023638 A KR20227023638 A KR 20227023638A KR 20220116221 A KR20220116221 A KR 20220116221A
Authority
KR
South Korea
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seq
amino acid
acid sequence
bcma
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020227023638A
Other languages
English (en)
Inventor
샤오후 판
취추안 주앙
윤청 자오
레이 양
수 팡
창밍 수
Original Assignee
난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/CN2020/112182 external-priority patent/WO2021037222A1/en
Application filed by 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. filed Critical 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디.
Publication of KR20220116221A publication Critical patent/KR20220116221A/ko
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Abstract

세포외 항원 결합 도메인으로서, 제1 BCMA 결합 모이어티 및 제2 BCMA 결합 모이어티를 포함하되, 제1 BCMA 결합 모이어티는 제1 항-BCMA 단일 도메인 항체이고, 제2 BCMA 결합 모이어티는 제2 항-BCMA sdAb이고; 제1 sdAb 및 제2 sdAb의 각각은 VHH 도메인인, 상기 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).

Description

BCMA를 표적화하는 단일 도메인 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이들의 사용 방법
상호참조
본 출원은 2019년 12월 16일자로 출원된 국제특허출원 PCT/CN2019/125681, 2020년 8월 28일자로 출원된 국제특허출원 PCT/CN2020/112181 및 2020년 8월 28일자로 출원된 국제특허출원 PCT/CN2020/112182의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록
본 출원은 2020년 12월 14일자로 생성되었고, 용량이 118,439 바이트이며, 파일명 "14651-013-228_SEQ_LISTING"의 텍스트 형식으로서 본 출원과 함께 제출된 서열목록을 참조에 의해 원용한다.
1. 기술분야
BCMA를 표적화하는 단일 도메인 항체, 및 하나 이상의 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(예컨대, 이중-에피토프 CAR을 포함하는 다가 CAR)가 제공된다. 추가로 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 제공된다. 암을 치료하는 약제학적 조성물, 키트 및 방법이 또한 제공된다.
종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17(TNFRSF17)로도 알려진 B-세포 성숙 항원(BCMA)은 성숙 B 림프구에 의해 우선적으로 발현되고, 이의 과발현 및 활성화는 다발성 골수종과 같은 인간암과 연관된다. 문헌[Shah et al., Leukemia, 34: 985-1005 (2020)].
다발성 골수종(MM)은 B-세포 신생물로 범주화되고 골수에서 제어될 수 없는 방법으로 증식하여, 혈액 세포의 정상적 대사 생성을 방해하고 고통스러운 골 병변을 야기하는, 불치의 공격적인 혈장 악성종양이다(Garfall, A.L. et al., Discovery Med. 2014, 17, 37). 다발성 골수종은 임상적으로 고칼슘혈증, 신기능부전, 빈혈, 골 병변, 박테리아 감염, 과다점도 및 아밀로이드증과 함께 존재할 수 있다(Robert Z. Orlowski, Cancer Cell. 2013, 24(3)). 연구 및 통계에 따르면, 매년 거의 86,000명의 환자가 골수종으로 진단되는 한편, 매년 약 63,000명의 환자가 질환-관련 합병증으로 사망한다(Becker, 2011). 노인 집단때문에, 골수종 사례의 수는 해마다 증가할 것으로 예측된다. 다수의 암처럼, 다발성 골수종의 원인은 알려져 있지 않으며, 치료되지 않는다. 다발성 골수종에 대한 일부 치료는 다른 암에 대한 치료, 예컨대, 화학요법 또는 방사선 치료, 줄기 세포 이식 또는 골수 이식, 표적치료 또는 생물요법과 유사하다(George, 2014). 항체-기반 세포 면역요법은 혈액 악성종양, 특히 B 세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자에 대해 실질적인 임상적 이익이 입증되었다. 다발성 골수종에 대한 현재의 요법은 종종 관해를 야기하지만, 거의 모든 환자는 종국적으로 재발한다. 다발성 골수종을 치료하기 위한 효과적인 면역치료제에 대한 필요가 있다.
키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 요법은, 특히 혈액 악성종양에서 최근에 생긴 효과적인 암 면역요법이다. 그러나, CAR-T 세포의 적용은 사이토카인 방출 증후군 및 종양 표적 외 독성(on-target off-tumor toxicity)과 같은 유해효과에 의해 방해된다(Yu et al., Molecular Cancer 18 (1): 125 (2019)). 개선된 결합 분자 및 조작된 세포가 필요하다. 예를 들어, 보다 효과적이거나 효율적인 CAR-T 요법에서 사용하기 위한 안정적이고 치료적으로 효과적인 BCMA 결합 분자를 개발할 필요성이 있다.
일 양상에서, (a) 제1 BCMA 결합 모이어티 및 제2 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서, 제1 BCMA 결합 모이어티는 제1 항-BCMA 단일 도메인 항체이고, 제2 BCMA 결합 모이어티는 제2 항-BCMA sdAb이고; 제1 sdAb 및 제2 sdAb의 각각은 VHH 도메인인, 상기 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공되되, (i) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; (ii) 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호　5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 항-BCMA sdAb는 제2 항-BCMA sdAb의 N-말단에 있다. 다른 실시형태에서, 제1 항-BCMA sdAb는 제2 항-BCMA sdAb의 C-말단에 있다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28에서 유래된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함하되, CMSD는 선택적으로 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 연결된 복수의 면역-수용체 타이로신-기반 활성화 모티프("CMSD ITAM")를 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단까지: 선택적 N-말단의 서열 - CD3δ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 선택적 제3 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 C-말단의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 CD137의 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 추가로 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치된 단일 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된다.
다른 양상에서, 서열번호 23 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 단리된 핵산은 서열번호 35 내지 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, CAR, 단리된 핵산 또는 본 명세서에 제공된 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포는 외인성 Nef 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 아형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 외인성 Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 다른 실시형태에서, 외인성 Nef 단백질은 돌연변이체 Nef이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단의 α-나선구조, 타이로신-기반 AP 보충(recruitment), CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 보충 도메인, 다이-류신 기반 AP 보충 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 SIV Nef(돌연변이체 SIV Nef M116)이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 유효량의 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다.
또 다른 양상에서, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 항-BCMA 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, sdAb는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-BCMA sdAb는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항-BCMA sdAb는 낙타과 sdAb이다. 다른 실시형태에서, 항-BCMA sdAb는 인간화된 sdAb이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 항-BCMA sdAb을 암호화하는 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, (a) 본 명세서에 제공된 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 CAR, 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양상에서, 유효량의 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
도 1은 각각 5:1 및 1:1의 상이한 E:T 비로 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에 대한 BCMA CAR-T 세포(GSI5021 및 LIC948A22 CAR-T 세포)의 비 세포독성(specific cytotoxicity)을 도시한 도면. "UnT"는 대조군으로서 작용한 비형질도입 T 세포를 나타낸다.
도 2는 GSI5021 및 LIC948A22 CAR-T 세포의 생체내 효능을 도시한 도면. NCG 마우스에 14일 후, HBSS, 비형질도입된 T 세포(UnT), LIC948A22 CAR-T 세포 및 GSI5021 CAR-T 세포(제0일로 언급)로 별도로 처리한, 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc를 생착시켰다. 마우스를 생물발광 영상화에 의해 종양 성장을 모니터링하기 위해 제-1일 및 제0일 기준으로부터 매주 평가하였다.
도 3은 각각 2:1, 1:1 및 1:2의 상이한 E:T 비로 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에 대한 인간화된(LIC948A22H31-LIC948A22H37) 및 비-인간화된 BCMA CAR-T 세포(LIC948A22)의 비 세포독성을 도시한 도면. "UnT"는 대조군으로서 작용한 비형질도입 T 세포를 나타낸다.
도 4는 인간화된 (LIC948A22H34 및 LIC948A22H37) 및 비-인간화된 BCMA CAR-T 세포(LIC948A22)의 생체내 효능을 도시한 도면. NCG 마우스에 14일 후, HBSS, 비형질도입된 T 세포(UnT), LIC948A22H34 CAR-T 세포, LIC948A22H37 CAR-T 세포 및 LIC948A22 CAR-T 세포(제0일로 언급)로 별도로 처리한, 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc를 생착시켰다. 마우스를 생물발광 영상화에 의해 종양 성장을 모니터링하기 위해 제-1일 및 제0일 기준으로부터 매주 평가하였다.
도 5는 LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 각각 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 T 세포의 TCRαβ 발현을 도시한 도면. "UnT"는 대조군으로서 작용한 비형질도입 T 세포를 나타낸다.
도 6은 5:1, 2.5:1 및 1.25:1의 상이한 E:T 비로 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에서 LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37를 별도로 발현시키는 T 세포의 상대 사멸 효율을 도시한 도면. "UnT"는 대조군으로서 작용한 비형질도입 T 세포를 나타낸다.
본 개시내용은 BCMA에 결합하는 신규한 단일 도메인 항체 및 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 조작된 세포, 및 이들의 개선된 특성에 부분적으로 기반한다.
5.1. 정의
본 명세서에 기재된 또는 참조로 되는 기법 및 절차는 당업자에 의한 통상적인 방법, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); 및 Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and
Figure pct00001
eds., 2d ed. 2010)]에 기재되어 있는 널리 이용되는 방법을 이용하여 일반적으로 잘 이해되고/되거나 통상적으로 사용되는 것을 포함한다. 본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 설명에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하는 목적을 위해, 용어의 다음의 설명을 적용할 것이며, 적절한 경우, 단수로 사용되는 용어는 또한 복수를 포함할 것이며, 그 반대도 포함할 것이다. 용어의 임의의 설명이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 임의의 문헌과 상충되는 경우에, 이하에 제시되는 용어의 설명으로 제어할 것이다.
용어 "항체", "면역글로불린" 또는 "Ig"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는, 예를 들어, 단클론성 항체(작용제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 무손상 단클론성 항체를 포함), 폴리에피토프 또는 모노에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다클론성 또는 1가 항체, 다가 항체, 이하에 기재하는 적어도 2개의 무손상 항체, 단일쇄 항체 및 이들의 단편(예를 들어, 도메인 항체)으로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이중특이성 항체)를 아우른다. 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 친화도 성숙뿐만 아니라 다른 종, 예를 들어, 마우스, 토끼, 라마 등으로부터의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된 폴리펩타이드의 면역글로불린 부류 내의 B 세포의 폴리펩타이드 생성물을 포함하는 것으로 의도되되, 각각의 쌍은 1개의 중쇄(약 50 내지 70kDa) 및 1개의 경쇄(약 25kDa)를 갖고, 각 쇄의 각각의 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각 쇄의 각 카복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); 및 Kuby, Immunology (3d ed. 1997)]을 참조한다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 낙타과 종(예를 들어, 라마 또는 알파)로부터 유래된 단일 도메인 항체 또는 이들의 인간화된 변이체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체 및 상기 중 어느 것의 기능성 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들은 단편이 유래된 항체의 결합 활성 중 일부 또는 모두를 보유하는 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 부분을 지칭한다. 기능성 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)의 비제한적 예는 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이성, 이중특이성 등을 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화물-연결된 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 특히, 본 명세서에 제공된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어, 항원-결합 도메인 또는 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224;
Figure pct00002
and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990)]에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체는 임의의 부류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 작용제 항체 또는 길항제 항체일 수 있다. 항체는 작용성도 아니고 길항성도 아닐 수 있다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 구조이다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연 유래 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 항원은 세포와 연관되며, 예를 들어, 세포 상에 또는 세포에 존재한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 영역, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩타이드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만, 4-쇄 항체에서 보통 발견되는 경쇄를 결여하는 기능성 항체를 지칭한다. 낙타과 동물(예컨대, 낙타, 라마 또는 알파카)은 HCAb를 생성하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 항원 결합할 수 있는(예를 들어, BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체인) 단일 단량체 가변 항체 도메인을 지칭한다. 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VHH 도메인을 포함한다. 단일 도메인 항체의 예는 자연적으로는 경쇄가 없는 항체, 예컨대, 낙타과(예를 들어, 라마)로부터의 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래된 것이 아닌 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 낙타과 종에서, 예를 들어, 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 생긴 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산할 수 있고; 이러한 다른 종으로부터 유래된 VHH는 본 발명의 범주 이내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 구조를 갖는다. 단일 도메인 항체는 유전적으로 융합되거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 다른 분자(예를 들어, 제제)에 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 보다 큰 결합 분자(예를 들어, 다중특이성 항체 또는 키메라 항원 수용체)의 부분일 수 있다.
용어 "결합한다" 또는 "결합하는"은, 예를 들어, 복합체 형성을 비롯한, 분자 사이의 상호작용을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반데르 발스 상호작용을 포함하는 비공유 상호작용일 수 있다. 복합체는 또한 공유 또는 비공유 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 유지되는 2개 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체 상의 단일 항원-결합 부위와 항원과 같은 표적 분자의 단일 에피토프 사이의 총 비공유 상호작용의 강도는 해당 에피토프에 대한 항체 또는 기능성 단편의 친화도이다. 1가 항원에 대한 결합 분자(예를 들어, 항체)의 해리 속도(koff) 대 결합 속도(kon)의 비(koff/kon)는 친화도와 반비례 관계가 있는 해리 상수 KD이다. KD 값이 낮을수록, 항체의 친화도는 더 높다. KD의 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 대해 달라지며, kon과 koff 둘 다에 따른다. 본 명세서에 제공된 항체에 대한 해리 상수 KD는 본 명세서에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 잘 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서 친화도는 항체와 항원 사이의 상호작용의 정확한 강도를 항상 반영하지는 않는다. 다중, 반복 항원 결정소, 예컨대, 다가 항원을 포함하는 복합체 항원이 다중 결합 부위를 포함하는 항체와 접촉될 때, 하나의 부위에서의 항체와 항원의 상호작용은 제2 부위에서의 반응 확률을 증가시킬 수 있을 것이다. 다가 항체와 항원 사이의 이러한 다중 상호작용 강도는 결합활성으로 불린다.
본 명세서에 기재된 결합 분자와 관련하여, "~에 결합하다", "에 특이적으로 결합하다"와 같은 용어 및 유사한 용어는 또한 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 폴리펩타이드와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 결합 분자를 지칭한다. 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 면역분석법, Octet®, Biacore® 또는 당업자에게 공지된 다른 기법에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 실험 기법, 예컨대, 방사면역분석법(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 결정된 바와 같은 임의의 교차-반응성 항원보다 더 높은 친화도로 항원에 결합할 때 항원에 결합하거나 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배일 것이며, 배경의 10배 초과일 수 있다. 예를 들어, 결합 특이성에 관한 논의에 대해 문헌[Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989)]을 참조한다. 특정 실시형태에서, "비-표적" 단백질에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합 정도는 표적 항원, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 RIA에 의해 결정된 바와 같이, 특정 표적 항원에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인 결합의 약 10% 미만이다. 결합 분자가, 예를 들어, 항원을 표적화함에 있어서 치료제 및/또는 진단제로서 유용하도록, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 해리 상수(KD)가 1μM, 800nM, 600nM, 550nM, 500nM, 300nM, 250nM, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM 또는 0.1nM 이하이다. 특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 상이한 종으로부터의 항원 중에서 보존된 항원의 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 한편, 쇄(들)의 나머지가 다른 종으로부터 유래된 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이거나 다른 항체 부류 또는 하위부류뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 "키메라" 서열을 포함할 수 있다(미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55]을 참조한다). 키메라 서열은 인간화된 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 천연 CDR 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 낙타과, 마우스, 래트(rat), 토끼 또는 비인간 영장류 비인간 종(예를 들어, 공여자 항체)의 대응하는 CDR로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(예를 들어, 수용자 항체)으로부터의 서열을 포함하는 비인간(예를 들어, 낙타과, 뮤린, 비-인간 영장류) 항체의 "인간화" 형태 일부를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린 서열의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 인간화된 항체 중쇄 또는 경쇄는 적어도 하나 이상의 가변 영역의 실질적으로 모두를 포함할 수 있으며, 이때 CDR의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 FR의 모두 또는 실질적으로 모두이다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 추가 상세한 설명을 위해, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-29 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992)]; 미국 특허 제6,800,738호; 제6,719,971호; 제6,639,055호; 제6,407,213호; 및 제6,054,297호를 참조한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 상기 용어는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고 인간 가변 영역 및, 예를 들어, 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 결합 분자는 단일 도메인 항체 서열을 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 상기 용어는 인간 유래의 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. "완전 인간" 항체는, 특정 실시형태에서, 또한 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 포함할 수 있고, 인간 생식계열 면역글로불린 핵산 서열의 천연 유래 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 암호화된다. 용어 "완전 인간 항체"는 문헌[Kabat et al]에 의해 기재된 바와 같은 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 대응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. (문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조). "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 대응하고/하거나 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 이용해서 제조된 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이런 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., Nature Protocols 1: 755-68 (2006))를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 또한 인간 단클론성 항체의 제조를 위해 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991); 및 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)]에 기재되어 있는 방법을 이용 가능하다. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 이의 내인성 좌위는 무력화된 유전자이식 동물, 예를 들어, 마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관해 문헌[Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66 (1995);
Figure pct00003
and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58 (1997)]; 및 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통한 인간 항체에 관해, 예를 들어, 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 (2006)]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "재조합 인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 상기 어구는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체, 재조합으로부터 단리된 항체, 조합적 인간 항체 라이브러리, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식되고/되거나 염색체이식(transchromosomal)된 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor, L. D. et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992)] 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에 관여하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 유전자이식이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발)되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고, 이와 관련되지만, 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
특정 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "단클론성 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하고, 예를 들어, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 또는 잘 공지된 번역 후 변형, 예컨대, 아미노산 이성질화 또는 탈아마이드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아마이드화를 제외하고 동일하며, 각 단클론성 항체는 전형적으로 항원 상의 단일 에피토프를 인식할 것이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론성 항체"는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생성된 항체이다. 용어 "단클론성"은 항체를 제조하기 위한 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용에서 유용한 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 이용하여 이루어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단클론성 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론성 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)]을 참조한다.
전형적인 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 이형사량체 당단백질이다. IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1개의 공유 이황화결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 이황화결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적 간격의 쇄내 이황화물 브리지를 가진다. 각 H 쇄는 N 말단에서, 가변 도메인(VH), 그 이후에 α와 γ 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ와 ε 아이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 사슬은 N 말단에서 가변 도메인(VL)을 갖고, 이후에 이의 다른 단부에서 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH에 맞추어 정렬되고, CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)에 맞추어 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍은 단일 항원-결합 부위를 함께 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed. 1994); 및 Immunobiology (Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)]을 참조한다.
용어 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 항원에 결합하는 항체 영역을 지칭한다. 통상적인 IgG는 보통 2개의 Fab 영역을 포함하며, 각각은 Y-형 IgG 구조의 2개 아암(arm) 중 하나에 존재한다. 각각의 Fab 영역은 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 전형적으로 구성된다. 더 구체적으로는, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역에서 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시내용에 따른 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방법으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있고, VL 및 CL 영역은 통상적인 IgG의 Fab 영역과 유사하게 별개의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있다. 대안적으로, VH, CH1, VL 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩타이드 상에 있을 수 있고 이하의 부문에서 더욱 상세하게 기재하는 바와 같이 상이한 순서로 배향된다.
용어 "가변 영역", "가변 도메인", "V 영역" 또는 "V 도메인"은 경쇄 또는 중쇄의 암이노-말단에 일반적으로 위치되고 중쇄에서 약 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노산 길이를 갖고, 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는, 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 용어 "가변"은 가변 영역의 특정 세그먼트가 항체 간 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. V 영역은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110-아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 그러나, V 영역은 각각 9 내지 12개의 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 보다 큰 가변성(예를 들어, 극도의 가변성)의 보다 짧은 영역에 의해 분리된 약 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 덜 가변적인(예를 들어, 상대적 비변이체) 신장으로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β 시트 입체배치를 대체로 채택하는 4개의 FR을 각각 포함하여, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β 시트 구조의 부분을 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근위에 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)] 참조). 불변 영역은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존적 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 가변 영역은 상이한 상체 사이의 서열이 광범위하게 다르다. 구체적 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
용어 "Kabat에 따른 가변 영역 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서 항체 편집의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 대해 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이들에 삽입에 상응하는 보다 소수의 또는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 잔기 82 뒤에 3개의 삽입된 잔기(예를 들면, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 언급할 때에 사용된다(예를 들면, 문헌[Kabat et al., 상기 참조]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지표"는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 언급할 때에 사용된다(예컨대, 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서 보고된 EU 지표). "Kabat에서의 EU 지표"는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 다른 넘버링 시스템은, 예를 들어, AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon에 의해 기재되었다.
항체에 대해 사용될 때 "중쇄"라는 용어는 약 50 내지 70kDa의 폴리펩타이드 쇄를 지칭하되, 아미노-말단의 부분은 약 120 내지 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카복시-말단의 부분은 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기반하여 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5가지의 별개의 유형(예를 들어, 아이소타입) 중 하나일 수 있다. 별개의 중쇄는 크기가 다르며: α, δ 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하는 반면, μ 및 ε은 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 경쇄와 조합될 때, 이들 별개 유형의 중쇄는 IgG의 4가지 하위부류, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는, 항체의 5가지 잘 알려진 부류(예를 들어, 아이소타입), 즉, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 생성한다.
항체에 대해 사용될 때 "경쇄"라는 용어는 약 25kDa의 폴리펩타이드 쇄를 지칭하되, 아미노-말단의 부분은 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 카복시-말단의 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄의 대략의 길이는 211 내지 217개의 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파(κ) 또는 람다(λ)로 지칭되는 2가지 별개 유형이 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "초가변 영역", "HVR", "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 상호 호환적으로 사용된다. "CDR"은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 프레임워크 내의 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 지칭한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 배치된 가변 영역이다.
CDR 영역은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 잘 공지된 넘버링 시스템에 의해 정해졌다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 다양성을 기준으로 하고 가장 통상적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 상기 참조; Nick Deschacht et al., J Immunol 2010; 184:5696-5704] 참조). 대신에 Chothia는 구조적 루프의 위치를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)] 참조). Kabat 넘버링 규약을 이용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다(이것은 Kabat 넘버링 체계가 H35A와 H35B에서 삽입을 배치하기 때문이며; 35A와 35B 둘 모두 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝나며; 35A만 존재하면, 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B 둘 모두 존재하면, 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 간의 절충안을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(예를 들어, 문헌[Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and
Figure pct00004
eds., 2d ed. 2010)] 참조). "컨택트(contact)" 초가변 영역은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 개발되어 있고 널리 적용되는 다른 보편적 넘버링 시스템은 ImMunoGeneTics(IMGT) Information System®(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))이다. IMGT는 인간 및 기타 척추동물의 면역글로불린(IG), T-세포 수용체(TCR) 및 주조직적합 복합체(MHC)에서 전문화된 통합 정보 시스템이다. 본 명세서에서, CDR은 경쇄 또는 중쇄 내의 아미노산 서열과 위치 둘 다에 대해 지칭된다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내에서 CDR의 "위치"가 종들 간에 보존되고 루프로 불리는 구조에 존재하기 때문에, 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 이용함으로써, CDR 및 프레임워크 잔기는 용이하게 확인된다. 이런 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR의, 전형적으로 인간 항체로부터의 억셉터 프레임워크로의 접합 및 대체에서 사용될 수 있다. 추가적인 넘버링 시스템(AHon)은 문헌[Honegger and
Figure pct00005
, J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001)]에 의해 개발되었다. 예를 들어, Kabat 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함하는 넘버링 시스템 사이의 대응도는 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Kabat, 상기 참조; Chothia and Lesk, 상기 참조; Martin, 상기 참조; Lefranc et al., 상기 참조] 참조). 이들 초가변 영역 또는 CDR 각각으로부터의 잔기는 이하의 표 1에 예시된다.
Figure pct00006
주어진 CDR의 경계는 식별을 위해 사용되는 체계에 따라 다를 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대, 가변 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역"이라는 용어뿐만 아니라 항체의 개개 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2) 또는 이의 영역은 본 명세서에서 상기 기재한 임의의 알려진 체계에 의해 규정되는 바와 같은 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, 특정 CDR 또는 CDR들의 식별을 위한 체계, 예컨대, IMGT, Kabat, Chothia 또는 Contact 방법에 의해 규정되는 바와 같은 CDR이 명시된다. 다른 경우에, CDR의 특정 아미노산 서열이 주어진다. CDR 영역은 또한 다양한 넘버링 시스템의 조합, 예를 들어, Kabat와 Chothia 넘버링 시스템의 조합, 또는 Kabat와 IMGT 넘버링 시스템의 조합에 의해 규정될 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 따라서, "특정 VH 또는 VHH에 제시된 바와 같은 CDR"과 같은 용어는 상기 기재한 예시적인 CDR 넘버링 시스템에 의해 정의되었지만, 이에 의해 제한되지 않는 임의의 CDR1을 포함한다. 일단 가변 영역(예를 들어, VHH, VH 또는 VL)이 주어지면, 당업자는 영역 내의 CDR이 상이한 넘버링 시스템 또는 이들의 조합에 의해 규정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
초가변 영역은 다음과 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24 내지 36 또는 24 내지 34(L1), 46 내지 56 또는 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97 또는 89 내지 96(L3), 및 VH에서 26 내지 35 또는 26 내지 35A(H1), 50 내지 65 또는 49 내지 65(H2) 및 93 내지 102, 94 내지 102 또는 95 내지 102(H3).
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되지는 않지만 Fc 수용체와의 상호작용 같은 다양한 효과기 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카복시 말단 부분을 지칭한다. 상기 용어는 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린의 다른 부분, 즉, 가변 영역에 비하여 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역 및 경쇄의 CL 영역을 포함할 수 있다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 CDR에 측접하는 해당 가변 영역 잔기를 지칭한다. FR 잔기는, 예를 들어, 키메라, 인간화, 인간, 도메인 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체), 다이아바디, 선형 항체 및 이중특이성 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 해당 가변 도메인 잔기이다.
본 명세서의 용어 "Fc 영역"은, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 종종 위치 Cys226에서 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그 카복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(lysine)(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)는, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안에 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 또는 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. "기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 조합될 Fc 영역을 필요로 하며, 당업자에게 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 첨가 또는 결실)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교되는 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 또는 이와 적어도 약 90% 상동성, 예를 들어, 이와 적어도 약 95% 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "에피토프"는 당업계의 용어이며, 결합 분자(예를 들어, 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항체)가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국재화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체구조적, 비-선형, 또는 불연속 에피토프일 수 있다. 폴리펩타이드 항원의 경우에, 예를 들어, 에피토프는 폴리펩타이드의 인접한 아미노산("선형" 에피토프)일 수 있거나 또는 에피토프는 폴리펩타이드의 둘 이상의 비-인접 영역으로부터의 아미노산("입체구조", "비-선형" 또는 "불연속" 에피토프)을 포함할 수 있다. 당업자는, 일반적으로, 선형 에피토프는 2차, 3차 또는 4차 구조에 따를 수도 있고 따르지 않을 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결합 분자는 천연 3차원 단백질 구조에서 이들이 접히는지의 여부와 상관없이 아미노산 그룹에 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합 분자는 에피토프를 인식하고 결합하기 위해 특정 입체구조(예를 들어, 굽힘, 트위스트, 회전 또는 접힘)를 나타내는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기를 필요로 한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실제적으로 또는 완전하게 저해한다.
"작용제" 또는 활성화 항체는 자신이 결합하는 항원에 의한 신호전달을 향상시키거나 또는 개시하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 작용제 항체는 천연 리간드의 존재없이 신호전달을 유발하거나 활성화시킨다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)" 및 "상동성"은 최고 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 특정한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기 위하여, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질 (예를 들어, CAR 또는 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다. 자연적 항체는 예로서, 단일 특이성이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "다중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)가 적어도 2개의 상이한 항원에 결합하는 둘 이상의 항원-결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은 "이중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)이 2가지 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다는 것을 표시한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단일특이성" CAR은 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 이들 각각이 동일한 항원에 결합하는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)을 표시한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "~가(valent)"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb) 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 예를 들어, 자연적 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 갖고 2가이다. 이렇게 해서 용어 "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb) 내에서의 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 각각 의미한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 유전적으로 조작된 수용체를 지칭하는데, 이는 하나 이상의 항원 특이성을 면역 효과기 세포, 예를 들면, T 세포 상에 접합시키는 데 이용될 수 있다. 일부 CAR은 "인공 T 세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "키메라 면역 수용체"로도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원(예컨대, 종양 항원)에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "CAR-T 세포"는 CAR을 발현하는 T 세포를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형되는 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 아미노산의 하나 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩타이드뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형이 정의 내에 또한 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 항체 또는 다른 구성원에 기반할 수 있으며, 특정 실시형태에서, "폴리펩타이드"는 단일 쇄로서 또는 둘 이상의 회합된 쇄로서 생길 수 있다는 것이 이해된다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는 반드시는 아니지만, 일반적으로, 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오타이드인 짧은, 일반적으로 단일 가닥의 합성 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대하여 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하게 및 완전하게 적용가능하다. 본 개시내용의 결합 분자를 생성하는 세포는 모 하이브리도마 세포뿐만 아니라 항체를 암호화하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵 숙주 세포를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌선성 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌선성 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 발생기 RNA 전사체의 5'에서 3' 첨가 방향은 전사 방향으로서 언급되며; RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
"단리된 핵산"은 다른 게놈 DNA 서열로부터 실질적으로 분리된 핵산, 예를 들어, RNA, DNA 또는 혼합된 핵산뿐만 아니라 자연적으로 천연 서열을 동반하는 단백질 또는 복합체, 예컨대, 리보솜 및 중합효소이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 게다가, "단리된" 핵산 분자, 예컨대, cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 구체적 실시형태에서, 단일 도메인 항체 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자는 단리되거나 정제된다. 상기 용어는 이들의 천연 유래 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 암호화하고, 재조합체 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종성 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분자의 단리된 형태를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 CAR 또는 sdAb를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생성된 환경에서 이것이 보통 연관되는 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다.
달리 구체화되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로 축퇴 형식이며 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이라는 어구는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 형식에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 또한 포함할 수 있다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된" 및 유사한 어구(예를 들어, 유전적으로 융합된)는, 핵산 또는 아미노산에 대해 사용될 때, 서로 기능적 관계에 위치된 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 작동적 결합을 각각 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 요소, 오픈 리딩 프레임, 5' 및 3' UTR, 및 종결자 서열은 핵산 분자(예를 들어, RNA)의 정확한 생성을 초래한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 핵산 요소는 오픈 리딩 프레임의 전사 및 궁극적으로 폴리펩타이드의 생성(즉, 오픈 리딩 프레임의 발현)을 초래한다. 다른 예로서, 작동 가능하게 연결된 펩타이드는 기능성 도메인이 각 도메인의 의도된 기능을 부여하기 위해 서로로부터 적절한 거리에 위치되는 것이다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에 핵산 서열을 도입하기 위해, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합 분자(예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 운반하거나 포함하는 데 사용되는 물질을 지칭한다. 용도를 위한 적용 가능한 벡터는 숙주 세포 염색체 내로 안정적인 도입을 위해 조작 가능한 선택 서열 또는 마커를 포함할 수 있는, 예를 들어, 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다. 추가적으로, 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택 가능한 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나 또는 배양 배지에서 없는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 제어 서열은 당업계에 잘 공지되어 있는 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 둘 이상의 핵산 분자가 공동 발현될 때(예를 들어, 항체 중쇄와 경쇄 또는 항체 VH와 VL 둘 다), 핵산 분자는 둘 다, 예를 들어, 단일 발현 벡터에 또는 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현에 대해, 암호화 핵산은 하나의 통상적인 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있거나 또는 상이한 발현 제어 서열, 예컨대, 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터에 연결될 수 있다. 숙주 세포 내로 핵산 분자의 도입은 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 핵산 분석, 예컨대, 노던 블롯 또는 mRNA의 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭, 유전자 산물의 발현을 위한 면역블롯팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 대응하는 유전자 산물의 발현을 시험하는 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당업자는 핵산 분자가 목적하는 산물을 생성하는 데 충분한 양으로 발현된다는 것을 이해하며, 추가로 발현 수준이 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 충분한 발현을 얻도록 최적화될 수 있다는 것을 이해한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "숙주"는 동물, 예컨대, 포유류(예를 들어, 인간)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염될 수 있는 특정 대상 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 다음 세대에서 생길 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 도입으로 인해 핵산으로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "자가"는 추후에 개체 내로 재도입되는, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 이전되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 것이다. 세포는 1차 개체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물, 더욱 특히 인간에서 사용에 대하여 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다.
"부형제"는 약제학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 부형제는, 예를 들어, 캡슐화 물질 또는 첨가제, 예컨대, 흡수 촉진제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 습윤제, 윤활제, 향수, 보존제, 추진제, 이형제, 살균제, 감미제, 가용화제, 습윤제 및 이들의 혼합물을 포함한다. 용어 "부형제"는 또한 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트(완전 또는 불완전) 또는 비히클을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제이다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 다른 예는 문헌[Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)]에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 각각의 성분은 약제학적 제형의 다른 성분과 양립 가능하고, 합리적인 유해/유익비에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제 또는 다른 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합하다는 의미로 "약제학적으로 허용 가능"하다. 예를 들어, 문헌[Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 사용되는 투약량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유류에 대해 비독성이다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 수성 pH 완충 용액이다.
일부 실시형태에서, 부형제는 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)이 정맥내로 투여될 때 예시적인 부형제이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액에 대한 액체 부형제로서 또한 사용될 수 있다. 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구 조성물은 표준 부형제, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.
약제학적 화합물을 포함하는 조성물은 적합한 양의 부형제와 함께 결합 분자(예를 들어, 항체)를, 예를 들어, 단리 또는 정제된 형태로 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 단일 도메인 항체, 또는 목적하는 결과를 초래하는 데 충분한 본 명세서에 제공된 제제 및 단일 도메인 항체 또는 약제학적 조성물을 포함하는 치료적 분자의 양을 지칭한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정 실시형태에서, 대상체는 포유류, 예컨대, 비-영장류 또는 영장류(예를 들어, 인간)이다. 구체적인 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 장애로 진단된 포유류, 예를 들어, 인간이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 장애가 발생될 위험에 있는 포유류, 예를 들어, 인간이다.
"투여하다" 또는 "투여"는 물질이 신체 밖에 존재하는 경우에, 예컨대, 점막, 진피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해, 환자에 물질을 주사하거나 달리 물리적으로 전달하는 작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법의 투여로부터 초래된 질환 또는 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 환자가 여전히 기저 장애를 앓고 있을 수도 있지만 환자에 의해 개선이 관찰되도록, 치료는 기저 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 감소, 경감 및/또는 완화가 있는지의 여부를 평가함으로써 결정될 수 있다. 용어 "치료하는"은 질환의 관리와 개선을 둘 다 포함한다. 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 본질적으로 질환 치유를 초래하지 않는 요법으로부터 대상체가 유도하는 유리한 효과를 지칭한다.
용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환, 장애, 병태 또는 연관된 증상(들)(예를 들어, 당뇨병 또는 암)의 발병(또는 재발) 가능성 감소를 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같은 암의 발생을 "지연시키는" 것은 상기 질환의 발달을 미루고, 방해하고, 늦추고, 지연시키고, 안정시키고/시키거나 연기하는 것을 의미한다. 상기 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간의 길이를 가질 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 암의 발생을 "지연시키는" 방법은 이러한 방법을 이용하지 않는 경우와 비교할 때, 주어진 시간틀에서 상기 질환이 발생하는 확률을 감소시키고/시키거나 주어진 시간틀에서 상기 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이런 비교는 전형적으로, 통계학적으로 유의미한 수의 개체를 이용한 임상 연구에 기반한다. 암 발생은 컴퓨터 축 단층촬영술(CAT Scan), 자기 공명 영상법(MRI), 복부 초음파, 응고 시험, 동맥조영술 또는 생검을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 표준 방법을 이용하여 검출 가능할 수 있다. 발생은 또한 초기에 검출할 수 없고, 그리고 발생, 재발 및 발병을 포함하는 암 진행을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 B 세포에 의해 매개되거나 비정상적 B 세포 기능에 의해 부여되는 질환 또는 장애(예컨대, B-세포 기능의 조절장애)를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 B 세포 악성종양, 예컨대, B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이는 또한 변연부 림프종(예를 들어, 비장 변연부 림프종), 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL), 소형 림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL), 소포성 림프종(FL), 버킷 림프종, 원발성 안구내 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 털세포 백혈병(HCL), 전구 B 림프모구 백혈병, 비호지킨 림프종(NHL), 고도 B-세포 림프종(HGBL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함한다. "B 세포 연관 질환 또는 장애"는 또한 특정 자가면역 및/또는 염증 질환, 예컨대, 부적절한 또는 향상된 B 세포수 및/또는 활성화와 연관된 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "BCMA 연관 질환 또는 장애"는 BCMA가 발현 또는 과발현되는 세포 또는 조직을 포함하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 일부 실시형태에서, BCMA 연관 질환 또는 장애는 BCMA가 비정상적으로 발현되는 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, BCMA 연관 질환 또는 장애는 BCMA가 결핍된 세포를 포함한다.
용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 그 이하를 의미한다.
본 개시내용 및 특허청구범위에서 사용되는 단수 용어는 문맥상 명확히 달리 표시되지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
실시형태가 본 명세서에서 "포함하는"의 용어로 기재되어 어떤 곳에서도, "이루어진" 및/또는 "실질적으로 이루어진"의 용어에서 기재된 그 외 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한 실시형태가 본 명세서에서 "~로 이루어진"에 관해 기재된 다른 유사한 실시형태의 어구 "본질적으로 이루어진"과 함께 기재되는 경우가 또한 제공된다는 것이 이해된다.
"A와 B 사이" 또는 "A 내지 B 사이"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같은 "사이"라는 용어는 A와 B를 둘 다 포함하는 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 어구, 예컨대, "A 및/또는 B"에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 A와 B; A 또는 B, A(단독); 및 B(단독)를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)의 각각의 실시형태를 포함하는 것으로 의도된다.
5.2. 단일 도메인 항체
5.2.1. BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체
일 양상에서, BCMA에 결합할 수 있는 단일 도메인 항체(예를 들어, 인간화된 VHH 도메인)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 인간 BCMA에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체는 하나 이상의 BCMA 활성을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1nM, ≤ 0.1nM, ≤ 0.01nM 또는 ≤ 0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(KD)로 BCMA(예를 들어, 인간 BCMA)에 결합한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이 중 어느 것은, 예를 들어, RIA, 예를 들어, 관심 대상의 항체의 Fab 형식 및 이의 항원으로 수행되는 RIA에 의해(Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81); 생물층 간섭계(BLI)에 의해 또는 Octet®에 의한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해, 예를 들어, Octet®Red96 시스템을 이용하여, 또는 Biacore®에 의해, 예를 들어, Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000을 이용하여, 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. "온-속도(on-rate)" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한, 예를 들어, Octet®Red96, Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000 시스템을 이용하여, 상기 기재한 동일한 생물층 간섭계(BLI) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체는 VHH 도메인이다. 본 명세서에 제공된 예시적인 VHH 도메인은 또한 이하의 표 4에 나타내는 바와 같은 269A37948H3, 269AS34822H1, 269AS34822H2, 269AS34822H3, 269AS34822H4, 269AS34822H5, 269AS34822H6, 269AS34822H7로 지칭되는 VHH 도메인을 포함하는, 부문 6에서 이하에 기재되는 바와 같이 생성된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 269A37948H3, 269AS34822H1, 269AS34822H2, 269AS34822H3, 269AS34822H4, 269AS34822H5, 269AS34822H6, 269AS34822H7 중 어느 하나의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다음의 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, CDR 서열은 269A37948H3, 269AS34822H1, 269AS34822H2, 269AS34822H3, 269AS34822H4, 269AS34822H5, 269AS34822H6, 269AS34822H7의 서열로부터 선택된다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
다른 실시형태에서, 서열번호 1에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (ii) 서열번호 2에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 (iii) 서열번호 3에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하고; CDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
다른 실시형태에서, 서열번호 4에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (ii) 서열번호 5에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 또는 서열번호 72에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 (iii) 서열번호 6에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 269A37948H3, 269AS34822H1, 269AS34822H2, 269AS34822H3, 269AS34822H4, 269AS34822H5, 269AS34822H6 및/또는 269AS34822H7의 하나 이상의 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 11의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 12의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 13의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 14의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 15의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 16의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체이다. 일부 실시형태에서, 인간화된 단일 도메인 항체는 이하의 부문 6에 예시된 방법 또는 이하의 부문에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 프레임워크 영역은 CDR 넘버링 시스템의 경계에 기반하여 결정된다. 다시 말해서, CDR이, 예를 들어, Kabat, IMGT 또는 Chothia에 의해 결정된다면, 프레임워크 영역은 N-말단에서 C-말단까지: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 형식으로 가변 영역에서 CDR을 둘러싸는 아미노산 잔기이다. 예를 들어, FR1은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 규정되는 바와 같은 CDR1 아미노산 잔기에 대해 N-말단의 아미노산 잔기로서 규정되며, FR2는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 규정되는 CDR1과 CDR2 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 규정되고, FR3은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 규정되는 CDR2와 CDR3 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 규정되며, FR4는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 규정되는 CDR3 아미노산 잔기에 대해 C-말단의 아미노산 잔기로서 규정된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-BCMA 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-BCMA 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-BCMA 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-BCMA 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 269A37948H3, 269AS34822H1, 269AS34822H2, 269AS34822H3, 269AS34822H4, 269AS34822H5, 269AS34822H6 및 269AS34822H7 중 임의의 하나에 비해서 특정 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
두 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877 (1993)]에서와 같이 변형되는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (1990)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 대해 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해, 예를 들어, 스코어 100, 단어 길이=12에 대해 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 파라미터에 의해 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 명세서에 기재된 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해, 예를 들어, 스코어 50, 단어 길이=3에 대해, XBLAST 프로그램 파라미터 세트로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 (1997)]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다(이하 참조). BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI Blast 프로그램을 이용할 때, (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST의) 각 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, 월드와이드웹, ncbi.nlm.nih.gov 상의 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 참조). 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 비제한적 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS 4:11-17 (1998)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 부분인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 갭과 함께 또는 허용되는 갭 없이 상기 기재한 것과 유사한 기법을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 전형적으로 정확한 매치만이 계수된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 9 내지 16으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 VHH 도메인을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 중 어느 하나를 갖는 VHH 서열은 기준 서열에 비해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합하는 능력을 보유한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 9 내지 16으로부터 선택된 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외측의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 선택적으로, 항-BCMA 단일 도메인 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하는 서열번호 9 내지 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 BCMA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 기능성 에피토프는 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체와의 상호작용에 필수적인 BCMA 단백질에서 아미노산을 확인하기 위해, 예를 들어, 조합 알라닌 스캐닝에 의해 맵핑될 수 있다. 일부 실시형태에서, BCMA에 결합된 항-BCMA 단일 도메인 항체의 입체구조적 및 결정 구조는 에피토프를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체 중 어느 것과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 항-BCMA 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체 중 어느 하나와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는, 항-BCMA 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 경쟁적 결합은 ELISA 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재한 항-BCMA 단일 도메인 항체 중 어느 하나를 포함하는 BCMA 결합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, BCMA 결합 단백질은 낙타과, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 항체는 항체 단편, 예를 들어, VHH 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA 항체는 임의의 항체 부류 또는 아이소타입, 예컨대, IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역을 포함하는 전장 중쇄 단독 항체이다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 감소되거나 또는 최소화된 효과기 기능을 갖는다. 일부 실시형태에서, BCMA 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시형태에서, BCMA 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함하는 다중특이성 항체이다. 다른 예시적인 BCMA 결합 분자는 다음의 부문에서 더욱 상세하게 기재된다.
일부 실시형태에서, 상기 실시형태 중 어느 것에 따른 항-BCMA 항체(예컨대, 항-BCMA 단일 도메인 항체) 또는 항원 결합 단백질은 이하의 부문 5.2.2 내지 5.2.7에 기재되는 바와 같은 특징 중 어느 것을 단독으로 또는 조합하여 혼입할 수 있다.
5.2.2. 인간화된 단일 도메인 항체
본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체를 포함한다. 낙타과 종으로부터의 단일 도메인 항체를 인간화하기 위한 일반적 전략은 기재되었고(예를 들어, 문헌[Vincke et al., J. Biol. Chem., 284(5):3273-3284 (2009)] 참조), 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간화된 VHH 도메인을 생성하는 데 유용할 수 있다. 낙타과 종으로부터의 인간화된 단일 도메인 항체의 설계는 VHH에서의 특질 잔기, 예컨대, 잔기 11, 37, 44, 45 및 47(Kabat에 따른 잔기 넘버링)을 포함할 수 있다(Muyldermans, Reviews Mol Biotech 74:277-302 (2001).
인간화된 항체, 예컨대, 본 명세서에 개시된 인간화된 단일 도메인 항체는 또한 CDR-접합(유럽 특허 제239,400호; 국제 특허 출원 공개 WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(유럽 특허 제592,106호 및 제519,596호; 문헌[Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)]), 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332), 및 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 또한 미국 특허 공개 제2005/0042664 A1호(2005년 2월 24일)를 참조하며, 각각은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간 BCMA를 포함하는 BCMA에 결합하는 인간화된 단일 도메인 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화된 단일쇄 항체는 서열번호 9 내지 16에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비인간인 공급원으로부터 항체 내에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534-36 (1988))]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체의 인간화는 이하의 부문 6에 기재된 바와 같이 수행된다.
일부 경우에, 인간화된 항체는, 모 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열이 인간 항체 프레임워크 상에 접합된 CDR 접합에 의해 작제된다. 예를 들어, Padlan 등은 CDR에서 잔기의 약 1/3만이 실제로 항원과 접촉한다는 것을 결정하였고, 이들은 "특이성 결정 잔기" 또는 SDR로 지칭된다(Padlan et al., FASEB J. 9:133-39 (1995)). SDR 접합 기법에서, SDR 잔기만이 인간 항체 프레임워크 상에 접합된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] 참조).
인간화된 항체를 제조하는 데 사용될 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 예를 들어, 소위 "최적-적합(best-fit)" 방법에 따라, 비-인간 항체의 가변 도메인의 서열은 알려진 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별된다. 비-인간 항체의 서열과 가장 가까운 인간 서열은 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 선택될 수 있다(문헌[Sims et al., J. Immunol. 151:2296-308 (1993); 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다(문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol. 151:2623-32 (1993)]). 일부 경우에, 프레임워크는 가장 흔한 인간 하위부류, VL6 하위그룹 I(VL6I) 및 VH 하위그룹 III(VHIII)의 공통 서열로부터 유래된다. 다른 방법에서, 인간 생식계열 유전자는 프레임워크 영역의 공급원으로서 사용된다.
초인간화로 불리는 CDR의 비교에 기반한 대안의 패러다임에서, FR 상동성은 부적절하다. 상기 방법은 비-인간 서열과 기능성 인간 생식계열 유전자 레퍼토리의 비교로 이루어진다. 이어서, 뮤린 서열과 동일 또는 밀접하게 관련된 정규형 구조를 암호화하는 해당 유전자가 선택된다. 다음에, 비-인간 항체를 갖는 정규형 구조를 공유하는 유전자 내에서, CDR 내에서 가장 높은 상동성을 갖는 것이 FR 공여자로서 선택된다. 최종적으로, 비-인간 CDR이 이들 FR 상에 접합된다(예를 들어, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)] 참조).
항체는 항원에 대한 이들의 친화도의 보유 및 다른 유리한 생물학적 특성으로 인간화되는 것이 더욱 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 한 가지 방법에 따르면, 인간화된 항체는 부모 서열의 분석 과정 및 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념의 인간화 산물에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용 가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택되는 후보 면역글로불린 서열의 가능성이 있는 3차원 입체 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들은, 예를 들어, WAM(문헌[Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13:819-24 (2002)]), Modeller(문헌[Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)]) 및 Swiss PDB Viewer(문헌[Guex and Peitsch, Electrophoresis 18:2714-23 (1997)])를 포함한다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수여자 및 유입 서열로부터 선택되고 조합되어, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 관여한다.
항체 인간화를 위한 다른 방법은 인간 스트링 함량(Human String Content: HSC)으로 지칭되는 항체 인간성의 측정 기준에 기반한다. 이 방법은 마우스 서열을 인간 생식계열 유전자의 레퍼토리와 비교하며, 차이는 HSC로서 점수화된다. 이어서, 표적 서열은 다수의 다양한 인간화된 변이체를 생성하기 위한 전반적 동일성 척도를 이용하기보다는 이의 HSC를 최대화함으로써 인간화된다(Lazar et al., Mol. Immunol. 44:1986-98 (2007)).
상기 기재한 방법에 추가로, 인간화된 항체를 생성하고 선택하기 위해 경험적 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 풍부화 기술 또는 고속대량(high throughput) 선별 기법을 이용하여 최고의 클론의 인간화된 변이체 및 선별의 거대 라이브러리 생성에 기반한 것을 포함한다. 항체 변이체는 파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리로부터 뿐만 아니라 박테리아 콜로니 선별에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23:1105-16 (2005); Dufner et al., Trends Biotechnol. 24:523-29 (2006); Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21:163-70 (2003); 및 Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60 (2004)] 참조).
FR 라이브러리 접근에서, 잔기 변이체의 수집물은 FR에서 특정 위치에 도입된 후에, 접합된 CDR을 가장 잘 지원하는 FR을 선택하기 위해 라이브러리를 선별한다. 치환될 잔기는 CDR 구조에 잠재적으로 기여하는 것으로 확인된 "Vernier" 잔기의 일부 또는 모두(예를 들어, 문헌[Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-99 (1992)] 참조)를 포함하거나, 문헌[Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-84 (1997)]에 의해 확인된 표적 잔기의 더 제한된 세트로부터 유래될 수 있다.
FR 셔플링에서, 전체 FR은 선택된 잔기 변이체의 조합 라이브러리를 생성하는 대신에 비-인간 CDR과 조합된다(예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] 참조). 1단계 FR 셔플링 과정이 사용될 수 있다. 얻어진 항체가 향상된 발현, 증가된 친화도 및 열 안정성을 포함하는 개선된 생화학적 및 물리화학적 특성을 나타내었기 때문에, 이러한 과정은 효율적이 되는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Damschroder et al., Mol. Immunol. 44:3049-60 (2007)] 참조).
"융화(humaneering)" 방법은 필수 최소 특이성 결정소(MSD)의 실험적 식별에 기반하며, 인간 FR의 라이브러리로 비-인간 단편의 순차적 대체 및 결합의 평가에 기반한다. 이 방법은 전형적으로 에피토프 보유 및 별도의 인간 V-세그먼트 CDR을 갖는 다중 하위부류로부터의 항체의 식별을 초래한다.
"인간 조작" 방법은 항체의 아미노산 서열에 대한 특정 변화를 생성함으로써 비인간 항체 또는 항체 단편을 변경하지만, 그럼에도 불구하고, 본래의 비인간 항체의 바람직한 결합 특성을 보유하는 인간에서의 감소된 면역원성을 갖는 변형된 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 기법은 비-인간 항체의 아미노산 잔기를 "저위험", "중간 위험" 또는 "고위험" 잔기로서 분류하는 것을 수반한다. 분류는 얻어진 항체의 접힘에 치환이 영향을 미칠 위험에 대해 (예를 들어, 인간에서의 면역원성에 대해) 특정 치환을 생성하는 것의 예측된 이익을 평가하는 전반적 위험/보상 계산을 이용하여 수행된다. 비인간 항체 서열의 주어진 위치(예를 들어, 저위험 또는 중간 위험)에서 치환될 특정 인간 아미노산 잔기는 특정 또는 공통 인간 항체 서열의 대응하는 영역을 갖는 비인간 항체의 가변 영역으로부터 아미노산 서열을 정렬함으로써 선택될 수 있다. 비인간 서열에서 저위험 또는 중간 위험 위치의 아미노산 잔기는 정렬에 따라 인간 항체 서열에서의 대응하는 잔기를 대체할 수 있다. 인간 조작 단백질을 제조하기 위한 기법은 문헌[Studnicka et al., Protein Engineering 7:805-14 (1994)]; 미국 특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 제5,821,123호; 및 제5,869,619호; 및 PCT 공개 WO 93/11794에 더 상세하게 기재되어 있다.
복합 인간 항체는, 예를 들어, Composite Human Antibody™ 기술(Antitope Ltd., 영국 케임브리지 소재)를 이용하여 생성될 수 있다. 복합 인간 항체를 생성하기 위해, 가변 영역 서열은 T 세포 에피토프를 피하고, 이에 의해 얻어진 항체의 면역원성을 최소화하는 방식으로 다중 인간 항체 가변 영역 서열의 단편으로부터 설계된다.
탈면역화된 항체는 T-세포 에피토프가 제거된 항체이다. 탈면역화된 항체의 제조 방법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Methods Mol Biol. 525:405-23 (2009), xiv, 및 De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006))]을 참조한다. 탈면역화된 항체는 T-세포 에피토프-고갈 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 간략히 말해서, 항체의 가변 영역은 클로닝되고, T-세포 에피토프는 후속적으로 T 세포 증식 검정에서 항체의 가변 영역으로부터 유래된 중복 펩타이드를 시험함으로써 확인된다. T 세포 에피토프는 인간 MHC 클래스 II에 대한 펩타이드 결합을 확인하기 위해 인실리코 방법을 통해 확인된다. 인간 MHC 클래스 II에 대한 결합을 없애기 위해 가변 영역에 돌연변이가 도입된다. 이어서, 돌연변이된 가변 영역은 탈면역화된 항체를 생성하는 데 이용된다.
5.2.3. 단일 도메인 항체 변이체
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 상정된다. 예를 들어, 결합 친화도, 및/또는 특이성, 열안정성, 발현 수준, 효과기 기능, 글리코실화, 감소된 면역원성 또는 용해도를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항체의 다른 생물학적 특성을 최적화하는 데 바람직할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체에 추가로, 본 명세서에 기재된 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체의 변이체가 제조될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 단일 도메인 항체 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 암호화 DNA에 도입함으로써, 그리고/또는 목적하는 항체 또는 폴리펩타이드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 단일 도메인 항체의 번역 후 과정을 변경시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
화학적 변형
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는, 예를 들어, 단일 도메인 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해, 화학적으로 변형된다. 항체 유도체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합 또는 하나 이상의 면역글로불린 도메인(예를 들어, Fc 또는 Fc의 일부)에 대한 접합에 의해 화학적으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 임의의 무수한 화학적 변형은 특정한 화학적 개열, 아세틸화, 제형화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 천연 항체는 일반적으로 Fc 영역의 CH2 영역의 Asn297에 대한 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 2안테나 올리고당을 포함한다. 예컨대, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 2안테나 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 결합 분자에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 본 명세서에 제공된 항체 변이체는 상기 Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정되는 경우에, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 합계(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)에 비해서, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 297번 위치(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한, 항체에서의 약간의 서열 변이로 인해, 297번 위치의 대략 ± 3 아미노산 상류 또는 하류에, 즉, 294번과 300번 위치 사이에 위치될 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변이체는 ADCC 작용을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0157108 및 US 2004/0093621을 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 공개 제2003/0157108호; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107)를 포함한다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자는 이등분 올리고당을 추가로 제공하며, 예를 들어, 이때 Fc 영역에 부착된 2안테나 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체가 또한 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
본 단일 도메인 항체 및 Fc 영역을 포함하는 분자에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 Fc 영역에 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 1종 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 출원은 모두는 아니지만 일부 효과기 기능을 갖는 변이체를 상정하는데, 이는 이 변이체를 생체내 결합 분자의 반감기가 중요하고 또한 특정 효과기 기능(예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용을 위한 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자가 FcγR 결합을 결여하지만(따라서 ADCC 활성을 결여할 가능성이 있는) FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)]) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)])에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다(예컨대, 유세포분석법의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. 캘리포니아주 마운틴뷰 소재; 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정(Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)을 참조한다. 이러한 분석을 위해 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 동물 모델에서, 예컨대, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 부재임을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 결합 분자는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 알라닌에 대한 265번 및 297번 잔기의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는 265번, 269번, 270번, 297번 및 327번의 아미노산 위치의 2개 이상에서의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대해 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조)
일부 실시형태에서, 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, WO 99/51642, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 생성하는 Fc 영역 내에서 변경이 이루어진다.
증가된 반감기 및 태아에 모계 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 증가된 결합을 갖는 결합 분자(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1(Hinton et al.)에 기재된다. 해당 분자는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것(미국 특허 제7,371,826호)을 포함한다. 또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 제94/29351호를 참조한다.
일부 실시형태에서, 시스테인 조작 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있는데, 이대 항체의 하나 이상의 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다. 일부 실시형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근 가능한 부위에서 생긴다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기는 이에 의해 항체의 접근 가능한 부위에 위치되고, 본 명세서에 추가로 기재되는 바와 같이, 면역접합체를 생성하기 위해 다른 모이어티, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 접합시키는 데 사용될 수 있다.
치환, 결실 또는 삽입
변형은 본래의 항체 또는 폴리펩타이드에 비해서 아미노산 서열의 변화를 초래하는 단일 도메인 항체 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 CDR 및 FR을 포함한다.
아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대, 류신을 세린으로 대체하는 것, 예를 들어, 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기법은, 예를 들어, 아미노산 치환을 초래하는 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발을 포함하는 본 명세서에 제공된 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하는 데 사용될 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1 내지 5개의 아미노산 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 치환, 결실 또는 삽입은 본래의 분자에 비해서 25개 이하의 아미노산 치환, 20개 이하의 아미노산 치환, 15개 이하의 아미노산 치환, 10개 이하의 아미노산 치환, 5개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 치환, 3개 이하의 아미노산 치환 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 생성된 보존적 아미노산 치환이다. 허용된 변이는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 생성하고 모 항체에 의해 나타내는 활성에 대해 얻어진 변이체를 시험함으로써 결정될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 다수의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다.
보존적 아미노산 치환에 의해 생성된 단일 도메인 항체는 본 개시내용에 포함된다. 보존적 아미노산 치환에서, 아미노산 잔기는 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된다. 상기 기재한 바와 같이, 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 미대전된 극성 측쇄(예컨대, 글리세린, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 암호화 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로, 예컨대, 포화 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 얻어진 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하는 생물학적 활성을 선별할 수 있다. 돌연변이유발 후에, 암호화된 단백질은 발현될 수 있고, 단백질의 활성은 결정될 수 있다. 특성을 유지하도록 또는 유의미하게 변화되지 않도록 보존적(예를 들어, 유사한 특성 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산기 내의) 치환이 이루어질 수 있다. 예시적 치환은 이하의 표 2에 나타낸다.
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아미노산은 이들 측쇄의 특성에서의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)] 참조): (1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 대안적으로, 천연 유래 잔기는 공통 측쇄 특성에 기반하여 그룹으로 나눌 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 예를 들어, 단일 도메인 항체의 적절한 입체구조를 유지하는 데 관여되지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한, 예를 들어, 분자의 산화적 안정성을 개선시키기 위해 그리고 비정상적 가교를 방지하기 위해, 다른 아미노산, 예컨대, 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있다. 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다(예컨대, 인간화 또는 인간 항체). 일반적으로 추가의 연구를 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 모 항체에 비해서 특정 생물학적 성질(예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나 상기 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 보유한다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체인데, 이는, 예로서, 파지 전시-기반 친화도 성숙 기법, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 것들을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략히 말해서, 하나 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
예컨대, 항체 친화도를 개선하기 위해, CDR에서 변경(예컨대, 치환)이 이루어질 수 있다. 이런 변경은 CDR "핫스팟", 즉, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)]) 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있고, 얻어진 변이체 항체 또는 이의 단편은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류 유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 선별하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 CDR-유도 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 CDR 잔기(즉, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 친화도 성숙에 관한 더 상세한 설명은 아래의 부문에 제공된다.
일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 이상의 CDR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 본 명세서에 제공된 변이체 VHH 서열의 일부 실시형태에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 식별을 위해 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹(예컨대, 하전된 잔기, 예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)이 확인되고, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환을 위한 후보물질로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 포함하는지를 결정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예컨대, ADEPT에 대한) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드-매개(부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 변이가 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); 및 Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)] 참조), 카세트 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)]) 또는 다른 공지된 기법이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 단일 도메인 항체 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
5.2.4. 시험관내 친화도 성숙
일부 실시형태에서, 모 항체에 비해서 개선된 특성, 예컨대, 친화도, 안정성 또는 발현 수준을 갖는 항체 변이체가 시험관내 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 천연 표현형과 같이, 시험관내 친화도 성숙은 돌연변이 및 선택 원칙에 기반한다. 항체의 라이브러리는 유기체(예를 들어, 파지, 박테리아, 효모 또는 포유류 세포)의 표면 상에 또는 이들의 암호화 mRNA 또는 DNA와 함께(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로) 디스플레이된다. 디스플레이된 항체의 친화도 선택은 항체를 암호화하는 유전자 정보를 운반하는 유기체 또는 복합체의 단리를 가능하게 한다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 이용하는 성숙 및 선택의 2 또는 3회 라운드는 보통 낮은 나노몰 범위의 친화도로 항체 단편을 초래한다. 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다.
파지 디스플레이는 항체의 디스플레이 및 선택을 위한 널리 퍼진 방법이다. 항체는 박테리오파지 외피 단백질에 대한 융합물로서 Fd 또는 M13 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 선택은 파지-디스플레이된 항체가 이들의 표적에 결합하는 것, 즉, "패닝"으로 지칭되는 과정을 가능하게 하기 위해 항원에 대한 노출을 수반한다. 항원에 결합된 파지는 회수되며, 추가적인 선택 라운드를 위해 파지를 생성하기 위해 박테리아를 감염시키는 데 사용된다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178:1-37 (2002); 및 Bradbury and Marks, J. Immunol. Methods 290:29-49 (2004)]을 참조한다.
효모 디스플레이 시스템(예를 들어, 문헌[Boder et al., Nat. Biotech. 15:553-57 (1997); 및 Chao et al., Nat. Protocols 1:755-68 (2006)] 참조)에서, 항체는 Aga1p에 대한 이황화결합을 통해 효모 세포벽에 부착되는 효모 응집소 단백질 Aga2p의 접착 서브유닛에 융합될 수 있다. Aga2p를 통한 단백질의 디스플레이는 세포 표면으로부터 단백질을 돌출시켜, 효모 세포벽 상의 다른 분자와의 잠재적 상호작용을 최소화한다. 개선된 친화도 또는 안정성을 갖는 항체를 선택하기 위한 라이브러리를 선별하기 위해 자기 분리 및 유세포분석이 사용된다. 관심 가용성 항원에 대한 결합은 바이오틴일화된 항원 및 2차 시약, 예컨대, 형광단에 접합된 스트렙타비딘에 의한 효모의 표지에 의해 결정된다. 항체의 표면 발현에서의 변이는 단일 쇄 항체(예를 들어, scFv)에 측접하는 혈구응집소 또는 c-Myc 에피토프 태그 중 하나의 면역형광 표지를 통해 측정될 수 있다. 발현은 디스플레이된 단백질의 안정성과의 상관관계를 나타내었고, 따라서 항체는 개선된 안정성뿐만 아니라 친화도에 대해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shusta et al., J. Mol. Biol. 292:949-56 (1999)] 참조). 효모 디스플레이의 추가적인 이점은 디스플레이된 단백질이 진핵 효모 세포의 소포체에서 접혀서, 소포체 샤페론 및 품질 관리 기작의 이점을 취한다는 것이다. 일단 성숙이 완료되면, 항체 친화도는 편리하게 "적정"될 수 있는 한편, 효모 표면 상에 디스플레이되어, 각 클론의 발현 및 정제에 대한 필요성을 제거한다. 효모 표면 디스플레이의 이론적 제한은 다른 디스플레이 방법의 라이브러리보다 잠재적으로 더 작은 기능성 라이브러리 크기이지만; 그러나, 최근의 접근은 크기가 1014로 추정되는 조합 다양성을 생성하기 위해 효모 세포의 교배방식을 사용한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0186374호; 및 문헌[Blaise et al., Gene 342:211-18 (2004)] 참조).
리보솜 디스플레이에서, 항체-리보솜-mRNA(ARM) 복합체는 무세포 시스템에서 선택을 위해 생성된다. 항체의 특정 라이브러리에 대한 DNA 라이브러리 암호화는 정지 코돈을 결여하는 스페이서 서열에 유전적으로 융합된다. 이 스페이서 서열은 번역되는 경우에 여전히 펩타이딜 tRNA에 부착되고, 리보솜 터널을 점유하며, 따라서, 관심 단백질이 리보솜 밖으로 돌출되고 접히는 것을 가능하게 한다. mRNA, 리보솜 및 단백질의 얻어진 복합체는 표면-결합 리간드에 결합하여, 리간드에 의한 친화도 포획을 통해 항체 및 이의 암호화 mRNA의 동시 단리를 가능하게 할 수 있다. 이어서, 리보솜-결합된 mRNA는 cDNA로 역전사되며, 이어서, 돌연변이유발될 수 있으며, 다음 선택 라운드에서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34:e127 (2006)] 참조). mRNA 디스플레이에서, 어댑터 분자로서 퓨로마이신을 이용하여 항체와 mRNA 사이의 공유결합이 확립된다(Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55 (2001)).
이들 방법이 시험관내에서 완전히 수행된다면, 이들은 다른 선택 기술 이상으로 2가지의 주된 이점을 제공한다. 첫째로, 라이브러리의 다양성은 시험관에 존재하는 리보솜 및 상이한 mRNA 분자의 수에 의하는 경우만을 제외하고 박테리아 세포의 형질전환 효율에 의해 제한되지 않는다. 둘째로, 무작위 돌연변이는 각각의 선택 라운드 후에, 예를 들어, 비-교정 중합효소에 의해 용이하게 도입될 수 있는데, 임의의 다양화 단계 후에 라이브러리가 형질전환되어야 할 필요가 없기 때문이다.
일부 실시형태에서, 포유류 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다.
표적화된 방식으로 또는 무작위 도입을 통해 항체 라이브러리의 CDR에 다양성이 도입될 수 있다. 전자의 접근은 고수준 또는 저수준의 돌연변이유발을 통해 항체의 CDR을 모두 순차적으로 표적화하거나 또는 체성 과변이의 단리된 핫스팟(예를 들어, 문헌[Ho et al., J. Biol. Chem. 280:607-17 (2005)] 참조) 또는 실험 기준 또는 구조적 이유로 친화도에 영향을 미치는 것으로 의심되는 잔기를 표적화하는 것을 포함한다. 다양성은 또한 DNA 셔플링 또는 유사한 기법을 통해 자연적으로 다양한 영역의 대체에 의해 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lu et al., J. Biol. Chem. 278:43496-507 (2003)]; 미국 특허 제5,565,332호 및 제6,989,250호 참조). 프레임워크-영역 잔기로 연장되는 초가변 루프를 표적화하는 대안의 기법은(예를 들어, 문헌[Bond et al., J. Mol. Biol. 348:699-709 (2005)] 참조) CDR에서 루프 결실 및 삽입을 사용하거나 또는 혼성화-기반 다양화를 사용한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2004/0005709호 참조). CDR에서 다양성을 생성하는 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,985,840호에 개시되어 있다. 항체 라이브러리 및/또는 항체 친화도 성숙을 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,685,897호 및 제8,603,930호 및 미국 특허 공개 제2014/0170705호, 제2014/0094392호, 제2012/0028301호, 제2011/0183855호 및 제2009/0075378호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
라이브러리의 선별은 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 고체 지지체, 칼럼, 핀 또는 셀룰로스/폴리(비닐리덴 플루오라이드) 막/기타 충전제 상에 고정되거나, 흡착판에 부착된 숙주 세포 상에서 발현되거나 또는 세포 분류에 사용되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅 비드에 의한 포착을 위해 바이오틴에 접합되거나 또는 패닝 디스플레이 라이브러리를 위해 임의의 다른 방법에서 사용될 수 있다.
시험관내 친화도 성숙 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology 23:1105-16 (2005); Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51 (2010)]; 및 이의 참고문헌을 참조한다.
5.2.5. 단일 도메인 항체의 변형
단일 도메인 항체의 공유 변형은 본 개시내용 범주 내에 포함된다. 공유 변형은 단일 도메인 항체의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단의 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체 제제와 단일 도메인 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 다른 변형은 글루타밀 및 아스파라긴일 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아마이드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983)] 참조), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단의 카복실기의 아마이드화를 포함한다.
본 개시내용의 범주 내에 포함된 단일 도메인 항체의 다른 유형의 공유 변형은 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 폴리펩타이드의 천연 글리코실화 패턴 변경(예를 들어, 문헌[Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501 (2008); 및 Walsh, Drug Discov. Today 15:773-80 (2010)]), 및 예를 들어, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 대한 항체의 연결을 포함한다. 본 개시내용의 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체는 또한 반감기를 연장시키기 위해 그리고/또는 알려진 Fc-매개 효과기 기능을 부여하기 위해 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc)에 유전적으로 융합 또는 접합될 수 있다.
본 개시내용의 BCMA에 결합하는 단일쇄 항체는 또한 다른 이종성 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 예를 들어, 에피토프 태그에 융합된 BCMA에 결합하는 단일쇄 항체를 포함하는 키메라 분자(예를 들어, 문헌[Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003)] 참조) 또는 IgG 분자의 Fc 영역(예를 들어, 문헌[Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow and Ashkenazi eds., 1999)] 참조)을 형성하도록 변형될 수 있다. BCMA에 결합하는 단일쇄 항체는 또한 이하에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이 BCMA 결합 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한 본 개시내용의 BCMA 및 이종성 폴리펩타이드에 결합하는 단일쇄 항체를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체가 유전적으로 융합되거나 화학적으로 접합된 이종성 폴리펩타이드는 세포 표면-발현된 BCMA를 갖는 세포에 항체를 표적화하는 데 유용하다.
또한 BCMA 항원에 결합하는 항체 패널이 본 명세서에 제공된다. 구체적 실시형태에서, 항체의 패널은 상이한 결합 속도, 상이한 해리 속도, BCMA 항원에 대한 상이한 친화도 및/또는 BCMA 항원에 대한 상이한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패널은 약 10 내지 약 1000개 이상의 항체를 포함하거나 이들로 이루어진다. 항체의 패널은 ELISA와 같은 검정을 위해, 예를 들어, 96-웰 또는 384-웰 플레이트에서 사용될 수 있다.
5.2.6. 단일 도메인 항체의 제조
단일 도메인 항체의 제조 방법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Els Pardon et al, Nature Protocol, 9(3): 674 (2014)]을 참조한다. 단일-도메인 항체(예컨대, VHHs)는 당업계에서 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 낙타과 종(예컨대, 낙타 또는 라마)을 면역화하고 이로부터 하이브리도마를 획득함으로써, 또는 당업계에서 공지된 분자생물학 기법을 이용하여 단일-도메인 항체의 라이브러리를 클로닝하고 후속적으로 비선택 라이브러리의 개별 클론을 이용하여 ELISA에 의해 선택함으로써 또는 파지 디스플레이를 이용함으로써 획득될 수 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 단일 도메인 항체-암호화 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 본 개시내용 항체의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기법을 이용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포 또는 B 세포와 같은 항체 생성 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현시킬 수 있는 재조합 벡터 내에 삽입된다. 당업계에서 입수 가능하며 공지되어 있는 다수의 벡터가 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 본 개시내용의 항체를 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 그램-음성 또는 그램-양성 유기체를 포함하는, 고세균 및 진정세균과 같은 원핵생물, 진핵 미생물, 예컨대, 사상성 진균 또는 효모, 무척추동물 세포, 예컨대, 곤충 또는 식물 세포, 및 척추동물 세포, 예컨대, 포유류 숙주 세포주를 포함한다. 숙주 세포는 위에서 기재한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는 데 적절하다면 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 정제된다.
벡터 작제, 발현 및 정제를 포함하는 항체 생성을 위한 방법은 문헌[
Figure pct00008
et al., Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty et al. eds., 1996); Kwong and Rader, E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments, in Current Protocols in Protein Science (2009); Tachibana and Takekoshi, Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli, in Antibody Expression and Production (Al-Rubeai ed., 2011); 및 Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009)]에 추가로 기재되어 있다.
물론 당업계에 잘 공지된 대안의 방법이 항-BCMA 단일 도메인 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 이의 일부는 고체상 기법을 이용하여 직접 펩타이드 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969); 및 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기법에 의해 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 항-BCMA 항체의 다양한 부분은 별개로 화학적으로 합성되고, 목적하는 항-BCMA 항체를 생성하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합될 수 있다. 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호 및 제5,827,690호에 기재된 바와 같이 항체를 발현시키도록 조작된 유전자이식 동물의 세포 또는 체액, 예컨대, 모유로부터 정제될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 또는 다른 BCMA 결합제는 라마를 면역화하고, 단일 B-세포 분류를 수행하고, V-유전자 추출에 착수하고, BCMA 결합제, 예컨대, VHH-Fc 융합을 클로닝하고, 이어서, 소규모 발현 및 정제를 수행함으로써 생성될 수 있다. ELISA-양성, BLI-양성 및 100nM 미만의 KD에 대한 선택 중 하나 이상을 포함하는 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체 및 기타 분자의 추가적인 선별이 수행될 수 있다. 이들 선택 기준은 이하의 부문 6에 기재되는 바와 같이 조합될 수 있다. 추가적으로, 개개 VHH 결합제(및 BCMA에 결합하는 다른 분자)는 BCMA를 발현시키는 세포에 결합하는 이들의 능력에 대해 검정될 수 있다. 이러한 검정은 BCMA를 발현시키는 세포에 의한 FACS 분석을 이용하고, 형광 표지된 VHH 분자의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하여 수행될 수 있다. 상기 언급한 다양한 양상은 이하에 더욱 상세하게 기재된다.
다클론성 항체
다클론성 항체는 일반적으로 적절한 항원 및 아쥬반트의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생긴다. 이는 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N-C=C=NR(여기서 R과 R1은 독립적으로 저급 알킬기임)를 이용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 적절한 항원을 접합시키는데 유용할 수 있다. 이용될 수 있는 아쥬반트의 예는 프로인트 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
예를 들어, 이들 동물은 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 접합체(각각, 토끼 또는 마우스의 경우)를 3 용적의 프로인트 완전 아쥬반트와 합하고 용액을 다수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 이들 동물은 복수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 아쥬반트에서 펩타이드 또는 접합체의 본래의 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 7 내지 14일 후에, 동물을 방혈시키고, 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 역가 안정기까지 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 이루어질 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대, 명반은 면역반응을 향상시키는 데 적합하다.
단클론성 항체
단클론성 항체는 실제적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예컨대, 이성질체화, 아마이드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 생성될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호).
하이브리도마 방법에서, 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 유발하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이후에, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합된다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
면역화 작용제는 전형적으로, 항원성 단백질 또는 이의 융합 변이체를 포함할 것이다. 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]. 불멸 세포주는 보통 형질전환 포유류 세포이다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 파종되고, 바람직하게는 비융합, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장된다. 바람직한 불멸 골수종 세포는 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생성을 효율적으로 뒷받침하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원으로 향하는 단클론성 항체의 생산에 대해 검정된다. 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 목적하는 항원으로 향하는 단클론성 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 이러한 기법 및 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화도는 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 다시 클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, 상기 참조). 본 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 포유류 내에 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단클론성 항체는 또한, 재조합 DNA 방법, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것에 의해, 그리고 위에서 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되거나 또는 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내에 위치될 수 있고, 이어서, 이들은 이러한 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체를 합성하기 위해, 숙주 세포, 예를 들어, 이콜라이(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또 다르게는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포에 형질감염된다. 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 검토 논문은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항체는 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에서 설명된 기술을 이용하여 산출된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]. 후속적 간행물은 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 조합적 감염 및 우 거대한 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생성을 기재한다. 따라서, 이러한 기법은 단클론성 항체의 분리를 위한 통상적인 단클론성 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어, 암호화 서열을 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 모두 또는 일부를 암호화 서열에 공유 결합시킴으로써, 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 항원에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-조합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성하도록 치환될 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교제를 수반하는 것을 비롯하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화물 교환 반응을 이용하여 또는 티오에터 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 본 목적을 위한 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토뷰티르이미데이트를 포함한다.
원핵 세포에서의 재조합체 생성
본 개시내용의 항체를 암호화하는 다중핵산 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 얻어질 수 있다. 목적하는 다중핵산 서열은 항체 생성 세포, 예를 들어, 하이브리도마 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 원핵 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 당업계에서 입수 가능하며 공지되어 있는 다수의 벡터가 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각 벡터는 기능(이종성 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 이것이 체류하는 특정 숙주 세포와의 양립성에 따라 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 보통 복제 부위뿐만 아니라 형질전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다. 예를 들어, 이콜라이는 전형적으로 이콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. 특정 항체의 발현에 이용되는 pBR322 유도체의 실례는 Carter 등의 미국 특허 제5,648,237호에서 상세하게 기재된다.
추가로, 숙주 미생물과 양립하는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 이용될 수 있다. 예컨대, 박테리오파지, 예를 들어, GEM™-11은 감수성 숙주 세포, 예를 들어, 이콜라이 LE392를 형질전환시키는 데 이용될 수 있는 재조합 벡터를 생성하는 데 이용될 수 있다.
본 출원의 발현 벡터는 각각의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 상류(5')에 위치된 미번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2가지 부류, 즉, 유도성 및 구조성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도에서 변화에 반응하여 자신의 제어 하에 증가된 수준의 시스트론의 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식된 매우 다수의 프로모터는 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 본 출원의 벡터 내로 단리된 프로모터 서열을 삽입함으로써 본 항체를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열과 다수의 이종성 프로모터 둘 다 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는데 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 프로모터가 이용되는데, 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터에 비해서, 발현된 표적 유전자의 더욱 큰 전사 및 더욱 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 혼성 프로모터, 예를 들어, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 박테리아에서 기능성인 다른 프로모터(예컨대, 다른 알려진 박테리아 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 이들의 핵산 서열은 공개되었고, 이에 의해 당업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어댑터를 이용하여, 표적 펩타이드를 암호화하는 시스트론에 이들을 작동 가능하게 결찰시키는 것을 가능하게 한다(Siebenlist et al. Cell 20: 269 (1980)).
일 양상에서, 재조합 벡터 내에서 각 시스트론은 막을 거쳐서 발현된 폴리펩타이드의 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 이는 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 부분일 수 있다. 본 발명을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(다시 말하면, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩타이드에 천연인 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 내열성 독소 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군에서 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고, 따라서 각 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 이콜라이 trxB- 균주)는 이황화결합 형성에 바람직한 세포질 조건을 제공하고, 이에 의해, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 접힘 및 조립을 가능하게 한다.
본 개시내용의 항체를 발현시키기 위한 적합한 원핵 숙주 세포는 고세균 및 진정세균, 예를 들면, 그람 음성 또는 그램 양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 실례는 에스케리키아(Escherichia)(예컨대, 이콜라이), 바실리(예컨대, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종(예컨대, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레스실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그램 음성 세포가 이용된다. 일 실시형태에서, 이콜라이 세포는 숙주로서 사용된다. 이콜라이 균주의 예는 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 기탁번호 27,325) 및 유전자형 W3110 AfhuA(AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR(미국 특허 제5,639,635호)를 갖는 균주 33D3을 비롯한 이의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 이들의 유도체, 예를 들면, 이콜라이 294(ATCC 31,446), 이콜라이 B, 이콜라이 1776(ATCC 31,537) 및 이콜라이 RV308(ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이러한 예는 제한하는 것이 아니라 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 전술한 세균 중에서 한 가지의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에서 공지되고, 예를 들어, 문헌[Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에서 설명된다. 박테리아의 세포에서 레플리콘의 복제 가능성을 고려하여, 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예컨대, 널리 알려진 플라스미드, 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하는데 이용될 때, 이콜라이, 세라티아(Serratia), 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 이용될 수 있다.
전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해효소를 분비해야 하고, 추가 단백질분해효소 저해제가 바람직하게는 세포 배양액에 혼입될 수 있다.
숙주 세포는 위에서 기재한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는 데 적절하다면 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성 부분에 의해 복제 가능하도록, DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 이용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이런 세포에 타당한 표준 기술을 이용하여 행해진다. 염화칼슘을 이용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 포함하는 박테리아 세포에 대해 일반적으로 이용된다. 형질전환을 위한 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 이용한다. 이용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 출원의 항체를 생산하는 데 이용되는 원핵 세포는 당업계에서 공지되어 있고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로스(luria broth: LB) + 필요한 영양소 보충물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해, 발현 벡터의 작제에 근거하여 선택된 선택제를 함유한다. 예컨대, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현시키는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외에 임의의 필요한 보충물은 또한, 단독으로 또는 다른 보충물 또는 배지, 예를 들어, 복합 질소원과의 혼합물로서 도입된 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 다이티오에리트리톨 및 다이티오트레이톨로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다. 원핵 숙주 세포는 적합한 온도 및 pH에서 배양된다.
유도성 프로모터가 본 출원의 발현 벡터에서 이용되는 경우에, 단백질 발현은 상기 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에 유도된다. 본 출원의 일 양상에서, PhoA 프로모터가 폴리펩타이드의 전사를 제어하는데 이용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위한 인산염-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 인산염-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다(예를 들어, 문헌[Simmons et al., J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002)] 참조). 당업계에서 공지된 바와 같이, 이용된 벡터 작제물에 따라, 다양한 다른 유도제가 이용될 수 있다.
본 개시내용의 발현된 항체는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 미생물을 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 파괴하는 것을 수반한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 조직파편 또는 전체 세포가 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은 예로서, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지 내로 수송되고 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양액으로부터 제거될 수 있고, 생성된 단백질의 추가 정제를 위해 배양 상층액은 여과되고 농축될 수 있다. 발현된 폴리펩타이드는 추가로 단리되고, 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어, 폴리아크릴아마이드 겔 전기이동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 확인될 수 있다.
대안적으로, 단백질 생산은 발효 과정에 의해 대량으로 수행된다. 재조합 단백질의 생성을 위해 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 이용 가능하다. 본 개시내용의 항체의 생산 수율 및 품질을 향상시키기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종성 단백질의 적절한 접힘 및 용해성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌[Chen et al. J Bio Chem 274:19601-19605 (1999)]; 미국 특허 제6,083,715호; 미국 특허 제6,027,888호; 문헌[Bothmann and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105 (2000); Ramm and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17106-17113 (2000); Arie et al., Mol. Microbiol. 39:199-210 (2001)].
발현된 이종성 단백질의 단백질 분해를 최소화하기 위해(특히 단백질 분해 민감성인 것), 단백질 분해 효소에 대해 결핍된 특정 숙주 균주가, 예를 들어, 미국 특허 제5,264,365호; 미국 특허 제5,508,192호; 문헌[Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재된 바와 같이 본 발명에 대해 사용될 수 있다. 단백질분해효소에 결함성이고, 그리고 하나 이상의 샤프롱 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이콜라이 균주가 본 출원의 항체를 암호화하는 발현 시스템에서 숙주 세포로서 이용될 수 있다.
본 명세서에서 생산된 항체는 추가 검정 및 이용을 위해 실제적으로 균질한 제제를 얻기 위해 추가로 정제될 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음의 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어, DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예로서, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과. 고체상 상에 고정된 단백질 A는, 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 개시내용의 결합 분자의 면역친화도 정제를 위해 사용될 수 있다. 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 더욱 바람직하게는 제어된 기공 유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 칼럼은 오염물질의 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도에서, 시약, 예를 들면, 글리세롤로 코팅되었다. 이어서, 고체상은, 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물질을 제거하기 위해 세척된다. 최종적으로, 관심 항체는 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.
진핵 세포에서 재조합 생산
진핵 발현을 위해, 벡터 성분은 일반적으로, 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중에서 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
또한, 진핵 숙주에서 사용하기 위한 벡터는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N 말단에서 특정한 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 삽입물일 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨) 것이다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이런 전구체 영역에 대한 DNA는 본 출원의 항체를 암호화하는 DNA에 리딩 프레임에서 결찰된다.
일반적으로, 복제기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기점은 전형적으로 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 선택 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, 영양 결핍을 보충하거나, 복합 배지로부터 이용 가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화할 수 있다.
선택 계획의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하여 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택은 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신 약물을 사용한다.
포유류 세포에 적합한 선택 가능한 마커의 다른 예는 본 출원의 항체를 암호화하는 핵산을 취하는 데 적격인 세포의 식별을 가능하게 하는 것이다. 예컨대, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉사트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR이 이용될 때 예시적인 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에서 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 암호화-DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선택 가능한 마커, 예를 들면, 아미노글리코시드 3'-인산전달효소(APH)로 형질전환된 또는 공동형질전환된 숙주 세포(특히, 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택 가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코사이드 항생제에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 생명체에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 진핵 유전자는 전사가 시작되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치된 AT-풍부한 영역을 갖는다. 다수 유전자의 전사 개시로부터 상류의 70 내지 80개 염기로 발견된 다른 서열이 포함될 수 있다. 대부분의 진핵의 3' 말단은 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있다. 이들 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
포유류 숙주세포 내 벡터로부터의 폴리펩타이드 전사는, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 양립할 수 있다면, 예를 들면, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 이종성 포유류 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터로부터 제어될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 본 개시내용의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유류 유전자로부터 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린). 예는 복제기점의 후측 상의 SV40 인핸서(bp 100 내지 270), 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제기점의 후측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해, 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 또한 참조한다. 인핸서는 폴리펩타이드 암호화 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 부위 5'에 위치된다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종료 및 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 간헐적으로 3', 비번역 영역으로부터 공통적으로 이용 가능하다. 이들 영역은 폴리펩타이드-암호화 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 포함한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다.
본 명세서에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여, 본 명세서에서 설명된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양 중인(조직 배양) 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되고 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통(현탁 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐암(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포 계통(Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환될 수 있고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하는 데 적절한 경우에 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본 출원의 항체를 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma)가 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 추가로, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지중 어느 것은 필요한 경우 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소(보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건(예컨대, 온도, pH 등)은 앞서 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것이며, 당업자에게는 분명할 것이다.
재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내에서 생산되거나, 원형질막주위 공간에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되면, 제1 단계로서, 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용균 단편이, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상층액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 사용하여 먼저 농축된다. 프로테아제 저해제, 예컨대, PMSF는 단백질 분해를 저해하기 위해 임의의 앞서 언급한 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 단백질 조성물은, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정한 기질, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스타이렌-다이비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 때보다 더 빠른 속도 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어, 이온-교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™에서 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼)에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전 역시 회수되는 항체에 따라 가용하다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체와 오염물질을 포함하는 혼합물은 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피 처리될 수 있다.
5.2.7. 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자
다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, BCMA에 대한 VHH 도메인)를 포함하는 결합 분자가 본 명세서에 제공된다. 이하의 부문 5.3에 기재된 바와 같은 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)에 추가로, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 BCMA에 대한 단일 도메인 항체는 다른 결합 분자의 부분이다. 본 개시내용의 예시적인 결합 분자는 본 명세서에 기재된다.
융합 단백질
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 다른 제제, 예를 들어, 단백질-기반 독립체에 유전적으로 융합되거나 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 제제에 화학적으로 접합되거나 또 다르게는 제제에 비공유적으로 접합될 수 있다. 제제는 펩타이드 또는 항체(또는 이의 단편)일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 생성하기 위해 이종성 단백질 또는 폴리펩타이드(또는 이의 단편, 예를 들어, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450 또는 약 500개의 아미노산 또는 500개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된(공유 또는 비공유 접합) 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)뿐만 아니라 이의 용도가 본 명세서에 제공된다. 특히, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3) 및 이종성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
또한, 본 명세서에 제공된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 마커 또는 "태그" 서열, 예컨대, 펩타이드에 융합될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 마커 또는 태그 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드, 혈구응집소("HA") 태그 및 "FLAG" 태그이다.
항체에 모이어티(폴리펩타이드를 포함)를 융합 또는 접합시키는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985); Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed. 1987); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985); Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985); Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]; 미국 특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,723,125호; 제5,783,181호; 제5,908,626호; 제5,844,095호; 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT 공개 WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, 및 WO 99/04813; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39 (1991); Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-600 (1995); 및 Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-41 (1992)] 참조).
융합 단백질은, 예를 들어, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(총괄적으로 "DNA 셔플링"으로서 지칭됨) 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은, 예를 들어, 보다 고친화도 및 낮은 해리 속도를 갖는 항체를 포함하는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 단일 도메인 항체의 활성을 변경시키도록 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); 및 Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998)] 참조). 항체 또는 암호화된 항체는 오류 유발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입 또는 재조합 전의 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발을 실시함으로써 변경될 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 부문, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 제2 항체에 접합되어 항체 이형접합체를 형성한다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 제제에 유전적으로 융합된다. 유전자 융합은 단일 도메인 항체와 제제 사이에 링커(예를 들어, 폴리펩타이드)를 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 링커는 가요성 링커일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 치료 분자에 단일 도메인 항체를 연결하는 힌지 영역을 갖는 치료 분자에 유전적으로 접합된다.
또한 본 명세서에 제공된 다양한 융합 단백질의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 상기 부문 5.2.6에 기재된 다양한 방법은 또한 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 생성하는 데 이용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 재조합적으로 발현된다. 본 명세서에 제공된 융합 단백질의 재조합체 발현은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 포함하는 발현 벡터의 작제를 필요로 할 수 있다. 일단 본 명세서에 제공된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편이 얻어지면, 분자 생성을 위한 벡터는 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 당업자에게 잘 공지된 방법은 암호화 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 작제하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들면, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편 또는 CDR을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 이어서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 생성하기 위한 통상적인 기법에 의해 배양된다. 따라서, 또한 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 제공된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현시키는 데 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 암호화 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때, 인시추로 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 미생물, 예컨대 암호화 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이콜라이 및 바실러스 서브틸리스); 암호화 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia)); 암호화 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 작제물을 포함하는 포유류 세포계(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 박테리아 세포, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 진핵 세포는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현에 대해, 재조합 융합 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 인간 거대세포바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)는 항체 또는 이의 변이체에 대한 효과적인 발현 시스템이다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 유리하게는 발현될 융합 단백질에 대해 의도된 용도에 따라서 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 융합 단백질이 생성될 경우, 융합 단백질의 약제학적 조성물의 생산을 위해, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 항체 암호화 서열이 lac Z 암호화 영역이 있는 프레임 내의 벡터 내로 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생성될 수 있는 이콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO 12:1791 (1983)); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)를 갖는 융합 단백질로서 융합 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합 다음에 유리 글루타티온의 존재 하에 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3중 리더 서열에 결찰될 수 있다. 그 다음, 이러한 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, El 또는 E3 영역)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 융합 단백질을 발현할 수 있고 생존 가능한 재조합 바이러스가 생성될 것이다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984)] 참조). 삽입된 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 필요로 될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 더 나아가, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 리딩 프레임과 일치되어야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 유래를 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결 인자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)] 참조).
추가적으로, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 목적하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 작용에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형에 대하여 특징적이고 특이적인 메커니즘을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사물의 적절한 가공, 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역글로불린 쇄를 내인성으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
장기간 동안, 고수율의 재조합 단백질, 안정적인 발현이 이용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질을 안정하게 발현시키는 세포주는 조작될 수 있다. 바이러스 복제기점을 포함하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 세포는 풍부화된 배지에서 1 내지 2일 동안 성장되고, 이어서, 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드에서 선택 가능한 마커는 선택에 내성을 부여하며, 세포가 이들의 염색체 내로 플라스미드를 안정하게 통합시키고 좌위를 형성하도록 성장하는 것을 가능하게 하여, 결국 세포주에 클로닝되고 확장될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 융합 단백질을 발현시키는 세포주를 조작하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 결합 분자와 간접적 또는 직접적으로 상호작용하는 조성물의 선별 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 사용될 수 있는, 단순포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:8-17 (1980)) 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 다음의 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코사이드G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)); 및 하이드로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법은 목적하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 및 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기재되어 있다.
융합 단백질의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 융합 단백질을 발현시키는 벡터 시스템에서 마커가 증폭 가능할 때, 숙주 세포 배양물에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 복제물 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 융합 단백질 유전자와 연관되기 때문에, 융합 단백질의 생성이 또한 증가될 것이다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
숙주 세포는 본 명세서에 제공된 다중 발현 벡터로 공동형질감염될 수 있다. 벡터는 각각의 암호화 폴리펩타이드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다중 폴리펩타이드를 암호화하고 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 명세서에 제공된 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생성되었다면, 폴리펩타이드(예를 들어, 면역글로불린 분자)의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도, 사이징 칼럼 크로마토그래피, 및 카파 선택 친화도 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 제공된 융합 단백질 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 본 명세서에 기재된 또는 당업계에 달리 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
면역접합체
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 또한, 하나 이상의 세포독성 작용제, 예를 들면, 화학요법제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 명세서에서 설명된 임의의 항체(예컨대, 항-BCMA 단일 도메인 항체)를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 제0 425 235 B1호); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 이의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제6,630,579호); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 약물에 항체가 접합된, 항체-약물 접합체(ADC)이다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편에 접합된 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사선 접합체의 생산을 위해 사용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화(자기 공명 영상법, mri로서 또한 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예를 들어, 요오드-123 또한, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 결합제, 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에의 방사성 뉴클레오타이드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조한다.
링커는 세포에서 접합제의 방출을 용이하게 하는 "절단 가능한 링커"일 수 있지만, 비-절단성 링커가 또한 본 명세서에 상정된다. 본 개시내용의 접합체에서 사용하기 위한 링커는 다제 수송체-매개 내성을 피하도록 설계된 산 불안성 링커(예를 들어, 하이드라존 링커), 이황화물-함유 링커, 펩티다제-민감성 링커(예를 들어, 아미노산, 예를 들어, 발린 및/또는 시트룰린을 포함하는 펩타이드 링커, 예컨대, 시트룰린-발린 또는 페닐알라닌-라이신), 광불안정 링커, 다이메틸 링커, 티오에터 링커 또는 친수성 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수 가능한(예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록퍼드 소재) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 가교 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 상정하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는, 예를 들어, 진단 분자에 접합되거나 재조합적으로 융합된다. 이러한 진단 및 검출은, 예를 들어, 다양한 효소, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제; 보결분자단, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 스트렙타비딘/바이오틴 또는 아비딘/바이오틴; 형광 물질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 루미놀; 생발광 물질, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 루시퍼라제, 루시페린 또는 에쿠오린; 화학발광 물질, 예컨대, 225Acγ-방출, Auger-방출, β-방출, 알파-방출 또는 양전자-방출 방사성 동위원소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 검출 가능한 물질에 항체를 결합시킴으로써, 달성될 수 있다.
5.3. 키메라 항원 수용체
다른 양상에서, BCMA에 결합하는 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다. 본 VHH 도메인을 포함하는 예시적인 CAR(즉, VHH-기반 CAR)은 이하의 부문 6에 예시된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)는: (a) 본 명세서에 제공된 바와 같은 BCMA에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 도메인 항체(sdAb), 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함한다. 각 성분 및 추가적인 영역은 아래에 더욱 상세하게 기재된다.
5.3.1. 세포외 항원 결합 도메인
본 명세서에 기재된 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 중 하나)의 단일-도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 펩타이드 결합을 통해, 또는 펩타이드 링커를 통해 서로에 대해 직접적으로 융합될 수 있다.
단일 도메인 항체
본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 단일 도메인 항체를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. sdAb는 동일하거나 또는 상이한 유래이고, 동일하거나 또는 상이한 크기일 수 있다. 예시적인 sdAb는 중쇄 단독 항체(예를 들어, VHH 또는 VNAR)로부터의 중쇄 가변 도메인, 경쇄를 자연적으로 결여하는 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인(예컨대, VH 또는 VL), 인간화 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생산된 인간 단일-도메인 항체, 및 항체로부터 유래된 것이 아닌 조작된 도메인 및 단일 도메인 골격을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용에서 상기 기재된 단일 도메인 항체를 포함하는, 당업계에 공지되어 있거나 본 개시내용에 의해 개발된 임의의 sdAb가 본 명세서에 기재된 CAR을 작제하는 데 사용될 수 있다. sdAb는 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 종에서 유래될 수 있다. 본 명세서에 상정된 단일 도메인 항체는 또한, 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 천연 유래 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, sdAb는 경쇄를 결여하는 중쇄 항체(본 명세서에서 "중쇄 단독 항체"로도 지칭됨)로서 알려져 있는 천연 유래 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는, 예를 들어, WO 94/04678 및 문헌[Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363:446-448 (1993)]에 개시되어 있다. 명료함의 이유로, 경쇄를 자연적으로 결여하는 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 이를 4 쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본 명세서에서 VHH로서 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉낙타, 알파카 및 콰나코에서 생긴 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외에 다른 종은 경쇄를 자연적으로 결여하는 중쇄 분자를 생산할 수 있고, 이러한 VHH는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 또한, VHH의 인간화된 형태뿐만 아니라 다른 변형 및 변이체가 또한 상정되며, 본 개시내용의 범주 이내이다.
낙타로부터 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. 이들은 단일 폴리펩타이드이고, 매우 안정적이며, 극도의 pH 및 온도 조건에 저항성일 수 있다. 게다가, 이들은 통상적인 4-쇄 항체의 경우에 해당하지 않는 프로테아제의 작용에 내성일 수 있다. 더 나아가, VHH의 시험관내 발현은 고수율, 적절하게 접힘된 기능적 VHH를 생산한다. 이에 더하여, 낙타에서 산출된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통해 또는 낙타 이외에 포유류의 면역화를 통해 시험관내에서 생성된 항체에 의해 인식되는 것 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예컨대, WO9749805 참조). 이렇게 해서, 하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR은 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR보다 표적과 더욱 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHH가 '특이한' 에피토프, 예를 들어, 공동(cavity) 또는 그루브에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이런 VHH를 포함하는 CAR의 친화도는 통상적인 다중특이성 폴리펩타이드보다 치료적 처치에 더욱 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 연골 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예컨대, sdAb는 상어의 혈청에서 발견되는 신규한 항원 수용체(NAR)로서 알려져 있는 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역에서 유래된 단일 도메인 분자("IgNAR")를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 문헌[Streltsov, Protein Sci. 14:2901-2909 (2005)]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 재조합, CDR-접합, 인간화, 낙타화, 탈면역화되고/되거나 시험관내에서 생성된다(예컨대, 파지 디스플레이에 의해 선택됨). 일부 실시형태에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역 내에 특정한 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 통상적인 4-쇄 항체로부터의 (천연 유래) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인에서 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하거나 또는 치환하는 것을 지칭한다. 이는 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있으며, 당업자에게 분명할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같이, VH-VL 계면에서, 그리고/또는 소위 낙타과 특징 잔기에서 형성하고/하거나 존재하는 아미노산에 삽입된다(예를 들어, WO 94/04678, 문헌[Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290 (1994); Davies and Riechmann, Protein Engineering 9 (6): 531-537 (1996); Riechmann, J. Mol. Biol. 259: 957-969 (1996); 및 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Meth. 231: 25-38 (1999)] 참조).
일부 실시형태에서, sdAb는 인간 중쇄 세그먼트를 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 래트에 의해 생성된 인간 단일 도메인 항체이다. 예를 들어, US20090307787, 미국 특허 제8,754,287호, US20150289489, US20100122358, 및 WO2004049794를 참조한다. 일부 실시형태에서, sdAb는 친화도 성숙된다.
일부 실시형태에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 천연 유래 VHH 도메인은 낙타 VHH 서열의 (미경험 또는 면역) 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이런 방법은 당업계에 공지된 하나 이상의 선별 기법을 이용하여, 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편, 항원 결정인자 또는 에피토프를 이용하여 이런 라이브러리를 선별하는 것을 수반할 수도 있고 또는 수반하지 않을 수도 있다. 이런 라이브러리 및 기법은, 예로서, WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에 기재되어 있다. 대안적으로, (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리, 예를 들어, 예로서 WO 00/43507에서 설명된 바와 같이, 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기법에 의해 (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 얻어진 VHH 라이브러리가 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 통상적인 4-쇄 항체로부터 산출된다. 예를 들어, EP 0 368 684; 문헌[Ward et al., Nature, 341 (6242): 544-6 (1989); Holt et al., Trends Biotechnol., 21(11):484-490 (2003)]; WO 06/030220; 및 WO 06/003388을 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 세포외 항원 결합 도메인은 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 바와 같은 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, 상기 부문 5.2에 기재된 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는, 예를 들어, 표 4의 VHH 도메인 및 표 4에서 해당 VHH 도메인 중 어느 것에서 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 갖는 것을 포함하는, 상기 부문 5.2에 기재된 바와 같은 항-BCMA sdAb이다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA sdAb는 낙타과, 키메라, 인간이거나 또는 인간화된다.
더 구체적으로는, 일부 실시형태에서, (a) 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호　2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
다른 실시형태에서, (a) 항-BCMA 단일 도메인 항체를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호　5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호　14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호　14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호　5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 2개의 VHH 도메인은 세포외 도메인에서 임의의 순서일 수 있으며, 즉, 제1 VHH 도메인 또는 제2 VHH 도메인은 세포외 도메인에서 N-말단에 있을 수 있다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, (a) 적어도 2개의 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공되되, 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)은 하나 이상의 추가적인 항원(들), 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 항원(들)을 표적화하는 1, 2, 3, 4개 이상의 추가적인 단일 도메인 항체 결합 영역(sdAb)에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에 의해 표적화된 추가적인 항원(들)은 세포 표면 분자이다. 단일 도메인 항체는 특수한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 행동하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 B 세포 악성 종양과 연관된다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응에 대한 표적 항원으로 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. CAR에 의해 표적화된 항원은 단일 병든 세포 상에서 항원 또는 질환에 각각 기여하는 상이한 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있다. CAR에 의해 표적화된 항원은 질환에 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 종양 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 본 개시내용의 추가적인 표적화된 항원의 선택은 치료될 암의 특정 유형에 따를 것이다. 예시적인 종양 항원은 신경교종-연관 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모생식선자극호르몬, 알파 태아단백질 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 타이로글로불린, RAGE-1, MN-CAIX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장관 카복실 에스터분해효소, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, 프로스테인, PSMA, HER2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 역할을 할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직 특이적 항원, 예를 들어, 흑색종에서 MART-1, 타이로시나제 및 gp100, 그리고 전립선암에서 전립선 산성 인산분해효소(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환-관련 분자의 그룹, 예를 들어, 종양유전자 HER2/Neu/ErbB-2에 속한다. 표적 항원의 또 다른 그룹은 종양태아 항원, 예를 들어, 암배아 항원(CEA)이다. B-세포 림프종에서, 종양-특이적 이디오타이프(idiotype) 면역글로불린은 개개 종양에 독특한 정말로 종양-특이적인 면역글로불린 항원을 구성한다. BCMA에 추가로, B-세포 분화 항원, 예컨대, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다.
일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양-연관 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 독특하며, 체내의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 연관 항원은 종양 세포에 독특하지 않고, 대신에, 상기 항원에 대한 면역 관용의 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서도 발현된다. 종양 상에서의 항원의 발현은 면역계가 상기 항원에 반응할 수 있게 하는 조건 하에 일어날 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙할 때인 태아 발달 동안 정상적인 세포에서 발현되고 반응할 수 없는 항원일 수 있거나, 또는 이들은 정상적인 세포에서는 극히 낮은 수준에서 정상적으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적 예는, 분화 항원, 예를 들면, MART-1/MelanA(MART-I), gp 100(Pmel 17), 타이로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양 특이적 다계열 항원, 예를 들면, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; 과발현된 배아 항원, 예를 들면, CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자, 예를 들면, p53, Ras, HER2/neu; 염색체 전위로부터 발생하는 독특한 종양 항원; 예를 들면, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 그리고 바이러스 항원, 예를 들면, 엡스타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원 E6과 E7을 포함한다.
다른 거대, 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP 및 TPS를 포함한다.
일부 더 구체적인 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 항원(들)은 CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 및 당지질 F77로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 sdAb는 낙타과, 키메라, 인간이거나 또는 인간화된다.
세포외 도메인에서 항원 결합 도메인에 추가로, 본 명세서에 제공된 CAR은 링커(예를 들어, 펩타이드 링커), 막관통 도메인, 힌지 영역, 신호 펩타이드, 세포내 신호전달 도메인, 공자극 신호전달 도메인 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 이들 각각은 이하에 더욱 상세하게 기재된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함하되, CMSD는 선택적으로 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 연결된 복수의 면역-수용체 타이로신-기반 활성화 모티프("CMSD ITAM")를 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 N-말단에서 C-말단까지: 선택적 N-말단의 서열 - CD3δ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 선택적 제3 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 C-말단의 서열 (예컨대, 본 명세서에 제공된 ITAM010)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 폴리펩타이드의 N 말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원-결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CMSD을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원-결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ으로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 단일특이성이다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 1가이다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 다중특이성이다. 일부 실시형태에서, BCMA CAR은 다가이다.
펩타이드 링커
본 명세서에 기재된 다중특이성 또는 다가 CAR에서 다양한 단일 도메인 항체는 펩타이드 링커를 통해 서로에 대해 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 임의의 펩타이드 링커 없이 서로에 대해 직접적으로 융합된다. 상이한 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)를 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. CAR의 상이한 도메인은 또한, 펩타이드 링커를 통해 서로에 대해 융합될 수 있다.
CAR에서 각 펩타이드 링커는 단일 도메인 항체 및/또는 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일하거나 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각 펩타이드 링커는 독립적으로 선택되고 최적화될 수 있다. CAR에서 사용된 펩타이드 링커(들)의 길이, 가요성의 정도 및/또는 다른 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도, 특이성 또는 결합활성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 특성에 일부 영향을 줄 수 있다. 예컨대, 2개의 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 방해하지 않는 것을 보장하기 위해 보다 긴 펩타이드 링커가 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 짧은 펩타이드 링커가 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기(예컨대, 글리신 및 세린)를 포함한다. 예컨대, 글리신-세린 이중체가 적합한 펩타이드 링커일 수 있다.
펩타이드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 이상의 아미노산 길이 중 적어도 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 또는 보다 소수의 아미노산 길이 이하이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커의 길이는 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 30개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산 중 어느 것이다.
펩타이드 링커는 천연 유래 서열 또는 비천연 유래 서열을 가질 수 있다. 예컨대, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열은 링커로서 이용될 수 있다. 예컨대, WO1996/34103을 참조한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 기타 가요성 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 펩타이드 링커는 이하의 표에 열거된다.
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예를 들어, WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, 문헌[Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197 (1990), 및 Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 링커는 또한 본 명세서에 제공된 CAR에 포함될 수 있으며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
5.3.2. 막관통 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵세포 막에서 열역학적으로 안정되는 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본 명세서에서 설명된 CAR에서의 용도에 양립 가능한 막관통 도메인은 천연 유래 단백질로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 이것은 세포막에서 열역학적으로 안정되는 합성, 비천연 유래 단백질 세그먼트, 예를 들어, 소수성 단백질 세그먼트일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3차원 구조에 근거하여 분류된다. 예컨대, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴, 또는 세포의 인지질 이중층에 걸쳐 있을 수 있는 임의의 다른 안정된 구조를 형성할 수 있다. 더 나아가, 막관통 도메인은 또한 또는 대안적으로, 막관통 도메인이 막을 가로지르는 통과의 횟수 및 단백질의 배향을 비롯한 막관통 도메인 위상에 기반하여 분류될 수 있다. 예컨대, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 1회 가로지르고, 다중-통과 막 단백질은 세포막을 적어도 2회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 이상) 가로지른다. 막 단백질은 세포의 내측 및 외측에 대해 이들의 말단 및 막-통과 세그먼트(들)의 위상에 따라 I형, II형 또는 III형으로서 규정될 수 있다. I형 막 단백질은 단일 막에 걸쳐 있는 영역을 가지며 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. II형 막 단백질은 또한 단일 막에 걸쳐 있는 영역을 갖지만 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측면 상에 존재하고 단백질의 N-말단이 세포질 측면 상에 존재하도록 배향된다. III형 막 단백질은 복수의 막-걸침(membrane-spanning) 세그먼트를 갖고, 막관통 세그먼트의 숫자 및 N-과 C-말단의 위치에 기반하여 더욱 하위로 분류될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 설명된 CAR의 막관통 도메인은 I형 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다중-통과 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본 명세서에서 설명된 CAR에서의 용도에 적합할 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합체(적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개의 이상) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중-통과 막 단백질의 N 말단 및 C 말단은 지질 이중층과 반대편 측면 상에 존재한다, 예를 들면, 단백질의 N 말단은 지질 이중층의 세포질 측면 상에 존재하고 단백질의 C 말단은 세포외 측면 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDl la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, BCMA, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
일부 구체적 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CD8α의 막관통 도메인이다.
본 명세서에 기재된 CAR에서 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한, 합성, 비천연 유래 단백질 세그먼트의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성, 비천연 유래 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시형태에서, 단백질 세그먼트는 적어도 대략 20개 아미노산, 예를 들어, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산이다. 합성 막관통 도메인의 예는 당업계에, 예를 들어, 미국 특허 제7,052,906호 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776에 공지되고, 이들의 적절한 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 제공된 막관통 도메인은 막관통 도메인의 C 말단 측에 위치된 세포질 영역 및 막관통 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 실시형태에서, 지질 이중층에서 막관통 도메인을 배향시킨다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 막관통 도메인의 막관통 영역 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 막관통 도메인의 세포질 영역 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 라이신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예컨대, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 막관통 도메인의 C 말단에서 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예를 들어, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 세그먼트의 수친화도(hydropathy) 또는 소수성 또는 친수성 특징은 당업계에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어, Kyte와 Doolittle 수친화도 분석에 의해 평가될 수 있다.
5.3.3. 세포내 신호전달 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR을 발현시키는 면역 효과기 세포의 정상적인 효과기 기능 중에서 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포질 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 비록 통상적으로 전체 세포질 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 사슬을 이용하는 것은 필요하지 않다. 세포질 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용되는 정도로, 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 이러한 절단된 부분은 무손상 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포질 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포질 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "1차 세포내 신호전달 도메인"은 면역 효과기 기능을 유도하기 위해 자극 방식으로 작동하는 세포질 신호전달 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프, 또는 ITAM으로서 알려져 있는 신호전달 모티프를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "ITAM"은 일반적으로 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 상기 모티프는 6 내지 8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개 반복을 포함할 수 있는데, 여기서 각 x는 독립적으로 임의의 아미노산이고, 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I가 생산된다. 신호전달 분자내의 ITAM은 세포 내에서의 신호전달에 중요한데, 이는 신호전달 분자의 활성화 이후에 ITAM 내에 타이로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 수반되는 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 작용할 수 있다. 예시적인 ITAM-포함 1차 세포질 신호전달 서열은 CD3ζ, FcR 감마 (FCER1G), FcR 베타(Fc 엡실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD3ζ의 1차 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 CD3ζ의 1차 세포내 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, Q65K를 포함하는 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인의 기능적 돌연변이체이다.
5.3.3.1. 키메라 신호전달 도메인
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR은 전문이 참조에 의해 원용된 PCT/CN2020/112181 및 PCT/CN2020/112182에 기재된 바와 같은 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함한다. 본 명세서에 기재된 CMSD는 임의의 천연 유래 ITAM-함유 모 분자와 상이한 입체배치로 배열된 ITAM(본 명세서에서 "CMSD ITAM"으로도 지칭됨) 및 선택적 링커(본 명세서에서 "CMSD 링커"로도 지칭됨)를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, CMSD는 서로 직접 연결된 2개 이상의 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 하나 이상의 "이종성 링커"에 의해 연결된 ITAM, 즉, ITAM-포함 모 분자(예를 들어, G/S 링커)로부터 유래되지 않은, 또는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된 링커 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 둘 이상의(예컨대, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 둘은 서로 상이하다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ로부터 유래되지 않는다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 실시형태에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및/또는 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ ITAM3이다. 일부 실시형태에서, CMSD는 CD3ζ로부터의 임의의 ITAM을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 둘은 동일한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CMSD는 둘 이상의(예컨대, 2, 3, 4개 이상의) ITAM을 포함하되, CMSD ITAM 중 적어도 둘은 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, CMSD는 하나 이상의 링커("CMSD 링커")에 의해 선택적으로 연결된 복수의 ITAM("CMSD ITAM")을 포함하되, (a) 복수의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM은 서로 직접 연결되고/되거나; (b) CMSD는 ITAM-포함 모 분자(예를 들어, G/S 링커)로부터 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM을 포함하고/하거나; (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고/하거나; (d) CMSD는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 CMSD ITAM을 포함하고/하거나; (e) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ로부터 유래되지 않고; (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고; (g) 복수의 CMSD ITAM은 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 각각 유래되고/되거나; 그리고/또는 (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, CMSD는 상기 기재한 특징 중 둘 이상을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, (a) 복수의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM은 서로 직접 연결되고, (d) CMSD는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b) CMSD는 ITAM-포함 모 분자(예를 들어, G/S 링커)로부터 유래되지 않은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM을 포함하고, 그리고 (d) CMSD는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고/하거나; (d) CMSD는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 CMSD ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니고, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, (b) CMSD는 ITAM-포함 모 분자로부터 유래되지 않은 하나 이상의 링커(예를 들어, G/S 링커)에 의해 연결된 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM을 포함하고, (f) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ의 ITAM1 또는 ITAM2가 아니다. 일부 실시형태에서, (b) CMSD는 ITAM-포함 모 분자로부터 유래되지 않은 하나 이상의 링커(예를 들어, G/S 링커)에 의해 연결된 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM을 포함하고, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, (b) CMSD는 ITAM-포함 모 분자로부터 유래되지 않은 하나 이상의 링커(예를 들어, G/S 링커)에 의해 연결된 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) CMSD ITAM을 포함하고, (d) CMSD는 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 동일한 CMSD ITAM을 포함하며, (h) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin으로 이루어진 군으로부터 선택된 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, (c) CMSD는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된 하나 이상의 CMSD 링커를 포함하고, (e) CMSD ITAM 중 적어도 하나는 CD3ζ로부터 유래되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR의 ISD는 CMSD로 본질적으로 이루어진다(예컨대, 이루어진다). 일부 실시형태에서, ISD는 CMSD의 N-말단 또는 C-말단에 위치된 공자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28 공자극 신호전달 도메인)을 추가로 포함하고, CMSD 내에서 선택적 연결 펩타이드를 통해 CMSD에 연결된다(예를 들어, 선택적 CMSD N-말단의 서열 또는 선택적 CMSD C-말단의 서열을 통해 연결된다).
본 명세서에 기재된 CMSD는 면역 효과기 기능을 유도하는 자극 방식으로 작용하는 ISD에서 1차 신호전달 도메인으로서 작용할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "ITAM"은 많은 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에서 발견되는 보존된 단백질 모티프를 지칭한다. ITAM은 다수의 세포 표면 수용체의 세포질 도메인(예를 들어, TCR 복합체) 또는 이들이 회합된 서브유닛에 존재하고, 신호 전달에서 중요한 역할을 한다. 전통적인 CAR은 보통 3 ITAM, CD3ζ ITAM1, CD3ζ ITAM2 및 CD3ζ ITAM3을 포함하는 CD3ζ의 1차 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함한다. 일부 실시형태에서 본 명세서에 기재된 ITAM은 천연 유래이며, 즉, 천연 유래 ITAM-포함 모 분자에서 발견될 수 있다. 일부 실시형태에서, ITAM은, 예를 들어, 천연 유래 ITAM에 비해 1, 2개 이상의 아미노산 치환을 생성함으로써, 추가로 변형된다.
ITAM은 보통 6 내지 8개의 아미노산 잔기에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개 반복을 포함할 수 있는데, 여기서 각 x는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이고, 보존된 모티프 YxxL/I-x6-8-YxxL/I를 얻는다. 일부 실시형태에서, ITAM은 제1 ITAM 타이로신(Y)에 비해 +2 위치에서 음으로 하전된 아미노산(D/E)을 포함하여, D/E-x0-2-YxxL/I-x6-8-YxxL/I의 공통 서열을 얻는다. 예시적인 ITAM-포함 신호전달 분자는 본 명세서에서 "ITAM-포함 모 분자"로도 지칭되는 CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 및 Moesin을 포함한다. ITAM-포함 모 분자에 존재하는 ITAM은 신호전달 분자의 활성화 후 ITAM에서 타이로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 리간드 맞물림 시 세포 내에서의 신호 전달에 관련된 것으로 알려져 있다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 수반되는 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 작용할 수 있다.
일부 실시형태에서, ITAM-포함 모 분자는 CD3ζ이다. 일부 실시형태에서, CD3ζ ISD는 CD3ζ ITAM1의 N-말단에, CD3ζ ITAM3의 C-말단에 CD3ζ ITAM1, CD3ζ ITAM2, CD3ζ ITAM3 및 비-ITAM을 포함하고, 3개의 ITAM을 연결한다.
일부 실시형태에서, CMSD는 복수의 ITAM을 포함하되, 이들 중 적어도 둘은 서로 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, CMSD는 복수의 ITAM을 포함하되, ITAM의 적어도 둘은 이종성 링커에 의해 연결된다. 일부 실시형태에서, CMSD는가장 N-말단의 CMSD ITAM의 N-말단에서 N-말단의 서열(본 명세서에서 "CMSD N-말단의 서열"로도 지칭됨)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 대부분의 C-말단의 CMSD ITAM의 C-말단에서 C-말단의 서열(본 명세서에서 "CMSD C-말단의 서열"로도 지칭됨)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커(들), N-말단의 서열 및/또는 C-말단의 서열은 약 1 내지 약 15개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 중 어느 것, 또는 이들 사이의 임의의 범위) 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 이종성 링커는 G/S 링커이다. 일부 실시형태에서, 이종성 링커는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 3-ITAM 포함 CMSD는 N'에서 C'까지, 선택적 CMSD N-말단의 서열 - 제1 CMSD ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - 제2 CMSD ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - 제3 CMSD ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM1 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함하되, 제1 CMSD 링커 및 제2 CMSD 링커 중 적어도 하나는 존재하지 않거나 CD3ζ에 대해 이종성이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM1 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM1 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함하되, 선택적 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 존재하지 않거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM2 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM2 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함하되, 선택적 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 존재하지 않거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함하되, 선택적 제1 CMSD 링커 및/또는 제2 CMSD 링커는 존재하지 않거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커와 동일할 수 있다).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM1 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ζ ITAM2 - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ζ ITAM3 - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CMSD는 CD3ζ의 임의의 ITAM(예를 들어, ITAM1, ITAM2 또는 ITAM3)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 3-ITAM 포함 CMSD는 비-CD3ζ ITAM-포함 모 분자(예를 들어, CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 또는 Moesin)로부터 유래된 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) ITAM을 포함하고, 이를 연결하는 선택적 링커(들)는 존재하지 않거나 또는 CMSD의 효과기 기능 신호 전달에 적합한 임의의 링커 서열일 수 있다(예를 들어, 제1 CMSD 링커는 CD3ζ 제1 링커와 동일할 수 있고, 제2 CMSD 링커는 CD3ζ 제2 링커 또는 G/S 링커와 동일할 수 있다).
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3ε ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - DAP12 ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - Igα ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - Igα ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - Igα ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - Igβ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - Igβ ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - FcεRIγ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - FcεRIγ ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 세포질 CD3ζ N-말단의 서열 - 제1 CMSD ITAM - CD3ζ 제1 링커 - 제2 CMSD ITAM - CD3ζ 제2 링커 - 제3 CMSD ITAM - CD3ζ C-말단의 서열을 포함하되, CMSD 내의 모든 비-ITAM 서열(세포질 CD3ζ N-말단의 서열, CD3ζ 제1 링커, CD3ζ 제2 링커 및 CD3ζ C-말단의 서열)은 이들이 모 CD3ζ ISD에서 자연적으로 존재하는 것과 동일하거나 동일한 위치에 있고, 이러한 CMSD는 또한 "비-ITAM CD3ζ ISD 프레임워크를 포함하는 CMSD"로도 지칭된다. 비-ITAM CD3ζ ISD 프레임워크를 포함하는 CMSD에 대해, 제1 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM1이고, 제2 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM2이며, 제3 CMSD ITAM이 CD3ζ ITAM3인 조합을 제외하고, 제1/제2/제3 CMSD ITAM은 CD3δ ITAM, CD3γ ITAM, CD3ζ ITAM1, CD3ζ ITAM2, CD3ζ ITAM3, DAP12 ITAM, Igα ITAM, Igβ ITAM 및 FcεRIγ ITAM으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 세포질 CD3ζ N-말단의 서열 - DAP12 ITAM - CD3ζ 제1 링커 - DAP12 ITAM - CD3ζ 제2 링커 - DAP12 ITAM - CD3ζ C-말단의 서열을 포함한다(예를 들어, 이들로 이루어진다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 세포질 CD3ζ N-말단의 서열 - CD3γ ITAM - CD3ζ 제1 링커 - CD3γ ITAM - CD3ζ 제2 링커 - CD3γ ITAM - CD3ζ C-말단의 서열을 포함한다(예를 들어, 이들로 이루어진다).
일부 실시형태에서, 4-ITAM 포함 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - 제1 CMSD ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - 제2 CMSD ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - 제3 CMSD ITAM - 선택적 제3 CMSD 링커 -fourth CMSD ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다. 5-ITAM 포함, 6-ITAM 포함 등의 CMSD에 대해서도 마찬가지이다. 4개 이상의(예를 들어, 4, 5개 이상의) ITAM을 포함하는 CMSD에 대해, ITAM-포함 모 분자는 보통 1 ITAM(예를 들어, 비-CD3ζ ITAM-포함 분자, 예컨대, CD3ε, CD3δ, CD3γ, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), FcεRIβ, FcεRIγ, DAP12, CNAIP/NFAM1, STAM-1, STAM-2 또는 Moesin) 또는 3 ITAM(예를 들어, CD3ζ)을 포함하기 때문에, CMSD 내의 적어도 하나의 ITAM은 ITAM-포함 모 분자와 상이한 분자로부터 유래되거나 또는 ITAM이 ITAM-포함 모 분자에 존재하는 경우와 상이한 위치에 존재하는 하나의 ITAM-포함 모 분자와 상이할 것이며, 따라서 4개 이상의(예를 들어, 4, 5개 이상의) ITAM을 포함하는 CMSD는 본 명세서에 기재된 임의의 ITAM-포함 모 분자(예를 들어, CD3ζ)로부터 유래된 ITAM을 포함할 수 있고, 선택적 링커는 존재하지 않거나, ITAM-포함 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열로부터 유래되거나, 또는 ITAM-포함 모 분자로부터의 이종성 서열을 가질 수 있다(예를 들어, G/S 링커일 수 있다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD는 N'에서 C'까지: 선택적 CMSD N-말단의 서열 - CD3δ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM( - 선택적 제3 CMSD 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 CMSD C-말단의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택적 CMSD 링커(들), CMSD N-말단의 서열 및 CMSD C-말단의 서열은 ITAM-포함 모 분자의 세포질 비-ITAM 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CMSD는 서열번호 53의 서열(본 명세서에서 이후에 "ITAM010" 또는 "ITAM010 작제물"로도 지칭됨)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 CMSD는 일부 실시형태에서 Nef 단백질에 대한 결합이 없거나 감소되었다. 일부 실시형태에서, CMSD는 Nef(예를 들어, 야생형 Nef, 예컨대, 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 돌연변이체 SIV Nef)에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, CMSD는 CD3ζ ITAM1 및 CD3ζ ITAM2를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 복수의 CMSD ITAM은 CD3ζ ITAM3, DAP12, CD3ε, Igα(CD79a), Igβ(CD79b) 또는 FcεRIγ로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CMSD 내의 ITAM은 모든 CD3ζ ITAM3이다. 일부 실시형태에서, CMSD 내의 ITAM은 모든 CD3ε ITAM이다. 일부 실시형태에서, CMSD는 DAP12 ITAM, CD3ε ITAM 및 CD3ζ ITAM3인 3개의 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, Nef(예를 들어, 야생형 Nef, 예컨대, 야생형 SIV Nef, 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 돌연변이체 SIV Nef)와 CMSD 사이의 결합은 Nef와 ITAM-포함 모 분자(예를 들어, CD3ζ, CD3ε) 사이의 결합보다 적어도 약 3% 미만, 5% 미만, 또는 10% 미만(예를 들어, 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 미만 중 어느 것)이다. 일부 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 인간화된 항-BCMA sdAb를 포함하는 본 명세서에 제공된 CAR은 서열번호　53의 아미노산 서열을 포함하는 CMSD를 포함하고, CAR은 Nef 단백질 변이체, 예컨대, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 Nef(돌연변이체 SIV Nef M116)를 발현시키는 조작된 T 세포에서 발현된다.
상기 논의한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 CMSD는 선택적 CMSD 링커(들), 선택적 CMSD C-말단의 서열 및/또는 선택적 CMSD N-말단의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단의 서열 및/또는 CMSD N-말단의 서열 중 적어도 하나는 ITAM-포함 모 분자로부터 유래되고, 예를 들어, ITAM-포함 모 분자의 링커 서열이다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커, CMSD C-말단의 서열 및/또는 CMSD N-말단의 서열은 이종성이고, 즉, 이들은 ITAM-포함 모 분자(예를 들어, G/S 링커)로부터 유래되지 않거나 또는 CMSD ITAM 중 하나 이상이 유래된 ITAM-포함 모 분자와 상이한 ITAM-포함 모 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커(들), CMSD C-말단의 서열 및/또는 CMSD N-말단의 서열 중 적어도 하나는 ITAM-포함 모 분자에 대해 이종성이고, 예를 들어, ITAM-포함 모 분자의 임의의 부분(예를 들어, G/S 링커)과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CMSD는 둘 이상의 이종성 CMSD 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 이종성 CMSD 링커는 서로 동일하다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 이종성 CMSD 링커 중 적어도 둘은 서로 동일하다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 이종성 CMSD 링커는 모두 서로 상이하다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커, CMSD C-말단의 서열 및/또는 CMSD N-말단의 서열 중 적어도 하나는 CD3ζ로부터 유래된다.
CMSD 내의 링커, C-말단의 서열 및 N-말단의 서열은 CMSD의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라서 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. CMSD 링커, CMSD C-말단의 서열 및 CMSD N-말단의 서열은 선택되고 독립적으로 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 인접한 ITAM이 서로 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하기 위해 보다 긴 CMSD 링커(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25개 이상의 아미노산 길이 중 어느 것인 링커)가 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 보다 긴 CMSD N-말단의 서열(예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25개 이상의 아미노산 길이 중 어느 것인 CMSD N-말단의 서열)은 가장 N-말단의 ITAM에 결합하는 신호 전달 분자에 충분한 공간을 제공하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커(들), C-말단의 CMSD 서열 및/또는 N-말단의 CMSD 서열은 약 25, 20, 15, 10, 5 또는 1개의 아미노산 길이 중 어느 것 이하이다. CMSD 링커 길이는 또한 ITAM-포함 모 분자의 ISD 내의 ITAM을 연결하는 내인성 링커와 동일하도록 설계될 수 있다. CMSD N-말단의 서열 길이는 또한 가장 N-말단의 ITAM과 막 사이에서 ITAM-포함 모 분자의 세포질 N-말단의 서열과 동일하게 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, CMSD 링커는 가요성 링커(예를 들어, 가요성 아미노산 잔기, 예컨대, Gly 및 Ser, 예를 들어, Gly-Ser 더블릿을 포함)이다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커는 G/S 링커이다. 일부 실시형태에서, CMSD N-말단의 서열 및/또는 CMSD C-말단의 서열은 가요성(예를 들어, 가요성 아미노산 잔기, 예컨대, Gly 및 Ser, 예를 들어, Gly-Ser 더블릿을 포함)이다.
선택적 CMSD 링커(들), N-말단의 서열 및/또는 C-말단의 서열은 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커, N-말단의 서열 및/또는 C-말단의 서열은 독립적으로 약 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 길이 중 어느 것 이하이다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커(들), N-말단의 서열 및/또는 C-말단의 서열의 길이는 독립적으로 약 1개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산 길이 또는 약 1개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, CMSD 링커(들), N-말단의 서열 및/또는 C-말단의 서열의 길이는 약 1개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산이다.
5.3.4. 공자극 신호전달 도메인
다수의 면역 효과기 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 증진할 뿐만 아니라 세포의 효과기 기능을 활성화시키기 위해, 항원 특이적 신호의 자극에 더하여, 공자극을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "공자극 신호전달 도메인"은 세포 내에서 신호전달을 매개하여 면역 반응, 예를 들어, 효과기 기능을 유도하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본 명세서에서 설명된 키메라 수용체의 공자극 신호전달 도메인은 공자극 단백질로부터 세포질 신호전달 도메인일 수 있는데, 이는 신호를 전달하고 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개된 반응을 조정한다. "공자극 신호전달 도메인"은 공자극 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하고, 이에 의해 면역 세포에 의한 공자극 반응, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 증식 및 생존을 매개하는 면역 세포(예컨대, T 세포) 상에서의 동계 결합 상대를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 둘 이상(예컨대, 약 2, 3, 4개 이상 중 어느 것)의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 동일한 공자극 신호전달 도메인 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 상이한 공자극 단백질, 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 임의의 둘 이상의 공자극 단백질로부터의 둘 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인 및 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인)은 선택적 펩타이드 링커를 통해 서로에 대해 융합된다. 1차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인과 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인) 사이에 위치된다. 다수의 공자극 신호전달 도메인은 상가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포(예컨대, 면역 세포)에서 공자극 신호전달 도메인의 활성화는 상기 세포가 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포작용 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공자극 분자의 공자극 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 CAR에서의 용도에 양립할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 효과기 분자가 발현될 면역 효과기 세포의 유형(예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 목적하는 면역 효과기 기능(예컨대, ADCC 효과)과 같은 인자에 기반하여 선택된다. CAR에서 사용하기 위한 공자극 신호전달 도메인의 예는 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 4- 1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공자극 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA- DR, Ikaros, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1) 및 NKG2C를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드(예컨대, CD83 및 MD2)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인(즉, 4-1BB)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 CD137의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다.
공자극 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있도록, 본 명세서에서 기재된 공자극 신호전달 도메인 중 어느 것의 변이체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 야생형 상대에 비해서 최대 10개의 아미노산 잔기 변이(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8개)를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공자극 신호전달 도메인은 변이체로서 지칭될 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공자극 신호전달 도메인에 비해서 신호 전달의 증가 및 면역 반응의 향상된 자극을 초래할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달에서의 감소 및 면역 반응의 감소된 자극을 유발할 수 있다.
5.3.5. 힌지 영역
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 단백질의 두 도메인 사이에서 일반적으로 발견되고, 그리고 단백질의 가요성 및 이들 도메인 중에서 어느 하나 또는 둘 모두의 서로에 대한 움직임을 가능하게 할 수 있는 아미노산 세그먼트이다. 효과기 분자의 막관통 도메인에 대해 세포외 항원 결합 도메인의 이런 가요성과 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 이용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10 내지 100개의 아미노산, 예를 들어, 약 15 내지 75개의 아미노산, 20 내지 50개의 아미노산, 또는 30 내지 60개의 아미노산 중 한 가지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개 아미노산 길이 중 어느 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 천연 유래 단백질의 힌지 도메인이다. 당업계에서 힌지 도메인을 포함하는 것으로 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본 명세서에서 설명된 키메라 수용체에서의 용도와 양립 가능하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 천연 유래 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며, 키메라 수용체에 가요성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 부분, 예를 들어, CD8α의 힌지 도메인의 적어도 15개(예컨대, 20, 25, 30, 35 또는 40개)의 연속적 아미노산을 포함하는 단편이다. 일부 실시형태에서, CD8α의 힌지 도메인은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
항체, 예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한, 본 명세서에서 설명된 pH-의존적 키메라 수용체 시스템에서의 용도를 위해 양립 가능하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인이고, 상기 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 상기 항체의 CH2와 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2와 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비천연 유래 펩타이드는 또한 본 명세서에서 기재된 키메라 수용체에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 힌지 도메인은 펩타이드 링커, 예를 들어, (GxS)n 링커이고, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상을 포함하는, 3과 12 사이의 정수일 수 있다.
5.3.6. 신호 펩타이드
본 개시내용의 CAR은 폴리펩타이드의 N 말단에서 신호 펩타이드(신호 서열로서 또한 알려져 있음)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩타이드는 폴리펩타이드를 세포 내의 목적하는 부위로 표적화하는 펩타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 효과기 분자를 세포의 분비 경로로 표적화시키고, 효과기 분자의 지질 이중층 내로의 통합 및 고정을 가능하게 할 것이다. 본 명세서에 기재된 CAR에서의 용도에 양립 가능한 천연 유래 단백질의 신호 서열 또는 합성, 비천연 유래 신호 서열을 포함하는 신호 펩타이드는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군에서 선택되는 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된다. 일부 구체예에서, CD8α의 신호 펩타이드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
5.3.7. 예시적인 CAR
예시적인 CAR은, 예컨대, LIC948A22, LIC948A22H31, LIC948A22H32, LIC948A22H33, LIC948A22H34, LIC948A22H35, LIC948A22H36, LIC948A22H37, LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 포함하는 표 5 및 표 6에 나타낸 것을 포함하여 이하의 부문 6에 나타낸 바와 같이 생성된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 이하의 부문 6에 예시되는 CAR 중 어느 하나에 대해 특정 동일성 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 25의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 33의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 BCMA CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 BCMA CAR 중 어느 것을 암호화하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 핵산 서열 및 벡터에 관한 더 상세한 설명이 이하에 제공된다.
5.4. 조작된 면역 효과기 세포
또 다른 양상에서, 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 면역 효과기 세포)가 본 명세서에 제공된다.
따라서, 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-BCMA sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 상기 부문 5.2에 기재된 바와 같은 항-BCMA sdAb, 예를 들어, 표 4의 VHH 도메인 및 표 4의 해당 VHH 도메인 중 어느 것 중 1, 2 또는 모두 3개의 CDR을 갖는 것이다. 구체적으로, 하나 이상의 항-BCMA sdAb(들)는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 항-BCMA sdAb; 서열번호 5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 항-BCMA sdAb로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-BCMA sdAb는 낙타과, 키메라, 인간이거나 또는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 키메라 신호전달 도메인(CMSD), 예컨대, ITAM010이다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N 말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ으로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CMSD, 예컨대, 본 명세서에 제공된 ITAM010을 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-BCMA sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-BCMA sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-BCMA sdAb는 서열번호 7 내지 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, (a) 2개의 항-BCMA sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, (1) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; (2) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나; (3) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나; (4) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나; (5) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나; (6) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나; (7) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나; (8) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나; (9) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나; (10) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나; (11) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나; (12) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나; (13) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나; (14) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (15) 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 키메라 신호전달 도메인(CMSD), 예컨대, ITAM010이다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N 말단에 위치된 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ으로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단까지, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공자극 신호전달 도메인 및 CMSD, 예컨대, 본 명세서에 제공된 ITAM010을 포함한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 서열번호 23 내지 34의 아미노산 서열, 또는 서열번호 23 내지 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 자가이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 동종이계이다.
둘 이상의 상이한 CAR을 포함하는 (또는 발현하는) 조작된 면역 효과기 세포가 또한 제공된다. 본 명세서에서 설명된 임의의 둘 이상의 CAR은 조합하여 발현될 수 있다. 이들 CAR은 상이한 항원을 표적으로 하고, 이에 의해 상가적 또는 상승적 효과를 제공할 수 있다. 둘 이상의 CAR은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에서 암호화될 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 치료적 단백질 및/또는 면역조절제, 예를 들어, 면역 관문 저해제를 추가로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2016/073489 및 PCT/CN2016/087855를 참조하며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
5.4.1. 벡터
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 클로닝하고 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 우두 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 및 이들의 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 다른 바이러스학과 분자생물학 매뉴얼에 기재되어 있다.
포유류 세포 내로 유전자 전달을 위한 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예컨대, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종성 핵산은 당업계에 공지된 기법을 이용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 시험관내 또는 생체외에서 조작된 포유류에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 면역조절제(예컨대, 면역 관문 저해제) 암호화 서열을 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 키메라 항원 수용체를 운반하는 자기-비활성화 렌티바이러스 벡터가 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 패키징될 수 있다. 얻어진 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 포유류 세포(예컨대, 1차 인간 T 세포)를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가 장기간 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구인데, 이들이 자손 세포에서의 이식유전자의 장기간, 안정적인 통합 및 이의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 갖고, 비-증식 세포를 형질도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에서 기재된 CAR을 암호화하는 핵산 중 어느 하나를 포함한다. 핵산은 예로서, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 이용하는 것을 비롯하여, 당업계에서 임의의 공지된 분자 클로닝 방법을 이용하여 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 포유류 세포에서의 유전자 발현을 위한 다양한 프로모터가 연구되었고, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 개시내용에서 이용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터, 예컨대, 유도성 프로모터로서 대략적으로 범주화될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종성 유전자(이식유전자로도 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되는 것을 가능하게 한다. 본 명세서에 상정된 예시적인 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 인간 연장 인자-1 알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로키나제 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 및 CMV 초기 인핸서(CAGG)와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 도입유전자 발현을 유도함에 있어서 이런 구성적 프로모터의 효율은 굉장히 다수의 연구에서 폭넓게 비교되었다. 예컨대, 문헌[Michael C. Milone et al]은 1차 인간 T 세포에서 키메라 항원 수용체 발현을 유도하는 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율을 비교하고, hEF1α 프로모터가 가장 높은 수준의 도입유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 내렸다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 하나 이상의 조건, 예를 들어, 신체 상태, 조작된 면역 효과기 세포의 미세환경, 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리학적 상태, 유도인자(즉, 유도제) 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유도 조건은 가공된 포유류 세포에서 및/또는 약제학적 조성물을 제공받는 개체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 유도인자, 방사선조사(예컨대, 이온화 방사선, 광), 온도(예컨대, 가열), 산화환원 상태, 종양 환경, 및 가공된 포유류 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 또한, 렌티바이러스 벡터를 통해 형질감염된 숙주 세포의 개체군으로부터 CAR을 발현하는 세포를 선택하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함한다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자는 둘 다 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하도록 적절한 조절 서열과 측접될 수 있다. 예컨대, 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 그리고 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 제1 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 제2 CAR을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하되, 제1 핵산은 자기-절단 펩타이드를 암호화하는 제3 핵산 서열을 통해 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 T2A, P2A 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.4.2. 면역 효과기 세포
"면역 효과기 세포"는 면역 효과기 기능을 수행할 수 있는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 면역 효과기 세포의 예는 말초혈액 단핵구 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CAR을 발현시키고 표적 세포, 예를 들면, BCMA+ 종양 세포에 결합할 때에 IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포는 CAR을 발현시키고 표적 세포에 결합할 때에 항원 특이적 표적 세포를 용해한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 다른 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS 또는 배아 줄기 세포와 구별된다.
조작된 면역 효과기 세포는 CAR을 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포 내로 도입함으로써 제조된다. 일부 실시형태에서, CAR은 단리된 핵산 중 임의의 하나 또는 상기 기재한 벡터 중 임의의 하나를 형질감염시킴으로써 면역 효과기 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포막에 단백질을 삽입하는 한편 CELL SQUEEZE®와 같은 미세유체 시스템을 통해 세포를 통과시킴으로써 면역 효과기 세포에 도입된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20140287509호 참조).
벡터 또는 단리된 핵산을 포유류 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기재된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역 효과기 세포에 전달될 수 있다.
벡터를 면역 효과기 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 현미주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 전기천공에 의해 세포 내로 도입된다.
벡터를 면역 효과기 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 이용을 포함한다. 바이러스 벡터는 유전자를 포유류, 예를 들어, 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 폭넓게 이용되는 방법이 되고 있다.
벡터를 면역 효과기 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예를 들어, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 그리고 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합된 마이셀 및 리포솜을 비롯한 지질계 시스템을 포함한다. 시험관내에서 전달 수송체로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예컨대, 인공 막 소포)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 것을 암호화하는 RNA 분자는 통상적인 방법(예컨대, 시험관내 전사)에 의해 제조되고, 이후에, 공지된 방법, 예를 들어, mRNA 전기천공을 통해 면역 효과기 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035 (2006)] 참조.
일부 실시형태에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후 생체외에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 증식하도록 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일 또는 14일 중 어느 것 동안에 배양된다. 일부 실시형태에서, 형질도입된 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 조작된 포유류 세포를 선택하기 위해 추가로 평가되거나 또는 선별된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하거나 또는 이에 의해 발현되지 않고 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어, 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)] 참조). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며 공지된 기법을 이용하여 제조되거나 또는 상업적으로 얻을 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포에서 CAR을 암호화하는 핵산의 존재를 확인하는 다른 방법은 예로서, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학적 검정, 예를 들어, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예를 들어, 예로서 면역학적 방법(예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
5.4.3. T 세포의 공급원
일부 실시형태에서, T 세포의 확장 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 얻어진다. T 세포는 말초혈액 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업계에서 입수 가능한 수많은 T 세포주가 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 수많은 기술, 예를 들어, Ficoll™ 분리를 이용하여 개체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포는 성분채집술에 의해 얻어진다. 성분채집술 산물은 전형적으로, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 비롯한 림프구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획물을 제거하고, 이들 세포를 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 위치시키기 위해 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘을 결여하고, 마그네슘을 결여할 수 있거나 또는 모두는 아니지만 다수의 2가 양이온을 결여할 수 있다. 칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 야기할 수 있다. 당업자가 용이하게 인식하는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 제조업체의 지침에 따라서 반자동화 "관류" 원심분리기(예컨대, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 이용함으로써 달성될 수 있다. 세척한 후에, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어, 무 Ca2+, 무 Mg2+ PBS, PlasmaLyte A에서, 또는 완충제가 있거나 또는 없는 다른 식염수에서 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 표본의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고, 그리고 세포는 배양 배지에서 직접적으로 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예로서, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 정화에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정한 하위집단, 예를 들어, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+T 세포는 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예컨대, 일부 실시형태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위한 충분한 기간 동안, 항-CD3/항-CD28(즉, 3×28)-접합된 비드, 예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 배양에 의해 단리된다. 일부 실시형태에서, 기간은 약 30분이다. 추가 실시형태에서, 기간은 30분 내지 36 시간 이상 및 이들 사이에 모든 정수 값의 범위에서 변한다. 추가 실시형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병을 앓는 환자로부터 T 세포의 단리의 경우에, 더욱 긴 배양 시간, 예를 들어, 24시간의 이용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형에 비해서 소수의 T 세포가 있는 임의의 환경에서, 예를 들어, 종양 조직으로부터 또는 면역-약화된 개체로부터 종양 침윤성 림프구(TIL)를 단리하는 경우에, 보다 긴 배양 시간이 T 세포를 단리하는데 이용될 수 있다. 게다가, 더욱 긴 배양 시간의 이용은 CD8+ T 세포의 포획의 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용되는 시간을 단순히 단축하거나 또는 늘림으로써 그리고/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시에서 또는 상기 과정 동안 다른 시점에 대해 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시에서 또는 다른 원하는 시점에 대해 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 복수 라운드의 선택이 또한 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 선택 절차를 수행하고, "비선택된" 세포를 활성화 및 확대 과정에서 이용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가 선택 라운드가 실시될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성으로 선택된 세포에 독특한 표면 마커로 향하는 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택인데, 이는 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 지향된 단클론성 항체의 칵테일을 이용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일정한 실시형태에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 전형적으로 발현시키는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일정한 실시형태에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리의 경우에, 세포 및 표면(예컨대, 입자, 예를 들어, 비드)의 농도가 변할 수 있다. 일정한 실시형태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 담보하기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 용적을 유의미하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 일 실시형태에서, 2십억개의 세포/㎖의 농도가 이용된다. 한 실시형태에서, 10억개의 세포/㎖의 농도가 이용된다. 추가 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/ml가 이용된다. 추가 실시형태에서, 1천만, 1천 5백만, 2천만, 2천 5백만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 5백만 또는 5천만개의 세포/㎖의 세포 농도가 이용된다. 또 다른 실시형태에서, 7천 5백만, 8천만, 8천 5백만, 9천만, 9천 5백만 또는 1억개의 세포/㎖의 세포 농도가 이용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만개의 세포/㎖의 농도가 이용될 수 있다. 고농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 이용은 많은 종양 세포가 존재하는 표본(즉, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)으로부터, 관심 표적 항원, 예를 들어, CD28-음성 T 세포를 약하게 발현시킬 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획을 허용한다. 이런 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 얻는 데 바람직할 것이다. 일부 실시형태에서, 고농도의 세포를 이용하는 것은 정상적으로 더욱 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선택을 허용한다.
일부 실시형태에서, 보다 낮은 농도의 세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예컨대, 입자, 예를 들어, 비드)의 혼합물을 유의미하게 희석함으로써, 이들 입자 및 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 많은 양의 목적하는 항원을 발현시키는 세포를 선택한다. 예컨대, CD4+ T 세포는 더욱 높은 수준의 CD28을 발현시키고, 묽은 농도에서 CD8+ T 세포보다 더욱 효율적으로 포획된다. 일부 실시형태에서, 이용되는 세포 농도는 5×106개/㎖이다. 일부 실시형태에서, 이용되는 농도는 약 1×105개/㎖ 내지 1×106개/㎖, 이들 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 2 내지 10℃에서, 또는 실온에서 변하는 속도에서 변하는 시간 길이 동안 회전기에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한, 세척 단계 후에 냉동될 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 냉동 및 후속적 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 일정한 정도로 단핵구를 제거함으로써 더 균일한 생성물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 냉동 용액에서 현탁될 수 있다. 많은 냉동 용액 및 파라미터가 당업계에서 공지되고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스말라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 7.5% DMSO를 포함하는 배양 배지, 또는 예로서, Hespan 및 PlasmaLyte A를 포함하는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 이용하는 것을 수반한다. 이들 세포는 이후, 분당 1°의 속도로 -80℃까지 냉동되고 액체 질소 보관 탱크의 증기 상에서 보관된다. -20℃ 또는 액체 질소에서 제어되지 않는 냉동뿐만 아니라 다른 제어된 냉동 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 냉동보존된 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 해동되고 세척되고, 활성화에 앞서 실온에서 1시간 동안 안정되도록 허용된다.
본 개시내용에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 때보다 앞선 기간에 개체로부터의 혈액 표본 또는 성분채집물 산물의 수집물이 본 개시내용에 또한 상정된다. 따라서, 확대되는 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예를 들어, T 세포는 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 많은 질환 또는 장애, 예를 들어, 본 명세서에서 설명된 것들에 대한 T 세포 요법에서 추후 이용을 위해 단리되고 냉동될 수 있다. 일 실시형태에서, 혈액 표본 또는 성분채집물은 전반적으로 건강한 개체로부터 채취된다. 특정 실시형태에서, 혈액 표본 또는 성분채집물은 질환이 발달할 위험에 처해있지만, 아직 질환이 발달하지 않은 전반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포는 추후 이용을 위해 단리되고 냉동된다. 특정 실시형태에서, T 세포는 확대되고, 냉동되고, 추후 시점에 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표본은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 하지만 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 추가 실시형태에서, 세포는 작용제, 예를 들어, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예를 들어, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 방사선조사로 치료를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 수많은 적절한 치료 양상에 앞서 대상체로부터의 혈액 표본 또는 성분채집물로부터 단리된다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타아제 칼시뉴린을 저해하거나(사이클로스포린 및 FK506), 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나아제를 저해한다(라파마이신)(Liu et al., Cell 66:807-815 (1991); Henderson et al., Immun 73:316-321 (1991); Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773 (1993)). 추가 실시형태에서, 세포는 환자에 대해 단리되고, 골수 또는 줄기 세포 이식, 화학요법 작용제, 예를 들어, 플루다라빈을 이용한 T 세포 절제 요법, 외부 빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파마이드, 또는 항체, 예를 들어, OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예컨대, 이전에, 동시에 또는 이후에) 추후 이용을 위해 냉동된다. 다른 실시형태에서, 세포는 CD20과 반응하는 제제, 예를 들어, 리툭산과 같은 B-세포 절제 요법 다음의 치료를 위해 사전에 단리되고 이후의 사용을 위해 냉동된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 치료 이후에 직접적으로 환자로부터 얻어진다. 이점에 관하여, 일정한 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로 치료 이후에, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복할 기간 동안 치료 직후에, 얻어진 T 세포의 품질은 생체외에서 확장되는 이들의 능력에 대해 최적이거나 또는 향상될 수 있는 것으로 관찰되었다. 유사하게, 본 명세서에서 설명된 방법을 이용한 생체외 조작 이후에, 이들 세포는 향상된 이식 및 생체내 확대를 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 개시내용과 관련하여, 이러한 회복 시기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 비롯한 혈액 세포를 수집하는 것이 상정된다. 게다가, 일정한 실시형태에서, 동원(mobilization)(예컨대, GM-CSF로 동원) 및 조건화 요법은 대상체에서, 특히 요법 이후에 규정된 시간 창 동안에, 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 상태를 생성하는데 이용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 면역계의 다른 세포를 포함한다.
5.4.4. T 세포의 활성화 및 확장
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR에 의한 T 세포의 유전자 변형 전 또는 후에, T 세포는 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 전반적으로 확대될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상에서 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확대될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 예를 들어, 표면 위에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(예컨대, 브리스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 예컨대, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기 위한 적절한 조건 하에, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD3 항체의 예는 당업계에 통상적으로 알려진 다른 방법과 같이 사용될 수 있는 UCHT1, OKT3, HIT3a(BioLegend, 미국 샌디에이고 소재)를 포함한다(문헌[Graves J, et al., J.Immunol. 146:2102 (1991); Li B, et al., Immunology 116:487 (2005); Rivollier A, et al., Blood 104:4029 (2004)]). 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송)을 비롯한 항-CD28 항체의 예는 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977 (1998); Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328 (1999); Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63 (1999)]).
일부 실시형태에서, T 세포에 대한 1차 자극성 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예컨대, 각 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 작용제는 동일한 표면에(즉, "시스" 형성에서) 또는 별개의 표면에(즉, "트랜스" 형성에서) 결합될 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 결합될 수 있고 다른 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 제제 둘 다 용액 중에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 표면, 예를 들어, Fc 수용체를 발현시키는 세포, 또는 이들 작용제에 결합할 항체 또는 다른 결합 작용제에 가교될 수 있다. 이점에 관하여, 예를 들어, 본 개시내용의 특정 실시형태에서 T 세포를 활성화하고 확대함에 있어서의 용도에 상정되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일부 실시형태에서, T 세포는 제제-코팅된 비드와 합쳐지고, 이들 비드 및 세포는 후속적으로 분리되고, 이어서, 세포는 배양된다. 대안적 실시형태에서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가 실시형태에서, 이들 비드 및 세포는 우선 힘, 예를 들어, 자기력의 적용에 의해 농축되어, 세포 표면 마커의 증가된 결찰을 초래하고, 따라서 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드(3x28 비드)가 T 세포에 접촉하도록 허용함으로써 결찰될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포(예를 들어, 104 내지 4×108개의 T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:100의 권장 역가에서 항-CD3/CD28 MACSiBead particlesa)는 완충제, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 없이)에서 합쳐진다. 당업자는 임의의 세포 농도가 이용될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다. 예컨대, 표적 세포가 샘플 내에서 매우 희귀하고 샘플의 단지 0.01%만을 구성할 수 있거나 또는 전체 표본(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 숫자는 본 개시내용의 맥락 안에 있다. 일정한 실시형태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자 및 세포가 함께 혼합되는 용적을 유의미하게 감소시키는 (즉, 세포 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 2십억개의 세포/㎖의 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천 5백만, 3천만, 3천 5백만, 4천만, 4천 5백만 또는 5천만개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7천 5백만, 8천만, 8천 5백만, 9천만, 9천 5백만 또는 1억개의 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만개의 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 이용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원, 예를 들어, CD28-음성 T 세포를 약하게 발현시킬 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획을 가능하게 할 수 있다. 이런 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 일정한 실시형태에서 얻는 것이 바람직할 것이다. 예컨대, 높은 농도의 세포를 이용하는 것은 정상적으로 더욱 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선별을 허용한다.
일부 실시형태에서, 혼합물은 수 시간(약 3 시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간별 정수 값 동안에 배양될 수 있다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록, 여러 주기의 자극이 또한 요망될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청(예컨대, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 비롯하여, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지(예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 환원제, 예를 들어, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있는데, 혈청이 없거나, 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확대에 충분한 사이토카인(들)의 양으로 보충된 아미노산, 나트륨 피루브산염 및 비타민이 첨가된다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험적 배양액에만 포함되고, 개체 내로 주입되는 세포의 배양액에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도(예를 들어, 37℃ 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다. 변하는 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예컨대, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초혈액 단핵구 세포 산물은 세포독성 또는 억제 T 세포 집단(TC, CD8)보다 큰 보조 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9 일 전에 TH 세포로 지배적으로 구성되는 T 세포의 집단을 생산하고, 반면 약 8 내지 9일 후에, T 세포의 집단은 TC 세포의 점점 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 개체에 TH 세포로 지배적으로 구성되는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원 특이적 부분집합이 단리되면, 이러한 부분집합을 더욱 큰 정도까지 확대하는 것이 유익할 수 있다.
게다가, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커가 유의미하게 변하지만, 대부분은 세포 확대 과정의 코스 동안 재현적이다. 따라서, 이런 재현성은 활성화된 T 세포 산물을 특정한 목적으로 재단하는 능력을 가능하게 할 수 있다.
5.4.5. Nef(음성 조절 인자) 단백질을 발현시키는 CAR-T 세포
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)는 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 예컨대, 야생형 SIV Nef 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 돌연변이체 SIV Nef)을 추가로 발현시킨다. PCT/CN2019/097969, PCT/CN2018/097235, PCT/CN2020/112181 및 PCT/CN2020/112182(이의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨)에 기재된 바와 같은 임의의 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 돌연변이체 Nef, 예컨대, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef), 이를 암호화하는 핵산, 이의 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터), 외인성 Nef 단백질을 발현시키거나 이를 암호화하는 핵산(또는 벡터)를 포함하는 변형된 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)는 모두 본 발명에서 사용될 수 있다.
야생형 Nef는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하는 영장류 렌티바이러스에 의해 암호화된 작은 27 내지 35kDa 미리스토일화된 단백질이다. Nef는 주로 세포질에 국재화되지만, 부분적으로 혈장막에 보충된다. 숙주의 세포 기작을 조작할 수 있고, 따라서 병원균의 감염, 생존 또는 복제를 가능하게 하는 발병인자로서 작용한다.
Nef는 모든 영장류 렌티바이러스에서 고도로 보존된다. HIV-2 및 SIV Nef 단백질은 HIV-1 Nef보다 긴 10 내지 60개의 아미노산이다. N-말단에서 C-말단까지, Nef 단백질은 다음의 도메인을 포함한다: 미리스토일화 부위(Nef의 내부 원형질막 표적화 및 비리온 혼입에, 그에 따른 감염에 필요한, CD4 하향 조절, MHC I 하향 조절 및 신호조절 분자와의 회합에 관여), N-말단의 α-나선구조(MHC I 하향 조절 및 단백질 키나제 보충된 단백질 키나제 보충에 관여), 타이로신-기반 AP 보충(HIV-2 /SIV Nef), CD4 결합 부위(HIV-1 Nef에 대해 특성규명된 CD4 하향 조절에 관여된 WL 잔기), 산성 클러스터(MHC I 하향 조절, 숙주 PACS1 및 PACS2와의 상호작용에 관여), 프롤린-기반 반복부(MHC I 하향 조절 및 SH3 결합에 관여), PAK(p21 활성화된 키나제) 결합 도메인(신호조절 분자와의 회합 및 CD4 하향 조절에 관여), COP I 보충 도메인(CD4 하향 조절에 관여), 다이-류신 기반 AP 보충 도메인(CD4 하향 조절에 관여, HIV-1 Nef) 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인(CD4 하향 조절 및 신호조절 분자와의 회합에 관여). CD4는 55kDa의 I형 내재성 세포 표면 당단백질이다. 이는 MHC 클래스 II-제한 세포, 예컨대, 헬퍼/유도물질 T-림프구 및 대식세포/단핵구 계통의 세포에 대한 TCR의 성분이다. 이는 HIV 및 SIV에 대한 주요 세포 수용체로서 작용한다.
일부 실시형태에서, Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 Nef 아형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Nef 단백질은 야생형 Nef이다. 일부 실시형태에서, Nef 아형은 HIV F2-Nef, HIV C2-Nef 또는 HIV HV2NZ-Nef이다.
일부 실시형태에서, Nef 단백질은 1차 HIV-1 아형 C Indian 단리물로부터 얻어지거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Nef 단백질은 전장 단백질을 암호화하는 Indian 단리물의 F2 대립유전자로부터 발현된다(HIV F2-Nef). 일부 실시형태에서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부 및 PAK 결합 도메인의 프레임 내 결실을 갖는 C2 대립유전자로 Indian 단리물로부터 발현된다(HIV C2-Nef). 일부 실시형태에서, Nef 단백질은 CD4 결합 부위의 프레임내 결실을 갖는 D2 대립유전자 Indian 단리물로부터 발현된다(HIV D2-Nef).
일부 실시형태에서, Nef 단백질은 삽입, 결실, 점 돌연변이(들) 및/또는 재배열 중 하나 이상을 포함하는 돌연변이체 Nef, 예컨대, Nef 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 돌연변이체 Nef는 T 세포에서 발현될 때 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 하향조절하지 않는(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능을 하향조절하지 않는) 비-천연 유래 돌연변이체 Nef, 예컨대, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef)는 T 세포에서 발현될 때의 야생형 Nef에 비해서 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 하향조절이 없거나 또는 더 적은 하향 조절을 야기한다. 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단의 α-나선구조, 타이로신-기반 AP 보충, CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 보충 도메인, 다이-류신 기반 AP 보충 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 모티프에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 다이-류신 기반 AP 보충 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 다이-류신 기반 AP 보충 도메인 및 PAK 결합 도메인에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 다이-류신 기반 AP 보충 도메인, PAK 결합 도메인, COP I 보충 도메인, 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 다이-류신 기반 AP 보충 도메인, COP I 보충 도메인 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 다이-류신 기반 AP 보충 도메인 및 V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef는 부분적 또는 전체 도메인을 결실하는 절단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef는 임의의 앞서 언급한 도메인/모티프에 있지 않은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef)는 돌연변이체 SIV Nef이다.
일부 실시형태에서, T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체)의 발현은 내인성 TCR을 하향조절한다(예를 들어, 세포 표면 발현 및/또는 효과기 기능을 하향조절한다). 일부 실시형태에서, 내인성 TCR 하향조절은 (예를 들어, 원형질막에 대한 Lck 및 LAT와 같은 필수 TCR 근위 기작의 수송을 지배하는 소포 수송 경로를 조절하는 것에 의한, 그리고/또는 TCR 근위 신호전달 기작의 시공간적 조화에 필수적인 TCR-유도 액틴 리모델링 사건을 붕괴시키는 것에 의한) 내인성 TCR, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현의 하향 조절, 및/또는 TCR-매개 신호전달, 예컨대, T 세포 활성화 또는 T 세포 증식의 방해를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef, 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 돌연변이체 SIV Nef)을 발현시키는 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 내인성 TCR, CD3ε, CD3δ 및/또는 CD3γ의 세포 표면 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에 비해서 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95 중 어느 것만큼 하향조절된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef, 예컨대, SIV Nef M116)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)은 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)과 상이하게 약 3% 이하(예컨대, 약 2% 또는 약 1% 이하)의 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef 단백질(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef, 예컨대, SIV Nef M116)은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 세포 표면 발현보다 적어도 약 3% 이상(예컨대, 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD4의 세포 표면 발현을 하향조절하지 않는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD4의 세포 표면 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD4의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 세포 표면 발현 보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만만큼 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD28의 세포 표면 발현을 하향조절하지 않는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD28의 세포 표면 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 세포 표면 발현 보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만만큼 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현과 상이하게 약 3% 이하(예컨대 약 2% 또는 약 1% 이하)로 하향조절하고(또는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 얗 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 초과만큼 하향조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향 조절하지 않는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현과 상이하게 약 3% 이하(예컨대 약 2% 또는 약 1% 이하)로 하향조절하고(또는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 초과 만큼 하향조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만으로 하향 조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향조절하지만, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 하향조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현을 하향조절한다). 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향 조절하고, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)의 세포 표면 발현과 상이하게 최대 약 3%(예컨대, 최대 약 2% 또는 약 1%) 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향조절하고, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 세포 표면 발현을 야생형 Nef(예를 들어, 야생형 SIV Nef)에 의한 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만으로 하향 조절한다.
일부 실시형태에서, T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 포함하는 동종이계 T 세포, 또는 변형된 T 세포)에서 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체)의 발현은 내인성 CD3ζ 발현 또는 CD3ζ-매개 신호전달을 변경시키지 않거나, 또는 내인성 CD3ζ 발현을 하향조절하지 않고/않거나 CD3ζ-매개 신호전달을 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)의 신호전달에 비해서 최대 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하 중 어느 것만큼 하향 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 외인성 Nef의 발현은 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)을 하향조절하는 것으로 의도되는 한편, 동일한 세포에 도입되는 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 신호전달에 대해 효과를 거의 또는 전혀 유발하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 Nef 발현은 또한 동일한 세포에 도입된 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 발현에 대해 효과를 거의 또는 전혀 유발하지 않는 것으로 요망된다.
일부 실시형태에서, 변형된 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체)의 발현은 동일한 T 세포에서 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 하향조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현을 하향조절한다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체)을 발현시키는 변형된 T 세포에 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR은 CMSD를 포함하는 CAR이 Nef 발현이 없는 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현될 때에 비해서 최대 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 중 어느 것만큼 하향조절된다(예를 들어, 세포 표면 발현은 하향조절된다). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR의 세포 표면 발현 및/또는 신호전달은 영향받지 않거나, 변형된 T 세포가 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질을 발현시킬 때 최대 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 중 어느 것만큼 하향조절된다.
일부 실시형태에서, T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체)의 발현은 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28을 하향조절하고, 예컨대, (예를 들어, 내포작용 빛 분해를 통해) 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질을 발현시키는 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 내인성 MHC I, CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현은 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에 비해서 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것만큼 하향조절된다.
일부 실시형태에서, T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 본 명세서에 기재된 돌연변이체(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체) Nef 단백질(예를 들어, CD4 및/또는 CD28 하향 조절에 관련된 돌연변이된 도메인/모티프)은 내인성 TCR 및/또는 MHC I을 하향 조절하는 한편, 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 발현될 때에 비해서 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대해 감소된 하향 조절 효과(적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만의 하향 조절)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 내인성 CD4 및/또는 CD28에 대한 하향 조절 효과는 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향 조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef는 내인성 CD4를 하향조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현을 하향조절한다). 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef는 내인성 CD28을 하향조절하지 않는다(예를 들어, 세포 표면 발현을 하향조절한다). 일부 실시형태에서, 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향 조절은 야생형 Nef가 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현될 때에 비해서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef)가 T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 발현될 때에 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, T 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 CAR을 발현시키는 동종이계 T 세포 또는 변형된 T 세포)에서 돌연변이체 Nef(예를 들어, 비-천연 유래 돌연변이체 Nef)의 발현은 내인성 TCR 및/또는 MHC I의 세포 표면 발현을 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포의 세포 표면 발현에 비해서 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 중 어느 것만큼 하향조절하는 한편, 내인성 CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현의 하향 조절은 야생형 Nef 단백질이 동일한 공여자 공급원으로부터의 T 세포에서 발현될 때에 비해서 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Nef(예를 들어, 돌연변이체 SIV Nef)는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현과 상이하게 약 3% 이하(예컨대 약 2% 또는 약 1% 이하)로 하향조절하고(또는 내인성 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 야생형 Nef의 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 초과만큼 하향조절하고), CD4 및/또는 CD28의 세포 표면 발현을 야생형 Nef에 의한 세포 표면 발현보다 적어도 약 3%(예컨대, 적어도 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 것) 미만으로 하향 조절한다.
또한 본 명세서에 기재된 외인성 Nef 단백질 중 어느 것(예를 들어, 야생형 Nef 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 비-천연 유래 Nef 단백질, 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산(예를 들어, 단리된 핵산)이 제공된다. 추가로 본 명세서에 기재된 임의의 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 비-천연 유래 Nef 단백질, 돌연변이체 SIV Nef)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터, 박테리아 발현 벡터)가 제공된다. 이들 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 임의의 T 세포, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포에 형질도입될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 Nef 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 또한 Nef-함유 T 세포를 얻기 위해 T 세포(예를 들어, 동종이계 T 세포)에 형질도입될 수 있고, 이어서, Nef-함유 CAR-T 세포를 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 임의의 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)로 추가로 형질도입될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 제공되 Nef 단백질은 서열번호 51을 포함하는 돌연변이체 SIV Nef M116이다.
외인성 Nef 단백질(예를 들어, 야생형 Nef 또는 돌연변이체 Nef, 예컨대, 비-천연 유래 Nef 단백질, 돌연변이체 SIV Nef)의 발현이 본 명세서에 기재된 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), MHC, CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD28, CAR 등을 하향조절하는지의 여부, 또는 외인성 Nef 단백질이 앞서 언급한 분자와 상호작용하는지(예를 들어, 결합하는지)의 여부를 시험하기 위해, 단백질의 세포 표면 발현의 하향조절이 있는지, 또는 신호전달 분자-매개 신호전달(예를 들어, TCR/CD3 복합체-매개 신호전달)이 영향받는지(예를 들어, 없어지거나 또는 약화되는지)를 시험할 수 있다. 예를 들어, 외인성 Nef 단백질의 발현이 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)의 세포 표면 발현을 하향조절하는지를 시험하기 위해, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 벡터로 형질도입/형질감염된 세포(예를 들어, T 세포)는 항-TCRα 및/또는 항-TCRβ 항체를 이용하여 FACS 또는 MACS 분류가 실시될 수 있다(또한 실시예 참조). 예를 들어, 형질도입/형질감염되 세포는 TCRαβ 양성률을 검출하기 위해 FACS에 대한 PE/Cy5 항-인간 TCRαβ 항체(예를 들어, Biolegend, #306710)와 함께 인큐베이션될 수 있거나, 바이오틴 표지를 위해 바이오틴일화된 인간 TCRαβ 항체(Miltenyi, 200-070-407)와 함께 인큐베이션되고, 이어서, MACS 키트 프로토콜에 따라 자기 분리 및 풍부화가 실시된다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 CAR(예를 들어, CMSD를 포함)의 세포 표면 발현을 하향조절하는지를 시험하기 위해, BCMA CAR 발현을 검출하기 위한 FACS에 대한 기능성 세포외 수용체에 의해 인식되는 표지된 항원, 예를 들어, FITC-표지 인간 BCMA 단백질(예를 들어, ACROBIOSYSTEM, BCA-HF254-200UG)을 사용할 수 있다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 신호전달 분자-매개 신호전달, 예를 들어, TCR/CD3 복합체-매개 신호전달을 하향조절하는지를 시험하기 위해, 외인성 Nef 단백질을 암호화하는 벡터로 형질도입/형질감염된 세포(예를 들어, T 세포)는 T 세포 활성화를 위해 피토헤마글루티닌(PHA)으로 유도될 수 있다. PHA는 TCR을 포함하는 글리코실화된 표면 단백질 상의 당에 결합하고, 이에 의해 이들을 가교한다. 이는 활성화된 T 세포(NFAT) 활성화의 핵 인자로 이어지는 칼슘-의존적 신호전달 경로를 촉발시킨다. 이어서, 이들 세포는 외인성 Nef 단백질의 영향 하에 PHA-매개 T 세포 활성화를 검출하기 위해, 예를 들어, PE 항-인간 CD69 항체를 이용하는 FACS를 이용하여 CD69+ 비율에 대해 시험될 수 있다. 외인성 Nef 단백질의 발현이 세포외 수용체(예를 들어, CD3ζ ISD를 갖는 전통적인 CAR, 또는 본 명세서에 기재된 CMSD를 포함하는 기능성 세포외 수용체)를 하향조절하는지를 시험하기 위해, 일부 실시형태에서, 표적 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 수용체-매개 세포독성은, 예를 들어, 시험관내 시험을 위해 또는 종양 크기에 대한 생체내 검사를 위해 루시퍼라제 표지(예를 들어, Raji.Luc)를 갖는 세포를 이용함으로써, 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전염증 인자, 케모카인 및/또는 사이토카인의 세포외 수용체-매개 방출이 측정될 수 있다. 전염증 인자, 케모카인 및/또는 사이토카인의 수용체-매개 세포독성 및/또는 방출이 외인성 Nef 단백질의 존재에 의해 감소된다면, 이는 Nef와 외인성 수용체와의 상호작용을 반영하거나, 또는 외인성 Nef 단백질은 외인성 수용체를 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 분자, 예컨대, 본 명세서에 제공된 CAR의 CMSD와 Nef 단백질의 결합은 또한 정기적인 생화학적 방법, 예컨대, 면역침전 및 면역형광을 이용하여 결정될 수 있다.
5.5. 폴리뉴클레오타이드
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 BCMA에 결합하는 본 단일 도메인 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며; 단일 가닥이 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다면 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드이다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 9의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 10의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 11의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 12의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 13의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 14의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 15의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 16의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 BCMA CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며; 단일 가닥이 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다면 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드이다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 23의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 35를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 24의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 36을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 25의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 37을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 26의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 38을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 27의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 39를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 28의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 40을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 29의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 41을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 30의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 42를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 31의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 43을 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 32의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 44를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 33의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 45를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 34의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다. 예시적인 핵산은 서열번호 46을 갖는다.
본 개시내용은 추가로 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이되, 변이체는, 예를 들어, 본 개시내용의 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 75% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 일부 실시형태에서, 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 어구 "참조 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는, 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드마다 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위해, 참조 서열 내에 뉴클레오타이드 중에서 최대 5%까지 결실되거나 또는 다른 뉴클레오타이드로 치환되고, 또는 참조 서열 내에 전체 뉴클레오타이드 중에서 최대 5%까지의 다수의 뉴클레오타이드가 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 서열에서 뉴클레오타이드 중에서 개별적으로 배치되거나 또는 참조 서열 내에서의 하나 이상의 인접한 기에 배치된, 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 해당 말단 위치의 어디에서나 생길 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화 영역, 비암호화 영역, 또는 둘 다에서 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 생성하지만, 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 변경을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 (유전자 암호의 축퇴로 인한) 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대해 변화를 초래하지 않는 침묵 치환을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 코돈 발현을 최적화하기 위해(즉, 인간 mRNA에서의 코돈을 박테리아 숙주, 예컨대, 이콜라이에 의해 바람직한 것으로 변화시키기 위해) 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 서열의 비암호화 또는 암호화 영역에 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현(또는 발현 수준)을 조절 또는 변경하도록 생성된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 증가시키도록 생성된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 감소시키도록 생성된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해서 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열에 비해서 암호화된 폴리펩타이드의 감소된 발현을 갖는다.
또한 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 핵산 분자는 재조합 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산 중 어느 것을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용하는 유전자 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 의미하며, 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 때, 벡터는 세포 내에서 발현되는 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 갖기에 충분한 조건 하에 세포와 접촉된다. 본 명세서에 기재된 벡터는 전체로서 천연 유래되지 않지만; 그러나, 벡터의 일부는 천연 유래일 수 있다. 기재된 재조합 발현 벡터는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 부분적으로 얻어지고, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연 유래 또는 비-천연 유래 뉴클레오타이드간 결합, 또는 결합 유형을 둘 다 포함할 수 있다. 비-천연 유래 또는 변경된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드간 결합은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
실시형태에서, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 확장을 위해 또는 둘 다를 위해 설계된 것, 예컨대, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences, 메릴랜드주 글렌 버니 소재), pBluescript 시리즈(Stratagene, 캘리포니아주 라 호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 위스콘신주 메디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재) 및 pEX 시리즈(Clontech, 캘리포니아주 팔로알토 소재)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예컨대, λGT10, λGT11, λEMBL4 및 λNM1149, λZapII(Stratagene)이 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
실시형태에서, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기 참조, 및 Ausubel et al., 상기 참조]에 기재된 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조된다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 작제물은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능성인 복제 시스템을 포함하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, SV40, 2μ 플라스미드, λ, 소유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는, 적절하다면 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 조절 서열, 예컨대, 벡터가 도입되는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 식물, 진균 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환 또는 형질감염 숙주의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 원영양성 등을 제공하기 위해 영양 요구성 숙주에서 항생제 내성, 예를 들어, 항생제에 대한 내성, 중금속 등을 포함한다. 기재된 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는, 예를 들어, 네오마이신/G418 내성 유전자, 히스티딘올 x 내성 유전자, 히스티딘올 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
재조합 발현 벡터는 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 천연 또는 규범적 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터의 선택, 예를 들어, 강, 약, 조직-특이적, 유도성 및 발생-특이적은 당업자의 보통의 기술 이내이다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서열을 프로모터와 조합하는 것은 또한 당업자의 기술 이내이다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 또는 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정적 발현을 위해, 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현을 위해 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다.
추가로, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현시키는 세포가 사멸되도록 야기하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 유전자가 발현되는 세포 상에서 제제, 예를 들어, 약물에 민감성을 부여하고, 세포가 제제와 접촉되거나 제제에 노출될 때 세포가 사멸되게 하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 사이토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 및 나이트로환원효소를 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
또한 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 이종성 핵산을 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 이종성 핵산은 벡터(예를 들어, 발현 벡터)일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 세포에 의한 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소의 발현을 위해, 임의의 방법으로 선택되거나, 변형되거나, 형질전환되거나, 성장되거나, 사용되거나 조작된 임의의 유기체로부터의 세포일 수 있다. 적절한 숙주가 결정될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 벡터 골격 및 목적하는 결과에 기반하여 선택될 수 있다. 예로서, 플라스미드 또는 코스미드는 몇 가지 유형의 벡터의 복제를 위해 원핵 숙주 세포에 도입될 수 있다. 박테리아 세포, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, DH5α, JM109 및 KCB, SURE® 적격 세포 및 SOLOPACK Gold 세포는 벡터 복제 및/또는 발현을 위해 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 박테리아 세포, 예컨대, 이콜라이 LE392는 파지 바이러스에 대한 숙주 세포로서 사용될 수 있었다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵 세포는 효모(예를 들어, YPH499, YPH500 및 YPH501), 곤충 및 포유류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 포유류 진핵 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, Saos, PC12, SP2/0(미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC), 버지니아주 매너서스 소재, CRL-1581), NS0(유럽 세포 배양물 보존센터(European Collection of Cell Cultures: ECACC), 영국 월트셔 솔즈베리 소재, ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATCC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래된 것, 예컨대, CHO-K1SV(Lonza Biologics, 메릴랜드주 워커스빌 소재), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44를 포함한다.
5.6. 약제학적 조성물
일 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단일 도메인 항체, 결합 분자 또는 단일 도메인 항체 또는 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는 치료 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 개시내용의 단일 도메인 항체, 결합 분자 또는 단일 도메인 항체 또는 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는 치료 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 치료 분자(예컨대, 융합 단백질, 면역접합체 및 다중특이성 결합 분자) 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 CAR 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 유전자 요법에 적합한, 예를 들어, 벡터에서 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
구체적 실시형태에서, 용어 "부형제"는 또한 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트(완전 또는 불완전), 담체 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 약제학적 부형제는 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 액체 부형제로서 또한 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유상액, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 예방적 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 제공된 활성 성분을, 예컨대 정제된 형태로, 적합한 양의 부형제와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합하여야 한다.
일부 실시형태에서, 부형제의 선택은 부분적으로 특정 세포, 결합 분자, 및/또는 항체에 의해, 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다.
전형적으로, 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 완충제, 아스코르빈산, 메티오닌, 비타민 E, 메타중아황산나트륨을 비롯한 항산화제; 보존제, 등장화제, 안정제, 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 복합체); 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
완충제는 특히, 안정성이 pH 의존성이면, 치료 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하는데 이용될 수 있다. 본 개시내용에서 이용하기 적합한 완충제는 유기산과 무기산 둘 다 및 이들의 염을 포함한다. 예컨대, 시트르산염, 인산염, 석신산염, 주석산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 옥살산염, 락트산염, 아세트산염. 추가적으로, 완충액은 히스티딘 및 트리메틸아민염, 예를 들어, Tris를 포함할 수 있다.
미생물 성장을 지연시키기 위해 보존제가 첨가될 수 있다. 본 개시내용에서 이용하기에 적합한 보존제는 옥타데실다이메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 할로겐화물(예를 들어, 염화물, 브로민화물, 아이오딘화물), 벤제토늄 염화물; 티메로살, 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
때때로 "안정제"로서 알려져 있는 긴장성 작용제는 조성물 내에 액체의 긴장성을 조정하거나 또는 유지하기 위해 존재할 수 있다. 거대한, 하전된 생체분자, 예를 들어, 단백질 및 항체와 함께 이용될 때, 이들은 종종 "안정제"로 명명되는데, 그 이유는 이들이 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하고, 따라서 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 잠재력을 줄일 수 있기 때문이다. 예시적인 등장제는 다가 당 알코올, 3가 또는 보다 고차의 당 알코올, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가적인 예시적인 부형제를 하기를 포함한다: (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 대한 접착을 방지하는 제제. 이런 부형제는 다음을 포함한다: 다가 당 알코올(상기 열거); 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루타민산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올, 예를 들어, 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이노시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨(예컨대, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 포함 환원제, 예를 들어, 요소, 글루타티온, 티옥산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 황산염; 저분자량 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (예컨대, 자일로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류(예컨대, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예를 들어, 라피노스; 및 다당류, 예를 들어, 덱스트린 또는 덱스트란.
비이온성 계면활성제 또는 세정제("습윤제"로도 알려져 있음)가 치료제를 가용화시킬 뿐만 아니라 교반-유도된 응집에 대항하여 치료적 단백질을 보호하는데 도움을 주기 위해 존재하는데, 이것은 또한, 활성 치료적 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않으면서, 제형이 전단 표면 응력에 노출되게 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에터(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아르산염, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스터, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 이용될 수 있는 음이온성 세정제는 라우릴 황산 나트륨, 다이옥틸 설포석산신나트륨 및 다이옥틸 설폰산나트륨을 포함한다. 양이온성 세정제는 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토늄을 포함한다.
약제학적 조성물이 생체내 투여에 이용되기 위해, 이들은 바람직하게는 멸균이다. 약제학적 조성물은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 멸균이 제공될 수 있다. 본 명세서에서 약제학적 조성물은 일반적으로, 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알에 위치된다.
투여 경로는 알려져 있고 허용된 방법, 예컨대, 적합한 방식으로 긴 기간에 걸쳐 일회 또는 다회의 볼루스 또는 주입, 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병소내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입 또는 지속 방출 또는 연장-방출 수단에 따른다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로서 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프는 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sefton, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507-16 (1980); 및 Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:569-74 (1989)] 참조). 다른 실시형태에서, 중합체 물질은 예방적 제제 또는 치료제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질) 또는 본 명세서에 제공된 조성물의 제어 또는 지속 방출을 달성하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126 (1983); Levy et al., Science 228:190-92 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351-56 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105-12 (1989)]; 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; PCT 공개 번호 WO 99/15154 및 WO 99/20253 참조). 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리산무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아마이드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오쏘에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 지속 방출 제형에서 사용되는 중합체는 비활성, 여과할 수 있는 불순물 없음, 보관 시 안정함, 멸균 및 생분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어 또는 지속 방출 시스템은 특정 표적 조직, 예를 들어, 비강 또는 폐 근위에 위치되고, 따라서, 전신 용량의 분획만을 필요로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)] 참조). 제어 방출 시스템은, 예를 들어, 문헌[Langer, Science 249:1527-33 (1990)]에 의해 논의된다. 당업자에게 공지된 임의의 기법은 본 명세서에 기재된 1종 이상의 제제를 포함하는 지속 방출 제형을 생산하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, PCT 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698, 문헌[Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-89 (1996); Song et al., PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97 (1995); Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54 (1997); 및 Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60 (1997)] 참조).
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 또한 필요하다면 치료 중인 특정 적응증에 대해 1종 초과의 화합물 또는 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 또는 이에 더하여, 조성물은 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 또는 성장 저해제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 제공된다.
활성 성분은 또한, 예로서 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition]에 개시되어 있다.
다양한 조성물 및 전달 시스템이 공지되어 있으며, 리포솜에서의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 또는 치료 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 제공된 치료제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 유효한 양, 예컨대, 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 결합 분자 및/또는 세포를 함유한다. 치료적 또는 예방적 효능은 일부 실시형태에서 치료되는 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링된다. 조건에 따라 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 치료는 원하는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있으며, 결정될 수 있다.
5.7. 방법 및 용도
다른 양상에서, 항-BCMA VHH, 키메라 항원 수용체(CAR), 및/또는 재조합 수용체를 발현시키는 조작된 세포를 비롯한 본 명세서에 제공된 BCMA 결합 분자의 이용 방법 및 용도가 본 명세서에 제공된다.
5.7.1. 치료 방법 및 용도
이러한 방법 및 용도는, 예를 들어, BCMA 발현을 발현시키거나 이와 연관되고/되거나 세포 또는 조직이 BCMA를 발현시키는 질환, 병태 또는 장애를 갖는 대상체에 대한 분자, 세포 또는 이를 함유하는 조성물의 투여를 수반하는 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자, 세포 및/또는 조성물은 질환 또는 장애의 효과적인 치료에 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서의 그리고 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 의약의 제조에서의 항체 및 세포의 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 질환 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에 항체 또는 세포, 또는 이를 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 이에 의해 대상체에서 질환 또는 장애를 치료한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애, 또는 증상, 유해효과 또는 결과, 또는 이와 연관된 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 야기한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 용어는 모든 증상 또는 결과에 대한 임의의 증상 또는 효과(들)의 질환 또는 완전한 제거의 완전한 치유를 포함하지만, 나타내지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키고, 예를 들어, 질환(예컨대, 암)의 발생을 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화, 억제 및/또는 연기시킨다. 상기 지연은 질환의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간의 길이를 가질 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환 또는 장애가 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기암, 예컨대, 전이의 발생이 지연될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 용도는 질환 또는 장애를 예방한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 BCMA 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 변연부 림프종(예를 들어, 비장 변연부 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포성 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 털세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고도 B-세포 림프종(HGBL)이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 입양 세포 요법을 포함하여, 제공된 BCMA-표적화된 CAR을 발현시키는 유전자 조작된 세포는 대상체에게 투여된다. 질환 또는 장애의 세포는 파괴를 위해 표적화되도록, 이러한 투여는 BCMA-표적화된 방식으로 세포의 활성화(예를 들어, T 세포 활성화)를 촉진시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 갖거나, 가질 위험에 있거나, 갖는 것으로 의심되는 대상체, 조직 또는 세포에 대한 세포 또는 세포를 함유하는 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 집단 및 조성물은, 예를 들어, 입양 세포 요법, 예컨대, 입양 T 세포 요법을 통해 치료될 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대, 질환 또는 장애를 갖거나 또는 질환 또는 장애의 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 이에 의해 방법은, 예컨대, BCMA-발현 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료한다, 예를 들어, 개선시킨다.
입양 세포 요법에 대한 세포 투여 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0170238호; 미국 특허 제4,690,915호; 문헌[Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol. 8 (10):577-85 (2011); Themeli et al., Nat Biotechnol. 31(10): 928-933 (2013); Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9 (2013); 및 Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013)]에 기재된 바와 같이 알려져 있다. 이들 방법은 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 이때 세포는 세포 요법을 받는 대상체로부터 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고/되거나 달리 제조된다. 따라서, 일부 양상에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 유래되고, 세포는, 단리 및 가공 후에, 동일한 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되고, 이때 세포는 세포 요법을 받는 대상체 또는 세포요법을 궁극적으로 받는 대상체, 예를 들어, 제1 대상체 이외의 대상체로부터 단리되고/되거나 달리 제조된다. 이러한 실시형태에서, 이어서, 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어, 제2 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 대상체와 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 대상체와 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 실시형태에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 슈퍼타입을 발현시킨다. 다른 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행된다.
일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 영장류, 예컨대, 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 영아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 질환, 입양 세포 요법 및/또는 독성 결과 평가를 위한 입증된 동물 모델이다.
BCMA-결합 분자, 예컨대, VHH 및 VHH를 함유하는 키메라 수용체 및 이를 발현시키는 세포는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 안구주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경격막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사, 결막밑 주사, 테논낭하 주사, 교후부 주사, 안구 주위 주입 또는 후부 공막곁 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내에 의해, 국소 치료를 위해 필요하다면, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
질환 또는 병태의 예방 및/또는 치료에서 효과적일 본 명세서에 제공된 예방적 또는 치료적 제제의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위해, 결합 분자 또는 세포의 적절한 투약량은 치료될 질환 또는 장애의 유형, 결합 분자의 유형, 질환 또는 장애의 중증도 및 과정, 치료제가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 요법, 환자의 임상적 병력 및 제제에 대한 반응 및 담당의사의 재량에 따를 것이다. 조성물, 분자 및 세포는 일부 실시형태에서 동시에 또는 일련의 치료를 거쳐서 환자에게 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 항체의 투약량은 약 10㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이상을 포함할 수 있다. 다회 용량은 간헐적으로 투여될 수 있다. 초기에 부하 용량이 높을수록, 그 다음에 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체 중 임의의 하나를 포함하고, 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라서, 1일당 약 10ng/㎏ 내지 최대 약 100㎎/㎏ 이상 체중의 개체의 투약량으로, 예를 들어, 약 1㎎/㎏/일 내지 10㎎/㎏/일로 투여된다. 특정 투약량 및 전달 방법에 따른 지침은 문헌에서 제공된다(예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 및 제5,225,212호).
결합 분자를 함유하는 유전자 조작된 세포와 관련하여, 일부 실시형태에서, 대상체는 약 1백만개 내지 약 1천억개의 세포의 범위 및/또는 킬로그램 체중당 세포의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포 중 어느 하나를 포함하며, 약제학적 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 세포/㎏ 체중의 개체 중 어느 것의 투약량으로 투여된다. 투약량은 속성, 특히, 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 기타 치료에 따라 다를 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 단일 시간 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 중 어느 것) 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투약 주기 동안 1회 또는 다회 투여된다. 투약 주기는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5주 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5개월 이상일 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 투약량 및 치료 요법은 질환 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조절함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 병용 치료의 부분으로서, 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로, 다른 치료적 개입, 예컨대, 다른 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대, 세포독성제 또는 치료제와 함께 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 함께, 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 공동 투여된다. 일부 내용에서, 세포는, 세포 집단이 1종 이상의 추가적인 치료제의 효과를 향상시키거나, 또는 그 반대가 되도록 충분히 가까운 시간에 다른 요법과 함께 공동 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 후에 투여된다.
특정 실시형태에서, 일단 세포가 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여된다면, 조작된 세포 집단 및/또는 항체의 생물학적 활성은 다수의 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가를 위한 파라미터는 생체내에서, 예를 들어 영상화에 의한, 또는 생체외에서, 예를 들어, ELISA 또는 유세포분석에 의해 항원에 대한 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된, 예컨대, 세포독성 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 특정 사이토카인, 예컨대, CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정될 수 있다. 일부 양상에서, 생물학적 활성은 임상적 결과, 예컨대, 종양 부담 또는 부하의 감소를 평가함으로써 측정된다.
일부 구체적 실시형태에서, 예를 들어, 표 4의 CDR을 갖는 것, 서열번호 7 내지 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것, 및 서열번호 7 내지 16에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하는 상기 부문 5.2에 기재된 바와 같은 BCMA에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 BCMA 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 변연부 림프종(예를 들어, 비장 변연부 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포성 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 털세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고도 B-세포 림프종(HGBL)이다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 부문 5.3에 제공된 CAR을 포함하는 세포를 포함하는, 부문 5.4에 제공된 바와 같은 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 (a) 항-BCMA sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하되, 항-BCMA sdAb는, 예를 들어, 표 4의 CDR을 갖는 것, 서열번호 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 것, 및 서열번호 7 내지 16에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하는, 상기 부문 5.2에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 서열번호 23 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 23 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 BCMA 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 연관 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 악성종양이다. 일부 실시형태에서, B 세포 악성종양은 B 세포 백혈병 또는 B 세포 림프종이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 변연부 림프종(예를 들어, 비장 변연부 림프종)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 광범위 큰 B 세포 림프종(DLBCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 중추 신경계(CNS) 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 종격동 B 세포 림프종(PMBL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소형 림프구성 림프종(SLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 B 세포 전림프구성 백혈병(B-PLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 소포성 림프종(FL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 버킷 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 원발성 안구내 림프종이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 털세포 백혈병(HCL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 전구 B 림프모구 백혈병이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 구체적 실시형태에서, 질환 또는 장애는 고도 B-세포 림프종(HGBL)이다.
5.7.2. 진단 및 검출 방법 및 용도
다른 양상에서, 하나 이상의 조직 또는 세포 유형에 대한 특정 치료의 결합 검출, 예후, 진단, 병기화, 결정, 및/또는 대상체에서의 치료 결정 통지를 위한, 예컨대, 항체에 의해 인식되는 BCMA 및/또는 이의 에피토프의 존재의 검출에 의한 본 명세서에 제공된 결합 분자, 예를 들어, BCMA에 결합하는 VHH 및 이러한 VHH를 함유하는 분자(예컨대, 접합체 및 복합체)의 용도에 관한 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 항-BCMA 항체(예컨대, 본 명세서에 기재된 항-BCMA 단일 도메인 항체 중 어느 하나)가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플에서 BCMA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 BCMA 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, BCMA는 인간 BCMA이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 BCMA-발현 질환 또는 장애와 관련된 진단 및/또는 예후 방법이다. 상기 방법은 일부 실시형태에서 생물학적 샘플을 항체와 함께 인큐베이션 및/또는 프로빙하는 단계 및/또는 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 또는 이의 일부, 예컨대, 종양 또는 암 조직 또는 생검 또는 이의 절편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 접촉시키는 단계는 샘플에 존재하는 BCMA에 대한 항-BCMA 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플에서 항-BCMA 항체와 BCMA 간에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계, 예컨대, 이러한 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 실시형태에서, 항-BCMA 항체는 항-BCMA 항체 또는 조작된 항원 수용체를 이용하여 요법의 자격이 있는 대상체를 선택하는 데 사용되며, 예를 들어, 여기서 BCMA는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
일부 실시형태에서, 샘플, 예컨대, 세포, 조직 샘플, 용해물, 조성물 또는 이로부터 유래된 다른 샘플은 항-BCMA 항체와 접촉되며, 항체와 샘플(예를 들어, 샘플 중 BCMA) 사이의 복합체의 결합 또는 형성은 결정되거나 검출된다. 동일한 조직 유형의 참조 세포에 비해서 시험 샘플에서의 결합이 입증되거나 검출될 때, 이는 연관 질환 또는 장애의 존재를 나타낼 수 있고/있거나 항체를 함유하는 치료제는 샘플이 유래된 조직 또는 세포 또는 다른 생물학적 물질과 동일하거나 동일한 유형을 갖는 조직 또는 세포에 특이적으로 결합할 것이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 인간 조직으로부터 유래되고, 질환 조직 및/또는 정상 조직으로부터, 예를 들어, 치료 중인 질환 또는 장애를 갖는 대상체로부터 그리고/또는 이러한 대상체와 동일하지만 치료될 질환 또는 장애를 갖지 않는 동일한 종의 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 정상 조직 또는 세포는 치료될 질환 또는 장애를 갖지만 그 자체는 질환 세포 또는 조직이 아닌, 예컨대, 주어진 대상체에 존재하는 암과 동일 또는 상이한 정상 조직을 갖는 대상체로부터 유래된다.
특이적 항체-항원 결합을 검출하기 위한 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 면역검정은 형광 편광 면역검정(FPIA), 형광 면역검정(FIA), 효소 면역검정(EIA), 비탁법 면역검정(NIA), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 및 방사선면역검정(RIA)을 포함한다. 지표 모이어티, 또는 표지 그룹은 검정 설비 및 양립가능한 면역검정 절차의 이용가능성에 의해 종종 지시된 방법의 다양한 용도의 요구를 충족하기 위해 사용된다. 예시적인 표지는 방사성 핵종(예를 들어, 125I,　131I,　35S,　3H 또는　32P 및/또는 크로뮴(51Cr), 코발트(57Co), 플루오린(18F), 가돌리늄(153Gd,　159Gd), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In,　113In,　112In,　111In), 아이오딘(125I,　123I,　121I), 란타늄 (140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브데늄(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴 (142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄 (186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), (85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti) 주석(113Sn,　117Sn), 트리튬(3H), 제논(133Xe), 이터븀(169Yb,　175Yb), 이트륨(90Y),), 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 겨자무과산화효소, 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제), 형광 모이어티 또는 단백질(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, GFP 또는 BFP), 또는 발광 모이어티(예를 들어, 캘리포니아주 팔로알토 소재의 Quantum Dot Corporation에 의해 공급된 Qdot™ 나노입자)를 포함한다. 상기 언급한 다양한 면역분석법을 수행하는 데 사용될 다양한 일반적 기법은 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, 표지된 항체(예컨대, 항-BCMA 단일 도메인 항체)가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예로서, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 항체는 표지되지 않으며, 이의 존재는 임의의 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
5.8. 키트 및 제조 물품
본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체, 키메라 항원 수용체 또는 조작된 면역 효과기 세포 중 어느 것을 포함하는 키트, 단위 투약량 및 제조 물품이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 기재된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 포함하고 바람직하게는, 이의 사용을 위한 지침을 제공하는 키트가 제공된다.
본 출원의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 보틀, 단지, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 비닐백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 키트는 선택적으로 추가적인 성분, 예컨대, 완충제 및 설명 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본 출원은 또한 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 병, 단지, 가요성 포장 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적절한 용기에는, 예로서, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에서 기재된 질환 또는 장애(예컨대, 암)를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 라벨 또는 포장 삽입물은 개체에서의 특정 병태를 치료하는 데 조성물이 사용된다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 개체에 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 라벨은 재구성 및/또는 사용을 위한 방향을 나타낼 수 있다. 약제학적 조성물을 유지하는 용기는 다회용 바이알일 수 있는데, 이는 재구성 제형의 반복 투여(예컨대, 2 내지 6회의 투여)를 가능하게 한다. 포장 삽입물은 이러한 치료 제품의 사용과 관련한 적응증, 투약량, 투여, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지침을 지칭한다. 추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트 또는 제조 물품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 처방 약국에서 보관 및 이용을 위한 충분한 양으로 포장된 다회 단위 용량의 약제학적 조성물 및 지침을 포함할 수 있다.
간결함을 위해, 특정 약어가 본 명세서에서 사용된다. 일례는 아미노산 잔기를 나타내기 위한 1글자 약어이다. 아미노산 및 이들의 대응한 3글자 및 1글자 약어는 다음과 같다:
Figure pct00010
본 개시내용은 일반적으로 수많은 실시형태를 기재하기 위해 긍정적인 언어를 이용하여 본 명세서에 개시된다. 본 개시내용은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석과 같은 특정 대상 물질이 제외된 실시형태를 구체적으로 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 일반적으로 본 개시내용이 포함하지 않는 것에 관해 본 명세서에서 표현되지 않지만, 그럼에도 불구하고 본 개시내용에 분명하게 포함되지 않는 양상이 본 명세서에 개시된다.
본 개시내용의 다수의 실시형태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 개시내용의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다음의 실시예는 청구범위에 기재되는 본 개시내용의 범주를 예시하지만, 이를 제한하지 않는 것으로 의도된다.
6. 실시예
하기는 본 연구에서 사용되는 다양한 방법 및 물질의 설명이며, 본 개시내용을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 이들의 개시내용으로 간주하는 범위를 제한하는 것을 의도하지도 않고, 이들은 이하 실험이 수행되었고 수행될 수 있는 모든 실험임을 나타내는 것으로 의도하지도 않는다. 현재 시제로 기재된 실시예 기재들은 반드시 수행되었다기 보다는, 그 기재내용이 본 개시내용의 교시와 관련하여 데이터 등을 생성하기 위해 실시될 수 있다는 것으로 이해하여야 한다. 사용된 수치 (예를 들면 양, 백분율 등)에 대하여 정확도를 확보하기 위해 노력하였지만 일부 실험적 오차는 설명되어야 한다.
6.1. 실시예 1- BCMA 표적화 CAR-T LIC948A22는 시험관내 및 생체내에서 강한 항-종양 효능을 유발하였다
6.1.1. 플라스미드
CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 플라스미드는 세포외 도메인, 인간 CD8 알파 힌지, 인간 CD8 알파 막관통 도메인(TM), CD137(4-1BB) 세포질 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인에서 인간 CD8 알파 신호 펩타이드(SP), 항-BCMA VHH 도메인(269A37948 및 269AS34822 또는 이의 인간화된 VHH 도메인)으로 이루어졌다. CD8 알파 SP 및 BCMA 결합 도메인의 코돈 최적화된 서열을 합성하고, EcoRI(5'-gaattc-3') 및 SpeI(5'-actagt-3') 제한 부위를 통해 pLVX-puro(Clontech, Takara Bio, #632164)에 기반하여 이전에 변형시킨, 인간 CD8 알파 힌지, 인간 CD8 알파 TM, CD137 세포질 도메인 및 CD3ζ 세포질 도메인의 암호화 서열을 포함하는 골격을 운반하는 렌티바이러스 전달 벡터에 클로닝시켰다.
일부 실시형태에서, 세포외 리간드 결합 도메인은 BCMA(즉, 항-BCMA sdAb), 예컨대, 각각 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시된 임의의 항-BCMA sdAb에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 sdAb를 포함한다.
6.1.2. 렌티바이러스 패키징
렌티바이러스 생산을 위해 Lenti-X 293T 세포(Clontech, Takara Bio, #632180)를 사용하였다. 형질감염 전날 각 15㎝ 접시에 20×106개의 Lenti-X 293T 세포를 파종하였다. 다음 날, 최적의 렌티바이러스 패키징 효율을 얻기 위해 형질감염에 대해 80% 내지 90%의 합류를 갖는 접착 세포를 수용하였다. pMDLg.pRRE, pRSV-Rev, pMD.2G 및 각 전달 플라스미드를 포함한 형질감염 플라스미드 칵테일을 부드럽게 피펫팅함으로써 함께 혼합하였다. 전달 플라스미드는 LIC948A22(CD8α SP-269A37948-링커-269AS34822-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ 서열번호 35의 핵산 서열을 가짐) 및 GSI5021(GSI5021 CAR은 PCT/CN2016/094408 및 PCT/CN2017/096938에 개시되어 있으며, 이들 각각의 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)를 개별적으로 암호화한다. PEI 시약을 혼합물에 3:1의 용적 비로 첨가하였다. 형질감염 후 48시간에, 상청액을 수집하였다.
바이러스-함유 상청액을 PEG6000와 3:1의 비로 혼합하고, 이어서, 30초 동안 교반하였다. 혼합물을 4℃ 및 90rpm/분에서 진탕하였다. 20 내지 72시간의 인큐베이션 후에, 혼합물을 4℃ 및 3000×g에서 30분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 조심해서 버리고, 펠릿을 배지와 함께 부드럽게 재현탁시켰다. CHO 세포를 형질도입함으로써 바이러스 역가를 결정하였다.
6.1.3. CAR-T 세포 제조
이하에 기재하는 바와 같은 제조업자의 프로토콜에 따라 MACSxpress 전혈 pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, #130-098-193)를 이용하여 건강한 공여자의 성분채집술로부터 T 세포를 단리시켰다. 30㎖의 혈액응고 저지된 전혈을 50㎖의 관에 옮기고, 15㎖의 단리 혼합물을 전혈에 첨가하였다. 관을 단단히 밀폐하고, 부드럽게 3회 뒤집는다. 샘플을 5분 동안 실온에서 대략 12 rpm의 영구 실행 속도로 MACSmix Tube Rotator를 이용하여 인큐베이션시켰다. 조심해서 캡을 열고, MACSxpress Separator의 자기장에서 15분 동안 개방된 관을 둔다. 상청액을 새로운 50㎖ 관에 수집하였다. 이어서, 풀링한 풍부화된 T 세포를 원심분리하고, TexMACS 배지+300 IU/㎖ IL-2에서 재현탁시켰다.
준비한 T 세포를 후속적으로 비드를 1:17.5의 비드-대-세포 용적비로 첨가한 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 MACS GMP T 세포 TransAct(Miltenyi Biotec, #170-076-156)와 함께 24 내지 48시간 동안 사전에 활성화시켰다.
사전 활성화시킨 T 세포를 7㎍/㎖ DEAE의 존재 하에 1200×g, 32℃에서 1.5시간 동안 원심분리에 의해 렌티바이러스 저장액으로 형질도입하였다. 이어서, 형질도입된 세포를 적합한 조건 하에 이식유전자 발현을 위해 세포 배양 인큐베이터에 전달하였다.
6.1.4. 시험관내 세포독성 분석
형질도입 후 7일에, 형질도입된 T 세포를 채취하고, 20시간 동안 5:1 및 1:1의 상이한 효과기(CAR-T) 대 표적 세포비(E:T)로 종양 세포와 함께 개별적으로 공동인큐베이션시켰다. 표적 세포는 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위해 사내에서 조작한 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc였다. 종양 세포에 대한 CAR-T의 세포독성을 검정하기 위해, ONE-GLO™ 발광 루시퍼라제 검정 시약(Promega, #E6120)을 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하고, 웰 내에 남아있는 루시퍼라제 활성을 검출하기 위해 공동배양 세포에 첨가하였다. 루시퍼라제를 표적 세포에서만 발현시키기 때문에, 웰에 남아있는 루시퍼라제 활성은 웰에서의 살아있는 표적 세포 수와 직접적으로 상관관계가 있다. 효과기 세포가 존재하지 않을 때 표적 세포에 배양 배지를 첨가함으로써 최대 루시퍼라제 활성을 얻었다. 세포독성 분석을 개시하였을 때 Triton X-100을 1%의 최종 농도로 첨가함으로써 최소 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 하기 식에 의해 세포독성을 계산하였다: 세포독성%= 100% * (1-(RLU샘플-RLUmin)/(RLUUnT-RLUmin)). 비형질도입 T 세포(UnT)는 대조군으로서 작용하였다.
도 1에 나타낸 세포독성 분석에 따라, LIC948A22 CAR-T 세포는 GSI5021 CAR-T 세포에 비해서 시험관내 BCMA 양성 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc에 대해 보다 높은 E:T에서 비슷한 세포독성을 나타내는 데 강력하였고; 1:1의 보다 낮은 E:T 비에서, LIC948A22 CAR-T 세포는 GSI5021 CAR-T보다 더 강력하였다(57.63±5.19 % 대 36.90±13.49%).
6.1.5. 종양 이종이식 마우스에서의 LIC948A22 CAR-T 세포의 생체내 효능
다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc를 생착시킨 NCG 마우스 모델(NOD-Prkdc em26Cd52 Il2rg em26Cd22 /NjuCrl)에서 GSI5021 CAR-T 세포의 생체내 항-종양 효능을 평가하였다.
건강한 공여자로부터의 T 세포를 이용하여 CAR-T 세포를 제조하였다. NCG 마우스에 RPMI8226.Luc 세포(4×106개의 인간 RPMI8226.Luc 세포/마우스)로 정맥내로 주사하였다. 14일 후에, 종양 생착 마우스를 CAR-T 세포(LIC948A22 또는 GSI5021, 1.5×106개의 CAR-T 세포/마우스), 비형질도입된 T 세포(UnT, 16.44×106개의 T 세포/마우스) 또는 HBSS 용매 대조군(400㎕/마우스)으로 처리하고, 제0일로 언급하였다. 생체내 생물발광 영상화 (BLI)를 종양 세포를 모니터링하기 위해 제-1일 및 제7일부터 제42일까지 매주 수행하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, LIC948A22 CAR-T 세포는 NCG 마우스에서 생착된 RPMI8226.Luc 종양 세포를 근절하기 위해 GSI5021 CAR-T 세포로서 효율적이었다.
6.2. 실시예 2. 인간화된 BCMA CAR-T는 시험관내 및 생체내에서 강한 항-종양 효능을 유발하였다
6.2.1. 렌티바이러스 패키징
렌티바이러스 생산을 위해 Lenti-X 293T 세포(Clontech, Takara Bio, #632180)를 사용하였다. 형질감염 전날 각 15㎝ 접시에 20×106개의 LentiX-293T 세포를 파종하였다. 다음 날, 최적의 렌티바이러스 패키징 효율을 얻기 위해 형질감염에 대해 80% 내지 90%의 합류를 갖는 접착 세포를 수용하였다. pMDLg.pRRE, pRSV-Rev, pMD.2G 및 각 전달 플라스미드를 포함한 형질감염 플라스미드 칵테일을 부드럽게 피펫팅함으로써 함께 혼합하였다. 전달 플라스미드는 인간화된 BCMA CAR을 별개로 암호화한다(LIC948A22H31-LIC948A22H37, CD8α SP-인간화된 BCMA VHH1-링커-인간화된 BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-CD3ζ, 인간화된 BCMA CAR 작제물 구조에 대해 표 5 참조). PEI 시약을 혼합물에 3:1의 용적 비로 첨가하였다. 형질감염 후 48시간에, 상청액을 수집하였고 렌티바이러스를 얻기 위해 초원심분리에 의해 농축시켰다.
Figure pct00011
Figure pct00012
0.5×106개의 CHO 세포를 2㎖로 6개의 웰 플레이트에 첨가하고, 형질도입을 개시하기 위해 각 웰에 각각 연속 희석시킨 렌티바이러스를 첨가하였다. 3일 후에, 각 웰의 세포를 수집하고, PE-토끼 항-EGFR(Novus, #NBP2-52671PE)로 30분 동안 염색한 후에, 유세포분석하여 바이러스 감염 역가를 평가하였다.
6.2.2. CAR-T 세포 제조
인간 T 세포는 아래에 설명하는 바와 같은 제조업체의 프로토콜에 따라서, Miltenyi Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 이용하여 인간 건강체 공여자로부터의 PBMC로부터 정제하였다. 세포 수를 처음 결정하였고, 세포 현탁액을 300×g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 이어서, 상청액을 완전히 흡인하고, 세포 펠릿을 107개의 총 세포당 40㎕ 완충제에서 재현탁시켰다. 10㎕의 Pan T 세포 바이오틴-항체 칵테일을 107개의 총 세포마다 첨가하였고, 철저히 혼합하고 나서, 냉장고(2 내지 8℃)에서 약 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 30㎕의 완충제를 107개의 세포마다 첨가하였다. 20㎕의 Pan T 세포 MicroBead Cocktail을 107개의 세포마다 첨가하였다. 세포 현탁액 혼합물을 잘 혼합하고, 냉장고(2 내지 8℃)에서 추가 10분 동안 인큐베이션시켰다. 자기 분리를 위해 최소 500㎕가 필요하다. 자기 분리를 위해, 적합한 MACS 분리기의 자기장에 LS 칼럼을 배치하였다. 칼럼은 3㎖의 완충제로 린스함으로써 준비하였다. 이어서, 세포 현탁액을 칼럼 상에 적용하고, 비표지 세포를 함유하는 통과액을 수집하였는데, 이는 풍부화된 T 세포 분획을 나타내었다. 3㎖의 완충제로 칼럼을 세척하고, 통과된 비표지 세포를 수집함으로써 추가적인 T 세포를 수집하였다. 이들 표지화되지 않은 세포는 다시 한 번, 농축된 T 세포를 대표하고, 이전 단계로부터 관류와 합동되었다. 이어서, 풀링한 풍부화된 T 세포를 원심분리하고, TexMACS 배지+300 IU/㎖ IL-2에서 재현탁시켰다.
준비한 T 세포를 후속적으로 비드를 1:100의 비드-대-세포 용적비로 첨가한 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 T 세포 TransAct(Miltenyi Biotec, #130-111-160)와 함께 24 내지 48시간 동안 사전에 활성화시켰다.
사전 활성화시킨 T 세포를 1200×g, 32℃에서 1.5시간 동안 원심분리에 의해 렌티바이러스 저장액으로 형질도입하였다. 이어서, 형질도입된 세포를 적합한 조건 하에 이식유전자 발현을 위해 세포 배양 인큐베이터에 전달하였다.
6.2.3. 시험관내 세포독성 분석
형질도입 후 6일에, 형질도입된 T 세포를 채취하고, 20시간 동안 2:1, 1:1 및 1:2의 상이한 E:T로 종양 세포와 함께 공동인큐베이션시켰다. 표적 세포는 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc였고, 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키기 위해 사내에서 조작하였다. 종양 세포에 대한 CAR-T의 세포독성을 검정하기 위해, ONE-GLO™ 발광 루시퍼라제 검정 시약(Promega, #E6120)을 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하고, 웰 내에 남아있는 루시퍼라제 활성을 검출하기 위해 공동배양 세포에 첨가하였다. 루시퍼라제를 표적 세포에서만 발현시키기 때문에, 웰에 남아있는 루시퍼라제 활성은 웰에서의 살아있는 표적 세포 수와 직접적으로 상관관계가 있다. 효과기 세포가 존재하지 않을 때 표적 세포에 배양 배지를 첨가함으로써 최대 루시퍼라제 활성을 얻었다. 세포독성 분석을 개시하였을 때 Triton X-100을 1%의 최종 농도로 첨가함으로써 최소 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 하기 식에 의해 세포독성을 계산하였다: 세포독성%= 100% * (1-(RLU샘플-RLUmin)/(RLUUnT-RLUmin)). 비형질도입 T 세포(UnT)는 대조군으로서 작용하였다.
7개의 인간화된 BCMA CAR 작제물(LIC948A22H31-LIC948A22H37)을 LIC948A22 CAR에 기반하여 설계하였다. 다발성 골수종 세포주(RPMI8226.Luc)에 대한 인간화된 BCMA CAR-T 세포의 항-종양 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포독성 분석을 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 시험한 CAR-T 후보는 시험관내에서 강한 항-종양 효능을 나타내었다. 비-인간화된 CAR-T(LIC948A22)에 비해서, LIC948A22H34, LIC948A22H35 및 LIC948A22H36은 시험관내에서 비슷한 항-종양 효력을 유발하였다.
6.2.4. 종양 이종이식 마우스에서 인간화된 BCMA CAR-T의 생체내 효능
상기 기재한 바와 같은 인간 다발성 골수종 종양 세포주를 생착시킨 NCG 마우스 모델(NOD-Prkdc em26Cd52 Il2rg em26Cd22 /NjuCrl)에서 인간화된 BCMA CAR-T 세포의 생체내 항-종양 효능을 평가하였다.
건강한 공여자로부터의 T 세포를 이용하여 CAR-T 세포를 제조하였다. 종양 이종이식편을 생성하기 위해, NCG 마우스에 RPMI8226.Luc 세포(4×106개의 인간 RPMI8226.Luc 세포/마우스)로 정맥내로 주사하였다. 14일 후에, 종양 생착 마우스를 CAR-T 세포(LIC948A22, LIC948A22H34 또는 LIC948A22H37, 1×106 CAR-T 세포/마우스), 비형질도입된 T 세포(UnT, 6.32×106개의 T 세포/마우스) 또는 HBSS 용매 대조군(400㎕/마우스)으로 처리하고, 제0일로 언급하였다. 생체내 생물발광 영상화 (BLI)를 종양 세포를 모니터링하기 위해 제-1일 및 제7일부터 제35일까지 매주 수행하였다.
도 4에 도시한 바와 같이, 시험한 BCMA 표적화 CAR-T의 모두(LIC948A22, LIC948A22H34 및 LIC948A22H37)는 이러한 종양 이종이식 마우스 모델에서 강한 항-종양 효능을 나타내었고, 종양 세포는 완전히 근절되었다.
6.3. 실시예 3. TCRαβ 발현에 대한 SIV Nef M116 및 인간화된 BCMA CAR 공동발현의 조절 평가
6.3.1. SIV Nef M116 및 인간화된 BCMA CAR을 포함하는 전달 플라스미드의 작제
pLVX-Puro는 HIV-1-기반, 렌티바이러스 발현 벡터이다. pLVX-hEF1α 벡터를 작제하기 위해, ClaI 및 EcoRI을 이용하여 pLVX-Puro(Clontech) 벡터를 효소적으로 분해하여 다중 클로닝 부위(MCS) 바로 상류에 위치된 구성적으로 활성인 인간 거대세포바이러스 급초기 프로모터(PCMV IE)를 제거하고, 이어서, 인간 EF1α 프로모터 (GenBank: J04617.1)를 분해된 벡터에 클로닝하였다. LUC948A22 UCAR(서열번호　47의 핵산 서열을 가짐)은 비-인간화된 BCMA VHH 도메인(클론 269A37948 및 269AS34822로부터 선택) 및 SIV Nef M116 공동 발현을 갖는 보편적 BCMA CAR이며, N'에서 C'까지: SIV Nef M116-IRES-CD8α SP-BCMA VHH1-링커-BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010의 구조를 갖는다. LUC948A22H34(서열번호 48의 핵산 서열을 가짐), LUC948A22H36(서열번호 49의 핵산 서열을 가짐) 및 LUC948A22H37(서열번호 50의 핵산 서열을 가짐)은 인간화된 BCMA VHH 도메인(269AS34822H4, 269AS34822H6 및 269AS34822H7와 함께 클론 269A37948H3의 임의의 조합으로부터 선택됨) 및 SIV Nef M116 공동 발현을 갖는 인간화된 보편적 BCMA CAR이고, N'에서 C'까지: SIV Nef M116-IRES-CD8α SP-인간화된 BCMA VHH1-링커-인간화된 BCMA VHH2-CD8α 힌지-CD8α TM-4-1BB-ITAM010의 구조를 갖는다, 인간화된 보편적 BCMA CAR 작제물 구조에 대해 표 6 참조. 일부 실시형태에서, 보편적 CAR은 외인성 Nef 단백질 및 키메라 신호전달 도메인(즉, SIV Nef 돌연변이체 및 CMSD ITAM), 예컨대, 각각 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 PCT/CN2020/112181에 개시된 임의의 보편적 CAR을 포함한다.
Figure pct00013
다음에, LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 암호화하는 융합 유전자를, 이어서, pLVX-hEF1α 플라스미드에 클로닝하여, 각각 재조합 전달 플라스미드 pLVX-LUC948A22 UCAR, pLVX- LUC948A22H34, pLVX- LUC948A22H36 및 pLVX- LUC948A22H37을 생성한다. 재조합 전달 플라스미드를 정제하고, 패키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G와 비례해서 혼합하고, 이어서, HEK 293T 세포에 공동형질도입하였다. 형질도입 후 60시간에, 바이러스 상청액을 수집하고, 4℃, 3000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 0.45㎛ 필터를 이용해서 상청액을 여과시키고, 500 KD 중공 섬유막 접선유동여과를 이용해서 추가로 농축시켜 농축된 렌티바이러스를 얻고, 이를 -80℃에서 보관하였다.
6.3.2. TCRαβ 발현에 대해 SIV Nef M116 및 인간화된 BCMA CAR을 함유하는 전달 플라스미드의 조절
지원자로부터 50㎖ 말초 혈액을 추출하였다. 밀도 구배 원심분리를 통해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. PBMC를 자기적으로 표지하고 T 림프구를 정제하기 위해 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec, #130-096-535)를 사용하였다. 정제된 T 림프구의 활성화 및 확장을 위해 CD3/CD28 접합 자기 비드를 사용하였다. 활성화된 T 림프구를 수집하고, RPMI 1640 배지(Life Technologies,　#22400-089)에서 재현탁시켰다. 활성화의 3일 후에, 5×106개의 활성화된 T 림프구를 LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 암호화하는 렌티바이러스로 각각 형질도입하였다. 형질도입 후 4일에, 5×105개의 세포를 함유하는 세포 현탁액을 실온에서 10분 동안 300×g에서 원심분리시키고, 상청액을 버렸다. 세포를 DPBS로 재현탁시키고, 이어서, 1㎕의 APC 항-인간 TCRαβ 항체(Biolegend, #B259839)를 첨가하고 나서, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 1㎖ DPBS 단계와 함께 원심분리 및 재현탁을 한 번 반복하였다. 이어서, TCRαβ 양성률 시험을 위해 형광-활성화 세포 분류기(FACS)에 대해 DPBS로 세포를 재현탁시켰다. 비형질도입 T 세포(UnT)는 대조군으로서 작용하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입한 T 세포의 TCRαβ 양성률은 각각 57.6%, 53.2%, 51.0% 및 56.4%였다. UnT의 TCRαβ 양성률은 85.8%였다. 이들 결과는 SIV Nef M116 및 비-인간화된 BCMA CAR 공동 발현(LUC948A22 UCAR)이 TCRαβ 양성률을 유의미하게 감소시켰고(P<0.05); 유사하게, SIV Nef M116 및 인간화된 BCMA CAR 공동 발현(LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37)은 TCRαβ 양성률을 유의미하게 감소시켰다(P<0.05)는 것을 입증한다. 비-인간(LUC948A22 UCAR)과 인간화된(LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37) 보편적 BCMA CAR 사이에 TCRαβ 발현 조절의 유의미한 차이는 없으며(P>0.05), 이는 TCR/CD3 복합체에 대한 SIV Nef M116의 조절이 인간화된 BCMA VHH 도메인에 의해 영향받지 않는다는 것을 시사한다.
요약하면, 상기 결과는 TCR/CD3 복합체에 대한 SIV Nef M116의 하향 조절이 SIV Nef M116과 비-인간화된 BCMA CAR 공동 발현에 의해 영향받지도, 또는 SIV Nef M116과 인간화된 BCMA CAR 공동 발현에 의해 영향받지도 않는다는 것을 입증하며, 이들 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았고, TCR/CD3 복합체에 대한 SIV Nef M116의 조절이 인간화된 BCMA VHH 도메인에 의해 영향받지 않는다는 것을 시사한다.
6.4. 실시예 4. 표적 세포 상에서 SIV Nef M116과 인간화된 BCMA CAR을 공동 발현시키는 T 세포의 시험관내 비 세포독성 평가
5×106개의 활성화된 T 림프구를 LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 암호화하는 렌티바이러스로 각각 형질도입하였다(실시예 3 참조). T 세포 현탁액을 6-웰 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션시켰다. 형질도입 후 7일에, LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 T 세포를 5:1, 2.5:1 및 1.25:1의 상이한 효과기 대 표적(E:T) 세포비로 다발성 골수종 세포주 RPMI8226.Luc(루시퍼라제(Luc) 마커와 함께 BCMA+)와 별개로 혼합하고, Corning® 384-웰 고체 백색 플레이트에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. ONE-Glo™ 루시퍼라제 분석 시스템(TAKARA, #B6120)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 25㎕ ONE-Glo™ 시약을 384-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 이어서, 표적 세포 상의 상이한 T 림프구의 세포독성을 계산하기 위해 형광 측정을 위한 Spark™ 10M 멀티모드 마이크로플레이트 판독기(TECAN)에 넣었다. 비형질도입 T 세포(UnT)는 대조군으로서 작용하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, UnT에 비해서, LUC948A22 UCAR, LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37을 별개로 발현시키는 T 세포는 모두 40% 초과의 상대 사멸 효율로 CAR-특이적 표적 세포주 RPMI8226.Luc를 효과적으로 용해시켰다(P<0.05). 비-인간화(LUC948A22 UCAR)와 인간화된(LUC948A22H34, LUC948A22H36 및 LUC948A22H37) 보편적 BCMA CAR-T 세포 사이의 세포독성에는 유의미한 차이가 없다(P>0.05). 이들 데이터는 SIV Nef M116 및 인간화된 BCMA VHH 도메인 공동발현 용량이 표적 세포-의존적인 CAR-비 세포독성에 영향을 미?? 않는다는 것을 입증한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개 출원 및 참고문헌의 교시는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 예시적 실시형태를 특히 나타내고 기재하였지만, 당업자는 첨부되는 청구범위에 의해 포함되는 실시형태의 범주로부터 벗어나는 일 없이 형태의 다양한 변화 및 상세한 설명이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기로부터, 비록 구체적 실시형태가 예시의 목적을 위해 본 명세서에서 설명되었지만, 본 명세서에 제공된 것의 사상과 범주를 벗어나는 일 없이 다양한 변형이 이루어질 수도 있다는 것이 인식될 것이다. 상기 언급한 모든 참고문헌은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD. <120> SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO/2021/121228 <140> PCT/CN2020/136570 <141> 2020-12-15 <150> PCT/CN2020/112182 <151> 2020-08-28 <150> PCT/CN2020/112181 <151> 2020-08-28 <150> PCT/CN2019/125681 <151> 2019-12-16 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA 269A37948 VHH CDR1 amino acid sequence <400> 1 Thr Tyr Phe Met Ala 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA 269A37948 VHH CDR2 amino acid sequence <400> 2 Gly Ile Ala Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA 269A37948 VHH CDR3 amino acid sequence <400> 3 Arg Gly Ile Glu Val Glu Glu Phe Gly Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA 269AS34822 VHH CDR1 amino acid sequence <400> 4 Asn 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gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440 atgcaggccc tgccccctcg ctgataa 1467 <210> 37 <211> 1467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIC948A22H32 CAR nucleic acid sequence <400> 37 atggccctgc ctgtcaccgc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgc 60 cctcaggtcc agctggtcga atctggcgga ggcctggtgc agccaggagg ctctctgagg 120 ctgagctgcg cagcatccgg aagggccttc tccacctact ttatggcatg gttcaggcag 180 gcacctggaa aggagagaga gtttgtggca ggaatcgcat ggtccggagg atctacagca 240 tacgccgact ctgtgaaggg caggttcacc atcagccgcg ataacgccaa gaatacactg 300 tatctgcaga tgaactccct gagggcagag gacaccgccg tgtactattg cgcccggaga 360 ggcatcgagg tggaggagtt tggagcatgg ggacagggaa ccatggtgac agtgagctcc 420 ggaggaggag gctctcaggt gcagctggag gagtctggag gaggcagcgt gcaggcagga 480 ggctccctgc 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tcaggcaggc accaggcaag gagagggagt ttgtggcagg aatcgcatgg 1500 tccggaggat ctacagcata cgcagacagc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagat 1560 aacgccaaga atacagtgta tctgcagatg aacagcctga agtccgagga taccgccgtg 1620 tactattgcg cctccagggg catcgaggtg gaggagtttg gagcatgggg acagggaacc 1680 caggtgacag tgagctccgg aggaggaggc tctcaggtgc agctggagga gtccggagga 1740 ggctctgtgc aggcaggagg cagcctgcgg ctgtcctgtg cctacaccta ttctacatac 1800 agcaactact atatgggatg gtttagggag gcaccaggca aggcaagaac ctctgtggcc 1860 atcatctcta gcgacaccac aatcacatat aaggatgctg tcaaaggccg gttcaccatt 1920 agcaaggaca acgccaagaa tacactgtac ctgcaaatga acagcctgaa gcctgaggat 1980 tctgccatgt atagatgtgc cgcctggact tcagattgga gcgtcgcata ctggggacag 2040 gggactcagg tcaccgtcag cagcactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 2100 ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 2160 gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 2220 cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 2280 cggggcagaa 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acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260 acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgctc tgctgctgcc tctggctctg 1320 ctgctgcacg ccgctcggcc tcaggtccag ctggtcgaat ccgggggagg cctggtgcag 1380 ccaggaggct ctctgaggct gagctgcgca gcatccggaa gggccttctc cacctacttt 1440 atggcatggt tcaggcaggc acctggaaag gagagagagt ttgtggcagg aatcgcatgg 1500 tccggaggat ctacagcata cgcagactcc gtgaagggca ggttcaccat ctctcgcgat 1560 aacgccaaga atacactgta tctgcagatg aacagcctga gggcagagga caccgccgtg 1620 tactattgcg cccggagagg catcgaggtg gaggagtttg gagcatgggg acagggaacc 1680 atggtgacag tgagctccgg aggaggaggc tctcaggtgc agctggagga gagcggaggc 1740 ggcctggtgc agcctggcgg ctctctgaga ctgagctgtg cctacaccta tagcacatac 1800 tccaactact atatgggctg gtttagggag gcaccaggaa agggcctgac ctccgtggcc 1860 atcatctcta gcgacaccac aatcacatat aaggatgccg tgaagggcag attcaccatc 1920 tccaaggaca actctaagaa tacactgtac ctgcagatga atagcctgcg ggccgaggat 1980 tccgccgtgt atagatgtgc cgcctggacc tctgattgga gcgtggctta ttgggggcag 2040 ggcactctgg tgaccgtgag cagcactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 2100 ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 2160 gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 2220 cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 2280 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 2340 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 2400 ctgggtgaaa atttgtattt tcaatctggt ggtgacacac aagctctgtt gaggaatgac 2460 caggtctatc agcccctccg agatcgagat gatgctcagt acagccacct tggaggaaac 2520 ggtggttctg gtgagaggcc accacctgtt cccaacccag actatgagcc catccggaaa 2580 ggccagcggg acctgtattc tggcctgaat cagagaggtg gttctggtga caagcagact 2640 ctgttgccca atgaccagct ctaccagccc ctcaaggatc gagaagatga ccagtacagc 2700 caccttcaag gaaacggtgg ttctggtcgg aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct 2760 tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat gtctacagcg acctcaacac acagggtggt 2820 tctggttaa 2829 <210> 49 <211> 2829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LUC948A22H36 nucleic acid sequence <400> 49 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260 acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgcac tgctgctgcc tctggctctg 1320 ctgctgcacg ccgcaaggcc tcaggtccag ctggtcgagt ctgggggagg cctggtgcag 1380 ccaggaggct ctctgaggct gagctgcgca gcatccggaa gggccttctc tacctacttt 1440 atggcatggt tcaggcaggc acctggaaag gagagagagt ttgtggcagg aatcgcatgg 1500 agcggaggat ctacagcata cgcagacagc gtgaagggca ggttcaccat ctcccgcgat 1560 aacgccaaga atacactgta tctgcagatg aactccctga gggcagagga caccgccgtg 1620 tactattgcg cccggagagg catcgaggtg gaggagtttg gagcatgggg acagggaacc 1680 atggtgacag tgagctccgg aggaggaggc tcccaggtgc agctggtgga gtctggagga 1740 ggcctggtga aacctggcgg ctctctgaga ctgagctgtg cctacaccta tagcacatac 1800 tccaactact atatgggctg gtttaggcag gcaccaggaa agggcctgac cagcgtggcc 1860 atcatctcta gcgacaccac aatcacctat aaggatgccg tgaagggcag attcacaatc 1920 agcaaggaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggat 1980 acagccgtgt atagatgtgc cgcctggact tccgattgga gcgtcgccta ttgggggcag 2040 ggcactctgg tcactgtcag cagcactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 2100 ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 2160 gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 2220 cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 2280 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 2340 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 2400 ctgggtgaaa atttgtattt tcaatctggt ggtgacacac aagctctgtt gaggaatgac 2460 caggtctatc agcccctccg agatcgagat gatgctcagt acagccacct tggaggaaac 2520 ggtggttctg gtgagaggcc accacctgtt cccaacccag actatgagcc catccggaaa 2580 ggccagcggg acctgtattc tggcctgaat cagagaggtg gttctggtga caagcagact 2640 ctgttgccca atgaccagct ctaccagccc ctcaaggatc gagaagatga ccagtacagc 2700 caccttcaag gaaacggtgg ttctggtcgg aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct 2760 tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat gtctacagcg acctcaacac acagggtggt 2820 tctggttaa 2829 <210> 50 <211> 2829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LUC948A22H37 nucleic acid sequence <400> 50 atgggctcca gcaactccaa gaggcagcaa cagggcttgc tcaagctctg gcgagggctg 60 cgagggaagc ctggggcaga ctgggtgcta ttgtccgatc cgcttatcgg gcagtcatca 120 acagtccaag aagagtgcgg caaggccttg aaaaagtcct ggggtaaagg taaaatgact 180 ccagacggcc gccgcctgca agaaggagac acctttgatg agtgggatga tgatgaagaa 240 gaagtaggct tccctgtgca acctcgagtc cccttaagac agatgaccta taaattagca 300 gtggactttt cccacttttt aaaatcaaag gggggactgg atgggatata ttactctgaa 360 agaagagaaa agatcctgaa tttgtatgcc ttgaacgagt ggggaataat agatgattgg 420 caagcttact caccaggccc ggggataagg tacccgagag tctttggctt ctgctttaag 480 ctagtcccag tggacctgca tgaggaggca cgcaactgtg agagacactg tgctgcacat 540 ccagcacaga tgggggaaga tcctgatgga atagatcatg gagaagtctt ggtctggaag 600 tttgacccga agttggcggt ggagtaccgc ccggacatgt ttaaggacat gcacgaacat 660 gcaaagcgct gaacgcgtgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 720 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 780 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 840 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 900 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 960 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1020 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1080 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1140 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1200 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 1260 acaggatccg ccgccaccat ggctctgccc gtcaccgccc tgctgctgcc cctggctctg 1320 ctgctgcacg ctgcccgccc tcaggtccag ctggtcgaaa gtgggggagg cctggtgcag 1380 ccaggaggct ccctgcggct gtcttgcgca gcaagcggaa gagcattctc cacctacttt 1440 atggcctggt tcaggcaggc acctggaaag gagagggagt ttgtggcagg aatcgcatgg 1500 tctggaggaa gcacagcata cgccgactct gtgaagggca ggttcaccat cagccgcgat 1560 aacgccaaga atacactgta tctgcagatg aactctctgc gggccgagga caccgccgtg 1620 tactattgcg cccggagagg catcgaggtg gaggagtttg gagcatgggg acagggaacc 1680 atggtgacag tgagctccgg aggaggaggc agccaggtgc agctggtgga gtccggcggc 1740 ggcctggtga agccaggagg ctccctgagg ctgtcttgtg cagcatccta ctctacatat 1800 agcaactact atatgggctg gtttagacag gcaccaggaa agggcctgga gagcgtgtcc 1860 atcatctcta gcgacaccac aatcacctac aaggatgccg tgaagggccg gttcacaatc 1920 agccgggaca acgccaagaa tagcctgtac ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat 1980 accgccgtgt actattgtgc ccgctggact tcagattgga gcgtcgccta ctgggggcag 2040 gggacactgg tgaccgtgag cagcactagt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 2100 ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 2160 gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 2220 cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 2280 cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 2340 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 2400 ctgggtgaaa atttgtattt tcaatctggt ggtgacacac aagctctgtt gaggaatgac 2460 caggtctatc agcccctccg agatcgagat gatgctcagt acagccacct tggaggaaac 2520 ggtggttctg gtgagaggcc accacctgtt cccaacccag actatgagcc catccggaaa 2580 ggccagcggg acctgtattc tggcctgaat cagagaggtg gttctggtga caagcagact 2640 ctgttgccca atgaccagct ctaccagccc ctcaaggatc gagaagatga ccagtacagc 2700 caccttcaag gaaacggtgg ttctggtcgg aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct 2760 tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat gtctacagcg acctcaacac acagggtggt 2820 tctggttaa 2829 <210> 51 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIV Nef M116 amino acid sequence <400> 51 Met Gly Ser Ser Asn Ser Lys Arg Gln Gln Gln Gly Leu Leu Lys Leu 1 5 10 15 Trp Arg Gly Leu Arg Gly Lys Pro Gly Ala Asp Trp Val Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Pro Leu Ile Gly Gln Ser Ser Thr Val Gln Glu Glu Cys Gly Lys 35 40 45 Ala Leu Lys Lys Ser Trp Gly Lys Gly Lys Met Thr Pro Asp Gly Arg 50 55 60 Arg Leu Gln Glu Gly Asp Thr Phe Asp Glu Trp Asp Asp Asp Glu Glu 65 70 75 80 Glu Val Gly Phe Pro Val Gln Pro Arg Val Pro Leu Arg Gln Met Thr 85 90 95 Tyr Lys Leu Ala Val Asp Phe Ser His Phe Leu Lys Ser Lys Gly Gly 100 105 110 Leu Asp Gly Ile Tyr Tyr Ser Glu Arg Arg Glu Lys Ile Leu Asn Leu 115 120 125 Tyr Ala Leu Asn Glu Trp Gly Ile Ile Asp Asp Trp Gln Ala Tyr Ser 130 135 140 Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Arg Val Phe Gly Phe Cys Phe Lys 145 150 155 160 Leu Val Pro Val Asp Leu His Glu Glu Ala Arg Asn Cys Glu Arg His 165 170 175 Cys Ala Ala His Pro Ala Gln Met Gly Glu Asp Pro Asp Gly Ile Asp 180 185 190 His Gly Glu Val Leu Val Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Val Glu 195 200 205 Tyr Arg Pro Asp Met Phe Lys Asp Met His Glu His Ala Lys Arg 210 215 220 <210> 52 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES nucleic acid sequence <400> 52 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60 gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540 gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccaca 585 <210> 53 <211> 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Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> 'GSGGS' can be repeated at least one time <400> 55 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(4) <223> 'GGGS' can be repeated at least one time <400> 56 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 57 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> 'GGGGS' can be repeated at least one time <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 59 Asp Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 60 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<213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 66 Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro 1 5 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 67 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 68 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 15 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 69 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 70 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker amino acid sequence <400> 71 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA 269AS34822H1/H3 VHH CDR2 amino acid sequence <400> 72 Ala Ile Ser Ser Asp Thr Thr Ile Thr Tyr Lys Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15

Claims (41)

  1. 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로서,
    (a) 제1 BCMA 결합 모이어티 및 제2 BCMA 결합 모이어티를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서, 상기 제1 BCMA 결합 모이어티는 제1 항-BCMA 단일 도메인 항체이고, 상기 제2 BCMA 결합 모이어티는 제2 항-BCMA sdAb이고; 상기 제1 sdAb 및 제2 sdAb의 각각은 VHH 도메인인, 상기 세포외 항원 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하되,
    (i) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고; 그리고
    (ii) 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는, 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, 선택적으로,
    (1) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (2) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (3) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (4) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (5) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (6) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (7) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (8) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (9) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (10) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (11) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (12) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (13) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (14) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (15) 상기 제1 항-BCMA sdAb는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항-BCMA sdAb는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 항-BCMA sdAb는 상기 제2 항-BCMA sdAb의 N-말단에 있거나; 또는 상기 제1 항-BCMA sdAb는 상기 제2 항-BCMA sdAb의 C-말단에 있는, CAR.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군에서 선택된 분자로부터 유래된, CAR.
  5. 제4항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래된, CAR.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  7. 제6항에 있어서, 상기 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ로부터 유래된, CAR.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 키메라 신호전달 도메인("CMSD")을 포함하되, 상기 CMSD는 하나 이상의 링커 ("CMSD 링커")에 의해 선택적으로 연결되는 복수의 면역-수용체 타이로신 기반 활성화 모티프("CMSD ITAM")를 포함하고, 선택적으로 상기 CMSD는 N-말단에서 C-말단까지: 선택적 N-말단의 서열 - CD3δ ITAM - 선택적 제1 CMSD 링커 - CD3ε ITAM - 선택적 제2 CMSD 링커 - CD3γ ITAM - 선택적 제3 링커 - DAP12 ITAM - 선택적 C-말단의 서열을 포함하는, CAR.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CMSD는 서열번호　53의 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  11. 제10항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 분자로부터 유래되되, 선택적으로 상기 공자극 신호전달 도메인은 CD28의 세포질 도메인 및/또는 CD137의 세포질 도메인을 포함하는, CAR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인의 상기 C-말단과 상기 막관통 도메인의 상기 N-말단 사이에 위치된 힌지 도메인을 더 포함하되, 선택적으로 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된, CAR.
  13. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 상기 N-말단에 위치된 신호 펩타이드를 더 포함하되, 선택적으로 상기 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된, CAR.
  14. 서열번호 23 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR).
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단리된 핵산은 서열번호 35 내지 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  17. 제16항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 CAR, 제15항 또는 제16항의 단리된 핵산 또는 제17항의 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포인, 조작된 면역 효과기 세포.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 외인성 Nef 단백질을 더 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질은 SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef 및 이들의 아형으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조작된 면역 효과기 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질은 야생형 Nef인, 조작된 면역 효과기 세포.
  23. 제20항에 있어서, 상기 외인성 Nef 단백질은 돌연변이체 Nef인, 조작된 면역 효과기 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 돌연변이체 Nef는 미리스토일화 부위, N-말단의 α-나선구조, 타이로신-기반 AP 보충(recruitment), CD4 결합 부위, 산성 클러스터, 프롤린-기반 반복부, PAK 결합 도메인, COP I 보충 도메인, 다이-류신 기반 AP 보충 도메인, V-ATPase 및 Raf-1 결합 도메인 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 돌연변이체 Nef는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 SIV Nef(돌연변이체 SIV Nef M116)인, 조작된 면역 효과기 세포.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 유효량의 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제26항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 다발성 골수종(MM)인, 방법.
  30. 항-BCMA 단일 도메인 항체(sdAb)로서
    (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 5 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
    을 포함하는, 항-BCMA 단일 도메인 항체.
  31. 제30항에 있어서, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항-BCMA sdAb.
  32. 제30항에 있어서, 항-BCMA sdAb는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진, 항-BCMA sdAb.
  33. 제30항에 있어서, 항-BCMA sdAb는 낙타과 sdAb인, 항-BCMA sdAb.
  34. 제30항에 있어서, 항-BCMA sdAb는 인간화된 sdAb인, 항-BCMA sdAb.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항-BCMA sdAb를 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 핵산 또는 벡터.
  36. 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    (a) 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항-BCMA sdAb를 포함하는, 세포외 항원 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  37. 제36항의 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 벡터.
  38. 제36항의 CAR, 제37항의 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는, 조작된 면역 효과기 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포인, 조작된 면역 효과기 세포.
  40. 제38항 또는 제39항의 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  41. 유효량의 제38항 또는 제39항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제40항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
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