KR20220112336A

KR20220112336A - 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR20220112336A
Application number: KR1020210015575A
Authority: KR
Inventors: 김혜빈
Original assignee: 김혜빈
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-08-11

Abstract

본 발명은 메밀꿀(F. esculentum honey)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 항산화 관련 인자의 발현을 증가시키고, UV로 인한 피부 노화에도 효능이 있으므로 항산화제로 활용하여 노화 방지에 효능이 있다.
또한, 본 발명의 메밀꿀은 세포 독성 및 피부 부작용이 낮아 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물{Compositon for antioxidation comprising F. esculentum honey}

본 발명은 메밀꿀(F. esculentum honey)을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

외부 환경으로부터 신체를 보호 및 구별하고, 서로 다른 층과 세포 유형으로 구성된 크고 복잡한 기관을 피부라 한다. 또한 외적인 부분을 화장품을 이용하여 건강하고 아름다운 외모로 인간관계와 사회적 행동에 긍정적인 영향을 나타날 수 있다고 보고되고 있다. 피부는 세포와 그 사이를 채우는 기질로 이루어져 있으며, 우리 몸을 보호하는 장벽 기능이기도 하다. 피부의 가장 큰 구성 요소 중 extracellular matrix (ECM, 세포외기질)은 콜라겐, 프리테오글리칸 및 엘라스틴 같은 거대 분자로 구성된 복잡한 네트워크로 많은 조직이 구조적으로 유지하기 위해 세포와 강하게 상호 작용한다. 피부 표면의 pH는 나이가 들어감에 따라 증가하여 감염에 대한 취약성을 증가시키고, 모든 신체의 기관은 태어나기 전부터 노화 과정이 시작되며, 피부 기능 및 구조적 안정성의 상실은 나이 들수록 불가피하게 진행되면서 환경으로 인해 노화의 징후를 더 한다.

피부 노화는 피부에 내인적(intrinsic), 외인적(extrinsic) 요소로 인해 영향 미치는 복잡한 생물학적 현상이다. 내인적 노화는 자연스러운 생기학적 현상으로 피부 두께 감소, 지속적 진피 위축, 건조, 주름, 처짐 및 황반변성 등 퇴행 과정으로 나타나며, 나이가 들어감에 따라 노화의 정도는 가시적으로 나타난다. 따라서 피부 노화에 따른 개선과 방지하기 위해 화장품, 의약외품 의약품을 사용함에 따라 고무적인 효능을 얻기 위한 연구가 지속되고 있다. 외인적 노화는 외부 환경적 요인인 ultraviolet (UV) 노출, 공기오염, 영양부족 등으로 인해 진피의 주된 상처와 형태학적 변화를 초래한다. 피부 노화의 경우 내인적 과정보다는 외인적 과정을 통해 많은 영향을 받으며, 특히 UV 노출로 진피 세포의 손상과 동시에 콜라겐이 분해되어 새로운 콜라겐 합성이 중단되는데 이 과정을 광노화(photoaging)라 한다.

인간에서 발견되는 가장 풍부한 단백질은 콜라겐이며, 피부 노화 과정에서 나타나는 변화는 콜라겐 섬유의 양적과 구조학적인 변화이다. 피부가 젊을수록 콜라겐 섬유는 풍부하며, 구조적으로 잘 정리되어 있는 반면, 피부 노화가 진행된 콜라겐 섬유는 분해되어 정리되어 있지 않다. 진피에서 2개의 상의한 콜라겐 Ⅰ 및 Ⅲ 타입이 발생하며, 콜라겐 Ⅰ 타입은 모든 피부층에서 발견되는 반면, 콜라겐 Ⅲ 타입의 경우 외래 진피 내에서 발견될 수 있다. 콜라겐 유도제인 transforming growth factor-beta (TGF-β)는 콜라겐 분비의 강력한 자극제이며, 콜라겐 생성을 증가시킨다. UV에 의한 TGF-β 감소는 피부 손상을 초래하고, 콜라겐 섬유 구조가 조직화되지 않은 것처럼 보이며, 진피에서 콜라겐 손실 영역이 차이나는 것으로 나타났다. 콜라겐 생합성 감소와 콜라겐 분해 증가가 콜라겐 항상성의 이상을 동시에 초래하고, 이는 콜라겐 감소증을 유발한다는 기존 연구들을 통해 보고되어 있으며, 이러한 변화는 노화된 피부에서 임상학적으로 나타나는 탄력 감소와 주름 발생을 초래한다. 광노화의 경우 콜라겐 Ⅰ 및 Ⅲ 타입 합성이 감소 되며, matrix metalloproteinase (MMP)의 지속적인 상승이 초래된다.

단백질 분해 효소인 MMP는 ECM 단백질의 다양한 성분을 분해할 수 있으며, MMP에 의해 ECM이 분해 및 변성하여 피부 노화의 특징인 피부 주름으로 나타난다. TGF-β는 섬유아세포에서 사이토카인 유도된 MMP 유전자 발현을 방지하고, TGF-β가 MMP의 mRNA 및 단백질 수중을 저해제만큼 조절한다. 도메인 구성 및 기질 특이성에 따라 MMP는 collagenases (MMP1, MMP8, MMP13), gelatinases (MMP2, MMP9), stomelysins (MMP3, MMP10, MMP11), matrilysins (MMP7, MMP26), membrane-type (MMP14, MMP15, MMP16)으로 분류된다. MMP1의 경우 콜라겐 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 타입을 분해할 수 있는 collagenases 중 하나이며, MMP3의 경우 여러 ECM 분자를 분해할 수 있는 stromelysins 중 하나이다. 내인적, 외인적 환경으로 인한 MMP1, MMP3의 발현이 유도되어 피부 노화를 촉진시키고, 특히 human dermal fibroblasts (HDFs)에서 MMP1, MMP3가 지속적으로 증가하므로 피부 노화 억제에 있어도 MMP1, MMP3의 발현 감소가 중요하다.

따라서, 약품, 화장품 및 식품 분야에서는 항산화, 광노화 방지 효과를 가지는 기능성 제품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특피 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다. 하지만, 피부 세포에 다른 항산화 및 광노화 방지 효과에 대한 미미한 실적으로 기대할 수 없는 문제점이 있다.

이에 본 발명자는 항산화 효과를 가지면서 인체에 부작용이 적은 새로운 천연 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 메밀꿀의 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거 활성이 증가하고, 세포 독성이 없으며, 콜라겐 생성 및 UV에서도 콜라겐 생성한다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 10-1295336호

본 발명은 상술한 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 광노화 방지용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 항산화 조성물 및 광노화 방지용 조성물을 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 이용하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 과제해결수단으로서, 본 발명에서는 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물 및 광노화 방지용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 메밀꿀은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상 90 중량% 일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 메밀꿀은 1~ 100㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본발명의 일 실시예에 의하면, 상기 메밀꿀은 증류수(distilled water)에 용해된 것일 수 있다.

또한, 본발명의 일 실시예에 의하면, 상기 항산화 조성물 및 광노화 방지용 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 총 페놀화합물 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거 활성이 증가하고, 세포 독성이 없으며, 콜라겐 생성으로 항산화 효과를 가진다. 뿐만 아니라 UV에서도 세포 독성이 없으며, ROS가 감소하여 콜라겐 생성하여 광노화에도 효과를 가진다.

도 1은 본 발명의 메밀꿀의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 메밀꿀의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 메밀꿀의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 메밀꿀의 HaCaT cells에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 메밀꿀의 B16F10 cells에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 메밀꿀의 HDFs에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 메밀꿀이 HDFs에서 COL1A1 및 COL3A1 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 메밀꿀이 HDFs에서 MMP1 및 MMP3 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 메밀꿀이 UVA에 의한 HDFs의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 메밀꿀이 UVB에 의한 HDFs의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 메밀꿀이 UVA에 의한 HDFs의 ROS을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 메밀꿀이 UVB에 의한 HDFs의 ROS을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 메밀꿀이 UVA 조사된 HDFs에 COL1A1 및 COL3A1 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 메밀꿀이 UVA 조사된 HDFs에 MMP1 및 MMP3 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 메밀꿀이 UVB 조사된 HDFs에 COL1A1 및 COL3A1 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 메밀꿀이 UVB 조사된 HDFs에 MMP1 및 MMP3 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

본 발명에서는 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 광노화 방지용 조성물을 제공한다.

상기 "유효성분으로 포함하는" 은 이를 섭취하는 개체에 대한 항산화 또는 광노화 방지 효과를 제공하기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 메밀꿀은 생체 안전성이 우수하므로 당업자가 다양한 변수를 고려하여 양적 상한을 적절히 조정할 수 있다

메밀꿀은 메밀꽃의 밀원으로 얻었으며, 메밀과 연결되어 있다. 메밀은 마디풀과 계통의 글루텐 (gluten)이 없는 곡물이며, 학명은 fagopyrum esculentum (F. esculentum)이다. 메밀에는 단백질, 피토스테롤(phytosterol), 플라보노이드(flavonoid), 티아민(thiamine) 결합 단백질 등 희귀 화합물의 기능 및 특성이 있어 이에 대한 연구와 프리바이오틱(prebiotics) 및 항산화 작용에 대한 연구도 보고되어 왔다. 그 중 메밀의 주요 물질로 알려진 루틴(rutin)과 케르세틴(quercetin)은 플라보노이드 계열로 항산화 기능에 도움되는 것으로 알려져 있으며, 메밀꿀 또한 연구를 통해 이로운 효과가 보고되는 것으로 알려져 있다. 메밀꿀은 매년 9월에서 10월 사이인 가을에 채밀하며, 적갈색 및 암갈색 어두운 색을 띈다. 메밀꿀은 천연 감미료 및 약용으로 이용되는데, 생화학적 특성으로 당, 단백질, 페놀, 수분, 미네랄 등이 있으며, 약 181가지 함유하고 있다. 메밀꿀에 함유되어 있는 항산화 물질로 클로로겐산(chlorogenic acid), 페롤산(ferulic acid), p-쿠마르산(p-Comaric acid), 루틴(rutin), 헤스페레틴(hesperetin) 등이 있다. 밀원별 벌꿀 중 메밀꿀이 페놀화합물 및 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 확인되었고, 이는 벌꿀의 색상과 깊은 상관 관계를 보이고 있는 것으로 알려져 있다. 단엽꿀에 속하는 메밀꿀은 열을 가했을 때 다엽꿀보다 알레르기 유발을 보인 반면, 메밀꿀은 가장 낮은 알레르기 유발성에 대해서 보고되어 있으며, 항균활성, 상처치유, DNA 손상 보호 효과, 항산화, 항염증, 미백 효과를 가지는 기능성 제품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 산업 소재로서 광범위하게 사용되고 있다.

본 발명의 항산화 및 광노화 방지용 조성물의 유효성분인 메밀꿀은 여러 방법으로 희석될 수 있다. 본 발명에서는 일실시예로서, 메밀꿀을 증류수(distilled water (DW))로 용해하여 사용하였다.

본 발명의 조성물에는 메밀꿀이 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 함량이 0.1% 미만일 경우 본 발명의 목적 효과인 항산화, 광노화 방지 효과를 수득할 수 없으며, 90%가 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

또한, 상기 메밀꿀은 1~ 100㎍/ml의 농도로 포함될 수 있고, 메밀꿀은 100㎍/ml의 농도 이하에서만 진피 섬유아세포의 콜라겐을 발현할 수 있다.

본 발명의 메밀꿀을 함유하는 조성물은 항산화, 광노화 방지 효과를 나타내며, 메밀꿀 자체의 항산화력을 평가하기 위해 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH radical 소거 활성을 통해 농도별 비교 측정 결과 세 실험 모두 증가하는 것으로 나타났다.

본 발명의 메밀꿀을 3종류의 피부 세포(HaCaT cells, B16F10 cells, HDFs)에 처리하여 세포 독성 및 독성 유발 농도를 확인한 결과 피부 세포 모두 독성이 나타나지 않았다.

본 발명에서 항노화 평가는 콜라겐 및 콜라겐분해효소 유전자 발현 유무를 확인한 결과 콜라겐은 증가하고, 콜라겐분해효소는 감소하였다.

본 발명에서 UV 조사(10 J/cm²UVA, 20 mJ/cm² UVB)를 통해 메밀꿀이 3종류의 피부 세포(HaCaT cells, B16F10 cells, HDFs)에서도 피부 세포 모두 독성이 나타나지 않았다.

본 발명에서 광노화의 원인 중 UV가 세포 대사 과정 중에 발생하는 ROS 활성되므로, HDFs에 UVA, UVB를 조사하여 메밀꿀을 처리한 결과 UV 모두 대조군 대비 감소하는 것으로 나타났다.

본 발명에서 메밀꿀 처리 유무에 따라 UV에 의해 콜라겐 감소 억제능이 존재하는지 확인한 결과 UV에 의해 유도되는 콜라겐 유전자 발현 감소를 현저히 증가 회복시키는 효과가 있으며, 콜라겐분해효소 유전자 발현 증가를 현저히 감소시키는 효과가 있다.

본 발명의 구체적인 하나의 실시양태에 따르면, 항산화 조성물 및/또는 광노화 방지용 조성물을 약학조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 분야의 통상적 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 칼셉제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 항산화 조성물 및/또는 광노화 방지용 조성물을 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

화장료 조성물로 제제화되는 경우, 상기 항산화 조성물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%이며, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%이다. 최소한의 자외선에 의한 피부 손상 개선 효과를 달성할 수 있도록 메밀꿀의 함량은 상기 최소치 이상인 것이 바람직하며, 과량 첨가에 따른 사용감 저하 및 각종 제형에의 적용 가능성을 고려하여 메밀꿀은 상기 최대치 이하인 것이 바람직하다. 이때, 상기 메밀꿀의 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 성분들의 함량에 따라 상기 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 메밀꿀 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영향크림, 수렴 화장수, 유연 화장수 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨태 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이드, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 그리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 항산화 조성물 및/또는 광노화 방지용 조성물을 식품 조성물로 이용할 수 있다. 통상적으로, 식품 조성물에 포함되는 메밀꿀의 양은 전체 식품 중량의 0.1~90 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수도 있다.

상기 식품 조성물에는 유효성분으로서 메밀꿀뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식물 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 메밀꿀 이외에 구연산, 액상 과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 한약 추출물 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 메밀꿀은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

<재료준비>

(1) 세포

실험에 사용된 HaCaT은 American Type culture Collection (ATCC; USA)사에서 구입하였고, B16F10는 ATCC 사에서 구입하였으며, HDFs는 Lonza (Basel, Switzerland)사에서 구입하였다.

(2) 추출물

실험에 사용된 메밀꿀은 강원도 평창군 봉평면 지역에서 채밀할 것으로 사용하였고, distilled water (DW)에 용해하여 사용하였다.

(3) 시약

사용된 시약은 TGF-β (Sigma-Aldrich, USA), 2N Folin-Ciocalteau' s phenol reagent (Sigma-Aldrich), caffeic acid (Sigma-Aldrich), Na2CO3 (Fluka, UK), quercetin (Sigma-Aldrich), AlCl3 (Daejung, Korea), NaOH3 (DUKSAN, Korea), 2, 2-depheny-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich), EpiLifeTM Medium, with 60 μM calcium (Gibco, USA), EpiLifeTM Defined Growth Supplement (EDGS; Gibco), RPMI 1640 Medium (Biowest, France), penicillin/streptomycin (P/S; Sigma-Aldrich), Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM; Biowest), Fetal Bovine Serum (FBS; Biowest), EZ-cytox cell viability assay kit reagent (ITSBio, Korea), 2' , 7' -dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA; Sigma-Aldrich), RiboExTM Total RNA Isolation Solution (GeneAll Biotechnology, Korea), chloroform (Sigma-Aldrich), isopropyl alcohol (Merck Millipore), Nuclease Free Water (Affymetrix, USA), Oligo dT (Bionics, Korea), dNTP mixture (Takara, Korea), 0.1M DTT (Invitrogen, USA), 5×First Stand Buffer (Invitrogen), M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen), ethanol (Merck Millipore, Germany), SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, USA) 등을 사용하였다.

(4) 기기

사용된 기기는 iMark micro plate reader (#1681130; Bio-Rad, USA), Vilber BIO-LINK BLX Crosslinker (BLX-254; Vilber Lourmat, France), UV Illuminator (UV-1000; BoTeck, Korea), Fluorescence Microplate Reader (SpectraMax Gemini XPS/EM; Molecular Devices LLC, USA), MaestroNano® Micorovolume Spertropho tometer (MN-913; Maetrogen, USA), GenePro Thermal Cycle (BIOER, China), StepOne Plus Real-Time PCR System (4379216; Thermo Fisher Scientific) 등을 사용하였다.

(5) 통계처리

모든 실험은 평균 ± 표준편차로 세 번의 독립적인 반복 실험을 실시하여 결과 값을 나타냈다. 각 실험에 관하여 Student' s t-test 방법(양측검정, 등분산)을 이용하여 통계적 유의성 및 p-value를 나타내어 분석하였고, 유의적인 값을 p < 0.05 이하일 경우 *(#)로 표시하여 통계적으로 유의하다고 검정하였다.

<실시예 1> 메밀꿀 제조

메밀꿀과 DW는 500 ㎎/ml의 양을 용해하여, -20℃에 보관하여 사용하였다.

<시험예 1> 메밀꿀 항산화력 효능 시험

(1) 총 폴리페놀 함량 측정

메밀꿀의 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 응용하여 측정하였다. 메밀꿀을 DW로 희석한 후 농도별 시료에 2N Folin-Ciocalteau' s phenol reagent를 분주하여 5분 동안 반응시킨 다음, 1% Na2CO3 분주하여 암실에서 1시간 동안 반응시켜 iMark microplate reader에 750 nm의 파장으로 설정하여 흡광도를 측정한 결과값을 결정하였다. 총 폴리페놀 함량은 caffeic acid 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 μg CAE/ml을 사용하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.

메밀꿀에 존재하는 총 폴리페놀 함량을 caffeic acid를 표준물질로 하여 측정한 결과, 표 1과 같이 메밀꿀은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 메밀꿀의 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 메밀꿀이 농도 의존적으로 증가함을 보였다.

(2) 총 플라보노이드 함량 측정

메밀꿀의 플라보노이드 함량은 Zhishen과 Dewanto 방법을 응용하여 측정하였다. 메밀꿀을 DW로 희석한 후 농도별 시료에 5% Na2CO2 분주하여 5분 동안 반응시키고, 10% AlCl3 분주하여 6분 동안 반응시킨 다음 1M NaOH3 분주한 후 DW를 넣어 피펫팅하였다. iMark microplate reader에 415 nm의 파장으로 설정하여 흡광도를 측정한 결과값을 결정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 μg QCT/ml을 사용하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

메밀꿀에 존재하는 총 플라보노이드 함량을 quercetin을 표준물질로 하여 측정한 결과, 표 2와 같이 메밀꿀은 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2은 본 발명의 메밀꿀의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 메밀꿀이 농도 의존적으로 증가함을 보였다.

(3) 2, 2-depheny-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거 활성 측정

자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법이다. 메밀꿀을 DW로 희석한 후 농도별 시료에 0.2 mM의 DPPH 용액을 시료에 분주하여 30분 동안 반응시키고, iMark microplate reader에 517 nm의 파장으로 설정하여 흡광도를 측정한 결과값을 결정하였다. DPPH radical 소거율은 수학식 1에 따라 계산하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3은 본 발명의 메밀꿀의 DPPH radical 소거율을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 메밀꿀이 농도 의존적으로 증가함을 보였다.

<실시예 2> 세포 배양

(1) HaCaT 세포 배양

동결된 HaCaT cells를 15ml 튜브에 옮기고 PBS 7ml을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 EpiLifeTM Medium, with 60 μM calcium에 EpiLifeTM Growth Supplement가 포함된 배지 1ml을 넣어 부유시켰다. 75cm2 cell culture flask에 8ml의 배지를 넣고, 부유시켜 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 3회 이상으로 하였고, 시료들은 처리하기 전에 24시간 적응시켰다.

(2) B16F10 세포 배양

동결된 B16F10 cells를 15ml 튜브에 옮기고 PBS 7ml을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 10% FBS와 1% penicillin으로 조성된 RPMI 1640 배지 1ml을 넣어 부유시켰다. 75cm2 cell culture flask에 8ml의 배지를 넣고, 부유시켜 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 3회 이상으로 하였고, 시료들은 처리하기 전에 24시간 적응시켰다.

(3) HDFs 세포 배양

동결된 HDFs를 15ml 튜브에 옮기고 PBS 7ml을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1200 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 세포가 있는 튜브에 10% FBS로 조성된 DMEM 배지 1ml을 넣어 부유시켰다. 75cm2 cell culture flask에 8ml의 배지를 넣고, 부유시켜 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 3회 이상으로 하였고, 시료들은 처리하기 전에 24시간 적응시켰다.

<시험예 2> 세포 독성 측정

HaCaT cells와 B16F10 cells, HDFs를 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 실험을 하기 전 새로운 배양액을 교체하였고, 메밀꿀의 농도별 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 μL의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 30분간 반응시킨 후 450 nm와 650 nm의 파장에서 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과는 도 4, 5, 6에 나타내었다. 도 4는 본 발명의 메밀꿀의 HaCaT cells에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 대조군이 세포 생존율 100% 대비 100.20%, 100%, 99.46%, 98.97%, 99.78%, 93.00% 농도순으로 세포독성이 나타나지 않았다.

도5는 본 발명의 메밀꿀의 B16F10 cells에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 대조군이 세포 생존율 100% 대비 104.02%, 103.34%, 104.75%, 105.26%, 102.26%, 98.86% 농도순으로 HaCaT cells에서 나타난 독성결과와 비슷하게 세포독성이 나타나지 않았다.

도 6은 본 발명의 메밀꿀의 HDFs에서 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 대조군이 세포 생존율 100% 대비 100.88%, 104.01%, 103.80%, 105.03%, 107.49%, 109.10% 농도순으로 세포독성이 나타나지 않았다.

<시험예 3> 메밀꿀의 항산화 효능 평가 ( in vitro )

HDFs의 콜라겐 유전자 유전자 및 콜라겐분해효소 유전자 발현 확인

사람 진피 섬유아세포주인 HDFs는 10% FBS로 조성된 DMEM 배지를 사용하여 세포배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 배양한 HDFs를 60mm plate에 분주하여 24시간 동안 배양하여 농도별 메밀꿀을 처리하고, 24시간 동안 세포배양(37℃ 5% CO₂)한 세포는 RiboExTM Total RNA Isolation Solution을 이용하여 scraper로 세포 용해한 후, chloroform을 넣어 원심 분리(4℃, 12000 rpm)한다. RNA가 있는 상층액에 isopropyl alcohol을 상층액 동양만큼 넣어 원심 분리(4℃, 12000 rpm)한 후, RNA 침전물을 제외한 상층액은 버린다. 남아있는 침전물에 75% ethanol 넣어 원심 분리하여 세척 후 ethanol을 제거하고, Nuclease Free Water로 용해하여 MaestroNano® Micorovolume Spertropho tometer A260/A280 파장에서 RNA의 순도와 농도를 측정하였다.

cDNA는 RNA, DW, Oligo dT, dNTP mixture를 PCR tube에 넣어 GenePro Thermal Cycle에 65℃, 5 min 돌린 후 0.1M DTT, 5×First Stand Buffer, M-MLV Reverse Transcriptase 넣어 GenePro Thermal Cycle에 37℃ 50 min, 70℃ 15 min 설정하여 반응시켰다.

메밀꿀에 의한 HDFs 내에 일어난 유전자 발현 분석은 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 방법으로 하였다. 실험에 사용된 primer 정보는 표 3에 기재하였으며, matrix metalloproteinase (MMP)는 콜라겐분해효소를 의미한다.

그 결과, 도 7, 8에 나타난 것과 같이 메밀꿀을 처리하였을 때 콜라겐 유전자의 발현이 대조군 대비 증가됨을 확인하였다. 특히, 50 μg/mL 메밀꿀 처리 시 COL1A1 mRNA 발현은 대조군 대비 114.35 ± 2.10% 증가함을 확인하였으나, COL3A1 mRNA 발현은 대조군 대비 149.76 ± 9.79% 현저하게 증가하였다. 메밀꿀을 처리하였을 때 콜라겐 분해효소의 발현이 대조군 대비 현저하게 감소됨을 나타났다. 특히, 50 μg/mL 메밀꿀 처리 시 MMP1 mRNA 발현은 대조군 대비 85.21 ± 1.15% 감소함을 확인하였으나, MMP3 mRNA 발현은 대조군 대비 60.97 ± 3.82% 현저하게 감소하였다. 실험 결과를 바탕으로 메밀꿀은 HDFs 내 콜라겐 발현을 증가시키고, 콜라겐 분해효소 발현을 감소시켜 피부 항노화의 소재 가능성을 제시하였다.

도 7은 HDFs에 메밀꿀을 처리하였을 때 콜라겐 유전자 발현력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 HDFs에 메밀꿀을 처리하였을 때 콜라겐분해효소(MMP) 유전자 발현력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

<시험예 4> 메밀꿀이 UV에 의한 HDFs의 세포 독성 측정

HDFs를 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 농도별 메밀꿀 전처리 4시간 처리하고, UV로 조사하여 후처리 over night한 후 10 μL의 WST solution을 첨가하여 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 30분간 반응시킨 후 450 nm와 650 nm의 파장에서 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과는 도 9, 10에 나타내었다. 도 9는 본 발명의 10 J/cm2 UVA는 세포에 조사하여 메밀꿀을 처리한 결과 음성 대조군 대비 20 μg/mL은 6.08% 증가하였고, 50 μg/mL은 11.65% 증가하였으며, 100 μg/mL은 15.72% 증가하였다.

도 10은 본 발명의 20 mJ/cm2 UVB는 세포에 조사하여 메밀꿀을 처리한 결과 음성 대조군 대비 20 μg/mL은 5.83% 증가하였고, 50 μg/mL은 12.02% 증가하였으며, 100 μg/mL은 17.19% 증가하였다(Figure 3-20). 본 실험 결과 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 세포 독성이 나타나지 않았다. 추후 세포 처리농도는 20-100 μg/mL으로 하여 다음 실험을 진행하였다.

<시험예 5> 메밀꿀이 UV에 의한 HDFs 내 ROS 생성 측정

피부 노화를 촉진시키는 UV가 세포 대사 과정 중에 발생하는 ROS를 활성시키므로, 메밀꿀이 세포 내 ROS 활성에 미치는 영향을 확인하였다. HDFs를 96-well plate에 분주하여 세포배양기에 18 h 배양 후, 시료 농도에 맞게 pre-treat하여 6 h 세포배양기에 배양하였고, PBS를 넣어 UV 조사한 후 post-treat하여 1 h 세포배양기에 배양하였다. 다시 PBS로 wash하여 10 μM DCF-DA를 분주하고, 1 h 세포배양기에서 반응시킨 후 PBS를 넣어 Fluorescence Microplate Reader 설정을 Ex는 481, Em은 538로 설정하여 측정한 뒤 결과 값을 결정하였다.

그 결과는 도 11, 12에 나타내었다. 도 11은 본 발명의 메밀꿀이 UVA에 의한 HDFs 내 음성 대조군 대비 20 μg/mL에서 22.33 ± 1.05%, 50 μg/mL에서 40.26 ± 13.01%, 100 μg/mL에서 56.66 ± 10.99% ROS 감소 효과를 확인하였다.

도 12는 본 발명의 메밀꿀이 UVB에 의한 HDFs 내 음성 대조군 대비 20 μg/mL에서 23.01 ± 1.54%, 50 μg/mL에서 38.42 ± 7.74%, 100 μg/mL에서 57.90 ± 3.37% ROS 감소 효과를 확인하였다. 본 실험 결과 메밀꿀이 ROS 감소하는 효과가 있는 것으로 사료되므로 추후 세포 처리농도는 20-50 μg/mL으로 하여 다음 실험을 진행하였다.

<시험예 6> 메밀꿀이 UVA 조사된 HDFs에 항산화 효능 평가

피부의 외인성 노화의 주요한 원인 물질로는 UV가 존재하며, 지속적인 UVA의 노출은 피부 진피층에 존재하는 HDFs의 콜라겐 발현량 감소 및 콜라겐 분해효소 발현 증가를 유도하여 ECM을 분해한다. HDFs 내 UVA를 조사하여 콜라겐 발현 감소 및 콜라겐 분해효소 발현 증가를 유도한 후, 메밀꿀 처리 유무에 따라 UVA에 의한 콜라겐 감소를 억제하는지 평가하였다. HDFs에 메밀꿀 20-50 μg/mL을 6 h pre-treat한 후, UVA를 세포에 조사하였으며, 이후 메밀꿀 20-50 μg/mL을 24 h post-treat하여 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현량과 MMP1, MMP3 mRNA의 발현량을 qRT-PCR로 분석하였다.

그 결과는 도 13, 14에 나타내었다. 도 13은 본 발명의 메밀꿀이 UVA에 의한 HDFs 내 COL1A1 및 COL3A1 mRNA의 발현을 67.47 ± 1.69% 및 82.63 ± 2.56% 감소 시켰으나, 50 μg/mL 처리 시 COL1A1 mRNA의 발현이 음성 대조군 대비 15.88 ± 2.36% 증가되어 나타났으며, COL3A1 mRNA의 발현은 10.25 ± 0.78% 증가되어 나타났다.

도 14는 본 발명의 메밀꿀이 UVA에 의한 HDFs 내 MMP1 및 MMP3 mRNA의 발현을 99.40 ± 14.27% 및 147.46 ± 4.55% 증가시켰으나, 50 μg/mL 처리 시 MMP1 mRNA의 발현이 음성 대조군 대비 45.78 ± 10.75% 감소되어 나타났으며, MMP3 mRNA의 발현은 146.80 ± 6.15% 감소되어 나타났다. 본 연구 결과를 통해 메밀꿀은 UVA에 의한 피부 세포 내 콜라겐 발현량 감소를 억제하는 효능이 존재함을 밝혔다.

<시험예 7> 메밀꿀이 UVB 조사된 HDFs에 항산화 효능 평가

피부의 외인성 노화의 주요한 원인 물질로는 UV가 존재하며, 지속적인 UVB의 경우 파장이 짧지만 에너지가 강해 반복적으로 조사되면 광생물학적 영향으로 인체 화상 및 HDFs까지 손상을 일으킬 수 있다.

HDFs 내 UVB를 조사하여 콜라겐 발현 감소 및 콜라겐 분해효소 발현 증가를 유도한 후, 메밀꿀 처리 유무에 따라 UVB에 의한 콜라겐 감소를 억제하는지 평가하였다. HDFs에 메밀꿀 20-50 μg/mL을 6 h pre-treat한 후, UVB를 세포에 조사하였으며, 이후 메밀꿀 20-50 μg/mL을 24 h post-treat하여 COL1A1, COL3A1 mRNA의 발현량과 MMP1, MMP3 mRNA의 발현량을 qRT-PCR로 분석하였다.

그 결과는 도 15, 16에 나타내었다. 도 15는 본 발명의 메밀꿀이 UVB에 의한 HDFs 내 CCOL1A1 및 COL3A1 mRNA의 발현을 77.29 ± 2.11% 및 68.19 ± 2.24% 감소 시켰으나, 50 μg/mL 처리 시 COL1A1 mRNA의 발현이 음성 대조군 대비 30.98 ± 3.47% 증가되어 나타났으며, COL3A1 mRNA의 발현은 68.19 ± 2.24% 증가되어 나타났다.

도 16은 본 발명의 메밀꿀이 UVB에 의한 HDFs 내 MMP1 및 MMP3 mRNA의 발현을 72.66 ± 10.38% 및 54.38 ± 15.11% 증가시켰으나, 50 μg/mL 처리 시 MMP1 mRNA의 발현이 음성 대조군 대비 35.12 ± 14.67% 감소되어 나타났으며, MMP3 mRNA의 발현은 41.08 ± 3.17% 감소되어 나타났다. 본 연구 결과를 통해 메밀꿀은 UVB에 의한 피부 세포 내 콜라겐 발현량 감소를 억제하는 효능이 존재함을 밝혔다.

이하, 본 발명의 조성물을 함유하는 식품 조성물의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제조예 1>

메밀꿀 200 ㎎

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 10 ㎎

비타민 B 1 013 ㎎

비타민 B 2 015 ㎎

비타민 B 6 05㎎

비타민 B 12 02 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴10 ㎍

니코틴산아미드 17 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 05 ㎎

황산제1철 175 ㎎

산화아연 082 ㎎

탄산마그네슘 253 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 248 ㎎

<제조예2: 크림>

메밀꿀 조성물을 포함하는 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

메밀꿀: 1중량%

친유형 모노스테아린산글리세린: 2중량%

세테아릴알콜: 2중량%

스테아린산: 15중량%

폴리솔베이트 60: 15중량%

솔비탄스테아레이트: 06중량%

하이드로제네이티드 폴리이소부텐: 1중량%

스쿠알란: 3중량%

광물유: 5중량%

사이클로메치콘: 5중량%

디메치콘: 1중량%

초산토코페롤: 05중량%

글리세린: 5중량%

베타인: 3중량%

트리에탄올아민: 1중량%

산탄검: 005중량%

향: 적량

방부제: 적량

색소: 적량

증류수: 잔량

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였는데, 본 발명의 기술적 범위는 상술한 실시예 및 도면들에 기재된 내용으로 한정되는 것은 아니며, 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 수정 또는 변경된 등가의 구성은 본 발명의 기술적 사상의 범위를 벗어나지 않는 것이라 할 것이다.

Claims

메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 메밀꿀은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 중량% 이상 90 중량% 이하인 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 메밀꿀은 1~ 100㎍/ml의 농도로 포함되는 항산화 조성물.
제1항에 있어서,
상기 메밀꿀은 증류수(distilled water)에 용해된 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
메밀꿀을 유효성분으로 포함하는 광노화 방지용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 이용되는 것인, 항산화 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 이용되는 것인, 광노화 방지용 조성물.