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KR20220092557A - 펩티드-나노입자 접합체 - Google Patents

펩티드-나노입자 접합체 Download PDF

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KR20220092557A
KR20220092557A KR1020227018078A KR20227018078A KR20220092557A KR 20220092557 A KR20220092557 A KR 20220092557A KR 1020227018078 A KR1020227018078 A KR 1020227018078A KR 20227018078 A KR20227018078 A KR 20227018078A KR 20220092557 A KR20220092557 A KR 20220092557A
Authority
KR
South Korea
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dendrimer
peptide
nanoparticle
hairpin
multivalent
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227018078A
Other languages
English (en)
Inventor
홍승표
정우진
Original Assignee
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2019/058463 external-priority patent/WO2020092304A1/en
Application filed by 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션, 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 filed Critical 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Publication of KR20220092557A publication Critical patent/KR20220092557A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본원에서 다가 나노입자 코어에 접합된 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 다가 나노입자 코어를 포함하는 나노입자 시스템이 개시된다. 또한 약학적 조성물 및 상기 나노입자 시스템을 제조하는 방법이 포함된다. 추가로 상기 나노입자 시스템을 인간 암 환자와 같은, 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역치료 방법이 포함된다.

Description

펩티드-나노입자 접합체
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 10월 29일에 출원된 PCT/US2019/058463의 일부 계속 출원이며, 2019년 10월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/927,293호에 대한 우선권을 주장하고, 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 치료적 β-헤어핀 펩티드의 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
항체는 표적 물질에 대한 높은 친화성 및 선택성 때문에, 면역요법을 포함한 많은 적용에서 결합 리간드로서 성공적으로 사용되었다. 그러나 단백질의 본질적인 단점인 낮은 열역학적 안정성 및 높은 제조 비용은 일상적인 적용에 장애가 되었다. 또한, 많은 표면 관능기 (예: 아민, 카복실, 하이드록실 및 설프하이드릴 기)를 함유하는 단백질은 종종 부위-특이적 화학 반응에 적합하지 않기 때문에, 첨단 나노생명공학 응용 분야에서의 사용을 제한한다. 이러한 문제를 해결하기 위한 한 가지 잠재적 접근 방식은 소분자 및 단백질의 유용한 특성을 갖는 펩티드를 구현하는 것이다. 라이브러리 스크리닝 및 구조-기반 분자 디자인과 같은 펩티드 디자인 전략의 발전으로, 표적 결합에서 단백질을 능가할 수 있는 인공 펩티드의 개발을 촉진하였다. 또한, 펩티드는 비용-효율적인 화학적 접근 방식인, 고체상 펩티드 합성 (한 번에 하나의 아미노산 접합)을 통해 합성할 수 있어서, 아미노산 조성 및 거대분자 토폴로지를 쉽고 정확하게 조정할 수 있다.
펩티드는 단백질에 대한 유망한 대안이지만, 짧은 펩티드의 표적 결합 친화도는 일반적으로 단백질의 표적 결합 친화도보다 더 낮다. 또한, 펩티드는 단백질 환경 (protein contexts)으로부터 분리되는 경우, 물리화학적 특성에 상당한 영향을 미치는 고유한 폴딩 구조 (folding structures)를 유지하지 않는다.
β-헤어핀 펩티드의 전달을 위한 새로운 조성물 및 방법이 필요하다.
간단한 요약
일 양상에서, 나노입자 시스템 (nanoparticle system)은 다가 나노입자 코어 (multivalent nanoparticle core)에 접합된 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 다가 나노입자 코어를 포함한다.
다른 양상에서, 약학적 조성물은 상기 나노입자 시스템 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
또 다른 양상에서, 나노입자 시스템을 제조하는 방법은 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 다가 나노입자 코어에 접합시켜서 나노입자 시스템을 제공하기에 충분한 조건하에 다수의 반응성 말단기를 포함하는 다가 나노입자 코어를 하나 이상의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 면역치료 방법은 상기 나노입자 시스템을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 PD-1/PD-L1 길항제로서 다가 덴드리머 펩티드 접합체의 개발 과정의 개략도를 나타낸다.
도 2는 PD-1, 조작된 PD-1의 구조, 및 PD-L1을 표적으로 하는 상이한 펩티드 구조들을 나타낸다. 서열번호: 1은 βH1-wt 서열이고, 서열번호: 2는 βH1-돌연변이체 서열이며, 서열번호: 3은 βH2-wt 서열이고, 서열번호: 4는 βH2-wt 서열이다. 결합 표면은 강조 표시하였다 (리본).
도 3은 βH2_mt 펩티드, G7 PAMAM 덴드리머, 및 PD-1/PD-L1 계면 간의 크기 비교를 보여주며, 이는 덴드리머 표면이 다수의 펩티드를 결합을 위한 충분한 공간적 거리만큼 분리하여 수용하는 것을 나타낸다.
도 4는 고정된 PD-L1 단백질에 대한 G7-βH2_mt (A), G7-βH2_wt (B), G7-βH1_mt (C), 및 완전히 아세틸화된 덴드리머 (D)의 결합에 대한 SPR 센서그램 (sensorgrams)을 나타낸다.
도 5는 PD-L1에 대한 90% (A), 80% (B) 및 60% (C) 아세틸화된 덴드리머를 사용한 G7-βH2_mt 접합체의 결합에 대한 SPR 센서그램을 나타낸다.
도 6은 정량적으로 측정된 결합 역학 (ka: 결합 속도 상수; kd: 해리 속도 상수; K D: 평형 해리 상수)과 함께, PDL1에 대한 G7-βH2_mt 접합체의 농도 의존적 결합 역학을 나타낸다. 곡선 A-D는 각각 45, 90, 180, 270 nM을 나타낸다.
도 7은 정량적으로 측정된 결합 역학 (ka: 결합 속도 상수; kd: 해리 속도 상수; K D: 평형 해리 상수)과 함께, PDL1에 대한 aPD-L1 항체의 농도 의존적 결합 역학을 나타낸다. 곡선 A-D는 각각 25, 50, 100, 200 nM을 나타낸다.
도 8은 정량적으로 측정된 결합 역학 (ka: 결합 속도 상수; kd: 해리 속도 상수; K D: 평형 해리 상수)과 함께, PDL1에 대한 유리 βH2_mt 펩티드의 농도 의존적 결합 역학을 나타낸다. 곡선 A-D는 각각 17, 25, 33, 42 μM을 나타낸다.
도 9는 G7-βH2_mt 접합체 (A), βH2_mt 펩티드 (B) 및 완전히 아세틸화된 덴드리머 (C)의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 G7-βH2_mt 접합체의 FTIR 스펙트럼, 및 β-sheet 및 β-turn 라벨링된 Fourier 자가-디콘볼루션 분석 (self-deconvolution analysis)을 보여준다. 삽도 (Inset): βH2_mt 펩티드 (상단) 및 완전히 아세틸화된 덴드리머 (하단)의 FTIR 스펙트럼.
도 11은 펩티드 폴딩에 대한 엔트로피 비용을 감소시키는 부피 효과가 배제된 개략도를 보여준다.
도 12는 초기에 확장된 βH2_mt (리본 βH2_mt, G5 원자)를 갖는 G5 PAMAM 덴드리머와의 접합 시에 βH2_mt의 폴딩 거동의 MD 시뮬레이션 결과를 보여준다.
도 13은 초기에 폴딩된 βH2_mt (리본 βH2_mt, G5 원자)를 갖는 G5 PAMAM 덴드리머와의 접합 시에 βH2_mt의 폴딩 거동의 MD 시뮬레이션 결과를 보여준다.
도 14는 PD-L1에 대한 fβH2_mt의 결합을 보여준다.
도 15는 fβH2_mt/PD-L1 복합체에 대한 G7-βH2_mt (A), aPD-L1 (B), βH2_mt (C), 및 완전히 아세틸화된 덴드리머 (D)에 대한 경쟁 분석을 보여준다.
도 16은 다수의 PD-L1 단백질에 결합하는 G7-βH2_mt 접합체의 예시이다.
도 17은 G7-βH2_mt로 1시간 동안 처리한 786-O 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다 (로다민으로부터의 형광, 좌측; 명시야 이미지, 우측), 스케일 바 (scale bar): 50 μm.
도 18은 G7-βH2_mt로 1시간 동안 처리한 MCF-7 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다 (로다민으로부터의 형광, 좌측; 명시야 이미지, 우측), 스케일 바: 50 μm.
도 19는 Jurkat T 세포에 의해 인터루킨-2 (IL-2) 분비를 증가시키는 면역 체크포인트 차단의 개략도를 보여준다.
도 20은 다양한 그룹으로 처리한 후에 786-O 및 MCF-7 세포와 공동-배양된 Jurkat T 세포로부터의 IL-2 분비를 보여준다.
도 21은 암 세포의 항암제 저항성 (chemoresistance)을 감소시키는 면역 체크포인트 차단의 개략도를 보여준다.
도 22는 독소루비신 (DOX) 처리 후에 암 세포 생존율을 보여주며, 이는 다양한 그룹과의 인큐베이션 시에 암 세포의 항암제 저항성을 입증한다.
도 23은 β-sheet-풍부한 단백질-단백질 상호작용 계면을 보여준다.
도 24는 단백질 환경으로부터 단리된 펩티드의 폴딩 구조 변화를 보여준다.
도 25는 Trpzip-DPC 시스템에 의한 β-헤어핀 안정화의 개략도를 보여준다.
도 26은 pL1 및 pL1TZ의 펩티드 서열 및 분자 구조를 보여준다.
도 27은 pL1의 CD 스펙트럼을 보여준다.
도 28은 pL1TZ의 CD 스펙트럼을 보여준다.
도 29는 G4-pL1TZ를 보여준다.
도 30은 부피 효과가 배제된 개략도를 보여준다.
도 31은 pL1 (좌측), pL1TZ (중간) 및 G7-pL1TZ (우측)의 PD-L1 결합에 대한 농도 의존적 SPR 센서그램을 나타낸다.
도 32는 pL1, pL1TZ 및 G7-pL1TZ로 1시간 동안 처리한 786-O 및 MCF-7 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다 (로다민으로부터의 형광, 좌측; 명시야 이미지, 우측).
도 33은 4T1 세포주를 접종하고, 유리 IgG, 유리 aPD-L1, G7-PMAM 덴드리머-Cy-5, G7-PMAM 덴드리머-pPD1-펩티드-Cy-5, 또는 유리 pPD1 펩티드로 처리한 암컷 Balb/c 마우스에서 시간의 함수로서 종양 부피를 보여준다.
도 34는 4T1 세포주를 접종하고, 유리 IgG, 유리 aPD-L1, G7-PMAM 덴드리머-Cy-5, G7-PMAM 덴드리머-pPD1-펩티드-Cy-5, 또는 유리 pPD1 펩티드로 처리한 암컷 Balb/c 마우스에서 시간의 함수로서 체중을 보여준다.
도 35는 도 33 및 34의 마우스에 대한 종양 생물발광을 보여준다.
전술한 특징 및 다른 특징은 하기 상세한 설명, 도면 및 첨부된 청구범위로부터 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이다.
상세한 설명
본원에는 단백질 표면으로부터 단리된 β-헤어핀 펩티드 (surface β-hairpin peptide: SβP)에 대한 새로운 조작 접근 방식이 개시된다. 본원에는 SβP를 나노입자 스캐폴드에 접합시켜 이를 구조적으로 안정화시키고, 추가로 펩티드가 다가 결합 효과를 나타내도록 하는 펩티드-나노입자 접합체가 개시된다. 예를 들어, 덴드리머-펩티드 접합체 (Dendrimer-peptide conjugate: DPC)는 펩티드 구조, 특히 β-헤어핀 펩티드에 대한 최소한의 변형으로 펩티드 구조를 안정화시킨다. β-헤어핀 펩티드는 공유 가교 (covalent crosslinking)에 의해 안정화될 수 있다. 그러나 화학적 변형은 전형적으로 펩티드 제조 과정을 복잡하게 하고, 결과적으로 합성 수율을 상당히 감소시킨다. 가닥간 비-공유 결합 (inter-strand noncovalent binding)의 도입은 통상적으로 사용되는 또 다른 전략이다; 그러나 이는 실질적인 아미노산 치환을 필요로 하며, 이는 잠재적으로 펩티드의 물리화학적 특성에 영향을 미친다. 본원에 기재된 나노입자, 예를 들어 DPC 플랫폼은 β-sheet-풍부 단백질 표면을 효과적으로 길항하고 표적화하는 신규한 방법을 제시한다.
단백질 표면에 펩티드 세그먼트를 사용하는 것은 단백질 기능을 활용하는 효율적인 접근 방식이다. 구체적으로, β-헤어핀 펩티드는 수 많은 단백질 상호작용에 2차 구조가 관여하기 때문에 유망하다. 입체형태적 유사성에 기반하여, 헤어핀 구조는 β-sheet-풍부 단백질 표면 (예: PD-1/PD-L1 계면)을 표적으로 하는 길항제 플랫폼으로서 역할을 할 잠재력을 가지며, 그 중 넓고 평편한 기하학적 구조는 일반적으로 소분자 약물이 사용할 수 없다 (도 23). 이러한 표면이 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction: PPI)에 편재하고 단백질 응집-관련 질병의 진행에서 중요한 역할을 하기 때문에, β-sheet-풍부 표면에 의해 매개되는 PPI의 조절은 의약 연구에서 중요하고 어려운 문제이다. 그러나, 펩티드 입체형태는 단백질 환경으로부터 단리되는 경우 쉽게 불안정화되며 (도 24), 이는 표적 결합 효능에 상당한 영향을 미친다. 짧은 혈장 순환 시간 및 프로테아제 소화에 대한 취약성은 펩티드의 또 다른 단점이며, 이는 광범위한 적용을 제한한다.
본원에 설명된 나노입자 시스템의 이점은 높은 수 용해성 (water solubility), 생체적합성 (biocompatibility), 변형 가능한 표면기 (modifiable surface groups), 및 다가성 (multivalency)을 갖는 나노입자 캐리어 (nanoparticulate carriers)의 사용을 포함한다.
일 구체예에서, 나노입자 시스템은 다가 나노입자 코어에 접합된 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 다가 나노입자 코어를 포함한다. 상기 복수 개의 β-헤어핀 펩티드는 동일한 나노입자 코어에 접합된 다수의 동일한 β-헤어핀 펩티드, 또는 상이한 β-헤어핀 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 다가 나노입자 코어는 초분지 폴리머 (hyperbranched polymer), 덴드리머 (dendrimer), 덴드론 (dendron), 혼성 나노입자 (hybrid nanoparticle), 또는 미셀 (micelle)을 포함한다. 상기 다가 나노입자 코어는 예를 들어 3 내지 150 nm의 직경을 가질 수 있다.
본원에 사용된, 초분지 폴리머는 분지 (branching) 및 구조 측면에서 다분산성 (polydisperse)이고 불규칙적 (irregular)인 다가 입자이다. 반대로, 덴드리머는 매우 규칙적이고, 방사상으로 대칭적인 생성 구조를 갖는다. 덴드리머는 단분산성 (monodisperse)의 구형 폴리머로, 초분지 폴리머와 비교하여 전형적으로 다단계 합성으로 제조된다. 덴드리머 구조는 대칭 중심을 나타내는 다관능성 코어 (polyfunctional core), 반복 단위 (세대)의 다양한 잘 정의된 방사형 대칭 층 및 말단기를 특징으로 한다.
초분지 폴리머는 폴리에스테르, 폴리에스테르아미드, 폴리에테르, 폴리아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리글리세롤, 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리락티드-코-글리콜리드, 폴리타르트레이트 및 폴리사카라이드를 포함한다. 초분지 폴리에스테르는 Perstorp AB의 Boltorn®을 포함하고, 초분지 폴리에스테르아미드는 DSM BV Niederlande의 Hybrane®을 포함하고, 폴리글리세롤은 Hyperpolymers GmbH에 의해 제조되고, 초분지 폴리에틸렌이민은 BASF AG의 Polyimin®을 포함한다.
초분지 폴리머는 또한 폴리카프로락톤 및 코폴리머, 예컨대 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) 및 Degussa AG에 의해 제조된 Dynapo;®S 및 Dynacoll® 제품군으로부터의 폴리에스테르 화합물을 포함한다.
초분지 폴리머, 예를 들어 초분지 폴리글리세롤의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 초분지 폴리글리세롤을 형성하기 위해서는 글리시돌 (glycidol)의 조절된 음이온성 개환 (ring-opening) 다분지 중합이 수행된다. 그 다음 초분지 폴리글리세롤을 피리딘 중 숙신산 무수물과 반응시켜 에스테르 결합을 통해 카복실산 말단기를 제공한다. 초분지 폴리글리세롤의 관능기 함량이 일단 확인되면, 하이드록실은 다음 계획에 의해 추가적으로 관능화될 수 있다: pH 8.5, DMSO 또는 DMF 중 초분지 폴리글리세롤-OH+N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트 (PMPI, 10배 몰 과량)로부터 초분지 폴리글리세롤-말레이미드를 얻는다. 따라서 초분지 폴리글리세롤은 상응하는 가교-결합제 (cross-linkers) 및 화학기와 반응할 수 있는 카복실 및 말레이미드 관능기를 모두 갖거나, 또는 이용 가능한 특정 관능기에 맞게 추가로 유도체화될 수 있다.
양친매성 (amphiphilic) 초분지 폴리머는 미셀-유사 구조를 형성할 수 있다. 상기 초분지 폴리머는 선형인 부위를 포함할 수 있고, 무작위 또는 비대칭 분지를 특징으로 할 수 있다는 점에서 "불완전한 (imperfect)" 분자일 수 있다. 초분지 폴리머는 표면에서 다수의 관능성을 달성하기 위해 선택적으로 변형될 수 있으며 소수성을 갖추기 위해 탄소 사슬과 같은 관능적 요소와 연결되고, 친수성 및 후속적인 변형을 위한 활성화를 위해 1차 아민기와 연결될 수 있다.
초분지 폴리머의 이점은 더 작은 단위 크기 (전형적으로 직경 <60 nm 미만) 및 상대적으로 단순한 합성 과정을 포함한다. 잠재적인 단점으로는 광범위한 크기 분포 및 특정 관능성을 위한 표면 변형을 조절하는데 있어서의 잠재적인 어려움을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "덴드리머 (dendrimer)"는, 이에 제한되지는 않으나, 내부 코어, 이 개시제 코어에 규칙적으로 부착되고 이로부터 연장되는 반복 단위의 내부 층 (또는 "세대 (generations)")으로서, 각 층은 하나 이상의 분지점 (branching point)을 갖는 것인 내부 층, 및 최외각 세대에 부착된 말단기의 외부 표면을 갖는 분자 아키텍처를 포함한다. 덴드리머는 규칙적인 덴드리메릭 (dendrimeric) 또는 "별모양 (starburst)"의 분자 구조를 갖는다. 나노입자 덴드리머는 예를 들어, 일반적으로 3 내지 10 nm의 직경을 갖는다.
각 연속적인 덴드리머 세대는 이전 세대에 공유 결합할 수 있다. 코어 구조의 반응성 기의 개수는 n-방향성 (n-directionality)을 결정하고 다음 세대를 형성하기 위해 부착될 수 있는 구조의 수를 정의한다.
덴드리머 구조의 분지 (branch) 개수는 코어를 포함하는, 단량체 빌딩 블록 (monomeric building block)의 분지 결합가 (branching valency)에 따라 달라진다. 예를 들어, 코어가 1차 아민인 경우, 아민 질소는 2가가 되어, 1-2 분지 모티프 (branching motif)가 된다.
예시적인 덴드리머는 알킬화 덴드리머, 예를 들면, 폴리(아미도-아민) (PAMAM), 폴리(에틸렌이민) (PEI), 폴리프로필렌이민 (PPI), 디아미노부탄 아민 폴리프로필렌이민 테트라민 (DAB-Am 4), 폴리프로필아민 (POPAM), 폴리리신, 폴리에스테르, 입티센 (iptycene), 지방족 폴리(에테르), 방향족 폴리에테르 덴드리머, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조합이다.
덴드리머는 카복실산, 아민 및 하이드록실 말단을 가질 수 있으며, 1세대 덴드리머 (G1), 2세대 덴드리머 (G2), 3세대 덴드리머 (G3), 4세대 덴드리머 (G4), 5세대 덴드리머 (G5), 6세대 덴드리머 (G6), 7세대 덴드리머 (G7), 8세대 덴드리머 (G8), 9세대 덴드리머 (G9), 또는 10세대 덴드리머 (G10)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 세대일 수 있다.
PAMAM 덴드리머는 생분해성을 향상시킬 수 있는 내부 아미드 결합을 함유하여, 인간 치료적 적용 측면에서 내약성 (tolerance)을 증가시킨다. 표면에는 극성이고, 고반응성인 1차 아민기가 포함된다. 아미노-관능성 PAMAM 덴드리머의 표면은 양이온성이며, 음으로 하전된 분자와의 이온 상호작용을 통해, 또는 1차 아민의 공유 관능화를 위해 잘 알려진 많은 시약들을 사용하여 유도체화될 수 있다.
PAMAM 덴드리머가 사용되는 경우, 0 내지 7세대의 PAMAM 덴드리머가 전형적으로 사용된다. 예를 들어, 혼성 나노입자는 0세대 PAMAM 덴드리머 (G0); 1세대 (G1) PAMAM 덴드리머; 2세대 (G2) PAMAM 덴드리머; 3세대 (G3) PAMAM 덴드리머; 4세대 (G4) PAMAM 덴드리머; 5세대 (G5) PAMAM 덴드리머; 6세대 (G6) PAMAM 덴드리머; 또는 7세대 (G7) PAMAM 덴드리머로부터 형성될 수 있다. PAMAM은 Sigma-Aldrich (Cat. No. 597309)를 포함한 여러 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다.
디아미노부탄 아민 폴리프로필렌이민 테트라민 (DAB Am 4)은 4개의 표면 1차 아미노기를 갖는 1,4-디아미노부탄 코어 (4-탄소 코어)를 갖는 폴리머이다. 혼성 나노입자가 DAB-AM 4 덴드리머로부터 형성될 때, 0 내지 7세대의 DAB-AM 4 덴드리머가 전형적으로 사용된다. 예를 들어, 혼성 나노입자는 0세대 DAB-AM 4 덴드리머 (G0); 1세대 (G1) DAB-AM 4 덴드리머; 2세대 (G2) DAB-AM 4 덴드리머; 3세대 (G3) DAB-AM 4 덴드리머; 4세대 (G4) DAB-AM 4 덴드리머; 5세대 (G5) DAB-AM 4 덴드리머; 6세대 (G6) DAB-AM 4 덴드리머; 또는 7세대 (G7) DAB-AM 4 덴드리머로부터 형성될 수 있다. DAB-AM 4는 Sigma-Aldrich (Cat. No. 460699)를 포함한 여러 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다.
상기 다가 나노입자는 하나 이상의 상이한 덴드리머로 형성될 수 있다. 덴드리머 복합체의 각 덴드리머는 다른 덴드리머와 유사하거나 또는 상이한 화학적 성질을 가질 수 있다 (예를 들어, 제1 덴드리머는 PAMAM 덴드리머인 반면, 제2 덴드리머는 POPAM 덴드리머일 수 있다).
덴드론은 다수의 말단기, 및 초점 (focal point)에 단일 반응성 기능을 갖는, 단분산성의 쐐기형 (wedge-shaped) 덴드리머 섹션이다. 덴드론은 예를 들어 표면, 또 다른 덴드론, 또는 거대분자에 그래프팅될 수 있다. Bis-MPA (비스-디메틸올프로피온산) 덴드론은 Sigma-Aldrich로부터 이용가능하다.
본원에 사용된, "미셀 (micelle)"은 수성 매질 중 내부 코어 및 외부 표면을 갖는, 양친매성 분자의 응집체를 지칭하며, 상기 양친매성 분자들은 대부분 그들의 소수성 부분이 코어를 형성하고, 친수성 부분이 외부 표면을 형성하도록 배향된다. 다양한 모노클로날 항체, 펩티드, 단백질 및 소분자는 미셀의 친수성 헤드 그룹 (head group)에 공유 결합하여, 더 강한 결합 역학을 위해 나노입자에 접합된 복수 개의 ICI를 포함하는 나노입자를 포함한다. 미셀은 전형적으로 응집되지 않은 형태로 용액에 존재하는, 그들을 형성하는 양친매성 분자 또는 이온과 동적 평형을 이룬다. 특히 세제, 계면활성제, 양친매성 폴리머, 리포폴리머 (예: PEG-지질), 담즙산염 (bile salts), 단일-사슬 인지질 및 기타 단일-사슬 양친매성 물질을 포함하는 많은 양친매성 화합물, 및 양친매성 약학적 화합물들은 임계 미셀화 농도 (critical micellization concentration), 또는 CMC로 알려진 특정 농도보다 높은 농도에서 수성 매질에서 미셀을 자발적으로 형성하는 것으로 알려져 있다. 미셀의 양친매성 성분, 예를 들어 지질은 이중층 상, 비-이중층 중간상 (mesophases), 등방성 (isotropic) 액체상, 또는 고체 비결정상 또는 결정상을 형성하지 않는다. 미셀의 개념뿐만 아니라 이의 형성을 위한 방법 및 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 미셀은 지질 입자와 함께 용액 중에 공존할 수 있다.
예시적인 미셀은 양친매성 덴드론-코일을 포함하는 미셀의 개시를 위해 참조로 포함된 미국특허 제9,212,258호에 기재된 것들을 포함한다. 각 양친매성 덴드론-코일은 비-펩티딜, 소수성 코어-형성 블록, 폴리에스테르 덴드론 및 폴리(에틸렌)글리콜 (PEG) 모이어티를 포함한다. 양친매성 덴드론-코일을 포함하는 미셀은 또한 "다가 덴드론 접합체 (multivalent dendron conjugates)" 및 "덴드론-기반 나노미셀 (dendron-based nanomicelles: DNM)"로도 지칭된다.
미셀의 소수성 코어-형성 블록은 비-펩티딜이고, 즉 상기 소수성 코어-형성 블록은 펩티드가 아니다. 일부 구체예에서, 미셀은 단일 타입의 양친매성 덴드론-코일을 포함한다 (즉, 상기 미셀의 양친매성 덴드론-코일은 모두 동일한 3개의 구성성분을 갖는다). 일부 구체예에서, 미셀은 1개 초과의 타입의 양친매성 덴드론-코일을 포함한다 (즉, 상기 미셀의 양친매성 덴드론-코일은 3개의 구성성분이 다르다).
일부 구체예에서, 양친매성 덴드론-코일의 비-펩티딜, 소수성 코어-형성 블록은 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA) 또는 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA)을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜 소수성 코어-형성 블록은 PCL이다. 일부 구체예에서, 상기 PCL은 폴리(ε-카프로락톤)이다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜 소수성 코어-형성 블록은 PLA이다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜 소수성 코어-형성 블록은 PGA이다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜 소수성 코어-형성 블록은 PLGA이다. 상기 비-펩티딜 소수성 코어-형성 블록은 약 0.5 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 포함하나, 이에 제한되지 않는 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜, 소수성 코어-형성 블록은 분자량이 약 3.5 kDa인 폴리(ε-카프로락톤)이다. 일부 구체예에서, 상기 비-펩티딜, 소수성 코어-형성 블록은 14 kDa의 분자량을 갖는 폴리(ε-카프로락톤)이다.
일부 구체예에서, 양친매성 덴드론-코일의 폴리에스테르 덴드론은 3세대 내지 5세대, 즉 3세대 (G3), 4세대 (G4) 또는 5세대 (G5)의, 아세틸렌 또는 카복실레이트 코어를 갖는 폴리에스테르 덴드론을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 G3 덴드론이다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 G5 덴드론이다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 아세틸렌 코어를 갖는다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 3세대 폴리에스테르-8-하이드록실-1-아세틸렌 비스-MPA 덴드론이다. 일부 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 카복실레이트 코어를 갖는다.
일부 구체예에서, 양친매성 덴드론-코일의 PEG 모이어티는 메톡시 PEG (mPEG) 모이어티, 아민-말단 PEG (PEG-NH2) 모이어티, 아세틸화 PEG (PEG-Ac) 모이어티, 카복실화 PEG (PEG-COOH) 모이어티, 티올-말단 PEG (PEG-SH) 모이어티, N-하이드록시숙신이미드-PEG (PEG-NHS) 모이어티, NH2-PEG-NH2 모이어티 또는 NH2-PEG-COOH 모이어티이다. 일부 구체예에서, 상기 PEG 모이어티는 약 0.2 kDa 내지 약 5 kDa의 분자량을 포함하나, 이에 제한되지 않는 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 PEG 모이어티는 mPEG 모이어티이다. 일부 구체예에서, 상기 PEG 모이어티는 분자량이 약 2 kDa인 mPEG 모이어티이다. 일부 구체예에서, 상기 PEG 모이어티는 분자량이 약 5 kDa인 mPEG 모이어티이다.
일 구체예에서, 폴리에스테르 덴드론은 코어-쉘 타입 미셀의 자가-조립 (self-assembly)을 돕는 사슬꼬임 (chain entanglement) 및 분자내 상호작용을 촉진하도록 돕고 소수성 약물 분자를 미셀 내에 로딩할 수 있도록 선형의 소수성 폴리머와 공유결합에 의해 변형된다. PEG 모이어티는 비-파울링 (non-fouling) 특성을 갖는 친수성 코로나 (corona)를 형성하고 미셀이 인 비보 투여될 때 증가된 순환 반감기 (circulation half-life)를 제공한다.
생분해성, 순환 반감기, 표적화 적합성, 약동학 및 약물 방출과 같은 생물학적으로 중요한 특성들은 양친매성 덴드론-코일의 3개 구성성분 (3개의 폴리머 블록이라고도 함)을 변경함으로써 조절할 수 있다. 또한, 코폴리머 구조는 유연하며 친수성-친유성 균형 (HLB)을 미세-조정하기 위해 각 구성성분의 분자량을 변경하여 쉽게 조작할 수 있다. 예를 들어, 다양한 구체예는 각각 0.5-20 kDa, G3-G5 (약 0.9-3.5 kDa) 및 0.2-5 kDa 범위의 분자량을 갖는 PCL, 폴리에스테르 덴드론 및 PEG를 사용한다. HLB (20 MH / (MH + ML), 여기서 MH는 친수성 블록의 질량이고, ML은 친유성 블록의 질량이다)는 따라서 2.22에서 19.94까지 다양하다.
양친매성 덴드론-코일의 생성에서 덴드론이 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA)과 같은 소수성 선형 폴리머와 공중합될 때, 원뿔 모양의, 양친매성 덴드론-코일은 결과적으로 열역학적으로 유리하고 혈액 순환 시간 증가를 위해 고도로 패킹된 PEG 표면층을 갖는, 자가-조립된 미셀을 형성하기 때문에 유리한 구조적 속성을 갖게 된다. 쉽게 조절가능한 고유한 구조와 함께, 열역학적 안정성을 갖는 미셀을 형성한다.
나노캐리어 (nanocarrier) 시스템은 초분지 폴리머 및 다른 생체적합성 나노입자의 혼성체를 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 혼성 나노입자는 덴드리머 (2-10 nm의 직경) 및 더 큰 나노입자 (50-200 nm)의 고유한 이점들을 조합한 덴드리머-리포솜, 덴드리머-PEG-PLA, 덴드리머-엑소좀 혼성체를 포함한다.
예시적인 혼성 나노입자 (나노혼성체 (nanohybrids)로도 지칭됨)는 혼성 나노입자의 개시를 위해 본원에 참조로 포함된 미국특허 제9,168,225호에 기재된 것들을 포함한다. 이 구체예에서, 혼성 나노입자는 나노코어 (nanocore)가 매트릭스 또는 쉘에 둘러싸이거나 또는 캡슐화된 입자이다. 즉, 더 큰 입자 내에 있는 더 작은 입자이다. 특정 구체예에서, 상기 혼성 나노입자는 리포솜 내부에 나노코어를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 나노코어는 폴리머 매트릭스 또는 쉘 (예: 폴리머 나노입자)로 둘러싸여 있다.
나노코어는 바람직하게는 최대 직경이 1 nm 내지 50 nm이다. 보다 바람직하게는, 나노코어의 최대 직경은 1 내지 40 nm, 가장 바람직하게는 최대 직경이 3 내지 20 nm 이다. 나노코어는 입자의 크기를 결정하기 위해 동적 광산란 및/또는 주사 전자 현미경에 의해 분석될 수 있다. 나노코어는 모든 모양 및 형태를 가질 수 있다. 나노코어의 예는 나노 분말, 나노 클러스터, 나노 결정, 나노 구체, 나노 섬유 및 나노 튜브를 포함한다. 나노스케일 (nanoscale)의 크기를 감안할 때 나노코어 스캐폴드는 쉽게 배출된다. 따라서, 사용된 나노코어 스캐폴드는 생분해성일 필요는 없지만, 특정 구체예에서, 상기 나노코어 스캐폴드는 생체적합성이고, 즉 세포에 독성이 없다. 스캐폴드는 이를 세포에 인 비트로 추가하여 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이하의 세포 사멸을 초래하고 인 비보에서 염증 또는 기타 원치 않는 유해 효과를 유발하지 않는 경우 "생체적합성"이 있다.
예시적인 폴리머 스캐폴드는 폴리아미드, 폴리사카라이드, 폴리안하이드라이드 (polyanhydride), 폴리-L-리신, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리펩티드, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌이민 (PEI), 또는 폴리(아미도아민) (PAMAM) 및 PAMAM (에틸렌디아민-EDA) 덴드리머와 같은 덴드리머 또는 이의 변형된 버전, 예를 들어 상기 폴리머의 하이드록실화, 아세틸화 또는 카복실화 버전을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예시적인 폴리머 백본은, 예를 들어 WO98/46270 (PCT/US98/07171) 또는 WO98/47002 (PCT/US98/06963)에 기재되어 있다. 다가 폴리머 스캐폴드 분자는 선형, 분지형, 포크형 (forked) 또는 별형 (star-like)으로부터 선택된 입체형태를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자의 적어도 일부는 소수성일 수 있다. 일부 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자의 적어도 일부는 친수성일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자의 일부는 소수성일 수 있고, 분자의 다른 부분은 친수성일 수 있다. 특정 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자는 양이온성이다. 다른 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자는 전기적으로 중성이다. 또 다른 구체예에서, 다가 폴리머 스캐폴드 분자는 음이온성이다. 당업자는 원하는 특성을 나타내는 다가 폴리머 스캐폴드 분자를 얻기 위해 다양한 출발 물질이 선택될 수 있음을 인식할 것이다.
일 구체예에서, 쉘 (shell)은 에그 (egg) 포스파티딜콜린, 에그 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 레시틴, 스핑고미엘린, 합성 포스파티딜콜린, 리소-포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 또는 포스파티딜세린과 같은 인지질로 이루어진 리포솜이며, 여기서 상기 인지질은 장기-순환제 (long-circulating agent) 또는 동결방지제로 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 쉘은 폴리-(γ-L-글루타밀글루타민), 폴리-(γ-L-아스파틸글루타민), 폴리-L-락트산, 폴리-(락트산-코-글리콜산), 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리안하이드라이드, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트 (polypropylfumerate), 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, [N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드] 코폴리머, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리아민 폴리엡실론-카프로락톤, 및 이들의 코폴리머의 그룹으로부터 선택된 폴리머로 구성된 폴리머 나노입자이며, 여기서 상기 폴리머는 단백질 분해 저항성을 향상시키거나, 순환 반감기를 개선하거나, 항원성을 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 독성을 감소시키거나, 용해성을 개선하거나, 또는 열적 또는 기계적 안정성을 개선하기 위해 변형 또는 유도체화된다. 특정 구체예에서, 상기 쉘은 생분해성이다. 특정 구체예에서 상기 다가 폴리머 스캐폴드는 양이온성이고 폴리아미드, 폴리사카라이드, 폴리안하이드라이드, 폴리-L-리신, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리펩티드, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌이민, 폴리(아미도아민)(PAMAM) 또는 PAMAM(에틸렌디아민-EDA)로 구성된다.
다른 혼성 나노입자는 미국 출원 시리얼 번호 16/011,922에 기재된 바와 같은 덴드리머-엑소좀 혼성체이다. 덴드리머-엑소좀 혼성체는 하나 이상의 나노입자 덴드리머가 로드된 엑소좀 (exosome)이다. 본원에 사용된, 엑소좀은 다양한 세포에서 분비되는 막 구조를 갖는 작은 소포를 의미한다. 엑소좀은 약 25 내지 약 150 nm의 직경을 갖는다. 엑소좀은 VLA-4, CD162, CXCR4, CD9, CD63, CD81 또는 이들의 조합과 같은 마커를 발현할 수 있다. 일 구체예에서, 엑소좀은 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 단리된 줄기세포 또는 종양 세포로부터 유래된다.
일 구체예에서, 엑소좀은 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 단리된 줄기세포 또는 종양 세포로부터 유래된다.
줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포, 바람직하게는 성체 줄기세포를 포함한다. 성체 줄기세포는 이에 제한되지 않고, 중간엽 줄기세포, 인간 조직-유래 중간엽 간질 세포 (중간엽 간질 세포), 인간 조직-유래 중간엽 줄기세포, 다능성 줄기세포 또는 양수 상피세포일 수 있고, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반 등으로부터 유래 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포 (MSC)는 암성 (cancerous) 영역에서 빈번하게 발견되는 염증 부위를 특이적으로 표적화할 수 있고, 즉 MSC 종양-귀소성 (tumor-homing)이다.
다른 구체예에서, 엑소좀은 종양 세포로부터 단리된다. 종양 세포는 엑소좀을 활발하게 생성, 방출 및 활용하여 종양 성장을 촉진한다.
엑소좀은 대상체로부터 종양 또는 줄기세포를 단리하고, 종양 또는 줄기세포를 확장하여, 확장된 세포 집단 (cell population)을 제공하고, 확장된 세포 집단을 배양하고, 상기 확장된 종양 또는 줄기세포로부터 분비된 엑소좀을 단리함으로써 생성할 수 있다. 단리된 엑소좀으로부터 내부 성분을 제거하여 나노입자 덴드리머와 같은 성분을 로드하기 위한 본질적으로 빈 용기 (vessel)인 소위 고스트 엑소좀 (ghost exosomes)을 제공할 수 있다. 환자로부터 유래된 엑소좀은 전술된 특징에 추가하여 환자에게 비-면역원성 나노캐리어 쉘을 제공할 수 있어, 개인 맞춤형 의약을 위한 옵션을 가능하게 한다.
면역 체크포인트 억제제의 접합을 허용하기 위해, 일 양상에서, 상기 다가 나노입자는 알킬 에폭사이드와의 반응에 의해 변형되고, 여기서 에폭사이드의 R 기는 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 알킬 에폭사이드는 다가 나노입자에 존재하는 아미노기와 반응하여 알킬화된 다가 나노입자를 형성한다.
다가 나노입자에 존재하는 아민기는 디사이클로헥실카보디이미드, 디이소프로필카보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드, 1,1'-카보닐디이미다졸, N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트, N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트, 2-머캅토에틸아민, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 숙신이미딜 아이오도아세테이트, 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 커플링 링커 (coupling linker)를 사용하여 다양한 아민-기반 접합 반응을 위한 반응성 부위를 제공한다. 일부 구체예에서, 반응성 에스테르는 에스테르 결합을 통해 다가 나노입자와 다른 화합물을 연결하는데 사용된다. 상기 반응성 에스테르의 예는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스테르, N-γ-말레이미도부티릴-옥시설포숙신이미드 에스테르, 니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로 페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 티오피리딜 에스테르, 티오니트로페닐 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 반응성 에스테르 기는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르이다.
본원에 기재된 나노입자는 β-헤어핀 펩티드, 예컨대 체크포인트 억제제 수용체에 대해 높은 친화성을 갖는 β-헤어핀 펩티드를 포함한다.
예시되는 β-헤어핀 펩티드는 종양 표적화 펩티드, 예컨대 세포 표면 수용체에 결합하는 펩티드, 세포내 수용체를 표적으로 하는 펩티드, 및 세포외 기질과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 세포 표면 수용체에 결합하는 종양 표적화 펩티드는 인테그린 (integrins), 예컨대 RGD 결합 모티프를 갖는 αvβ3 인테그린, 및 결장, 간, 난소, 췌장 및 편평세포 암 세포의 표면에서 발현되는 αvβ6 인테그린에 결합하는 펩티드를 포함한다. 종양 표적화 펩티드의 추가 표적에는 아미노펩티다제 N, 펩티드 수송체 1, 표피 성장인자 수용체, 전립선-특이적 막 항원, 뮤신1, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체, 위-분비 펩티드 수용체, 소마토스타틴 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 뉴로텐신 수용체, 트랜스페린 수용체, 혈관 내피 성장인자 수용체, 인슐린, 에프린 수용체 등을 포함한다. 세포내 수용체에 결합하는 종양 표적화 펩티드는 만성 골수성 백혈병 (CML), 사이클린 A, CDK, 미토콘드리아 등의 만성 단계를 담당하는 병원성 융합 단백질인 BCR/ABL에 결합하는 펩티드를 포함한다. 세포외 기질을 표적으로 하는 펩티드는 피브로넥틴, 섬유아세포 성장인자, 기질 메탈로프로테이나제, 전립선-특이적 항원, 카텝시스 (cathepsis) 등에 결합하는 펩티드를 포함한다.
세포 투과성 펩티드에는 R8, TAT, 트란스포르탄 (Transportan) 및 Xentry를 포함한다.
β-헤어핀 펩티드, 예컨대 ZAβ3은 단백질 폴딩 질병 (protein folding diseases) 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 크로이츠펠트-야콥병, 낭포성 섬유증, 고셔병 (Gaucher's disease) 및 기타 여러 퇴행성 및 신경퇴행성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
면역 체크포인트 억제제인 β-헤어핀 펩티드는 면역 체크포인트 수용체 표면과 높은 친화도로 상호작용하는, 면역 체크포인트 억제제 리간드 펩티드, 예를 들어 표면 펩티드를 확인함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 높은 친화도로 PD-L1과 상호작용하는 표면 β-헤어핀 PD-1 펩티드가 본원에서 확인되었다. 본원에 사용된, 높은 친화도는 K D가 0.1-1,000 nM인 것을 의미한다. 이러한 펩티드는 5 내지 50개의 아미노산 길이를 가질 수 있으며, 전체 면역 체크포인트 억제제에 해당하지 않는다.
예시되는 β-헤어핀 PD-1 펩티드는 하기를 포함한다.
서열번호: 1: TYLCGAISLAPKLQIKESLRA (βH1- wt 서열)
서열번호: 2: TYVCGVISLAPRIQIKESLRA (βH1- 돌연변이체 서열)
서열번호: 3: VLNWYRMSPSNQTDRKAA (βH2- wt 서열)
서열번호: 4: HVVWHRESPSGQTDTKAA (βH2- wt 서열)
일 양상에서, β-헤어핀 펩티드는 트립토판 지퍼 (tryptophan zipper)를 포함한다. 서열번호: 4의 트립토판 지퍼 유사체는 서열번호: 5이다.
서열번호: 5: HKVWHWESPSGQWDTWAA (Trp-Zip βH2 돌연변이체 서열)
본원에 사용된, 트립토판 지퍼는 β-헤어핀 펩티드를 클러스터링하고 안정화시키는 동일한 펩티드 표면 상에 배치된 4개의 트립토판 잔기를 포함하는 β-헤어핀 펩티드이다.
trpzip 전략 (예: 펩티드의 폴딩된 구조의 안정화)은 나노입자에 대한 접합에 추가하여, 나노입자, 예컨대 덴드리머의 표면에서 펩티드의 폴딩된 구조의 안정화로 인한 베타-헤어핀 펩티드의 결합 역학을 추가로 향상시킨다. 펩티드 및 나노입자 표면 사이의 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자 상호작용을 포함한 분자간 힘이 또한 펩티드의 폴딩된 구조의 안정화에 기여하여, 전반적인 결합 역학을 향상시킨다.
다가 나노입자 코어 상의 다수의 말단기는 β-헤어핀 펩티드에 추가하여 다양한 분자의 접합을 허용한다. 다가 나노입자 코어는 치료제, 예방제 또는 진단제 중 하나 이상과 회합될 수 있고, 예를 들어 복합체화되거나 또는 접합될 수 있다. 진단제에는 영상화제를 포함한다.
일 양상에서, 치료제는 화학요법제이다. 화학요법제는 하기 부류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 알킬화제, 항대사산물, 안트라사이클린, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 모노클로날 항체 및 기타 항-종양제. 전술한 화학요법 약물, 즉 독소루비신, 파클리탁셀에 추가하여, 다른 적합한 화학요법 약물로는 티로신 키나제 억제제 이마티닙 메실레이트 (Gleeve® 또는 Glivec®), 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로에타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 피리미딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신 (L01CB), 에토포시드, 도세탁셀, 토포이소머라제 억제제 (L01CB 및 L01XX) 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 닥티노마이신, 로니다민, 및 모노클로날 항체, 예컨대 트라스트주맙 (Herceptin®), 세툭시맙, 베바시주맙 및 리툭시맙 (Rituxan®)을 포함한다.
치료제의 또 다른 예는 항미생물제, 진통제, 항염증제 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 메티실린 내성 포도상구균 (methicillin resistant staph aureus: MRSA)으로 인한 감염을 포함하여, 감염 치료에 자주 사용되는 반코마이신과 같은 항생제가 상기 입자에 포함될 수 있다. 상기 입자는 선택적으로 면역 억제제인 친유성 약물로서, 동종 장기이식 후에 환자의 면역계 활성과 장기 거부의 위험을 줄이기 위해 널리 사용되는 사이클로스포린을 포함한다 (Sandimmune® 및 Neoral®이라는 브랜드 이름으로 Novartis에서 판매). 사이클로스포린을 포함하는 입자는 건성각결막염 (keratoconjunctivitis sicca)을 치료하기 위한 국소용 에멀젼에도 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 약물을 포함하는 다관능성 표면 도메인을 갖는 입자는 다양한 약물의 동등한 투여량을 암 세포에 직접 전달하도록 디자인될 수 있으며, 이렇게 하여 일반적으로 환자에게 전달되는 양을 잠재적으로 최소화하고 다른 조직에 대한 부수적 손상을 최소화할 수 있다.
치료제는 또한 유전자-침묵 (gene-silencing) 제제, 유전자-조절제, 안티센스 제제, 펩티드 핵산 제제, 리보자임 제제, RNA 제제 및 DNA 제제와 같은 치료적 핵산을 포함한다. 핵산 치료제는 단일가닥 또는 이중가닥 RNA 또는 DNA, 특히 RNA, 예를 들어 삼중 (triplex) 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머, siRNA (짧은 간섭 RNA) 및 shRNA (짧은 헤어핀 RNA)를 포함하는 작은 간섭 RNA, 안티센스 RNA, microRNA (miRNA), 또는 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 수 있는 이의 일부, 또는 이의 유사체 또는 모방체를 포함한다. 억제성 핵산은, 예를 들어, 간섭 RNA 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개하거나 또는 이의 번역을 억제함으로써 작용할 수 있다.
진단제는 조직 또는 질병의 검출 또는 영상화를 가능하게 하는 제제이다. 진단제의 예는 방사성 표지, 형광단 및 염료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
영상화제는 대상체의 종양, 장기 또는 조직을 이미징하기 위해 본 발명의 랜덤 코폴리머에 부착되는 표지를 의미한다. 영상화제의 예는 제한 없이, 방사성 핵종, 형광단 예컨대 플루오레세인, 로다민, 이소티오시아네이트 (TRITC, FITC), 텍사스 레드 (Texas Red), Cy2, Cy3, Cy5, APC 및 AlexaFluor® (Invitrogen, Carlsbad, CA) 범위의 형광단, 항체, 가돌리늄 (gadolinium), 금, 나노물질, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제, 이들의 유도체, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
방사성 표지는 방사능을 나타내는 핵종을 지칭한다. "핵종 (nuclide)"은 원자번호, 원자량, 및 에너지 상태로 특정된 원자 타입을 의미하고, 예를 들면, 탄소 14 (14C)이다. "방사능 (radioactivity)"은 방사성 물질에 의해 방출되는 방사선을 의미하고, 알파 입자, 베타 입자, 핵자 (nucleons), 전자, 양전자, 중성미자 (neutrinos) 및 감마선을 포함한다.
예방제의 투여는 질병 또는 장애의 특징적인 증상이 나타나기 전에 투여될 수 있어, 질병 또는 장애가 예방되거나, 또는 대안적으로 진행이 지연된다.
치료적 분자, 진단제 및 예방제는 화학적 접합, 물리적 캡슐화, 및/또는 정전기적 상호작용 방법을 통해 다가 나노입자 코어와 결합될 수 있다.
또한 본원에 기재된 나노입자 시스템을 포함하는 약학적 조성물이 포함된다. 약학적 조성물은 전술된 바와 같은 치료제, 예방제 또는 진단제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "약학적 조성물"은 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제 및 아쥬반트와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 치료적 유효량의 나노입자를 의미한다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 당업자에게 잘 알려져 있다.
경구 투여용 정제 및 캡슐은 단위 투여량 제형일 수 있으며, 결합제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 또는 폴리비닐-피롤리돈; 충전제, 예를 들어 락토스, 당, 옥수수 전분, 인산 칼슘, 소르비톨 또는 글리신; 정제화 활택제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실리카; 붕해제, 예를 들어 감자 전분, 또는 소듐 라우릴 설페이트와 같은 허용 가능한 습윤제와 같은 통상적인 부형제를 함유할 수 있다. 정제는 일반적인 제약 관행에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다. 경구용 액체 제제는 예를 들어, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수 있거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 건조 제품으로 제시될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁화제, 예를 들어 소르비톨, 시럽, 메틸 셀룰로스, 글루코스 시럽, 젤라틴 수소첨가 식용 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트, 또는 아카시아; 비-수성 비히클 (식용 오일을 포함할 수 있음), 예를 들어 아몬드 오일, 분별 코코넛 오일, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 에틸 알코올과 같은 유성 에스테르; 보존제, 예를 들어 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산, 및 원하는 경우 통상적인 풍미제 또는 착색제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다.
피부에 국소 적용하기 위해, 약물은 크림, 로션 또는 연고로 제조될 수 있다. 약물에 사용될 수 있는 크림 또는 연고 제제는 당업계에 잘 알려진 통상적인 제제이다. 국소 투여에는 패치와 같은 경피 제제가 포함된다.
눈에 국소 적용하기 위해, 억제제는 적절하게 멸균된 수성 또는 비-수성 비히클 중 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 첨가제, 예를 들어 소듐 메타바이설파이트 또는 디소듐 에데에이트 (disodium edeate)와 같은 버퍼; 페닐 수은 아세테이트 또는 니트레이트, 벤잘코늄 클로라이드 또는 클로르헥시딘과 같은 살박테리아제 및 살진균제를 포함하는 보존제, 및 하이프로멜로스와 같은 증점제가 또한 포함될 수 있다.
멸균 매질내 활성 성분이 또한 비경구로 투여될 수 있고, 멸균된 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태로, 피하, 또는 정맥내, 또는 근육내, 또는 흉골내, 또는 주입 (infusion) 기법으로 투여될 수 있다. 사용된 비히클 및 농도에 따라, 약물은 비히클에 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 유리하게는, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 아쥬반트가 비히클에 용해될 수 있다.
약학적 조성물은 편리하게 단위 투여량 제형으로 제공될 수 있고 제약 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "단위 투여량 (unit dosage)" 또는 "단위 용량 (unit dose)"은 표시된 활성 또는 상태를 치료하기에 효과적인 충분한 활성 성분의 미리 결정된 양을 의미한다. 각 타입의 약학적 조성물을 제조하는 것은 활성 화합물을 담체 및 하나 이상의 선택적 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 화합물을 액체 또는 고체 담체와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 다음에, 필요한 경우 산물을 원하는 단위 투여량 제형으로 성형함으로써 제조된다.
일 양상에서, 나노입자 시스템을 제조하는 방법은 복수 개의 면역 체크포인트 억제제를 다가 나노입자 코어에 접합시켜서 나노입자 시스템을 제공하기에 충분한 조건하에 다수의 반응성 말단기를 포함하는 다가 나노입자 코어와 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 예시적인 말단기는 커플링 링커 및 반응성 에폭사이드, 예를 들어 디사이클로헥실카보디이미드, 디이소프로필카보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드, 1,1'-카보닐디이미다졸, N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트, N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트, 2-머캅토에틸아민, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 숙신이미딜 아이오도아세테이트, 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스테르, N-γ-말레이미도부티릴-옥시설포숙신이미드 에스테르, 니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로 페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 티오피리딜 에스테르, 티오니트로페닐 에스테르, 및 이들 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 다가 나노입자 코어는 2개 이상의 상이한 타입의 반응성 말단기를 포함하여 코어의 반응성 및/또는 특이성을 향상시킨다.
다른 구체예에서, 면역치료 방법은 본원에 기재된 나노입자 시스템을 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예시적인 인간 대상체는 암 환자, 및 다발성 경화증 및 류마티스 관절염과 같은 면역 질환을 가진 환자를 포함한다. 상기 나노입자는 T 세포, 암 세포 및/또는 항원 제시 세포와 상호작용하여 면역계를 표적화할 수 있다.
β-헤어핀 펩티드가 면역 체크포인트 억제제 펩티드인 경우, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 고형 종양 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암 및 뇌암, 및 액체 암 예컨대 백혈병 및 림프종을 포함하는 모든 암에 적용 가능하다.
본원에 기재된 방법은 방사선 요법, 화학요법, 수술, 및 이들의 조합과 같은 추가 암 요법과 추가로 조합될 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: PD-1/PD-L1 펩티드 억제제 복합체의 합성 및 분석
물질 및 방법
펩티드 합성. Fmoc-아미노산 및 커플링 시약은 Anaspec (미국) 및 Novabiochem (독일)으로부터 구입하였고, 일반 화학 물질은 Sigma-Aldrich (미국)로부터 구입하였다. Rink Amid MBHA 수지 LL (Novabiochem, Germany)은 펩티드 합성을 위한 스캐폴드로 사용하였다. 표준 Fmoc 보호기를 갖는 표준 아미노산을 사용하여 서열을 합성하였다. 수지로부터 펩티드의 최종 탈보호 및 절단은 절단 칵테일 (트리플루오로아세트산 (TFA): 티오아니솔: 에탄디티올 (EDT) 95:2.5:2.5의 비율)로 수지-결합된 펩티드를 2시간 동안 처리하고, 이어서 tert-부틸 메틸 에테르로 침전시키는 단계를 포함하였다. 역상 HPLC (0.1% TFA를 포함하는 물/아세토니트릴의 이동상)를 사용하여 펩티드를 정제하였다. 펩티드 분자량은 α-시아노-4-하이드록시신남산 (CHCA)을 매트릭스로 사용하여 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법 (AXIMATM, Shimadzu, Japan)에 의해 정량 분석하였다. 280nm에서 트립토판 (5500 M-1cm-1) 및 티로신 (1280 M-1cm-1)에 대한 몰 흡광 계수 (molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴 (1:1)에서 자외선-가시광선 (UV-Vis) 분광광도계로 펩티드 농도를 정량 분석하였다.
덴드리머-펩티드 접합체 (DPC) 제조. G7 PAMAM 덴드리머 (10 mg) (Dendritech, U.S.A)를 1 mlL의 메탄올에 용해시키고, 덴드리머의 600 몰 과량의 트리에틸아민 (TEA)과 함께, 덴드리머 표면에 아민 기의 수에 대해 60, 80 및 90% 당량으로 아세트산 무수물을 부가하여 아세틸화시켰다. 반응을 실온에서 격렬하게 교반하면서 24시간 동안 수행하였다. 4,000 r.p.m.으로 VivaspinTM Turbo 15 (MWCO 10,000, Sartorius, Germany)를 사용하여 15분 동안 과잉 시약을 제거하였고, ddH2O로 10회 세척 (원심 여과)하였다. 그 다음에 아세틸화된 덴드리머를 N-하이드록시숙신이미드 로다민 (NHS-RHO)을 사용하여 형광 표지하여, 나노입자가 더 잘 정량 분석되고 시각화되도록 하였다. 덴드리머를 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해시키고, 덴드리머의 수에 대해 10 당량으로 DMSO 중에 용해된 NHS-RHO를 적가한 다음에, 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 과잉의 시약을 원심 여과로 제거하였다. 그 다음에 NHS-RHO 표지된 덴드리머를 펩티드와 접합시켰다. 덴드리머를 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)에 용해시킨 다음에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 (EDC) 및 PBS에 용해된 NHS를 덴드리머 용액에 부가하였다. 그 다음에, 용액을 실온에서 1시간 동안 격렬하게 교반하였다. 이후, PBS에 용해된 펩티드를 부가하고, 실온에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 과잉의 펩티드 및 시약은 원심 여과로 제거하였다.
SPR (Surface plasma resonance). SPR 분석은 BIAcoreTMX (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다. 요약하면, EDC/NHS 화학을 통해 센서 칩 (CM5 센서 칩, GE Healthcare)의 카복실화 덱스트란-코팅된 금 필름 표면에 PD-L1 단백질 (R&D systems)을 고정시켰다. 30 μL의 샘플 용액을 20 μL/min의 유속으로 주입하였다. 샘플 용액을 두 채널 (참조용 채널 1, PD-L1이 있는 채널 2)로 유동시키고, 채널 1의 신호로부터 채널 2의 신호를 빼서 최종 SPR 센서그램을 수득하였다.
CD (Circular Dichroism) 분광법. CD 스펙트럼은 Aviv 모델 420 C 원편광 이색성 분광계 (Circular Dichroism spectrometer) (Aviv, U.S.A.)를 사용하여 수득하였다. 1 mm 경로 길이의 석영 큐벳을 사용하여 260 nm에서 190 nm으로 샘플을 분석하였다.
ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared) 분광법. H2O에 용해된 샘플을 ZnSe ATR 프리즘에서 건조시켰다. FTIR 스펙트럼은 Bruker Equinox 55/S FTIR 분광계에서 수득하였다.
MD (Molecular dynamics) 시뮬레이션 연구. 감쇠 상수 (damping constant)가 0.01 ps-1이고 시간 간격이 2 fs인 Langevin 동역학을 사용하여, P = 1 bar 및 T = 300 K에서 NPT 앙상블의 NAMD 및 CHARMM force field (CHARMM General Force Field and CHARMM36)로 시스템을 시뮬레이션하였다. 장거리 정전기적 상호작용 (Long-range electrostatic interactions)은 주기적 경계 조건의 존재하에 PME 방법으로 계산하였다. H-결합 수는 3.5 Å의 컷오프 거리 및 60°의 각도로 VMD로 분석하였다.
FP (Fluorescence polarization) 분석. PBS에서 FP 분석을 PD-L1 결합 및 경쟁 분석에 사용하였다 (λex = 480 nm; λem = 535 nm). 형광 이방성 측정은 실온에서 384-웰 플레이트에서 Infinite® M1000 Pro 마이크로플레이트 판독기 (Tecan)를 사용하여 수행하였다. fβH2_mt/PD-L1 복합체를 30분 인큐베이션 시간 후에 FP 경쟁 분석에 사용하였고, 경쟁제 (competitors)로 적정하였다.
세포 배양. 인간 신세포 암종 (RCC) 세포주인 786-O 및 유방암 세포주인 MCF-7을 각각 PD-L1 발현이 높은 암 세포 모델 및 이의 발현이 낮은 암 세포 모델로 사용하였다. 인간 T 림프구 세포주인 Jurkat을 본 연구에서 대표적인 PD-1-발현 면역 세포로 사용하였다. 786-O 및 Jurkat T 세포는 RPMI 배지에서 배양한 반면에, MCF-7 세포는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 모든 세포 배양 배지는 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 10% (v/v) 우태아 혈청 (FBS)을 보충하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 대기에서 인큐베이션하였다.
웨스턴 블롯 (Western Blot). 786-O 및 MCF-7 세포의 총 단백질 용해물은 세포를 RIPA 버퍼 (150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일 II)와 함께 인큐베이션하여 제조하였다. 용해물의 단백질 함량은 BCA 분석 (PierceTM BCA Protein Assay Kit)으로 정량 분석하였다. 25 μg의 단백질을 4-16% 구배 아크릴아미드 겔에서 분해하고, 습식 전달 조건에서 PVDF 막으로 전달하였다. 블롯 (blot)은 4℃에서 PD-L1 (폴리클로날 항 인간 PD-L1, AF156, R&D Systems) 및 베타-액틴 (모노클로날 항-베타-액틴, MAB8929, R&D Systems)에 대한 1차 항체로 밤새 프로브한 (probed) 다음에, 실온에서 적절한 2차 항체와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯 상의 단백질은 화학발광 시약인 ClarityTM Western ECL Substrate (Bio-Rad)를 사용하여 검출하였고, SyngeneTM G:Box F3 (Syngene, Frederick, MD)를 사용하여 이미지화하였다.
T 세포 사이토카인 생성의 평가. Jurkat T 세포의 활성은 ELISA를 사용하여 T 세포가 분비하는 인터루킨-2 (IL-2)의 양을 평가함으로써, 암-면역 세포 공동-배양 시스템에서 조사하였다. 암 세포를 96-웰 플레이트 (5,000개 세포/웰)에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. PD-L1 및 PD-1 발현을 각각 활성화시키기 위해, 인터페론-γ (IFNγ, 10 ng/mL) 및 파이토헤마글루티닌 (PHA, 1 μg/mL)/포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA, 50 ng/mL)로 암 세포 및 T 세포를 30시간 동안 사전-처리하였다. 그 다음에 암 세포를 ICI로 6시간 동안 처리한 다음에, Jurkat T와 1:4의 비율로 공동-배양하였다. 세포 배양 상등액을 인큐베이션 48시간 후에 수집하고, IL-2에 대해 평가하였다.
항암제 감수성 분석 (Chemosensitivity Assay). 화학요법 약물인 독소루비신과 함께, 면역 체크포인트 억제제의 세포독성의 시너지 효과를 측정하여 항암제 감수성 분석을 수행하였다. 암 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (5,000개 세포/웰), 48시간 동안 인큐베이션하였다. 암 세포 및 Jurkat T 세포를 전술한 바와 같이 IFNγ 및 PHA/PMA로 사전-처리하였다. 그 다음에 암 세포를 칼세인 AM (1.5μM)으로 염색한 다음에, ICIS로 2시간 처리하였다. 세포를 독소루비신 (5 μM) 처리 전에 1:4의 비율로 또 다른 24시간 동안 공동-배양하였다. 독소루비신 처리 (2시간) 후에 암 세포 생존율에 대한 각 ICI의 효과를 형광 강도의 변화를 기반으로 분석하였다.
결과:
PD-1/PD-L1 펩티드 억제제 복합체를 개발하기 위해, PD-1 표면으로부터 β-헤어핀 펩티드를 확인하고, 3가지 상승적 접근 방식의 조합을 통해 조작하였다 (도 1). 첫째, 본 발명자들은 높은 PD-L1 친화도를 나타내도록 최적화된 비천연 PD-1 엑토도메인의 아미노산 조성을 사용하였다. 둘째, 펩티드를 다가 방식으로 덴드리머 표면에 접합시켜서, 종양 세포 상의 여러 PD-L1 단백질과 협력적이고 강력한 상호 작용을 가능하게 하였다. 셋째, 덴드리머 표면에의 접합은 배제된 부피 효과 및 덴드리머-펩티드 상호작용으로 인해 펩티드가 본래 구조인 β-헤어핀으로 폴딩하는 것을 보조하였다. 이러한 공학적 접근 방식의 잠재적인 시너지 효과를 고려하여, 본 발명자들은 이러한 DPC 전략으로 항종양 면역의 회복을 위해 PD-L1과의 경쟁적 상호작용에서 상기 펩티드가 천연 PD-1을 능가할 수 있다는 가설을 세웠다.
PD-L1-표적화 DPC를 개발하기 위해, 조작된 PD-1 엑토도메인 서열 (βH1_mt 및 βH2_mt, 도 2)을 기반으로 β-헤어핀 펩티드를 합성하고, 7세대 (G7) 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머의 표면에 부착시켰다. G7 PAMAM 덴드리머의 표면적이 PD-1/PD-L1 계면의 표면적보다 약 10배 더 크다는 점을 감안할 때, 접합 전에 부착된 펩티드의 수를 제어하기 위해, 덴드리머 아민 기의 90%를 아세틸화하였다 (도 3). 그 다음에 G7-βH1_mt 및 G7-βH2_mt로 표시된 생성된 DPC를 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 분석하여 결합 역학을 측정하였다. 도 4에 개시된 바와 같이, G7-βH2_mt는 G7-βH1_mt보다 고정화된 PD-L1 단백질에 대해 더 높은 친화도를 나타내는 반면에, 완전히 아세틸화된 덴드리머는 결합 반응을 나타내지 않았다. 또한, G7-βH2_mt의 PD-L1 친화도는 야생형 βH2-덴드리머 접합체 대조군 (G7-βH2_wt)보다 더 높았으며, 이는 조작된 PD-1 서열 (βH2_mt)이 더 높은 친화도를 유도하였음을 나타낸다. 그러므로, 본 발명자들은 βH2_mt 펩티드를 PDL1-표적화 리간드로 선택하고, 다양한 아세틸화 정도를 가진 덴드리머 표면에 접합시켜서, 효과적인 펩티드 결합가를 결정하였다. 다가 결합 상호작용의 결과로서의 결합 강도는 리간드 분자의 수에 비례할 것으로 기대될 수 있다. 그러나, 더 많은 수의 βH2_mt 펩티드를 갖는 DPC (즉, 80% 및 60% 아세틸화된 덴드리머로부터 제조된 DPC)의 경우에 PD-L1 친화도가 더 낮은 것으로 관찰되었다 (도 5). 이러한 의외의 결과는 다른 곳에서도 관찰되는, 리간드 수의 단순한 증가보다는, 리간드 간의 최적화된 공간적 거리가 더 강한 결합을 달성하는데 핵심적인 역할을 한다는 사실에 기인한 것으로 보인다. 이러한 결과는 종합적으로 90% 아세틸화된 덴드리머로부터 제조된 G7-βH2_mt가 해당 대응물인 G7-βH1_mt 및 G7-βH2_wt보다 PD-1/PD-L1 상호작용을 더 효과적으로 길항 작용할 가능성이 있음을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자들은 G7-βH2_mt의 PD-L1 결합 역학을 항-PD-L1 (aPD-L1) 항체 및 유리 βH2_mt 펩티드의 PD-L1 결합 역학과 비교하였다. SPR 분석에 따르면, G7-βH2_mt는 βH2_mt보다 5배 더 높은 PD-L1 친화도를 보였고 (K D 2.75×10-9 대 1.19×10-4), 이는 도 6-8에 개시된 바와 같이 전체 aPD-L1 항체와 유사하다 (K D 2.09×10-9). 덴드리머당 30개의 펩티드만이 존재하였지만 (데이터는 표시되지 않음), G7-βH2_mt의 해리 속도 상수 (kd)가 유리 펩티드와 비교하여 ~180배까지 감소한 것은 주목할 만하다. 결합의 이러한 비-선형 향상은 다가 결합 효과의 특징이며, 즉 다가 객체는 1가 대응물보다 표적 분자에 더 높은 재결합 기회를 갖는다 (통계적 재결합 메커니즘). 흥미롭게도, 다가 결합 효과에서 중요하지 않은 역할을 하는 것으로 알려진 결합 속도 상수 (ka)가 또한 비-선형으로 증가하였다 (2.52×105 대 1.07×103). 이러한 결과는 다가 결합에 추가하여 다른 요인들이 G7-βH2_mt의 PD-L1 결합을 유의미하게 향상시키는데 기여한다는 것을 의미한다.
G7-βH2_mt의 향상된 결합 역학 이면의 메커니즘을 설명하기 위해, 본 발명자들은 덴드리머에 접합 시에 표적 친화도 및 선택성에 유의미하게 영향을 미치는 펩티드의 폴딩 구조 변화를 조사하였다[20]. 도 9는 펩티드 폴딩 정도가 관찰된 G7-βH2_mt (적색 선)의 원편광 이색성 (CD) 프로파일을 보여주며 (약 220 nm에서 네기티브 신호), 이는 α-나선 구조로 인한 222 nm에 중심을 둔 전형적인 넓은 네가티브 CD 밴드와는 구별된다. 대조적으로, 유리 βH2_mt는 약 200 nm에서 강한 네가티브 CD 밴드에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분 언폴딩된 랜덤-코일 구조 (unfolded random-coil structure) (검은색 선)를 나타내었다. 덴드리머에 대한 CD 프로파일 (적색 및 회색 선 모두)은 원자외선 (far ultraviolet) 광을 흡수하는 덴드리머 백본의 풍부한 아미드 결합으로 인해 218 nm 미만의 신호를 생략하였음에 유의한다. 1 μM 농도의 덴드리머를 사용하여 거대분자에 의한 저파장 광의 흡수를 최소화하고, 펩티드의 2차 구조가 전형적으로 특성화되는 190-230 nm 범위의 데이터 해석을 위한 강한 충분한 신호를 수득하였다.
그 다음에 본 발명자들은 ATR-FTIR (attenuated total reflection-Fourier transform Infrared)을 사용하여 펩티드의 폴딩 거동을 연구하였다. 도 10에 개시된 바와 같이, FTIR 스펙트럼은 βH2_mt 펩티드에서 미량의 β-turn 구조 (1670 및 1690 cm-1 부근에서 약한 흡수)와 함께, 랜덤 코일 및 β-sheet (1640 cm-1 부근의 넓은 밴드)의 존재를 확인하였다. 대조적으로, G7-βH2_mt의 FTIR 스펙트럼은 가닥간 진동 커플링 (inter-strand vibrational couplings)의 경우 1634 cm-1 및 β-turn 입체형태의 경우 1668 및 1683 cm-1에서 분해 가능한 흡수를 갖는 β-헤어핀 구조의 시그니처를 표시하였다. 그러므로, 구조 분석 모두는 종합적으로 βH2_mt의 헤어핀 구조가 덴드리머 접합에 의해 안정화됨을 보여주었다. 이러한 결과는 표면 테더링이 배제된 부피 효과를 통해 생체분자 구조를 안정화시키고 (도 11), 즉 기질이 존재하는 경우, 언폴딩되는 펩티드의 입체형태적 자유도가 제한되어, 폴딩에 대한 엔트로피 비용을 감소시킨다고 제시하는 여러 이론적 연구와 일치한다 (도 11).
실험 결과를 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 추가로 단일 βH2_mt 펩티드-5세대 (G5) PAMAM 덴드리머 접합체를 사용하여 분자 동역학 (MD) 시뮬레이션을 수행하였다. 효율적인 계산 시간을 위해, 더 큰 G7 대신에 G5 PAMAM 덴드리머를 사용하였음에 유의한다. 덴드리머 표면의 펩티드 거동은 초기에 (1) 확장 및 (2) 폴딩된 βH2_mt로부터 500 ns 동안 비교하였다 (도 12 및 13). 용액에서 폴딩 입체형태 및 확장된 입체형태를 모두 나타내는 유리 βH2_mt와 대조적으로, 초기에 확장된 펩티드는 폴딩된 구조로 구부러지고, 초기에 폴딩된 βH2_mt는 덴드리머 표면에서 폴딩된 입체형태를 안정하게 유지하였다. 흥미롭게도, 펩티드는 헤어핀 구조를 유지하면서 (데이터는 표시되지 않음), 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용을 포함하는, 덴드리머 표면과 다양한 분자간 힘을 생성하였다. 일반적으로, 표면과 이러한 분자 상호작용이 형성되면, 단백질의 구조적 안정성이 저하되는 것으로 알려져 있다. 그러나 βH2_mt는 전체 PD-1 단백질 구조 내에 다수의 분자 상호작용에 원래 노출된 단리된 펩티드 세그먼트이다 (데이터는 표시되지 않음). 이러한 분자 상호작용은 상기 기재된 감소된 엔트로피 비용에 추가하여, 덴드리머 표면에서 폴딩된 입체형태로 펩티드 분자의 추가적 안정화에 기여하는 것으로 보인다. β-헤어핀을 안정화시키는 최선의 방법은 펩티드에서 2개의 가닥을 공유 가교 (covalent cross-linking)시키는 것이다. 그러나 화학적 변형은 전형적으로 펩티드 제조 과정을 복잡하게 만들고, 합성 수율을 크게 감소시킨다. 가닥 간 비-공유 결합의 도입은 통상적으로 사용되는 또 다른 전략이며; 그러나 이는 잠재적으로 펩티드의 물리화학적 특성에 영향을 미치는, 실질적인 아미노산 치환을 필요로 한다. 반대로, 본 발명자들의 DPC 전략은 펩티드 구조에 대한 최소한의 변형으로 펩티드의 헤어핀 구조를 안정화시킬 수 있다. 덴드리머 나노입자로부터 부여된 다가 결합 이점과 조합하여, 이러한 고유한 DPC 플랫폼은 β-sheet-풍부 단백질 표면을 효과적으로 길항하고 표적화하는 새로운 방법을 제시한다.
다음으로, G7-βH2_mt를 PD-1/PD-L1 억제제로서 사용할 가능성을 조사하였다. FP (fluorescence polarization) 경쟁 분석을 수행하기 위해, 플루오레세인-접합된 βH2_mt (fβH2_mt) 펩티드를 합성하고, PD-L1 단백질과 표적 복합체를 제작하는데 사용하였다 (도 14). 경쟁 실험 (fβH2_mt, 10 nM; PD-L1, 2 μM)에서, 복합체 완전성은 βH2_mt 펩티드 및 완전히 아세틸화된 덴드리머의 부가에 의해 영향을 받지 않은 반면에, G7-βH2_mt는 PD-L1로부터 fβH2_mt의 용량-의존적 치환을 유도하였다 (도 15). 흥미롭게도, DPC는 PD-L1 친화도가 약간 더 낮음에도 불구하고, aPDL1 항체보다 더 효과적인 경쟁력을 보여주었으며, 이는 DPC 표면에 다수의 표적 단백질을 수용하는 다가 리간드 디스플레이에 기인할 수 있다 (도 16).
효율을 더 자세히 조사하기 위해, DPC를 인 비트로 테스트하였다. 도 17 및 18에 개시된 바와 같이, G7-βH2_mt와 786-O 세포 (PD-L1 과발현 세포주)의 강한 세포 상호작용을 형광 현미경을 사용하여 관찰한 반면에, DPC는 MCF-7 세포 (낮은 수준의 PD-L1 발현)와의 상호작용은 유의미하게 적었으며, 이는 G7-βH2_mt의 높은 PD-L1 선택성을 입증하였다. 인 비트로 PD-1/PD-L1 억제 효과는 다른 곳에서 서술된 바와 같이 암 세포와 공동-배양한 후에 Jurkat T 세포에 의해 분비되는 사이토카인 (인터루킨-2, IL-2)의 양을 측정함으로써 평가하였다 (도 19). PD-1/PD-L1 결합의 차단은 T 세포를 활성화하고 이들의 사이토카인 생성을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있다. 도 20은 G7-βH2_mt가 786-O/Jurkat T 세포 상호작용을 효과적으로 억제하여 T 세포로부터의 IL-2 분비를 비-처리 암 세포와 비교하여 1.52배 (p<0.001) 증가시켰음을 보여주었고, 이는 1.34배 향상 (p = 0.011)만 보여준 aPD-L1 항체보다 훨씬 더 현저하다. 이는 G7-βH2_mt의 다가 결합 효과에 기인할 수 있다. 유리 펩티드나, 완전히 아세틸화된 덴드리머는 현저한 IL-2 생성을 유도하지 않았다.
PD-1/PD-L1 억제를 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 DPC 처리가 암 세포의 항암제 저항성에 영향을 미칠 수 있는지를 테스트하였고, 이는 많은 임상 및 전임상 연구에서 면역 체크포인트 차단에 의해 감소되는 것으로 입증되었다. 종양 (786-O 또는 MCF-7) 및 Jurkat T 세포를 사용하는 공동-배양 모델을 사용하여 독소루비신 (DOX) 및 G7-βH2_mt의 시너지 세포독성 효과를 조사하였다 (도 21). 상이한 PD-L1 길항제로 처리한 암 세포를 T 세포와 공동-배양한 다음에, DOX 처리하여 세포 사멸을 유도하였다. 도 22에 개시된 바와 같이, G7-βH2_mt로 PD-L1 분자를 차단하면 786-O 세포의 항암제 저항성이 현저히 감소하여, 독소루비신 단독으로 처리한 세포와 비교하여 8.4 ± 3.8% 만큼 세포 생존율 감소를 나타내었다 (p = 0.022). G7-βH2_mt는 7.2 ± 3.7% 세포 생존율 감소를 유도한 aPD-L1 항체보다 약간 더 효과적이었다 (p = 0.030). 유리 펩티드가 항암제 저항성에 약간의 영향만 미치고 (1.8 ± 2.0% 감소; p = 0.334), 완전히 아세틸화된 G7 덴드리머가 암 세포에 세포독성 효과가 없다는 점을 고려하면, 이러한 결과는 다가 G7-βH2_mt가 PD-1/PDL1 면역 체크포인트를 효과적으로 차단한다는 또 다른 증거를 제공한다. 낮은 수준의 PD-L1을 발현하는 MCF-7 세포가 또한 유사한 경향을 나타내었지만, 그 차이는 높은 PD-L1 발현 786-O 세포만큼 유의미하지 않았다.
결론적으로, 본 발명자들은 DPC 접근 방식이 단백질 표면으로부터 단리된 β-헤어핀 펩티드가 다량체화되고 나노스케일 덴드리머에서 입체형태로 안정화되어, 유의미하게 향상된 표적 친화도를 나타낼 수 있음을 입증하였다. 향상된 결합 역학은 DPC가 유리 펩티드보다 극적으로 더 강한 PD-1/PD-L1 억제 효과를 나타내고, aPD-L1 항체에 필적할 만한 수준의 효율을 나타내는 인 비트로 효율의 유의미한 향상으로 해석되었다. 항체를 이용한 PD-L1 억제는 비-소세포 폐암, 방광암 및 메르켈 세포 (Merkel cell) 피부암과 같은 여러 타입의 암 치료에서 이미 임상적으로 효과가 입증되었다. 그러나 현재 승인된 모노클로날 항체 기반의 길항제는 높은 비용과 모듈성의 부족으로 한계가 있다. 덴드리머-펩티드 시스템은 면역요법 뿐만 아니라 다른 항종양제까지 수용할 수 있는 플랫폼 기술을 제공하기 때문에, 본 발명자들의 전략은 이러한 문제를 해결할 잠재력이 있다. 또한, 많은 단백질 표면에 있는 다양한 β-헤어핀 펩티드가 이러한 DPC 접근 방식과 적합할 수 있어서, 다양한 생물의약 적용에서 사용될 잠재력이 증가하였다. 이러한 연구는 암 치료를 위한 면역 체크포인트 차단을 포함하여, 다양한 질병을 해결하기 위해 단백질 상호작용의 효과적인 조절을 위한 새롭게 조작된 펩티드-나노입자 플랫폼을 제공한다.
실시예 2: Trpzip DPC
β-헤어핀이 Trpzip에 의해 안정화되는 경우, Trp 잔기는 동일한 펩티드 표면 상에 배치된다 (도 25). 그러므로, 적절한 방향으로 펩티드의 표면 부착은 Trp 클러스터의 노출을 방지하고, 결과적으로 표적 결합에서 이들의 비-특이적 기여를 최소화한다. Trpzip-DPC 혼성 시스템을 개발하기 위해, PD-1/PD-L1 복합체 구조와 덴드리머 접합 과정을 고려하여 pL1의 1차 구조를 변형시켜서 (서열번호: 4), 서열번호: 5를 제공하였다 (도 26). PD-1 코어에 매립된 아미노산 잔기는 PD-L1 결합과 관련이 없기 때문에, 본 발명자들은 Trpzip 구조를 도입하기 위해 이들의 일부 (아르기닌, 아스파르테이트 및 류신)를 Trp 잔기로 치환하였다. 코어 잔기 중 하나인 발린을 덴드리머 접합을 위해 리신으로 추가로 치환하였고, 이는 PD-L1 결합 표면을 노출시키고 Trp 클러스터가 나노입자 표면 (pL1TZ)을 향하도록 펩티드 방향성을 결정한다. 나노입자 스캐폴드로서, 본 발명자들은 덴드리머를 선택하였다.
도 27에 개시된 바와 같이, pL1은 200 nm 부근에서 강한 네가티브 밴드를 갖는 랜덤 코일 구조로 존재하는 것을 발견하였다. 한편, pL1TZ의 CD 스펙트럼은 200 nm에서 네가티브 밴드, 215 nm에서 약한 숄더 (β-sheet), 및 228 nm에서 약한 포지티브 밴드 (Trp 잔기들 간의 상호작용을 보여주는 엑시톤-커플링된 밴드)로 구성되며, 이는 Trpzip 형성으로 부분적으로 안정화된 β-헤어핀 구조를 보여준다 (도 28). 흥미롭게도, 2차 구조는 덴드리머 표면에 부착되는 경우 한 단계 더 안정화되었으며, 이는 200 및 230 nm에서 CD 신호의 유의미한 증가로 확인되었다 (도 29). 이전 연구의 발견에 기반하여, 본 발명자들은 이러한 표면-보조 헤어핀 안정화를 배제된 부피 효과에 귀속시켰고: 표면의 존재는 정렬되지 않은 구조의 입체형태적 공간을 제한하여, 언폴딩된 상태의 엔트로피를 감소시켰다 (도 30). 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석으로 안정화되고 다량체화된 PD-L1 결합 펩티드가 유리 펩티드와 비교하여 매우 증가된 PD-L1 결합 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 31). 추가로, DPC는 또한 펩티드/덴드리머 계면 공간에서 Trp 잔기를 감추어서, 현저하게 향상된 PD-L1 선택성을 나타내었다 (도 32).
실시예 3: 덴드리머-펩티드 접합체는 인 비트로 치료 효능을 향상시킨다.
펩티드 pPD1은 마우스 PD-L1에 결합하는, 서열 IYLCGAISLHPKAKIEESPGA (서열번호: 6)를 갖는다. 상기 펩티드는 시스테인 (C) 기를 통한 SMCC 화학을 통해 덴드리머에 접합되었다.
암컷 Balb/c 마우스 (4-6주령)는 Charles River에서 입수하였다. 동물 절차 및 유지 관리는 University of Wisconsin의 기관 지침에 따라 수행하였다. 4T1 세포주를 각 마우스의 등쪽 옆구리에 피하 주사로 접종하고, 캘리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양이 ~250 mm3의 부피에 도달하면, 마우스를 무작위로 그룹으로 나누고, 치료를 시작하였다. 100 μL의 시약을 꼬리 정맥 주사로 3-4회 투여하였다. 시간의 함수로서 종양 부피 및 체중을 도 33 및 34에 제공하였다. IVIS Spectrum Imaging System (Perkin Elmer)을 사용하여 종양 생물발광에 대해 마우스를 검사하였다. 도 35의 데이터에서, 35개의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시어 (특히 하기 청구항의 맥락에서)의 사용은 본원에서 달리 지시되거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 용어 제1 (first), 제2 (second) 등은 임의의 특정 순서를 의미하는 것이 아니라, 단순히 편의상 복수의 대상, 예를 들어, 층 (layers)을 표시하는 것을 의미한다. 용어 "포함하는 (comprising)", "갖는 (having)", "포괄하는 (including)" 및 "함유하는 (containing)"은 달리 명시되지 않는 한, 개방형 (open-ended) 용어 (즉, "포함하지만 이에 제한되지 않는 (including, but not limited to)"을 의미)로 해석되어야 한다. 값 범위의 기재는 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 단순히 범위 내에 있는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 기재된 것처럼 명세서에 포함된다. 모든 범위의 끝점은 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합될 수 있다. 본원에서 설명된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 수행될 수 있다. 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예: "예컨대 (such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 비-청구 요소 (non-claimed element)를 본원에서 사용된 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명이 예시적인 구체예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고, 등가물이 그 요소를 대체할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 교시에 특정 상황 또는 재료를 적용하기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 최상의 방식으로서 개시된 특정 구체예에 제한되지 않고, 본 발명은 첨부된 청구항들의 범위 내에 속하는 모든 구체예를 포함하는 것으로 의도된다. 모든 가능한 변형에서 전술한 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Wisconsin Alumni Research Foundation Hong, Seungpyo Jeong, Woo-jin <120> Peptide-Nanoparticle Conjugates <130> WIS0054US2 (P200080US02) <150> US 62/927293 <151> 2019-10-29 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> comment BetaH1- wt sequence <400> 1 Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Leu Gln Ile Lys 1 5 10 15 Glu Ser Leu Arg Ala 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> comment BetaH1- mutant sequence <400> 2 Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Arg Ile Gln Ile Lys 1 5 10 15 Glu Ser Leu Arg Ala 20 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> comment BetaH2- wt sequence, and <400> 3 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Arg Lys 1 5 10 15 Ala Ala <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> comment BetaH2 mutant sequence <400> 4 His Val Val Trp His Arg Glu Ser Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ala <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trp-Zip BetaH2 mutant sequence <400> 5 His Lys Val Trp His Trp Glu Ser Pro Ser Gly Gln Trp Asp Thr Trp 1 5 10 15 Ala Ala <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide pPD1 based on mouse <400> 6 Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu 1 5 10 15 Glu Ser Pro Gly Ala 20

Claims (31)

  1. 다가 나노입자 코어 (multivalent nanoparticle core)에 접합된 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 다가 나노입자 코어를 포함하는 나노입자 시스템 (nanoparticle system).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 다가 나노입자 코어는 초분지 폴리머 (hyperbranched polymer), 덴드리머 (dendrimer), 덴드론 (dendron), 혼성 나노입자 (hybrid nanoparticle), 또는 미셀 (micelle)을 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 미셀은 양친매성 덴드론-코일 (dendron-coil)을 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 혼성 나노입자는 덴드리머-엑소좀 혼성체 (dendrimer-exosome hybrid)를 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 혼성 나노입자는 β-헤어핀 펩티드가 공유 결합으로 부착된 다가 폴리머 스캐폴드 나노입자 코어; 및 상기 폴리머 스캐폴드 나노입자 코어를 캡슐화하는 외부 쉘 (outer shell)을 포함하고, 상기 외부 쉘은 리포솜 또는 폴리머 쉘을 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 덴드리머는 폴리(아미도-아민) (PAMAM) 덴드리머, 폴리에스테르 덴드리머, 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머, 디아미노부탄 아민 폴리프로필렌이민 테트라민 (DAB-Am 4) 덴드리머, 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머, 폴리리신 덴드리머, 폴리에스테르 덴드리머, 입티센 (iptycene) 덴드리머, 지방족 폴리(에테르) 덴드리머, 방향족 폴리에테르 덴드리머, 또는 이들의 조합인 것인 나노입자 시스템.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 덴드리머는 PAMAM 덴드리머인 것인 나노입자 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 종양 표적화 펩티드, 세포-투과성 펩티드, 체크포인트 억제제 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 β-헤어핀 펩티드, 또는 단백질 폴딩 질병 (protein folding disease)의 치료를 위한 펩티드를 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 Trpzip 펩티드를 포함하는 것인 나노입자 시스템.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 PD-L1에 높은 친화도로 결합하는 PD-1의 표면 펩티드와 같은, 면역 체크포인트 억제제 β-헤어핀 펩티드인 것인 나노입자 시스템.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자 시스템은 치료제, 예방제 또는 진단제와 추가로 회합되는 것인 나노입자 시스템.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 치료제는 화학요법제 또는 치료적 핵산인 것인 나노입자 시스템.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 진단제는 영상화제인 것인 나노입자 시스템.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 항의 나노입자 시스템 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 청구항 17에 있어서, 치료제, 예방제 또는 진단제를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  16. 복수 개의 β-헤어핀 펩티드를 다가 나노입자 코어에 접합시켜서 나노입자 시스템을 제공하기에 충분한 조건하에, 다수의 반응성 말단기를 포함하는 다가 나노입자 코어를 하나 이상의 β-헤어핀 펩티드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 나노입자 시스템을 제조하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 반응성 말단기는 디사이클로헥실카보디이미드, 디이소프로필카보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드, 1,1'-카보닐디이미다졸, N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트, N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트, 2-머캅토에틸아민, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 숙신이미딜 아이오도아세테이트, 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스테르, N-γ-말레이미도부티릴-옥시설포숙신이미드 에스테르, 니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로 페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 티오피리딜 에스테르, 티오니트로페닐 에스테르, 및 이들 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 다가 나노입자 코어는 2개 이상의 상이한 반응성 말단기를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 다수의 반응성 말단기를 포함하는 다가 나노입자 코어를 치료제, 예방제 또는 진단제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 다가 나노입자 코어는 초분지 폴리머, 덴드리머, 덴드론, 혼성 나노입자 또는 미셀을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 미셀은 양친매성 덴드론-코일을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 혼성 나노입자는 덴드리머-엑소좀 혼성체를 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 혼성 나노입자는 면역 체크포인트 억제제가 공유 결합으로 부착된 다가 폴리머 스캐폴드 나노입자 코어; 및 상기 폴리머 스캐폴드 나노입자 코어를 캡슐화하는 외부 쉘을 포함하고, 상기 외부 쉘은 리포솜 또는 폴리머 쉘을 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 덴드리머는 폴리(아미도-아민) (PAMAM) 덴드리머, 폴리에스테르 덴드리머, 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머, 디아미노부탄 아민 폴리프로필렌이민 테트라민 (DAB-Am 4) 덴드리머, 폴리프로필아민 (POPAM) 덴드리머, 폴리리신 덴드리머, 폴리에스테르 덴드리머, 입티센 덴드리머, 지방족 폴리(에테르) 덴드리머, 방향족 폴리에테르 덴드리머, 또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 조합인 것인 방법.
  25. 청구항 20에 있어서, 상기 덴드리머는 PAMAM 덴드리머인 것인 방법.
  26. 청구항 16에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 종양 표적화 펩티드, 세포-투과성 펩티드, 체크포인트 억제제 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 β-헤어핀 펩티드, 또는 단백질 폴딩 질병의 치료를 위한 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  27. 청구항 16에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 PD-L1에 높은 친화도로 결합하는 PD-1의 표면 펩티드와 같은, 면역 체크포인트 억제제 β-헤어핀 펩티드인 것인 방법.
  28. 청구항 16에 있어서, 상기 β-헤어핀 펩티드는 Trpzip 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  29. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 나노입자 시스템을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역치료 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 대상체는 인간 암 환자 또는 면역 질환을 가진 인간 환자인 것인 면역치료 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 방사선 요법, 화학요법, 수술, 또는 이들 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 면역치료 방법.
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