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KR20220059958A - 암 세포에 교번 전기장을 적용하고 체크포인트 억제제를 투여하여 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법 - Google Patents

암 세포에 교번 전기장을 적용하고 체크포인트 억제제를 투여하여 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법 Download PDF

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KR20220059958A
KR20220059958A KR1020227011678A KR20227011678A KR20220059958A KR 20220059958 A KR20220059958 A KR 20220059958A KR 1020227011678 A KR1020227011678 A KR 1020227011678A KR 20227011678 A KR20227011678 A KR 20227011678A KR 20220059958 A KR20220059958 A KR 20220059958A
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KR
South Korea
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electric field
alternating electric
cancer cells
days
cells
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020227011678A
Other languages
English (en)
Inventor
동지앙 첸
데이비드 트란
Original Assignee
노보큐어 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노보큐어 게엠베하 filed Critical 노보큐어 게엠베하
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Abstract

암 세포(예: 교모세포종 세포)의 활력성은 100 내지 500kHz 주파수의 교번 전기장을 약 3 내지 10일 동안 암 세포에 적용하고 암 세포에 체크포인트 억제제를 투여함으로써 감소될 수 있다.

Description

암 세포에 교번 전기장을 적용하고 체크포인트 억제제를 투여하여 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법
본 출원은 2019년 9월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/898,290호의 이점을 청구하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 출원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 기술은 암 세포에 교번 전기장을 적용하고 체크포인트 억제제를 투여하여 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법과 관련된다.
종양 치료장 (Tumor Treating Fields, TTFields)은 낮은 강도, 중간 주파수 (예를 들어, 100-500 kHz), 교류 전기장의 비침습적 적용을 통해 전달되는 효과적인 항-종양 치료 양상이다. TTFields는 극성 미세소관에 방향성 힘을 가하고 유사분열 방추의 정상적인 조립을 방해한다. 미세소관 역학에 대한 이러한 간섭은 비정상적인 방추 형성 및 후속적인 유사분열 정지 또는 지연을 초래한다. 세포는 유사분열 정지 중에 죽거나 세포 분열로 진행되어 정상 또는 비정상적 이수성 자손의 형성을 초래할 수 있다. 사배체 세포의 형성은 슬리피지 (slippage)를 통한 유사분열 종결 (mitotic exit)로 인해 발생할 수 있거나 부적절한 세포 분열 동안 발생할 수 있다.
비정상적인 딸 세포는 후속 간기에서 죽거나, 영구적인 정지를 겪을 수 있으며, 또는 추가적인 유사분열을 통해 증식하여, 추가 TTFields 공격을 받을 수 있다. Giladi M et al. Sci Rep. 2015;5:18046
생체내 맥락에서, TTFields 요법은 웨어러블 및 휴대용 장치(Optune®)를 사용하여 전달될 수 있다. 상기 전달 시스템은 전기장 발생기, 4개의 접착 패치(비침습성, 절연 변환기 어레이), 재충전 가능한 배터리 및 운반 케이스를 포함한다. 상기 변환기 어레이는 피부에 적용되고 상기 장치 및 배터리에 연결된다. 상기 요법은 낮과 밤에 걸쳐 가능한 많은 시간 동안 착용되도록 설계된다.
전임상 환경에서, TTFields는, 예를 들어, InovitroTM TTFields 랩 벤치 시스템을 사용하여 시험관 내 (in vitro)에서 적용될 수 있다. InovitroTM는 TTFields 발생기 및 플레이트당 8개의 세라믹 접시를 포함하는 베이스 플레이트를 포함한다. 세포는 각각의 접시 내부에 배치된 커버 슬립 상에 도금된다. TTFields는 각각의 접시에 고유전율 세라믹에 의해 절연된 두 개의 수직 쌍의 변환기 어레이를 사용하여 적용된다. 각각의 접시에서 TTField의 방향은 매 1초마다 90°로 전환되고, 따라서 세포 분열의 상이한 방향 축을 커버한다.
최근에, 면역 감지 분자 사이클릭 GMP-AMP 합성효소 (cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-인터페론 유전자의 자극제(STING, TMEM 173에 의해 암호화됨) 경로가 세포질 DNA 감지의 중요한 성분으로서 확인되었으며 세포에서 면역 반응을 매개하는데 중요한 역할을 한다. Ghaffari et al., British Journal of Cancer, volume 119, pages 440-449 (2018); 예를 들어, 도 3 참조. STING 경로의 활성화는 세포에서의 이상(예를 들어, 세포질 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 존재)에 반응함으로써 면역 반응을 매개한다.
체크포인트 단백질은 면역계 (예를 들어, T-세포 증식 및 IL-2 생성)의 억제제로서 작용하여 이를 유도할 수 있다. Azoury et al., Curr Cancer Drug Targets. 2015;15(6):452-62. 체크포인트 단백질은 면역 반응을 중단시킴으로써 암에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 체크포인트 단백질의 기능을 차단하는 것은 암 세포를 공격하기 위해 휴면 T-세포를 활성화시키는데 사용될 수 있다. 체크포인트 억제제는 암 세포를 공격하기 위해 면역계를 동원하기 위해 체크포인트 단백질을 억제하는 암 약물이다.
따라서, 사이토카인의 생산 및 암성 세포를 공격하기 위한 T-세포의 동원을 가능하게 하는 체크포인트 단백질의 활성을 차단하기 위한 암 치료로서 체크포인트 억제제를 사용하는 것에 관심이 있고 면역요법 약물 개발에서 활성 영역이다.
필요한 것은 면역 반응을 활성화하고 체크포인트 억제제와 같은 암 치료에 대한 반응을 증강시키고 자극하는 방법이다.
교번 전기장 적용 및 체크포인트 억제제 투여를 통해 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법은 없었다. 본 실시예는 이러한 종래 기술의 난점을 해속하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 방법은 3일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 교번 전기장을 암에 적용하고 체크포인트 억제제를 암 세포에 투여함으로써 암 세포의 생존력을 감소시킨다. 교번 전기장은 3일 동안 연속적으로 또는 불연속적으로 암 세포에 적용될 수 있다. 또 다른 양상에서, 교번 전기장은 3일 각각에서 하루에 적어도 4시간 동안, 또는 3일 각각에서 하루에 적어도 6시간 이상 동안 암 세포에 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 암 세포 (예를 들어, 교모세포종 세포)를 TTFields에 노출시키는 것은 전염증성 사이토카인 (예컨대, 타입 I 인터페론)의 생성 및 피로피토시스(pyroptosis)를 유도하는 STING 경로를 유도한다. 일 양상에서, TTFields로 STING 경로를 활성화시키는 것은 암 세포를 "백신접종 (vaccinating)"시키는 것과 유사하여, 암 세포가 체크포인트 억제제와 같은 항암 약물에 의한 치료에 특히 민감하게 한다. 따라서, 암 세포를 TTField에 연속적으로, 불연속적으로 또는 간헐적으로 노출시키는 것은 STING 경로를 유도한 후 하나 이상의 체크포인트 억제제 및/또는 다른 종양학 약물을 사용한 치료에 의해 암 세포를 추가 치료에 민감하게 만들 수 있다.
본 기술에 의하면 교번 전기장 적용 및 체크포인트 억제제를 투여하여 암 치료를 수행할 수 있다는 장점이 제공된다.
도 1은 TTFields에 노출된 교모세포종(GBM) 세포(TTFields) 대(vs) 대조군 GBM 세포(대조군)에서 TTFields가 세포질 미세핵(이중가닥 DNA 또는 dsDNA)의 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 2는 핵 라민 B1 구조가 TTFields에 노출된 후 파괴되어, dsDNA가 LN827 세포에서 세포질로 방출되는 것을 나타낸다.
도 3은 세포질 dsDNA에 의해 유도된 생화학적 경로(전염증(STING) 및 피로피토시스(pyroptosis) 경로)의 예를 나타낸다.
도 4는 cGAS 및 AIM2가 TTFields에 대한 노출에 응답하여 미세핵과 독립적으로 공동-국소화되는 것을 나타낸다.
도 5는 도 4의 결과로부터의 미세핵과의 AIM2/cGAS 공동-국소화의 백분율의 차트를 제공한다.
도 6은 U87 및 LN827 세포에서 하루 동안 TTFields에 노출된 후 IRF3 및 p65의 인산화를 나타낸다.
도 7은 TTFields가 STING의 하류 (downstream)에서 타입 I IFN 반응 및 전염증성 사이토카인을 유도하는 것을 나타낸다.
도 8은 STING이 GBM 세포(LN428 인간 세포 및 KR158 마우스 세포)에서 TTFields에 의해 활성화된 후 분해되는 것을 나타낸다.
도 9는 STING이 GBM 세포(LN428 인간 세포, KR158 마우스 세포, 및 F98 래트 세포)에서 dsDNA 및 TTFields 치료에 의해 유도된 염증 반응에 필요하다는 것을 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 자가포식 (autophagy) 및 dsDNA 또는 TTFields가 KR158 및 F98 GBM 세포에서 STING-의존성 전염증성 반응을 상승적으로 유도하는 것을 나타낸다.
도 11a 및 11b는 TTFields-유도된 염증성 사이토카인 생성이 F98 래트 교종 모델에서 STING 및 AIM2에 의존한다는 것을 나타낸다.
도 12는 종양 크기가 TTFields에 반응하는 염증성 사이토킨 발현의 배수 변화와 관련이 있음을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 CD45 세포의 GBM으로의 동원이 F98 래트 신경교종(glioma) 모델에서 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서 더 낮다는 것을 나타내는 예시적인 히트 맵을 제공한다.
도 14a 및 14b는 CD3(T 세포) 동원이 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서 더 낮다는 것을 나타내는 예시적인 히트 맵을 제공한다.
도 15a 내지 15d는 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서, DC/매크로파지 동원이 더 낮고 MDSC 동원은 더 높음을 나타내는 예시적인 히트 맵을 제공한다.
도 16은 도 17의 데이터의 정량적 결과를 제공한다.
도 17은 인간 GBM 세포주 LN308 및 LN827에서 TTField에 3일의 노출에 의해 유도된 '고스팅 (ghosting)'을 나타낸다.
도 18은 TTFields에 노출된 U87 GBM 세포에서 TTFields가 막 손상을 유도하고 GSDMD를 감소시키는 것을 나타낸다.
도 19는 TTFields가 인간 백혈병 단핵구 세포주 THP-1 대식세포에서 막 손상을 유도하고 GSDMD를 절단하는 것을 나타낸다.
도 20은 24시간 동안 TTField에 노출된 THP1-GFP PMA 전처리된 세포를 나타낸다.
도 21은 TTFields에 노출되지 않은 THP1-GFP PMA 전처리된 대조군 세포를 나타낸다.
도 22는 TTField가 1일 및 3일 동안 TTField에 노출된 후 피로피토시스-의존성 카스파제-1 (pyroptosis-dependent Caspase-1) 활성화를 유도하는 것을 나타낸다.
도 23은 TTFields-유도된 카스파제-1 활성화 및 피로피토시스가 1일 및 3일 동안 TTFields에 노출된 후 더 낮은 수준의 전장 IL-1 베타 (full-length IL-1 beta) 및 더 높은 LDH 방출과 일치하는 것을 나타낸다.
도 24는 TTFields-유도된 STING/AIM2 활성화 및 염증성 사이토카인 생성이 TTTFields 치료가 종료된 후 적어도 3일 동안 지속되는 것을 나타낸다.
도 25는 짧은 펄스 TTF-유도된 STING/AIM2 활성이 감소된 종양 성장 및 심경부 배수 림프절 (deep cervical draining lymph nodes)로의 증가된 수지상 세포 (DC) 동원과 관련됨을 나타낸다.
도 26은 카스파제 1이 AIM2 없이 TTFields-처리된 세포에서 검출됨을 나타낸다.
교모세포종 (Glioblastoma, GBM)은 공격적인 화학방사선요법에도 불구하고 성인에서 가장 일반적이고 치명적인 악성 뇌암이다. 종양 치료 영역 (Tumor Treating Fields, TTFields)은 최근에 새로 진단된 GBM 환자에 대한 아쥬반트 테모졸로마이드 (temozolomide) 화학요법과 조합하여 승인되었다. TTField의 추가는 전체 생존에서 상당한 개선을 초래하였다. TTFields는 유사분열 거대분자(mitotic macromolecules)의 조립을 방해하여 염색체 분리, 무결성 및 안정성을 방해하는 것으로 것으로 생각되는 저-강도 교번 전기장이다. 많은 환자에서, 증가된 종양주위 부종의 일시적 단계는 종종 TTFields 치료의 과정에서 초기에 관찰되고, 그 후 객관적 방사선 반응이 이어지며, 이는 TTFields에 의한 치료 효과의 주요 성분이 면역 매개된 과정일 수 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 관찰의 기초가 되는 메커니즘은 여전히 불명확하다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, TTFields-활성화된 미세핵-dsDNA 센서 복합체는 i) 특정 LDH 방출 어세이 및 AIM2-동원 카스파제1 및 파이로프토시스 특이적 Gasdermin D (pyroptosis-specific Gasdermin D)의 절단에 의해 측정된 발열성 (pyroptotic) 세포 사멸의 유도; 및 ii) NFκB 경로의 하류에서 타입 I 인터페론(IFN) 및 전염증성 사이토카인을 포함하는 STING 경로 성분의 활성화를 유도하였다. 예를 들어, 도 3 참조. 골수 세포 또는 비장세포와 녹다운 GBM 세포로부터 수득된 상청액 (supernatants)의 공동-배양 실험에서 AIM2 또는 STING 또는 둘 모두의 GBM 세포-특이적 shRNA 고갈은 면역 세포의 유도를 역전시킬 수 있었다.
GBM 세포주를 시험관내 TTFields 시스템을 사용하여 200 kHz의 임상적으로 승인된 주파수에서 TTFields로 처리하였다. 일 양상에서, 24시간의 TTFields-처리된 GBM 세포는 TTFields-유도된 염색체 불안정성의 결과로서 세포질 내로 방출되는 미세핵 구조의 상당히 더 높은 속도(19.9% 대 4.3%, p=0.0032)를 가졌다. 처리되지 않은 세포에서 공동-국소화의 부재와 비교하여, 이들 미세핵의 거의 40%가 2개의 상류 dsDNA 센서(흑색종 2(AIM2) 및 인터페론(IFN)-유도성 단백질 사이클릭 GMP-AMP 합성효소(cGAS)에 부재함)와 함께 공동-국소화되었다. 이들 결과는 TTFields가 GBM 세포에서 면역계를 활성화시킴을 입증한다.
본 명세서에 기재된 양상은 3 내지 10일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 암 세포에 교번 전기장을 적용하고 암 세포에 체크포인트 억제제를 투여함으로써 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법을 제공한다. 교번 전기장은 3 내지 10일 동안 연속적으로 또는 불연속적으로 암 세포에 적용될 수 있다. 또 다른 양상에서, 교번 전기장은 3 내지 10일 각각에서 하루에 적어도 4시간 동안, 또는 3 내지 1O일 각각에서 하루에 적어도 6시간 동안 암 세포에 적용될 수 있다. 교번 전기장은 임의로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 암세포에 적용될 수 있다. 또 다른 양상에서, 교번 전기장은 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 또는 3-15일 동안 암 세포에 적용될 수 있다.
용어 "암 세포의 활력성을 감소시키는"은 암세포가 살아있는 상태로 유지되는 능력을 단축시키거나, 제한하거나 또는 부정적인 영향을 미치는 것을 의미한다. 예를 들어, 암 세포의 성장 또는 생식 속도를 감소시키는 것은 이것의 활력성을 감소시킨다.
용어 "체크포인트 억제제를 투여하는"은 관리 기관에 의해, 의료 전문가의 관리 하에, 또는 승인된 임상 시험의 일부로서 제품 표지에 대해 승인된 바와 같은 임의의 적절하고 허용되는 투여 경로(예를 들어, 경구, 정맥내, 비경구, 국소 등)를 통해 의료 전문가 또는 환자에 의해 환자에게 체크포인트 억제제를 제공하는 것을 의미한다. 체크포인트 억제제를 처방하는 것은 또한 체크포인트 억제제를 "투여"하는 것일 수 있다.
용어 "연속적으로"는 실질적으로 일정한 기간 동안 교번 전기장을 적용하는 것을 의미한다. 교번 전기장의 연속적인 적용은 장비를 적절하게 위치시키기 위해 짧은 시간(예를 들어, 초) 동안 적용이 중단되는 경우, 또는 전력의 짧은 중단이 존재하는 경우에도 발생할 수 있다.
용어 "불연속적으로"는 초, 분, 1시간 이상 동안 주기적인 중단 또는 중단과 함께 일정 기간 동안 교번 전기장을 적용하는 것을 의미한다. 이 양상에서, 환자는 15분, 30분, 45분, 1시간 동안 교번 전기장을 적용하지 않고 일정 기간 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4시간) 동안 교번 전기장을 적용할 수 있다. 다른 양상에서, 환자는 수면 중에는 연속적으로 그리고 깨어 있는 동안에는 불연속적으로 교번 장을 적용할 수 있다. 추가 양상에서, 환자는 식사 시간 동안 또는 사회적 이벤트 동안을 제외하고는 연속적으로 교번 전기장을 적용할 수 있다.
추가 양상에서, 교번 전기장은 3 내지 10일 각각에서 하루에 적어도 4 또는 6시간 동안 암 세포에 적용된다.
또 다른 양상에서, 상기 교번 전기장은 상기 암 세포에 3일 동안 적용된 후, 상기 교번 전기장이 상기 암 세포에 적용되지 않는 3일의 기간, 이어서 상기 교번 전기장이 상기 암 세포에 적용되는 3일의 기간 동안 적용된다.
다른 양상에서, 교번 전기장은 주당 적어도 3일 상기 암 세포에 적용된다.
추가 양상에서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일의 제1 기간 동안 상기 암 세포에 적용되고, 이어서 상기 교번 전기장이 적용되지 않는 제2 기간 동안 상기 암 세포에 적용된다. 다른 양상에서, 제2 기간은 적어도 제1 기간과 동일하다.
이러한 양상은 TTFields를 적용하기 위한 디바이스가, 디바이스를 연속적으로 착용하는 것이 더 편리할 때 환자가 집에 있거나 수면 중인 기간 동안 환자에 의해 착용될 수 있기 때문에, 환자에 대한 편안함 및 편리성을 상당히 향상시킬 수 있다. 환자는 환자가 의료 장치에 의해 방해받지 않는 것을 원하는 기간 (예를 들어, 작업, 운동, 사회적 활동에 참여) 동안 장치를 계속 착용할 필요가 없다.
따라서, 환자는 필요한 TTFields 치료를 받은 후, 예를 들어, 공공 또는 사회적 환경에서 장치를 계속 착용하지 않고 체크포인트 저해제를 위한 알약을 복용할 것이다. 치료에 대한 순응성은 환자에 대한 편안함과 함께 개선될 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 사이클 동안 TTFields의 사용을 중단하는 것은 이전에 개시되거나 제안되지 않았다.
또 다른 양상에서, 교번 전기장은 짧은 펄스로 암세포에 적용된다. 용어 "짧은 펄스"는 각각의 펄스가 예를 들어 5초 미만의 지속시간을 갖는 암 세포에 적용되는 불연속적인 교번 전기장을 의미한다.
상기 암 세포는 교모세포종 세포 (glioblastoma cells), 췌장암 세포 (pancreatic cancer cells), 난소암 세포 (ovarian cancer cells), 비소세포 폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 세포 및 중피종 (mesothelioma)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 양상에서, 상기 암 세포는 교모세포종 세포이다.
상기 체크포인트 억제제는, 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 및 니볼루맙 (nivolumab)으로 이루어진 군으로부터 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 교번 전기장은 180 내지 220 kHz의 주파수를 가질 수 있다.
또 다른 양상에서, 상기 체크포인트 억제제를 암 세포에 투여하는 단계의 적어도 일부는 3 내지 10일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 암 세포에 교번 전기장을 적용하는 것을 중단한 후에 발생한다.
추가 양상은 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 100 내지 500 kHz의 주파수에서 3일 동안 교번 전기장을 적용하고, 대상체에 체크포인트 억제제를 투여함으로써 교모세포종을 치료하는 방법을 제공한다. 교번 전기장은 대상체에 3일 동안 연속적으로 또는 불연속적으로 적용된다. 또 다른 양상에서, 교번 전기장은 3일 각각에서 하루에 적어도 4시간 동안 대상체에 적용된다. 체크포인트 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 및 니볼루맙으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 교번 전기장은 180 내지 220 kHz의 주파수를 가질 수 있다.
추가 양상에서, 체크포인트 억제제를 대상체에 투여하는 단계의 적어도 일부는 3 내지 10일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 전기장을 교번시키는 것을 적용하는 것을 중단한 후에 발생한다.
추가 양상은 암 세포의 약 1 내지 2%를 사멸시키기에 충분한 시간 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 암 세포에 교번 전기장을 적용하는 단계; 및 상기 암 세포에 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 양상에서, 암 세포의 약 1 내지 2%를 사멸시키기에 충분한 기간은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일이다.
TTFields는 TTFields에 노출된 세포질 미세핵 GBM 세포의 형성을 유도할 수 있다. 도 1은 LN827 세포를 TTFields에 의해 24시간 동안 처리한 후, 4% PFA에 의해 20분 동안 고정시킨 예시적인 실험의 결과를 나타낸다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌)(1:5000) 염색을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 핵 및 미세핵을 염색하였다. 도 1 (우측 패널)은 TTFields 노출된 세포 (약 20%)에 대한 미세핵 (약 4%)을 갖는 대조군 세포의 백분율을 나타낸다. 따라서, TTFields는 STING 경로를 유도할 수 있는 세포질 미세핵(dsDNA)의 형성을 유도한다.
소분자 STING 활성화제 (예를 들어, STING 효능제)가 공지되어 있고 임상 개발 중에 있지만 (Ryan Cross, STING fever is sweeping through the cancer immunotherapy world, Volume 96 Issue 9 | pp. 24-26, Chemical & Engineering News (February 26, 2018)), 이들 약물은 환자에게 상당한 부작용을 가질 수 있다. 대조적으로, TTField는 실질적으로 부작용을 갖지 않으며, 따라서 소분자 STING 활성화제에 대한 보다 안전하고 편안한 대안을 제공한다.
라민 (Lamin) B1 구조는 TTFields에 노출된 후 파괴되어, dsDNA가 LN827 세포에서 세포질로 방출된다. 도 2는 TTFields에 의해 24시간 동안 처리되고, 4% PFA에 의해 20분 동안 고정되고, 0.2% Triton/0.04% BSA로 1시간 동안 차단된 LN827 세포에서의 추가의 핵 분열을 나타낸다. DAPI 염색된 세포는 좌측 측면 패널 상에 나타나 있다 (라벨링된 대로 비처리된 및 처리된 TTFields). 중간 패널은 세포를 4°C에서 밤새 라민 B1 항체와 인큐베이션한 후, 형광 2차 항체와 1시간 동안 인큐베이션한 때의 결과를 나타낸다 (라벨링된 대로 비처리된 및 처리된 TTFields). 우측 패널은 병합된 이미지(DAPI/Lamin B1)를 나타낸다. 이들 결과는 dsDNA가 TTFields 적용 후 세포질로 방출되어 STING 경로의 유도를 초래한다는 것을 나타낸다.
도 3은 dsDNA에 의한 전염증성 STING 및 피로피토시스 경로의 유도를 나타낸다. dsDNA는 비정상적인 유사분열에 의해 유도된 미세핵으로부터 생산될 수 있다. 비정상적인 유사분열은 예를 들어 TTFields에 의해 유도될 수 있다. TTFields는 또한 나타낸 바와 같이 세포질에서 dsDNA를 유도하는 라민 B1 구조의 파괴 및 STING 경로의 유도에 의해 나타낸 바와 같은 핵막 (nuclear envelope) 완전성을 감소시킬 수 있다.
cGAS (사이클릭 GMP-AMP 합성효소) 및 AIM2는 TTFields에 대한 노출에 반응하여 미세핵과 독립적으로 공동-국소화된다. cGAS 및 AIM2는 세포질 dsDNA의 존재를 검출하는 면역 센서이다. 도 4에서, LN827 세포를 TTFields에 의해 24시간 동안 처리하고, 4% PFA에 의해 20분 동안 고정시키고, 0.2% Triton/0.04% BSA(소 혈청 알부민)에 의해 1시간 동안 차단하였다. 플래그 (Flag) 및 cGAS 항체를 밤새 4°C에서 인큐베이션한 후, 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 5분 동안 DAPI 염색하였다.
따라서, cGAS 및 AIM2는 TTFields가 세포질 dsDNA의 존재를 유도하고 STING 경로를 활성화함을 나타내는 TTFields에 대한 응답으로 미세핵과 각각 독립적으로 공동 국소화된다. 도 5는 도 4의 결과로부터 TTFields 노출시 및 노출없이 cGAS, AIM2 및 미세핵의 백분율을 정량한다.
IRF3 및 p65는 U87 및 LN827 세포에서 1일 동안 TTFields에 노출된 후 인산화된다. 도 6에서, U87 및 LN827 세포를 TTFields로 24시간 동안 처리한 후 총 단백질을 수집하였다. STING 경로의 하류의 IRF3 및 p65 존재뿐만 아니라 이들의 활성화된 인산화된 형태를 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 로딩 대조군으로서 B-액틴을 사용하였다. STING-유도된 경로(IRF3 및 p65)는 인산화된 형태의 IRF3 및 p65의 존재로 나타낸 바와 같이 TTFields 후에 활성화된다. 따라서, IRF3 또는 인터페론 조절 인자 3 및 p65 인산화는 STING 활성화에 의해 촉발된다.
TTFields는 STING의 하류에서 타입 I IFN 반응 및 전염증성 사이토카인을 유도한다. "STING의 하류"라는 용어는 STING 경로의 활성화 후에 유도되는 사이토카인을 의미한다. 이 양상에서, TTField들은 본 명세서에 설명된 바와 같이 STING 응답을 유도한다.
LN428 세포를 TTFields 있이/없이 24시간 동안 처리하였다 (도 7). 총 RNA를 추출하고 cDNA로 전환시켰다. 정량적 PCR을 이용하여 IL1α, IL1β, IL6, IL8 및 ISG15, IFNα, IFNβ의 전사 수준을 검출하였다. 총 LN428 단백질을 단백질 용해 완충액에 수집하고 세포수를 측정하였다. IFNβ의 내인성 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 최종 단백질 수준을 세포수로 표준화하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, TTFields는 LN428에서 인터페론 b(IFNb)과 같은 사이토카인의 발현을 유도한다. 특히, 3일 동안 TTFields에 LN428 세포의 노출은 IFNb 수준을 대조군에 대해 300배 및 1일 동안 TTFields에 노출에 대해 100배 증가시켰다. 이 양상에서, 약 3일 동안 TTFields를 적용하는 것은 전염증성 사이토카인의 수준을 상당히 증가시켰다.
STING는 GBM 세포에서 TTFields에 의해 활성화된 후 분해된다. 도 8에 요약된 실험에서, LN428 (인간) 및 KR158 (마우스) 단백질을 나타낸 시점에서 수집하였다. STING, p65 및 인산화-p65 단백질 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. B-액틴/GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, STING 단백질 수준 및 인산화-p65 수준은 TTFields 처리의 24시간 기간에 걸쳐 감소된다.
STING는 인간 GBM 세포(LN428 인간 세포)에서 dsDNA 및 TTFields 치료에 의해 유도된 염증 반응에 필요하다. 도 9에 요약된 실험에서, 인간 GBM 세포주 LN428은 렌티바이러스-shScramble 또는 shSTING에 의해 안정하게 감염되었다. 세포를 dsDNA 또는 TTFields로 24시간 동안 별도로 처리하였다. 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI)을 형질주입 (transfection) 완충액으로서 사용하여 dsDNA를 세포질로 이동시켰다. 총 RNA를 추출하고 cDNA로 전환시켰다. 정량적 PCR을 이용하여 IL1α, IL1β, IL8, ISG15 및 STING의 전사 수준을 검출하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 다양한 사이토카인 RNA 전사체의 수준은 STING 경로가 LN428 세포에서 dsDNA 및 TTFields 둘 모두에 의해 유도될 때 STING(shSTING)의 부재 하에 감소된다.
자가포식 및 dsDNA 또는 TTFields는 KR158 및 F98 GBM 세포에서 STING-의존성 전염증성 반응을 상승적으로 유도한다. 도 10에 요약된 실험에서, 마우스 GBM 세포주 KR158 및 래트 GBM 세포주 F98은 렌티바이러스-shScramble 또는 shSTING에 의해 안정하게 감염되었다. 세포를 분리하여 dsDNA 또는 TTFields로 24시간 동안 처리하였다. PEI를 형질주입 완충액으로서 사용하여 dsDNA를 세포질 내로 유도하였다. 총 RNA를 추출하고 cDNA로 전환시켰다. 정량적 PCR을 이용하여 IL1α, IL6, ISG15, IFNβ 및 STING의 전사 수준을 검출하였다.
관련 실험에서, 상기 기재된 바와 같은 세포를 분리하고, 클로로퀸 (chloroquine)(자가포식 억제제) 있이/없이 및 dsDNA 또는 TTFields를 사용하여 24시간 동안 처리하였다. PEI를 형질주입 완충액으로서 사용하여 dsDNA를 세포질로 유도하였다. 총 RNA를 추출하고 cDNA로 전환시켰다. 정량적 PCR을 이용하여 IL6, ISG15, IFNβ의 전사 수준을 검출하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 다양한 사이토카인 RNA 전사체의 수준은 STING 경로가 KR158 및 F98 세포에서 dsDNA 및 TTFields 둘 모두에 의해 유도될 때 STING(shSTING)의 부재 하에 감소된다. 사이토카인 전사체의 수준은 자가포식 유도제 조효소 Q(coenzyme Q, CQ)에 의해 추가로 감소되었다.
TTFields-유도된 염증성 사이토카인 생성은 F98 Rat Glioma Model에서 STING 및 AIM2에 의존한다. 도 11에 요약된 실험에서, 래트 GBM 세포주 F98은 렌티바이러스-스크램블 (lentivirus- scramble) 대조군(WT) 또는 STING 및 AIM2(DKD)의 이중 녹다운에 의해 안정하게 감염되었다. 세포를 입체 시스템을 사용하여 수컷 피셔 래트의 뇌에 주사하였다. 세포를 주사한 지 7일 후에, 열 또는 TTFields를 추가적인 7일 동안 래트에 적용하였다. 치료의 마지막에, 래트를 희생시키고, 조직을 수집하고 추가로 분석하였다. 정량적 PCR을 이용하여 IL1α, IL1β, IL6, ISG15 및 IFNβ의 전사 수준을 검출하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, STING 및 AIM2(DKD)의 이중 녹다운은 나타낸 사이토카인의 수준을 상당히 감소시켰다.
종양 크기는 TTFields에 반응하는 염증성 사이토카인 발현의 배수 변화와 관련이 있다. 도 12는 도 11에 요약된 실험에서 사용된 래트 뇌의 이미지를 나타낸다. 도 11의 정량적 PCR 결과 (예를 들어, 개별적인 래트의 MRI 사진의 상대적 mRNA 수준)는 주사 후 15일째 각 그림 아래에 나타난다.
도 13은 CD45 세포의 GBM으로의 동원이 F98 래트 신경교종 모델에서 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서 더 낮다는 것을 나타내는 예시적인 열 지도 (heat map)를 제공한다. 도 13에 요약된 실험에서, 래트 GBM 세포주 F98은 렌티바이러스-스크램블 대조군 (WT) 또는 STING 및 AIM2의 이중 녹다운 (DKD)에 의해 안정하게 편집되었다. 세포를 입체 시스템을 사용하여 수컷 피셔 래트의 뇌에 주사하였다. 세포 주사 7일 후, 열 또는 TTFields를 추가로 7일 동안 래트에 적용하였다.
치료의 마지막에, 래트를 희생시키고, 조직을 수집하고, 추가의 분석을 위해 분할하였다. 여기서, 벌크 종양은 단일 세포 현탁액으로 해리되었다. 다중 흐름 항체를 사용하여 CD45를 염색하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 고정시키고, 다음 날에 유세포분석기 상에서 분석하였다.
도 14는 CD3(T 세포) 동원이 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서 더 낮다는 것을 나타내는 예시적인 히트 맵을 제공한다. 도 14는 도 13과 동일한 실험을 요약하지만, CD3에 대한 항체를 사용한다.
도 15는 STING 및 AIM2가 결여된 GBM에서, DC/대식세포 동원이 더 낮고 MDSC 동원은 더 높음을 나타내는 예시적인 히트 맵을 제공한다. 도 15는 CD11b/c 및 MHC II(대식세포)를 검출하기 위한 항체를 사용하여 도 13과 동일한 실험을 요약한 것이다.
도 16은 도 15의 유세포분석 결과로부터 정량적 데이터를 제공한다.
도 17은 인간 GBM 세포주 LN308 및 LN827 인간 GBM 세포주에서 TTField에 3일 동안 노출에 의해 유도된 '고스팅 (ghosting)'을 나타낸다. 용어 "고스팅"은 면역원성 세포 사멸 후에 남아있는 세포 잔여물의 존재를 의미한다. 이들 실험에서, LN308 및 LN827 세포를 TTFields 있이/없이 3일 동안 처리하였다. 명시야 현미경 (bright field microscope) 하에서 이미지를 촬영하였다. 상기 이미지는 3일의 TTFields 노출 후 증가된 면역원성 세포 사멸을 나타낸다.
도 18은 TTFields가 TTFields에 노출된 U87 GBM 세포에서 막 손상을 유도하고 GSDMD를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 18에 요약된 실험에서, 인간 GBM 세포주 U87을 나타낸 조건 하에 24시간 동안 처리하였다. 세포 배양 배지 내로 방출된 젖산 탈수소효소(Lactic Acid Dehydrogenase, LDH)를 세포독성 어세이 (cytotoxicity assay)에 의해 검출하였다. U87 세포를 렌티바이러스-GSDMD-Flag-N에 의해 Gasdermin D (GSDMD)를 발현시키고 TTFields 있이/없이 처리하였다. 총 단백질을 나타낸 시점에 수집하였다. 과발현된 단백질 GSDMD 수준을 플래그 (flag) 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 로딩 대조군으로서 B-액틴을 사용하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, TTFields에 대한 노출은 세포의 1-2%를 사멸시켰다.
도 19는 TTFields가 인간 백혈병 단핵구 세포주 THP-1 대식세포에서 막 손상을 유도하고 GSDMD를 절단함을 나타낸다. 도 19에 요약된 실험에서, 인간 백혈병 단핵구 세포주 THP-1을 150nM PMA 처리로 24시간 동안 처리하여 대식세포로의 분화를 자극하였다. TTFields 치료 3일째에 LDH 방출을 시험하여 전기장 주파수 범위를 검사하였다. THP-1 세포를 렌티바이러스-GSDMD-Flag-N에 의해 GSDMD를 발현시키고, TTField 있이/없이 처리하였다. 총 단백질을 나타낸 시점에 수집하였다. 과발현된 단백질 GSDMD 수준 및 이의 절단된 N-단편을 플래그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 로딩 대조군으로서 B-액틴을 사용하였다. 양성 대조군은 6시간 동안 LPS 처리 후 1시간 ATP로 나타났다.
도 20은 GFP 렌티바이러스에 의해 표지되고 150nM PMA에 의해 24시간 동안 전처리된 THP-1 세포를 나타낸다. 24시간 후, 세포를 TTFields에 24시간 동안 노출시키고, 20분마다 시간 경과 이미지를 포착하였다.
도 21은 GFP 렌티바이러스에 의해 표지되고 150nM PMA에 의해 24시간 동안 전처리된 THP-1 세포를 나타낸다. 24시간 후, 세포를 통상의 배양 조건에서 24시간 배양하고, 20분마다 시간 경과 이미지를 포착하였다.
도 20 및 21에 나타낸 바와 같이, TTFields로의 치료는 대조군 세포(도 21)에 비해 더 큰 면역원성 세포 사멸을 초래한다(도 20).
도 22는 TTFields에 1일 및 3일 동안 노출된 후 TTFields가 피로피토시스-의존성 카스파제-1 활성화를 유도하는 것을 나타낸다. 도 22에 요약된 실험에서, THP-1 세포를 24시간 동안 150nM PMA로 전처리하였다. 24시간 후, 세포를 나타낸 시점 동안 TTField 있이 및 없이 처리하였다. 카스파제-1 활성화 검출 키트를 사용하여 절단된(cleaved) 카스파제-1 형태를 갖는 세포를 표지하였다. 상기 샘플을 유세포 분석기에서 분석하였다.
도 23은 TTFields-유도된 카스파제-1 활성화 및 피로피토시스가 1일 및 3일 동안 TTFields에 노출된 후 더 낮은 수준의 전장 IL-1 베타, 및 더 높은 LDH 방출 수준과 일치한다는 것을 보여준다. 도 23에 요약된 실험에서, THP-1 세포를 24시간 동안 150nM PMA로 전처리하였다. 24시간 후, 세포를 3일 동안 TTFields 있이 및 없이 처리하였다. 니게리신 (Nigericin)을 양성 대조군으로서 12시간 동안 사용하였다. 카스파제-1 활성화 검출 키트를 사용하여 절단된 카스페제-1 형태를 갖는 세포를 표지하였다. 상기 샘플을 유세포 분석기에서 분석하였다. 세포 배양 배지를 3일째에 동일한 시점에 수집하였다. 배양 배지 중의 IL1β 및 LDH 수준을 ELISA 및 세포독성 어세이에 의해 측정하였다.
도 24는 TTFields-유도된 STING/AIM2 활성화 및 염증성 사이토카인 생성이 TTFields 치료가 종료된 후 적어도 3일 동안 지속되는 것을 보여준다. 도 24에 나타낸 바와 같이, TTF에 의해 유도된 염증성 사이토카인 생성은 STING 및 AIM2에 의존하며 TTF 치료의 짧은 펄스 후 수일 후에 기준선 위로 상승된 상태로 유지된다. 도 24에 요약된 실험에서, K-LUC 세포를 빈 바이러스 또는 이중-가닥 shRNA 표적화 및 억제 STING 및 AIM2를 운반하는 바이러스로 형질도입시켰다. 이어서, 디쉬 당 이들 세포 30k를 3일 동안 TTFields로 처리한 후, TTF 회수 후 추가적인 3일 동안 배양하고, 염증성 사이토카인 측정을 위해 수집하였다 (IL-6 및 ISG15). 도 24에 나타난 바와 같이, 상승된 IL6 및 ISG15 생산은 TTFields가 중단된 후 적어도 3일 동안 지속되었다(청색 막대, EV).
도 25는 짧은 펄스 TTF-유도된 STING/AIM2 활성이 감소된 종양 성장 및 심경부 배수 림프절로의 증가된 DC(수지상 세포) 동원과 관련됨을 보여준다. STING/AIM2를 통한 TTFields에 의한 이러한 지속적인 염증 활성화는 TTFields 치료가 중단된 후 면역계를 활성화하였다.
도 25에 요약된 실험에서, K-LUC 세포를 빈 바이러스 또는 이중 shRNA 표적화 STING 및 AIM2를 발현하는 바이러스로 형질도입시킨 후, 3일 동안 TTF로 처리하거나 처리하지 않았다. 이들 K-LUC 세포의 3x105를 B6 마우스에 정위적으로 (orthotopically) 이식하였다. 종양 성장은 luc BLI에 의해 측정되었다. 중간 패널에 나타낸 바와 같이, 이식 후 2 주 후 종양 크기는 이중 녹다운 (DKD) 마우스와 비교하여 빈 바이러스 (EV) TTFields 마우스에서 크게 감소되었다. 이들 마우스는 또한 최고 수준의 DC 세포 (예를 들어, T 세포) (우측 패널)를 나타냈다. 심경부 림프절은 뇌로부터 유래하는 항원에 대해 DC 동원 및 나이브 T 세포 (na
Figure pct00001
ve T cells)의 프라이밍 (priming)이 발생하는 곳인 것으로 생각된다.
따라서, TTFields는 면역계를 자극하여, 세포가 추가의 암 요법을 위해 프라이밍되는 in situ "백신접종"과 유사한 항-종양 면역 반응을 생성한다 (예를 들어, 적어도 3일 동안의 TTFields 치료 후 체크포인트 억제제로의 치료).
도 26은 카스파제 1이 AIM2 없이 TTFields-처리된 세포에서 검출되지 않음을 나타낸다. 카스파제 1은 AIM2-이중 가닥 DNA 복합체의 바로 하류이며 피로피토시스의 분자적 특징이다. 카스파제 1의 절단 생성물(활성화된)을 검출하는 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 카스페제 1 활성화를 검출한다. 활성화된 카스파제 1은 정상 AIM2 수준을 갖는 TTFields-처리된 세포(EV(빈 바이러스) 대 EV + TTFields)에만 존재하는 우측으로 이동하는 청색 곡선의 제2 FITC 피크로서 검출된다. 그러나, 이러한 피크는 AIM2 없이 TTFields-처리된 세포에서 관찰되지 않았다(AIM2 KD 대 AIM 2 KD+TTFields). 따라서, 피로피토시스에 대한 TTFields의 효과는, 적어도 부분적으로, AIM2에 의해 매개된다.
본 발명이 특정 실시예들을 참조하여 개시되었지만, 설명된 실시예들에 대한 다수의 수정들, 변경들, 및 변화들은 첨부된 청구항들에 정의된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 범위로부터 벗어나지 않고 가능하다. 따라서, 본 발명은 설명된 실시예들로 제한되지 않고, 다음의 청구항들의 언어 및 그 등가물들에 의해 정의된 전체 범위를 갖는 것으로 의도된다.

Claims (26)

  1. 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    3 내지 10일 동안 100 내지 500kHz의 주파수에서 암 세포에 교번 전기장을 적용하는 단계; 및 암 세포에 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 동안 상기 암 세포에 연속적으로 적용되는, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 동안 상기 암 세포에 불연속적으로 적용되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 각각에서 하루에 적어도 4시간 동안 상기 암 세포에 적용되는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 각각에서 하루에 적어도 6시간 동안 상기 암 세포에 적용되는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 상기 암 세포에 3일 동안 적용된 후, 상기 교번 전기장이 상기 암 세포에 적용되지 않는 3일의 기간, 이어서 상기 교번 전기장이 상기 암 세포에 적용되는 3일의 기간 동안 적용되는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 주당 적어도 3일 상기 암세포에 적용되는, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일의 제1 기간 동안 상기 암 세포에 적용되고, 이어서 상기 교번 전기장이 적용되지 않는 제2 기간 동안 상기 암 세포에 적용되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 제2 기간은 상기 제1 기간과 적어도 동일한, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 상기 암 세포에 짧은 펄스(pulse)로 적용되는, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 암 세포는 교모세포종 세포 (glioblastoma cells), 췌장암 세포 (pancreatic cancer cells), 난소암 세포 (ovarian cancer cells), 비소세포 폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 세포 및 중피종 (mesothelioma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 암 세포는 교모세포종 세포인, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 체크포인트 억제제는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 및 니볼루맙 (nivolumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 교번 전기장은 180 내지 220 kHz의 주파수를 갖는, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 체크포인트 억제제를 암 세포에 투여하는 단계의 적어도 일부는 3 내지 10일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 암 세포에 교번 전기장을 적용하는 것을 중단한 후에 발생하는 것인, 방법.
  16. 교모세포종을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
    교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 100 내지 500 kHz의 주파수에서 3 내지 10일 동안 교번 전기장을 적용하는 단계; 및
    체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 동안 상기 대상체에 연속적으로 적용되는, 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 3 내지 10일 동안 상기 대상체에 불연속적으로 적용되는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 교번 전기장은 상기 3일 각각에서 하루에 적어도 4시간 동안 상기 대상체에 적용되는, 방법.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 체크포인트 억제제는 이필리무맙 (ipilimumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 및 니볼루맙 (nivolumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 180 내지 220 kHz의 주파수를 갖는, 방법.
  22. 청구항 16에 있어서, 상기 체크포인트 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계의 적어도 일부는 3 내지 10일 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 전기장을 교번시키는 것을 적용하는 것을 중단한 후에 발생하는 것인, 방법.
  23. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 3일 동안 적용된 후, 교번 전기장을 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 적용되지 않는 3일의 기간, 이어서 상기 교번 전기장이 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 적용되는 3 일의 기간 동안 적용되는, 방법.
  24. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 상기 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 짧은 펄스(pulse)로 적용되는, 방법.
  25. 청구항 16에 있어서, 상기 교번 전기장은 상기 교모세포종을 갖는 대상체의 머리에 주당 적어도 3일 적용되는, 방법.
  26. 암 세포의 활력성을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    약 1 내지 2%의 암 세포를 죽이기에 충분한 시간 동안 100 내지 500 kHz의 주파수에서 상기 암 세포에 교번 전기장을 적용하는 단계; 및 상기 암 세포에 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240149471A (ko) 2023-04-05 2024-10-15 주식회사 뉴아인 세포사멸을 위한 전기장 집속 장치
KR20240149472A (ko) 2023-04-05 2024-10-15 주식회사 뉴아인 세포사멸을 위한 전기장 집속 장치
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3029468A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zeev Bomzon Arrays for longitudinal delivery of ttfields to a body
CA3049949C (en) 2017-01-19 2024-04-23 Novocure Limited System for viewing cell cultures under a microscope whilst applying tumor treating fields
US11986647B2 (en) 2018-09-07 2024-05-21 Novocure Gmbh Treating autoinflammatory and mitochondrial diseases using an alternating electric field
JP7284886B2 (ja) 2018-10-15 2023-06-01 ノボキュア ゲーエムベーハー 脳全体にわたる高均一性での腫瘍治療電場（ｔｔ電場）の発生
CN112955208B (zh) 2018-10-25 2024-11-22 诺沃库勒有限责任公司 向受试者的脊柱解剖结构递送交变电场(例如，ttfields)的方法
EP4019081B1 (en) 2018-11-29 2024-04-03 Novocure GmbH Enhanced-flexibility transducer arrays for delivering ttfields (tumor treating fields)
CN113330485A (zh) 2019-01-08 2021-08-31 诺沃库勒有限责任公司 评估将图像分割成不同类型组织的质量，用于使用肿瘤治疗场（TTField）来计划治疗
HUE061231T2 (hu) 2019-04-17 2023-05-28 Novocure Gmbh Adatok feltöltése egy szigetelt rendszerbõl a szigetelés veszélyeztetése nélkül
EP4074368A1 (en) 2019-12-31 2022-10-19 Novocure GmbH High voltage, high efficiency sine wave generator that prevents spikes during amplitude adjustments and switching of channels
CA3163316A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Novocure Gmbh Arrays for delivering tumor treating fields (ttfields) with individually accessible electrode elements and temperature sensors
US20210299440A1 (en) 2020-03-30 2021-09-30 Novocure Gmbh Intravenous / Intra-Spinal / Intra-Cavity / Intraventricular Delivery of TTFields (Tumor Treating Fields) for Treating Cancer and Metastases
JP2023522817A (ja) 2020-04-24 2023-06-01 ノボキュア ゲーエムベーハー 血液脳関門の透過性を増加させるための交流電界の使用
US11818943B2 (en) 2020-06-25 2023-11-14 Novocure Gmbh Fabricating organic light emitting diodes (OLEDs) using tubulin
JP2023542785A (ja) 2020-09-25 2023-10-12 ノボキュア ゲーエムベーハー 過熱することなく電流を最大化するために腫瘍治療電場（ＴＴＦｉｅｌｄ）における個々の電極要素における金属化範囲を変化させること
WO2022208444A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Novocure Gmbh Impedance tomography using electrodes of a tumor treating fields (ttfields) system
CN117794618A (zh) * 2021-06-14 2024-03-29 诺沃库勒有限责任公司 用交变电场、放射性粒子和全身疗法治疗和预防癌症的方法
EP4344414A1 (en) * 2021-08-06 2024-04-03 Novocure GmbH Electrode assembly for applying tumor treating fields (ttfields) with a sheet of anisotropic material
WO2023187689A1 (en) * 2022-03-30 2023-10-05 Novocure Gmbh Using interleaved cooling periods to increase the peak intensity of tumor treating fields
US20240108704A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Novocure Gmbh Compositions, systems, and methods for treating cancer using alternating electric fields and apoptotic cancer cell vaccination
US12268863B2 (en) 2023-02-06 2025-04-08 Novocure Gmbh Shiftable transducer array with anisotropic material layer
WO2024246868A1 (en) * 2023-06-01 2024-12-05 Novocure Gmbh Methods of using alternating electric fields and checkpoint inhibitors
WO2025062369A1 (en) * 2023-09-21 2025-03-27 Novocure Gmbh Compositions, systems, and methods for treating cancer using tumor treating fields with immune checkpoint inhibitors and mhc class i activators

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7599745B2 (en) 2000-02-17 2009-10-06 Standen Ltd Treating a tumor or the like with an electric field
US20020198567A1 (en) 2001-06-07 2002-12-26 Yona Keisari Electro-endocytotic therapy as a treatment modality of cancer
US8019414B2 (en) 2006-04-05 2011-09-13 Novocure Ltd. Treating cancer using electromagnetic fields in combination with other treatment regimens
US20180133313A1 (en) * 2014-12-16 2018-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Use of immune checkpoint inhibitors in central nervous systems neoplasms
CN109069624A (zh) 2016-01-15 2018-12-21 瑞美控股有限责任公司 癌症的免疫治疗
EP3225253A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Cancer therapy with an oncolytic virus combined with a checkpoint inhibitor
US20180008708A1 (en) * 2016-07-10 2018-01-11 Novocure Limited Synchronizing Tumor Cells to the G2/M Phase Using TTFields Combined with Taxane or Other Anti-Microtubule Agents
WO2018071837A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Baylor College Of Medicine Radiofrequency field hyperthermia and solid tumor immunomodulation
CN111479612A (zh) 2017-10-04 2020-07-31 仿真治疗有限公司 仅无线信号或与一或多癌症药联用治疗GBM或rGBM的方法及相关系统、装置和设备
US20200368525A1 (en) 2017-11-17 2020-11-26 Abbvie Inc. Methods of Treating Glioblastoma
US11351349B2 (en) 2018-08-23 2022-06-07 Novocure Gmbh Using alternating electric fields to increase permeability of the blood brain barrier

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240149471A (ko) 2023-04-05 2024-10-15 주식회사 뉴아인 세포사멸을 위한 전기장 집속 장치
KR20240149472A (ko) 2023-04-05 2024-10-15 주식회사 뉴아인 세포사멸을 위한 전기장 집속 장치
KR20240149470A (ko) 2023-04-05 2024-10-15 주식회사 뉴아인 전기장을 이용한 세포사멸장치

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