KR20220036113A - 신규한 페녹시아르테미시닌을 유효성분으로 함유하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 페녹시아르테미시닌 화합물은 대장암 세포와 대장암 줄기세포의 성장을 억제하고, 대장암 세포보다 대장암 줄기세포의 성장을 10배 이상 특이적으로 억제할 뿐만 아니라, 대장암 줄기세포의 스피어 형성을 억제하여 암 줄기세포의 줄기세포능을 억제하므로 대장암의 전이, 재발 또는 내성을 억제하는 치료제로 활용이 가능하다.

Description

신규한 페녹시아르테미시닌을 유효성분으로 함유하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for growth inhibition of colorectal cancer cells and cancer stem cells comprising novel phenoxyartemisinin}

본 발명은 신규한 페녹시아르테미시닌 화합물을 유효성분으로 함유하는, 대장암 세포 및 대장암 줄기세포의 성장뿐만 아니라 클론원성 활성을 효과적으로 억제하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

노령사회 생활습관의 변화로 대장암 발생이 높아지고 있으며 이미 세계적으로 매년 100만 건 이상의 대장암이 발생하고 있으며 매년 70만 명 이상이 사망하고 있다. 이에 따라 많은 사회 비용이 발생하고 있다.

대장암은 주로 수술요법과 항암제를 사용하고 있으나 대장암 치료에 사용할 수 있는 약제의 수가 많지 않다. 현재 대장암치료에 사용되는 약제로는 옥살리플라틴, 이리노테칸 같은 항암제와 세툭시맙이나 베바시주맙 같은 항체 치료제를 병용하여 사용하고 있으나 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 치명적일 뿐만 아니라 항암제 내성으로 재발률이 높아 항암치료를 하여도 5년 생존율이 65%이다(Front Pharmacol. 2019; 10: 912.). 이러한 현상을 나타내는 이유는 암 줄기세포에 기인하는 것으로 보고되었다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923). 즉, 암 줄기세포는 원래부터 항암제에 대해 내성이 있어 기존 항암제 치료시 분화된 암세포는 사멸하지만 암 줄기세포는 생존하여 다시 암이 재발하기 때문이다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923).

암 줄기세포의 존재는 급성골수성 백혈병(leukemia)에서 처음 증명되었으며(J. Cell. Physiol. 2007, 213, 440), 최근에는 유방암 등을 포함한 일반 고형암에서도 암 줄기세포의 존재를 증명함으로써, 고형암에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다(FASEB J. 2013, 27, 13-24). 암 줄기세포는 자기재생능력(self-renewal)과 함께 다양한 생물학적 특징을 가지는 세포로 분화하여 암세포의 침윤 및 전이를 용이하게 하고, 분화된 암세포들에 비하여 일반적인 항암요법(항암제 및 방사선)에 대하여 더 높은 내성을 가져 종양의 재발 등 환자의 예후에 나쁜 영향을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923). 따라서 대장암치료용 항암제의 개발이 절실하며 특히 암 줄기세포에도 효과적인 항암제가 필요하다.

아르테미시닌은 개똥쑥에서 유래된 말라리아 치료약제로서 인체에 안전한 약물이며 더욱이 내성이 잘 생기지 않는 것으로 알려졌다(Engineering 2019, 5, 32). 아르테미시닌은 좋은 활성에도 불구하고 낮은 생리활성으로 인해 다양한 유도체가 개발되었다. 특히, 아르테미시닌을 환원하여 얻은 디하이드로아르테미시닌(Lin, A. J.; Klayman, D. L.; Milhous, W. K. J. Med. Chem. 1987, 30, 2147)은 아르테미시닌보다 높은 항말라리아 활성을 가진다(Coordinating Group for Research on the Structure of Qing Hau Sau. K'o Hsueh Tung Bao 1977, 22, 142; Chem Abstr. 1977, 87, 98788g.).

다양한 항말라리아제를 개발하기 위해 많은 유도체들이 합성되었으며 디하이드로아테미신, 아르테수네이트, 아르테에테르 등이 말라리아 치료제로 사용되고 있다. 또한 말라리아 치료제로 사용되고 있는 아르테미시닌 유도체들은 다양한 항암활성도 보고되어 있다. 아르테미시닌의 항암 활성은 항말라리아 활성과 마찬가지로 아르테미시닌내의 엔도퍼옥사이드에 기인하는 것으로 설명되며 세포내 철분과 결합시 활성산소를 발생시켜 암세포의 페롭토시스(ferroptosis)을 유도한다. 이러한 이유로 아르테미시닌류 약물들은 약제 내성이 잘생기지 않으며, 인체에 안전성이 확보되어 약물 재발견(drug repositioning)을 이용한 항암제 개발을 시도하고 있다. 그러나, 현재 말라리아 치료제로 사용되고 있는 아르테미시닌류들은 기존 항암제보다 활성이 낮은 단점이 있다. 따라서 기존의 화학요법제에 필적할 수 있는 항암 활성을 갖는 새로운 아르테미시닌 유도체의 합성이 필요하다.

이에 본 발명자들은 아르테미시닌 유도체 중 대장암 세포와 대장암 줄기세포에 대한 효과적인 성장 억제 효과를 갖는 대장암 치료제 또는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 페녹시아르테미시닌이 대장암 세포의 성장을 억제할 뿐만 아니라, 대장암 세포 보다 대장암 줄기세포의 성장도 특이적으로 더욱 억제하며, 줄기세포능을 나타내는 클론원성 활성(clonogenic activity)을 효과적으로 억제함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허공개 제2020-0021893호: 세트라리아 속 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물 대한민국 등록특허 제10-1774652호: 암 줄기세포 치료용 조성물

본 발명의 과제는 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 대장암 줄기세포에 대해 특이적 성장 억제 효과를 나타내고, 대장암 세포의 스피어 형성능(sphere formation), 즉 대장암 세포의 줄기세포화를 억제하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은,

하기 화학식 1로 표시되는 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

X 및 Y는 독립적으로 수소, -CHO, -NO₂ 또는 -OCH₃이다.)

또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 대장암 치료를 위하여 기존의 항암제와는 종류가 다른 새로운 화합물군을 제공하므로 항암제 선택의 기회를 제공할 수 있다. 또한 대장암 세포와 대장암 줄기세포를 억제함으로써 대장암의 근본적 치료를 가능하게 하고, 방사선, 수술, 화학요법 등 기존의 항암요법에 내성이 있는 암 줄기세포를 표적으로 할 수 있으므로 기존 항암요법과 병행시 암재발을 방지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 페녹시아르테미시닌 화합물의 대장암 줄기세포와 대장암세포에 대한 성장 억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 페녹시아르테미시닌 화합물의 대장암 줄기세포에 대한 구형성 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 페녹시아르테미시닌 화합물의 대장암줄기세포의 구형성을 50% 억제하는 농도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2의 페녹시아르테미시닌 화합물(BP1007)의 마우스 모델에서의 항암 활성을 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 약학 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

X 및 Y는 독립적으로 수소, -CHO, -NO₂ 또는 -OCH₃이다.)

본 명세서에서 사용된 용어 '암 줄기세포'는 일반 줄기세포와 같은 자기재생능력, 암 형성능력 및 약물 저항성의 특성을 갖는 암세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '예방'이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증상을 차단하거나, 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '치료'란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '이성질체'는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 이러한 이성질체 및 그의 염 및 이성질체의 혼합물(racemic mixture) 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염, 염기 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.

산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 무독산 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산-1，6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 를투엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β_하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다.

또한 약제학적으로 허용되는 염에는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속염 또는 알칼리토 금속염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등과의 아미노산염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과의 유기염 등이 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 예로는 하기 화학식 2 내지 화학식 7로 표시되는 화합물을 들 수 있다:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

본 발명의 페녹시아르테미시닌 화합물은 대장암 줄기세포에 작용하여 현격히 적은 농도에서 대장암 세포의 스피어 형성능(sphere formation), 즉 대장암 세포의 줄기세포화를 억제하고, 또한 대장암 세포의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

많은 연구에서 암세포의 치료 저항성, 혈관의 신생, 침윤, 전이 및 재발을 비롯한 암의 악성 형질이 모두 암 줄기세포(cancer stem cell)에 의해 유발됨이 밝혀졌다. 본 발명의 약학 조성물은 대장암 세포의 성장을 억제할 뿐만 아니라 대장암 세포 보다 대장암 줄기세포의 성장을 특이적으로 억제하여 대장암 줄기세포의 성장과, 대장암 세포의 줄기세포화를 억제함으로써, 대장암의 증식, 생존, 전이, 재발, 항암제 내성을 방지할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 대장암 세포 및 대장암 줄기세포에 대한 성장 억제 효과를 더욱 증강시킬 수 있다. 상기 항암제는 바람직하게는 옥살리플라틴, 이리노테칸, 세툭시맙, 베바시주맙 등일 수 있으나, 항암제로 사용되고 있는 화합물이라면 이에 제한되지 않는다. 일 예로 이때, 추가로 포함되는 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 마시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 파조파닙, 토세라닙, 닌테다닙, 레고라페닙, 세막사닙, 티보자닙, 포나티닙, 카보잔티닙 카보플라틴, 소라페닙, 렌바티닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 케페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 흡입제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 무수알콜, 레시틴, 올레산, 락토스모노하이드레이트, 무수 락토스, HFA-134a, HFA-227 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서, '비경구'는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제, 흡입제로 제형될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1. 10β-(3,5-디메톡시페녹시)아르테미시닌의 제조

1.1 디하이드로아르테미시닌(Dihydroartemisinin)의 제조

[반응식 1]

Eur. J. Med. Chem. 1995, 30, 697-706에 기재된 내용을 참조하여 반응식 1에 나타낸 바와 같이 아르테미시닌으로부터 디하이드로아르테미시닌을 합성하였다. 아르테미시닌(Artemisinin) 5g(17.7mmol)을 메탄올 200㎖에 녹인 후, 얼음 중탕에서 수소화붕소나트륨(NaBH₄) 3g(39mmol)을 천천히 적가한 후, 실온에서 4시간 교반하고, 박층 크로마토그래피로 출발 물질이 없어진 것을 확인한 다음 과량의 수소화붕소나트륨을 제거하기 위해 아세트산을 1㎖ 정도 넣어주고, 10분간 다시 교반하였다. 그 후 용매를 제거하기 위하여 감압 하에서 증류하고, 남은 여액에 물100㎖를 가하고, 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 추출(100㎖X3회)하였다. 유기층을 포화탄산수소나트륨과 포화 식염수로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 수분을제거하고, 감압 하에 에틸아세테이트를 증류하였다. 순수한 생성물을 얻기 위해 헥산(Hexane)/에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 재결정하여 고체상 화합물 디하이드로아르테미시닌 4.9g(수율 91%)을 얻었다.

1.2 10β-(3,5-디메톡시페녹시)아르테미시닌 (10β-(3,5-dimethoxyphenoxy) artemisinin, BP1007 )

[반응식 2]

디하이드로아르테미시닌(284mg 1.0 mmol)와 3,5-디메톡시페놀(308mg, 2.0mmol)을 디클로로메탄(CH₂Cl₂)에 녹이고 TMSOTf(트리메틸실릴트리플루오로메탄설폰, 1.0 mmol)과 AgCIO₄(Silver perchlorate 0.2 mmol)를 가한 후 12시간 교반하였다. 반응종결 후 sat-NaHCO₃로 중화시키고 CH₂Cl₂로 추출한 후 MgSO₄로 수분을 건조하여 여과하였다. 여액을 강압증류를 이용하여 용매을 증발시키고 silica gel column chromatography(Hexane:Ethyl acetate=5:1)를 이용하여 정제하였다(수율 35%)

BP1007; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.78 (d, J=3.6Hz, 3H), 0.99 (d, J=1.2Hz, 3H), 1.43 (s, 3H), 1.19-2.06 (m, 10H), 2.42 (dt, 1H), 2.82 (m, 1H), 3.56 (s, 3H, OMe), 3.57 (s, 3H, OMe), 5.17 (d, J=3.3Hz, 1H), 5.42 (s, 1H), 6.00 (s, 1H, aromatic), 6.02 (s, 1H, aromatic), 8.33 (s, 1H, aromatic) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 160, 154, 149, 118, 115, 105, 104, 102, 88, 83, 56, 53, 44, 37, 36, 35, 31, 27 25, 24, 20, 12 ppm.

실시예 2: 10β-(4-니트로페녹시)아르테미시닌 및 10α-(4-니트로페녹시)아르테미시닌의 제조

[반응식 3]

반응식 3에 기재된 바와 같이 실시예 1과 동일한 방법으로 10β-(4-니트로페녹시)아르테미시닌(10β-(4-nitrophenoxy) artemisinin, BP1009-1)과 10α-(4-니트로페녹시)아르테미시닌(10α-(4-nitrophenoxy) artemisinin, BP1009-2)를 합성하였으며, BP1009-1과 BP1009-1(3.5:1)를 45%의 수율로 합성하였다.

BP1009-1; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.96 (d, J=6.0 Hz, 3H), 0.99 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.21-2.07 (m, 10H), 2.37 (dt, 1H), 2.77 (m, 1H), 5.35 (d, J=3.3Hz, 1H), 5.50 (s, 1H), 6.90-7.08 (m, 4H, aromatic) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 157, 155, 154, 119, 118, 114, 103, 101, 84, 81, 52, 44, 37, 36, 35, 30, 24, 23, 20, 12 ppm.

BP1009-2; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.94 (d, J=1.8 Hz, 3H), 1.00 (d, J=3.0Hz, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.25-2.07 (m, 10H), 2.37 (dt, J = 13.8, 3.8 Hz, 1H), 2.70 (m, 1H), 4.94 (d, J=9.3Hz, 1H), 5.45 (s, 1H), 6.91-6.97 (2H, m, 2H, aromatic), 7.03-7.08 (m, 2H, aromatic) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 158, 156, 154, 118, 118, 116, 112, 103, 100, 89, 80, 51, 45, 37, 35, 34, 32, 26, 25, 22, 19, 11 ppm.

실시예 3: 10β-(4-카르브알데히드페녹시)아르테미시닌 및 10α-(4-카르브알데히드페녹시)아르테미시닌의 제조

[반응식 4]

반응식 4에 기재된 바와 같이 실시예 1과 동일한 방법으로 10β-(4-카르브알데히드페녹시)아르테미시닌(10β-(4-carbaldehydehenoxy) artemisinin, BP1010-1)과 10α-(4-카르브알데히드페녹시)아르테미시닌(10α-(4-carbaldehydephenoxy)artemisinin, BP1010-2)를 합성하였으며, BP1010-1과 BP1010-1(3:1)를 55%의 수율로 합성하였다.

BP1010-1; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.98 (d, J=6.0 Hz, 3H), 1.01 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.25-2.05 (m, 10H), 2.37 (dt, 1H), 2.78 (m, 1H), 5.41 (d, J=3.3Hz, 1H), 5.57 (s, 1H), 6.95-7.12 (m, 4H, aromatic), 9.89(s, 1H, CHO) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 198, 164, 158, 157, 119, 118, 116, 104, 102, 86, 81, 52, 44, 37, 36, 34, 31, 27, 25, 21, 13 ppm.

BP1010-2; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.98 (d, J=6.0 Hz, 3H), 1.02 (d, J=7.2Hz, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.25-2.07 (m, 10H), 2.40 (dt, J=13.8, 3.8 Hz, 1H), 2.70 (m, 1H), 4.95 (d, J=9.3Hz, 1H), 5.46 (s, 1H), 6.93-6.98 (m, 2H, aromatic), 7.05-7.09 (m, 4H, aromatic), 9.89(s, 1H, CHO) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 194, 162, 153, 151, 119, 118, 116, 115, 104, 102, 92, 81, 51, 45, 38, 36, 34, 31, 26, 25, 23, 20, 12 ppm.

실시예 4: 10β-(3,5-디메톡시벤질옥시)아르테미시닌의 제조

[반응식 5]

반응식 5에 기재된 바와 같이 실시예 1과 동일한 방법으로 10β-(3,5-디메톡시벤질옥시)아르테미시닌(10β-(3,5-dimethoxybenzyloxy)artemisinin, BP1012)를 58%의 수율로 합성하였다.

BP1012; ¹Η-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0.96 (d, J=5.9 Hz, 3H), 0.97 (d, J=7.4Hz, 3H), 1.48 (s, 3H), 0.87-1.97 (m, 9H), 2.07 (ddd, J=14.5, 4.68, 2.92Hz, 1H), 2.41 (ddd, J=17.6, 9.49, 3.94Hz, 1H), 2.65-2.75 (m, 1H), 4.95 (d, J=12.4Hz, 1H, benzyl), 4.96 (d, J=3.55Hz, 1H, benzyl), 5.49 (s, H1), 6.02 (2H, s, aromatic), 8.50 (s. 1H, aromatic) ppm.; ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 60, 154, 149, 118, 115, 105, 104, 102, 88, 83, 56, 53, 48, 44, 37, 36, 35, 31, 27 25, 24, 20, 12 ppm.

실험예 1: 대장암세포에 대한 아르테미시닌 유도체의 작용 효과 확인

1-1.세포 배양 및 암줄기세포의 분리

인간 유래 대장암세포는 DLD-1 세포주를 사용하였고, 일반 암세포배양은 10%혈청이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 세포배양플라스크에서 단층배양하면서 유지하였다. 이 세포주로부터 sphere forming assay를 이용하여 암줄기세포를 분리하였다. 이를 위하여 DMEM/F12 배지 (20ng/mL의 EGF, 10ng/mL의 bFGF, 0.1% B27 (GIBCO), 및 1% 항생제-항균제 용액(Welgene) (암 줄기세포 배지)을 사용하였다. 단층 배양된 DLD-1 세포를 0.2% 트립신으로 처리하어 96웰 플레이트 웰당 1개 이하의 세포가 들어가도록 암 줄기세포 배지로 희석하여 96웰 플레이트 각 웰에 넣은 후 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 이때 단일세포로부터 유도된 구형의 부유 상태(floating sphere state)로 성장하는 세포를 분리하여 암 줄기세포를 확보하였고, 부착상태로 자라는 세포는 따로 분리하여 줄기세포능이 없는 암세포( non-cancer stem cell: NCSC)로 사용하였다. 암 줄기세포는 암 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 구형의 부유 상태로 키우면서 유지하였고, 줄기세포능이 없는 암세포는 10% 혈청이 포함된 일반 세포배양배지에서 키우면서 실험에 사용하였다.

1-2. 암 줄기세포 및 줄기세포능이 없는 암세포에 대한 억제효과

상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 제조된 페녹시아르테미시닌 화합물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해하여, 하기 실험에서 사용하였다.

암 줄기세포는 줄기세포배양배지에서 성장할 때 스피어(sphere)를 형성하므로 단층배양을 위하여는 미리 배양플레이트에 피브로넥틴(fibronectin)을 코팅하여야 한다. 페녹시아르테미시닌의 대장암 줄기세포와 줄기세포능이 없는 대장암 세포에 대한 증식 억제활성을 조사하기 위하여 96웰 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅한 후 여기에 대장암 줄기세포와 줄기세포능이 없는 대장암 세포를 각 웰에 3000 cell씩 넣어 부착시켰다. 이후 페녹시아르테미시닌 화합물을 농도별로 처리하여 CO₂ 배양기에서 5~7일 동안 배양하였다. 배양 후 MTS시약으로 1시간 처리하여 세포생존율을 측정하였다. 이때 세포증식 억제활성은 100-(처리군의 흡광도-음성대조군의 흡광도) x 100/(약물 비처리 대조군의 흡광도 - 음성대조군의 흡광도)의 공식에 따라 백분율로 나타내었으며, 프리즘 프로그램을 이용하여 IC₅₀ 농도를 계산하였다. 그 결과는 도 1 및 아래 표 1에 나타내었다.

페녹시아르테미시닌 화합물	Growth inhibition (IC50, μM)		대장암줄기세포에 대한 선택도
	대장암 줄기세포	대장암 세포
화학식 2 (BP1007)	0.14	1.55	11.1
화학식 3 (BP1009-1)	3.95	23.1	5.8
화학식 4 (BP1009-2)	0.25	1.43	4.2
화학식 5 (BP1010-1)	5.53	67.3	12.4
화학식 6 (BP1010-2)	0.64	4.07	6.4
화학식 7 (BP1012)	3.59	46.4	12.9
adriamycin	0.18	0.40	2.2
* 대장암줄기세포 선택도 = 대장암세포에 대한 IC50/대장암 줄기세포에 대한 IC50

1-3. 페녹시아르테미시닌의 대장암 줄기세포 스피어 형성 억제활성 분석

인간 유래 대장암 줄기세포의 스피어 형성(sphere formation) 능력에 대하여 페녹시아르테미시닌(BP1007, BP1009-1, BP1009-2, BP1010-1, BP1010-2, BP1012)이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 0.2% 트립신을 이용하여, 대장암 줄기세포를 단일세포로 분리하고 재현탁시켰다. 스피어 형성(sphere formation)을 위하여, 0.3㎖의 배지를 함유하는 48 웰 플레이트에 각 웰당 단일 대장암 줄기세포 300 cell를 접종하였다. 실시예 1 내지 4에서 합성된 페녹시아르테미시닌 화합물(BP1007, BP1009-1, BP1009-2, BP1010-1, BP1010-2, BP1012)을 농도별로 처리하여 10일 동안 배양하였다. 이후, 10% FBS를 첨가하여 스피어를 형성한 대장암 줄기세포를 플레이트에 부착시키고, 0.05% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet in 20% 메탄올)으로 염색한 뒤, 계수하였다.

실험 결과, 페녹시아르테미시닌 화합물(BP1007, BP1009-1, BP1009-2, BP1010-1, BP1010-2, BP1012)을 각각 처리하였을 대장암 세포주의 스피어 형성을 50% 억제하는 농도는 각각 0.64, 1.73, 0.44, 2.29, 0.88, 2.14, 0.22 μM이었다.

페녹시아르테미시닌 화합물	구형성 억제능 (IC50, μM)
화학식 2 (BP1007)	0.64
화학식 3 (BP1009-1)	1.73
화학식 4 (BP1009-2)	0.44
화학식 5 (BP1010-1)	2.29
화학식 6 (BP1010-2)	0.88
화학식 7 (BP1012)	2.14
adriamycin	0.22

이상의 결과로부터, 실시예 1 내지 실시예 4에서 제조된 화학식 2 내지 화학식 7의 페녹시아르테미시닌(BP1007, BP1009-1, BP1009-2, BP1010-1, BP1010-2, BP1012는 대장암 줄기세포의 성장뿐만 아니라 줄기세포능을 나타내는 클론원성 활성(clonogenic activity)을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 마우스 모델에서 항암 효과

페녹시아르테미시닌의 생체 내 항암활성을 검증하기 위하여 화학식 2의 페녹시아르테미시닌 화합물(BP1007)을 20mg/ml 농도가 되도록 식용유에 녹여 사용하였으며, 마우스 종양모델로는 마우스 대장암 세포주 CT26을 Balb/c 마우스 피하에 접종하여 사용하였다. CT26 마우스 대장암 세포배양은 10%혈청이 함유된 DMEM배지를 이용하여 세포배양 플라스크에서 단층배양하면서 사용하였으며 실험직전 트립신 0.2%를 사용하여 단세포 부유물을 만들고 혈구계수기로 세포수를 측정하여 DMEM 배지로 세포수가 10⁶/ml되도록 맞춘 후 마우스 등과 허리부분의 피하에 0.1ml씩 주사하여 암세포를 이식시켰다. Balb/c 마우스는 6주령의 암컷을 사용하였으며 동물실험 1주전 미리 구입하여 그룹당 6마리씩 배정한 후 동물실에서 순화시킨 후 실험하였다. 암이식 5일 후 종양을 육안으로 확인하고 페녹시아르테미시닌 화합물(BP1007)을 매일 100mg/kg이 되도록 0.1ml씩 경구투여 하였다. 20여일간 관찰하면서 마우스 몸무게 변화와 종양크기를 측정하고 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 화학식 2의 페녹시아르테미시닌 투여군에서 종양의 크기는 20일간 화학식 2의 페녹시아르테미시닌 투여시 치료하지 않은 대조군에 비하여 50% 정도 줄었다. 또한 화학식 2의 페녹시아르테미시닌 화합물은 시험관내 뿐만 아니라 생체 내에서도 대장암에 대한 항암활성이 나타나는 것이 확인되었다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물:
   [화학식 1]
   
   (상기 화학식 1에서,
   X 및 Y는 독립적으로 수소, -CHO, -NO₂ 또는 -OCH₃이다.)
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 7로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물:
   [화학식 2]
   
   [화학식 3]
   
   [화학식 4]
   
   [화학식 5]
   
   [화학식 6]
   
   [화학식 7]
   
3. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은
   대장암의 전이, 재발, 또는 항암제 내성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물.
5. 하기 화학식 1로 표시되는 페녹시아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물:
   [화학식 1]
   
   (상기 화학식 1에서,
   X 및 Y는 독립적으로 수소, -CHO, -NO₂ 또는 -OCH₃이다.)
6. 제5항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 7로 표시되는 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물:
   [화학식 2]
   
   [화학식 3]
   
   [화학식 4]
   
   [화학식 5]
   
   [화학식 6]
   
   [화학식 7]