KR20220008412A

KR20220008412A - Stat3 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 sars 코로나바이러스 생산 저해용 조성물

Info

Publication number: KR20220008412A
Application number: KR1020200085896A
Authority: KR
Inventors: 권형주; 박병권; 김동범; 김진수
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-01-21

Abstract

본 발명은 STAT3 활성화 저해제, 및/또는 STAT3 이량체화 억제제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 SARS 코로나바이러스-2 생산 정도를 감소시키는 효과가 있다.

Description

STAT3 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물{A COMPOSITION FOR SUPRESSING PRODUCTION OF SARS CORONAVIRUS COMPRISING STAT3 ACTIVATION INHIBITOR}

본 발명은 STAT3 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물에 관한 것이다.

코로나바이러스는 코로나비리다에(Coronaviridae)과의 아과 코로나비리나에 (Coronavirinae)에 속하는 바이러스 종이며, 인간 및 동물을 감염시키고 호흡기, 위장관 또는 신경계 질환을 유발하는 포지티브-센스(positivesense) RNA 바이러스이다.

코로나바이러스는 동물에서 발생하여, 2002년에서 2003년까지 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)와 2012에 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)에 의해 예시되는 인간의 심각한 전염병을 유발할 수 있으며, 이는 신종 바이러스로 확인되었다. 놀랍게도, 이러한 바이러스는 침입성 병원체를 탐지하고 제거하기 위한 중요한 선천면역에 작용하는 대식세포의 세포질에서 복제될 수 있다. 코로나바이러스는 유형 I 인터페론 (IFN) 및 인터페론 자극 유전자(ISG)의 활성화를 방해하고 지연시키는 기능을 하며, 길항제 무리의 발현이 발병에 기여하는 다수의 인터페론 길항제를 코딩한다. 마우스의 SARS-CoV 감염을 이용한 최근의 연구는 질병에 기여하는 인터페론의 지연되고 제한된 생산을 기록했다.

코로나바이러스 질환에 대한 기존의 백신 접근법은 자발적이고 자연적인 약독화, 바이러스 불활성화 및 발현 벡터를 통한 재조합 바이러스 구조 단백질에 기초한다. 기존 백신 후보는 강력한 보호 면역 반응을 유발하지 못한다. 이러한 장기적인 보호의 부족은 적응 면역 및 면역 기억을 증진시키는데 중요한 분자인 유형 1 인터페론과 같은 선천적 면역 반응의 비효율적인 유도에 기인할 수 있다.

한편, 중동호흡기증후군(middle east respiratory syndrome, MERS)은 2012년 9월 중동 지역을 중심으로 처음 발생하였으며, WHO에서 발표한 바에 따르면, 2020년 3월을 기준으로 27개국으로 확산되어, 전 세계적으로 2,494명의 확진환자와 858명의 사망자를 발생시킨 치사율이 34%에 이르는 고위험 질환이다.

또한 2019년 12월 중국 우한에서 새로운 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)가 사람에 감염되어, 2020년 4월 18일 기준으로 전 세계적으로 2,160,207명의 확진환자와 146,088명의 사망자를 발생시킨 고위험 질환인 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)이 발생되었다.

MERS의 병원체인 중동호흡기증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)는 2012년에 새로 발견된 베타코로나바이러스(β이며, 약 3만 kb의 (+)-센스 단일가닥 RNA 바이러스로 중증급성호흡기증후군 (severe acute respiratory syndrome, SARS) 바이러스와 유사한 바이러스이다.

MERS-CoV는 스파이크 단백질(S protein)을 이용해 사람의 DPP4(Dipeptidyl peptidase 4) 수용체에 결합하여 세포 내로 침투한다(Wang N, Shi X, Jiang LJ, Zhang S, Wang D, Tong P, Guo D, et al., Cell Research 2013:23:986). MERS-CoV는 1주일 정도의 잠복기를 가지며, 고열, 기침, 호흡곤란 등 심한 호흡기 증상을 일으킨다.

현재, MERS 치료는 면역조절인자인 인터페론과 항바이러스제인 리바비린(ribarvirin) 또는 로피나비어(lopinavir)를 사용하여 치료하고 있다(Public Health England, ISARIC, 2015 Sep 5 ver 30; 정용필, 송준영, 서유빈 et al., Infection & Chemotherapy 2015).

인터페론은 인체에서 바이러스나 세균이 들어왔을 때 배출하는 면역 단백질로 주변 세포들에게 항바이러스 싸이토카인들을 내뿜도록 유도하여 바이러스 증식을 억제하고, 면역 세포들을 불러들여 바이러스에 감염된 세포들을 제거하도록 한다. 그러나 인터페론의 사용은 골수의 기능저하, 빈혈, 백혈구 수의 감소 또는 혈소판 수의 감소 등의 부작용을 유발한다.

또 다른 치료제인 리바비린은 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogue) 형태로 다양한 종류의 바이러스의 RNA 합성을 방해함으로써 이의 증식을 억제한다. 그러나 리바비린은 독성, 발암 또는 용혈빈혈 등의 부작용을 유발한다. 또한, MERS의 치료를 위해 인터페론과 리바비린을 투여하는 것에 대한 임상적인 근거도 희박하다. 붉은털 원숭이 동물모델에서는 인터페론과 리바비린을 혼합하여 투여하였을 때 MERS의 치료효과를 보였으나(Falzarano D, Wit E, Rasmussen AL et al., Nature Medicine, 2013, 19, 10, p1313- 1318), 실제 중동에서 인터페론과 리바비린을 혼합하여 심각한 상태의 메르스 환자들 총 5명에게 주입하였을 때 큰 효과를 나타내지 못하였다(Al-Tawfiq JA, Momattin H, Dib J et al., International Journal of Infectious Diseases 2014, 20, p42-46).

한편, STAT(signal transducer and activator of transcription) 단백질은 세포 밖의 다양한 시토카인(cytokines) 및 성장인자(growth factors)들로부터의 신호를 핵 내에 전달하는 전사 인자(transcription factor)이다. STAT 단백질은 현재까지 총 7개의 아류형(sub type: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6)이 보고되어 있으며, 일반적으로 약 750~850개의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 각각의 단백질은 STAT 단백질의 기능 발현에 중요한 역할을 하는 몇몇 보존영역(conserved domain)을 갖는 것으로 알려져 있는데, N-말단으로부터 C-말단에 이르기까지 5개의 영역(coiled-coiled domain, DNA binding domain, linker domain, SH2 domain 및 trans activation domain (TAD))이 존재함이 보고되어 있고, 1998년 이후로 STAT1, STAT3, STAT4 및 STAT5의 X-ray 결정구조가 알려져 있다(Becker S et al, Nature, 1998, 394; Vinkemeier U et al, Science, 1998, 279;Chen X et al, Cell, 1998, 93; D Neculai et al., J Biol Chem, 2005, 280) 시토카인 및 성장인자들이 결합하는 수용체들은 크게 Class I 및 Class II 수용체 군으로 분류되며, Class I 수용체들에는 IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-12, G-CSF, GM-CSF, LIF, 트롬보포이에틴 (thrombopoietin) 등이 결합하고, Class II 수용체들에는 INF-α, INF-γ, IL-10 등이 결합하는 것으로 알려져 있다(Schindler C et al, Annu Rev Biochem,1995, 64; Novick D et al, Cell, 1994, 77; Ho AS et al., Proc Natl Acad Sci, 1993, 90)

이 중, STAT 단백질의 활성화에 관여하는 시토카인 수용체들은 세포밖 영역의 구조적 형태를 기준으로 gp-130 계열(gp-130 family), IL-2 계열(IL-2 family), 성장 호르몬 계열(growth factor family), 인터페론 계열(interferon family) 및 타이로신 키나제 수용체 계열(receptor tyrosine kinase family)로 나뉜다. IL-6 계열(interleukin-6 family) 시토카인은 다양한 생리 활성을 일으키는 대표적인 다중기능성 시토카인(multifunctional cytokine)으로서, IL-6가 세포막 표면에 존재하는 IL-6 수용체에 결합하게 되면, gp-130 수용체가 유인되어 IL-6-gp-130 수용체 콤플렉스(receptor complex)를 형성하게 된다. 이때, 세포질내의 JAK 키나제들(JAK1, JAK2, JAK3 및 Tyk2)이 수용체의 세포질 부분(cytoplasmic region)으로 유인되어 인산화되면서 활성화된다. 이후 연이어, 세포질에 비활성화 상태로 존재하던 STAT 단백질이 수용체로 유인되면서, JAK 키나제에 의해 인산화되고 활성화된다. 이때, STAT 단백질의 C-말단 부위에 존재하는 SH2 영역 부근의 티로신-705가 인산화되고, 활성화된 각 STAT 단백질 단량체의 티로신-705이 상호 다른 단량체의 SH2 영역에 결합(reciprocal manner)하여, 동종(homo-) 또는 이종(hetero-)의 이량체를 형성(dimerization)하여 핵 내로 이동하게 된다. 핵내로 이동한 이량체는 특정 DNA 결합 부위에 결합하여, 전사과정을 통해 세포 성장(proliferation), 생존(survival), 신생 혈관(angiogenesis) 및 면역 회피(immune evasion)와 관련된 다양한 단백질들(Myc, Cyclin D1/D2, BCLxL, Mcl, survivin, VEGF, HIF1, 면역 억제 인자등)을 생성하게 한다 (Stark et al., Annu Rev Biochem, 1997, 67; Levy et al, Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3)

특히 이중 STAT3 단백질은 급성 염증 반응에서 핵심적 역할을 수행하며, IL-6 및 [0003] EGF 신호 전달 체계의 매우 중요한 매개자로 알려져 있다(Akira et al, Cell, 1994, 76; Zhong et al, Science, 1994, 264) 최근 임상 환자를 대상으로 한 연구 결과에 의하면, 전립선, 위, 유방, 폐, 췌장, 신장, 자궁, 난소, 두경부등의 고형암환자 및 급성, 만성 백혈병, 다발성 골수종등의 혈액암 환자에서 지속적으로 활성화됨이 보고되고 있으며, STAT3가 활성화된 환자군의 비활성화된 환자군 대비 생존률이 크게 감소함이 보고되고 있다(Masuda et al., Cancer Res, 2002, 62; Benekli et al, Blood, 2002, 99; Yuichi et al, Int J Oncology, 2007, 30) 한편, 설치류(mouse)의 STAT3 녹아웃(knock out) 모델에서 STAT3가 생쥐 배아 줄기 세포의 성장 및 유지에 필수 인자임이 확인되었고, 성체에서의 조직 특이적 STAT3 결핍 생쥐 모델을 통해, 개체 사망 없이 STAT3가 조직 특이적으로 세포 성장, 세포사멸 및 세포 운동성에 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었다(Akira et al, Oncogene 2000, 19) 또한, 다양한 암 세포주에서도 anti-STAT3에 의한 세포 사멸 유도가 확인되어, STAT3은 매우 유망한 신규 항암 타겟으로서 여겨지고 있다. 또한, 당뇨, 면역계 질환, C형 간염(hepatitis C), 황반 변성(macular degeneration), 유두종 바이러스 감염(papilloma virus infection), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 결핵 환자 등의 치료에서도 유망한 타겟으로 기대되고 있다. 이에 비해, STAT1은 동일한 시토카인 및 성장인자들의 세포내 하부 반응 경로를 공유하면서도, 염증 및 선천성, 후천성 면역을 증가시켜, 대부분의 경우 암세포의 성장을 저해(anti-proliferation)하거나 세포사멸 전단계의 반응(pro-apoptotic responses)을 일으켜 STAT3와 반대의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Valeria Poli et al, Review, Landes Bioscience, 2009)

STAT3 저해제 개발 전략으로서는 크게, i) IL-6/gp-130/JAK 키나제에 의한 STAT3 단백질의 인산화 저해, ii)활성화된 STAT3의 이량체화에 대한 직접 저해, 및 iii) STAT3 이량체의 핵 내 DNA 결합 저해로 나뉠 수 있다.

현재 개발 진행 중인 저분자 화합물로서 STAT3 저해제로는, 오츠카 제약에 의해 개발 중인 OPB-31121, OPB-51602 및 OPB-111077이 고형암 및 혈액암 환자를 대상으로 임상 시험을 진행 중인 것으로 보고되고 있으며, S3I-201 (Siddiquee et al, Proc Natl Acad Sci, 2007, 104), S3I-M2001 (Siddiquee et al, Chem Biol, 2007, 2), LLL-12 (Lin et al, Neoplasia, 2010, 12), Stattic (Schust et al, Chem Biol 2006, 13), STA-21 (Song et al, Proc Natl Acad Sci, 2005, 102), SF-1-066 (Zhang et al, Biochem Pharm, 2010, 79) 및 STX-0119 (Matsuno et al, ACS Med Chem Lett, 2010, 1) 등이 일부 암세포 성장 억제 실험 및 항암 동물 모델(xenograft model)에서 약효를 나타냄이 문헌을 통해 보고되어 있다. 또한, SH2 영역에 결합하는 pY-705 주변 아미노산 서열 또는 JAK 키나제가 결합하는 gp-130 수용체의 아미노산 서열을 모방한 펩티드화합물 (Turkson　J et al., Mol Cancer Ther 2004, 261 , Coleman et al, J Med Chem, 2005, 48) 등이 보고되고 있다.

현재까지 SARS-CoV-2 감염에 의한 코로나바이러스감염증-19 발생의 정확한 원인 및 코로나바이러스감염증-19의 치료제는 제시되지 못하고 있다.

따라서, 효과적으로 바이러스의 증식을 막으면서 중증환자, 면역저하환자 및 기저질환환자에게도 사용 가능한 생물학적으로 안전한 치료제의 개발이 필요하다.

관련특허로, 대한민국 특허등록 제10-1593641호에는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 포함하는 MERS-CoV 진단용 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 STAT3 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 STAT3 활성화 저해제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 SARS 코로나바이러스는 SARS CoV-2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 STAT3 이량체화 억제제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한 본 발명은 STAT3 이량체화 억제제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산 감소용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한 본 발명은 인 비트로에서 SARS 코로나바이러스 감염된 세포에 STAT3 이량체화 억제제를 처리하여 인 비트로에서 상기 세포의 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 STAT3 활성화 저해제는 S3I-201 또는 STA-21인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 SARS CoV-2의 감염 후 Calu-3 세포의 세포 반응 및 바이러스 생산을 조사했다. 또한, STAT3 이량체화(예를 들어, STA-21, S3I-201)를 표적으로하는 소분자 억제제를 포함하는 경로 특이적 억제제가 항 바이러스 효과를 갖는지 여부를 조사하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

Calu-3 세포에서 STAT1 및 STAT3 인산화에 대한 SARS-CoV-2 감염의 효과

바이러스 생산 및 병인에 STAT1 및 SAT3의 의미를 고려하여 우리는 먼저 Calu-3 세포에서 STAT1 (Tyr-701) 및 STAT3 (Tyr-705)의 인산화 수준을 조사했다. STAT1 및 STAT3의 인산화 수준은 SARS-CoV-2 감염 후 48 시간까지 증가한 후 72 시간에 약간 감소했다(그림 1A).

감염 후 STAT1 및 STAT3 인산화 수준의 MOI 의존적 증가는 최대 0.5 MOI의 SARS-CoV-2 감염으로 검출되었다 (도 1B).

모의-감염된 Calu-3 세포에서 기저 수준의 STAT 인산화가 있었다(도 1C).

NF-λB 신호 전달 경로가 몇몇 바이러스에 의해 활성화됨에 따라, IλBα 인산화 및 분해가 조사되었지만 SARS-CoV-2 감염 후 변화는 없었다 (도 1A).

SARS-CoV-2 감염으로 유도된 STAT1 및 STAT3 인산화에 대한 경로 특이적 억제제의 효과

STAT 패밀리 구성원은 JAK 및 MAPK를 포함하여 여러 키나제에 의해 인산화되기 때문에, 본 발명자들은 Calu-3 세포에서 SARS-CoV-2 감염에 반응하여 세포 내 신호를 조사하였다.

본 발명자들은 SARS-CoV-2가 MAPK 수퍼 패밀리 및 JAK 패밀리의 활성을 통해 STAT1 및 STAT3의 인산화를 조절하는지 여부를 경로-특이적 키나제 억제제를 사용하여 조사하였다.

SARS-CoV-2 감염에 의한 STAT1 인산화는 p38 MAP 키나제 억제제 PD 169316 및 JAK1, 2 및 3의 강력한 ATP- 경쟁 억제제인 JAK 억제제 I에 의해 억제되었다.

그러나, MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제 PD 98059, 스트레스 활성화 단백질 키나제(SAPK)/Jun N- 말단 키나제(JNK) 억제제 SP 600125 및 JAK2 억제제 AG490은 STAT1 인산화에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, STAT3 인산화는 p38 MAP 키나제 억제제 PD 169316에 의해 억제되지 않았지만 JAK 억제제 I에 의해 억제되었다 (도 2A).

본 발명자들은 STAT1 및 STAT3 인산화에 대한 S3I-201의 효과를 확인하였다.

S3I-201은 SARS-CoV-2 감염에 의해 유도된 STAT1 및 STAT3 인산화에 영향을 미치지 않았다 (도 2B).

모의-감염된 세포를 사용하여 대조 실험을 수행하였고, STAT1 및 STAT3 인산화의 기초 수준을 감소시킨 JAK 억제제 I을 제외하고 억제제의 효과가 최소라는 것을 발견하였다 (도 2C).

본 발명자들은 면역 염색 및 공 초점 현미경으로 JAK 억제제 I에 의한 STAT3 인산화의 억제 및 SARS-CoV-2 감염에 대한 반응으로 STAT3의 인산화를 확인 하였다.

렙토마이신 B가 핵 배출을 차단하기 위해 처리되었을 때, 인산화된 STAT3가 핵으로 전위됨을 시사하는 핵에서의 인산화 및 국소화 STAT3가 SARS-CoV-2 감염에 의해 관찰되었고, STAT3 이량체화 억제제인 S3I-201와 STA-21의 전처리에 의해 인산화된 STAT3가 핵으로 전위되는 것이 현저하게 감소되었다 (도 3).

SARS-CoV-2 생산에 대한 경로 특이적 억제제의 효과

SARS-CoV-2를 치료하기 위한 치료제로서 기능 및 STAT3 활성화를 표적으로 하는 억제제를 평가하기 위해, 본 발명자들은 Calu-3 세포를 DMSO, JAK 억제제 I, S3I-201, STA-21로 전처리하고 SARS-CoV-2 생성을 측정하였다.

Calu-3 세포에서 경로- 특이적인 저해제 JAK Inhibitor I에 비하여, S3I-201, STA-21에 의해 약 30% 정도의 SARS-CoV-2 생산을 상대적으로 더 감소된다는 것을 플라크 형성과 정량적인 RT-PCR 로 확인하였다(도 4).

본 발명의 통하여 알 수 있는 바와 같이, STAT3 이량체화 억제제는 SARS 코로나바이러스 생산을 저해하는 것을 확인하여 SARS 코로나바이러스 치료용 후보물질로 적용할 수도 있는 효과가 있다.

도 1은 SARS-CoV-2- 감염 Calu-3 세포에서의 STAT1 및 STAT3 인산화를 나타낸 그림으로,
(A) Calu-3 세포를 표시된 기간 동안 0.5 MOI SARS-CoV-2로 감염시켰다.
(B) Calu-3 세포를 48 시간 동안 SARS-CoV-2의 표시된 MOI로 감염시켰다.
(C) 모의 감염 세포를 대조군으로 분석하였다. 세포 용해물에 대한 웨스턴 블롯팅을 표시된 항체로 수행하였다. β-액틴의 발현 수준을 대조군으로 사용하였다.
도 2는 Calu-3 세포에서 SARS-CoV-2-유도된 STAT1 및 STAT3 인산화에 대한 경로-특이적 억제제의 효과를 나타낸 그림으로,
(A) Calu-3 세포를 0.1 % DMSO, 10 μM PD169316, 25 μM PD98059, 25 μM SP600125, 25 μM AG490 또는 1 μM JAK 억제제 I로 30 분 동안 전처리하였다.
(B) Calu-3 세포를 표시된 농도의 S3I-201 억제제로 30 분 동안 전처리하였다.
(A, B) 세포를 PBS로 세척한 다음 PBS 중 0.5 MOI에서 SARS-CoV-2로 감염시켰다. 1 시간 배양 후, 배지에 2 % FBS를 함유하는 DMEM을 보충하였다.
(C) Calu-3 세포를 0.1 % DMSO, 10 μM PD169316, 25 μM PD98059, 25 μM SP600125, 25 μM AG490, 1 μM JAK 억제제 I, 또는 20 μM S3I-201로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 배지에 2 % FBS를 함유하는 DMEM을 보충하였다.
(A-C) 48 시간 인큐베이션 후, 세포 용해물을 제조하고, 표시된 항체로 웨스턴 블 롯팅을 수행하였다.
도 3은 Calu-3 세포에서 SARS-CoV-2-유도된 phosphor-STAT3 핵 위치에 대한 경로 특이적 억제제의 효과를 나타낸 그림으로,
Calu-3 세포를 0.1 % DMSO, 1 μM JAK 억제제 I, 20 μM S3I-201 또는 10 μM STA-21로 30 분 동안 전처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음 PBS 중 0.5 MOI의 SARS-CoV-2로 감염시켰다. 1 시간 배양 후, 배지에 2 % FBS를 함유하는 DMEM을 보충하였다. 48 시간 배양 후, 세포를 20 nM 렙토마이신 B로 3 시간 동안 처리하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정한 다음, phosph-STAT3 항체(녹색)로 면역 형광 염색한 후 공초점 현미경으로 STAT3의 인산화 및 국소화를 관찰 하였다. Hoechst 33258은 핵 염색 (파란색)에 사용되었다.
도 4는 경로-특이적 억제제의 존재하에 Calu-3 세포에서 SARS-CoV-2의 생성을 나타낸 그림으로,
Calu-3 세포를 PBS 대조군, 0.1 % DMSO 비히클 대조군, 1 μM JAK 억제제 I, 20 μM S3I-201, 또는 10 μM STA-21로 30 분 동안 전처리하였다. 세포를 PBS로 세척 한 다음 PBS 중 0.1 MOI의 SARS-CoV-2로 감염시켰다. 72 시간 인큐베이션 후, 바이러스 생산을 측정하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
(A) 플라크 형성 분석
(B) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 실시간 RT-PCR 분석.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:세포 배양 및 바이러스

아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, Vero 세포 및 Vero E6 세포, 인간기도 상피 세포, Calu-3 세포는 한국 세포주 은행 (서울, 한국)으로부터 입수하였다.

10 % 소 태아 혈청(FBS, Thermo Fisher Scientific), 25 mM HEPES, 100 U/ ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토 마이신을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, MA, USA)에서 세포를 배양하였다.

그 세포를 37 ℃에서 95 % 공기 및 5 % CO₂의 대기 조건에서 인큐베이션하였다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2, NCCP No. 43326)는 국가 병원체 자원은행(오송, 대한민국)에 의해 제공되었다.

실시예 2: 바이러스 증폭 및 정량

베로 세포(6- 웰 플레이트에서 2 x 10⁵ 세포/웰)를 10 % FBS를 함유하는 DMEM 배지로 플레이팅하고 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.

밤새 배양 후 세포를 PBS로 세척한 다음, PBS 중의 MOI 0.01의 SARS-CoV-2를 각 웰에 첨가한 후, CO₂인큐베이터에서 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 2 % FBS를 함유하는 2 ml의 DMEM 배지를 첨가하고 3 일 동안 CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.

세포 배양 상청액을 수거하고 4 ℃에서 10 분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리하여 세포 파편을 제거하였다.

증폭된 바이러스 상층액을 플라크 분석에 의해 정량화하였다. 베로 E6 세포 (6-웰 플레이트에서 7 x 10⁵ 세포/웰)를 플레이팅하고 세포를 37 ℃에서 밤새 CO₂인큐베이터에서 배양하였다.

그 세포를 PBS로 세척하고 증폭된 SARS-CoV-2를 10 배 연속 희석 후 감염시켰다. 1 시간 배양 후, 상층액을 제거하고 0.6 % 옥소이드 아가 및 Np-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK, 1 μg/ml)-처리된 트립신을 함유하는 DMEM/F12 배지 (Thermo Fisher Scientific)를 세포 단층 위에 놓았다.

플라크를 37℃에서 72 시간 동안 전개시켰다. 플라크 형성을 확인하기 위해 플레이트를 0.1 % 크리스탈 바이올렛으로 1 시간 동안 염색하였다.

정량화된 바이러스 (5 x 10⁶pfu/ml)를 에펜도르프 튜브 당 400 ㎕로 분취한 다음 -70℃에서 보관했다. SARS-CoV-2 증폭 및 세포 배양 절차는 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 조건에서 수행되었다.

실시예 3: 시약 및 바이러스 감염

STAT1 (카탈로그 번호 14994S), 포스포-STAT1 (Tyr-701, 카탈로그 번호 9167S), STAT3(카탈로그 번호 12640S), 포스포-STAT3 (Tyr-705, 카탈로그 번호 9145S), Iκα (카탈로그 번호 4814S) 및 포스포-Iκα (Ser32/36, 카탈로그 번호 9246S)는 셀 시그널링 테크놀로지(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다.

항-β액틴 모노클로 날 항체는 Sigma-Aldrich (미국 미주리 주 세인트루이스)에서 입수하였다.

MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제 PD 98059 (카탈로그 번호 P215), p38 억제제 PD 169316 (카탈로그 번호 P9248), 스트레스 활성화 단백질 키나제 (SAPK)/Jun N- 말단 키나제 (JNK) 억제제 SP 600125 (카탈로그) S5567), JAK2 키나제 억제제 AG490 (카탈로그 번호 T3434), STAT3 이량체화 억제제 S3I-201 (카탈로그 번호 SML0330) 및 STAT3 이량체화 억제제 STA-21 (카탈로그 번호 SML2161)을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

상기 화합물 중 S3I-201 및 STA-21의 화합물 명 및 구조는 하기와 같다.

S3I-201 : 2-Hydroxy-4-[[[[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy]acetyl]amino]-benzoic acid, NSC 74859

STA-21 : 　(±)-Ochromycinone, (±)-Deoxytetrangomycin, 3,4-Dihydro-8-hydroxy-3-methylbenz[a]anthracene-1,7,12(2H)-trione, NSC 628869

JAK1, JAK2 및 JAK3의 강력한 ATP- 경쟁 억제제인 JAK 억제제 I (카탈로그 번호 420099)은 Calbiochem (미국 캘리포니아 샌디에고)에서 구입하였다.

모든 억제제를 디메틸 설폭사이드(DMSO, 간토 케미칼, 도쿄, 일본, 카탈로그 번호 10378-73)에 용해시켰다. 억제제를 처리할 때, 세포를 30 분 동안 각각의 억제제와 함께 예비 인큐베이션한 후 SARS-CoV-2로 0.1 또는 0.5 MOI로 1 시간 동안 접종한 후, 세포를 2 % FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 48 시간 또는 72 시간 동안 배양하였다.

실시예 4: 웨스턴 블로팅

Calu-3 세포 및 SARS-CoV-2- 감염 세포로부터의 세포 용해물을 세포 용해 완충제(20 mM Tris · HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1 % NP-40)로 제조하였고, 4 ℃에서 14,000 rpm으로 20 분 동안 원심 분리하였다. 동일한 양의 단백질을 4-12 % 비스-트리스 구배 겔 (Thermo Fisher Scientific)에서 분리하고 니트로 셀룰로스 막으로 옮겼다.

그 막을 블로킹하고 4 ℃에서 밤새 각 항체와 함께 배양하였다. 막을 양 고추 냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 항체와 함께 배양한 후, 면역 반응성 밴드를 강화 화학 발광 (ECL) 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 현상하였다.

실시예 5: 공초점 이미지

SARS-CoV-2에 의한 STAT3 인산화 및 포스포-STAT3 핵 국소화의 유도는 공초점 현미경으로 간접 면역 형광 분석에 의해 관찰되었다. Calu-3 세포를 12-웰 플레이트의 유리 커버 슬립상에서 밤새 배양하였다.

세포를 0.1% DMSO, 1 μM JAK 억제제 I, 20 μM S3I-201, 또는 10 μM STA-21로 30 분 동안 전처리한 후, PBS에서 SARS-CoV-2 (0.5 MOI)로 1시간 동안 37 ℃에서 감염시켰다.

그 세포를 2% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 48 시간 동안 배양 한 다음, 핵 배출 수용체 CRM1의 억제제인 렙토마이신 B (LMB, Cell Signaling Technology, 20 nM)로 3 시간 동안 처리하였다. 그 세포를 PBS 중 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1 % Triton X-100으로 투과시킨 후 3 % BSA로 차단 하였다.

STAT3 인산화 및 포스포-STAT3 핵 위치를 검출하기 위해, 세포를 실온에서 2 시간 동안 포스포-STAT3 항체(Cell Signaling Technology)로 염색하였다.

세포를 1 % BSA를 함유하는 PBST (PBS 중 0.1 % Triton X-100)로 세척한 다음, Alexa Flour 488- 접합된 이차 항체 (Thermo Fisher Scientific)로 1 시간 동안 염색하였다.

핵은 Hoechst 33258 (Thermo Fisher Scientific)로 염색되었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 시스템 (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Jena, Germany)에 의해 샘플을 관찰하였다.

실시예 6: 경로 특이적 억제제의 존재하에 SARS-CoV-2 생산의 조사

Calu-3 세포(2 x 10⁴세포/웰)를 12-웰 플레이트(Corning, NY, USA)에서 밤새 배양하였다. SARS-CoV-2 생산에 대한 경로 특이적 키나제 억제제 및 STAT3 이량체화 억제제(S3I-201 및 STA-21)의 효과를 조사하기 위하여 0.1% DMSO, 1 μM JAK 억제제 I, 20 μM S3I-201 또는 10 μM STA- 21을 바이러스 감염 30 분 전에 전처리되었다.

세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 PBS 중의 SARS-CoV-2 (0.1 MOI)로 감염시킨 후, 2 % FBS를 함유하는 2ml의 DMEM 배지를 첨가하고 또 다른 72 시간 동안 배양 하였다. 바이러스-감염된 세포 배양의 상층액을 수집하고, 실시간 RT-PCR 및 플라크 형성 분석을 사용하여 바이러스 복제를 정량화하였다.

실시예 7: 정량적 실시간 RT-PCR

바이러스 감염된 세포 배양 상청액 (100 μL)으로부터 바이러스 입자를 수집하고, 제조업자의 지침에 따라 QIAamp Viral RNA Mini Kit (카탈로그 번호 52904, Qiagen, Hilden, Germany)로 상층액으로부터 바이러스 RNA를 분리하였다.

cDNA (50 μL)를 역전사 시스템 키트 (Catalog No. A3500, Promega, Madison, WI, USA)로 합성하였다.

SARS-CoV-2의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자를 정량하기 위해, 다음 프라이머가 사용되었다.

정방향 프라이머, 5'-GTGAAATGGTCATGTGTGGCGG-3 ',

역방향 프라이머 5'-CAAATGTTAAAAACACTATTAGCATA-3' 및

TaqMan®프로브 5'-FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-TAMRA-3 '.

상기 프라이머 및 프로브 서열은 Genotech (대전, 한국)에 의해 합성되었다. 10 μL의 GoTaq®Probe qPCR Master Mix (카탈로그 번호 A6101, Promega, WI, Madison, USA)를 각각 125 nM 정방향 및 역방향 프라이머, 250 nM의 프로브 및 1μL cDNA 용액을 포함하는 10 μL의 반응 혼합물에 첨가했다.

95 ℃에서 5 분 동안 예비 변성 후, Rotor-Gene Q (Qiagen)를 사용하여 45 사이클의 PCR 반응을 95 ℃에서 15 초 동안 및 60 ℃에서 1 분 동안 수행하였다. RdRP 유전자의 cDNA로 얻은 표준 곡선을 사용하여 샘플에서 RdRP 유전자의 카피 수를 계산하였고, PBS 및 DMSO 대조군 샘플과 비교 하였다.

실시예 8:플라크 형성 분석

베로 E6 세포 (7 x 10⁵ 세포/웰)를 6-웰 플레이트(Corning, NY, USA) 상에 플레이팅하고 12 시간 동안 배양하였다. SARS-CoV-2 배양액들을 각각 PBS중에 10 배 연속 희석 후 Vero E6 세포에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, 상층액을 제거하고, 플레이트를 0.6 % 옥소이드 아가 및 Np-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK, 1 μg/ml) 처리된 트립신을 함유하는 3 ml DMEM/F12 배지 (Thermo Fisher Scientific)를 세포 단층 위에 놓았다.

3 일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 플라크를 계수하고 억제제-처리된 샘플과 대조 샘플 (DMSO 및 PBS) 사이에서 비교하였다.

상기 실시예의 결과는 평균±표준 편차로 표시된다. 두 샘플 사이의 차이의 통계적 유의성은 통계적 유의성에 대한 임계 값으로서 p <0.05를 갖는 스튜던트 t- 검정을 사용하여 평가되었다.

Claims

STAT3 활성화 저해제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 STAT3 활성화 저해제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]
제 1항 또는 제2항에 있어서,
상기 SARS 코로나바이러스는 SARS CoV-2인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.
STAT3 이량체화 억제제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 STAT3 이량체화 억제제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]
제 4항 또는 제 5항에 있어서,
상기 SARS 코로나바이러스는 SARS CoV-2인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스 생산 저해용 조성물.
STAT3 이량체화 억제제를 유효성분으로 포함하는 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산 감소용 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 STAT3 이량체화 억제제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산 감소용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]
제 7항 또는 제 8항에 있어서,
상기 SARS 코로나바이러스는 SARS CoV-2인 것을 특징으로 하는 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산 감소용 조성물.
인 비트로에서 SARS 코로나바이러스 감염된 세포에 STAT3 이량체화 억제제를 처리하여 인 비트로에서 상기 세포의 SARS 코로나바이러스의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제(RdRP) 유전자 생산을 감소시키는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 STAT3 이량체화 억제제는 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 1]

[화학식 2]
제 10항 또는 제 11항에 있어서,
상기 SARS 코로나바이러스는 SARS CoV-2인 것을 특징으로 하는 방법.