KR20210145130A - 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 개선된 뼈 임플란트 매트릭스 및 그것의 제조 방법 - Google Patents
프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 개선된 뼈 임플란트 매트릭스 및 그것의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 - 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스, - 천연 미네랄 공급원의 매트릭스, - 합성 바이오세라믹 매트릭스, 또는 상기의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 베이스 매트릭스를 포함하는 뼈 임플란트 매트릭스에 관한 것이며, 상기 베이스 매트릭스의 표면은 적어도 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체, 적어도 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴 및 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된다.
Description
본 발명은 다음의 분야: 뼈 재건 수술, 뼈 재생 수술, 재생 수술, 두개골 및 악안면 뼈 재건 수술, 종양 수술, 소아과 사례 수술, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학 및 이식학, 및 소아과 사례의 경우 이들 전부, 예컨대 뼈 재건 수술, 빼 재생 수술, 재생 수술, 두개골 및 악안면 뼈 재건 수술, 종양 수술, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학 및 이식학 중 적어도 하나에서 일반적으로 사용되는 임플란트 매트릭스에 관한 것이다.
뼈 결손을 치료하기 위해 빈번하게 사용되는 방법은 조직 재생을 촉진하기 위한 뼈 이식편(bone grafts)의 사용이다. 이것은 그것이 뼈 복구 및 치유를 촉진하는 골전도성, 골유도성 및/또는 골형성 환경을 제공하기 때문이다 [Y. Fillingham, J. Jacobs, Bone grafts and their substitutes, The bone & joint journal 98(1_Supple_A) (2016) 6-9]. 현재, 환자의 신체의 한 부위에서 다른 부위로 조직을 이식하는 자가이식이 황금 표준을 나타낸다 [L. Roseti, V. Parisi, M. Petretta, C. Cavallo, G. Desando, I. Bartolotti, B. Grigolo, Scaffolds for Bone Tissue Engineering: State of the art and new perspectives, Mater Sci Eng C 78 (2017) 1246-1262]. 그러나, 이 방법은 제한된 공급 및 도너 부위 이환의 위험과 같은 결점을 가진다 [R. Agarwal, A.J. Garc
a, Biomaterial strategies for engineering implants for enhanced osseointegration and bone repair, Adv Drug Deliver Rev 94 (2015) 53-62.]. 더욱이, 환자의 31%가 시술 후 2년 동안 도너 부위에서 지속적인 통증을 겪는 것으로 보고되었다 [D.L. Skaggs, M.A. Samuelson, J.M. Hale, R.M. Kay, V.T. Tolo, Complications of posterior iliac crest bone grafting in spine surgery in children, Spine 25(18) (2000) 2400-2402]. 이것은 특히 바이오폴리머, 바이오세라믹, 및 그것들의 복합재의 합성 이식편이 최근에 많은 연구적 관심을 받게 된 대체 뼈 이식편 공급원에 대한 연구의 동기부여가 되었다 [B. Huang, G. Caetano, C. Vyas, J.J. Blaker, C. Diver, P. Bartolo, 중합체-Ceramic Composite Scaffolds: The Effect of Hydroxyapatite and β-tri-Calcium Phosphate, Materials 11(1) (2018) 129; M. Domingos, A. Gloria, J. Coelho, P. Bartolo, J. Ciurana, Three-dimensional printed bone scaffolds: The role of nano/micro-hydroxyapatite particles on the adhesion and differentiation of human mesenchymal stem cells, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine 231(6) (2017) 555-564]. 그러나 합성 이식편은 전통적으로 자가이식편, 동종이식편 및 이종이식편에 비교하여 생물학적 성능에서 뒤처지는 경향이 있다 [G. Hannink, J.C. Arts, Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone substitutes: what is optimal for bone regeneration?, Injury 42 (2011) S22-S25; S. Corbella, S. Taschieri, R. Weinstein, M. Del Fabbro, Histomorphometric outcomes after lateral sinus floor elevation procedure: a systematic review of the literature and meta-analysis, Clin Oral Implan Res 27(9) (2016) 1106-1122]. 그렇긴 하지만, 무기질 소 뼈 (Bio-Oss®, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland) 및 이상(biphasic) 인산 칼슘 (Straumann® BoneCeramic, Institute Straumann AG, Basel, Switzerland)을 사용한 부비동 바닥 증대를 비교하는 이전의 연구가 두 그룹에 대한 뼈 형성 사이에 통계적 차이를 보이지 않았고 [L. Cordaro, D.D. Bosshardt, P. Palattella, W. Rao, G. Serino, M. Chiapasco, Maxillary sinus grafting with Bio-Oss® or Straumann® Bone Ceramic: histomorphometric results from a randomized controlled multicenter clinical trial, Clin Oral Implan Res 19(8) (2008) 796-803], 이것은 합성 뼈 이식편에 대한 상업적 연구가 진행되고 있음을 나타낸다.
다시, 학술적인 연구 환경을 보면, 인용된 많은 연구가 이식편을 제조하기 위하여 부가 제조 시스템을 사용한다. 비록 3D 프린팅이, 특히 맞춤 임플란트의 경우에, 유망한 잠재력을 갖고 있지만, 높은 제조 비용 및 긴 제조 시간에 의해 여전히 실행이 제한된다 [A. Aldaadaa, N. Owji, J. Knowles, Three-dimensional Printing in Maxillofacial Surgery: Hype versus Reality, Journal of tissue engineering 9 (2018) 2041731418770909]. 뼈 이식편에 대한 현재의 상업적 시장은 주로 소 미네랄 매트릭스의 정제를 기반으로 한 장치로 이루어진다. 정형외과적 결합의 치료를 위한 예의 선태적 세트는 SmartBone® (IBI-SA, Switzerland), Bio-Oss® (Geistlich, Switzerland) 및 maxgraft® (Biotiss, Germany - 가공된 인간 동종이식편)이다. 더 큰 뼈 블록의 치료는 일반적으로 3D 프린팅 스캐폴드보다 더 높은 생산성 및 더 낮은 비용을 가진다.
상업적으로 이용 가능한 뼈 이식편 대체물이 많이 있음에도 불구하고, 특히 소아과 시장을 겨냥한 것은 없다. 골절이 아동에 대한 모든 진단의 20-30%를 차지한다는 안정적인 보고가 있다 [P.-E. Fournier, R. Rizzoli, D.O. Slosman, G. Theintz, J.-P. Bonjour, Asynchrony between the rates of standing height gain and bone mass accumulation during puberty, Osteoporosis Int 7(6) (1997) 525-532]. 이것은 집단의 크기가 증가함에 따라 치료 수요가 증가하는 것을 의미한다. 소아과 시장은 환자의 골격의 미성숙이 추가의 뼈 성장과 상당하게 연결되기 때문에 독특하고 [N.E. Picardo, G.W. Blunn, A.S. Shekkeris, J. Meswania, W.J. Aston, R.C. Pollock, J.A. Skinner, S.R. Cannon, T.W. Briggs, The medium-term results of the Stanmore non-invasive extendible endoprosthesis in the treatment of paediatric bone tumours, The Journal of Bone and Joint Surgery. British volume 94-B(3) (2012) 425-430.], 의료 장치에 대한 매우 높은 성능 필요조건을 유도한다. 사춘기를 지나는 동안, 인간 신체는 신체 치수의 매우 높은 증가를 경험하지만, 골량의 증가는 뒤처지는 것처럼 보인다 [P.-E. Fournier, R. Rizzoli, D.O. Slosman, G. Theintz, J.P. Bonjour, Asynchrony between the rates of standing height gain and bone mass accumulation during puberty, Osteoporosis Int 7(6) (1997) 525-532]. 그러므로, 뼈 이식편이 모방해야 하는 성장 메커니즘은 매우 복잡하다. 이것은 생광물화(biomineralization)를 고속으로, 그러나 필요할 때에만 자극하는 방식으로 뼈 재생을 조절하는 장치를 개발할 필요가 있음을 의미한다. 더욱이, 뼈 조직 재생을 위해 가장 풍부하게 사용되는 성장 인자인 뼈 형성 단백질 (BMP)의 장기간 효과는 분명히 확인되지 않으며, 그것은 소아과 치료를 위해 FDA-승인되는 것을 방해한다 [K.M. Emara, R.A. Diab, A.K. Emara, Recent biological trends in management of fracture non-union, World journal of orthopedics 6(8) (2015) 623; S. Boraiah, O. Paul, D. Hawkes, M. Wickham, D.G. Lorich, Complications of recombinant human BMP-2 for treating complex tibial plateau fractures: a preliminary report, Clinical Orthopaedics and Related Research® 467(12) (2009) 3257-3262]. 이것은 개선된 특성 및 생체적합성을 가진 새로운 유형의 성장 인자에 대한 수요로 이어진다.
최근에 본질적으로 무질서한 단백질 (IDP)이, 특히 결정 성장의 방향 및 확장의 신호전달 및 조절을 통해 생광물화에서 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다 [L. Kalmar, D. Homola, G. Varga, P. Tompa, Structural disorder in proteins brings order to crystal growth in biomineralization, Bone 51(3) (2012) 528-534]. 이것은 세포 신호전달, 거대분자 자체 조립, 단백질 제거, 및 결정 핵화 및 성장과 같은 화학적 및 세포 사건에 영향을 미침으로써 이루어진다 [M. Wojtas, P. Dobryszycki, A. Ozyhar, Intrinsically disordered proteins in biomineralization, Advanced Topics in Biomineralization, InTech2012]. IDP는 그것이 조직화되지 않은 방식으로, 전체적으로 또는 부분적으로 유연한 분자의 이질적인 조화를 이루어서, 그것의 3D 구조가 정의되지 않도록 유발하는 것에 의해 인식된다 [M. Wojtas, P. Dobryszycki, A. Ozyhar, Intrinsically disordered proteins in biomineralization, Advanced Topics in Biomineralization, InTech2012; J. Habchi, P. Tompa, S. Longhi, V.N. Uversky, Introducing protein intrinsic disorder, Chemical reviews 114(13) (2014) 6561-6588]. 이것은 그것들이 매우 유연한 분자가 되게 하고 최근 결과는 조정된 무질서-질서 비율을 가진 IDP가 광물화 과정을 프로그래밍하기 위해 사용될 수 있어서, 정렬된 나노결정의 성장을 계층적 광물화된 구조로 생성할 수 있게 한다 [Elsharkawy, M. Al-Jawad, M.F. Pantano, E. Tejeda-Montes, K. Mehta, H. Jamal, S. Agarwal, K. Shuturminska, A. Rice, N.V. Tarakina, Protein disorder-order interplay to guide the growth of hierarchical mineralized structures, Nature communications 9(1) (2018) 2145].
이들 펩타이드의 일부는 이미 의학적 생광물화에서 상업적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, Straumann AG (Basel, Switzerland)사가 주로 에나멜 재생을 위한 아멜로게닌(amelogenin)을 기반으로 한 젤-코팅인 Straumann® Emdogain® (EMD)을 생산하고 판매하고 있다. 비록 일부 IDP가 상업적으로 사용되었지만, 특히 소아과 시장의 경우 임의의 상업적으로 이용 가능한 뼈 이식편의 부족은, 재생 뼈 수술의 분야에서, 외상 유도 두개골 뼈 손실, 두개골 뼈 결손 또는 종양학에서 필요한 뼈 절편 제거 (종양 치료)와 같은 결함의 임상적 카테고리에 대해, 특히 소아과 뼈 이식편으로서 사용하기에 만족스러운 특징을 가지는 새로운 뼈 임플란트 매트릭스를 찾고자 하는 필요성이 있음을 나타낸다.
발명의 요약
본 발명의 목적은:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스, 즉 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스;
- 진주 충(mother of pearl), 산호, 진주층과 같은 천연 미네랄 공급원의 매트릭스;
- 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리와 같은 합성 바이오세라믹 매트릭스
또는 상기의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 베이스 매트릭스(base matrix)를 포함하는 뼈 임플란트용 매트릭스이며, 상기 베이스 매트릭스의 표면은 적어도 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근(cell-rooting) 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질, 및 본 발명에 따라 PRP (프롤린-풍부 펩타이드)로도 정의되는 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된다.
뼈 임플란트 매트릭스의 바람직한 구체예는 청구범위에서 제2항 내지 제20항에서 정의된다.
본 발명의 뼈 임플란트 매트릭스 목적은 일반적으로 뼈 재건 수술 분야, 정형외과 수술, 외상학 수술, 종양학 수술, 척추 수술 및 구강 수술에서, 악안면 및 치과 이식에서 사용하기에, 또는 보다 일반적으로 인간 또는 수의학적 치료를 위해 사용하기에 적합하다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 다음 분야: 뼈 재건 수술, 악안면 뼈 재건 수술, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술 및 이식학 중 적어도 하나에서 사용하기 위해, 보다 일반적으로 인간 또는 수의학적 치료를 위해 사용하기 위해 본원에서 개시된 뼈 임플란트 매트릭스이다.
본 발명의 추가의 목적은 본원에 개시된 뼈 임플란트 매트릭스의 제조 방법이며, 상기 방법은:
a) 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 ("세포 친화성(friendliness to cell)") 적어도 물질, 및 본 발명에 따라 PRP로서도 정의되는 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물의 용액을 제조하는 단계,
b) 베이스 매트릭스를 상기 강화 혼합물 용액에 침지하는 단계,
c) 가능한 용매 잔류물을 제거하기 위하여 매트릭스를 건조시키고 선택적으로 탈기하는 단계;
d) 건조되고 선택적으로 탈기된 매트릭스를, 다시, 상기 강화 매트릭스 용액에 선택적으로 침지하는 단계
를 포함한다.
발명의 특정 구체예는 첨부된 도면을 참조하여, 예시의 방식으로서 하기에서 상세하게 기술되지만, 그것에 제한되지 않는다:
- 도 1: 2 ml 식염수 중의 SEQ ID 8+FITC를 가진 SB의 μg으로 표시된 질량 방출 대비 경과일의 시간의 프로파일;
- 도 2: 10 ml의 정제수 중의 PRP P2 및 P5에 대한 N 및 C 말단 상에 FITC가 있는 SEQ ID 8 및 4를 가진 SB의 μg으로 표시된 방출된 질량 대비 경과일의 시간의 프로파일. 삼각형: P2 (SEQ ID 4), 원형: P5 (SEQ ID 8). 검게 채워진 원형 및 삼각형: C-말단에 부착된 FITC, 채워지지 않은 삼각형 및 원형: N-말단에 부착된 FITC. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)는 플루오레세인의 유도체로부터의 형광색소이다. FITC는 대략 495 nm 및 519 nm의 여기 및 방출 스펙트럼 피크 파장을 가지며 본원에서 형광 표지로서만 사용된다;
- 도 3: SBP의 외부 표면 상의 무작위 지점의 SEM 분석. A: 뼈 상(phase) (베이스 매트릭스)의 SEM 사진 및 C: EDS 분석. B: 중합체 상 (강화 매트릭스)의 SEM 사진 및 D: EDS 분석;
- 도 4: SBP의 외부 표면 상의 무작위 지점의 SEM 분석. A: 뼈 상 (베이스 매트릭스)의 SEM 사진 및 C: EDS 분석. B: 중합체 상 (강화 혼합물)의 SEM 사진 및 D: EDS 분석;
- 도 5: 2일 및 14일 동안 샘플의 표면에서 성장하는 MC3T3-E1 세포의 SEM 시각화. 제시된 이미지는 대표적인 표면 영역으로부터 유래됨;
- 도 6: SBP 샘플 상에서 2일 및 14일 동안 배양된 MC3T3-E1 세포의 공초점 현미경 사진. 세포는 팔로이딘-FITC (액틴 필라멘트, 신장된 섬유를 염색함) 및 DAPI (핵, 둥근 구조를 염색함)로 염색되었다. 각각의 일의 상부 열은 심층 투사 현미경 사진을 보여주고, 이미지는 z-축을 따라 순차적인 단계로 반복적으로 획득된 섹션의 2D 재구성이다. 이들 열 상의 회색톤 코드는 0 μm의 어두운 곳으로부터 60μm 깊이의 밝은 곳 까지 코딩된, DAPI-염색된 핵의 z-축 깊이에 상응한다;
- 도 7: P2 (SBP2), P5 (SBP5) 및 P6 (SBP6)을 가진 SBP 변이체에 대한 세포독성 수준. 결과는 전-조골세포 세포주를 향한 독성이 없음을 보여주었다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 그룹간 통계적 차이는 없다;
- 도 8: 세포 배양 중에 2 (2d), 6 (6d) 및 14 (14d)일 후의 SBP2, SBP5 및 SBP6에 대한 대사 활성; 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 그룹간 통계적 차이는 없다;
- 도 9: 세포 배양 중에 14일 후에 상이한 그룹에 대한 ALP 활성. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다;
- 도 10: 각각 SBP2H, SBP2M, SBP2L, SBP5, SBP6으로서 PRP P2, P5, P6에 대한 mRNA 수준 (-H: 높음; -M: 중간; -L: 낮음, 농도) 및 1일로부터의 대조군 값 (C)의 백분율로서 EMD (Straumann Emdogain®)의 RT-PCR 분석. COL1A1: 콜라겐 유형 1 알파 1 사슬; ALP: 알칼리 포스페이트; OC: 오스테오칼신; VEGFA: 혈관 내피 성장 인자 A. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 첨가된 펩타이드 서열에 대한 뼈 세포 반응이 증강된 것을 보여준다;
- 도 11: 8주 후 돼지 두개골의 콘 빔 컴퓨터 단층촬영 (CBCT) 이미지. 둥근 원형은 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. SBP 변이체는 SEQ ID 4 (SBP2) 및 SEQ ID 9 (SBP6)를 가진다. CBCT 이미지는 펩타이드 서열 4 및 9가 있는 결함 주변의 증강된 뼈 성장을 나타낸다 (SBP6:, 검은색 상자 우측, SBP2: 검은색 상자 좌측, 비어 있음 (음성 대조군): 원형 우측 및 Smartbone® (양성 대조군): 원형
- 도 12: 뼈의 결함 안으로의 내성장을 보여주는, SEQ ID 4를 가진 SBP 변이체 (SBP2)를 가진 두개골 결함의 마이크로 컴퓨터 단층촬영.
- 도 1: 2 ml 식염수 중의 SEQ ID 8+FITC를 가진 SB의 μg으로 표시된 질량 방출 대비 경과일의 시간의 프로파일;
- 도 2: 10 ml의 정제수 중의 PRP P2 및 P5에 대한 N 및 C 말단 상에 FITC가 있는 SEQ ID 8 및 4를 가진 SB의 μg으로 표시된 방출된 질량 대비 경과일의 시간의 프로파일. 삼각형: P2 (SEQ ID 4), 원형: P5 (SEQ ID 8). 검게 채워진 원형 및 삼각형: C-말단에 부착된 FITC, 채워지지 않은 삼각형 및 원형: N-말단에 부착된 FITC. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)는 플루오레세인의 유도체로부터의 형광색소이다. FITC는 대략 495 nm 및 519 nm의 여기 및 방출 스펙트럼 피크 파장을 가지며 본원에서 형광 표지로서만 사용된다;
- 도 3: SBP의 외부 표면 상의 무작위 지점의 SEM 분석. A: 뼈 상(phase) (베이스 매트릭스)의 SEM 사진 및 C: EDS 분석. B: 중합체 상 (강화 매트릭스)의 SEM 사진 및 D: EDS 분석;
- 도 4: SBP의 외부 표면 상의 무작위 지점의 SEM 분석. A: 뼈 상 (베이스 매트릭스)의 SEM 사진 및 C: EDS 분석. B: 중합체 상 (강화 혼합물)의 SEM 사진 및 D: EDS 분석;
- 도 5: 2일 및 14일 동안 샘플의 표면에서 성장하는 MC3T3-E1 세포의 SEM 시각화. 제시된 이미지는 대표적인 표면 영역으로부터 유래됨;
- 도 6: SBP 샘플 상에서 2일 및 14일 동안 배양된 MC3T3-E1 세포의 공초점 현미경 사진. 세포는 팔로이딘-FITC (액틴 필라멘트, 신장된 섬유를 염색함) 및 DAPI (핵, 둥근 구조를 염색함)로 염색되었다. 각각의 일의 상부 열은 심층 투사 현미경 사진을 보여주고, 이미지는 z-축을 따라 순차적인 단계로 반복적으로 획득된 섹션의 2D 재구성이다. 이들 열 상의 회색톤 코드는 0 μm의 어두운 곳으로부터 60μm 깊이의 밝은 곳 까지 코딩된, DAPI-염색된 핵의 z-축 깊이에 상응한다;
- 도 7: P2 (SBP2), P5 (SBP5) 및 P6 (SBP6)을 가진 SBP 변이체에 대한 세포독성 수준. 결과는 전-조골세포 세포주를 향한 독성이 없음을 보여주었다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 그룹간 통계적 차이는 없다;
- 도 8: 세포 배양 중에 2 (2d), 6 (6d) 및 14 (14d)일 후의 SBP2, SBP5 및 SBP6에 대한 대사 활성; 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 그룹간 통계적 차이는 없다;
- 도 9: 세포 배양 중에 14일 후에 상이한 그룹에 대한 ALP 활성. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다;
- 도 10: 각각 SBP2H, SBP2M, SBP2L, SBP5, SBP6으로서 PRP P2, P5, P6에 대한 mRNA 수준 (-H: 높음; -M: 중간; -L: 낮음, 농도) 및 1일로부터의 대조군 값 (C)의 백분율로서 EMD (Straumann Emdogain®)의 RT-PCR 분석. COL1A1: 콜라겐 유형 1 알파 1 사슬; ALP: 알칼리 포스페이트; OC: 오스테오칼신; VEGFA: 혈관 내피 성장 인자 A. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 첨가된 펩타이드 서열에 대한 뼈 세포 반응이 증강된 것을 보여준다;
- 도 11: 8주 후 돼지 두개골의 콘 빔 컴퓨터 단층촬영 (CBCT) 이미지. 둥근 원형은 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. SBP 변이체는 SEQ ID 4 (SBP2) 및 SEQ ID 9 (SBP6)를 가진다. CBCT 이미지는 펩타이드 서열 4 및 9가 있는 결함 주변의 증강된 뼈 성장을 나타낸다 (SBP6:, 검은색 상자 우측, SBP2: 검은색 상자 좌측, 비어 있음 (음성 대조군): 원형 우측 및 Smartbone® (양성 대조군): 원형
- 도 12: 뼈의 결함 안으로의 내성장을 보여주는, SEQ ID 4를 가진 SBP 변이체 (SBP2)를 가진 두개골 결함의 마이크로 컴퓨터 단층촬영.
정의
본 맥락에서, "인공 펩타이드"는 그것이 자연계에서 정상적으로 발생하지 않지만 본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 펩타이드를 생성하는 순서, 양 및 방식으로 함께 취해지고 선택된 아미노산의 생성물이라는 점에서 비-천연 펩타이드인 펩타이드를 나타낸다. "인공 펩타이드"는 그것이 자연계에 존재하는 것으로 나타난 펩타이드의 일부 또는 전체를 포함하더라도 본 발명에 의해 포함된 펩타이드이다. "인공"은 "합성" 또는 "비천연"과 같은 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 맥락에서, "Pro"는 아미노산 프롤린을 나타낸다.
본 맥락에서, "X"는 소수성 아미노산을 나타낸다. 소수성 아미노산은, 본 맥락에서, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산으로서 정의된다.
본 맥락에서, "Y"는 극성 아미노산을 나타낸다.
극성 ("친수성") 아미노산은, 본 맥락에서, Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산으로서 정의된다.
본 맥락에서, 아미노산을 표시하기 위해 일반적인 명명법이 사용된다. 그러므로, 예를 들어, A는 알라닌 (소수성)이고, C는 시스테인 (극성)이며, F는 페닐알라닌 (소수성)이고, H는 히스티딘이며, I는 아이소류신 (소수성)이고, L은 류신 (소수성)이며, M은 메티오닌 (극성)이고, N은 아스파라긴 (극성)이며, Q는 글리신 (극성)이고, S는 세린 (극성)이며, T는 트레오닌 (극성)이고, V는 발린 (소수성)이며, W는 트립토판 (소수성)이고, Y는 티로신 (극성)이다.
본 맥락에서 "대상체"는 임의의 척추동물, 예컨대 조류, 파충류, 포유류, 영장류 및 인간에 관한 것이다.
본 맥락에서 "PRP"는 Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드로부터 선택된 인공 프롤린-풍부 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산인 것인 인공 프롤린-풍부 펩타이드,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산인 것인 인공 펩타이드에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
발명의 구체예에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스는:
그것의 표면이 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 ("세포 친화성") 적어도 물질 및 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 베이스 매트릭스를 포함하며, 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스, 즉 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스;
- 진주 충, 산호, 진주층과 같은 천연 미네랄 공급원의 매트릭스;
- 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리와 같은 합성 바이오세라믹 매트릭스;
또는 상기의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되고, 강화 혼합물의 가용성 중합체는 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체이며, "세포 친화성"은 젤라틴, 예컨대 소 및/또는 돼지 젤라틴, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 및/또는 돼지 가수분해된 젤라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되고 본 발명에 따르는, PRP로도 정의되는, 내재성 무질서 단백질 (IDP)에 속하는 인공 프롤린-풍부 펩타이드는 다음으로부터 선택된다:
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이고,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 베이스 매트릭스를 포함하는 뼈 임플란트 매트릭스를 다룬다:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스, 즉 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스;
- 진주 충, 산호, 진주층과 같은 천연 미네랄 공급원의 매트릭스;
- 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리와 같은 합성 바이오세라믹 매트릭스;
또는 상기의 조합; 여기서 상기 베이스 매트릭스의 표면은 적어도 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체, 적어도 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴 및 PRP로서도 정의되는, 본 발명에 따르는 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅되며, 상기 뼈 임플란트 매트릭스는 또한 "SBP"로서 확인된다.
베이스 매트릭스.
"베이스 매트릭스"라는 표현은 하기에 기술된 치료 후에, 뼈 구멍에 이식될, 전형적으로 다공성인 것으로 의도된, 실질적으로 고체 3차원 본체를 의미한다.
본 발명에 따르는 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스, 즉 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스;
- 진주 충, 산호, 진주층과 같은 천연 미네랄 공급원의 매트릭스;
- 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리와 같은 합성 바이오세라믹 매트릭스,
또는 상기의 조합으로부터 선택되는 베이스 매트릭스이다.
본 발명에 따르는 베이스 매트릭스는 특히, 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스; 바람직하게는 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스 또는 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스; 보다 바람직하게는 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스를 포함하는 군으로부터 선택된 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스; 가장 바람직하게는 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스이다.
알려진 바와 같이, 무세포화된 뼈 매트릭스는 가장 일반적으로 도너의 세포 물질이 완전하게 (또는 실질적으로) 없는 미네랄이 제거되지 않은 매트릭스: 즉 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스이다.
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스는, 예컨대 상기 매트릭스가 이식될 수 있는 곳인 뼈 구멍(bone cavities)의 형상 및 크기에 따라 적응되도록 상이한 형상 및 크기를 가질 수 있다.
예를 들어, 그러한 뼈 매트릭스는 평행육면체 형상, 특히 정육면체 형상일 수 있다.
뼈 임플란트 매트릭스의 크기는, 예를 들어, 수 mm부터 최대 길이의 몇 dm까지 달라질 수 있다.
베이스 매트릭스 및 강화 혼합물의 중합체(들)는 유리하게 생체적합성이다.
나아가, 베이스 매트릭스 및/또는 강화 혼합물의 중합체는 주변 조직과 새로운 뼈의 성장이 통합되는 것을 더 잘 보조하기 위해, 바람직하게 생체통합성이다.
강화 혼합물
더욱이 "강화 혼합물"이란 표현은 적어도 중합체, 즉 단지 하나의 중합체를 포함하거나, 또는 대안으로, 하나 이상의 중합체를 동시에 포함할 수 있는 다중 중합체일 수 있는 중합체를, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 상기에서 기술된, 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드와 함께 포함하는 혼합물을 의미한다.
특히, 강화 혼합물이란 표현은 합성 또는 천연, 및 유리하게는 생체적합성 중합체 또는 중합체들이 미세하게 분산되어 있는 혼합물을 의미한다.
본 발명에 따르는 강화 혼합물은 2개 용액으로부터 출발하여 얻어지며, 그 중 하나는 가용성 중합체: 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체로 만들졌고, 다른 하나는 동일한 용매에 첨가된 "세포 친화성": 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴 및 본 발명에 따르는 인공 프롤린-풍부 펩타이드로 만들어졌으며, 상기 두 용액은 서로에 대해 혼화할 수 없지만, 강화 혼합물의 적어도 3개의 구성요소의 미세하고 균질한 분자 분산을 얻기 위해, 알코올 또는 또 다른 적절한 용매를 두 용액의 각각에 첨가함으로써 부분적으로 혼화할 수 있다. 용매 증발 단계 중에 상기 분산은 다공성 뼈 매트릭스의 표면 상에 미세하게 분산된 통계적으로 균질한 코팅 조성물을 생성하며, 즉 코팅은 또한 내부 공동을 폐쇄하지 않으면서, 내부 공동을 코팅한다.
가용성 중합체/중합체들
강화 혼합물을 제조하기 위해 사용된 용매는 일반적으로 기술분야에서 강화 혼합물의 구성요소의 확인된 본질에 따라 사용되는 것으로 알려져 있는 것들 중에서 사용되고, 예를 들어, 물, 다이클로로메탄, 테트라하이드로푸란, 이소프로판올, 등일 수 있으며, 그것의 특정 용도는 잘 알려져 있는 화학 법칙의 측면에서 사용된, 중합체/중합체들, 젤라틴 또는 가수분해된 젤라틴, 본 발명에 따르는 인공 프롤린-풍부 펩타이드의 종류로부터 유발된다.
강화 혼합물의 중합체는 예를 들어 생분해성 중합체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 폴리에스테르, 특히 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL) 및 그것들의 공중합체, 예컨대 예를 들자면 폴리카프로락톤-폴리락틱 (PLA/PCL) 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체가 바람직하다.
더욱이, 중합체는 전분, 폴리(카프로락톤), 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드), 그것들의 거울상 이성질체, 그것들의 공중합체 및 그것들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직한 중합체/중합체들 및 또는 공중합체는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체이다.
발명에 따르면, 강화 혼합물은 중합체 또는 중합체들 외에: 예컨대 적어도 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체, 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드, 및 적어도 "세포 친화성"을 포함할 수 있다.
세포 친화성
"세포 친화성"이란 표현은 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 따르면 "세포 친화성"은 젤라틴, 가수분해된 젤라틴, 특히 돼지 또는 소 또는 임의의 다른 천연 기원의 젤라틴 및/또는 돼지 또는 소 또는 임의의 다른 천연 기원의 가수분해된 젤라틴으로부터 선택되며 "세포 친화성"이 특히 바람직하다. 적어도 하나의 "세포 친화성"의 존재는, 세포 증식 및 조직 통합이 촉진되고 이것이 선행 기술과 관련하여 중요한 장점이기 때문에, 세포 발근 및 성장을 보조한다.
인공 프롤린-풍부 펩타이드
본 발명의 바람직한 구체예에서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드이다:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합,
여기서 C는 Cys이고, L은 Leu이며, M은 Met이고, Q는 Gln이며, S는 Ser이고, V는 Val이며, Y는 Tyr이고, H는 His이며, P는 Pro이고; 보다 바람직하게 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
의 아미노산 서열을 포함하는 군으로부터 선택된 인공 펩타이드 서열 (N-말단에서 C-말단 쪽으로)이며, 여기서 C는 Cys이고, L은 Leu이며, M은 Met이고, Q는 Gln이며, S는 Ser이고, V는 Val이며, Y는 Tyr이고, H는 His이며, P는 Pro이고; 가장 바람직한 인공 프롤린-풍부 펩타이드는 (P6) PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9) (L은 Leu이고, M은 Met이며, Q는 Gln이고, V는 Val이며, Y는 Tyr이고, H는 His이며, P는 Pro임)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드 서열 (N-말단에서 C-말단 쪽으로)이다.
바람직한 구체예
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스의 바람직한 구체예로는 다음이 있다:
1) 그것의 표면이 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 베이스 매트릭스를 포함하는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 여기서 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스,
- 천연 미네랄 공급원의 매트릭스,
- 합성 바이오세라믹 매트릭스,
또는 그것들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되고,
강화 혼합물의 가용성 중합체는 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체이며, "세포 친화성"은 젤라틴, 가수분해된 젤라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되고 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 인공 펩타이드,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 인공 펩타이드
로부터 선택된다.
2) 구체예 1에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL) 및 폴리카프로락톤-폴리락틱 (PLA/PCL) 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체, 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드), 그것들의 거울상 이성질체, 그것들의 공중합체 및 그것들의 혼합물을 포함한 그것들의 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
3) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리(카프로락톤), 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드), 그것들의 거울상 이성질체, 그것들의 공중합체 및 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
4) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
5) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
6) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)
또는
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
7) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
8) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
9) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
10) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스는:
- 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스,
- 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스
를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
11) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 천연 미네랄 공급원의 매트릭스는 진주 충, 산호, 진주층을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
12) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 합성 바이오세라믹 매트릭스는 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
13) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
14) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
15) 구체예 13-14)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL)인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
16) 구체예 13-14)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
17) 구체예 13-14)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
18) 구체예 13-14)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
19) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
20) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
21) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
22) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
23) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
24) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
25) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
26) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
27) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
28) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
29) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
30) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
31) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
32) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
33) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
34) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
35) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)를 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
36) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
37) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
38) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 포함하는 군으로부터 선택된 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴 및 아미노산 서열:
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 조합을 포함하는 인공 펩타이드인 내재성 무질서 단백질 (IDP)에 속하는 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
39) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 다음의 분야: 뼈 재건 수술, 빼 재생 수술, 재생 수술, 두개골 및 악안면 뼈 재건 수술, 종양 수술, 소아과 사례, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학 및 이식학 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
40) 구체예 1)에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스로서, 인간 또는 수의학적 치료에서 사용하기 위한 것인 뼈 임플란트 매트릭스.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예로는 다음이 있다:
I) 그것의 표면이 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 바람직하게는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴, 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드,
바람직하게는 다음:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드,
보다 바람직하게는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드
를 포함하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 뼈 임플란트 매트릭스.
II) 그것의 표면이 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 바람직하게는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체로도 알려져 있는 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체, 가수분해된 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 가수분해된 젤라틴, 또는 젤라틴, 예컨대 소 또는 돼지 젤라틴, 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드,
바람직하게는 다음:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드,
보다 바람직하게는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드
를 포함하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 뼈 임플란트 매트릭스.
상기 기술된 뼈 임플란트 매트릭스는 정형외과, 종양, 소아과, 척추 및 구강 수술에서, 두개골 뼈와 관련된 신경수술에서, 일반적으로 뼈 재건 수술에서 및 이식학에서 사용될 수 있다.
상기 뼈 임플란트 매트릭스는 특히 모든 뼈 재건 수술에, 특히 예컨대 외상-관련 결함, 종양 절제 및/또는 상이한 기원의 뼈 낭종의 소파술 과정, 다른 외부적인 또는 내부적인 원인 또는 병리로 인한 임의의 뼈 손실 또는 임의이 대사 장애로 인해 뼈 구조를 재건하고 누락시키는 것에 적합하다.
바람직한 용법에 따르면, 상기 뼈 임플란트 매트릭스는 병리적 뼈 절편의 절제술, 뼈 낭종의 소파술 후의 뼈 재건 수술에 특히 적합하다.
추가적으로, 상기 뼈 임플란트 매트릭스는 또한 구강 및 치과 적용, 치과에서, 뼈 "칩"으로서, 세포 하우징을 위한 지지체 매트릭스로서 및 세포 치료법에서 사용될 수 있다.
뼈 임플란트 매트릭스는 인간 및 수의학적 용도에 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 다음 분야 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 본원에 개시된 뼈 임플란트 매트릭스이다: 뼈 재건 수술, 빼 재생 수술, 재생 수술, 두개골 및 악안면 뼈 재건 수술, 종양 수술, 소아과 사례 수술, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학 및 이식학.
본 발명의 추가의 목적은 인간 또는 수의학적 치료에 사용하기 위한, 본원에 개시된 뼈 임플란트 매트릭스이다.
본 발명에 따르면, 본원에 개시된 뼈 임플란트 매트릭스는 생광물화의 생체내 유도 및/또는 자극, 예컨대 뼈, 연골, 백악질 및/또는 치과 조직 형성 및/또는 재생의 생체내 유도에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 뼈 재건 수술을 위한, 빼 재생 수술, 재생 수술, 악안면 뼈 재건 수술, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학, 종양적 뼈 재건 수술 및 이식학에서, 대상체에서 생광물화의 생체내 유도 및/또는 자극, 예컨대 뼈의 생체내 유도, 및/또는 뼈 임플란트 매트릭스의 재생 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
I) 뼈 임플란트 매트릭스를 제공하는 단계, 여기서 뼈 임플란트 매트릭스는:
그것의 표면이 적어도 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 베이스 매트릭스를 포함하고, 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스,
- 이종 기원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스,
- 천연 미네랄 공급원의 매트릭스,
- 합성 바이오세라믹 매트릭스,
또는 그것들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되며,
강화 혼합물의 중합체는 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체이고, "세포 친화성"은 젤라틴, 가수분해된 젤라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되며 인공 프롤린-풍부 펩타이드는: Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 인공 펩타이드,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 인공 펩타이드로부터 선택되는 것인 단계;
II) 상기 뼈 임플란트 매트릭스를 상기 대상체에 이식하는 단계
를 포함한다.
이것을 이루기 위하여, 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스는 관심의 조직에 투여된다. 뼈 임플란트 매트릭스는 의도된 용도에 따라 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 발명의 뼈 임플란트 매트릭스가 조직에 투여될 때 그것은 생광물화 및 추가의 뼈 형성을 유도할 수 있다. 본 맥락에서 관심의 조직의 예로는 뼈, 연골, 백악질 및 치아를 들 수 있다. 뼈 골절로 이어질 수 있는 상태의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 예컨대 외상, 종양, 낭종, 및 감염 또는 염증, 예컨대 치주염, 임플란트 주위염 또는 골염에서의 뼈 절제를 들 수 있다. 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스는 그러한 상태를 앓고 있는, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 그것을 필요로 하는 대상체에게 뼈 임플란트 매트릭스를 투여하는 단계를 포함하는, 뼈, 연골, 백악질의 생체내 유도 및/또는 치과 조직 형성을 위한 방법이며, 뼈 임플란트 매트릭스는:
그것의 표면이 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 베이스 매트릭스를 포함하고, 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스,
- 이종 기원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스;
- 천연 미네랄 공급원의 매트릭스,
- 합성 바이오세라믹 매트릭스,
또는 그것들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되며,
강화 혼합물의 가용성 중합체는 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체이고, "세포 친화성"은 젤라틴, 가수분해된 젤라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되며 인공 프롤린-풍부 펩타이드는: Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 것인 인공 펩타이드,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산인 것인 인공 펩타이드로부터 선택된다.
뼈 임플란트 매트릭스를 제조하는 방법은 하기에서 기술되며, 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 상기 기술된 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물의 용액을 제조하는 단계,
b) 본 발명에 따르는 베이스 매트릭스를 단계 a)에 따라 만들어진 강화 혼합물에 침지하는 단계,
c) 단계 b)에 따라 만들어진 매트릭스를, 바람직하게는 37℃ (±2℃)의 진공로에서 24시간 동안 건조시키고 탈기하여 가능한 용매 잔류물을 제거하는 단계 (예를 들어 공기 중에서 또는 바람직하게는 진공로에서).
뼈 임플란트 매트릭스를 건조시키고 탈기시키는 것은 보통 동시에 일어날 수 있다.
그러한 방법에는 예를 들어 가열하는 단계, 비활성 분위기 중에서 뼈 임플란트 매트릭스를 조건화하는 단계 및 제조 과정에서 사용된 용매의 가능한 잔류물을 완전하게 제거하기 위한 탈기 단계를 포함하는 후-처리 단계가 선택적으로 이어질 수 있다.
더욱이, 뼈 임플란트 매트릭스 제조 과정에는:
d) 멸균 및 비활성인 분위기 중에서 포장하는 단계,
e) (바람직하게는 산화 에틸렌 또는 베타 방사선 조사를 통해) 멸균하는 단계
를 포함하는 포장 방법이 이어질 수 있다.
기술분야에서 알려져 있고 정형외과 수술에서 일반적으로 사용되는 매트릭스는 빈약한 기계적 저항, 빈약한 고정 저항, 취약성 및 매우 적은 연성 특징을 가진다.
본 출원인은 놀랍게도, 본 발명에 따르는 베이스 매트릭스를 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 상기 기술된 적어도 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물로 처리함으로써, 그것이 가지는 뼈 임플란트 매트릭스를 얻는 것이 가능한 것을 발견하였다.
다음의, 비제한적인 실시예는 발명의 구체예들을 기술한다.
실시예
발명에 따르는 구체예
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP"의 실행 가능성, 재생성 및 효능을 보여주기 위하여, 본 발명에 따라, 상이한 유형의 베이스 매트릭스, 가용성 중합체, "세포 친화성" 및 "PRP"로도 정의되는 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 하기 실시예 2A - 2E에 따라 조합하였고, 이상적으로 1 cc의 베이스 매트릭스당 1 μg의 펩타이드를 표적화하여 상응하는 효능을 테스트하였다.
실시예 1: 펩타이드 용액의 제조
3개의 펩타이드: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4), PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및 PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)의 각각에 대해 0.1% 중량/중량 아세트산 (물에서 - 멸균 여과됨) 중의 4 mM의 상응하는 스톡 용액을 제조하였다. 부분표본을 만들어서 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2A: 인공 프롤린-풍부 펩타이드 PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)를 가진 뼈 임플란트 매트릭스를 제조하는 방법
폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체 (PLCL)로도 알려져 있는 1 g의 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 자기 교반기로 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 가진 용액을 얻는다.
가수분해된 돼지 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 가수분해된 돼지 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조한 다이클로로메탄 중의 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체 용액에 첨가한다.
얻어진 중합체 용액을 15분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴 수용액에, 펩타이드 PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)의 용액을 상기 펩타이드의 최종 농도가 0.025 μM 이상을 이루도록 첨가한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴/펩타이드 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 최종 공중합체 용액을 10분 동안 실온에서 잘 교반된 상태를 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용액을 얻는다.
미네랄이 제거되지 않은, 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
실시예 2B. 고농도를 가진 P2로서 확인된 인공 프롤린-풍부 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)를 가진 뼈 임플란트 매트릭스: SBP2H의 제조 방법
폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체 (PLCL)로도 알려져 있는 1 g의 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 자기 교반기로 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 특징으로 한 용액을 얻는다.
가수분해된 돼지 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 가수분해된 돼지 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조한 다이클로로메탄 중의 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체 용액에 첨가한다.
얻어진 중합체 용액을 15분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴 수용액에, 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)의 용액을 상기 펩타이드의 최종 농도가 0.025 μM 이상을 이루도록 첨가한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴/펩타이드 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 최종 공중합체 용액을 10분 동안 실온에서 잘 교반된 상태를 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용액을 얻는다.
미네랄이 제거되지 않은, 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
실시예 2C. 중간 농도를 가진 P2로서 확인된 인공 프롤린-풍부 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)를 가진 뼈 임플란트 매트릭스: SBP2M의 제조 방법
1 g의 PLA/PCL 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 자기 교반기로 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 특징으로 한 용액을 얻는다.
가수분해된 소 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 가수분해된 소 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조된 다이클로로메탄 중의 PLA/PCL 공중합체 용액에 첨가한다.
얻어진 중합체 용액을 15분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 가수분해된 소 젤라틴 수용액에, 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)의 용액을, 상기 펩타이드의 최종 농도가 0.025 μM 이하로 달성되도록 첨가한다.
앞서 제조된 가수분해된 소 젤라틴/펩타이드 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 최종 공중합체 용액을 10분 동안 실온에서 잘 교반된 상태를 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용액을 얻는다.
미네랄이 제거되지 않은, 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
실시예 2D. 저농도를 가진 P2로서 확인된 인공 프롤린-풍부 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)를 가진 뼈 임플란트 매트릭스: SBP2L의 제조 방법
1 g의 P(L,DL)LA [폴리(70L-락타이드-코-30DL-락타이드)] 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 자기 교반기로 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 가진 용액을 얻는다.
돼지 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 돼지 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조된 다이클로로메탄 중의 PLA/PCL 공중합체 용액에 첨가한다.
얻어진 중합체 용액을 15분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴 수용액에, P2로서 확인된 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)의 용액을, 상기 펩타이드의 최종 농도가 2.5 μM 이하로 달성되도록 첨가한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴/펩타이드 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 최종 공중합체 용액을 10분 동안 실온에서 잘 교반된 상태를 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용액을 얻는다.
무세포화된 소 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
실시예 2E. 인공 프롤린-풍부 펩타이드 PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)를 가진 뼈 임플란트 매트릭스의 제조 방법
1 g의 PLA/PCL 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 자기 교반기로 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 특징으로 한 용액을 얻는다.
돼지 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 돼지 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조된 다이클로로메탄 중의 PLA/PCL 공중합체 용액에 첨가한다.
얻어진 중합체 용액을 15분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 돼지 젤라틴 수용액에, P2로서 확인된 펩타이드 PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)의 용액을, 상기 펩타이드의 최종 농도가 0.025 μM 이상으로 달성되도록 첨가한다.
앞서 제조된 돼지 젤라틴/펩타이드 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 최종 공중합체 용액을 10분 동안 실온에서 잘 교반된 상태를 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용액을 얻는다.
미네랄이 제거되지 않은, 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
비교 구체예
비교 목적으로, 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP"의 효능을 증명하기 위하여, PCT 출원 번호 PCT/IB2009/007759에 따르는, "SB"로서 확인된 뼈 임플란트 매트릭스를 재현하고 (실시예 3) 테스트하였다.
실시예 3. 인공 프롤린-풍부 펩타이드가 없는 뼈 임플란트 매트릭스: 뼈 이식편 대체물 또는 SB (발명에 따르는 것이 아님)의 제조 방법.
폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) 공중합체 (PLCL)로도 알려져 있는 1 g의 폴리(L-락타이드-코-카프로락톤) 공중합체를 20 ml의 다이클로로메탄에 넣어 용액을 만든다. 실온에서 적어도 45분 동안 교반 하에 유지하여 매우 균질한 분산을 가진 용액을 얻는다.
가수분해된 돼지 젤라틴의 20 ml의 1.5% 중량/중량 수용액을 제조한다. 바람직하게는 주입에 의해 물을 붓고, 부드럽게 교반하고, 가수분해된 돼지 젤라틴을 첨가한다. 적어도 1시간 동안 37℃ (± 3℃)에서 교반 하에 유지하여, 매우 균질한 분산을 특징으로 하는 용액을 얻는다.
10 ml의 아이소프로판올을 앞서 제조된 다이클로로메탄 중의 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) (PLCL) 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 공중합체 용액을 20분 동안 교반 하에 유지한다.
앞서 제조된 가수분해된 돼지 젤라틴 용액을 공중합체 용액에 첨가한다.
그렇게 얻어진 공중합체 용액을 실온에서 10분 동안 잘 교반된 상태로 유지하여 사용된 모든 화합물의 안정적인, 꽤 균질하고 나노-분산된 용애을 얻는다.
소 미네랄이 제거되지 않은, 무세포화된 뼈 매트릭스를 중합체 용액에 침지하고 침지된 상태를 적어도 30분 동안 교반 하에 유지한다.
마지막으로, 생성물을 37℃ (± 3℃)에서 24시간 동안 진공로에 넣어 용매를 제거한다.
실시예 4. 비교 펩타이드: EMD
이미 의료용 생광물화에서 사용된 펩타이드로서 Straumann® Emdogain® (EMD)에 의해 생산되고 판매되는 에나멜 재생용 아멜로게닌을 주로 기반으로 하는 젤-코팅을 비교를 위해 사용하였다. 0.1% 중량/중량 아세트산 (물에서 - 멸균 여과됨) 중의 10 mg/ml로 스톡 용액을 제조한다. 부분표본을 만들어서 -20℃에서 보관한다.
실시예 5. 실험 테스트
방출 프로파일
FITC 방출 프로파일을 얻기 위하여, 본 발명에 따르는 10x10x10 mm3 FITC- 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" 블록 (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)을 2 ml의 정제수에 침지하였다. 4일 동안 용액을 자외성-가시광(UV-vis)을 사용하여 24시간마다 분석한 후, 48시간 후에, 최종적으로 30일 후에 분석하였다. 생체내 조건을 더 잘 시뮬레이션하여 구동력을 최대화하기 위하여, 물을 매번 교환하였다. FITC+H2O 보정 곡선이 있으면, 흡광도는 농도와 관련될 수 있을 것이다. 공지량의 물을 사용하여, 방출된 질량을 측정된 농도로부터 유도할 수 있을 것이다.
적절한 FITC 방출 프로파일을 위해, 또한 실시예 3에 따라 재현한, "SB"로서 확인된 뼈 임플란트 매트릭스 샘플을 연구하였는데, "SB"의 다른 구성요소가 방출될 가능성이 있고, 분광학에 사용된 블랭크가 물 + "SB" 용액을 기반으로 한 것이었기 때문이다. 동일한 방법, 예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 방법을 적절한 "SBP"의 방출 프로파일을 만들기 위해 사용하였고, 단 10 ml의 정제수를 2 ml 대신 사용하였다. 수용액 중의 "PRP"의 존재를 확인하기 위하여, FITC 분자를 로딩 전에 펩타이드의 C- 또는 N-말단에 부착하였다.
이식편 특성화
이식편을 문헌으로부터 채택된 표준 방법에 상응하는 분석 방법을 사용하여 특성화하였다 [G. Perale, P. Arosio, D. Moscatelli, V. Barri, M. M
ller, S. MacCagnan, M. Masi, A new model of resorbable device degradation and drug release: transient 1-dimension diffusional model, Journal of Controlled Release 136(3) (2009) 196-205]. 분석적 분석은 확장된 압력 현미경 (환경 SEM, E/SEM) 및 이식편 상의 무작위 스팟을 가리키는 에너지 분산 분광법 (EDX)로 구성되었다. 사용한 기계는 EDS로 x100 배율에서 15 KV를 사용하는 JEOL 6010-LA SEM (Tokyo, Japan)이었다. 외부 및 내부 표면을 조사하였다. 내부 표면의 사진을 얻기 위하여 스캐폴드를 메스를 사용하여 조각으로 절단하였다.
코팅, 즉 본 발명에 따르는 강화 혼합물 중의 펩타이드 조성이 매우 낮기 때문에 [대략 0.0005 중량%], 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP"의 기계적 특성은 실시예 3에 따라 재현된, "SB"로서 확인된 뼈 임플란트 매트릭스와 동일한 가능성이 매우 높다.
시험관내 세포 실험
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 생체적합성, 세포독성 및 생체활성을 LDH 활성, 대사 활성 및 광물화의 시험관내 분석을 통해 수행하였다. 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 16 mm 직경 및 3 mm 높이의 디스크를 연구에 사용하였다. 디스크는 3개의 상이한 코드: 실시예 2A - 2E에 따르는 합성 펩타이드로의 상이한 처리와 관련된 SBP2, SBP5 및 SBP6 및 대조군 표면을 가졌고 연구를 맹검방식으로 수행하였다.
평가한 세포는 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(DSMC, Braunschweig, Germany)으로부터 얻은 쥐과 전-조골 세포주 (MC3T3-E1) 였다. MC3T3-E1 세포를 37℃에서 5% CO2의 보습 분위기에서 일상적으로 배양하고, 10% 소 태아 혈청 (FCS) 및 항생물질 (50 IU 페니실린/ml 및 50 mg 스트렙토마이신/ml)이 보충된 α-MEM에서 유지하였다. 세포를 PBS 및 트립신/EDTA를 사용하여 합류점에 도달하기 전에 1:4로 하위배양하였다. 모든 실험을 MC3T3-E1 세포의 동일한 계대에서 수행하였다.
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 상이한 표면 및 처리를 테스트하기 위하여, 디스크를 12-웰 플레이트에 놓고 각 디스크 상에 2x105 세포를 시딩하였다. 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 내부에서 균질한 세포 분포를 보장하기 위하여, 교반된 시딩 방법을 사용하였다 [M. Gomez-Florit, M. Rubert, J.M. Ramis, H.J. Haugen, H. Tiainen, S.P. Lyngstadaas, M. Monjo, TiO2 Scaffolds Sustain Differentiation of MC3T3-E1 Cells, J Biomater Tiss Eng 2(4) (2012) 336-344.]. 간단하게 설명하면, 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP"에 1 ml의 세포 현탁액을 첨가한 후, 플레이트를 궤도형 쉐이커 (Unitron, Infors HT, Basel, Switzerland) 상에서 6시간 동안 37℃에서 및 습도 조건 하에서 교반하였다. 그런 후, 세포를 5% CO2의 보습 분위기에서 37℃에서 최대 14일 동안 가만히 놓아둔 채로 유지하였다. 모든 실험에서 동일한 수의 세포를 플라스틱에서 나란히 배양하였다.
실험을 위해, MC3T3-E1 세포를 10% FCS 및 항생물질이 보충된 α-MEM에서, 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" 상에서 48시간 동안 (독성, 대사 활성, 유전자 발현, 주사 전자 현미경 및 공초점 현미경 용) 및 2주 동안 (유전자 발현 분석, ALP 활성, SEM 및 공초점 현미경 용) 유지하였다.
세포독성 테스트:
세포독성의 지표인 락테이트 탈수소효소 (LDH) 활성을 테스트 샘플 및 대조군과 함께 48시간 동안 인큐베이션한 후의 배양 배지에서 측정하였다. LDH-키트를 사용하였다. 낮은 대조군 (0% 독성)을 플라스틱 (TCP) 상에 시딩한 MC3T3-E1 세포의 배양 배지로부터 얻었다. 높은 대조군 (100% 독성)을 TCP상에 시딩하고 1% SDS로 처리한 MC3T3-E1 세포의 배양 배지로부터 얻었다. 백분율 세포독성을 다음 식을 사용하여 구하였다:
세포독성 (%)=(실험값-낮은 대조군)/(높은 대조군-낮은 대조군).
대사 활성:
총 대사 활성을 프레스토 블루(Presto Blue) 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 MC3T3-E1 세포 배양 후 2, 6, 14일 째에 측정하였다. 세포를 포함한 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)를 새로운 조직 배양 플레이트에 옮기고 100 μl의 프레스토 블루를 1000 μl의 배양 배지와 함께 세포에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 시약을 인큐베이션한 후에 제조사의 프로토콜을 따라 배지의 흡광도를 570 및 600 nm에서 판독하였다.
면역형광:
본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" 상에서 48시간 또는 14일 동안 성장시킨 세포를 실온에서 PBS 중의 4% 포름알데하이드로 15분 동안 고정시켰다. 액틴 세포골격 시각화를 위해, 세포를 Triton X-100 0.2%가 첨가된 PBS 중의 팔로이딘-플루오레세인 이소티오시아네이트 (팔로이딘-FITC) 5 μg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 30분 동안 염색하였다. 그런 후, DAPI를 포함한 FluoroshieldTM (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 한 방울 첨가하고 커버 글래스를 샘플 위에 장착하였다.
각 그룹의 2개 샘플을 사용하여 실험을 사용하였고 각 샘플의 2개의 이미지를 공초점 현미경 (Leica TCS SPE 레이저 시스템이 장착된 Leica DMI 4000B)으로 채택하였다.
주사 전자 현미경:
피상적 표면 상에 시딩한 세포의 시각적 표시를 시딩 후 48시간 및 14일에, 10kV, 40 Pa에서 SEM (Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Germany)을 사용하여 만들었다. 세포를 PBS에서 글루타르알데하이드로 2시간 동안 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고, 세포를 증류수로 2회 세척하였다. 30분 간격으로, 세포를 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올 용액의 첨가에 의해 탈수시켰다. 마지막으로, 에탄올을 제거하고, 세포를 실온에 두어 나머지 에탄올을 분석 전에 증발시켰다. 샘플을 절반으로 절단하여 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" 물질에서의 세포 침윤을 평가하였다. 각 그룹의 2개 샘플을 사용하여 실험을 수행하였고 각 샘플의 2개 이미지를 SEM을 사용하여 채택하였다.
실시간 PCL 분석:
총 RNA를 Tripure (Roche Diagnostics)로 분리하고 RNA를 분광계 세트를 사용하여 260 nm에서 정량화하였다. 실시간 PCR을 2개의 참조 유전자 및 여러 개의 표적 유전자 (표)에 대해 수행하였다.
각 샘플로부터의 동일한 양의 총 RNA (370 ng)를 37℃에서 60분 동안 20 μl의 최종 부피로, 고용량 RNA에서 cDNA로의 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 각각의 cDNA를 1/7로 희석하고 이들 희석을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다.
실시간 PCR을 SYBR 그린 검출을 사용하여 Lightcycler 480® (Roche Diagnostics, Germany)에서 수행하였다. 각각의 반응에 대해, 7 μl의 Lightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR 그린 I, 0.5 μM의 센스 및 안티센스 특정 프라이머 및 3 μl의 the cDNA 희석을 10 μl의 최종 부피로 첨가하였다. 정상적인 증폭 프로그램은 주형 cDNA의 변성을 위한 사전인큐베이션 단계 (95℃), 이어서 변성 단계 (95℃), 어닐링 단계 (60℃, 각각 65℃ 및 68℃인 ALP 및 오스테릭스(osterix)를 제외한 모든 경우에) 및 연장 단계 (72℃)로 이루어진 45회 사이클로 이루어졌다. 실시간 효율을 연속 희석을 사용하여 LightCycler 480 소프트웨어로 주어진 기울기로부터 계산하였다.
PCR 후의 상대적인 정량화를 각 샘플 중의 표적 유전자의 농도를, LightCycler 480 분석 소프트웨어 버전 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에 의해 제공된 진보된 상대적 정량화 방법을 사용하여 동일한 샘플 중의 2개의 참조 유전자 (하우스키핑 유전자)의 농도 평균으로 나눔으로써 계산하였다.
알칼리 포스페이트 활성
ALP 활성을 세포 배양 14일 후에 세포로부터 측정하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100으로 용해시켰다. 그런 후, 샘플을 p-니트로페닐 포스페이트 (pNPP)의 검정 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡수하는 가용성 황색 종점 생성물 중에서의 pNPP (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA)의 절단을 사용하여 ALP 활성을 평가하였다. 샘플과 병행하여, 소 장의 알칼리 포스파타제 (CIAP) (Promega, Madison, USA)를 사용하여 표준 곡선을 구성하였다; 스톡 CIAP로부터의 1 μl를 5 ml의 알칼리 포스파타제 완충액 (1:5000 희석)과 혼합하고, 계속해서 1:5로 희석하였다.
분석적 조사
방출 프로파일:
보정을 사용하여 주어진 시점에서 물 용액에 방출된 FITC의 농도를 구하였다. 주어진 시간에 사용한 공지량의 물로, 방출된 질량을 구할 수 있다.
도 1에서 초기 질량 방출 속도는 매우 높고 (처음 24시간에 대략 6 μg), 그런 후 빠르게 속도가 떨어지는 것을 관찰할 수 있다. 36일 후에, 방출 속도는 대부분의 코팅이 방출된 것을 유의하게 나타낼 정도로 떨어졌다. 경향을 나타내기 위해 로그 최적-맞춤 플롯을 작성하였고, 0.956의 R2 값은 식 1.2가 적합한 것을 시사한다:
방출된 질량 = 0.7836 * ln(t) + 6.2617 μg 1.2
식에서 't'는 경과일의 시간이다.
유사한 분석을 PRP (버전 P2 및 P5, C 또는 N 말단에 FITC가 부착됨)에 대해 실시하였다. 실험 데이터를 도 2에 나타낸다. 2개 전부의 펩타이드 버전의 -C 및 -N 기는 거의 동일하게 방출되는 것으로 관찰될 수 있다. 이런 경향으로부터 벗어나는 것은 단지 P2N이, 감소하는 속도 경향과 반대로 방출 속도가 갑자기 증가하는 14일 후 뿐이다. 또한 P2 그룹은 P5보다 더 높은 초기 방출을 나타내지만, 속도가 또한 더 빠르게 떨어지는 것을 주지할 수 있다.
최상의 맞춤 플롯을 로그 함수와 거듭제곱 함수를 모두 가정하는 그래프(소프트웨어)의 내장 최적 맞춤 기능을 사용하여 만들었다. 일반적으로, 로그 함수가 더 정확하였다 (1에 더 가까운 R2-값).
이식편 특성화:
주어진 지점에 대한 SEM 사진 및 EDS 분석을 도 3 및 4에 나타낸다. 이전의 문헌으로부터의 결과 [G. Pertici, F. Rossi, T. Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral grafts for bone regeneration: material characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]와 비교할 때, ESEM 연구는 실시예 3에 따라 재현한, "SB"로서 확인된 뼈 임플란트 매트릭스 및 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)에 대한 동일한 미세구조를 확인시켜주었다. 강화 혼합물의 중합체 상(phase)은 뼈 상, 베이스 매트릭스와 비교하여 매우 높은 탄소 함량 (EDS로부터 유래됨)에 의해 인식된다 (대략 4-5배 높은 원자 카운트). 마찬가지로, 뼈 상은 중합체 상보다 대략 10-20배 많은 칼슘 및 인 함량을 가진다. 뼈는 대부분 결정질 인회석으로 구성되며 [K. Chatzipanagis, M. Iafisco, T. Roncal-Herrero, M. Bilton, A. Tampieri, R. Kroger, J.M. Delgado-Lopez, Crystallization of citrate-stabilized amorphous calcium phosphate to nanocrystalline apatite: a surface-mediated transformation, CrystEngComm 18(18) (2016) 3170-3173.], 칼슘과 인 두 가지로 구성된 분자 구조를 가진다. 이것은 강화 혼합물이 성공적으로 적용되었음을 확인시켜준다.
도 3 및 4로부터 외부 표면과 같은 내부 표면 상의 동등한 결과를 관찰할 수 있고, 이것은 강화 혼합물 코팅의 양호한 분포를 나타낸다.
시험관내 결과
MC3T3-E1을 "SBP" 뼈 이식편 대체물, 즉 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)에 성공적으로 시딩하였다. 이것은 도 5에서 SEM 사진을 통해 시각적으로 표시된다. 이식편의 표면 상에 시딩된 세포의 상당한 형태 변화를 관찰할 수 있다. 2일 후에 세포는 이식편 표면에서는 거의 관찰할 수 없지만, 14일 후에 모든 그룹, 특히 SBP2에 대해 우수한 세포 성장이 있었다.
추가적으로, 세포 침윤을 염색된 샘플의 공초점 현미경을 사용하여 조사하였다 (도 6). 배양 후 2일 후에, 비록 약간의 세포가 SEM 이미지 상에서 관찰되었지만, 공초점 현미경으로 SBP를 통한 그것의 존재 및 침투를 확인하였다. 이것은 아마도 "SBP" 샘플, 즉 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 강화 혼합물의 중합체 상에 세포가 부착하고 성장한 것에 기인한 것이고, 이것은 SEM 하에서 시각화를 손상시킨다. 배양 후 14일 후에, 세포는 모든 "SBP" 그룹의 표면에서 잘 성장하였지만, 소수의 세포는 SEM 분석에 의해 스캐폴드 내부에서 관찰할 수 있었다. 그러나, 공초점 이미지는 적어도 60 μm 깊이를 통해 세포의 존재를 확인시켜 주었고 이것은 SBP2 그룹 상에 시딩된 세포가 SBP5 및 SBP6 (분홍핵 핵을 관찰할 수 없음)과 비교하여 더 깊게 침투한 것을 보여준다 (분홍색 핵을 2일 및 14일 째에 모두 관찰할 수 있음). 이들 결과는 세포 증식과 연관된, 대사적으로 활성인 세포에 의한 레사주린(resazurin)의 레소루핀(resorufin)으로의 환원을 토대로 한, SBP2 그룹에서 관찰된 증가된 대사 활성과 일치한다.
세포독성:
SBP의 상이한 그룹의 생체적합성을 먼저 LDH 활성을 활용하여 정량적으로 평가하였다 (도 7). LDH 검정은 세포독성의 마커로서, 손상된 세포의 원형질막을 통해 유출되는 LDH의 양을 검출한다. 테스트는 대조군과 비교하여 낮은 또는 심지어 음성 백분율의 LDH-수준을 나타낸다. 이것은 "SBP" 그룹 중 어느 것도, 즉 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 그룹 중 어느 것도 48시간 후에 MC3T3-E1 세포를 향한 독성을 갖지 않은 것으로 해석될 수 있을 것이다. SBP2는 최고 수준의 세포독성을 나타냈지만, 평균은 여전히 20% 미만이었다. SBP6은 겨우 몇 퍼센트를 나타낸 한편, SBP5는 음성 결과를 나타냈다. 비록 일원변량 분석 및 본페로닌 사후 분석을 수행하였지만, 3개 그룹간에 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 그러므로, 모두 대조군과 유사하거나 낮은 수준을 가졌다 (0% 독성). 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 모든 그룹은 ISO-10993:5에 따르는 의료 장치의 세포독성에 대해 승인된 최대 값인 30% 미만의 독성을 가졌다.
대사 활성:
대사 활성을 비교 기준으로서 2일째의 SBP2를 사용하여, 시딩 후 2, 6 및 14일째에 측정하였다 (도 8). 더 높은 대사 활성은 더 나은 세포 증식의 지표이다. 2일 후에, SBP2는 SBP5 및 SBP6보다 더 높은 대사 활성을 나타냈다. 특히 SBP6이 훨씬 낮았다. 6일 후에 대사 활성은 거의 동일하였지만, 14일 후에는 SBP2가 다시 더 높은 활성을 나타냈다.
세포 증식:
알칼리 포스페이트 수준을 세포 증식의 지표로서 사용하였다. 도 9에서 나타낸 것과 같이, SBP6 EMD 및, 부분적으로, SBP2M이 더 낮은 ALP 활성을 나타냈고, 따라서 나머지 그룹보다 더 낮은 증식을 나타냈다. 대조군 그룹은 최고 ALP 활성을 갖지만, P2L의 수준은 거의 동일하고 P2H가 약간 더 낮다. 그룹간 통계적 차이는 없었고, 이것은 모든 그룹에 대해 양호한 세포 증식이 있음을 의미한다.
유전자 발현:
상이한 골형성 마커의 mRNA 수준에 미치는 펩타이드 및 EMD의 영향을 세포 배양의 1, 3, 7 및 14일 후에 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 콜라겐 타입 1 알파 1 사슬 (COL1A1), 알칼리 포스페이트 (ALP), 오스테오칼신 (OC) 및 혈관 내피 성장 인자 A (VEGFA)를 포함한, 4개의 상이한 마커를 분석하였다 (도 10). 모든 그룹은 모든 유전자 발현의 경우, 1일 후 OC 수준을 제외하고, 대조군 그룹보다 나은 mRNA 수준을 보였다. 이것은 그것들이 모두 생물학적 성능을 개선시킨 것을 가리킨다.
처음 며칠 동안, 그룹은 모두 유사한 COL1A1 mRNA 수준을 보였고, 그런 후 14일 후에 P6 및 특히 EMD의 수준이 상당히 상승하였다. 동시에 P2H, P2M, P5 및 대조군의 수준이 떨어졌다.
펩타이드의 ALP 수준은 대조군 그룹에 유사한 경향을 따랐지만, 여기서 P2 그룹은 그룹 중에서 최고 수준을 보인 한편, EMD는 상당히 더 낮은 수준을 나타냈다. 또한 이 유전자 발현에 대해 P2L은 개선된 성능을 가졌다. 이것은 ALP 활성 테스트와 함께 합성 펩타이드가 아멜로게닌 유래된 EDM보다 나은 세포 증식을 나타내는 것을 시사한다.
통상적인 뼈 형성 마커는 유골 (osteoid) 합성 중 골모세포에 의해 방출된 오스테오칼신이다; 그러나, 또한 그것은 생체내에서 및 시험관내에 빠르게 분해되는 것으로 보고된다 [J.P. Brown, C. Albert, B.A. Nassar, J.D. Adachi, D. Cole, K.S. Davison, K.C. Dooley, A. Don-Wauchope, P. Douville, D.A. Hanley, S.A. Jamal, R. Josse, S. Kaiser, J. Krahn, R. Krause, R. Kremer, R. Lepage, E. Letendre, S. Morin, D.S. Ooi, A. Papaioaonnou, L.-G. Ste-Marie, Bone turnover markers in the management of postmenopausal osteoporosis, Clinical Biochemistry 42(10) (2009) 929-942.]. P2H, P2M, P6 및 EMD의 경우, OC 수준은 7일 이후에 가장 높고 그 이후에 2주차 동안 떨어진다. 이것은 이들 그룹에 대한 초기의 높은 골모세포 활성을 시사한다. P2L 및 대조군의 경우 최대는 14일 후에 도달하는 한편, P5는 꽤 안정적이다.
VEGFA의 관점에서 펩타이드는 초기에 대조군 그룹보다 나은 성능을 보이지만, 7일 및 14일 후에는 대조군이 나머지 그룹보다 더 나은 수준을 보인다. 비록 P2L이 대조군 그룹과 동일한 경향을 일부 따랐다.
실시예 6. 생체내 실험
동물 실험을 수술 전 28일 동안 격리된 생후 3-4개월의 잡종 돼지 18마리로 수행하였다. 모든 실험을 이 목적을 위해 Rof Codina 재단이 이용할 수 있는 시설에서 관할 자치 당국의 승인을 받은 후 커뮤니티 지침에 따라 국가 법률에 따라 수행하였다. 모든 과정을 표준 프로토콜을 따라 전신 마취를 사용하여 수행하였다. 테스팅 물질은 실시예 2a에서 기술한 것과 같다. 세로방향 절개를 정면 뼈 수준에서 만들었고 근육을 반사시켰다. 그런 후, 멸균 식염수로 연속적인 세척 하에 뼈 플레이트 수준에서 2 mm 직경의 4개의 천공을 만들었다. 상기 천공을 상이한 테스트 또는 대조군의 사용으로 밀봉하고 근육, 피하 및 피부 평면을 닫고 4주 동안 치유되도록 하였다. 직경이 16 mm인 4개의 결함을 특수 버(burr)로 만들었다. 양성 대조군은 PCT 출원 번호 PCT/IB2009/007759에 따르는 기술을 재현한, 본 출원의 실시예 3의 비교 구체예에 상응하는 뼈 임플란트 매트릭스인 Smartbone®이었고, 음성 대조군은 빈 공간 샴(sham)이었다. 샴을 제외한 결합은 샴을 제외하고 소 심낭막 (Tutopatch, Tissue Matrix, Tutogen Medical GmbH)을 가졌다. 결함을 전두골 및 정수리골의 수준의 중간 선에 생성하여 테스트할 물질로 채웠다. 항생물질 예방은 아목시실린 (20 mg/kg/s.i.d./피하)을 사용하여 1주 동안 투여하였다. 8주 및 16주의 2개의 시점이 있었다. 9마리의 동물을 8주 후 사전 진정 후에 과다용량의 펜토바르비탈 (40-60 mg/kg, 정맥내)에 의해 희생시켰고, 9마리의 동물을 16주 후에 희생시켰다. 두개골을 해부하고 연구 중인 결함이 있는 뼈 블록을 얻어서, 4-7일 동안 4℃에서 10% 완충 포름알데하이드 용액에서 고정시켰다. 결함의 콘 빔 및 현미경 단층 촬영 연구를 수행하였고 그것들의 재생 백분율을 수행하였다. 결과 (도 11: SEQ ID 4 (SBP2) and SEQ ID 9 (SBP6)를 가진 SBP 변이체의 CBCT 이미지는 펩타이드 서열 4 및 9를 가진 결함 주변에서의 증강된 뼈 성장을 보이며 (각각 SBP6:, 검은색 상자 우측, SBP2: 검은색 상자 좌측, 비어 있음 (음성 대조군): 원형 우측 및 Smartbone® (양성 대조군): 원형 좌측) 도 12: 뼈의 결함 안으로의 내성장을 보여주는, SEQ ID 4를 가진 SBP 변이체 (SBP2)를 가진 두개골 결함)는 음성 및 양성 두 대조군과 비교했을 때 증강된 뼈 형성 및 더 빠른 결함의 폐쇄를 보여주었다. 펩타이드 서열을 가진 모든 결함은 샴과 비교했을 때 결함에서 상당히 더 두껍고 더 많은 뼈 형성을 나타냈다.
논의
본원에서 실시예 3에 따라 재현된, PCT 출원 번호 PCT/IB2009/007759에 따르는, "SB"로서 확인된 뼈 임플란트 매트릭스는 평균 27% 다공도를 가지는 건강한 장골과 유사한 미세구조를 가지며, 상기 "SB"의 조작된 구조는 소 기반의 이종이식편보다 더 나은 골유착을 보장하는 것으로 이미 확립되어 있다 [G. Pertici, F. Rossi, T. Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral grafts for bone regeneration: material characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]. 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 강화 혼합물 코팅을 분석함으로써, 미세구조는 상기 인용된 "SB"의 미세구조와 동등하며 강화 혼합물 코팅 중의 펩타이드의 균질한 분포가 있는 것으로 확인되었다. 천연 조직이 균질한 구조를 갖지 않기 때문에, 이것은 꽤 기본적인 코팅 구조이다 [J. Leijten, Y.C. Chai, I. Papantoniou, L. Geris, J. Schrooten, F. Luyten, Cell based advanced therapeutic medicinal products for bone repair: keep it simple?, Adv Drug Deliver Rev 84 (2015) 30-44.]. 이상적으로, 성장 인자는 조직 성장 및 광물화를 촉진하여서 재생된 조직이 천연 조직 환경과 유사한 구조를 가져야 한다. 이것은 BMP 또는 EDM과 같은 종래의 성장 인자의 균질한 분포로는 어려울 수 있지만, "PRP"는 자동 생물학적 온-오프 기능을 갖도록 설계되었다. 이것은 "PRP"가 필요할 때에만 활성이 되는 것을 허용한다.
뼈는 성공적인 조직 성장을 촉진하기 위하여 그것의 복합적인 세포가 다층 유기적인 구조에서 증식, 분화 및 성숙의 상이한 단계에 있을 것을 필요로 한다 [D. Tang, R.S. Tare, L.Y. Yang, D.F. Williams, K.L. Ou, R.O.C. Oreffo, Biofabrication of bone tissue: approaches, challenges and translation for bone regeneration, Biomaterials 83 (2016) 363-382.]. 그러므로, 높은 초기 성장이 있지만, 또한 세포에 대한 단계 다양성을 재보장하도록 펩타이드 방출 속도를 조정하는 것이 중요하다. 펩타이드 유용성에 대한 표적 방출은 실험적으로 증명된 바, 1주 동안 1일당 1 mg (cc "SBP"당)이었다. 이것은 14일 이내에 10 mg을 방출하여야 하고 처음 2일 내에 피크를 이루어야 한다. 결과에서 알 수 있는 것과 같이, 서열 ID 4 및 서열 ID 8은 처음 2일 동안 최고 방출 속도를 나타냈고 14일 이후에는 서열 ID 4는 11.75-14.01 mg 정도였고 서열 ID 8의 경우 8.75-9.90 mg을 방출하였다. 이것은 방출이 설계된 대로였음을 확인시켜 준다. 그러므로 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)는 소아 뼈 재생에 매우 적당한 펩타이드 방출 속도를 가진다.
"PRP" 및 ALP 활성에 대한 mRNA 수준을 고려하면 그것은 펩타이드가 더 높은 골모세포 분화를 제공하고 골형성을 촉진한다는 강력한 표시이다. 더욱이, 아멜로게닌 유래된 EMD보다 "PRP"에 대한 상당히 더 높은 ALP 활성은 그것이 조직 재생의 임상적인 성공과 관련될 때 IDP의 수많은 잠재력을 설명해준다. 현재 이용 가능한 이식편의 특히 좋지 못한 골유착 및 조직 형성은 새롭게 형성된 뼈의 증강된 성장 및 개선된 수율에 대한 필요성을 구동시킨다 [D. Tang, R.S. Tare, L.Y. Yang, D.F. Williams, K.L. Ou, R.O.C. Oreffo, Biofabrication of bone tissue: approaches, challenges and translation for bone regeneration, Biomaterials 83 (2016) 363-382]. 그러므로, 본 발명에 따르는 뼈 임플란트 매트릭스 "SBP" (예컨대 실시예 2A - 2E에 따르는 것들)의 강화 혼합물 코팅에서 "PRP"의 존재는 올바른 방향으로 가는 양호한 단계이다.
SEQUENCE LISTING
<110> INDUSTRIE BIOMEDICHE INSUBRI SA
<120> "IMPROVED BONE IMPLANT MATRIX COMPRISING PROLINE-RICH PEPTIDE AND
METHOD OF PREPARING THE SAME"
<130> P65760EP00
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> seqidno1
<222> (1)..(92)
<223> I (Ile) can be an aa independently selected form the group consisting of: Ala,
Ile, Leu, Met, Phe, Trp and Val, preferably Ile, Leu, Val and
Met; S (Ser) can be an aa independently selected from the group consisting of:
Asn, Cys, Gln, Ser, Thr and Tyr, preferably Ser and Gln
<400> 1
Pro Ile Ile Pro Ser Ser Ser Pro Ile Ile Pro Ser Ser Pro Ile Ile
1 5 10 15
Pro Ile Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Pro Ile Ile Pro Ile Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ile
35 40 45
Ile Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ile Ile Pro Ser Ser Pro Ile Ile Pro
50 55 60
Ser Ser Pro Ile Ile Pro Ser Pro Pro Ile Pro Pro Ile Ile Ile Ile
65 70 75 80
Ile Ile Ile Ile Pro Ile Ile Pro Ile Ile Ile Ile
85 90
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<223> I (Ile) can be an aa independently selected form the group consisting of: Ala,
Ile, Leu, Met, Phe, Trp and Val; S (Ser) can be an aa independently selected
from the group consisting of: Asn, Cys, Gln, Ser, Thr and Tyr
<400> 2
Pro Ile Ile Pro Ser Ser Pro Ile Ile Pro Ser Ser Pro Ile Ile Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ser Pro Pro Ile Pro Pro
20 25
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 3
Pro Leu Val Pro Ser Tyr Pro Leu Val Pro Ser Tyr Pro Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Tyr Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 4
Pro Leu Val Pro Ser Gln Pro Leu Val Pro Ser Gln Pro Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Gln Pro Gln Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 5
Pro Leu Val Pro Cys Cys Pro Leu Val Pro Cys Cys Pro Leu Val Pro
1 5 10 15
Cys Cys Pro Cys Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 6
Pro Met Met Pro Ser Tyr Pro Met Met Pro Ser Tyr Pro Met Met Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Tyr Pro Pro Met Pro Pro
20 25
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 7
Pro Leu Val Pro Ser Ser Pro Leu Val Pro Ser Ser Pro Leu Val Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ser Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 8
Pro Leu Val Pro Ser Ser Pro Leu Val Pro Cys Cys Pro Leu Val Pro
1 5 10 15
Cys Cys Pro Ser Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proline rich peptide
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25)
<400> 9
Pro His Gln Pro Met Gln Pro Gln Pro Pro Val His Pro Met Gln Pro
1 5 10 15
Leu Pro Pro Gln Pro Pro Leu Pro Pro
20 25
Claims (20)
- 뼈 임플란트 매트릭스로서,
그것의 표면이 적어도 가용성 중합체, 세포 증식 및 조직 통합을 자극함으로써 세포 발근 및 세포 성장을 촉진할 수 있는 적어도 물질 ("세포 친화성") 및 적어도 하나의 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 함유하는 강화 혼합물인 통계적으로 균질한 조성물로 코팅된 베이스 매트릭스를 포함하고, 베이스 매트릭스는:
- 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스,
- 천연 미네랄 공급원의 매트릭스,
- 합성 바이오세라믹 매트릭스,
또는 그것들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되며,
강화 혼합물의 가용성 중합체는 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체이고, "세포 친화성"은 젤라틴, 가수분해된 젤라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되며 인공 프롤린-풍부 펩타이드는: Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val, 바람직하게는 Ile, Leu, Val 및 Met로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr, 바람직하게는 Ser 및 Gln로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산인 것인 인공 펩타이드,
또는
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드, 여기서:
a) Pro는 프롤린이고;
b) X는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산이며;
c) Y는 Asn, Cys, Gln, Ser, Thr 및 Tyr로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산인 것인 인공 펩타이드
로부터 선택되는, 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤 (PCL) 및 그것의 공중합체 및 폴리카프로락톤-폴리락틱 (PLA/PCL) 공중합체, 폴리(L-락타이드-코--카프로락톤) 공중합체, 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드), 그것들의 거울상 이성질체, 그것들의 공중합체 및 그것들의 혼합물을 포함하는 그것들의 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리(카프로락톤), 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(L-락타이드-코-D,L-락타이드), 그것들의 거울상 이성질체, 그것들의 공중합체 및 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르 또는 그것의 공중합체는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL) 또는 폴리(L-락타이드-코--카프로락톤) 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는:
PLVP SQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)
의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
의 아미노산 서열의 조합인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 임의의 공급원의 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 뼈 매트릭스는:
- 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 인간-유래 뼈 매트릭스,
- 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 이종-유래 뼈 매트릭스, 예컨대 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 말-뼈 매트릭스, 무세포화된 또는 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 돼지-뼈 매트릭스
를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 천연 미네랄 공급원의 매트릭스는 진주 충, 산호, 진주층을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 합성 바이오세라믹 매트릭스는 하이드록실-아파타이트, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 규소, 산화 티탄, 산화 알루미늄, 산화 지르코니아, 흑연, 생체유리를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴/젤라틴 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체, 가수분해된 젤라틴/젤라틴 및 다음:
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3),
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5),
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6),
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는 그것들의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 인공 프롤린-풍부 펩타이드를 포함하는 강화 혼합물로 코팅된 무세포화된 미네랄이 제거되지 않은 소 뼈 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제13항 또는 제14항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체는 폴리카프로락톤-폴리락틱 공중합체 (PLA/PCL)인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 생분해성 폴리에스테르-기반 공중합체는 폴리(L-락타이드-코--카프로락톤) 공중합체인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4),
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8),
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
또는:
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합,
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8) 및
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)의 아미노산 서열의 조합
을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제13항 또는 제14항에 있어서, 인공 프롤린-풍부 펩타이드는:
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
의 아미노산 서열을 포함하는 인공 펩타이드인 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스. - 제1항에 있어서, 다음 분야: 뼈 재건 수술, 빼 재생 수술, 재생 수술, 두개골 및 악안면 뼈 재건 수술, 종양 수술, 소아과 사례, 구강 수술, 치과 수술, 정형외과 수술, 척추 수술, 외상학 및 이식학 중 적어도 한 분야에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
- 제1항에 있어서, 인간 또는 수의학적 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 뼈 임플란트 매트릭스.
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| PA0105 | International application |
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