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KR20210129105A - 면역치료법을 위한 변형된 자연 살해(nk) 세포 - Google Patents

면역치료법을 위한 변형된 자연 살해(nk) 세포 Download PDF

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KR20210129105A
KR20210129105A KR1020217029133A KR20217029133A KR20210129105A KR 20210129105 A KR20210129105 A KR 20210129105A KR 1020217029133 A KR1020217029133 A KR 1020217029133A KR 20217029133 A KR20217029133 A KR 20217029133A KR 20210129105 A KR20210129105 A KR 20210129105A
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KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cells
modified
lymphocyte
tigit
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217029133A
Other languages
English (en)
Inventor
고든 그랜트 웰스테드
크리스토퍼 보르게스
카리에 카 와이 웡
Original Assignee
에디타스 메디신, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에디타스 메디신, 인코포레이티드 filed Critical 에디타스 메디신, 인코포레이티드
Publication of KR20210129105A publication Critical patent/KR20210129105A/ko
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Abstract

본 개시내용은 세포, 예를 들어, 발달상 성숙 T 세포로부터 유래된, 유도된 만능 세포로부터의 NK 세포(또는 다른 림프구)의 생성, 및 면역치료법을 위한 이의 용도에 대한 것이다.

Description

면역치료법을 위한 변형된 자연 살해(NK) 세포
관련 출원
본 출원은 2019년 2월 15일에 출원된 미국 가출원 제62/806,457호; 2019년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/841,066호; 2019년 5월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/841,684호; 및 2019년 12월 4일에 출원된 미국 가출원 제62/943,649호에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전문은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
NK 세포는, 예를 들어, 면역-종양학의 맥락에서, 면역치료법 접근에 유용하다. NK 세포는 세포독성 선천성 림프구의 한 유형이다. NK 세포는 종양 면역성에서 중요한 역할을 담당하며, NK 세포의 세포독성 활성은 활성화 및 저해 경로의 네트워크에 의해 철저히 조절된다(예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gras Navarro A, Bjorklund AT and Chekenya M (2015) Front. Immunol. 6:202] 참고).
예를 들어, 자가 또는 동종이형 NK 세포 전달을 통한, 면역치료법 접근에서 자연 생성 또는 변형된 NK 세포의 사용이 보고되었으며, 일부는 성공을 거두었으나, 이러한 접근은 전형적으로 최적에 못 미치는 NK 세포 반응을 특징으로 한다. 면역-종양학의 맥락에서, 상기 최적에 못 미치는 반응은, 적어도 부분적으로, 종양이 NK 세포 저해 경로를 지배하여 세포독성 NK 세포 활성을 억제하고/하거나, NK 세포 침습을 제한하고/하거나, NK 세포 증식 및 생존을 저해하는 것으로 여겨진다. 따라서, 고형 종양의 치료법에서 NK 세포의 적용은 제한된 성공을 나타내었다.
최초의 작업은, 예를 들어, NK 세포에서 NK 세포를 종양 세포로 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현시킴으로써, 또는 더 강하고/강하거나 더 지속되는 NK 세포 반응을 달성하기 위해 활성화 또는 저해 NK 세포 경로를 조절함으로써, 특이적 세포 상에서 NK 세포 반응에 초점을 맞추는 것을 시도할 때 수행되었다. 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Jing Y, et al. (2015) PLoS ONE 10(3):e0121788; 및 Oberschmidt 0, Kloess S and Koehl U (2017) Front. Immunol. 8:654]을 참고한다.
치료 항체와 조합되어 사용될 수 있는 기성(off-the shelf) 동종이형 NK 세포 치료법을 추구하기 위해, 세포가 CD16의 증강된 버전(hnCD16)을 발현하는 유도된 만능 줄기 세포주가 개발되었고, NK 세포는 상기 iPSC 세포주로부터 유래되었다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Li et al., Cell Stem Cell. 2018 Aug 2;23(2):181-192.e5]을 참고한다.
그러나, 현재까지 이들 접근은 모두 제한된 성공을 나타내었다. 따라서, 면역치료법을 위해 더 우수한 치료 접근을 개발할 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시내용의 일부 양태는 면역치료 접근, 예를 들어, 면역종양학 치료 접근의 맥락에서 유용한 조성물, 세포, 세포 집단, 방법, 전략, 및 치료 방식을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 예를 들어, 면역치료 접근의 맥락에서, NK 세포 치료법에서 유용한 변형된 NK 세포(또는 다른 림프구)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 세포 및 세포 집단은 면역치료 접근에서 이의 유효성을 증강시키는 하나 이상의 변형을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치료 맥락에서 NK 세포 기능의 저해와 연관된 유전자 또는 단백질의 기능-상실을 가져오는 하나 이상의 변형, 및/또는 치료 맥락에서 증강된 NK 세포 기능과 연관된 외인성 핵산 또는 단백질의 발현을 가져오는 하나 이상의 변형을 포함하는 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유도 만능 세포(iPSC)로부터 유래되는 변형된 NK 세포를 제공한다. IPSC-유래된 NK 세포는 본원에서 iNK 세포로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 체세포로부터, 예를 들어 비제한적으로 섬유아세포, 말초혈 세포, 또는 발달상 성숙 T 세포(가슴샘 선택을 거친 T 세포)로부터 유래되는 변형된 iNK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 NK 또는 iNK 세포는 하나 이상의 게놈 편집물, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제로 게놈 유전자좌를 절단하여 생성되는 외인성 핵산 핵산 구축물의 인델(indel) 또는 삽입을 포함한다. 변형된 NK 및 iNK 세포의 생성 맥락에서 RNA-가이드 뉴클레아제 기술의 사용은 임상 적용에 관련된 증강된 특징을 갖는 복합 변경의 조작을 허용한다.
본 개시내용의 일부 양태는 복합 편집 전략, 그리고 복합 게놈 변경을 갖는 생성된 NK 세포를 제공하며, 이는 임상 적용을 위한, 예를 들어, 면역종양학 치료 접근을 위한 진보된 NK 세포 산물의 생성을 허용한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 고증식성 질병, 예컨대, 암을 갖거나, 이를 갖는 것으로 진단된 환자를 위한 기성 임상 해결책으로 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 변형되지 않은 NK 세포에 비해 증강된 생존, 증식, NK 세포 반응 수준, NK 세포 반응 기간, NK 세포 고갈에 대한 저항성, 및/또는 표적 인식을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 변형된 NK 세포에서 관심 키메라 항원 수용체(CAR), 예를 들어, 메조텔린, EGFR, HER2 및/또는 MICA/B를 표적화하는 CAR의 발현; CD16 변이체, 예를 들어, 비-자연 생성 CD16 변이체, 예컨대 hnCD16(예를 들어, 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Zhu et al., Blood 2017, 130:4452] 참고)의 발현; IL15/IL15RA 융합물의 발현; TGF 베타 수용체 2(TGF베타R2)의 기능-상실; 및/또는 TGF베타R2의 우성-음성 변이체의 발현; ADORA2A의 기능-상실; B2M의 기능-상실; HLA-G의 발현: CIITA의 기능-상실; PD1의 기능-상실; TIGIT의 기능-상실; 및/또는 CISH의 기능-상실; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 CISH의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TIGIT의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TIGIT의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 ADORA2A의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 TIGIT의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 CISH의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 TIGIT의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 가용성 MICA 및/또는 MICB의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 가용성 MICA 및/또는 MICB의 발현, 외인성 IL-12의 발현, 외인성 IL-18의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 외인성 IL-12의 발현, 외인성 IL-18의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서 본 개시내용은 변형된 림프구를 특징으로 하며, 여기서 변형된 림프구는 내인성 CD3, CD4, 및/또는 CD8을 발현하지 않고; (i) CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45; (ii) NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하고; 변형된 림프구는 추가로 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) 인터류킨-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표현 항원 분화 클러스터 CD47(CD47)을 인코딩하는 핵산 서열; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1); (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH); (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA); (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A); (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자; (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B); (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGFβR2의 기능 상실 및 CISH의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 ADORA2A의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 내인성 CD3, CD4, 및/또는 CD8을 발현하지 않으며; (i) CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45; (ii) NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하고; 여기서 변형된 림프구는 추가로 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) 인터류킨-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47)을 인코딩하는 핵산 서열; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2), 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH), 또는 이의 조합의 기능 상실을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 핵산 구축물은 표적 세포에서, 예를 들어, 변형된 림프구, 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 핵산 서열의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, (1)(i) 내지 (1)(ix)에 열거된 유전자 산물, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구축물이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 표적 세포에서 특이적으로 발현되며, 예를 들어, 프로모터는 림프구- 또는 NK-세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD56(NCAM) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD49 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD45 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 FcγRIII 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 NKG2D 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD69 프로모터이다.
일부 실시형태에서, (1)에 열거된 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 핵산 구축물은 (2)에 열거된 유전자 산물을 인코딩하는 게놈 유전자좌 내로 녹킹되어, (2)에 열거된 유전자 산물의 기능-상실 및 이종성 프로모터에 의해 유도되거나 외인성 핵산 구축물이 녹킹된 게놈 유전자좌의 내인성 프로모터에 의해 유도되는, 외인성 핵산 구축물에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 발현을 초래한다.
일부 실시형태에서, (1)에 열거된 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 핵산 구축물은 "세이프 하버(safe harbor)" 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌, 콜라겐 유전자좌, 또는 AAVSI 게놈 유전자좌 내로 녹킹된다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자는 HLA-DQA1, HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DMA, HLA-DQA2, 및 HLA-DOA로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB3, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, 및 HLA-DRB5로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 재배열된 내인성 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열된 TCR은 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함한다.
일부 실시형태에서, 자연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b이다.
일부 실시형태에서, IL-15R 변이체는 구성적으로 활성이 있는 IL-15R 변이체이다. 일부 실시형태에서, 구성적으로 활성이 있는 IL-15R 변이체는 IL-15R 및 IL-15R 작용제, 예를 들어, IL-15 단백질 또는 이의 IL-15R-결합 단편 간 융합물이다. 일부 실시형태에서, IL-15R 작용제는 IL-15, 또는 이의 IL-15R-결합 변이체이다. 예시적인 적합한 IL-15R 변이체는 비제한적으로, 예를 들어, 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Mortier E et al, 2006; The Journal of Biological Chemistry 2006 281: 1612-1619; 또는 Bessard-A et al., Mol Cancer Ther. 2009 Sep;8(9):2736-45]에 기재된 것들을 포함한다. 추가적인 적합한 변이체는 본 개시내용 및 당업계에서의 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용은 이에 관해 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, TGFβR2는 TGFβ 수용체 II의 우성-음성 변이체(DN-TGFβR2)이다.
일부 실시형태에서, CAR은 메조텔린, EGFR, HER2, MICA/B, BCMA, CD19, CD22, CD20, CD33, CD123, 안드로겐 수용체, PSMA, PSCA, Muc1, HPV 바이러스 펩타이드(즉 E7), EBV 바이러스 펩타이드, CD70, WT1, CEA, EGFRvIII, IL13Rα2, GD2, CA125, CD7, EpCAM, Muc16, 및/또는 CD30에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다능성 줄기 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC)이다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 림프구에 (1)(i) 내지 (1)(ix) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나 이상의 외인성 핵산 구축물; 및 또는 (2)(i) 내지 (2)(xi) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경을 포함하는 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 림프구에 (2)(i) 내지 (2)(xi) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경을 포함하는 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 림프구에서 하나 이상의 (2)(i) 내지 (2)(xi)의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경은 외인성 핵산 구축물의 삽입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 외인성 핵산 구축물은 (1)(i) 내지 (1)(ix) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 (2)에 열거된 유전자/단백질 중 2개 이상의 기능-상실을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 (2)의 유전자를 보유하거나 단백질을 인코딩하는 게놈 유전자좌 내로의 외인성 뉴클레오타이드 구축물의 인델 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 (2)의 유전자를 보유하거나 단백질을 인코딩하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 내로의 외인성 뉴클레오타이드 구축물의 인델 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 RNA-가이드 뉴클레아제로 게놈 유전자좌를 편집함으로써 수득되었다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 SpCas9, SaCas9, (KKH) SaCas9, AsCpf1(AsCas12a), LbCpf1, (LbCas12a), CasX, CasY, Cas12h1, Cas12i1, Cas12c1, Cas12c2, eSpCas9, Cas9-HF1, HypaCas9, dCas9-Fokl, Sniper-Cas9, xCas9, AaCas12b, evoCas9, SpCas9-NG, VRQR, VRER, NmeCas9, CjCas9, BhCas12b, 및 BhCas12b V4로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌를 편집함으로써 수득된다. 일부 실시형태에서, (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 중 적어도 2개는 상이한 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 편집되었다. 일부 실시형태에서, (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 중 적어도 하나는 Cas9에 의해 편집되었고, 유전자좌 중 적어도 하나는 Cpf1에 의해 편집되었다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 내인성 CD56, CD49, 및 CD45를 발현한다.
일부 실시형태에서, 변형된 림프구는 자연 살해(NK) 세포이다.
또 다른 양태에서 본 개시내용은 변형된 세포를 특징으로 하며, 여기서 변형된 세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγIII, 분화 클러스터 16(CD16))의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1); (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH); (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA); (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A); (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자; (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B); (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGFβR2의 기능 상실 및 CISH의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TIGIT의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TIGIT의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 ADORA2A의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TGF베타R2의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 CISH의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 TIGIT의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 변형된 세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγIII, 분화 클러스터 16(CD16))의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2), 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH), 또는 이의 조합의 기능 상실을 나타낸다.
외인성 핵산 구축물을 포함하는 변형된 세포, 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 림프구의 일부 실시형태에서, 외인성 핵산 구축물은 표적 세포에서, 예를 들어, 변형된 림프구, 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 핵산 서열의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, (1)(i) 내지 (1)(x)에 열거된 유전자 산물, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구축물이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 표적 세포에서 특이적으로 발현되며, 예를 들어, 프로모터는 림프구- 또는 NK-세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD56(NCAM) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD49 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD45 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 FcγRIII 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 NKG2D 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 CD69 프로모터이다.
변형된 세포, 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 림프구의 일부 실시형태에서, (1)에 열거된 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 핵산 구축물은 (2)에 열거된 유전자 산물을 인코딩하는 게놈 유전자좌 내로 녹킹되어, (2)에 열거된 유전자 산물의 기능-상실 및 이종성 프로모터에 의해 유도되거나 외인성 핵산 구축물이 노킹된 게놈 유전자좌의 내인성 프로토커에 의해 유도되는, 외인성 핵산 구축물에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 발현을 초래한다.
2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자의 기능 상실을 포함하는 변형된 세포, 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 림프구의 일부 실시형태에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자는 HLA-DQA1, HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DMA, HLA-DQA2, 및 HLA-DOA로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB3, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, 및 HLA-DRB5로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 실시형태에서, 림프구는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 림프구는 iNK 세포이다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 다능성 또는 만능 줄기 세포, 예를 들어, iPS 세포, 또는 조혈 줄기 세포, 또는 이러한 다능성 또는 만능 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포, 예를 들어, iNK 세포이다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 내인성 T-세포 공동-수용체를 발현하지 않는다.
일부 실시형태에서, 림프구는 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 재배열된 내인성 TCR 유전자좌를 포함하며, 여기서 재배열된 TCR은 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 (i) CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45; (ii) NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현한다.
일부 실시형태에서, 자연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b이다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 적어도 하나의 NK 세포 바이오마커를 발현한다. 일부 실시형태에서, NK 세포 바이오마커는 CD56, CD49, 및/또는 CD45이다.
하나의 양태에서, 본원에서 기재되는 변형된 림프구, 또는 본원에서 기재되는 변형된 세포를 포함하는 세포 집단이 본원에서 개시된다.
하나의 양태에서, 본원에서 개시되는 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 개시된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 림프구의 단리된 집단을 제공하며, 여기서 집단은 적어도 1x103, 적어도 1x104, 적어도 1x105, 적어도 2x105, 적어도 3x105, 적어도 4x105, 적어도 5x105, 적어도 1x106, 적어도 2x106, 적어도 3x106, 적어도 4x106, 적어도 5x106, 적어도 1x107, 적어도 1x107, 적어도 2x107, 적어도 3x107, 적어도 4x107, 적어도 5x107, 적어도 1x108, 적어도 2x108, 적어도 3x108, 적어도 4x108, 적어도 5x108, 적어도 1x109, 적어도 1x109, 적어도 2x109, 적어도 3x109, 적어도 4x109, 적어도 5x109, 적어도 1x1010, 적어도 2x1010, 적어도 3x1010, 적어도 4x1010, 적어도 5x1010, 적어도 1x1011, 또는 적어도 1x1012 세포를 포함하고, 집단 내 림프구의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 적어도 99.99%, 적어도 99.999%, 또는 실제로 100%는 (a) 재배열된 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 포함하며; (b) 내인성 CD3을 발현하지 않고; (c) 내인성 CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45를 발현하고; (d) 적어도 (i) NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)); (ii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iii) CD69; (iv) 자연 세포독성 수용체; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 내인성 유전자를 발현하고; 변형된 림프구는 추가로 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1); (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH); (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA); (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A); (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자; (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B); (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGFβR2의 기능 상실 및 CISH의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 ADORA2A의 기능-상실 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 TIGIT의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, CISH의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TGF베타R2의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 ADORA2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, TIGIT의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 CISH의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 변형된 림프구는 TIGIT의 기능-상실, ADORA2A의 기능-상실, 및 NKG2A의 기능-상실을 나타낸다.
하나의 실시형태에서, 림프구의 단리된 집단은 적어도 1x103, 적어도 1x104, 적어도 1x105, 적어도 2x105, 적어도 3x105, 적어도 4x105, 적어도 5x105, 적어도 1x106, 적어도 2x106, 적어도 3x106, 적어도 4x106, 적어도 5x106, 적어도 1x107, 적어도 1x107, 적어도 2x107, 적어도 3x107, 적어도 4x107, 적어도 5x107, 적어도 1x108, 적어도 2x108, 적어도 3x108, 적어도 4x108, 적어도 5x108, 적어도 1x109, 적어도 1x109, 적어도 2x109, 적어도 3x109, 적어도 4x109, 적어도 5x109, 적어도 1x1010, 적어도 2x1010, 적어도 3x1010, 적어도 4x1010, 적어도 5x1010, 적어도 1x1011, 또는 적어도 1x1012 세포를 포함하며, 집단 내 림프구의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 적어도 99.99%, 적어도 99.999%, 또는 실제로 100%는 (a) 재배열된 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 포함하며; (b) 내인성 CD3을 발현하지 않고; (c) 내인성 CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45를 발현하고; 및 (d) 적어도 (i) NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)); (ii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iii) CD69; (iv) 자연 세포독성 수용체; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 내인성 유전자를 발현하고; 변형된 림프구는 추가로 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체; (iii) 인터류킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체; (v) 인터류킨 12(IL-12); (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하고/하거나; (2) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2), 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH), 또는 이의 조합의 기능 상실을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 재배열된 TCR 유전자좌는 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재배열된 내인성 TCR 유전자좌는 2개 이하의 재배열된 대립유전자로 구성된다.
일부 실시형태에서, 자연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b이다.
일부 실시형태에서, 림프구의 시험관내 집단은 외인성 핵산 구축물로부터의 재프로그래밍 인자를 발현하는 세포를 1% 초과, 0.1% 초과, 0.001% 초과, 0.0001% 초과, 0.00001% 초과, 0.000001% 초과, 0.0000001% 초과, 0.00000001% 초과, 0.000000001% 초과, 0.0000000001% 초과, 또는 0.00000000001% 초과로 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 림프구의 시험관내 집단은 외인성 핵산 구축물로부터의 재프로그래밍 인자를 발현하는 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 Oct-4 및/또는 Sox-2이다.
일부 실시형태에서, 림프구의 시험관내 집단은 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 에피솜 발현 구축물을 보유하는 세포를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 림프구의 시험관내 집단에서 각각의 세포는 (1)에 열거된 외인성 핵산 구축물 및 (2)에 열거된 기능 상실의 동일한 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 림프구의 시험관내 집단은 염색체 전위를 보유하는 0.001% 미만, 0.002% 미만, 0.003% 미만, 0.004% 미만, 0.005% 미만, 0.006% 미만, 0.007% 미만, 0.008% 미만, 0.009% 미만, 0.01% 미만, 0.02% 미만, 0.03% 미만, 0.04% 미만, 0.05% 미만, 0.06% 미만, 0.07% 미만, 0.08% 미만, 0.09% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 또는 10% 미만의 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 본 개시내용에 기재된 바와 같은 임의의 변형된 림프구, 임의의 변형된 세포, 임의의 약제학적 조성물, 또는 단리된 시험관내 세포 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 증식성 질병을 갖거나 이로 진단받았다. 일부 실시형태에서, 증식성 질병은 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 결장직장암, 위암, 신세포 암종(RCC), 또는 비-소세포 폐암(NSCLC), 고형 종양, 방광암, 간세포 암종, 전립샘암, 난소암/자궁암, 췌장암, 중피종, 흑색종, 교모세포종, HPV-연관 및/또는 HPV-양성 암, 예컨대 자궁경부암 및 HPV+ 두부경부암, 구강암, 인두암, 갑상샘암, 담낭암, 연조직 육종, 및 혈액암, 예컨대 ALL, CLL, NHL, DLBCL, AML, CML, 다발 골수종(MM)이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 또는 단리된 시험관내 림프구 집단을 생성하는 방법은 (a) 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 수득하는 단계; (b) (1)의 적어도 하나의 외인성 유전자의 발현을 포함하고/하거나 (2)의 적어도 하나의 유전자의 기능 상실을 포함하도록 iPSC, 또는 이의 분화되지 않은 또는 분화된 딸 세포를 변형하는 단계; (c) iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하며, 여기서 조혈 계통 세포는 iPSC에 포함된 편집된 유전적 유전자좌를 보유한다.
일부 실시형태에서, 분화를 유도하는 단계는 (i) iPSC를 BMP 경로 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포를 수득하는 단계; 및 (ii) 중배엽 세포를 BMP 경로 활성화제, bFGF, 및 WNT 경로 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포는 조혈 계통 세포를 제공할 수 있고; 중배엽 세포 및 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포는 배아체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 수득되며; 조혈 계통 세포는 확정적 혈액생성 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프리(pre)-T 세포 전구 세포, 프리-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 B 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 방법은 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 분화를 유도하는 방법은 확정적 HE 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 분화를 유도하는 방법은 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성화제, ROCK 저해제, TPO, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 분화를 유도하는 방법은 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성화제, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 또는 단리된 시험관내 림프구 집단을 생성하는 방법은 단계 c) 전에, 만능 줄기 세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 세포를 접종하고 증식시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 또는 단리된 시험관내 림프구 집단을 생성하는 방법은 조혈 계통 세포에서 재배열된 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 관심 항원에 결합하는 재배열된 TCR 유전자좌에 의해 인코딩되는 TCR에 기반하여 재배열된 TCR 유전자좌를 포함하는 조혈 계통 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 항원은 종양 항원이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 공여체 세포를 만능 상태로 재프로그래밍하는 단계; 공여체 세포 게놈 내 표적 유전자좌를 편집하는 단계; 및 재프로그래밍된 공여체 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 편집하는 단계는 공여체 세포를 만능 상태로 재프로그래밍하는 단계 전에 또는 동안에 수행된다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포는 섬유아세포, 말초혈 세포, 림프구, 또는 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산; (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체를 인코딩하는 핵산; (iii) 인터류킨 15(IL-15)를 인코딩하는 핵산; (iv) IL-15R, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산; (v) 인터류킨 12(IL-12)를 인코딩하는 핵산; (vi) IL-12R, 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G)를 인코딩하는 핵산; (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 포함하는 외인성 핵산; 및 (2) 하기 유전적 유전자좌: (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279); (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH); (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA); (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A); (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자; (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B); (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합 중 하나 이상에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하며, 인델 또는 삽입은 각각의 유전적 유전자좌 또는 유전자좌들에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2 및 CISH에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하며, 인델 또는 삽입은 TGFβR2 및/또는 CISH에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2 및 TIGIT에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2 및/또는 TIGIT에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH 및 TIGIT에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH 및/또는 TIGIT에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TIGIT 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TIGIT 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TIGIT 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TIGIT 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 ADORA2A 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 ADORA2A 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, CISH 및 TIGIT에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, CISH 및/또는 TIGIT에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, CISH 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, CISH 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, CISH 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, CISH 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, TIGIT 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, TIGIT 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, TIGIT 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, TIGIT 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TGFβR2, ADORA2A 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TGFβR2, ADORA2A 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH, TIGIT 및 ADORA2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH, TIGIT 및/또는 ADORA2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH, TIGIT 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH, TIGIT 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 CISH, ADORA2A 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 CISH, ADORA2A 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다. 하나의 실시형태에서, 방법은 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 여기서 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포는 TIGIT, ADORA2A 및 NKG2A에서 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입을 포함하고, 인델 또는 삽입은 TIGIT, ADORA2A 및/또는 NKG2A에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래한다.
일부 실시형태에서, (2)의 외인성 핵산은 (1)의 외인성 핵산이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPS 세포이다. 일부 실시형태에서, 분화시키는 단계는 만능 줄기 세포를 분화 배지 또는 일련의 분화 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다.
도 1a 및 도 1b는 TGFBR2 및 CISH의 강력한 단일 및 이중-유전자 편집이 NK 세포에서 달성되었음을 도시한다. CRISPR-Cpf1을 사용하는 NK 세포에서의 TGFBR2 및 CISH의 단일 및 동시 표적화 둘 모두가 NK 세포에서 80% 초과로 두 표적 모두에서 인/델(in/del)을 생성하였고, 편집된 NK 세포의 90% 초과가 편집-후 72시간째에 생활성이었다.
도 2a 및 도 2b는 3개 고유 공여체 및 5회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 구형체 곡선의 정규화가 정규화되지 않은 데이터에서 관찰된 바와 동일한 유효성 패턴을 유지함을 도시한다. 각각의 단일 녹아웃(SKO) NK 군은 대조군 NK에 비해 SK-OV-3 구형체 크기의 감소에서 유의하게 더 효율적이었고, 이중 녹아웃(DKO) NK 군은 SKO NK 군에 비해 SK-OV-3 구형체 크기의 감소에서 유의하게 더 효율적이었다. 도 2a는 10 ng/㎖ TGF베타로 10:1 E:T에서의 SK-OV-3 구형체 분석(3개 공여체, 5회 독립 실험)을 도시한다. 도 2b는 SEM인 오차 막대를 갖는다. 통계적 유의성은 2원 ANOVA 분석 결과이다. 2원 ANOVA 분석에는 일부 실험에서 누락된 시점으로 인해 104시간 초과의 시점은 제외된다. 혼합 모델 분석은 모든 시점이 고려되는 경우 군 간 동일하거나 개선된 통계적 유의성을 산출한다.
도 3a 및 도 3b는 CISH/TGFBR2 이중 녹아웃 NK 세포가 더 낮은 NK 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서도, SK-OV-3 구형체 검정법에서 단일 녹아웃 NK 세포 또는 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 3a는 3개 고유 공여체 및 5회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 10 ng/㎖ TGF-β를 이용한, 20:1 E:T에서의 SK-OV-3 구형체 분석을 도시한다. 도 3b는 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 10 ng/㎖ TGF-β를 이용한, 10:1 E:T에서의 SK-OV-3 구형체 분석을 도시한다. 모든 조건에서 상이한 E:T 비 간 이러한 약간의 차이는 효과기 세포 표현형이 NK 세포 대 표적 비보다 녹아웃에 의해 유도됨을 제시한다.
도 4a 및 도 4b는 CISH/TGFBR2 이중 녹아웃 NK 세포가 더 낮은 NK 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서도, PC-3 구형체 검정법에서 단일 녹아웃 NK 세포 또는 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 4a는 3개 고유 공여체 및 5회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 10 ng/㎖ TGF-β를 이용한, 20:1 E:T에서의 PC-3 구형체 분석을 도시한다. 도 4b는 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 10 ng/㎖ TGF-β를 이용한, 10:1 E:T에서의 PC-3 구형체 분석을 도시한다. 모든 조건에서 상이한 E:T 비 간 이러한 약간의 차이는 효과기 세포 표현형이 NK 세포 대 표적 비보다 녹아웃에 의해 유도됨을 제시한다.
도 5a 및 도 5b는 CISH/TGFBR2 이중 녹아웃 NK 세포가 임의의 외인성 사이토카인의 부재 하에, SK-OV-3 및 PC-3 구형체 검정법에서 단일 녹아웃 NK 세포 또는 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 5a는 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 임의의 외인성 사이토카인의 부재 하에, 10:1 E:T에서의 SK-OV-3 구형체 분석을 도시한다. 도 5b는 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 임의의 외인성 사이토카인의 부재 하에, 10:1 E:T에서의 PC-3 구형체 분석을 도시한다.
도 6a는 IFN-γ 농도가 구형체 검정법에서 NK 세포 유효성과 관련됨을 도시한다. SK-OV-3 구형체 분석을 10 ng/㎖ TGF-β 및 5 ng/㎖ IL-15로 상이한 E:T에 걸쳐 수행하였다. 5:1 및 10:1 E:T에 대한 분석을 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 수행하였다. 20:1 E:T에 대한 분석을 3개 고유 공여체, 및 5회 독립 실험에 걸쳐 수행하였다.
도 6b는 TNF-α 농도가 구형체 검정법에서 NK 세포 유효성과 관련됨을 도시한다. SK-OV-3 구형체 분석을 10 ng/㎖ TGF-β 및 5 ng/㎖ IL-15로 상이한 E:T에 걸쳐 수행하였다. 5:1 및 10:1 E:T에 대한 분석을 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐 수행하였다. 20:1 E:T에 대한 분석을 3개 고유 공여체, 및 5회 독립 실험에 걸쳐 수행하였다.
도 6c는 CISH/TGFBR2 이중 녹아웃(DKO) NK 세포에서의 마커 발현을 도시한다. 대조군(편집되지 않음) 및 이중 녹아웃 NK 세포를 편집 72시간 후 염색을 위해 수확하였다. NK 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현을 정량하였다. 이중 KO NK 세포는 대조군 NK 세포에 비해 유의하게 더 높은 수준의 활성화 마커 CD25 및 CD69를 발현하였다.
도 6d는 NK 세포의 항-종양 활성이 생체내 모델에서 측정되었음을 도시한다. NSG 마우스는 루시퍼라제로 표지된 500,000개의 SKOV3 종양 세포의 복강내 주사를 제공받았다. 종양 이식-후 7일째에, 1,000만 개의 편집된(CISH/TGFBR2 이중-녹아웃) 또는 편집되지 않은(대조군) NK 세포를 종양-보유 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 부담을 루시페린의 IP 투여 및 IVIS 조영에 의해 매주 모니터링하였다. 2원 ANOVA 분석을 34일차에 수행하여 대조군 및 DKO NK 세포군 간 통계적 유의성을 결정하였다(****, P<0.0001).
도 7a는 2회 독립 실험 및 3개 고유 공여체에 걸쳐, NK 세포에서 달성된 TIGIT의 강력한 단일 유전자 편집을 도시한다.
도 7b는 2회 독립 실험 및 3개 고유 공여체에 걸쳐, NK 세포에서 달성된 NKG2A의 강력한 단일 유전자 편집을 도시한다.
도 7c는 3회 독립 실험 및 3개 고유 공여체에 걸쳐, NK 세포에서 달성된 ADORA2A의 강력한 단일 유전자 편집을 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 상이한 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서, TIGIT 단일 녹아웃 NK 세포가 시험관내 구형체 검정법에서 편집되지 않은 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 8a는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 도 8b는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 1.25:1, 2.5:1. 5:1. 10:1 및 20:1 효과기 대 표적 비에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. NK 세포 첨가 후 100시간째의 적색 물체 세기를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 상이한 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서, NKG2A 단일 녹아웃 NK 세포가 시험관내 구형체 검정법에서 편집되지 않은 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 9a는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 도 9b는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 1.25:1, 2.5:1. 5:1. 10:1 및 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. NK 세포 첨가 후 100시간째의 적색 물체 세기를 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 상이한 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서, ADORA2A 단일 녹아웃 NK 세포가 시험관내 구형체 검정법에서 편집되지 않은 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 10a는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 도 10b는 2개 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐 분석된 바와 같이, 1.25:1, 2.5:1. 5:1. 10:1 및 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. NK 세포 첨가 후 100시간째의 적색 물체 세기를 나타낸다.
도 11은 NK 세포에서 달성된 TGFbR2/CISH/TIGIT의 삼중 유전자 편집을 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 상이한 효과기 세포 대 표적 세포(E:T) 비에서, TGFbR2/CISH/TIGIT 삼중 녹아웃 NK 세포가 시험관내 구형체 검정법에서 편집되지 않은 대조군 NK 세포에 비해 더 우수한 효과기 기능을 실증함을 도시한다. 도 12a는 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 도 12b는 5:1. 10:1 및 20:1 E:T에서의 종양 구형체 분석을 도시한다. NK 세포 첨가 후 100시간째의 적색 물체 세기를 나타낸다.
본 개시내용의 일부 양태는 임상 적용에서 사용될 수 있는 기성 동종이형 세포를 조작하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 일부 양태는 분화된 딸 세포, 예를 들어, 변형된 림프구, 예컨대 iNK 세포를 유도하기 위해 사용될 수 있는 만능 또는 다능성 줄기 세포(예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 조혈 줄기 세포(HSC)를 조작하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다. 이식편-대-숙주 및 숙주-대-이식편 둘 모두의 면역반응성은 동종이형 세포의 임상 적용에 있어서 주요 난제이다. 본 개시내용의 일부 양태는 동종이형 환경에서 변형되지 않은 세포 이식편이 전형적으로 직면하는 면역반응성의 다양한 양태를 해결하는, 세포를 조작하기 위한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다.
본 개시내용의 일부 양태는, 예를 들어, 동종이형 임상 적용을 위해 표적 세포에서 MHC 클래스 I 및 II 기능성을 제거함으로써, "비-자가" 숙주-대-이식편 면역반응성을 극복하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, MHC 클래스 I 및 II 기능성은 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재된 바와 같이, B2M(클래스 I) 및 CIITA(클래스 II) 및/또는 2개 이상의 MHC 클래스 II 알파 및/또는 베타 사슬의 기능-상실을 가져옴으로써 달성된다.
본 개시내용의 일부 양태는, 예를 들어, NK 저해 방식을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 발현 구축물을 동종이형 임상 적용을 위한 표적 세포 내로 도입함으로써, "자가 상실" 숙주-대-이식편 면역반응성을 극복하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 "자가 상실" 면역반응성은 동종이형 임상 적용을 위한 표적 세포에서 HLA-G, HLA-E, 및/또는 CD47의 트랜스제닉 발현을 가져옴으로써 해결된다.
본 개시내용의 일부 양태는 내인성 TCR 기능성을 제거함으로써 이식편-대-숙주 T-세포 수용체(TCR) 동종반응성을 극복하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에서 기재되는 면역조절 변형을 포함하도록 줄기 세포를 조작하는 단계, 이어서 줄기 세포를 이를 필요로 하는 환자에 투여하기 위한 세포 유형, 예를 들어, 림프구, 예컨대 면역치료법을 위한, iNK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 다능성 또는 만능 줄기 세포로부터 동종이형 임상 적용을 위한 변형된 세포의 생성에 유용한 전략, 조성물, 및 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 만능 또는 다능성 줄기 세포는 TCR을 발현하거나 재배열된 TCR 유전자좌를 포함하는 세포로부터, 예를 들어, T-세포로부터 유래되며, 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 조작된 줄기 세포로부터 유래되는 분화된 림프구는 TCR을 발현할 수 있고 TCR 동종반응성의 표적일 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 내인성 TCR 발현 산물의 기능-상실을 가져오는 것이 유리하며, 본 개시내용은, 예를 들어, 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재된 바와 같이 TRAC의 기능-상실을 가져옴으로써, 각각의 세포에서 이러한 기능-상실을 달성하는 데 유용한 전략, 조성물, 및 방법을 제공한다.
본 개시내용의 일부 양태는, 예를 들어, 면역종양학의 맥락에서, 치료제로서 유용한 변형된 NK 세포(또는 다른 림프구)의 생성에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포의 적어도 일부는 변형되지 않은 NK 세포에 비해 증강된 NK 세포 반응 특징, 예를 들어, 증강된 표적 인식, 증강된 NK 세포 반응 수준 및/또는 기간, 개선된 NK 세포 생존, 지연된 NK 세포 고갈, 증강된 표적 인식, 및/또는 변형되지 않은 NK 세포에 의해 전형적으로 인식되지 않는 표적의 인식을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 양태는 변형된 NK 세포의 생성을 위한 조성물, 방법, 및 전략을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형된 NK 세포는 성숙 NK 세포의 게놈을 편집함으로써생성된다. 일부 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 NK 세포가 시험관내 또는 생체내 유래되는 세포의 게놈을 편집함으로써 생성된다. 일부 실시형태에서, NK 세포가 유래되는 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포(HSC), 또는 만능 줄기 세포, 예컨대, 배아 줄기 세포(ES 세포) 또는 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 ES 세포, iPS 세포, 또는 조혈 줄기 세포의 게놈을 편집하고, 이어서 편집된 줄기 세포를 NK 세포로 분화시킴으로써 생성된다. 변형된 NK 세포의 생성에 iPS 세포로부터의 변형된 NK 세포의 분화가 관여되는 일부 실시형태에서, 게놈의 편집은 iPS 세포의 생성, 유지, 또는 분화 동안 임의의 적합한 시간에 일어날 수 있다. 예를 들어, 공여체 세포가 iPS 세포로 재프로그래밍되는 경우, 공여체 세포, 예를 들어, 체세포, 예컨대, 섬유아세포 또는 T 림프구는 iPS 세포로의 재프로그래밍 전에, 재프로그래밍 절차 동안, 또는 공여체 세포가 iPS 세포로 재프로그래밍된 후에 본원에서 기재되는 유전자 편집 접근을 거칠 수 있다.
iPS 세포로부터 유래되는 NK 세포는 본원에서 iNK 세포로도 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 체세포로도 지칭되는 발달상 성숙 세포, 예컨대, 섬유아세포 또는 말초혈 세포로부터 유래된 iNK 세포를 생성하기 위한 조성물, 방법, 및 전략을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 발달상 성숙 T 세포(가슴샘 선택을 거친 T 세포)로부터 유래된 iNK 세포를 생성하기 위한 조성물, 방법, 및 전략을 제공한다. 발달상 성숙 T 세포의 하나의 특질은 재배열된 T 세포 수용체 유전자좌이다. T 세포 성숙 동안, TCR 유전자좌는 V(D)J 재배열을 거쳐 전체 V-도메인 엑손을 생성한다. 이들 재배열은 T 세포의 유도된 만능 줄기(iPS) 세포로의 재프로그래밍에 걸쳐, 그리고 생성된 iPS 세포의 체세포로의 분화에 걸쳐 보유된다.
iPS 세포의 생성을 위해 T 세포를 사용하는 것의 하나의 장점은 T 세포가 상대적으로 용이하게, 예를 들어, CRISPR-기반 방법 또는 다른 유전자-편집 방법에 의해 편집될 수 있다는 것이다.
iPS 세포의 생성을 위해 T 세포를 사용하는 것의 또 다른 장점은 재배열된 TCR 유전자좌가 개별 세포 및 이의 딸 세포의 유전적 추적을 허용한다는 것이다. 재프로그래밍, 증식, 배양, 및/또는 분화 전략이 단일 세포의 클론 증식인 NK 세포의 생성에 관여되는 경우, 재배열된 TCR 유전자좌는 유전 마커로 사용되어 세포 및 그 딸 세포를 분명하게 확인할 수 있다. 이는, 결국, 세포 집단의 실제 클론성으로의 특성규명, 또는 혼합된 집단, 또는 클론성 집단 내 오염 세포의 확인을 허용한다.
다수의 편집물을 운반하는 iNK 세포의 생성에서 T 세포를 사용하는 것의 세 번째 장점은 염색체 전위와 연관된 소정 핵형 이상이 T 세포 배양에 대해 선택된다는 것이다. 이러한 이상은 CRISPR 기술에 의해 세포를 편집하는 경우, 그리고 특히 다수의 편집물을 운반하는 세포를 생성하는 경우 우려를 낳는다.
치료 림프구의 유도를 위한 시작점으로서 T 세포-유래된 iPS 세포로부터 를 사용하는 것의 네 번째 장점은, 예를 들어, 특정 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 결합 활성에 대한 T 세포 선택, 선택된 T 세포의 iPS 세포로의 재프로그래밍, 이어서 TCR을 발현하는 이들 iPS 세포(예를 들어, T 세포)로부터의 림프구 유도를 통해, 림프구에서 사전-스크리닝된 TCR의 발현을 허용한다는 것이다. 상기 전략은 또한, 예를 들어, 유전적 또는 후성적 전략에 의해, 다른 세포 유형에서 TCR의 활성화를 허용할 것이다.
iNK 분화를 위한 시작점으로서 T 세포-유래된 iPS 세포를 사용하는 것의 다섯 번째 장점은 T 세포가 재프로그래밍 공정에 걸쳐 이의 "후성적 기억"의 적어도 일부를 보유하고, 이에 따라, 동일하거나 밀접하게 관련된 세포 유형, 예컨대 iNK 세포의 후속 분화가 iNK 유도를 위한 시작점으로서, 관련되지 않은 세포, 예컨대 섬유아세포를 사용하는 접근에 비해 보다 효율적일 것이고/것이거나 더 고품질 세포 집단을 초래할 것이라는 점이다.
정의 및 약어
다르게 명시되지 않는 한, 하기 용어는 각각 본 섹션에 나타낸 의미를 가진다.
부정 관사("a" 및 "an")는 연관된 명사 중 적어도 하나를 지칭하고, 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상의"와 통용된다.
접속사 "또는" 및 "및/또는"은 비-배타적 괴리(disjunction)로서 통용된다.
"대상체"는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다. 인간 대상체는 임의의 연령(예를 들어, 영아, 어린이, 청년, 또는 성인)일 수 있거나, 질병을 앓을 수 있거나, 유전자 또는 특정 유전자 조합의 변경을 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 대상체는 동물일 수 있고, 이 용어는 비제한적으로 포유류, 보다 구체적으로 비-인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 등), 토끼, 기니 피그, 개, 고양이 등을 포함한다. 본 개시내용의 소정의 실시형태에서, 대상체는 가축, 예를 들어, 소, 말, 양, 또는 염소이다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 가금이다.
용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 본원에서 기재되는 바와 같은 질병 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 그 시작을 지연하거나, 그 진행을 저해하고/하거나, 재발을 예방하거나 지연하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 기재되는 바와 같은 변형된 NK 세포 또는 변형된 NK 세포 집단 형태의 치료는 하나 이상의 증상이 발생한 후에 및/또는 질병이 진단된 후에 대상체에 투여될 수 있다. 치료는 증상의 부재 하에, 예를 들어, 질병의 증상을 예방하거나 지연하거나 그 시작 또는 진행을 저해하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 시작 전에 취약한 개체에 투여될 수 있다(에를 들어, 유전적 또는 다른 취약 인자의 견지에서). 치료는, 예를 들어 이의 재발을 예방하거나 지연하기 위해 증상이 해소된 후에도 계속될 수 있다.
"예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 (a) 질병을 피하거나 배제하는 것; (b) 질병을 향한 소인에 영향을 주는 것; 또는 (c) 질병의 적어도 하나의 증상의 시작을 예방하거나 지연하는 것을 포함하여, 포유류, 예를 들어 인간에서 질병의 예방을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 DNA 및 RNA 내의 일련의 뉴클레오타이드 염기("뉴클레오타이드"라고도 함)를 지칭하고, 2개 이상의 뉴클레오타이드의 임의의 사슬을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 서열, 핵산 등은 단일-가닥 또는 이중-가닥인 키메라 혼합물 또는 이의 유도체 또는 변형된 버전일 수 있다. 이들은 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 포스페이트 백본에서 예를 들어 분자의 안정성, 이의 혼성화 매개변수 등을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로, 비제한적으로 단백질 및 효소를 만들기 위해 세포성 머시너리(machinery)에 의해 사용되는 정보를 포함하여 유전자 정보를 운반한다. 이들 용어는 이중- 또는 단일-가닥 게놈 DNA, RNA, 임의의 합성 및 유전자 조작된 폴리뉴클레오타이드, 및 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드 둘 모두를 포함한다. 이들 용어는 또한, 변형된 염기를 함유하는 핵산을 포함한다.
종래의 IUPAC 표기법은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 본원에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 사용된다(본원에 참조로 포함된 문헌[Cornish-Bowden A, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; 13(9):3021-30] 참고). 그러나, "T"는 서열이 DNA 또는 RNA에 의해 인코딩될 수 있는 경우에서, 예를 들어 gRNA 표적화 도메인에서 "티민 또는 우라실"을 나타냄을 주지해야 한다.
[표 1]
IUPAC 핵산 표기
Figure pct00001
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는, 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 사슬을 지칭하는 데 통용된다. 이러한 용어는 개별 단백질, 함께 연관되는 단백질의 그룹 또는 복합체, 뿐만 아니라 이러한 단백질의 단편 또는 부분, 변이체, 유도체 및 유사체를 포함한다. 펩타이드 서열은 종래의 표기법을 사용하여, 좌측에서 아미노 또는 N-말단으로 시작하고 우측에서 카르복실 또는 C-말단까지 진행되어 본원에 제시된다. 표준 1-글자 또는 3-글자 약어가 사용될 수 있다.
용어 "변이체"는 참조 엔터티(entity)와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 엔터티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에 있어서 참조 엔터티와 구조적으로 상이한 엔터티, 예컨대 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 소분자를 지칭한다. 여러 실시형태에서, 변이체는 이의 참조 엔터티와 기능적으로도 상이하다. 일반적으로, 특정 엔터티가 참조 엔터티의 "변이체"로 적절히 고려되는지 여부는 참조 엔터티와의 구조적 동일성 정도에 기반한다.
핵산(예를 들어, 유전자, 단백질-인코딩 게놈 영역, 프로모터)의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "내인성"은 그 자연적 위치에, 예를 들어 세포의 게놈 내에 있는 네이티브(native) 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 대조적으로, 핵산, 예를 들어, 발현 구축물, cDNA, 인델, 및 핵산 벡터의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "외인성"은, 예를 들어, 유전자-편집 또는 유전 조작 기법, 예를 들어 CRISPR-기반 편집 기법을 사용하여 세포의 게놈 내로 인공적으로 도입된 핵산을 지칭한다.
용어 "RNA-가이드 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드 뉴클레아제 분자"는 본원에서 통용된다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제이다. RNA-가이드 뉴클레아제의 비제한적 예를 아래의 표 2에 열거하며, 본원에서 개시되는 방법 및 조성물은 본원에서 개시되거나 당업자에게 공지된 RNA-가이드 뉴클레아제의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 맥락에서 사용하기 적합한 추가 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체를 인지할 것이며, 본 개시내용이 이에 관해 제한되지 않음이 이해될 것이다.
[표 2]
RNA-가이드 뉴클레아제
Figure pct00002
추가적인 적합한 RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 및 Cas12 뉴클레아제는 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용은 본원에서 제공되는 예시적인 적합한 뉴클레아제에 의해 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 적합한 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1(Cas12a) 뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 뉴클레아제 변이체, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제 변이체를 포함한다. 뉴클레아제 변이체는 뉴클레아제의 야생형 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하는 뉴클레아제를 지칭한다. 적합한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체는 또한 정제 태그(예를 들어 폴리히스티딘 태그) 및, 예를 들어, 핵 편재 신호 서열을 포함하거나 이로 구성되는 신호전달 펩타이드를 포함할 수 있다. 적합한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체의 일부 비제한적 예가 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재되며, 또한 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, 2019년 3월 14일에 출원되고 "Systems and Methods for the Treatment of Hemoglobinopathies"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2019/22374에 기재된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 애시드아미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1 변이체(AsCpf1 변이체)이다. 적합한 AsCpf1 변이체를 포함하는 적합한 Cpf1 뉴클레아제 변이체는 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 공지되거나 명백할 것이며, 비제한적으로 본원에서 개시되거나 달리 당업계에 공지된 Cpf1 변이체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 애시드아미노코커스 종 Cpf1 RR 변이체(AsCpf1-RR)이다. 또 다른 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cpf1 RVR 변이체이다. 예를 들어, 적합한 Cpf1 변이체는 M537R 치환, H800A 치환, 및/또는 F870L 치환, 또는 이의 임의의 조합을 갖는 것들을 포함한다(넘버링 체계는 AsCpf1 야생형 서열을 따름).
본원에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 세포", 또는 "확정적 조혈 줄기 세포"는 T 세포, 자연 살해 세포 및 B 세포를 포함하는 성숙 골수 및 림프 세포 유형 둘 모두를 생성할 수 있는 CD34+ 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 잠재력 증가" 또는 "발달 잠재력 증가"는 세포의 잠재력을 증가시키거나 세포를 덜 분화된 상태로 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 잠재력을 갖는 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포에 비해 더 큰 발달 가소성을 갖는다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화될 수 있다). 다시 말하면, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포에 비해 덜 분화된 상태에 있는 것이다. 일부 실시형태에서, 용어 "재프로그래밍"은 체세포 또는 다능성 줄기 세포의, 유도된 만능 줄기 세포 또는 iPS 세포로도 지칭되는 만능 줄기 세포로의 탈분화를 지칭한다. 체세포 또는 다능성 줄기 세포로부터 iPS 세포의 생성에 적합한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "분화"는 특화되지 않은("수임되지 않은") 또는 덜 특화된 세포가 특화된 세포, 예컨대, 혈액 세포 또는 근육 세포의 특징을 획득하는 공정이다. 분화된 또는 분화-유도 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된("수임된") 위치를 취한 것이다. 예를 들어, iPS 세포는 세포 배양 배지 중 적합한 분화 인자로의 처리 시, 다양한 보다 분화된 세포 유형, 예를 들어, 신경 또는 조혈 줄기 세포, 림프구, 심근세포, 및 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다. 만능 및 다능성 세포 유형의 보다 분화된 세포 유형으로의 분화에 적합한 방법, 분화 인자, 및 세포 배양 배지는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 용어 "수임된"은, 분화 공정에 적용되는 경우, 분화 경로에서, 정상 상황 하에, 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화될 것이며, 정상 상황 하에, 상이한 세포 유형으로 분화되거나 덜 분화된 세포 유형으로 복귀할 수 없는 지점까지 진행된 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "분화 마커", "분화 마커 유전자" 또는 "분화 유전자"는 그 발현이 세포, 예컨대 만능 세포 내에서 일어나는 세포 분화를 시사하는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 분화 마커 유전자는 비제한적으로 하기 유전자를 포함한다: CD34, CD4, CD8, CD3, CD56(NCAM), CD49, CD45; NK 세포 수용체(분화 클러스터 16(CD16)), 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D), CD69, NKp30, NKp44, NKp46, CD158b, FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GAT A3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(Brachyury), ZIC1, GATA1, GATA2, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, PAX5, RBPJ, RUNX1, STAT1 및 STAT3.
본원에서 사용되는 용어 "분화 마커 유전자 프로필", 또는 "분화 유전자 프로필", "분화 유전자 발현 프로필", "분화 유전자 발현 특징부", "분화 유전자 발현 패널", "분화 유전자 패널", 또는 "분화 유전자 특징부"는 복수의 분화 마커 유전자의 발현 또는 발현 수준을 지칭한다.
세포 발달 잠재력의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "잠재력" 또는 "발달 잠재력"은 세포에 접근 가능한 모든 발달 옵션의 합(즉, 발달 잠재력)을 지칭한다. 세포 잠재력의 연속체는 비제한적으로 전능(totipotent) 세포, 만능(pluripotent) 세포, 다능성(multipotent) 세포, 올리고능(oligopotent) 세포, 단일능(unipotent) 세포, 및 말단 분화된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "만능"은 세포가 신체 또는 몸체(즉, 고유배)의 모든 계통을 형성하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기 세포는 각각의 3 배엽층인 외배엽, 중배엽, 및 내배엽으로부터 세포를 형성할 수 있는 유형의 만능 줄기 세포이다. 만능성(pluripotency)은 전체 유기체를 생성할 수 없는 불완전한 또는 부분적 만능 세포(예를 들어, 배아덩이위판 줄기 세포 또는 EpiSC)로부터 전체 유기체를 생성할 수 있는 보다 원시적인, 보다 만능인 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포)까지의 범위의 발달 잠재력의 연속체이다.
본원에서 사용되는 용어 "유도된 만능 줄기 세포" 또는 iPS 세포는 모든 3 배엽층 또는 피부층: 중배엽, 내배엽, 및 외배엽의 조직으로 분화될 수 있는 세포로의 재프로그래밍으로 지칭되는 공정에 의한 분화된 신체, 예를 들어, 성체, 신생아, 또는 태아 세포로부터 수득된 줄기 세포를 지칭한다. IPS 세포는 자연에서 확인되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기 세포"는 배아 주머니배의 내세포괴로부터 유래되는 만능 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 만능이며 발달 동안 3 원시 배엽층: 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 모든 유도체를 생성한다. 이들은 배아외 막 또는 태반에는 기여하지 않는다, 즉 전능이 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성 줄기 세포"는 모든 3개 배엽층의 세포로는 아니지만, 하나 이상의 배엽층(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화될 발달 잠재력을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"라고도 할 수 있다. 다능성 세포는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다능성 세포의 예는 성체 줄기 세포, 예컨대, 조혈 줄기 세포 및 신경 줄기 세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 주어진 계통에서 여러 유형의 세포를 형성할 수 있지만, 다른 계통의 세포는 형성할 수 없음을 시사한다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 여러 상이한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)는 형성할 수 있지만, 신경은 형성할 수 없다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능 및 만능보다 적은 정도의 발달 잠재력을 갖는 세포의 상태를 지칭한다.
만능성은 부분적으로, 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은 비제한적으로 (i) 만능 줄기 세포 형태; (ii) 제한되지 않는 자가-재생 잠재력; (iii) 비제한적으로 SSEA1(마우스만), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하는 만능 줄기 세포 마커의 발현; (iv) 모든 3 신체 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화되는 능력; (v) 3 신체 계통으로 구성되는 기형종 형성; 및 (vi) 3 신체 계통으로부터의 세포로 구성되는 배아체의 형성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "만능 줄기 세포 형태"는 배아 줄기 세포의 전통적인 형태적 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기 세포 형태는 형태가 둥글고 작은 것을 특징으로 하며, 높은 핵-대-세포질 비, 뚜렷한 인의 존재, 및 전형적인 세포간 간격을 갖는다.
게놈 편집 시스템
본 개시내용은 변형된 NK 세포, 예를 들어, 그 게놈이 변형되었거나, 다능성 또는 만능 줄기 세포, 예를 들어, HSC, ES 세포, 또는 iPS 세포로부터 유래되고, 그 게놈이 변형된, NK 세포의 생성에 관한 것이다. 본원에서 제공되는 NK 세포 및 줄기 세포는, 예를 들어, 게놈 편집 시스템, 예를 들어, CRISPR을 사용하는 것을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 유전자-편집 기술을 사용하여 변형될 수 있다.
용어 "게놈 편집 시스템"은 RNA-가이드 DNA 편집 활성을 갖는 임의의 시스템을 지칭한다. 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 자연 생성 CRISPR 시스템으로부터 적응된 적어도 2개의 구성성분: 가이드 RNA(gRNA) 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함한다. 이들 2개의 구성성분은, 예를 들어 단일-가닥 절단부(SSB 또는 틈새), 이중-가닥 절단부(DSB) 및/또는 점 돌연변이 중 하나 이상을 만듦으로써 특이적인 핵산 서열과 연관되고 해당 핵산 서열에서 또는 그 주변에서 DNA를 편집할 수 있는 복합체를 형성한다.
자연 생성 CRISPR 시스템은 2개의 클래스 및 5개의 유형으로 진화적으로 구조화되고(본원에 참조로 포함된 문헌[Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2011 Jun; 9(6): 467-477](Makarova)), 본 개시내용의 게놈 편집 시스템이 임의의 유형 또는 클래스의 자연 생성 CRISPR 시스템의 구성성분을 적응시킬 수 있는 한편, 본원에 제시된 실시형태는 일반적으로, 클래스 2, 및 유형 II 또는 V CRISPR 시스템으로부터 적응된다. 유형 II 및 V를 포괄하는 클래스 2 시스템은 상대적으로 큰 다중도메인 RNA-가이드 뉴클레아제 단백질(예를 들어 Cas9 또는 Cpf1) 및 하나 이상의 가이드 RNA(예를 들어 crRNA 및 선택적으로 tracrRNA)를 특징으로 하며, 이는 crRNA의 표적화(또는 스페이서) 서열에 상보성인 특이적인 유전자좌와 연관되고(즉 표적화하고) 절단하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다. 본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템은 세포성 DNA 서열을 유사하게 표적화하고 편집하지만, 자연상에서 생성하는 CRISPR 시스템으로부터 유의하게 상이하다. 예를 들어, 본원에 기재된 단분자 가이드 RNA는 자연상에서 생성하지 않고, 본 개시내용에 따른 가이드 RNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제 둘 모두는 임의의 수의 비-자연 생성 변형을 혼입할 수 있다.
게놈 편집 시스템은 여러 가지 방식으로 실시될 수 있고(예를 들어 세포 또는 대상체에 투여되거나 전달될 수 있고), 상이한 실시는 별개의 적용에 적합할 수 있다. 예를 들어 소정의 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 단백질/RNA 복합체(리보뉴클레오단백질, 또는 RNP)로서 실시되며, 이러한 복합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 캡슐화제, 예컨대 지질 또는 중합체 미세- 또는 나노-입자, 미쉘, 리포좀 등을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 하나 이상의 RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 및 상기 기재된 가이드 RNA 구성성분(선택적으로 하나 이상의 추가의 구성성분과 함께)으로서 실시되며; 소정의 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예를 들어 아데노-연관 바이러스와 같은 바이러스 벡터로서 실시되고; 소정의 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 이들 중 임의의 것의 조합으로서 실시된다. 본원에 제시된 원리에 따라 작동하는 추가의 또는 변형된 실시는 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 단일 특이적 뉴클레오타이드 서열로 표적화될 수 있거나, 2개 이상의 가이드 RNA의 사용을 통해 2개 이상의 특이적 뉴클레오타이드 서열로 표적화되고 - 동시에 편집할 수 있음을 주지해야 한다. 다수의 gRNA의 사용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 "멀티플렉싱(multiplexing)"으로 지칭되고, 다수의 관련없는 관심 표적 서열을 표적화하거나 단일 표적 도메인 내에서 다수의 SSB 또는 DSB를 형성하고 일부 경우 이러한 표적 도메인 내에서 특이적인 편집물을 생성하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 Maeder 등(Maeder)에 의한 국제 특허 공개 WO 2015/138510은, 크립틱(cryptic) 스플라이스 부위의 생성을 초래하는 인간 CEP290 유전자에서의 점 돌연변이(C.2991+1655A -> G)를 교정하기 위한 게놈 편집 시스템을 기재하고 있으며, 이는 결국 이러한 유전자의 기능을 감소시키거나 없앤다. Maeder의 게놈 편집 시스템은 점 돌연변이의 어느 한쪽 면 상에 있는(즉, 측면에 있는) 서열로 표적화된 2개의 가이드 RNA를 이용하고, 이러한 돌연변이의 측면에서 DSB를 형성한다. 이는 결국, 돌연변이를 포함하여 개재(intervening) 서열의 결실을 촉진함으로써, 크립틱 스플라이스 부위를 없애고 정상적인 유전자 기능을 복구시킨다.
또 다른 예로서, 본원에 참조로 포함된 Cotta-Ramusino 등("Cotta-Ramusino")에 의한 WO 2016/073990은 "이중-닉카제(nickase) 시스템"이라고 하는 배열인 Cas9 닉카제(스트렙토코쿠스 피오게네스(s. pyogenes) D10A와 같은 단일 가닥 틈새를 만드는 Cas9)와 조합된 2개의 gRNA를 이용하는 게놈 편집 시스템을 기재하고 있다. Cotta-Ramusino의 이중-닉카제 시스템은 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 상쇄(offset)되는 관심 서열의 반대 가닥 상에 2개의 틈새를 만들도록 배치되고, 이러한 틈새들은 조합되어, 오버행(overhang)(Cotta-Ramusino의 경우 5'이긴 하지만, 3' 오버행도 가능함)을 갖는 이중 가닥 절단부를 생성한다. 오버행은 결국 일부 상황에서 상동성 직접 수선 사건(event)을 용이하게 할 수 있다. 또한 또 다른 예로서, Palestrant 등의 WO 2015/070083(본원에 참조로 포함된 "Palestrant")은 Cas9를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 표적화된 gRNA("지배 RNA"로 지칭됨)를 기재하고 있으며, 이는 Cas9의 일시적 발현을 허용하기 위해 하나 이상의 추가의 gRNA를 포함하는 게놈 편집 시스템에 포함될 수 있고, 그렇지 않다면 Cas9는 예를 들어 일부 바이러스 형질도입된 세포에서 구성적으로 발현될 것이다. 이들 멀티플렉싱 적용은 제한적이기보다는 예시적이고자 하고, 당업자는, 멀티플렉싱의 다른 적용이 일반적으로 본원에 기재된 게놈 편집 시스템과 상용성임을 이해할 것이다.
게놈 편집 시스템은 일부 경우, NHEJ 또는 HDR과 같은 세포성 DNA 이중-가닥 절단부 기전에 의해 수선되는 이중 가닥 절단부를 형성할 수 있다. 이들 기전은 문헌 전반에 걸쳐, 예를 들어 문헌[Davis & Maizels, PNAS, 111(10):E924-932, March 11, 2014](Davis)(Alt-HDR을 기재하고 있음); 문헌[Frit et al. DNA Repair 17(2014) 81-97](Frit)(Alt-NHEJ를 기재하고 있음); 및 문헌[Iyama and Wilson III, DNA Repair(Amst.) 2013-Aug; 12(8): 620-636](Iyama)(일반적으로 정준 HDR 및 NHEJ 경로를 기재하고 있음)에 의해 기재되어 있다.
게놈 편집 시스템이 DSB를 형성함으로써 작동되는 경우, 이러한 시스템은 선택적으로, 특정한 방식의 이중-가닥 절단부 수선 또는 특정한 수선 결과물을 촉진하거나 용이하게 하는 하나 이상의 구성성분을 포함한다. 예를 들어, Cotta-Ramusino가 또한, 게놈 편집 시스템을 기재하고 있는데, 이러한 시스템에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 "공여체 주형"이 첨가되며; 공여체 주형은, 게놈 편집 시스템에 의해 절단되는 세포성 DNA의 표적 영역 내로 혼입되고, 표적 서열에서 변화를 초래할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 게놈 편집 시스템은 단일-가닥 또는 이중-가닥 절단부를 유발하지 않으면서, 표적 서열을 변형하거나 표적 서열 내에서 또는 그 부근에서 유전자의 발현을 변형한다. 예를 들어, 게놈 편집 시스템은, DNA 상에 작동하는 기능적 도메인에 융합된 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함하여, 이로써 표적 서열 또는 이의 발현을 변형할 수 있다. 일례로, RNA-가이드 뉴클레아제는 시티딘 데아미나제 기능적 도메인에 연결(예를 들어 융합)될 수 있고, 표적화된 C-투(to)-A 치환을 생성함으로써 작동할 수 있다. 예시적인 뉴클레아제/데아미나제 융합은 참조로 포함된 문헌[Komor et al. Nature 533, 420-424 (19 May 2016)]("Komor")에 기재되어 있다. 대안적으로, 게놈 편집 시스템은 절단-불활성화된(즉 "데드(dead)") 뉴클레아제, 예컨대 데드 Cas9(dCas9)를 이용할 수 있고, 세포성 DNA의 하나 이상의 표적화된 영역 상에서 안정한 복합체를 형성하여 이로써 비제한적으로 mRNA 전사, 염색질 재건(remodeling) 등을 포함하여 표적화된 영역(들)을 수반하는 기능을 간섭함으로써 작동할 수 있다.
가이드 RNA(gRNA) 분자
용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 세포 내에서 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열로의 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제의 특이적인 연관(또는 "표적화")을 촉진하는 임의의 핵산을 지칭한다. gRNA는 단분자(단일 RNA를 포함하고 대안적으로 키메라로서 지칭됨), 또는 모듈식(통상 예를 들어 듀플렉싱(duplexing)에 의해 서로 연관되는 1개 초과, 전형적으로 2개의 별개의 RNA 분자, 예컨대 crRNA 및 tracrRNA를 포함함)일 수 있다. gRNA 및 이들의 구성성분 파트(part)는 예를 들어 Briner 등(참조로 포함된 문헌[Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014](Briner)) 및 Cotta-Ramusino에서 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
박테리아 및 고세균에서, 유형 II CRISPR 시스템은 일반적으로, Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제 단백질, 외래 서열에 상보성인 5' 영역을 포함하는 CRISPR RNA(crRNA), 및 crRNA의 3' 영역에 상보적이고 이와 듀플렉스(duplex)를 형성하는 5' 영역을 포함하는 trans-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 듀플렉스는 Cas9/gRNA 복합체의 형성을 용이하게 하고, 이의 활성에 필요한 것으로 생각된다. 유형 II CRISPR 시스템은 유전자 편집에 사용하도록 적응되었기 때문에, crRNA 및 tracrRNA는, 하나의 비제한적인 예에서, crRNA(이의 3' 말단에서) 및 tracrRNA(이의 5' 말단에서)의 상보성인 영역을 가교하는 4개 뉴클레오타이드(예를 들어 GAAA) "테트라루프" 또는 "링커" 서열에 의해 단일 단분자 또는 키메라 가이드 RNA 내로 접합될 수 있을 것으로 발견되었다(문헌[Mali et al. Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823-826("Mali"); Jiang et al. Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3): 233-239("Jiang"); 및 Jinek et al., 2012 Science Aug. 17; 337(6096): 816-821("Jinek")], 이들 모두는 본원에 참조로 포함됨).
단분자이든지 모듈식이든지 간에 가이드 RNA는, 편집이 요망되는 세포의 게놈 내의 DNA 서열과 같은 표적 서열 내의 표적 도메인에 전체적으로 또는 부분적으로 상보성인 "표적화 도메인"을 포함한다. 표적화 도메인은 비제한적으로 "가이드 서열"(본원에 참조로 포함된 문헌[Hsu et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9): 827-832("Hsu")]), "상보성 영역"(Cotta-Ramusino), "스페이서"(Briner) 및 일반적으로 "crRNA"(Jiang)를 포함하여 문헌에서 다양한 명칭으로 지칭된다. 표적화 도메인에 주어지는 명칭과는 상관 없이, 이들 도메인은 전형적으로 10개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이고, 소정의 실시형태에서 16개 내지 24개 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개 뉴클레오타이드 길이)이고, Cas9 gRNA의 경우 5' 말단에 또는 그 부근에, 그리고 Cpf1 gRNA의 경우 3' 말단에 또는 그 부근에 위치한다.
표적화 도메인 외에도, gRNA는 전형적으로(그러나 예를 들어 하기 고찰된 바와 같이 필수적으로는 아니게), gRNA/Cas9 복합체의 형성 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 복수의 도메인을 포함한다. 예를 들어 상기 언급된 바와 같이, gRNA의 제1 및 제2 상보성 도메인에 의해 형성된 듀플렉싱된 구조(반복부:안티-반복부 듀플렉스로도 지칭됨)는 Cas9의 인지(REC) 로브(lobe)와 상호작용하고, Cas9/gRNA 복합체의 형성을 매개할 수 있다(문헌[Nishimasu et al., Cell 156, 935-949, February 27, 2014(Nishimasu 2014)] 및 [Nishimasu et al., Cell 162, 1113-1126, August 27, 2015(Nishimasu 2015)], 둘 모두는 본원에 참조로 포함됨). 제1 및/또는 제2 상보성 도메인은 하나 이상의 폴리-A 트랙을 함유할 수 있으며, 이러한 트랙은 종결 신호로서 RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 제1 및 제2 상보성 도메인의 서열은 선택적으로, 예를 들어 Briner에 기재된 바와 같이 A-G 스왑(swap), 또는 A-U 스왑의 사용을 통해 이들 트랙을 없애고 gRNA의 완전한 시험관내 전사를 촉진하도록 변형된다. 제1 및 제2 상보성 도메인에 대한 이들 및 다른 유사한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
제1 및 제2 상보성 도메인과 함께, Cas9 gRNA는 전형적으로, 필수적으로 시험관내에서는 아니지만 생체내에서 뉴클레아제 활성에 관여하는 2개 이상의 추가의 듀플렉싱된 영역을 포함한다(Nishimasu 2015). 제2 상보성 도메인의 3' 부분 부근의 제1 스템-루프 영역은 "근위부(proximal) 도메인"(Cotta-Ramusino), "스템 루프 1"(Nishimasu 2014 및 2015) 및 "넥서스(nexus)"(Briner)로서 다양하게 지칭된다. 하나 이상의 추가의 스템 루프 구조는 일반적으로, gRNA의 3' 말단 부근에 존재하고, 이때 그 수는 종에 따라 다양하다: 스트렙토코쿠스 피오게네스 gRNA는 전형적으로 2개의 3' 스템 루프(반복부:안티-반복부 듀플렉스를 포함하여 총 4개 스템 루프 구조에 대해)를 포함하는 한편, 스태필로코쿠스 아우레우스 및 다른 종들은 단지 1개만 갖는다(총 3개의 스템 루프 구조에 대해). 종에 의해 구조화된 보존된 스템 루프 구조(및 보다 일반적으로 gRNA 구조)의 설명은 Briner에 제공된다.
상기 설명이 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA에 초점을 맞추고 있는 한편, 이러한 관점에서 기재된 것과 일부 방식에서 상이한 gRNA를 이용하는 다른 RNA-가이드 뉴클레아제가 발견되었거나 발명되었음(또는 향후 그럴 수 있음)을 이해해야 한다. 예를 들어, Cpf1("프레보텔라(Prevotella) 및 프란치스셀라(Franciscella) 1로부터의 CRISPR")은 작용하는 데 tracrRNA가 필요 없는, 최근에 발견된 RNA-가이드 뉴클레아제이다(본원에 참조로 포함된 문헌[Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015(Zetsche I)]). Cpf1 게놈 편집 시스템에 사용하기 위한 gRNA는 일반적으로, 표적화 도메인 및 상보성 도메인(대안적으로 "핸들(handle)"로서 지칭됨)을 포함한다. Cpf1과 함께 사용하기 위한 gRNA에서, 표적화 도메인은 통상, Cas9 gRNA와 연관하여 상기 기재된 바와 같이 5' 말단보다는 3' 말단에 또는 그 부근에 존재함(핸들은 Cpf1 gRNA의 5' 말단에 또는 그 부근에 존재함)을 주지해야 한다.
당업자는, 상이한 원핵 종으로부터의 gRNA 사이에 또는 Cpf1 gRNA와 Cas9 gRNA 사이에 구조적 차이가 존재할 수 있더라도, gRNA가 작동하는 원리는 일반적으로 일관됨을 이해할 것이다. 작동의 이러한 일관성때문에, gRNA는 광범위한 의미에서 이들의 표적화 도메인 서열에 의해 정의될 수 있고, 당업자는 주어진 표적화 도메인 서열이, 단분자 또는 키메라 gRNA, 또는 하나 이상의 화학적 변형 및/또는 순차적 변형(치환, 추가의 뉴클레오타이드, 절단 등)을 포함하는 gRNA를 포함하여 임의의 적합한 gRNA 내에 혼입될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시내용에서 제시의 경제성을 위해, gRNA는 이들의 표적화 도메인 서열의 측면에서만 기재될 수 있다.
보다 일반적으로 당업자는, 본 개시내용의 일부 양태가 다수의 RNA-가이드 뉴클레아제에서 실시될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유에서 다르게 명시되지 않는 한, 용어 gRNA는, 특정 종의 Cas9 또는 Cpf1과 상용성인 gRNA뿐만 아니라 임의의 RNA-가이드 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있는 임의의 적합한 gRNA를 포괄하는 것으로 이해해야 한다. 예시로서 소정의 실시형태에서, 용어 gRNA는 클래스 2 CRISPR 시스템, 예컨대 유형 II 또는 유형 V 또는 CRISPR 시스템에서 생성하는 임의의 RNA-가이드 뉴클레아제, 또는 이로부터 유래되거나 적응된 RNA-가이드 뉴클레아제와 함께 사용하기 위한 gRNA를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사용되는 가이드 RNA는 표준 gRNA 스캐폴드 대비 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, gRNA의 일부, 예를 들어, 뉴클레오염기 또는 백본 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 변형은 또한 gRNA 내에, 예를 들어 표적화 도메인 내에 또는 외부에 DNA 뉴클레오타이드의 존재를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은, 예를 들어 가이드 RNA의 3' 말단 또는 5' 말단, 예를 들어, 표적화 도메인에 대해 원부에 있는 말단에 RNA 및/또는 DNA 뉴클레오타이드를 포함하는, 1개 내지 100개 뉴클레오타이드의 부가에 의한, gRNA 스캐폴드의 연장을 포함할 수 있다.
일반적으로, gRNA는 당 기(group) 리보스를 포함하고, 이러한 리보스는 산소를 갖는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 gRNA는 비제한적으로, 리보스에서 (예를 들어 황(S), 셀레늄(Se), 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌으로의) 산소의 대체; 이중 결합의 첨가(예를 들어 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체하기 위해); 리보스의 고리 축소(예를 들어 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위해); 리보스의 고리 팽창(예를 들어 추가의 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6-원 또는 7-원 고리, 예를 들어, 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 포스포라미데이트 백본을 갖기도 하는 모르폴리노를 형성하기 위해)을 포함할 수 있다. 대부분의 당 유사체 변경이 2' 위치에 위치하더라도, 4' 위치를 포함하여 다른 부위도 변형을 받을 수 있다. 소정의 실시형태에서, gRNA는 4'-S, 4'-Se 또는 4'-C-아미노메틸-2'-O-Me 변형을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신이 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 소정의 실시형태에서, O-알킬화된 및 N-알킬화된 뉴클레오타이드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 소정의 실시형태에서, gRNA 내의 하나 이상의 또는 모든 뉴클레오타이드는 데옥시뉴클레오타이드이다.
소정의 실시형태에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 gRNA는 변형된 또는 변형되지 않은 gRNA일 수 있다. 소정의 실시형태에서, gRNA는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트 결합 변형, 포스포로디티오에이트(PS2) 결합 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 있을 수 있다.
소정 실시형태에서, gRNA 변형은 하나 이상의 포스포로디티오에이트(PS2) 결합 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 본원에서 "DNA 신장"으로도 지칭되는, 데옥시리보핵산(DNA) 염기의 하나 이상 또는 그 신장물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 DNA 신장을 포함한다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 DNA 염기 길이일 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25 DNA 염기 길이일 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 또는 티민(T)으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 염기를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 동일한 DNA 염기를 포함한다. 예를 들어, DNA 신장은 아데닌(A) 염기의 신장물을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 티민(T) 염기의 신장물을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 상이한 DNA 염기의 조합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장은 표 3에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 DNA 신장 뿐만 아니라 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 변형, 하나 이상의 포스포로디티오에이트(PS2) 결합 변형, 하나 이상의 2'-O-메틸 변형, 또는 이의 조합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, DNA 신장을 포함하는 gRNA는 DNA 신장을 포함하는 표 3에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, gRNA에 의해 표적화되는 표적 핵산에 혼성화하지 않고 또한 이러한 DNA 신장을 포함하지 않는 gRNA에 비해 표적 핵산 부위에서 편집 증가를 나타내는 한, 임의의 DNA 신장이 본원에서 사용될 수 있음이 고려된다.
일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 본원에서 "RNA 신장"으로도 지칭되는 리보핵산(RNA) 염기의 하나 이상 또는 신장물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 RNA 신장을 포함한다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 RNA 염기 길이일 수 있다. 예를 들어, 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25 RNA 염기 길이일 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 아데닌(rA), 구아닌(rG), 시토신(rC), 또는 우라실(rU)로부터 선택되는 하나 이상의 RNA 염기를 포함할 수 있고, 여기서 "r"은 2'-하이드록시, RNA를 나타낸다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 동일한 RNA 염기를 포함한다. 예를 들어, RNA 신장은 아데닌(rA) 염기의 신장물을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 상이한 RNA 염기의 조합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 표 3에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본원에서 사용되는 gRNA는 RNA 신장 뿐만 아니라 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 변형, 하나 이상의 포스포로디티오에이트(PS2) 결합 변형, 하나 이상의 2'-O-메틸 변형, 또는 이의 조합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장을 포함하는 gRNA는 RNA 신장을 포함하는 표 3에 나타낸 서열을 포함할 수 있다. gRNA의 5' 말단에 RNA 신장을 포함하는 gRNA는 본원에서 개시되는 서열을 포함할 수 있다. gRNA의 3' 말단에 RNA 신장을 포함하는 gRNA는 본원에서 개시되는 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 gRNA는 또한 RNA 신장 및 DNA 신장을 포함할 수 있음이 고려된다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장 및 DNA 신장은 둘 모두 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 gRNA의 5' 말단에 있으며 DNA 신장은 gRNA의 3' 말단에 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 신장은 gRNA의 3' 말단에 있으며 DNA 신장은 gRNA의 5' 말단에 있다.
일부 실시형태에서, 변형, 예를 들어, 5' 말단에 DNA 신장을 포함하는 gRNA는 RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, AsCpf1 뉴클레아제와 복합체화되어 RNP를 형성하며, 이는 이후 표적 세포, 예를 들어 NK 세포를 편집하는 데 이용된다.
Cpf1 가이드 RNA를 위한 예시적인 적합한 5' 신장을 아래의 표에 제공한다:
[표 3]
gRNA 5' 신장
Figure pct00003
추가적인 적합한 gRNA 변형은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 gRNA 변형은, 예를 들어, 그 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2018년 10월 2일에 출원되고 "MODIFIED CPF1 GUIDE RNA"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2018/054027, 2015년 12월 3일에 출원되고 "GUIDE RNA WITH CHEMICAL MODIFICATIONS"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2015/000143; 2016년 4월 5일에 출원되고 "CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNAS FOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2016/026028; 및 2016년 9월 23일에 출원되고 "NUCLEASE-MEDIATED GENOME EDITING OF PRIMARY CELLS AND ENRICHMENT THEREOF"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2016/053344에 기재된 것들을 포함한다.
gRNA 설계
표적 서열의 선택 및 검증을 위한 방법 뿐만 아니라 표적-외 분석은 전에, 예를 들어, 문헌[Mali; Hsu; Fu et al., 2014 Nat biotechnol 32(3): 279-84, Heigwer et al., 2014 Nat methods 11(2):122-3; Bae et al. (2014) Bioinformatics 30(10): 1473-5; 및 Xiao A et al. (2014) Bioinformatics 30(8): 1180-1182]에 기재되었다. 각각의 이들 참고문헌이 본원에 참조로 포함된다. 비제한적인 예로서, gRNA 설계는, 사용자의 표적 서열에 상응하는 잠재적인 표적 서열의 선택을 최적화하기 위해, 예를 들어 게놈에 걸쳐 총 표적-외 활성을 최소화하기 위해, 소프트웨어 툴의 사용을 수반할 수 있다. 표적-외 활성이 절단으로 제한되지 않긴 하지만, 각각의 표적-외 서열에서의 절단 효율은, 예를 들어 실험적으로-유래된 가중 방식을 사용하여 예측될 수 있다. 이들 및 다른 가이드 선택 방법은 Maeder 및 Cotta-Ramusino에 상세히 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, gRNA 내의 하나 이상의 또는 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. gRNA를 변형하는 전략은 그 전체 내용이 본원에 명시적으로 참조로 포함되는, 2019년 8월 8일 공개된 WO2019/152519에 기재되어 있다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 소정 실시형태에 적합한 가이드 RNA의 비제한적 예를 본원에, 예를 들어 아래의 표에 제공한다. 당업자는 DNA 또는 RNA 서열로서, 표적화 도메인 서열의 개시내용으로부터, 특이적 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf-1 뉴클레아제에 적합한 가이드 RNA 서열을 상정할 수 있을 것이다. 예를 들어, RNA 뉴클레오타이드로 구성되는 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA는 DNA 서열로 제공되는 표적화 도메인 서열과 상응하는 RNA 서열을 포함할 것이며, 이는 티미딘 뉴클레오타이드 대신에 우라실을 함유한다. 예를 들어, RNA 뉴클레오타이드로 구성되고 DNA 서열 TCTGCAGAAATGTTCCCCGT(SEQ ID NO:__)로 기재되는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA는 상응하는 RNA 서열 UCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO:__)의 표적화 도메인을 가질 것이다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 이러한 표적화 서열은 적합한 가이드 RNA 스캐폴드, 예를 들어, crRNA 스캐폴드 서열 또는 키메라 crRNA/tracerRNA 스캐폴드 서열에 결합될 것이다. 적합한 gRNA 스캐폴드 서열은 당업자에게 공지되어 있다. AsCpf1에 있어서, 예를 들어, 적합한 스캐폴드 서열은 표적화 도메인의 5'-말단에 부가된, 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO:__)를 포함한다. 상기 예에서, 이는 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO:__)의 Cpf1 가이드 RNA를 초래할 것이다. 당업자는 추가로, 예를 들어, DNA 신장을 부가함으로써, 이러한 가이드 RNA를 어떻게 변형하는지를 이해할 것이다(예를 들어, 상기 예에서, 본원에서 기재되는 바와 같은 25-머(mer) DNA 신장의 부가는, 예를 들어, 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTTrUrArArUrUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrUrCrUrGrCrArGrArArArUrGrUrUrCrCrCrCrGrU(SEQ ID NO:__)의 가이드 RNA를 초래할 것이다. 본원에서 제공되는 예시적인 표적화 서열은 제한적인 것이 아님이 이해될 것이며, 추가적인 적합한 서열, 예를 들어, 본원에서 개시되는 특이적 서열의 변이체는 당업계에서의 일반 지식의 관점에서 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 TIGIT을 표적화하는 gRNA(TIGIT gRNA)이다. 일부 실시형태에서, TIGIT을 표적화하는 gRNA는 표 4에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 4]
TIGIT gRNA
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 ADORA2a를 표적화하는 gRNA(ADORA2a gRNA)이다. 일부 실시형태에서, ADORA2a를 표적화하는 gRNA는 표 5에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 5]
ADORA2a gRNA
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 TGF베타R2(TGF베타R2 gRNA)를 표적화하는 gRNA이다. 일부 실시형태에서, TGF베타R2를 표적화하는 gRNA는 표 6에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 6]
TGF베타R2 gRNA
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 CISH를 표적화하는 gRNA(CISH gRNA)이다. 일부 실시형태에서, CISH를 표적화하는 gRNA는 표 7에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 7]
CISH gRNA
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 B2M을 표적화하는 gRNA(B2M gRNA)이다. 일부 실시형태에서, B2M을 표적화하는 gRNA는 표 8에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 8]
B2M gRNA
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 NKG2A를 표적화하는 gRNA(NKG2A gRNA)이다. 일부 실시형태에서, NKG2A를 표적화하는 gRNA는 표 9에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 9]
NKG2A gRNA
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 PD1을 표적화하는 gRNA이다. 일부 실시형태에서 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 PD1을 표적화하는 gRNA이다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 B2M 및 PD1을 표적화하는 gRNA는 둘 모두 이의 전문이 본원에 참조로 포함된, Welstead 등의 WO2015161276 및 WO2017152015("Welstead")에 추가로 기재된다.
RNA-가이드 뉴클레아제
본 개시내용에 따른 RNA-가이드 뉴클레아제는 자연-생성 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 및 Cpf1, 뿐만 아니라 이로부터 유래되거나 수득되는 다른 뉴클레아제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 기능적인 용어에서, RNA-가이드 뉴클레아제는: (a) gRNA와 상호작용하고(예를 들어 복합체화하고); (b) gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 상보성인 서열 및 선택적으로, (ii) 하기에 보다 상세히 기재된 "프로토스페이서 인접 모티프," 또는 "PAM"으로 지칭되는 추가의 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역에 연관되고 이를 선택적으로 절단하거나 변형하는 뉴클레아제로서 정의된다. 하기 예가 예시할 바와 같이, RNA-가이드 뉴클레아제는 광범위한 의미에서 이들의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있긴 하지만, 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별 RNA-가이드 뉴클레아제 사이에 변동이 존재할 수 있다. 당업자는, 본 개시내용의 일부 양태가 소정의 PAM 특이성 및/또는 절단 활성을 갖는 임의의 적합한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 실시될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유에서 다르게 명시되지 않는 한, 용어 RNA-가이드 뉴클레아제는 일반 용어로서 이해되고, 임의의 특정 유형(예를 들어 Cas9 대(vs.) Cpf1), 종(예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스 대 스태필로코쿠스 아우레우스) 또는 변동(예를 들어, 전장 대 절단 또는 분할; 자연-생성 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성 등)의 RNA-가이드 뉴클레아제로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
PAM 서열은 이의 명칭을, gRNA 표적화 도메인(또는 "스페이서")에 상보성인 "프로토스페이서" 서열과의 이의 순차 관계(sequential relationship)로부터 취해진 것이다. 프로토스페이서 서열과 함께 PAM 서열은, 특이적인 RNA-가이드 뉴클레아제/gRNA 조합에 대한 표적 영역 또는 서열을 정의한다.
다양한 RNA-가이드 뉴클레아제는 PAM과 프로토스페이서 사이의 상이한 순차 관계를 필요로 할 수 있다. 일반적으로, Cas9은 프로토스페이서의 3'인 PAM 서열을 인식하는 반면,
한편, Cpf1은 일반적으로 프로토스페이서의 5'인 PAM 서열을 인식한다.
PAM 및 프로토스페이서의 특이적인 순차 배향을 인지하는 것 외에도, RNA-가이드 뉴클레아제는 또한, 특이적인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 스태필로코쿠스 아우레우스 Cas9은 예를 들어 NNGRRT 또는 NNGRRV의 PAM 서열을 인식하며, 여기서, N 잔기는 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식되는 영역의 3' 바로 옆에 존재한다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9은 NGG PAM 서열을 인식한다. 또한, 프란시셀라 노비시다(F. novicida) Cpf1은 TTN PAM 서열을 인식한다. PAM 서열은 여러 가지 RNA-가이드 뉴클레아제에 대해 식별되어 왔으며, 신규 PAM 서열을 식별하기 위한 전략은 문헌[Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397, November 5, 2015]에 기재되어 있다. 또한, 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제는 참조 분자의 PAM 특이성과 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있음을 주지해야 한다(예를 들어, 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제의 경우, 참조 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제가 유래되는 자연 생성 변이체, 또는 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제와 가장 큰 아미노산 서열 상동성을 갖는 자연 생성 변이체일 수 있음).
RNA-가이드 뉴클레아제는 이들의 PAM 특이성 외에도, 이들의 DNA 절단 활성을 특징으로 할 수 있으며: 자연-생성 RNA-가이드 뉴클레아제는 전형적으로 표적 핵산에서 DSB를 형성하지만, SSB만 생성하거나(상기 고찰됨)(본원에 참조로 포함된 문헌[Ran & Hsu, et al., Cell 154(6), 1380-1389, September 12, 2013(Ran)]) 전혀 절단하지 않는 조작된 변이체가 생성되었다.
Cas9
결정 구조는 단분자 가이드 RNA 및 표적 DNA와의 복합체에서 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(Jinek 2014) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 Cas9에 대해 결정되었다(Nishimasu 2014; Anders 2014; 및 Nishimasu 2015).
자연 생성 Cas9 단백질은 2개의 로브: 인지(REC) 로브 및 뉴클레아제(NUC) 로브를 포함하고, 이들 로브는 각각 특정 구조적 및/또는 기능적 도메인을 포함한다. REC 로브는 아르기닌-풍부 가교 나선(BH) 도메인, 및 적어도 하나의 REC 도메인(예를 들어 REC1 도메인 및 선택적으로 REC2 도메인)을 포함한다. REC 로브는 다른 공지된 단백질과 구조적 유사성을 공유하지 않으며, 이는 이러한 REC 로브가 독특한 기능적 도메인임을 가리킨다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 돌연변이 분석은 BH 및 REC 도메인에 대한 특이적인 기능적 역할을 제안하며: BH 도메인은 gRNA:DNA 인지에서 역할을 하는 것으로 보이는 한편, REC 도메인은 gRNA의 반복부:안티-반복부 듀플렉스와 상호작용하고 Cas9/gRNA 복합체의 형성을 매개하는 것으로 생각된다.
NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제(integrase) 슈퍼패밀리 구성원과 구조적 유사성을 공유하고, 표적 핵산의 비-상보성인(즉 하부) 가닥을 절단한다. RuvC 도메인은 2개 이상의 분할된 RuvC 모티프(예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스 및 스태필로코쿠스 아우레우스에서 RuvCI, RuvCII 및 RuvCIII)로부터 형성될 수 있다. 한편, HNH 도메인은 HNN 엔도뉴클레아제 모티프와 구조적으로 유사하고, 표적 핵산의 상보성인(즉, 상부) 가닥을 절단한다. PI 도메인은 이의 명칭에서처럼, PAM 특이성에 기여한다.
Cas9의 소정의 기능이 상기 제시된 특이적인 도메인과 연결되어 있긴 하지만(그러나 필수적으로 전체적으로 이러한 도메인에 의해 결정되는 것은 아님), 이들 및 다른 기능은 다른 Cas9 도메인에 의해, 또는 어느 하나의 로브 상의 다수의 도메인에 의해 매개되거나 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, Nishimasu 2014에 기재된 바와 같이 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9에서, gRNA의 반복부:안티반복부 듀플렉스는 REC 로브와 NUC 로브 사이의 그루브(groove)에 함닉되고, 이러한 듀플렉스 내의 뉴클레오타이드는 BH, PI 및 REC 도메인 내의 아미노산과 상호작용한다. 제1 스템 루프 구조 내의 일부 뉴클레오타이드는 또한, 다수의 도메인(PI, BH 및 REC1) 내의 아미노산과 상호작용하고, 제2 및 제3 스템 루프(RuvC 및 PI 도메인) 내의 일부 뉴클레오타이드도 마찬가지이다.
Cpf1
TTTN PAM 서열을 포함한 이중-가닥(ds) DNA 표적 및 crRNA와의 복합체에서 애시드아미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1의 결정 구조는 Yamano 등에 의해 해결되었다(본원에 참조로 포함된 문헌[Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962(Yamano)]). Cas9와 마찬가지로 Cpf1은 2개의 로브: REC(인지) 로브 및 NUC(뉴클레아제) 로브를 가진다. REC 로브는 REC1 및 REC2 도메인을 포함하며, 임의의 공지된 단백질 구조와의 유사성이 결여되어 있다. 한편, NUC 로브는 3개의 RuvC 도메인(RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III) 및 BH 도메인을 포함한다. 그러나, Cas9와는 대조적으로, Cpf1 REC 로브는 HNH 도메인이 결여되어 있고, 공지된 단백질 구조와의 유사성이 또한 결여되어 있는 다른 도메인: 구조적으로 독특한 PI 도메인, 3개의 Ÿ‡지(Wedge)(WED) 도메인(WED-I, WED-II 및 WED-III), 및 뉴클레아제(Nuc) 도메인을 포함한다.
Cas9 및 Cpf1이 구조 및 기능 면에서 유사성을 공유하긴 하지만, 소정의 Cpf1 활성은 임의의 Cas9 도메인과 유사하지 않은 구조 도메인에 의해 매개됨을 이해해야 한다. 예를 들어, 표적 DNA의 상보성인 가닥의 절단은 Nuc 도메인에 의해 매개되는 것으로 보이며, 이러한 Nuc 도메인은 Cas9의 HNH 도메인으로부터 순차적으로 및 공간적으로 상이하다. 부가적으로, Cpf1 gRNA의 비-표적화 부분(핸들)은, Cas9 gRNA에서 반복부:안티반복부 듀플렉스에 의해 형성되는 스템 루프 구조보다는 슈도노트(pseudoknot) 구조를 채택한다.
RNA-가이드 뉴클레아제의 변형
상기 기재된 RNA-가이드 뉴클레아제는 여러 가지 적용에서 유용할 수 있는 활성 및 특성을 갖지만, 당업자는, RNA-가이드 뉴클레아제가 소정의 경우, 절단 활성, PAM 특이성, 또는 다른 구조적 또는 기능적 특징을 변경하도록 변형될 수도 있음을 이해할 것이다.
우선, 절단 활성을 변경하는 변형에 관하여, NUC 로브 내의 도메인의 활성을 감소시키거나 없애는 돌연변이가 상기에 기재되었다. RuvC 도메인, Cas9 HNH 도메인, 또는 Cpf1 Nuc 도메인에서 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 Ran 및 Yamano, 뿐만 아니라 Cotta-Ramusino에 기재되어 있다. 일반적으로, 2개의 뉴클레아제 도메인 중 하나에서 활성을 감소시키거나 없애는 돌연변이는 닉카제 활성을 갖는 RNA-가이드 뉴클레아제를 초래하지만, 어떤 도메인이 불활성화되는지에 따라 닉카제 활성의 유형이 다양해짐을 주지해야 한다. 일례로, RuvC 도메인의 또는 Cas9 HNH 도메인의 불활성화는 닉카제를 초래할 것이다.
자연 생성 Cas9 참조 분자와 관련한 PAM 특이성의 변형은 스트렙토코쿠스 피오게네스(문헌[Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5(Kleinstiver I)]) 및 스태필로코쿠스 아우레우스(문헌[Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec; 33(12): 1293-1298(Klienstiver II)]) 둘 모두에 대해 Kleinstiver 등에 의해 기재되었다. Kleinstiver 등은 또한, Cas9의 표적화 충실도(fidelity)를 개선하는 변형을 기재하였다(문헌[Nature, 2016 January 28; 529, 490-495(Kleinstiver III)]). 이들 참조문헌은 각각 본원에 참조로 포함된다.
RNA-가이드 뉴클레아제는 Zetsche 등에 의해(참조로 포함된 문헌[Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42(Zetsche II)]) 및 Fine 등에 의해(참조로 포함된 문헌[Sci Rep. 2015 Jul 1;5:10777(Fine)]) 기재된 바와 같이 2개 이상의 파트로 분할되었다.
소정의 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 예를 들어 gRNA 연관, 표적 및 PAM 인지, 및 절단 활성을 여전히 보유하면서도 뉴클레아제의 크기를 감소시키는 하나 이상의 결실을 통해 크기-최적화되거나 절단될 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 가이드 뉴클레아제는, 선택적으로 링커에 의해, 또 다른 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 또는 다른 구조에 공유 또는 비-공유 결합된다. 예시적인 결합된 뉴클레아제 및 링커는 문헌[Guilinger et al., Nature Biotechnology 32, 577-582 (2014)]에 기재되어 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
RNA-가이드 뉴클레아제는 또한 선택적으로, 핵 내로의 RNA-가이드 뉴클레아제 단백질의 이동을 용이하게 하기 위해 비제한적으로 핵 위치화 신호와 같은 태그를 포함한다. 소정의 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 C-말단 및/또는 N-말단 핵 위치화 신호를 혼입할 수 있다. 핵 위치화 서열은 당업계에 공지되어 있고, Maeder에서와 다른 곳에서도 기재되어 있다.
상기 변형 목록은 그 성질이 예시적이고자 한 것이며, 당업자는 본 개시내용의 측면에서 다른 변형이 소정의 적용에서 가능하거나 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 간략화를 위해, 본 개시내용의 예시적인 시스템, 방법 및 조성물은 특정 RNA-가이드 뉴클레아제를 참조로 하여 제시되지만, 사용되는 RNA-가이드 뉴클레아제는 이들의 작동 원리를 변경하지 않는 방식으로 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
예시적인 적합한 뉴클레아제 변이체는 비제한적으로 M537R 치환, H800A 치환, 및/또는 F870L 치환, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 AsCpf1 변이체를 포함한다(넘버링 체계는 AsCpf1 야생형 서열에 따름). AsCpf1 아미노산 서열의 다른 적합한 변형은 당업자엥게 공지되어 있다. 야생형 AsCpf1 및 AsCpf1 변이체의 일부 예시적인 서열을 아래에 제공한다.
His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A 아미노산 서열(SEQ ID NO:[XX])
Figure pct00040
Cpf1 변이체 1 아미노산 서열(SEQ ID NO:[XX])
Figure pct00041
Cpf1 변이체 2 아미노산 서열(SEQ ID NO:[XX])
Figure pct00042
Cpf1 변이체 3 아미노산 서열(SEQ ID NO:1096)
Figure pct00043
Cpf1 변이체 4 아미노산 서열(SEQ ID NO:1097)
Figure pct00044
Cpf1 변이체 5 아미노산 서열(SEQ ID NO:1107)
Figure pct00045
Cpf1 변이체 6 아미노산 서열(SEQ ID NO:1108)
Figure pct00046
Cpf1 변이체 7 아미노산 서열(SEQ ID NO:[[XX]])
Figure pct00047
예시적인 AsCpf1 야생형 아미노산 서열(SEQ ID NO: [[XX]]):
Figure pct00048
RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산
RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9, Cpf1 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 예시적인 핵산은 전에 기재되었다(예를 들어 Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012 참고).
일부 경우, RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA는 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어 모두)을 가질 것이다: mRNA는 캡핑되며; 폴리아데닐화되고; 5-메틸시티딘 및/또는 슈도우리딘으로 치환될 수 있다.
합성 핵산 서열은 또한, 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어 적어도 하나의 비-보편적인 코돈 또는 덜-보편적인 코돈은 보편적인 코돈에 의해 대체되어 왔다. 예를 들어, 합성 핵산은, 예를 들어 본원에 기재된 포유류 발현 시스템에서 발현을 위해 최적화된 것과 같은 최적화된 메신저 mRNA의 합성을 명령할 수 있다. 코돈 최적화된 Cas9 코딩 서열의 예는 Cotta-Ramusino에 제시되어 있다.
이외에도 또는 대안적으로, RNA-가이드 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 핵 위치화 서열(NLS)을 포함할 수 있다. 핵 위치화 서열은 당업계에 공지되어 있다.
후보 분자의 기능적 분석
후보 RNA-가이드 뉴클레아제, gRNA, 및 이들의 복합체는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어 Cotta-Ramusino를 참고한다. RNP 복합체의 안정성은 하기 기재된 바와 같이 시차 주사 형광측정법(Differential scanning fluorimetry)에 의해 평가될 수 있다.
시차 주사 형광측정법(DSF)
gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 열안정성(thermostability)은 DSF를 통해 측정될 수 있다. DSF 기술은 단백질의 열안정성을 측정하며, 이러한 열안정성은 결합 RNA 분자, 예를 들어 gRNA의 첨가와 같은 호의적인 조건 하에 증가할 수 있다.
DSF 검정법은 임의의 적합한 프로토콜에 따라 수행될 수 있고, 비제한적으로 (a) RNP 형성을 위한 최적 조건을 식별하기 위해 상이한 조건(예를 들어 상이한 화학양론비의 gRNA: RNA-가이드 뉴클레아제 단백질, 상이한 완충 용액 등)을 시험하는 것; 및 (b) RNP 형성 또는 안정성을 개선하는 변형을 식별하기 위해 RNA-가이드 뉴클레아제 및/또는 gRNA의 변형(예를 들어 서열의 화학적 변형, 변경 등)을 시험하는 것을 포함하여 임의의 적합한 설정에서 이용될 수 있다. DSF 검정법의 하나의 판독은 RNP 복합체의 용융 온도에서의 이동(shift)이며; 상대적으로 높은 이동은 이러한 RNP 복합체가, 더 낮은 이동을 특징으로 하는 참조 RNP 복합체와 관련하여 더 안정함(및 따라서 더 큰 활성 또는 더 호의적인 형성 동역학, 분해 동역학, 또는 또 다른 기능적 특징을 가질 수 있음)을 제안한다. DSF 검정법이 스크리닝 툴로서 전개되는 경우, 역치 용융 온도 이동이 명시될 수 있으며, 따라서, 출력(output)은 역치 이상에서 용융 온도 이동을 갖는 하나 이상의 RNP이다. 예를 들어, 이러한 역치는 5℃ 내지 10℃(예를 들어 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°) 이상일 수 있고, 이러한 출력은 역치 이상의 용융 온도 이동을 특징으로 하는 하나 이상의 RNP일 수 있다.
DSF 검정법 조건의 2개의 비제한적인 예는 하기에 제시된다:
RNP 복합체를 형성하기 위한 최상의 용액을 결정하기 위해, 물+10x SYPRO Orange®(Life Technologies cat#S-6650) 중 고정된 농도(예를 들어 2 μM)의 Cas9을 384웰 플레이트 내로 분배한다. 그 후에, 다양한 pH 및 염을 갖는 용액 내에 희석된 등몰량의 gRNA를 첨가한다. 실온에서 10' 동안 인큐베이션하고 간단히 원심분리하여 임의의 방울을 제거한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 구비된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여, 20℃로부터 90℃까지의 경사도(gradient)를 진행시키고, 이때 10초마다 온도는 1℃ 증가한다.
제2 검정법은 다양한 농도의 gRNA를 상기 검정법 1로부터의 최적 완충제 중 고정된 농도(예를 들어 2 μM)의 Cas9와 함께 혼합하고, 384웰 플레이트에서 (예를 들어 RT에서 10' 동안) 인큐베이션하는 것으로 구성된다. 동일한 부피의 최적 완충제 + 10x SYPRO Orange®(Life Technologies cat#S-6650)를 첨가하고, 상기 플레이트를 Microseal® B 접착제(MSB-1001)로 밀봉한다. 간단히 원심분리하여 임의의 방울을 제거한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 구비된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여, 20℃로부터 90℃까지의 경사도를 진행시키고, 이때 10초마다 온도는 1℃ 증가한다.
게놈 편집 전략
본 개시내용의 다양한 실시형태에서 상기 기재된 게놈 편집 시스템을 사용하여, 세포 내의 또는 이로부터 수득된 DNA의 표적화된 영역에서 편집물을 생성한다(즉, 변경함). 특정 편집물을 생성하기 위한 다양한 전략이 본원에 기재되어 있고, 이들 전략은 일반적으로, 요망되는 수선 결과물, 개별 편집물(예를 들어 SSB 또는 DSB)의 수 및 위치, 및 이러한 편집물의 표적 부위의 측면에서 기재되어 있다.
SSB 또는 DSB의 형성을 수반하는 게놈 편집 전략은: (a) 표적화된 영역 모두 또는 일부의 결실; (b) 표적화된 영역 모두 또는 일부 내로의 삽입 또는 대체; 또는 (c) 표적화된 영역 모두 또는 일부의 방해(interruption)를 포함하는 수선 결과물을 특징으로 한다. 이러한 분류는 제한적이지 않거나 임의의 특정 이론 또는 모델로 결부되고자 하는 것이 아니며, 제시의 경제성을 위해서만 제공된다. 당업자는, 열거된 결과물이 상호 배타적이지 않고 일부 수선이 다른 결과물을 초래할 수 있음을 이해할 것이다. 특정 편집 전략 또는 방법의 설명이 다르게 명시되지 않는 한, 특정 수선 결과물을 필요로 하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
표적화된 영역의 대체는 일반적으로, 표적화된 영역 내의 기존의 서열 모두 또는 일부를 예를 들어 HDR 경로에 의해 매개되는 2개의 수선 결과물인 유전자 교정 또는 유전자 전환을 통해 상동성 서열로 대체하는 것을 수반한다. HDR은 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 공여체 주형의 사용에 의해 촉진된다. 단일-가닥 또는 이중-가닥은 외인성일 수 있으며 이러한 경우 이들 가닥은 유전자 교정을 촉진할 것이며, 또는 이들 가닥은 내인성(예를 들어 세포성 게놈 내의 상동성 서열)이어서 유전자 전환을 촉진할 수 있다. 외인성 주형은 예를 들어 Richardson 등(참조로 포함된 문헌[Nature Biotechnology 34, 339-344 (2016)(Richardson)])에 의해 기재된 바와 같이 비대칭 오버행(즉, DSB의 부위에 상보성인 주형의 일부는 공여체 주형 내에 중점적으로 존재하기 보다는 3' 또는 5' 방향에서 상쇄될 수 있음)을 가질 수 있다. 주형이 단일 가닥인 경우, 이러한 주형은 표적화된 영역의 상보성인(상부) 또는 비-상보성인(하부) 가닥에 상응할 수 있다.
유전자 구축물
일부 양태에서, 본 개시내용은 임상 적용을 위한, 예를 들어, 면역종양학 치료 접근을 위한 진보된 NK 세포 산물의 생성을 허용하는, 복합 편집 전략, 및 복합 게놈 변경을 갖는 변형된 생성 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 게놈 변경은 하나 이상의 HDR 발현 구축물을 사용하여 도입된다. 일부 실시형태에서, 게놈 변경은 하나 이상의 HDR 발현 구축물을 사용하여 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 HDR 발현 구축물은 하나 이상의 공여체 HDR 주형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공여체 HDR 주형은 하나 이상의 cDNA를 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 하나의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 2개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 3개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 4개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 5개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 6개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 7개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 8개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 9개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공여체 HDR 주형은 10개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 단일시스트론이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 2시스트론이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 하나의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 2개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 3개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 4개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 5개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 6개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 7개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 8개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 9개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 10개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 2A 서열에 의해 분리된 하나 이상의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 2A 서열에 의해 분리된 2개의 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 2A 서열에 의해 분리된 3개의 cDNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, HDR 발현 구축물은 이종성 프로모터에 의해 유도되는 하나 이상의 cDNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 발현을 위한 cDNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, HDR 발현 구축물은 표적 유전자에 불활성화 돌연변이를 삽입하기 위한 하나 이상의 공여체 주형을 포함하며, 여기서 유전자 산물은 더 작은 기능을 갖거나 갖지 않는다(부분적으로 또는 전체적으로 불활성화됨). 일부 실시형태에서, HDR 발현 구축물은 표적 유전자에 불활성화 돌연변이를 삽입하기 위한 하나 이상의 공여체 주형을 포함하며, 여기서 유전자 산물은 기능을 갖지 않는다(전체적으로 불활성화됨).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 3개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 4개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 5개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 6개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 7개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 8개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 9개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 10개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 NK 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 3개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 4개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 5개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 6개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 7개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 8개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 9개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 10개 이상의 외인성 핵산 구축물의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 하나 이상의 유전자, 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 2개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 3개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 4개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 5개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 6개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 7개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 8개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 9개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 10개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 NK 세포는 표 11에 열거된 적어도 하나 이상의 유전자, 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 2개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 3개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 4개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 5개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 6개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 7개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 8개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 9개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 11에 열거된 적어도 10개 이상의 유전자의 기능 상실을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물을 포함하며 표 11에 열거된 적어도 하나의 유전자의 기능 상실을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산 구축물 및 표 11에 열거된 적어도 하나의 유전자의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산 구축물 및 표 11에 열거된 2개 이상의 유전자의 기능 상실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 표 10에 열거된 하나 이상의 유전자의 cDNA를 인코딩하는 2개 이상의 외인성 핵산 구축물 및 표 11에 열거된 2개 이상의 유전자의 기능 상실을 포함한다.
유전자 전환 및 유전자 교정은 일부 경우, Ran 및 Cotta-Ramusino에 기재된 바와 같이 표적화된 영역 내에서 또는 주변에서 하나 이상의 틈새의 형성에 의해 용이하게 된다. 일부 경우, 이중-닉카제 전략은 2개의 상쇄된 SSB를 형성하는 데 사용되며, 이러한 SSB는 결국 오버행(예를 들어 5' 오버행)을 갖는 단일 DSB를 형성한다.
표적화된 서열의 모두 또는 일부의 방해 및/또는 결실은 여러 가지 수선 결과물에 의해 달성될 수 있다. 일례로, 서열은 Maeder에서 LCA10 돌연변이에 대해 기재된 바와 같이, 표적화된 영역의 측면에 존재하는 2개 이상의 DSB를 동시에 생성하고, 그 후에 이러한 DSB가 수선될 때 절제됨으로써 결실될 수 있다. 또 다른 예를 들어, 서열은, 단일-가닥 오버행을 갖는 이중 가닥 절단부의 형성, 뒤이어 수선 전에 이러한 오버행의 엑소뉴클레오리틱(exoucleolytic) 과정에 의해 생성된 결실에 의해 방해받을 수 있다.
표적 서열 방해의 하나의 특이적인 하위세트(subset)는 표적화된 서열 내에서 인델의 형성에 의해 매개되며, 여기서, 수선 결과물은 전형적으로 NHEJ 경로(Alt-NHEJ를 포함함)에 의해 매개된다. NHEJ는 인델 돌연변이와 이의 연관성 때문에 "오류 빈발" 수선 경로로 지칭된다. 그러나, 일부 경우, DSB는 이것 주위의 서열이 변경되지 않으면서 NHEJ에 의해 수선되며(소위 "완벽한" 또는 "흠없는(scarless)" 수선); 이는 일반적으로 DSB의 2개 말단이 완벽하게 연결되는 것을 필요로 한다. 한편, 인델은, 자유 DNA 말단이 연결되기 전에, 자유 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두의 어느 하나 또는 둘 모두의 가닥으로부터 뉴클레오타이드를 첨가하고/하거나 제거하는 자유 DNA 말단의 효소적 가공으로 인한 것으로 생각된다.
자유 DSB 말단의 효소적 가공이 자연상에서 확률적(stochastic)일 수 있기 때문에, 인델 돌연변이는 분포를 따라 생성하여 가변적인 경향이 있고, 특이적인 표적 부위, 사용되는 세포 유형, 사용되는 게놈 편집 전략 등을 포함한 여러 가지 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 그럼에도, 인델 정보에 대해 제한된 일반화를 도출하는 것이 가능하며: 단일 DSB의 수선에 의해 형성된 결실은 가장 보편적으로 1 내지 50 bp 범위이지만, 100 내지 200 bp 초과에 도달할 수 있다. 단일 DSB의 수선에 의해 형성된 삽입은 더 짧은 경향이 있고, 주변 절단부 부위 바로 옆에 서열의 짧은 중복(duplication)을 종종 포함한다. 그러나, 큰 삽입물을 수득하는 것이 가능하고, 이들 경우에, 삽입된 서열은 종종, 세포에 존재하는 게놈의 다른 영역까지 또는 플라스미드 DNA까지 추적되었다.
인델 돌연변이 - 및 인델을 제조하도록 배치된 게놈 편집 시스템 - 는 예를 들어 특이적인 최종 서열의 생성이 필요하지 않을 때 및/또는 틀이동 돌연변이가 관용적일 경우에, 표적 서열을 방해하는 데 유용하다. 이들 인델 돌연변이는 또한, 요망되는 소정의 서열이 주어진 부위에서 SSB 또는 DSB의 수선으로부터 우선적으로 생성하는 경향이 있는 한, 특정 서열이 바람직한 설정에서 유용할 수 있다. 인델 돌연변이는 또한, 특정 게놈 편집 시스템 및 이들의 구성성분의 활성을 평가하거나 스크리닝하는 데 유용한 툴이다. 이들 및 다른 설정에서, 인델은 (a) 게놈 편집 시스템과 접촉된 세포의 게놈에서 이들의 상대 빈도 및 절대 빈도, 및 (b) 편집되지 않은 서열과 관련하여 예를 들어 ±1, ±2, ±3 등의 수치 차이의 분포를 특징으로 할 수 있다. 일례로, 리드(lead)-발견 설정에서, 다수의 gRNA가 스크리닝되어, 조절된 조건 하에 인델 판독에 기반하여 표적 부위에서 절단을 가장 효율적으로 구동하는 gRNA를 식별할 수 있다. 역치 빈도 이상에서 인델을 생성하거나, 인델의 특정 분포를 생성하는 가이드는 추가의 연구 및 개발을 위해 선택될 수 있다. 인델 빈도 및 분포는 또한, 예를 들어 gRNA를 일정하게 유지시키고 소정의 다른 반응 조건 또는 전달 방법을 다양하게 함으로써, 상이한 게놈 편집 시스템 실시 또는 제제화 및 전달 방법을 평가하기 위한 판독으로서 유용할 수 있다.
멀티플렉스 전략
상기 고찰된 예시적인 전략이 단일 DSB에 의해 매개된 수선 결과물에 초점을 맞추고 있는 한편, 본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템은 또한, 동일한 유전자좌에서 또는 상이한 유전자좌에서 2개 이상의 DSB를 생성하는 데 이용될 수 있다. 다수의 DSB 또는 SSB의 형성을 수반하는 편집 전략은 예를 들어 Cotta-Ramusino에 기재되어 있다. 다수의 편집물이 NK세포, 또는 NK 세포가 유래되는 세포의 게놈에서 제조되는 일부 실시형태에서, 편집물은 동시에 또는 시간적으로 매우 가깝게 제조된다. 일부 이러한 실시형태에서, 2개 이상의 게놈 편집물은 2개 이상의 상이한 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 영향을 미친다. 예를 들어, 게놈 편집물 중 하나는 saCas9(각각의 saCas9 가이드 RNA와 연계되어)에 의해 영향을 미칠 수 있고, 상이한 게놈 편집물은 Cpf1(각각의 Cpf1 가이드 RNA와 연계되어)에 의해 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 멀티플렉스 게놈 편집 접근의 맥락에서 상이한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하는 것은 2개 이상의 편집물에 대해 동일한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하는 것에 비해, 예를 들어, 요망되지 않는 효과, 예컨대 표적-외 절단, 및 게놈 전위의 발생 가능성 또는 빈도를 감소시킬 수 있도록 한다는 점에서 유리하다.
공여체 주형 설계
공여체 주형 설계는 문헌에, 예를 들어 Cotta-Ramusino에 상세히 기재되어 있다. 단일-가닥(ssODN) 또는 이중-가닥(dsODN)일 수 있는 DNA 올리고머 공여체 주형(올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 ODN)은 DSB의 HDR-기반 수선을 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 표적 DNA 서열 내로 변경을 도입하거나 표적 서열 내로 새로운 서열을 삽입하거나 표적 서열을 대체로 대체하는 데 특히 유용하다.
공여체 주형은 단일-가닥 또는 이중-가닥이든지 간에 일반적으로, 절단되는 표적 서열 내의 또는 그 부근의(예를 들어 측면에 존재하거나 인접해 있는) DNA의 영역에 상동성인 영역을 포함한다. 이들 상동성 영역은 본원에서 "상동성 암(상동성 암)"으로 지칭되고, 하기에 도식적으로 예시된다:
Figure pct00049
.
상동성 암은 임의의 적합한 길이를 가질 수 있고(단지 1개의 상동성 암만 사용되는 경우 0개의 뉴클레오타이드를 포함함), 3' 및 5' 상동성 암은 동일한 길이를 가질 수 있거나 길이가 상이할 수 있다. 적절한 상동성 암 길이의 선택은, Alu 반복부 또는 다른 매우 보편적인 요소와 같은 소정의 서열과의 상동성 또는 미세상동성을 피하기 위한 요망과 같은 여러 가지 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 서열 반복 요소를 피하기 위해 5' 상동성 암이 단축될 수 있다. 다른 실시형태에서, 서열 반복 요소를 피하기 위해 3' 상동성 암이 단축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 서열 반복 요소를 포함하는 것을 피하기 위해 5' 및 3' 상동성 암 둘 모두가 단축될 수 있다. 또한, 일부 상동성 암 설계는 편집 효율을 개선하거나, 요망되는 수선 결과물의 빈도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 참조로 포함된 문헌[Richardson et al. Nature Biotechnology 34, 339-344 (2016)(Richardson)]은, 단일 가닥 공여체 주형의 3' 및 5' 상동성 암의 상대 비대칭이 수선율 및/또는 결과물에 영향을 미친 것을 확인하였다.
공여체 주형 내의 대체 서열은 Cotta-Ramusino 등을 포함하여 어디에나 기재되어 있다. 대체 서열은 임의의 적합한 길이(요망되는 수선 결과물이 결실인 경우, 0개 뉴클레오타이드를 포함함)일 수 있고, 편집이 요망되는 세포 내의 자연-생성 서열과 관련하여 1개, 2개, 3개 이상의 서열 변형을 전형적으로 포함한다. 하나의 보편적인 서열 변형은, 치료가 요망되는 질병 또는 질환과 관련된 돌연변이를 수선하기 위한 자연-생성 서열의 변경을 수반한다. 또 다른 보편적인 서열 변형은, SSB 또는 DSB를 생성하며 대체 서열이 표적 부위 내에 혼입된 후 이러한 표적 부위의 반복된 절단을 감소시키거나 없애기 위해 사용되는 gRNA(들)의 RNA-가이드 뉴클레아제 또는 표적화 도메인의 PAM 서열에 상보성이거나 코딩하는 하나 이상의 서열의 변경을 수반한다.
선형 ssODN이 사용되는 경우, 이러한 선형 ssODN은 (i) 표적 핵산의 틈새 가닥에 어닐링하며, (ii) 표적 핵산의 온전한(intact) 가닥에 어닐링하며, (iii) 표적 핵산의 + 가닥에 어닐링하며, 및/또는 (iv) 표적 핵산의 마이너스 가닥에 어닐링하도록 배치될 수 있다. ssODN은 임의의 적합한 길이, 예를 들어 약 적어도 150개 내지 200개 또는 약 150개 내지 200개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들어 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개 뉴클레오타이드)를 가질 수 있다.
주형 핵산은 또한, 핵산 벡터, 예컨대 바이러스 게놈 또는 환형 이중 가닥 DNA, 예를 들어 플라스미드일 수 있음을 주지해야 한다. 공여체 주형을 포함하는 핵산 벡터는 다른 코딩 또는 비-코딩 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주형 핵산은, 소정의 게놈 백본 요소(예를 들어 AAV 게놈의 경우, 역방위 말단 반복)를 포함하고 gRNA 및/또는 RNA-가이드 뉴클레아제를 코딩하는 추가의 서열을 선택적으로 포함하는 바이러스 게놈(예를 들어 AAV 또는 렌티바이러스 게놈에서)의 일부로서 전달될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 공여체 주형은, 동일한 gRNA를 사용하여 세포성 DNA 내에서 형성되는 상응하는 SSB 또는 DSB의 수선에 참여할 수 있는 공여체 주형의 하나의 말단 또는 두 말단 모두 상에서 자유 DSB의 형성을 용이하게 하기 위해, 하나 이상의 gRNA에 의해 인식되는 표적 부위에 인접해 있거나 이의 측면에 존재할 수 있다. 공여체 주형으로서 사용하기에 적합한 예시적인 핵산 벡터는 Cotta-Ramusino에 기재되어 있다.
어떤 포맷이 사용되든지 간에, 바람직하지 못한 서열을 피하기 위해 주형 핵산이 설계될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 소정의 서열 반복 요소, 예를 들어 Alu 반복, LINE 요소 등과의 중첩을 피하기 위해 하나의 또는 둘 모두의 상동성 말단은 단축될 수 있다.
표적-상 유전자 편집의 정량적 측정
본 개시내용의 게놈 편집 시스템이 표적화된 통합을 포함하는, 표적-상 유전자 편집 결과의 검출 및 정량적 측정을 허용함을 주지해야 한다. 본원에서 기재되는 조성물 및 방법은 5' 상동성 암(homology arm), 카고(cargo), 하나 이상의 프라이밍(priming) 부위, 3' 상동성 암, 및 선택적으로 스터퍼(stuffer) 서열을 포함하는 공여체 주형의 사용에 의존할 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, Ramusino 등의 국제 특허 공개 WO2019/014564(Ramusino)는 표적화된 게놈 DNA 유전자좌(즉, 표적 핵산)에 존재하는 프라이밍 부위와 실질적으로 동일한 공여체 주형 내로 하나 이상의 프라이머 결합 부위(즉, 프라이밍 부위)를 포매함으로써, 표적화된 통합 사건(event)를 포함하는 표적-상 유전자 편집 결과의 정량적 분석을 허용하는 조성물 및 방법을 기재한다. 프라이밍 부위는 공여체 주형과 표적 핵산의 상동성 재조합이 일어나는 경우, 표적-상 편집 결과를 정량적으로 결정하기 위해 적어도 하나의 앰플리콘이 생성될 수 있도록 공여체 주형의 성공적인 표적화된 통합이 공여체 주형으로부터의 프라이밍 부위를 표적 핵산 내로 통합시키도록, 공여체 주형 내로 포매된다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 제1 프라이밍 부위(P1) 및 제2 프라이밍 부위(P2)를 포함하며, 공여체 주형은 카고 서열, 제1 프라이밍 부위(P1'), 및 제2 프라이밍 부위(P2')를 포함하고, 여기서 P2'은 카고 서열로부터 5'에 위치하고, P1'은 카고 서열로부터 3'에 위치하며(즉, A1--P2'--N--P1'--A2), P1'은 P1과 실질적으로 동일하고, P2'은 P2와 실질적으로 동일하다. 정확한 상동성-유도 표적화된 통합 후, 3개의 앰플리콘이 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머로 단일 PCR 반응을 사용하여 생산된다. 제1 앰플리콘인 앰플리콘 X는 원래 게놈 DNA에 존재하는 프라이머 결합 부위(P1 및 P2)로부터 생성되며, 서열분석되어 표적화된 통합을 초래하지 않는 표적-상 편집 사건(예를 들어, 삽입, 결실, 유전자 전환)을 분석할 수 있다. 나머지 2개의 앰플리콘은 상동성-유도 표적화된 통합 후 5' 및 3' 접합부로 맵핑된다. 제2 앰플리콘인 앰플리콘 Y는 표적 핵산에서 표적화된 통합 사건 후, P1 및 P2' 간 핵산 서열의 증폭으로 생성됨으로써, 5' 접합부를 증폭한다. 제3 앰플리콘인 앰플리콘 Z는 표적 핵산에서 표적화된 통합 사건 후 P1' 및 P2 간 핵산 서열의 증폭으로 생성됨으로써, 3' 접합부를 증폭한다. 이들 앰플리콘의 서열분석은 표적화된 통합의 정확도에 관한 정보에 부가하여, 표적 핵산에서 표적화된 통합의 정량적 평가를 제공한다. 앰플리콘 크기에 내재된 임의의 편향을 피하기 위해, 스터퍼 서열이 공여체 주형에 선택적으로 포함되어 모든 3개의 예상되는 앰플리콘을 동일한 길이로 유지할 수 있다.
게놈 편집 시스템의 실시: 전달, 제제화, 및 투여 경로
상기 고찰된 바와 같이, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 임의의 적합한 방식으로 실시될 수 있으며, 이는, 비제한적으로 RNA-가이드 뉴클레아제, gRNA 및 선택적인 공여체 주형 핵산을 포함하여 이러한 시스템의 구성성분이, 게놈 편집 시스템의 형질도입, 발현 또는 도입을 초래하고/하거나 세포, 조직 또는 대상체에서 요망되는 수선 결과물을 유발하는 임의의 적합한 형태 또는 형태들의 조합으로 전달되거나, 제제화되거나 투여될 수 있음을 의미한다. 본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템은 다수의 gRNA, 다수의 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 다른 구성성분, 예컨대 단백질을 혼입할 수 있고, 다양한 실시가 본 개시내용의 시스템에 예시된 원리에 기반하여 당업자에게 자명할 것이다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 세포 내로 전달된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 RNP 복합체가 세포에 순차적으로 임의의 순서로, 또는 동시에 전달된다.
본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템의 다양한 요소를 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 대상체에 투여되거나, 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제-인코딩 및/또는 gRNA-인코딩 DNA, 뿐만 아니라 공여체 주형 핵산은 예를 들어 벡터(예를 들어 바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 비-벡터 기반 방법(예를 들어 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 사용함), 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 AAV에 의해 전달된다.
게놈 편집 시스템을 인코딩하는 핵산 또는 이의 구성성분은 예를 들어 형질감염 또는 전기천공에 의해 네이키드 DNA 또는 RNA로서 세포에 직접적으로 전달될 수 있거나, 표적 세포(예를 들어 적혈구, HSC)에 의한 흡수(uptake)를 촉진하는 분자(예를 들어 N-아세틸갈락토사민)에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 전기천공에 의해 세포 내로 전달된다.
세포 치료법 공정을 개선하기 위한 하나의 유망한 해결책은 활성 단백질의 인간 세포 내로의 직접적 전달로 구성된다. 단백질 전달제인 펠단 셔틀(Feldan Shuttle)은 단백질-기반 전달제이며, 세포 치료법을 위해 설계된다(그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Del'Guidice et al., PLoS One. 2018 Apr 4;13(4):e0195558]). 일부 실시형태에서 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 펠단 셔틀에 의해 세포 내로 전달된다.
본 개시내용의 변형된 세포는 본 출원의 출원 당시, 당업자에게 공지된 임의의 공지 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 변형된 세포는 정맥내로(IV) 투여된다. 일부 실시형태에서 본 개시내용의 변형된 NK 세포는 정맥내로(IV) 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "용량"은 주어진 시간 동안 대상체에 대한 투여를 위한 약리 활성 물질의 특정량을 지칭한다. 다르게 명시되지 않는 한, 인용되는 용량은 임상 적용을 위한 진보된 NK 세포 산물의 생성을 허용하는, 복합 게놈 변경을 갖는 NK 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 NK 세포의 용량은 변형된 NK 세포의 유효량을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 변형된 NK 세포의 용량 또는 유효량은 용량 당 약 1 × 109 변형된 NK 세포 내지 5 × 109 변형된 NK 세포, 또는 약 2 × 109 변형된 NK 세포 내지 5 × 109 변형된 NK 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서 변형된 NK 세포의 용량 또는 유효량은 용량 당 약 3 × 109 변형된 NK 세포 내지 5 × 109 변형된 NK 세포, 또는 약 4 × 109 변형된 NK 세포 내지 5 × 109 변형된 NK 세포를 지칭한다.
변형된 iNK 세포의 생성
본 개시내용의 일부 양태는 줄기 세포, 예를 들어, 다능성 세포, 예컨대, HSC로부터, 또는 만능 줄기 세포, 예컨대, ES 세포 또는 iPS 세포로부터 유래되는 유전적으로 변형된 NK 세포의 생성에 관한 것이다. 유전적으로 변형된 iNK 세포가 iPS 세포로부터 유래되는 일부 실시형태에서, iPS 세포는 신체 공여체 세포로부터 유래된다. 유전적으로 변형된 iNK 세포가 iPS 세포로부터 유래되는 일부 실시형태에서, iPS 세포는 다능성 공여체 세포로부터, 예를 들어, HSC로부터 유래된다.
최종 iNK 세포에 존재하는 게놈 편집물은 공여체 세포를 iPS 세포 상태로 재프로그래밍하는 공정의 임의의 단계에, iPS 세포 상태 동안, 및/또는 iPS 세포를 iNK 상태로 분화시키는 공정의 임의의 단계에, 예를 들어 중간 단계, 예컨대 iPS 세포-유래된 HSC 상태에서, 또는 심지어 최종 iNK 세포 상태까지 또는 최종 iNK 세포 상태에서 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 iNK 세포에 존재하는 하나 이상의 게놈 편집물은 공여체 세포의 iPS 세포 상태로의 재프로그래밍 전에 제조된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 iNK 세포에 존재하는 모든 편집물은 동시에, 시간적으로 가까이 인접해서, 및/또는 재프로그래밍/분화 공정의 동일한 세포 단계에, 예를 들어, 공여체 세포 단계에, 재프로그래밍 공정 동안, iPS 세포 단계에, 또는 분화 공정 동안 제조된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 iNK 세포에 존재하는 2개 이상의 편집물은 상이한 시점에 및/또는 재프로그래밍/분화 공정의 상이한 세포 단계에 제조된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 편집물은 공여체 세포 단계에 제조되며 상이한 편집물은 iPS 세포 단계에 제조되고; 일부 실시형태에서, 편집물은 재프로그래밍 단계에 제조되고 상이한 편집물은 iPS 세포 단계에 제조된다. 이들 실시예는 본원에서 제공되는 일부 전략을 예시하기 위해 제공되며, 제한하는 것을 의미하지 않는다.
다양한 세포 유형이 변형된 iNK 세포의 유도를 위해 본원에서 제공되는 재프로그래밍, 분화, 및 게놈 편집 전략을 거칠 수 있는 공여체 세포로 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 재프로그래밍, 분화, 및 게놈 편집 전략을 거칠 공여체 세포는 임의의 적합한 세포 유형일 수 있다. 예를 들어, 공여체 세포는 만능 줄기 세포 또는 분화된 세포, 예를 들어, 체세포, 예컨대, 섬유아세포 또는 T 림프구일 수 있다.
일부 실시형태에서, 공여체 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포는 체세포이다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포는 줄기 또는 전구 세포이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 인간 배아의 일부가 아니며 그 유도는 인간 배아의 파괴를 수반하지 않는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 게놈 변경(예를 들어, 면역종양학 치료 접근을 위해 요망되지 않는 유전자의 녹-아웃 및/또는 외인성 핵산, 예를 들어 면역종양학 치료 접근을 위해 요망되는 유전자 산물을 인코딩하는 발현 구축물의 녹-인)을 갖는 iNK 세포, 및 이러한 iNK 세포를 유도하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, iNK 세포는 iPS 세포로부터 유래되며, 이는 결국 신체 공여체 세포로부터 유래된다. 임의의 적합한 체세포가 iPS 세포의 생성에서, 그리고 결국 iNK 세포의 생성에서 사용될 수 있다. 다양한 신체 공여체 세포 유형으로부터 iPS 세포를 유도하기 적합한 전략은 당업계에 기재되었고 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 신체 공여체 세포는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 신체 공여체 세포는 성숙 T 세포이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, iPS 세포, 그리고 이후 iNK 세포가 유래되는 신체 공여체 세포는 발달상 성숙 T 세포(가슴샘 선택을 거친 T 세포)이다. 발달상 성숙 T 세포의 하나의 특질은 재배열된 T 세포 수용체 유전자좌이다. T 세포 성숙 동안, TCR 유전자좌는 V(D)J 재배열을 거쳐 전체 V-도메인 엑손을 생성한다. 이들 재배열은 T 세포의 유도된 만능 줄기(iPS) 세포로의 재프로그래밍을 통해, 그리고 생성 iPS 세포의 체세포로의 분화를 통해 보유된다.
소정의 실시형태에서, 신체 공여체 세포는 CD8+ T 세포, CD8+ 나이브 T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포, CD4+ 효과기 기억 T 세포, CD4+ 효과기 기억 T 세포, CD4+ T 세포, CD4+ 줄기 세포 기억 T 세포, CD8+ 줄기 세포 기억 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+ 나이브 T 세포, TH17 CD4+ T 세포, TH1 CD4+ T 세포, TH2 CD4+ T 세포, TH9 CD4+ T 세포, CD4+ Foxp3+ T 세포, CD4+ CD25+ CD127- T 세포, 또는 CD4+ CD25+ CD127- Foxp3+ T 세포이다.
iPS 세포의 생성을 위해 T 세포를 사용하는 하나의 장점은 T 세포가 상대적으로 용이하게, 예를 들어 CRISPR-기반 방법 또는 다른 유전자-편집 방법에 의해 편집될 수 있다는 것이다. iPS 세포의 생성을 위해 T 세포를 사용하는 또 다른 장점은 재배열된 TCR 유전자좌가 개별 세포 및 이의 딸 세포의 유전적 추적을 허용한다는 것이다. 재프로그래밍, 증식, 배양, 및/또는 분화 전략이 NK 세포의 생성에서 단일 세포의 클론성 증식을 수반하는 경우, 재배열된 TCR 유전자좌는 세포 및 그 딸 세포를 분명하게 확인하는 유전 마커로 사용될 수 있다. 이는 결국, 세포 집단을 실제 클론성으로 특성규명하거나, 혼합된 집단, 또는 클론성 집단에서 오염 세포의 확인을 허용한다.
다수의 편집물을 운반하는 iNK 세포의 생성에서 T 세포를 사용하는 세 번째 장점은 염색체 전위와 연관되는 소정 핵형 이상이 T 세포 배양에 대해 선택된다는 것이다. 이러한 이상은 CRISPR 기술에 의해 세포를 편집하는 경우, 특히 다수의 편집물을 운반하는 세포를 생성하는 경우 우려를 낳는다.
치료 림프구의 유도를 위한 시작점으로 T 세포 유래된 iPS 세포를 사용하는 네 번째 장점은, 예를 들어, 특정 항원, 예를 들어, 종양 항원에 대한 결합 활성에 대해 T 세포를 선택하고, 선택된 T 세포를 iPS 세포로 재프로그래밍한 후, TCR을 발현하는 이들 iPS 세포로부터 림프구(예를 들어, T 세포)를 유도하여, 림프구에서 사전-스크리닝된 TCR의 발현을 허용한다는 것이다. 상기 전략은 또한, 예를 들어, 유전적 또는 후성적 전략에 의해, 다른 세포 유형에서 TCR의 활성화를 허용할 것이다.
iNK 분화를 위한 시작점으로 T 세포 유래된 iPS 세포를 사용하는 다섯 번째 장점은 T 세포가 재프로그래밍 공정을 통해 이의 "후성적 기억"의 적어도 일부를 보유하고, 이에 따라 동일하거나 가깝게 관련된 세포 유형, 예컨대 iNK 세포의 후속 분화가 iNK 유도를 위한 시작점으로 관련되지 않은 세포, 예컨대 섬유아세포를 사용하는 접근에 비해 더 효율적일 것이고/것이거나 더 높은 품질의 세포 집단을 초래할 것이라는 점이다.
소정의 실시형태에서, 조작되는 공여체 세포, 예를 들어, 재프로그래밍되는 세포 및/또는 그 게놈이 편집되는 세포는 장기 조혈 줄기 세포, 단기 조혈 줄기 세포, 다능성 전구 세포, 계통 제한 전구 세포, 림프 전구 세포, 골수 전구 세포, 일반 골수 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 거핵구 적혈 전구 세포, 망막 세포, 광수용체 세포, 막대 세포, 원뿔 세포, 망막 색소 상피 세포, 잔기둥 그물 세포, 달팽이관 털 세포, 외유모 세포, 내유모 세포, 폐 상피 세포, 기관지 상피 세포, 폐포 상피 세포, 폐 상피 전구 세포, 가로무늬근 세포, 심장근 세포, 근육 위성 세포, 뉴론, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 유도된 만능 줄기(iPS) 세포, 배아 줄기 세포, 섬유아세포, 단핵구-유래된 대식구 또는 수지상 세포, 거핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 그물적혈구, B 세포, 예를 들어, 전구 B 세포, 프리(Pre) B 세포, 프로(Pro) B 세포, 기억 B 세포, 혈장 B 세포, 위장관 상피 세포, 담도 상피 세포, 췌장관 상피 세포, 내장 줄기 세포, 간세포, 간 별(stellate) 세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 골모세포, 파골세포, 지방세포, 전지방세포, 췌장 섬 세포(예를 들어, 베타 세포, 알파 세포, 델타 세포), 췌장 외분비 세포, 슈반(Schwann) 세포, 또는 희소돌기아교세포이다.
소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 순환 혈액 세포, 예를 들어, 그물적혈구, 거핵구 적혈 전구(MEP) 세포, 골수 전구 세포(CMP/GMP), 림프 전구(LP) 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC), 또는 내피 세포(EC)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 골수 세포(예를 들어, 그물적혈구, 적혈 세포(예를 들어, 적모세포), MEP 세포, 골수 전구 세포(CMP/GMP), LP 세포, 적혈 전구(EP) 세포, HSC, 다능성 전구(MPP) 세포, 내피 세포(EC), 혈액생성 내피 (HE) 세포, 또는 중간엽 줄기 세포)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 골수 전구 세포(예를 들어, 일반 골수 전구(CMP) 세포 또는 과립구 대식구 전구(GMP) 세포)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 림프 전구 세포, 예를 들어, 일반 림프 전구(CLP) 세포이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 적혈 전구 세포(예를 들어, MEP 세포)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 조혈 줄기/전구 세포(예를 들어, 장기 HSC(LT-HSC), 단기 HSC(ST-HSC), MPP 세포, 또는 계통 제한 전구(LRP) 세포)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 CD34+ 세포, CD34+CD90+ 세포, CD34+CD38- 세포, CD34+CD90+CD49f+CD38-CD45RA- 세포, CD105+ 세포, CD31+, 또는 CD133+ 세포, 또는 CD34+CD90+CD133+ 세포이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 제대혈 CD34+ HSPC, 제대 정맥 내피 세포, 제대 동맥 내피 세포, 양수 CD34+ 세포, 양수 내피 세포, 태반 내피 세포, 또는 태반 조혈 CD34+ 세포이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 가동화된 말초혈 조혈 CD34+ 세포(환자가 가동화제, 예를 들어, G-CSF 또는 플레릭사포르(Plerixafor)로 처리된 후)이다. 소정의 실시형태에서, 공여체 세포는 말초혈 내피 세포이다.
일부 실시형태에서, 공여체 세포는 분열 중인 세포이다. 다른 실시형태에서, 공여체 세포는 분열 중이 아닌 세포이다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 재프로그래밍, 분화, 및 편집 방법 및 전략으로부터 생성되는 변형된 iNK 세포는 이를 필요로 하는 대상체에, 예를 들어, 면역종양학 치료 접근의 맥락에서 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 재프로그래밍, 분화, 및 편집 전략의 임의의 단계의 공여체 세포, 또는 임의의 세포는, 예를 들어, 후속 특성규명 또는 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여를 위해, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양 중에 유지되거나 보관될(예를 들어, 액체 질소 중에 냉동될) 수 있다.
세포 재프로그래밍
증가된 세포 잠재력을 갖는 세포는 재프로그래밍 되지 않은 상태의 동일한 세포에 비해 더 큰 발달 가소성을 갖는다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화될 수 있음). 다시 말하면, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포에 비해 덜 분화된 상태의 세포이다.
본 개시내용의 세포의 재프로그래밍은 몇몇 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 본 개시내용의 체세포를 재프로그래밍하기 위한 일부 방법의 예는 비제한적으로 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Valamehr et al. WO2017/078807 ("Valamehr") 및 Mendlein et al. WO2010/108126("Mendlein")]에 기재된다.
간략하게, 만능 줄기 세포의 확정적 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 방법은 (i) 만능 줄기 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (ii) 중배엽 세포를 BMP 활성화제, bFGF, 및 GSK3 저해제를 포함하는 조성물로서, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포로부터 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iii) 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성화제를 포함하는 조성물로서, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피 잠재력을 갖는 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포로부터 확정적 혈액생성 내피의 분화 및 증식을 시작하는 단계; 및 선택적으로 혈액생성 내피, 및/또는 만능 줄기 세포, 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포, 확정적 혈액생성 내피를 갖는 중배엽 세포를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 긴장 하에 거치는 단계를 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 추가로 만능 줄기 세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물로서, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포를 접종하고 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 나이브 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전적 각인을 포함하며, 여기서 iPSC에 포함되는 하나 이상의 유전적 각인은 이로부터 분화된 만능 중기 세포 유래된 조혈 세포에 보유된다.
만능 줄기 세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 조혈 계통 세포로의 분화는 배아체 발생이 없고, 단층 배양 형태이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 수득되는 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 수득되는 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈액생성 내피 세포는 CD34+CD93-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 추가로 (i) 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피의 프리-T 세포 전구체로의 분화를 시작하는 단계; 및 선택적으로, (ii) 프리-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성화제 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시켜, 프리-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 시작하는 단계를 포함한다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다.
만능 줄기 세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 추가로 (i) 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피의 프리-NK 세포 전구체로의 분화를 시작하는 단계; 및 선택적으로, (ii) 만능 줄기 세포-유래된 프리-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물로서, 배지에 하나 이상의 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성화제 및 ROCK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 프리-NK 세포 전구체의 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 시작하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 NK 전구체는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이며, 선택적으로 NKp46+, CD57+ 및 CD16+에 의해 추가 정의된다.
만능 줄기 세포의 NK 세포로의 분화를 유도하는 상기 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 추가로 만능 줄기 세포에서 유전자 Nrg1을 녹아웃시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포-유래된 T 계통 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는 (i) 만능 줄기 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (ii) 중배엽 세포를 BMP 활성화제, bFGF, 및 GSK3 저해제를 포함하지만 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포로부터 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iii) 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성화제를 포함하는 조성물로서, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 혈액생성 내피의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iv) 확정적 혈액생성 내피를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피의 프리-T 세포 전구체로의 분화를 시작하는 단계; 및 (v) 프리-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물로서, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성화제 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시켜 프리-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 시작하는 단계를 포함하며; 선택적으로, 접종된 만능 줄기 세포, 중배엽 세포, 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포, 및/또는 확정적 혈액생성 내피는 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 긴장을 거칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 그룹 II는 추가로 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하지만 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포를 접종하고 증식시키는 단계를 포함하며 및/또는 만능 줄기 세포. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 나이브 iPSC이다. 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포의 T 세포 계통으로의 분화는 배아체 생성이 없으며, 단층 배양 형태이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포-유래된 NK 계통 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는 (i) 만능 줄기 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (ii) 중배엽 세포를 BMP 활성화제, bFGF, 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포로부터 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iii) 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; ROCK 저해제; 선택적으로 Wnt 경로 활성화제를 포함하고; 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 잠재력을 갖는 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포로부터 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iv) 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피를 ROCK 저해제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로, BMP 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피의 프리-NK 세포 전구체로의 분화를 시작하는 단계; 및 (v) 만능 줄기 세포-유래된 프리-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성화제 및 ROCK 저해제 중 하나 이상이 없는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포-유래된 프리-NK 세포 전구체의 만능 줄기 세포-유래된 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 시작하는 단계; 및 선택적으로, 접종된 만능 줄기 세포, 만능 줄기 세포-유래-중배엽 세포, 및/또는 확정적 혈액생성 내피를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 긴장 하에 거치는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그룹 II의 만능 줄기 세포-유래된 NK 계통 세포를 생성하는 방법은 추가로 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 iPSC를 접종하고 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 나이브 iPSC이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 NK 계통 세포를 생성하는 방법은 배아체의 생성이 없고, 단층 배양 형태이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은 (i) iPSC를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포로부터 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (ii) 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포를 BMP 활성화제, bFGF, 및 GSK3 저해제를 포함하고, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포로부터 확정적 HE 잠재력을 갖는 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iii) 확정적 HE 잠재력을 갖는 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포를 bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; ROCK 저해제; 및 선택적으로 Wnt 경로 활성화제를 포함하며, 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 잠재력을 갖는 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포로부터 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피의 분화 및 증식을 시작하는 단계; 및 선택적으로, 접종된 만능 줄기 세포, 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포, 및/또는 확정적 혈액생성 내피를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 긴장 하에 거치는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 확정적 혈액생성 내피를 생성하는 상기 방법은 추가로 iPSC를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 iPSC를 접종하고 증식시키는 단계를 포함하고/하거나; iPSC는 나이브 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전적 각인을 포함하며, 여기서 iPSC에 포함되는 하나 이상의 유전적 각인은 이로부터 분화된 만능 줄기 세포 유래된 확정적 혈액생성 내피 세포에 보유된다. 일부 실시형태에서, iPSC를 확정적 혈액생성 내피 세포로 분화시키는 상기 방법은 배아체의 생성이 없고, 단층 배양 형태이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 조혈 계통의 만능 줄기 세포-유래된 다능성 전구체를 생성하는 방법을 제공하며, (i) iPSC를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 iPSC로부터 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (ii) 만능 줄기 세포-유래된 중배엽 세포를 BMP 활성화제, bFGF, 및 GSK3 저해제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포로부터 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iii) 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 저해제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성화제를 포함하는 조성물로서, TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포로부터 확정적 혈액생성 내피의 분화 및 증식을 시작하는 단계; (iv) 확정적 혈액생성 내피를 BMP 활성화제, ROCK 저해제, TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피의 프리-HSC로의 분화를 시작하는 단계; 및 (v) 프리-HSC를 BMP 활성화제, TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, ROCK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 프리-HSC의 조혈 다능성 전구체로의 분화를 시작하는 단계; 및 선택적으로, 접종된 만능 줄기 세포, 중배엽 세포, 및/또는 확정적 혈액생성 내피를 약 2% 내지 약 10%의 낮은 산소 긴장 하에 거치는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포-유래된 조혈 다능성 전구체를 생성하는 상기 방법은 추가로 만능 줄기 세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하지만 TGFβ 수용체/ALK 저해제가 없는 조성물과 접촉시켜 만능 줄기 세포를 접종하고 증식시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 나이브 iPSC이다. 일부 실시형태에서, iPSC는 하나 이상의 유전적 각인을 포함하며, 여기서 iPSC에 포함되는 하나 이상의 유전적 각인은 이로부터 분화된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 다능성 전구 세포에 보유된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법을 사용하는 만능 줄기 세포의 조혈 다능성 전구체로의 분화는 배아체의 생성이 없고, 단층 배양 형태이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에서 개시되는 배양 플랫폼으로부터 생성된 하나 이상의 세포 집단: 만능 줄기 세포-유래된 (i) CD34+ 확정적 혈액생성 내피(iCD34)로서, 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 B 세포로의 분화능을 가지며, CD34+CD43-인 iCD34 세포; (ii) 확정적 혈액생성 내피(iHE)로서, CD34+이고, CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73-, 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나인 iHE 세포; (iii) 만능 줄기 세포-유래된 확정적 HSC로서, CD34+CD45+인 iHSC; (iv) 조혈 만능 전구 세포로서, CD34+CD45+인 iMPP; (v) T 세포 전구체로서, CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+인 T 세포 전구체; (vi) T 세포로서, CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+인 T 세포; (vii) NK 세포 전구체로서, CD45+CD56+CD7+인 NK 세포 전구체; (viii) NK 세포로서, CD3-CD45+CD56+이며, 선택적으로 NKp46+, CD57+, 및 CD16+에 의해 추가로 정의되는 NK 세포; (ix) NKT 세포로서, CD45+Vα24Jα18+CD3+인 NKT 세포; 및 (x) B 세포로서, CD45+CD19+인 B 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에서 개시되는 방법을 사용하여 생성되는 하나 이상의 세포주, 또는 클론성 세포: 만능 줄기 세포-유래된 (i) CD34+ 확정적 혈액생성 내피(iCD34)로서, 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포로의 분화능을 가지며, CD34+CD43-인 iCD34 세포; (ii) 확정적 혈액생성 내피(iHE)로서, CD34+이며, CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73-, 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나인 iHE 세포주 또는 클론성 세포; (iii) 확정적 HSC로서, CD34+CD45+인 iHSC; (iv) 조혈 만능 전구 세포(iMPP)로서, CD34+CD45+인 iMPP 세포; (v) T 세포 전구체로서, CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+인 T 세포 전구체; (vi) T 세포로서, CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+인 T 세포; (vii) NK 세포 전구체로서, CD45+CD56+CD7+인 NK 세포 전구체; (viii) NK 세포로서, CD3-CD45+CD56+이며, 선택적으로 NKp46+, CD57+, 및 CD16+에 의해 추가로 정의되는 NK 세포; (ix) NKT 세포로서, CD45+Vα24Jα18+CD3+인 NKT 세포; 및 (x) B 세포로서, CD45+CD19+인 B 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에서 개시되는 방법을 사용하여 생성된 세포 집단, 세포주 또는 클론성 세포: 만능 줄기 세포-유래된 (i) CD34+ 확정적 혈액생성 내피(iCD34)로서, 다능성 전구 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포로의 분화능을 가지며, CD34+CD43-인 iCD34 세포; (ii) 확정적 혈액생성 내피(iHE)로서, CD34+이며, CD43-, CD93-, CXCR4-, CD73-, 및 CXCR4-CD73- 중 적어도 하나인 iHE 세포주 또는 클론성 세포; (iii) 확정적 HSC로서, CD34+CD45+인 iHSC; (iv) 조혈 만능 전구 세포(iMPP)로서, CD34+CD45+인 iMPP 세포; (v) T 세포 전구체로서, CD34+CD45+CD7+ 또는 CD34-CD45+CD7+인 T 세포 전구체; (vi) T 세포로서, CD45+CD3+CD4+ 또는 CD45+CD3+CD8+인 T 세포; (vii) NK 세포 전구체로서, CD45+CD56+CD7+인 NK 세포 전구체; (viii) NK 세포로서, CD3-CD45+CD56+이며, 선택적으로 NKp46+, CD57+, 및 CD16+에 의해 추가로 정의되는 NK 세포; (ix) NKT 세포로서, CD45+Vα24Jα18+CD3+인 NKT 세포; 및 (x) B 세포로서, CD45+CD19+인 B 세포 중 하나 이상을 사용하여 조혈 재생, 재구성 또는 그래프팅을 촉진하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 증강된 치료 특성을 갖는 조혈 계통 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은 하나 이상의 유전적 각인을 포함하는 iPSC를 수득하는 단계; 및 iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 유도된 분화 단계는 추가로 (i) 만능 줄기 세포를 BMP 경로 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포를 수득하는 단계; 및 (ii) 중배엽 세포를 BMP 경로 활성화제, bFGF, 및 WNT 경로 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 수득하는 단계를 포함하며, 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포는 조혈 계통 세포를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 중배엽 세포 및 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포는 배아체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 수득되며, 수득되는 조혈 계통 세포는 확정적 혈액생성 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프리-T 세포 전구 세포, 프리-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 B 세포를 포함한다. 또한, 조혈 계통 세포는 유도된 분화를 위해 iPSC에 포함된 유전적 각인을 보유한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법의 유도된 분화 단계는 추가로 (i) 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 세포를 수득하는 단계; (ii) 확정적 HE 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 수득하는 단계; (iii) 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 하나 이상의 BMP 활성화제, ROCK 저해제, TPO, VEGF 및 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 수득하는 단계; 또는 (iv) 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성화제, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
간략하게, 방법은 성숙 원천 T 또는 B 세포를 재프로그래밍하여 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 수득하는 단계; 및 iPSC 또는 이로부터 유래된 조혈 계통 세포에서, iPSC의 생성을 위해 성숙 T 또는 B 세포에 포함된 것과 동일한 특이적 V(D)J재조합의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 성숙 원천 T 또는 B 세포와 동일한 V(D)J 재조합을 포함하는 iPSC 또는 조혈 계통 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 원천 세포의 재프로그래밍 전에, 재프로그래밍을 위한 성숙 원천 T 또는 B 세포를 수득하는 단계; 및 성숙 원천 T 또는 B 세포에 특이적인 면역글로불린(Ig) 또는 T 세포 수용체(TCR)에 포함되는 V(D)J 재조합을 결정하는 단계를 포함한다.
"만능 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 제제와 조합되어 세포의 발달 잠재력을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 만능 인자는 비제한적으로 세포의 발달 잠재력을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 소분자를 포함한다. 예시적인 만능 인자는, 예를 들어, 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 제제를 포함한다.
비제한적으로 간 및 위(Aoi et al., 2008); 췌장 β 세포(Stadtfeld et al., 2008); 성숙 B 림프구(Hanna et al., 2008); 인간 피부 섬유아세포(Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Lowry et al., 2008; Aasen et al., 2008); 수막조직구(Qin et al., 2008); 신경 줄기 세포(DiSteffano et al., 2008); 및 신경 전구 세포(Eminli et al., 2008)를 포함하는 모든 3개 배엽층으로부터의 여러 다양한 세포 유형이 체세포 재프로그래밍에 적합한 것으로 나타났다. 따라서, 본 개시내용은 부분적으로, 임의의 세포 계통으로부터 세포를 재프로그래밍하고/하거나 프로그래밍하는 방법을 고려한다.
본 개시내용은 부분적으로, 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제와 접촉시켜 세포 잠재력의 결정이나 영향에 연관되는 세포 경로의 구성성분의 후성적 상태, 염색질 구조, 전사, mRNA 스플라이싱, 전사-후 변형, mRNA 안정성 및/또는 반감기, 번역, 번역-후 변형, 단백질 안정성 및/또는 반감기 및/또는 단백질 활성을 조절함으로써 세포의 잠재력을 변경하는 단계를 고려한다.
따라서, 다양한 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에서 다른 곳에 논의되는 바와 같이, 유전자 발현을 위해 예측 가능하고 고도로 제어되는 방법을 사용하며, 이는 생체외 또는 생체내 체세포의 재프로그래밍 또는 탈분화 및 프로그래밍 또는 분화를 가능하게 한다. 그러나 상기 주지된 바와 같이, 세포의 의도적인 유전 조작은 세포 게놈을 변경하며 유전적 또는 후성적 이상을 초래할 수 있을 것이므로, 바람직하지 않다. 대조적으로, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 세포의 재프로그래밍 및/또는 프로그래밍을 달성하기 위해 세포의 내인성 발달 잠재력 경로를 모방함으로써 세포의 잠재력을 비유전적으로 변경하는 억제인자 및/또는 활성화제를 제공한다.
재프로그래밍에서의 소분자
체세포의 유도된 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍은 또한 소분자와 조합된 정의된 유전자(예를 들어, Oct-3/4, Sox-2, Klf-4, c-Myc, 및 Lin28 등)의 레트로바이러스 감염에 의해 달성되었다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제 또는 이를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 잠재력을 변경하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써, 세포의 잠재력을 변경한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 하나 이상의 구성성분을 조절함으로써 세포의 잠재력을 변경한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 잠재력과 연관된 하나 이상의 세포 경로의 하나 이상의 구성성분을 조절함으로써 세포의 잠재력을 변경한다. 소정 관련 실시형태에서, 구성성분(들)의 조절은 상승적이며 세포의 잠재력을 변경하는 전반적 유효성을 증가시킨다. 세포의 잠재력은 배경 잠재력 상태에 비해, 보다 효력 있는 상태로(예를 들어, 분화된 세포로부터 다능성, 만능, 또는 전능 세포로) 또는 덜 효력 있는 상태로(예를 들어, 전능, 만능, 또는 다능성 세포로부터 분화된 체세포로) 변경될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포의 잠재력은 1회 초과 변경될 수 있다. 예를 들어, 세포는 먼저 더 효력 있는 상태로 재프로그래밍된 후 특정 체세포로 프로그래밍될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 잠재력을 증가시키기 위해 제공되며, 여기서 세포는 재프로그래밍되거나 전능 상태로 탈분화되며, 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 전능성과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포의 잠재력을 전능 상태로 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 세포의 잠재력을 만능 상태로 증가시키는 방법은 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포의 잠재력을 만능 상태로 증가시킨다.
또 다른 특정 실시형태에서, 세포의 잠재력을 다능성 상태로 증가시키는 방법은 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포의 잠재력을 다능성 상태로 증가시킨다.
소정의 실시형태에서, 세포의 잠재력을 증가시키는 방법은 추가로 전능 세포, 만능 세포 또는 다능성 세포를 제2 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제2 조성물은 세포의 전능성, 만능성 또는 다능성을 감소시키고 세포를 성숙 체세포로 분화시키는 세포성 잠재력 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절한다.
또 다른 관련 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 세포의 재프로그래밍과 연관된 세포 경로 또는 경로들의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포를 재프로그래밍한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 하나의/하나 이상의 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 보다 효력 있는 상태로 탈분화시키는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 억제인자 및/또는 활성화제는 보다 효력 있는 상태로의 세포의 탈분화와 연관되는 세포 경로 또는 경로들의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포를 효력 없는 상태로 탈분화시킨다.
본 개시내용의 다양한 실시형태에 따르면 억제인자는 항체 또는 항체 단편, 인트라바디, 트랜스바디, DNA자임, ssRNA, dsRNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 프리(pri)-miRNA, shRNA, 안타고미어, 앱타머, siRNA, dsDNA, ssDNA; 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편, 펩타이드모사체, 펩토이드, 또는 유기 소분자일 수 있다. 폴리펩타이드-기반 억제인자는 비제한적으로 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드-기반 억제인자는 또한 전사 억제인자를 포함하며, 이는 추가로 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드 및/또는 인공적으로 설게된 전사 억제인자일 수 있다.
다른 다양한 실시형태에 따르면, 활성화제는 항체 또는 항체 단편, mRNA, 2작용성 안티센스 올리고뉴클레오타이드, dsDNA, 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편, 펩타이드 모사체, 펩토이드, 또는 유기 소분자일 수 있다.
일부 실시형태에서, 억제인자는 a) 적어도 하나의 구성성분을 억제하여; b) 적어도 하나의 구성성분의 억제인자를 탈-억제하여; 또는 c) 적어도 하나의 구성성분의 활성화제를 억제하여 세포성 잠재력 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절한다. 관련 실시형태에서, 하나 이상의 억제인자는 a) 적어도 하나의 구성성분을 탈-억제하여; b) 적어도 하나의 구성성분의 억제인자를 억제하여; 또는 c) 적어도 하나의 구성성분의 활성화제를 탈-억제하여, 세포의 잠재력과 연관된 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 억제인자는 a) 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 억제하거나 적어도 하나의 구성성분의 후성적 상태, 염색질 구조, 전사, mRNA 스플라이싱, 전사-후 변형, mRNA 안정성 및/또는 반감기, 번역, 번역-후 변형, 단백질 안정성 및/또는 반감기 및/또는 단백질 활성을 억제하여; 또는 b) 탈메틸효소를 탈억제하거나 적어도 하나의 구성성분의 후성적 상태, 염색질 구조, 전사, mRNA 스플라이싱, 전사-후 변형, mRNA 안정성 및/또는 반감기, 번역, 번역-후 변형, 단백질 안정성 및/또는 반감기 및/또는 단백질 활성을 활성화하여, 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절한다.
관련 실시형태에서, 활성화제는 a) 적어도 하나의 구성성분을 활성화하여; b) 적어도 하나의 구성성분의 억제인자의 억제인자를 활성화하여; 또는 c) 적어도 하나의 구성성분의 활성화제를 활성화하여, 세포의 잠재력과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절한다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 활성화제는 a) 히스톤 탈메틸효소를 활성화하거나 적어도 하나의 구성성분의 후성적 상태, 염색질 구조, 전사, mRNA 스플라이싱, 전사-후 변형, mRNA 안정성 및/또는 반감기, 번역, 번역-후 변형, 단백질 안정성 및/또는 반감기 및/또는 단백질 활성을 활성화하여; 또는 b) 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 억제인자를 활성화하거나 적어도 하나의 구성성분의 후성적 상태, 염색질 구조, 전사, mRNA 스플라이싱, 전사-후 변형, mRNA 안정성 및/또는 반감기, 번역, 번역-후 변형, 단백질 안정성 및/또는 반감기 및/또는 단백질 활성의 억제인자를 활성화하여 적어도 하나의 구성성분을 조절한다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 부분적으로, 세포를 하나 이상의 억제인자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법을 고려하며, 여기서 하나 이상의 억제인자는 세포의 재프로그래밍과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포를 재프로그래밍한다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 부분적으로, 세포를 하나 이상의 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법을 고려하며, 여기서 하나 이상의 활성화제는 세포의 재프로그래밍과 연관된 세포 경로의 적어도 하나의 구성성분을 조절함으로써 세포를 재프로그래밍한다.
재프로그래밍/NK 세포 분화를 위한 일부 예시적인 방법이 본원에서 제공되지만, 이들은 예시적이며 본 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 재프로그래밍/NK 세포 분화를 위한 추가적인 적합한 방법은 당업계의 지식 측면에서 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다.
영양세포층 상에서 또는 영양세포층 세포와 함께 NK 세포를 배양하는 방법은, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[EP3184109, Valamehr et al.("Valamehr")]에 상세히 기재된다.
일반적으로, 임의의 유형의 NK 세포 집단이 다양한 방법 및 장치를 사용하여 배양될 수 있다. 배양 기구의 선택은 보통 배양 규모 및 목적에 기반한다. 세포 배양의 스케일 업은 바람직하게는 전용 장치의 사용을 수반한다. 대규모, 임상 등급 NK 세포 생산을 위한 기구는, 예를 들어 문헌[Spanholtz et al. (PLoS ONE 2010;5:e9221) 및 Sutlu et al. (Cytotherapy 2010, Early Online 1-12)]에 상세히 제공된다.
NK 세포 집단의 생체외 배양을 위해 본원에서 상술되는 방법은, 특히, 배양된 NK 세포 집단을 초래할 수 있다.
편집물의 유형
본 개시내용의 일부 양태는 복합 편집 전략, 및 복합 게놈 변경을 갖는 생성 NK 세포를 제공하며, 이는 임상 적용을 위한, 예를 들어, 면역종양학 치료 접근을 위한 진보된 NK 세포 산물의 생성을 허용한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 고증식성 질병, 예컨대, 암을 갖거나 이를 갖는 것으로 진단받은 환자에 대한 기성 임상 해결책으로 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 NK 세포는 변형되지 않은 NK 세포에 비해 증강된 생존, 증식, NK 세포 반응 수준, NK 세포 반응 기간, NK 세포 고갈에 대한 저항성, 및/또는 표적 인식을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 변형된 NK 세포에서 관심 키메라 항원 수용체(CAR), 예를 들어, 메조텔린, EGFR, HER2 및/또는 MICA/B를 표적화하는 CAR의 발현; CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현; IL15/IL15RA 융합물의 발현; TGF 베타 수용체 2(TGF베타R2)의 기능-상실; 및/또는 TGF베타R2의 우성-음성 변이체의 발현; ADORA2A의 기능-상실; B2M의 기능-상실; HLA-G의 발현: CIITA의 기능-상실; PD1의 기능-상실; TIGIT의 기능-상실; 및/또는 CISH의 기능-상실; 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 가용성 MICA 및/또는 MICB의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 가용성 MICA 및/또는 MICB의 발현, 외인성 IL-12의 발현, 외인성 IL-18의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는 외인성 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16의 발현, 외인성 IL15/IL15RA 융합물의 발현, 외인성 HLA-G의 발현, 외인성 DN-TGF베타R2의 발현, 외인성 IL-12의 발현, 외인성 IL-18의 발현, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실을 초래하는 게놈 편집물을 포함할 수 있다.
변형된 NK 세포는 표적 유전자에서 기능-상실을 초래하는 이의 게놈 내 하나 이상의 편집물, 및/또는 외인성 핵산 구축물로부터, 예를 들어, 변형된 NK 세포의 게놈 내에 통합되거나 염색체외 방식으로, 예를 들어 에피솜 발현 구축물 형태로 제공되는 유전자 산물을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 구축물로부터, 유전자 산물, 예를 들어, 단백질의 기능-획득, 또는 과발현을 초래하는 하나 이상의 변형을 나타낼 수 있다.
표적 유전자의 기능-상실은 게놈 변형, 예를 들어, 인코딩되는 유전자 산물의 불활성화, 또는 감소된 발현 또는 기능을 초래하는 표적 유전자 내 RNA-가이드 뉴클레아제-매개 절단에 기반하는 표적 유전자 발현의 감소를 특징으로 한다.
유전자 산물의 기능-획득은 세포 내 유전자 산물, 예를 들어, 단백질의 증가된 발현(본원에서 과발현으로도 지칭됨)을 특징으로 하며, 이는, 예를 들어, 유전자 산물의 증가된 발현 수준, 또는 내인성으로, 예를 들어, 내인성 유전자로부터 유전자 산물을 발현하지 않는 세포에서 유전자 산물의 발현을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 산물의 증가된 발현은 세포 내로 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 핵산 구축물, 예를 들어, 이종성 프로모터의 제어 하에 유전자 산물을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 외인성 핵산 구축물을 도입하여 가져온다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산 구축물은, 예를 들어, 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, HDR-매개 유전자 편집을 통해, 특이적 유전자좌 내로 통합된다. 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 기술을 통해, 기능-상실 편집물을 가져오는 방법 뿐만 아니라 유전자 산물의 증가된 발현을 가져오는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 그 중 하나 이상이 과발현될 수 있는, 일부 예시적인 유전자 산물을 아래에서 표 10에 제공한다:
[표 10]
Figure pct00050
본 개시내용의 일부 실시형태에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 그 중 하나 이상이 기능-상실을 나타내도록 변형되는, 일부 예시적인 표적 유전자를 아래에서 표 11에 제공한다:
[표 11]
Figure pct00051
본 개시내용은 조합된 표 7 및 표 8에 열거된 유전자 산물의 임의의 편집물 및/또는 증가된 발현을 나타내는 변형된 NK 세포 뿐만 아니라 이들 표에 열거된 유전자 산물의 이러한 편집물 및/또는 증가된 발현의 임의의 조합을 포괄한다. 예를 들어, 본 개시내용이 표 10 또는 표 11에 열거된 단일 편집물, 예를 들어, ADORA2A의 기능 상실, 또는 B2M의 기능 상실, 또는 HLA-G의 증가된 발현 등을 포함하는 변형된 NK 세포가 제공되는 실시형태를 포괄함이 이해되어야 한다. 본 개시내용이 표 표 11에 열거된 단일 편집물 및 표 10에 열거된 유전자 산물의 증가된 발현, 예를 들어, ADORA2A의 기능 상실 또는 B2M의 기능 상실; 및 증가된 HLA-G의 발현을 포함하는 변형된 NK 세포가 제공되는 실시형태를 포괄함이 이해되어야 한다. 또한 본 개시내용이 표 11에 열거된 2개 이상의 편집물, 및 표 10에 열거된 단일 유전자 산물의 증가된 발현을 포함하는 변형된 NK 세포가 제공되는 실시형태를 포괄함이 이해되어야 한다. 또한 본 개시내용이 표 11에 열거된 단일 편집물, 및 표 10에 열거된 2개 이상의 유전자 산물의 증가된 발현을 포함하는 변형된 NK 세포가 제공되는 실시형태를 포괄함이 이해되어야 한다. 또한 또한 본 개시내용은 표 11에 열거된 2개 이상의 편집물, 및 표 10에 열거된 2개 이상의 유전자 산물의 증가된 발현을 포함하는 변형된 NK 세포가 제공되는 실시형태를 포괄함이 이해되어야 한다.
본 개시내용에 의해 포괄되는 변형된 NK 세포의 일부 구성을 예시하기 위해, 일부 예시적인, 비제한적인 실시형태가 아래에 그리고 본원에서 다른 곳에 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A의 기능-상실을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, B2M의 기능-상실을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TGFbRII의 기능-상실을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, hnCD16의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, CAR, 예를 들어, Her2, EGFR, 알파 폴레이트 수용체, CEA, cMET, MUC1, 메조텔린, ROR1, 또는, 예를 들어, 본원에서 개시되거나 달리 당업계에 공지된 상이한 표적에 결합하는 CAR의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, HLA-G의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 hnCD16의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 CAR, 예를 들어, Her2, EGFR, 알파 폴레이트 수용체, CEA, cMET, MUC1, 메조텔린, ROR1, 또는 예를 들어, 본원에서 개시되거나 달리 당업계에 공지된 상이한 표적에 결합하는 CAR의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 HLA-G의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 hnCD16 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 CAR, 예를 들어, Her2, EGFR, 알파 폴레이트 수용체, CEA, cMET, MUC1, 메조텔린, ROR1, 또는 예를 들어, 본원에서 개시되거나 달리 당업계에 공지된 상이한 표적에 결합하는 CAR, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 HLA-G 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A, CISH, 및 B2M의 기능-상실, 및 hnCD16 및 HLA-G의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질, HLA-G, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 및 B2M의 기능-상실, 및 hnCD16 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 및 B2M의 기능-상실, 및 CAR, 예를 들어, Her2, EGFR, 알파 폴레이트 수용체, CEA, cMET, MUC1, 메조텔린, ROR1, 또는 예를 들어, 본원에서 개시되거나 달리 당업계에 공지된 상이한 표적에 결합하는 CAR, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 및 B2M의 기능-상실, 및 HLA-G 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT, CISH, 및 B2M의 기능-상실, 및 hnCD16 및 HLA-G의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, TIGIT 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질, HLA-G, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, ADORA2A, TIGIT, PD-1, 및 B2M의 기능-상실, 및 단일-사슬 IL-15/IL-15R 융합물 단백질, HLA-G, 및 우성-음성 TGFbRII 변이체의 기능-획득을 나타내는 변형된 NK 세포가 제공된다.
본원에서 제공되는 예시적인 실시형태는 본 개시내용에 의해 포괄되는 NK 세포의 일부 예를 예시하려는 것임이 이해되어야 한다. 간결성을 위해 본원에 상세히 기재되지 않은 추가적인 구성이 포괄되지만, 이러한 실시형태는 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 바로 명백할 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 (CAR"은 CAR을 발현하는 세포에 특이적 단백질을 표적화하는 새로운 능력을 제공하도록 변형된 수용체 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, CAR을 포함하도록 변형된 NK 세포는 질병 또는 장애에 연관된 세포, 예를 들어, 암 세포를 표적화하고 파괴하는 면역치료법을 위해 사용될 수 있다.
관심 CAR은 비제한적으로 메조텔린, EGFR, HER2 및/또는 MICA/B를 표적화하는 CAR을 포함한다. 현재까지, 메조텔린-표적화 CAR T-세포 치료법은 중피종, 비-소세포 폐암, 및 유방암을 갖는 대상체의 I상 임상 시험(NCT02414269)에서 유효성의 조기 증거를 나타내었다. 유사하게, EGFR, HER2 및 MICA/B를 표적화하는 CAR은 초기 연구에서 전망을 나타내었다(예를 들어, 각각의 전체 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Li et al. (2018), Cell Death & Disease, 9(177); Han et al. (2018) Am. J. Cancer Res., 8(1):106-119; 및 Demoulin 2017) Future Oncology, 13(8)] 참고).
CAR은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 각각의 전체 내용의 전문이 본원에 명시적으로 참조로 포함되는 WO13/063419(메조텔린), WO15/164594(EGFR), WO13/063419(HER2), WO16/154585(MICA 및 MICB)에 기재된 것들을 포함한다. 세포, 예를 들어, NK 세포를 표적 세포, 예를 들어, 질병 또는 장애와 연관된 세포로 표적화하는 임의의 적합한 CAR, NK-CAR, 또는 다른 결합제가 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 발현될 수 있다. 예시적인 CAR, 및 결합제는 비제한적으로 BCMA, CD19, CD22, CD20, CD33, CD123, 안드로겐 수용체, PSMA, PSCA, Muc1, HPV 바이러스 펩타이드(즉 E7), EBV 바이러스 펩타이드, CD70, WT1, CEA, EGFRvIII, IL13Rα2, 및 GD2, CA125, CD7, EpCAM, Muc16, CD30에 결합하는 CAR 및 결합제를 포함한다. 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 사용하기 위한 추가적인 적합한 CAR 및 결합제는 본 개시내용 및 당업계의 일반 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 추가적인 적합한 CAR은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Davies and Maher, Adoptive T-cell Immunotherapy of Cancer Using Chimeric Antigen Receptor-Grafted T Cells, Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 58(3):165-78 (2010)]의 도 3에 기재된 것들을 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 NK 세포는, 일부 실시형태에서, CAR 및 CD16 변이체, 예를 들어, hnCD16, 또는 CAR 및 CD16 비함유 변이체를 포함할 수 있다. CD16, 또는 이의 변이체를 발현하는 임의의 세포가 모노클로날 항체, 예를 들어 암 치료법에서 사용되는 모노클로날 항체와의, 또는 병리적 세포를 표적화하는 Fc 융합 단백질과의 조합 치료법에 적합할 것이다.
녹인(Knock-In) 및 녹아웃(Knock-Out)
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 외인성 hnCD16, 외인성 IL-15, 외인성 IL-15RA, TGF베타R2의 기능 상실, 외인성 DN-TGF베타R2, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 세포는 B2M의 기능 상실, 외인성 HLA-G, CIITA의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 또는 CISH의 기능 상실을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 외인성 hnCD16, 외인성 IL-15, 외인성 IL-15RA, 외인성 HLA-G, 외인성 DN-TGF베타R2, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 외인성 hnCD16, 외인성 IL-15, 외인성 IL-15RA, 외인성 HLA-G, 외인성 DN-TGF베타R2, 가용성 MICA 및/또는 MICB, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 외인성 hnCD16, 외인성 IL-15, 외인성 IL-15RA, 외인성 HLA-G, 외인성 DN-TGF베타R2, 외인성 IL-12, 외인성 IL-18, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포는 외인성 hnCD16, 외인성 IL-15, 외인성 IL-15RA, 외인성 HLA-G, 외인성 DN-TGF베타R2, 외인성 IL-12, 외인성 IL-18, 가용성 MICA 및/또는 MICB, TGF베타R2의 기능 상실, B2M의 기능 상실, PD1의 기능 상실, TIGIT의 기능 상실, 및/또는 ADORA2A의 기능 상실 중 하나 이상을 발현할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현한다" 또는 "발현"은 전사 및 번역을 포함하는, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 공정을 지칭한다. 발현은, 예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 수 증가, 유전자의 전사 증가(예컨대 구성적 프로모터의 제어 하에 유전자를 배치함으로써), 유전자의 번역 증가, 경쟁적 유전자의 녹아웃, 또는 이들 및/또는 다른 접근의 조합을 포함하는, 여러 접근에 의해 증가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "녹인"은 세포의 유전적 유전자좌 내로의 표적 유전자의 부가를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "녹아웃"은 표적 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 지칭하며, 여기서 표적 유전자의 산물은 기능 상실을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "기능 상실"은 표적 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 지칭하며, 여기서 유전자 산물은 더 적은 기능을 갖거나, 기능을 갖지 않는다(부분적으로 또는 전체적으로 불활성화됨). 본원에서 사용되는 용어 "전체 기능 상실"은 표적 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 지칭하며, 여기서 유전자 산물은 기능을 갖지 않는다(전체적으로 불활성화됨).
본원에서 사용되는 용어 "hnCD16a"는 CD16의 고친화도, 절단 불가능한 변이체(항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 수반되는 저친화도 Fcγ 수용체를 지칭한다. 전형적으로, CD16은 ADCC 동안 절단된다 - hnCD16 CAR은 상기 절단을 거치지 않으며, 이에 따라 ADCC 신호가 더 길게 지속된다. 일부 실시형태에서, hnCD16a는 그 전체 내용이 본원에 명시적으로 참조로 포함되는 문헌[Blood 2016 128:3363]에 개시된다.
본원에서 사용되는 용어 "MICA/B"는 MHC 클래스 I 사슬-관련 단백질 A(MICA) 및 B(MICB)를 지칭하며 세포의 스트레스, 손상 또는 (악성) 암화 시 유도되는 다형태 단백질이고, 세포독성 림프구 상에서 발현되는 자연-살해 그룹 2, 구성원 D 수용체를 통해 '킬 미(kill me)' 신호로 작용한다. MICA/B는 건강한 정상 세포에 의해서는 구성적으로 발현되는 것으로 여겨지지는 않지만, 대부분의 종양 유형에 있어서 발현이 보고되었다. MICA에 대한 예시적인 서열은 NG_034139.1에 제공되며, MICB에 대한 예시적인 서열은 NG_021405.1에 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "AAVSI"은 Adeno 연관된 통합 부위 1을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "2A"는 자가-절단성 2A 펩타이드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "TGFβRII" 또는 "TGF베타R2"는 단백질 키나제 도메인을 갖고, TGF-베타 수용체 유형-1과 이종이량체성 복합체를 형성하고, TGF-베타에 결합하는 막통과 단백질을 지칭한다. 상기 수용체/리간드 복합체는 단백질을 인산화하고, 이어서 핵에 들어가 세포 증식, 세포 주기 정지, 상처 치유, 면역억제, 및 종양발생에 관련된 유전자의 전사를 조절한다. TGFβRII의 예시적인 서열을 KR710923.1, NM_001024847.2, 및 NM_003242.5에 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "DN-TGFβRII"는 우성 음성 TGF 베타 수용체 II(NK-특이적 프로모터로부터 발현될 수 있음)를 지칭한다 TGFβRII는 T-세포 분화에서 중요한 역할을 담당하며, iPSC에서의 KO는 CD34+ 분화를 예방할 것이다; KO는 이후 수행되어야 할 것이지만, DN은 NK 특이적 프로모터로부터 발현될 수 있다(CD34+ 분화 후 턴-온(turn on)될 것임). 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII는 그 전체 내용이 본원에 명시적으로 참조로 포함되는 문헌[Immunity. 2000 Feb;12(2):171-81]에 개시된다.
TGF-β의 효과에 대해 스스로 보호하기 위해 종양 세포에 의해 사용되는 전략은 종양-분비 TGF-β의 저해-효과로부터 종양-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)를 차폐하도록 조작될 수 있다. 우성 음성 TGF 베타 수용체 II(예를 들어, TGFβRIIDNR 서열)를 발현하는 종양-특이적 CTL은 TGF-β-분비 종양의 존재 하에 변형되지 않은 CTL에 비해 선택적인 기능적 및 생존 장점을 갖는다(Bollard et al., 2002 Blood. 2002 May 1;99(9):3179-87; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 DN-TGFβRII 구축물을 발현한다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 EF1a 장형 프로모터에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 스트렙토코쿠스 피오게네스 gRNA를 사용함으로써 ADORA2A 유전자좌 내로 녹킹된다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 TGFβRIIDNR 서열, 그 바로 뒤에 2A 서열, 그리고 이어서 추가로 절단된 EGFR 서열(EGFRt)을 포함하여, 구축물을 효율적으로 발현하는 세포를 추적할 수 있도록 한다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 장형 단일 가닥 DNA 분자로 생산된다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 RNP로 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, DN-TGFβRII 구축물은 AAV 전달에 의해(예를 들어, AAV6를 통해) 세포에 전달된다.
CD56으로도 불리는, 본원에서 사용되는 용어 "신경 세포 접착 분자"(NCAM)는 뉴론, 아교세포 및 골격근 그리고 조혈계의 소정 세포의 표면 상에서 발현되는 호모필릭(homophilic) 결합 당단백질을 지칭한다. CD56의 발현은 비제한적으로, 자연 살해 세포와 연관되다. NCAM에 대한 예시적인 서열은 NM_000615.6, NM_181351.4, NM_001076682.3, NM_001242608.1, 및 NM_001242607.1에서 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "CISH"는 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질을 지칭하며, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Delconte et al., Nat Immunol. 2016 Jul;17(7):816-24]을 참고한다. CISH에 대한 예시적인 서열은 NG_023194.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "IL-15/IL15RA" 또는 "인터류킨-15"(IL-15)는 인터류킨-2(IL-2)와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인을 지칭한다. IL-2와 유사하게, IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬(CD122) 및 공통 감마 사슬(감마-C, CD132)로 이루어진 복합체에 결합하고 이를 통해 신호를 전달한다. IL-15는 바이러스(들)에 의한 감염 후 단핵 식세포(및 일부 다른 세포)에 의해 분비된다. 상기 사이토카인은 그 주요 역할이 바이러스 감염된 세포를 사멸시키는 것인 선천성 면역계의 세포인, 자연 살해 세포의 세포 증식을 유도한다. IL-15 수용체 알파(IL15RA)는 매우 높은 친화도로 IL15에 특이적으로 결합하며, 다른 서브유닛과 독립적으로 IL-15에 결합할 수 있다. 상기 특성은 IL-15가 하나의 세포에 의해 생산되고, 또 다른 세포에 의해 세포내 이입된 후 제3 세포로 제시될 수 있도록 함이 제시된다. IL15RA는 세포 증식 및 아폽토시스 저해제 BCL2L1/BCL2-XL 및 BCL2의 발현을 증강시키는 것으로 보고된다. IL-15의 예시적인 서열은 NG_029605.2에 제공되며, IL-15RA의 예시적인 서열은 NM_002189.4에 제공된다.
IL-15는 NK 세포 성장의 촉진 및 기억 T 세포의 항상적 유지에서 핵심 사이토카인이다. IL-15 및 그 수용체 사슬, IL-15Ra는 NK 생존을 위해 필수적이며 조절 T 세포를 자극하지 않는다. IL-15/IL-15Ra는 IL-2 수용체의 베타 및 감마 서브유닛에 결합함으로써 JAK1/3 및 STAT5를 활성화한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포(예를 들어, NK 세포)는 외인성 IL-15/IL-15Ra를 발현한다. 일부 실시형태에서, 외인성 IL-15/IL-15Ra는 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Imamura et al., Blood. 2014 Aug 14;124(7):1081-8 및 Hurton LV et al., PNAS, 2016]에 기재된 바와 같이, 막-결합 IL15.IL15Ra 복합체로 발현된다. 일부 실시형태에서, 외인성 IL-15/IL-15Ra는 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Mortier E et al, JBC 2006; Bessard A, Mol Cancer Ther 2009; 및 Desbois M, JI 2016]에 기재된 바와 같이, 가용성 IL15Ra.IL15 복합체로 발현된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포(예를 들어, NK 세포)는 막-결합 IL15.IL15Ra 복합체 및 가용성 IL15Ra.IL15 복합체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포(예를 들어, NK 세포)는 절단 가능한 링커를 갖는 IL15.IL15Ra 복합체의 막-결합 형태를 발현한다. CISH의 녹아웃은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Delconte P, Nat Immunol 2016]에 기재된 바와 같이, IL-15 신호전달의 추가 촉진과 연관된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포(예를 들어, NK 세포)는 CISH의 기능 상실을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포(예를 들어, NK 세포)는 외인성 IL-15/IL-15Ra 및 CISH의 기능 상실을 발현한다.
본원에서 사용되는 용어 "ADORA2A"는 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질(G 단백질)-커플링 수용체(GPCR) 수퍼패밀리의 구성원을 인코딩하는 아데노신 A2A 수용체를 지칭하며, 이는 클래스 및 서브타입으로 세분된다. 수용체는 세포외 신호에 반응하고 세포내 신호 전달 경로를 활성화하는 7회-통과 막통과 단백질이다. A2A 서브타입의 아데노신 수용체인 상기 단백질은 바람직한 내인성 작용제로 아데노신을 사용하며 G 단백질의 G(s) 및 G(olf) 패밀리와 우선적으로 상호작용하여 세포내 cAMP 수준을 증가시킨다. 이는 여러 생물학적 기능, 예컨대 심장 율동 및 순환, 뇌 및 신장 혈류, 면역 기능, 통증 조절, 및 수면에서 중요한 역할을 담당한다. 이는 병태생리적 상태, 예컨대 염증성 질병 및 신경변성 장애에 연루되었다. ADORA2a의 예시적인 서열이 NG_052804.1에 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "B2M"(β2 마이크로글로불린)은 거의 모든 핵화 세포의 표면 상에서 주 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 중쇄와 연합하여 확인되는 혈청 단백질을 지칭한다. 단백질은 일부 병리적 상태에서 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 있는 우선적으로 베타-주름 시트 구조를 갖는다. 인코딩되는 항균 단백질은 양수에서 항균 활성을 나타낸다. B2M에 대한 예시적인 서열을 NG_012920.2로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CD32B"는 인간에서, FCGR2B 유전자에 의해 인코딩되는, 저친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 그 전체 내용이 참조로 포함되는 문헌[Rankin-CT et al., CD32B, the human inhibitory Fc-gamma receptor IIB, as a target for monoclonal antibody therapy of B-cell lymphoma. Blood 2006 108(7):2384-91]을 참고한다.
때때로 "인테그린 연관된 단백질"(IAP)로도 지칭되는, 본원에서 사용되는 용어 "CD47"은 인간에서 CD47 유전자에 의해 인코딩되는 막통과 단백질을 지칭한다. CD47은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하며, 막 인테그린과 파트너를 이루고, 또한 리간드 트롬보스폰딘-1(TSP-1) 및 신호-조절 단백질 알파(SIRPα)에 결합한다. CD47은 대식구에 CD47-발현 세포가 대식구 공격을 탈출할 수 있도록 하는 신호로 작용한다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Deuse-T, et al., Nature Biotechnology 2019 37: 252-258]을 참고한다.
본원에서 사용되는 용어 "HLA-E"는 때때로 MHC 클래스 I 항원 E로도 지칭되는, HLA 클래스 I 조직 적합성 항원, 알파 사슬 E를 지칭한다. 인간에서 HLA-E 단백질은 HLA-E 유전자에 의해 인코딩된다. 인간 HLA-E는 제한된 다형성 및 그 전통적 파라로그(paralogue)보다 낮은 세포 표면 발현을 특징으로 하는 비-전통적 MHC 클래스 I 분자이다. 상기 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄(베타-2 마이크로글로불린)로 구성되는 이종이량체이다. 중쇄는 막에 부착된다. HLA-E는 다른 클래스 I 분자의 리더 펩타이드로부터 유래된 펩타이드의 제한된 하위세트에 결합한다. HLA-E 발현 세포는 동종이형 반응으로부터 탈출하고 NK 세포에 의해 용해된다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Geornalusse-G et al., Nature Biotechnology 2017 35(8)]을 참고한다. HLA-E 단백질의 예시적인 서열이 NM_005516.6에 제공된다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자는 본원에서 제공되는 변형된 림프구에서, 예를 들어, 게놈 편집에 의해, 녹아웃된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, HLA-DQA1, HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DMA, HLA-DQA2, 및 HLA-DOA로부터 선택되는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자가 녹아웃된다. 또 다른 예에 있어서, 일부 실시형태에서, HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB3, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, 및 HLA-DRB5로부터 선택되는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자가 녹아웃된다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Crivello et al., J Immunol January 2019, ji1800257; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1800257]을 참고한다.
본원에서 사용되는 용어 "HLA-G"는 HLA 비-전통적 클래스 I 중쇄 파라로그를 지칭한다. 상기 클래스 I 분자는 중쇄 및 경쇄(베타-2 마이크로글로불린)로 구성되는 이종이량체이다. 중쇄는 막에 부착된다. HLA-G는 태아 유래된 태반 세포 상에서 발현된다. HLA-G는 NK 세포 저해 수용체 KIR2DL4에 대한 리간드이며, 이에 따라 영양막에 의한 상기 HLA의 발현은 이를 NK 세포-매개 사멸에 대해 방어한다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Favier et al., Tolerogenic Function of Dimeric Forms of HLA-G Recombinant Proteins: A Comparative Study In Vivo PLOS One 2011]을 참고한다. HLA-G의 예시적인 서열을 NG_029039.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CIITA"는 클래스 II 주 조직 적합성 복합체 유전자 전사의 양성적 조절인자로 작용하는 핵에 위치하는 단백질을 지칭하며, 이들 유전자의 발현을 위한 "마스터 제어 인자"로 지칭된다. 단백질은 또한 GTP에 결합하며 그 자신의 핵내 수송을 용이하게 하기 위해 GTP 결합을 사용한다. 일단 핵에 들어가면 DNA에 결합하지 않고 내인성 아세틸트랜스퍼라제(AT) 활성을 사용하여 공동-활성화제-유사 방식으로 작용한다. 상기 유전자에서의 돌연변이는 무표지 림프구 증후군 유형 II(선천성 MHC 클래스 II 결핍 또는 HLA 클래스 II-결손 복합 면역결핍으로도 공지됨), 류마티스 관절염에 대해 증가된 취약성, 다발 경화증, 및 가능하게는 심근 경색과 연관되었다. 예를 들어, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Chang et al., J Exp Med 180:1367-1374; 및 Chang et al., Immunity. 1996 Feb;4(2):167-78]을 참고한다. CIITA의 예시적인 서열을 NG_009628.1로 나타낸다.
CD279(분화 클러스터 279)로도 공지된, 본원에서 사용되는 용어 "PD1" 세포 예정사 단백질 1은 면역계를 하향조절함으로써 인체 세포에 대한 면역계의 반응을 조절하고 T 세포 염증 활성을 억제함으로써 자가-관용성을 촉진하는 데 역할을 갖는 세포 표면 상에서 확인되는 단백질을 지칭한다. 이는 자가면역 질병을 예방하지만, 면역계가 암 세포를 사멸시키는 것도 예방할 수 있다. PD-1은 2가지 기전을 통하는 자가면역에 대한 면역 체크포인트 및 가드이다. 첫 번째로, 이는 림프절에서 항원-특이적 T-세포의 아폽토시스(세포 예정사)를 촉진한다. 두 번째로, 이는 조절 T 세포(항염증성, 억제성 T 세포)에서 아폽토시스를 감소시킨다. PD1에 대한 예시적인 서열을 NM_005018.3으로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "TIGIT"은 면역글로빈 단백질의 PVR(폴리오바이러스 수용체) 패밀리의 구성원을 지칭한다. 상기 유전자의 산물은 소포 B 헬퍼 T 세포(TFH)를 포함하는 몇몇 클래스의 T 세포 상에서 발현된다. 단백질은 고친화도로 PVR에 결합하는 것으로 나타났다; 상기 결합은 T 세포 의존적 B 세포 반응을 조절하기 위한 TFH 및 수지상 세포 간 상호작용을 보조하는 것으로 여겨진다. TIGIT에 대한 예시적인 서열을 NM_173799.4에 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "NLRC5"는 면역계에서 역할을 담당하는 NOD-유사 수용체 패밀리 CARD 도메인 함유 5 세포내 단백질을 지칭한다. NLRC5는 인터페론 활성을 조절함으로써 잠재적으로 바이러스에 대한 선천성 면역성에 연루되는 패턴 인식 수용체이다. NLRC5에 대한 예시적인 서열을 NM_032206.4로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CTLA4"는 T 세포에 저해 신호를 전송하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질은 V 도메인, 막통과 도메인, 및 세포질 꼬리를 함유한다. CTLA4에 대한 예시적인 서열을 AF414120.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "LAG3"은 림프구-활성화 단백질 3을 지칭하며, 이는 Ig 수퍼패밀리에 속하고 4개의 세포외 Ig-유사 도메인을 함유한다. LAG3에 대한 예시적인 서열을 NM_002286.6으로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CBLB"는 유비퀴틴을 E2 유비퀴틴-접합 효소로부터 기질로 전달함으로써 프로테오좀-매개 단백질 분해를 촉진하는 E3 유비퀴틴-단백질 리가제를 지칭한다. 인코딩되는 단백질은 T-세포 수용체, B-세포 수용체, 및 고친화도 면역글로불린 엡실론 수용체 활성화를 제한함으로써 면역 반응의 조절에 수반된다. CBLB에 대한 예시적인 서열을 KR709533.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "NKG2A"는 NKG2 패밀리로도 불리는, 살해 세포 렉틴-유사 수용체 패밀리에 속하는 단백질을 지칭하며, 이는 NK 세포에서 우선적으로 발현되는 일군의 막통과 단백질이다. 상기 단백질 패밀리는 유형 II 막 배향 및 C-유형 렉틴 도메인의 존재를 특징으로 한다. 상기 단백질은 또 다른 패밀리 구성원인 KLRD1/CD94와 복합체를 형성하며, NK 세포에서 MHC 클래스 I HLA-E 분자의 인식에 연루되었다. 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kamiya-T et al., J Clin Invest 2019 https://doi.org/10.1172/JCI123955]을 참고한다. NKG2A에 대한 예시적인 서열을 AF461812.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "CCR5"는 베타 케모카인 수용체 패밀리의 구성원을 지칭하며, 이는 G 단백질-커플링 수용체와 유사한 7회 막통과 단백질로 예측된다. 상기 단백질은 T 세포 및 대식구에 의해 발현되며, HIV를 포함하는, 대식구-친화성 바이러스에 있어서 숙주 세포에 진입하기 위한 중요한 공동-수용체로 공지되어 있다. CCR5에 대한 예시적인 서열을 U54994.1로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "SOCS"는 JAK-STAT 신호전달 경로의 저해에 수반되는 유전자 패밀리를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "BIM"은 BCL-2 단백질 패밀리의 친-아폽토시스 구성원을 지칭하며, 이는 BCL2, BCL2L1/BCL-X(L), 및 MCL1을 포함하는 BCL-2 단백질 패밀리의 다른 구성원과 상호작용하고, 아폽토시스 활성화제로 작용한다.
본원에서 사용되는 용어 "FAS"는 TNF-수용체 수퍼패밀리의 구성원을 지칭한다. 상기 수용체는 사멸 도메인을 함유한다. 이는 세포 예정사의 생리적 조절에서 중추적 역할을 담당하는 것으로 나타났다.
본원에서 사용되는 용어 "GITR"은 활성화-유도성 TNFR 패밀리 수용체(AITR) 또는 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질로도 공지된 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 18(TNFRSF18)을 지칭한다. 이는 활성화된 T-림프구 및 내피 세포 간 상호작용에 그리고 T-세포 수용체-매개 세포사의 조절에 수반된다.
본원에서 사용되는 용어 "소르틸린(Sortilin)"은 VPS10-관련 소르틸린(Sortilin) 단백질 패밀리를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "TIM3"은 인간에서 HAVCR2 유전자에 의해 인코딩되는 T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3) 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CD96" 또는 "TACTILE"은 면역 반응의 후기상 동안 활성화된 T 및 NK 세포의 접착성 상호작용에서 역할을 담당하는 유형 I 막 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "IL1R8"은 인터류킨 1 수용체 패밀리의 구성원을 지칭하며 인터류킨 1 악세서리 단백질과 유사하다.
본원에서 사용되는 용어 "KIR2DL1", "KIR2DL2" 및 "KIR2DL3"은 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)를 지칭하며, 이는 자연 살해 세포 및 T 세포의 하위세트에 의해 발현되는 막통과 당단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "CDK8"은 사이클린-의존적 단백질 키나제(CDK) 패밀리의 구성원을 지칭하며, 이는 세포 주기 진행의 조절인자로서 기능한다.
본원에서 사용되는 용어 "CXCR3"은 CXCL9/Mig(인터페론-g에 의해 유도되는 모노카인), CXCL10/IP10(인터페론-g-유도성 10 kDa 단백질) 및 CXCL11/I-TAC(인터페론-유도성 T 세포 a-화학유인물질)이라고 하는, 3개 케모카인에 대해 선택성을 갖는 G 단백질-커플링 수용체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CCR7"은 G 단백질-커플링 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. 상기 수용체는 다양한 림프 조직에서 발현되며 B 림프구 및 T 림프구를 활성화한다.
본원에서 사용되는 용어 "EP4"는 G-단백질 커플링된 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. 상기 단백질은 프로스타글란틴 E2(PGE2)에 대해 확인된 4개 수용체 중 하나이다. 상기 수용체는 T-세포 인자 신호전달을 활성화할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "IL-2"는 T 림프구 및 B 림프구의 증식을 위해 중요한 분비된 사이토카인인 인터류킨-2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "IL-12"는 T 및 자연 살해 세포 상에 작용하는 사이토카인인 인터류킨-12를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "IL-18"은 주로 분극화된 T-헬퍼 1(Th1) 세포 및 자연 살해(NK) 세포 면역 반응에 수반되는 친염증성 사이토카인인 인터류킨-18을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CXCR1"은 G-단백질-커플링 수용체 패밀리의 구성원을 지칭한다. 상기 단백질은 인터류킨 8(IL8)에 대한 수용체이다.
본원에서 사용되는 용어 "CX3CR1"은 백혈구의 접착 및 이동에 수반되는 막통과 단백질 및 케모카인을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "mTRAIL"은 종양 괴사 인자(TNF) 리간드 패밀리에 속하는 사이토카인을 지칭한다. 상기 단백질은 우선적으로 암화된 세포 및 종양 세포에서 아폽토시스를 유도한다.
본원에서 사용되는 용어 "TOSO"는 IgM 수용체의 Fc 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "CD16"은 면역글로불린 G의 Fc 부분에 대한 수용체를 지칭하며, 이는 순환으로부터 항원-항체 복합체의 제거 뿐만 아니라 다른 항체-의존적 반응에 수반된다.
일부 실시형태에서, TRAC의 기능 상실을 나타내는 변형된 세포가 본원에서 제공된다. 용어 "TRAC"는 TRAC 유전자좌에 의해 인코딩되는, T-세포 수용체 알파 서브유닛(불변)을 지칭한다. TRAC의 기능-상실을 나타내는 세포는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, TCR을 발현하는 세포로부터 또는 재배열된 내인성 TCR 유전자좌를 갖는 세포로부터, 예를 들어 T-세포로부터 유래된, 변형된 세포, 예를 들어, 만능 또는 다능성 줄기 세포 또는 이의 분화된 딸 세포(예를 들어, iNK 세포)가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 TRAC의 기능-상실을 가져오는 변형을 포함하며 이에 따라 기능적 TCR을 발현하지 않는다. TRAC의 기능-상실을 가져오는 데 적합한 방법 및 조성물은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 방법 및 조성물은 비제한적으로 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, "CRISPR-CAS-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2015/026504; "CRISPR-CAS-related methods, compositions and components"를 표제로 하는 PCT/US2016/024353; 및 "CRISPR-CPF1-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy"를 표제로 하는 PCT 출원 PCT/US2017/020598에 개시된 것들을 포함한다.
본 개시내용은 구체적으로 상기 확인된 유전자 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성%를 갖는 변이체를 포함하는, 상기 유전자 및 CAR의 변이체를 포괄한다. "상동성"을 또한 포함하는 본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성%" 또는 "동일성%"는 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우, 갭을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 일환으로 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고, 참조 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율로 정의된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 수동 이외에도, [Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, [Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)에 의해 생성될 수 있다.
녹인 및 녹아웃은 당업자에게 공지된 게놈 편집 기술에 의해 가져올 수 있고 CRISPR/Cas 기술을 포함한다. 단일-절단 뿐만 아니라 멀티플렉스 편집 전략이 본원에서 제공되는 요망되는 산물 구성을 달성하는 데 적합하며, 이러한 전략은 본원에 기재되거나 당업자에게 달리 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 예시적인 변형된 세포, 예를 들어, 변형된 만능 세포 또는 이의 분화된 자손, 예를 들어, iNK 세포 또는 다른 변형된 림프구 유형이 비-자가 숙주, 예를 들어 면역치료법을 필요로 하는 환자의 면역계를 탈출하는 이의 능력에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 이러한 평가는 시험관내 검정법을 포함한다. 이러한 평가에 적합한 시험관내 검정법은 당업자에게 공지되어 있으며, 비제한적으로 혼합 림프구 반응성(MLR) 검정법을 포함한다. 상기 검정법 및 다른 적합한 검정법은, 예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 7th edition, ISBN 9781437735734]에 기재된다. 다른 적합한 검정법은 본 개시내용의 측면에서 당업자에게 명백할 것이다.
사용 방법
대상체에 본 발명의 변형된 세포를 도입함으로써 다양한 질병이 완화될 수 있다. 질병의 예는 비제한적으로 뇌, 전립샘, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 정소, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 인두, 또는 식도의 종양을 포함하는 비제한적으로 고형 종양; 및 비제한적으로 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발 골수종 및 골수형성이상 증후군을 포함하는 혈액 악성물을 포함하는, 비제한적으로 암을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 본원에서 기재되는 임의의 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 대한 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "치료하는", "치료" 등은 일반적으로 요망되는 약리학적 및/또는 생리적 효과의 수득을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 효과는 질병의 전체적 또는 부분적 예방 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질병의 부분적 또는 전체적 근치 및/또는 질병에 기여할 수 있는 유해 효과의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유류에서 질병의 임의의 치료를 커버하며, 질병이 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 이를 갖는 것으로 진단받지 않은 대상체에서 질병의 발생 예방; 질병의 저해, 즉 그 발생의 중지; 또는 질병의 경감, 즉 질병의 퇴행 유도를 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질병 또는 손상의 시작 전에, 동안, 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 요망되지 않은 임상 증상을 안정화하거나 감소시키는, 진행 중인 질병의 치료가 특히 관심의 대상이다.
특정 실시형태에서, 대상체는 세포 치료법에 의해 치료되고/되거나, 완화되고/되거나 개선될 수 있는 질병, 질환, 및/또는 손상을 갖는다. 세포 치료법을 필요로 하는 대상체가 손상, 질병, 또는 질환을 갖는 대상체인 일부 실시형태가 고려되며, 이에 따라 세포 치료법, 예를 들어, 세포성 물질이 대상체에 투여되는 치료법은 손상, 질병, 또는 질환과 연관된 적어도 하나의 중증도를 치료하고/하거나, 완화하고/하거나, 개선하고/하거나, 감소시킬 수 있다. 세포 치료법을 필요로 하는 대상체가 비제한적으로 골수 또는 줄기 세포 이식을 위한 후보, 화학치료법 또는 방사선 치료법을 제공받은 대상체, 고증식성 장애 또는 암, 예를 들어 조혈계의 고증식성 장애 또는 암을 갖거나 이를 가질 위험이 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양을 갖거나 그 발생 위험이 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 연관되는 질병을 갖거나 이를 가질 위험이 있는 대상체를 포함하는 소정 실시형태가 고려된다.
따라서, 본 발명은 추가로 본원에서 개시되는 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에서 개시되는 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 T 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에서 개시되는 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에서 개시되는 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 CD34 HE 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본원에서 개시되는 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 HSC를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 차용 세포 치료법에 적합한 대상체에 조성물을 도입함으로써 상기 약제학적 조성물의 치료적 용도를 제공하며, 여기서 대상체는 자가면역 장애; 혈액학적 악성물; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스, 또는 BK 폴리오마바이러스와 연관된 감염을 갖는다.
단리된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료법을 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는 약제학적 조성물, 예컨대 약 95% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 만능 줄기 세포 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 포함하며, 여기서 집단은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 미만의 iPSC 유래된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다. 일부 실시형태에서 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 초과의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 60% 내지 70%, 약 70% 내지 80%, 약 80% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 또는 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 약 0.1%, 약 1%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98% , 약 99%, 또는 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 가질 수 있다.
당업자는 자가 및 동종이형 면역 세포 둘 모두가 세포 치료법에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 자가 세포 치료법은 감소된 감염, GvHD에 대한 감소된 확률, 및 신속한 면역 재구성을 가질 수 있다. 동종이형 세포 치료법은 면역 매개된 이식편-대-악성물(GVM) 효과, 및 낮은 비율의 재발을 가질 수 있다. 세포 치료법을 필요로 하는 환자 또는 대상체의 구체적 질환에 기반하여, 당업자는 어느 구체적 유형의 치료법을 투여해야하는지를 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 동종이형이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형물의 유래된 조혈 계통 세포는 대상체에 대해 자가이다. 자가 이식에 있어서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 전체적으로 또는 부분적으로 HLA-매치된다. 또 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체와 HLA-매치되지 않는다.
본 발명에 의해 제공되는 유래된 조혈 계통 세포는 투여 전에 생체외 또는 시험관내 증식되지 않고 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 개선된 치료 잠재력을 갖는 면역 세포를 수득하기 위해 하나 이상의 제제를 사용하여 생체외 조절되고 치료된다. 유래된 조혈 계통 세포의 조절된 집단은 세척되어 치료제(들)를 제거할 수 있고, 개선된 집단은 시험관내 집단의 추가 증식 없이 환자에 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 제제로 T 림프구의 단리된 집단 또는 하위집단을 조절하기 전에 증식되는 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 TCR, CAR 또는 다른 단백질을 발현하도록 재조합적으로 생산될 수 있다.
세포의 유전적 변형 이전이건 이후이건, 재조합 TCR 또는 CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 있어서, 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다.
암
본 개시내용의 적합한 치료 표적인 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 눈, 위장관, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 코인두, 경부, 난소, 전립샘, 피부, 위, 정소, 혀, 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함한다. 또한, 암은 구체적으로 하기 조직학적 유형일 수 있지만, 이들에 제한되지는 않는다: 악성, 신생물; 암종; 미분화, 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두모양 암종; 편평상피세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두모양 이행 세포 암종; 샘암종; 악성, 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 잔기둥 샘암종; 샘낭암종; 샘종 폴립에서의 샘암종; 가족성 대장폴립증, 샘암종; 고형 암종; 악성, 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 샘암종; 유두모양 샘암종; 비염색 암종; 호산성 암종; 호산세포 샘암종; 호염기세포 암종; 투명 세포 샘암종; 과립 세포 암종; 난포 샘암종; 유두모양 및 난포 샘암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막모양 암종; 피부 부속기관 암종; 부분분비 샘암종; 피지 샘암종; 귀지 샘암종; 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두모양 낭샘암종; 유두모양 장액 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 샘암종; 반지 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방, 파제트병; 샘꽈리 세포 암종; 선편평상피세포 암종; 편평상피화생을 갖는 샘암종; 악성, 가슴샘종; 악성, 난소 간질 종양; 악성, 난포막종; 악성, 과립층 세포 종양; 악성, 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성, 레이디히 세포 종양; 악성, 지질 세포 종양; 악성, 겉신경절종; 악성, 유방-외 겉신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대 색소 모반에서의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성, 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성, 섬유 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질 육종; 악성, 혼합 종양; 뮐러리안 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성, 중간엽종; 악성, 브렌너 종양; 악성, 엽상 종양; 윤활 육종; 악성, 중피종; 난소고환종; 배아 암종; 악성, 기형종; 악성, 난소 갑상샘종; 융모막암종; 악성, 중신종; 혈관육종; 악성, 혈관내피종; 카포시 육종; 악성, 혈관주위세포종; 림프혈관육종; 골육종; 피질근접 골육종; 연골육종; 악성, 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 어윙 육종; 악성, 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성, 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성, 송과체종; 척삭종; 악성, 아교종; 뇌실막종; 별아교세포종; 원형질성 별아교세포종; 원섬유 별아교세포종; 별아교모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후신경원성 종양; 악성, 수막종; 신경섬유육종; 악성, 신경집종; 악성, 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 파라육아종; 작은 림프구, 악성 림프종; 큰 세포, 미만성, 악성 림프종; 난포, 악성 림프종; 균상 식육종; 기타 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질병; 백혈병; 림프 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적혈백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구 백혈병; 골수 육종; 및 털 세포 백혈병.
일부 실시형태에서, 암은 유방암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 결장암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 위암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 RCC이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 비-소세포 폐암(NSCLC)이다.
일부 실시형태에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 암 치료 방식과 조합된, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포로 치료될 수 있는 고형 암 적응증은 방광암, 간세포 암종, 전립샘암, 난소암/자궁암, 췌장암, 중피종, 흑색종, 교모세포종, HPV-연관 및/또는 HPV-양성 암, 예컨대 자궁경부암 및 HPV+ 두부경부암, 구강암, 인두암, 갑상샘암, 담낭암, 및 연조직 육종을 포함한다;
일부 실시형태에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 암 치료 방식과 조합된, 본원에서 제공되는 변형된 NK 세포로 치료될 수 있는 혈액학적 암 적응증은 ALL, CLL, NHL, DLBCL, AML, CML, 다발 골수종(MM)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "암"(또한 용어 "과증식성" 및 "신생물"과 통용됨)은 자율 성장능, 즉 신속 증식 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적 상태 또는 질환을 갖는 세포를 지칭한다. 암성 질병 상태는 병리적으로, 즉 질병 상태, 예를 들어 악성 종양 성장을 특징으로 하거나 구성하는 것으로 분류될 수 있거나, 비-병리적으로, 즉 정상으로부터의 일탈이지만 질병 상태와 연관되지 않은 것으로, 예를 들어, 상처 보수와 연관된 세포 증식으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리 유형 또는 침습성 단계와 무관하게, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양형성 공정, 전이성 조직 또는 악성으로 암화된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "암"은 다양한 기관계의 악성물, 예컨대 페, 유방, 갑상샘, 림프, 위장관, 및 비뇨생식관에 영향을 주는 것들뿐만 아니라 악성물, 예컨대 대부분의 결장암, 신세포 암종, 전립샘암 및/또는 정소 종양, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암 및 식도의 암을 포함하는 샘암종을 포함한다. 용어 "암종"은 당업계에서 인식되며 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식계 암종, 정소 암종, 유방 암종, 전립샘 암종, 내분비계 암종, 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성물을 지칭한다. 예시적인 암종은 자궁경부, 폐, 전립샘, 유방, 두부 및 경부, 결장 및 난소의 조직으로부터 형성되는 것들을 포함한다. 용어 "암종"은 또한, 예를 들어 암종 및 육종 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. "샘암종"은 샘 조직으로부터 유래되거나 종양 세포가 인식 가능한 샘 구조를 형성하는 암종을 지칭한다. 용어 "육종"은 당업계에서 인식되며 중간엽 유래의 악성 종양을 지칭한다.
폐의 세포 증식성 및/또는 분화 장애의 예는 비제한적으로 종양, 예컨대 신생물딸림 증후군을 포함하는 기관지원성 암종, 세기관지폐포암종, 신경내분비 종양, 예컨대 기관지 카르시노이드, 기타 종양, 전이성 종양, 및 고립 섬유성 종양(흉막 섬유종)을 포함하는 흉막 종양 및 악성 중피종을 포함한다.
유방의 세포 증식성 및/또는 분화 장애의 예는 비제한적으로, 예를 들어, 상피 과다형성, 경화샘증, 및 작은 관 유두종을 포함하는 증식성 유방 질병; 종양, 예를 들어, 간질 종양, 예컨대 섬유샘종, 엽상 종양, 및 육종, 및 상피 종양, 예컨대 큰 관 유두종; 원 위치 관 암종(파제트병 포함) 및 원 위치 소엽 암종을 포함하는 원 위치(비침습성) 암종, 및 비제한적으로, 침습성 관 암종, 침습성 소엽 암종, 수질 암종, 콜로이드(점액) 암종, 관형 암종, 및 침습성 유두모양 암종을 포함하는 침습성(침윤) 암종을 포함하는 유방의 암종, 및 기타 악성 신생물을 포함한다. 남성 유방에서의 장애는 비제한적으로 여성형유방증 및 암종을 포함한다.
결장이 수반되는 세포 증식성 및/또는 분화 장애의 예는 비제한적으로 결장의 종양, 예컨대 비-신생물 폴립, 샘종, 선천성 증후군, 결장직장 암형성, 결장직장 암종, 및 카르시노이드 종양을 포함한다.
상술된 것들에 부가하여, 암 또는 신행물 질환의 예는 비제한적으로 섬유육종, 근육육종, 지방육종, 연골육종, 뼈형성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 윤활막종, 중피종, 어윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 위암, 식도암, 직장암, 췌장암, 난소암, 전립샘암, 자궁암, 두부경부암, 피부암, 뇌암, 편평상피세포 암종, 피지샘 암종, 유두모양 암종, 유두모양 샘암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 정소암, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경집종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 또는 카포시 육종을 포함한다.
상기 맥락에서 고려되는 유용한 이차 또는 보조 치료제는 하기를 포함한다: 화학치료제는 비제한적으로 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코포렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파니드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴과 같은 니트로스우레아; 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메갈1(예를 들어, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참고); 다인네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제 발색단); 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사(DOXIL®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트, 젬시타빈(GEMZAR®), 테가푸르(UFTORAL®), 카페시타빈(XELODA®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-안드로겐; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글락톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 매이탄신 및 안사미토신과 같은 매이타시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리콜테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 메토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형물(ABRAXANET™), 및 독세탁셀(TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 사이클로스포린, 시롤리무스, 파라마이신, 파라로그, 이반드로네이트; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합된 치료법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU, 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)을 이용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX; 예를 들어, 타목시펜(NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜(EVISTA®), 드롤록시펜, 4-하이드로시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(FARESTON®)을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 항-프로게스테론; 에스테론 수용체 하향-조절제(ERD); 풀베스트란트(FASLODEX®)와 같은 에스트로겐 수용체 길항제; 난소를 억제하거나 셧다운시키는 작용을 하는 제제, 예를 들어, 류프롤리드 아세테이트(LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린과 같은 황체형성 호르몬-분비 호르몬(LHRH) 작용제; 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드와 같은 다른 항-안드로겐; 및 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트(MEGASE®), 엑세메스탄(AROMASIN®), 포르메스타니, 파드로졸, 보로졸(RIVISOR®), 레트로졸(FEMARA®), 및 아나스트로졸(ARIMIDEX®)과 같은, 부신 샘에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 저해하는 아로마타제 저해제; 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트(DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA®), 알렌드로네이트(FOSAMAX®), 파미드로네이트(AREDIA®), 틸루드로네이트(SKELID®), 또는 리세드로네이트(ACTONEL®)와 같은 비스포스포네이트; 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는, 미국 특허 제6,344,321호에 기재된 압타머; 항 HGF 모노클로날 항체(예를 들어, Aveo의 AV299, Amgen의 AMG102); 절단된 mTOR 변이체(예를 들어, Compugen의 CGEN241); mTOR 유도된 경로를 차단하는 단백질 키나제 저해제(예를 들어, Arqule의 ARQ197, Exelexis의 XL880, SGX Pharmaceuticals의 SGX523, Supergen의 MP470, Pfizer의 PF2341066); THERATOPE® 백신 및 유전자 치료법 백신과 같은 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제(예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH(예를 들어, ABARELIX®); 라파티닙 디토실레이트(GW572016으로도 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 저해제); 셀로콕시브(CELEBREX®)와 같은 COX-2 저해제; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠설폰아미드; 및 임의의 상기의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하는 화학치료제를 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 적합한 암 치료에 효과적인 다른 화합물은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되며, 예를 들어, 관련 부분이 본원에 참조로 포함되는 문헌["Physicians Desk Reference, 62nd edition. Oradell, N.J.: Medical Economics Co., 2008", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eleventh Edition. McGraw-Hill, 2005", "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, Md.: Lippincott Williams & Wilkins, 2000." 및 "The Merck Index, Fourteenth Edition. Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 2006"]에 기재된다.
위에서든 아래에서든, 본원에서 인용되는 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 명세서를 통해, 맥락 상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 군의 포함을 시사하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 군의 배제가 아님이 이해될 것이다. "~로 구성되는"이란 어구 "~로 구성되는"에 뒤따르는 것이 무엇이든, 이를 포함하며 이에 제한됨을 의미한다. 따라서, 어구 "~로 구성되는은 열거된 요소가 요구되거나 의무적이고, 다른 요소가 존재할 수 없음을 시사한다. "본질적으로 ~로 구성되는은 어구 뒤에 열거되는 임의의 요소를 포함함을 의미하며 열거된 요소에 대해 본 개시내용에 특정된 활성 또는 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 어구 "본질적으로 ~로 구성되는은 열거된 요소가 요구되거나 의무적이지만, 다른 요소는 선택적이 아니고 이들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 주는지 여부에 따라 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있음을 시사한다.
상술된 다양한 실시형태가 조합되어 추가 실시형태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 나타내고/나타내거나 출원 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 제공되는 데이터베이스 엔트리, 예를 들어, NCBI 뉴클레오타이드 또는 단백질 데이터베이스 엔트리의 내용은 이의 전문이 본원에 포함된다. 데이터베이스 엔트리가 경시적으로 변화를 거치는 경우, 본 출원의 출원일의 내용이 본원에 참조로 포함된다. 실시형태의 양태는 필요한 경우, 또 다른 추가 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 채택하도록 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화가 상술된 기재의 견지에서 실시형태에 대해 수행될 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용되는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시되는 특정 실시형태로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 이러한 청구범위에 권리가 부여되는 전체 균등부 범위와 더불어 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적이며, 임의의 방식으로 본 개시내용의 범위 또는 내용을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: iPS 세포로부터 변형된 iNK 세포의 생성
복합 편집 전략의 실시를 위한 iPS 세포 기술의 사용 및 예를 들어, iNK 세포 또는 다른 림프구의 후속 유도는, 메조텔린, EGFR, HER2, 및 MICA/B와 같은 관심 CAR을 발현하고/하거나 목록 A 및/또는 표 10으로부터의 하나 이상의 편집물, 및 목록 B 및/또는 표 11로부터의 하나 이상의 편집물을 갖는 iNK 세포의 생성을 가능하게 한다.
목록 A:
● CD16의 증강된 변이체, 예컨대 hnCD16a(CD16의 고친화도, 절단-불가능한 변이체 - 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 수반되는 저친화도 Fcy 수용체)의 외인성 발현. 전형적으로, CD16은 프로테아제에 의해 ADCC 동안 절단되며, hnCD16 CAR은 상기 절단을 거치지 않고 이에 따라 ADCC 신호가 더 길게 지속된다.
● IL-15/IL 15RA의 외인성 발현
● TGFbR2의 기능 상실, 또는 TGFbR2의 우성-음성 변이체의 외인성 발현(우성 음성 TGF 베타 수용체 II는 CD34 세포의 분화에서 TGFbRII의 역할을 방해하지 않기 위해 NK-특이적 프로모터로부터 발현되며, 이는 iPS 세포로부터 유래될 수 있고, 전형적으로 조혈 계열(예컨대 NK 세포)이 분화되는 세포 유형으로 작용할 수 있음)
● ADORA2A의 기능 상실
목록 Β:
● B2M의 기능 상실(예컨대, B2M 발현의 표적화에 의해 MHC 클래스 I 발현을 제거함) HLA-G의 외인성 발현
● CIITA의 기능 상실(예컨대, CIITA의 표적화에 의해 MHC 클래스 II 발현을 제거함)
● PD1의 기능 상실
● TIGIT의 기능 상실
● CISH(사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질)의 기능 상실
기능 상실은 바람직하게는 각각의 단백질의 표면 발현의 전체 제거를 포함한다.
예를 들어, CAR 및 CD16 변이체(예컨대, hnCD16), 또는 CAR 및 CD16 변이체 부재의 외인성 발현을 갖는 iNK 세포를 생성할 수 있다. CAR 부재를 그러나 CD16 변이체를 발현하는 세포도 생성할 수 있다. CD16을 발현하는 임의의 세포, 또는 이의 증강된 변이체(예컨대, hnCD16)는 모노클로날 항체(예컨대, 암 치료법에서 사용됨)와의 또는 병리적 세포를 표적화하는 Fc 융합 단백질과의 조합 치료법에 적합할 것이다.
2개를 초과하는 트랜스유전자가 녹인되는 경우, 다중시스트론 발현 구축물, 또는 2A 구축물이 각각의 트랜스유전자에 대해 개별 구축물을 삽입해야 하는 것을 피하기 위해 유리할 수 있다.
이러한 iNK 세포는 비제한적으로 증식성 질병, 예컨대 소정 형태의 암의 치료를 포함하는 광범위한 면역치료법 적용에 유용하다. 상기 개략된 CAR을 사용하는 경우, 유방암, 결장암, 위암, 신세포 암종, 및 NSCLC에서의 적용이 상정된다. 이러한 세포의 변경된 표면 분자 레퍼토리가 또한 고형 종양의 성공적인 치료를 가능하게 할 것이며, 이는 현재의 NK-세포 기반 전략으로는 어렵다는 것이 증명되었다.
재프로그래밍된 체세포(또는 이의 딸 세포)로부터 수득된 예시적인 iNK 세포는 하기 특징 중 하나 이상(예컨대, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상)을 포함한다:
- 이들은 재배열된 내인성 TCR 유전자좌(예컨대, TCRa VJ 및/또는 TCRf3 V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손)를 포함하며;
- 이들은 내인성 T 세포 공동-수용체, 예컨대, CD3, CD4, 및/또는 CD8을 발현하지 않으며;
- 이들은 NK-세포 바이오마커, 예를 들어 하기를 발현하며:
● CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45;
● NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 클러스터 16(CD16));
● 자연 살해 그룹-2 구성원 0(NKG2D, MICAIB 스트레스 리간드 수용체);
● CD69;
● 자연 세포독성 수용체(예컨대, NKp30; NKp44; NKp46; 및/또는 CD158b); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합;
- 이들은 하기를 발현할 수 있고:
● 키메라 항원 수용체(CAR),
● 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcyRIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체
● 인터류킨 15(IL-15) 경로 작용제, 예컨대 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 15 수용체(IL-15R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-15R의 구성적 활성 변이체, 예컨대 IL-15R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-15R; 대안적으로 또는 IL-15 경로 작용제와 조합된 다른 인터류킨 경로 작용제, 예컨대 인터류킨 2(IL-2) 경로 작용제, 예컨대, IL-2, 인터류킨 2 수용체(IL-2R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-2R의 구성적 활성 변이체, 예컨대, IL-2R 작용제(IL-2RA)에 융합된 IL-2R); 및/또는 인터류킨 12(IL12) 경로 작용제, 예컨대 IL-12, 인터류킨 12 수용체(IL-12R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-12R의 구성적 활성 변이체, 예컨대, IL-12R 작용제(IL-12RA)에 융합된 IL-12R)도 고려되며; 2개 이상의 인터류킨의 조합, 예컨대 IL-15 경로 작용제 또는 IL-2 작용제 및 IL-12 작용제, 예컨대, IL-12R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-12R과 조합된 IL-15R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-15R도 고려된다.
● 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합;
● 인간 백혈구 항원 E(HLA-E)
● 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47)
● 그리고
- 이들은 하기의 기능 상실을 나타낼 수 있다:
● 전환 성장 인자 베타 수용체 2(예컨대 인코딩 서열의 변형에 의한 또는 우성 음성 변이체의 발현에 의한 TGF베타R2);
● 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
● Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
● β-2 마이크로글로불린(B2M);
● 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
● 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279), 또는 PD-1 길항제를 발현함;
● 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
● 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
● 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파쇄 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타쇄 유전자;
● 분화 클러스터 32B(CD32B, BCGR2B);
● 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합.
편집물의 수를 최소화함으로써 이들 특징의 특이적 조합, 예컨대 CAR, IL-15 및 HLA-G를 발현하고, B2M 및 PD-1의 기능 상실을 나타내는 iNK 세포를 달성하는 것이 요망된다. 예를 들어, CAR을 인코딩하는 발현 구축물을 B2M 유전자좌 내로 삽입할 수 있고 IL-15 및 HLA-G를 인코딩하는 발현 구축물을 B2M 유전자좌 내로 삽입할 수 있다. 유사한 전략이 다른 조합에 적용될 것이다.
iNK 세포는 단독치료법으로 사용될 수 있으며, CAR(예컨대, 메조텔린, EGFR, 또는 HER2에 결합하는 CAR)을 발현하는 것들은 CAR이 결합하는 표면 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 치료 접근에 특히 적합할 것이다. 상정되는 일부 iNK 세포가 또한, 예컨대 암 세포를 표적화하는 모노클로날 항체와 조합된 조합 치료법 접근에 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, iPS 세포의 생성은 공여체 세포, 예컨대 건강한 공여체 개인으로부터 체세포를 수득하는 것을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 공여체 세포 또는 세포 집단은 핵형이 정상으로 확인되며, 병리적 상태, 예컨대 악성 상태와 연관된 것으로 공지된 유전자 또는 유전자 조합의 발현을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 체세포를 편집한 후 만능 상태로 재프로그래밍한다. 일부 실시형태에서, 체세포를 재프로그래밍하고 동시에 편집한다. 일부 실시형태에서, 체세포를 재프로그래밍하고 생성된 만능 세포를 편집한다. 일부 실시형태에서, iPS 세포의 생성은 재프로그래밍된 세포주의 클론성 증식, 이러한 여러 클론성 iPS 세포주의 특성규명, 및 핵형이 정상이면서 모든 요망되는 편집물을 포함하는 세포주의 선택을 포함한다.
임상적 용도를 위한 최종 산물은 각각의 편집물을 운반하는 iNK 세포 집단이다. 세포의 수는 대상체로의 투여 후 요망되는 면역 반응을 유발하기에 충분할 것이다. 정확한 수는 다른 인자 중에서도, 구체적으로 요망되는 임상 결과, 환자, 및 치료될 질병에 좌우될 것이며, 크게 변할 수 있다. 투여에 적합한 세포 집단은 약 1,000 세포 내지 약 100,000,000 세포 범위일 수 있음이 기대된다. 임상적 용도를 위한 iNK 세포 집단에는, 잔여 줄기 세포, 예컨대 Oct-4 및/또는 Sox2를 발현하는 iPS 세포가 없어야 하며, 이상적으로는 에피솜 발현 구축물, 예컨대 T 세포의 재프로그래밍 동안 사용되는 에피솜 발현 구축물을 보유하는 세포가 없거나 최소량으로만 함유되어야 하고; 요망되는 조합의 세포 마커를 발현하지 않고 표면 분자를 과발현하는 세포가 없거나 1%, 5%, 또는 10% 이하로 함유되어야 한다.
실시예 2: 복합 편집 전략을 위한 기원 세포로서의 T 세포의 사용 및 iNK 세포의 후속 유도
복합 편집 전략을 위한 기원 세포로서의 T 세포의 사용 및 예를 들어 iNK 세포 또는 다른 림프구의 후속 유도는, 메조텔린, EGFR, HER2, 및 MICA/B와 같은 관심 CAR을 발현하고/하거나 목록 A 및/또는 표 10으로부터의 하나 이상의 편집물, 및 목록 B 및/또는 표 11로부터의 하나 이상의 편집물을 갖는 iNK 세포의 생성을 가능하게 한다.
목록 A:
● CD16의 증강된 변이체, 예컨대 hnCD16a(CD16의 고친화도, 절단-불가능한 변이체 - 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 수반되는 저친화도 Fcy 수용체)의 외인성 발현. 전형적으로, CD16은 프로테아제에 의해 ADCC 동안 절단되며, hnCD16 CAR은 상기 절단을 거치지 않고 이에 따라 ADCC 신호가 더 길게 지속된다.
● IL-15/IL 15RA의 외인성 발현
● TGFbR2의 기능 상실, 또는 TGFbR2의 우성-음성 변이체의 외인성 발현(우성 음성 TGF 베타 수용체 II는 CD34 세포의 분화에서 TGFbRII의 역할을 방해하지 않기 위해 NK-특이적 프로모터로부터 발현되며, 이는 iPS 세포로부터 유래될 수 있고, 전형적으로 조혈 계열(예컨대 NK 세포)이 분화되는 세포 유형으로 작용할 수 있음)
● ADORA2A의 기능 상실
목록 Β:
● B2M의 기능 상실(예컨대, B2M 발현의 표적화에 의해 MHC 클래스 I 발현을 제거함) HLA-G의 외인성 발현
● CIITA의 기능 상실(예컨대, CIITA의 표적화에 의해 MHC 클래스 II 발현을 제거함)
● PD1의 기능 상실
● TIGIT의 기능 상실
● CISH(사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질)의 기능 상실
기능 상실은 바람직하게는 각각의 단백질의 표면 발현의 전체 제거를 포함한다.
예를 들어, CAR 및 CD16 변이체(예컨대, hnCD16), 또는 CAR 및 CD16 변이체 부재의 외인성 발현을 갖는 iNK 세포를 생성할 수 있다. CAR 부재를 그러나 CD16 변이체를 발현하는 세포도 생성할 수 있다. CD16을 발현하는 임의의 세포, 또는 이의 증강된 변이체(예컨대, hnCD16)는 모노클로날 항체(예컨대, 암 치료법에서 사용됨)와의 또는 병리적 세포를 표적화하는 Fc 융합 단백질과의 조합 치료법에 적합할 것이다.
2개를 초과하는 트랜스유전자가 녹인되는 경우, 다중시스트론 발현 구축물, 또는 2A 구축물이 각각의 트랜스유전자에 대해 개별 구축물을 삽입해야 하는 것을 피하기 위해 유리할 수 있다.
이러한 iNK 세포는 비제한적으로 증식성 질병, 예컨대 소정 형태의 암의 치료를 포함하는 광범위한 면역치료법 적용에 유용하다. 상기 개략된 CAR을 사용하는 경우, 유방암, 결장암, 위암, 신세포 암종, 및 NSCLC에서의 적용이 상정된다. 이러한 세포의 변경된 표면 분자 레퍼토리가 또한 고형 종양의 성공적인 치료를 가능하게 할 것이며, 이는 현재의 NK-세포 기반 전략으로는 어렵다는 것이 증명되었다.
재프로그래밍된 편집된 T 세포(또는 이의 딸 세포)로부터 수득된 예시적인 iNK 세포는 하기 특징 중 하나 이상(예컨대, 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상)을 포함한다:
- 이들은 재배열된 내인성 TCR 유전자좌(예컨대, TCRa VJ 및/또는 TCRf3 V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손)를 포함하며;
- 이들은 내인성 T 세포 공동-수용체, 예컨대, CD3, CD4, 및/또는 CD8을 발현하지 않으며;
- 이들은 NK-세포 바이오마커, 예를 들어 하기를 발현하며:
● CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45;
● NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 클러스터 16(CD16));
● 자연 살해 그룹-2 구성원 0(NKG2D, MICAIB 스트레스 리간드 수용체);
● CD69;
● 자연 세포독성 수용체(예컨대, NKp30; NKp44; NKp46; 및/또는 CD158b); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합;
- 이들은 하기를 발현할 수 있고:
● 키메라 항원 수용체(CAR),
● 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcyRIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체
● 인터류킨 15(IL-15) 경로 작용제, 예컨대 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 15 수용체(IL-15R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-15R의 구성적 활성 변이체, 예컨대 IL-15R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-15R; 대안적으로 또는 IL-15 경로 작용제와 조합된 다른 인터류킨 경로 작용제, 예컨대 인터류킨 2(IL-2) 경로 작용제, 예컨대, IL-2, 인터류킨 2 수용체(IL-2R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-2R의 구성적 활성 변이체, 예컨대, IL-2R 작용제(IL-2RA)에 융합된 IL-2R); 및/또는 인터류킨 12(IL12) 경로 작용제, 예컨대 IL-12, 인터류킨 12 수용체(IL-12R) 또는 이의 변이체(예컨대, IL-12R의 구성적 활성 변이체, 예컨대, IL-12R 작용제(IL-12RA)에 융합된 IL-12R)도 고려되며; 2개 이상의 인터류킨의 조합, 예컨대 IL-15 경로 작용제 또는 IL-2 작용제 및 IL-12 작용제, 예컨대, IL-12R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-12R과 조합된 IL-15R 작용제(IL-15RA)에 융합된 IL-15R도 고려된다.
● 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합;
● 인간 백혈구 항원 E(HLA-E)
● 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47)
● 그리고
- 이들은 하기의 기능 상실을 나타낼 수 있다:
● 전환 성장 인자 베타 수용체 2(예컨대 인코딩 서열의 변형에 의한 또는 우성 음성 변이체의 발현에 의한 TGF베타R2);
● 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
● Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
● β-2 마이크로글로불린(B2M);
● 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
● 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279), 또는 PD-1 길항제를 발현함;
● 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
● 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
● 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파쇄 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타쇄 유전자;
● 분화 클러스터 32B(CD32B, BCGR2B);
● T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC);
● 또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합.
편집물의 수를 최소화함으로써 이들 특징의 특이적 조합, 예컨대 CAR, IL-15 및 HLA-G를 발현하고, B2M 및 PD-1의 기능 상실을 나타내는 iNK 세포를 달성하는 것이 요망된다. 예를 들어, CAR을 인코딩하는 발현 구축물을 B2M 유전자좌 내로 삽입할 수 있고 IL-15 및 HLA-G를 인코딩하는 발현 구축물을 B2M 유전자좌 내로 삽입할 수 있다. 유사한 전략이 다른 조합에 적용될 것이다.
iNK 세포는 단독치료법으로 사용될 수 있으며, CAR(예컨대, 메조텔린, EGFR, 또는 HER2에 결합하는 CAR)을 발현하는 것들은 CAR이 결합하는 표면 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 치료 접근에 특히 적합할 것이다. 상정되는 일부 iNK 세포가 또한, 예컨대 암 세포를 표적화하는 모노클로날 항체와 조합된 조합 치료법 접근에 적합할 수 있다.
iPS 세포의 생성은 재프로그래밍된 세포주의 클론성 증식, 이러한 여러 클론성 iPS 세포주의 특성규명, 및 핵형이 정상이면서 모든 요망되는 편집물을 포함하는 세포주의 선택을 포함할 것이다.
임상적 용도를 위한 최종 산물은 각각의 편집물을 운반하는 iNK 세포 집단이다. 세포의 수는 대상체로의 투여 후 요망되는 면역 반응을 유발하기에 충분할 것이다. 정확한 수는 다른 인자 중에서도, 구체적으로 요망되는 임상 결과, 환자, 및 치료될 질병에 좌우될 것이며, 크게 변할 수 있다. 투여에 적합한 세포 집단은 약 1,000 세포 내지 약 100,000,000 세포 범위일 수 있음이 기대된다. 임상적 용도를 위한 iNK 세포 집단에는, 잔여 줄기 세포, 예컨대 Oct-4 및/또는 Sox2를 발현하는 iPS 세포가 없어야 하며, 이상적으로는 에피솜 발현 구축물, 예컨대 T 세포의 재프로그래밍 동안 사용되는 에피솜 발현 구축물을 보유하는 세포가 없거나 최소량으로만 함유되어야 하고; 요망되는 조합의 세포 마커를 발현하지 않고 표면 분자를 과발현하는 세포가 없거나 1%, 5%, 또는 10% 이하로 함유되어야 한다.
실시예 3: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; CIITA의 기능-상실; 및 HLA-G를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 4: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; CIITA의 기능-상실; 및 HLA-E를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 세포는 NKG2A의 기능 상실을 추가로 포함한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 5: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; CIITA의 기능-상실; 및 CD47을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 6: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 및 HLA-DPB1의 기능-상실; 및 HLA-G를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 7: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 및 HLA-DPB1의 기능-상실; 및 HLA-E를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 세포는 NKG2A의 기능 상실을 추가로 포함한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 8: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
예를 들어, 면역종양학 적용의 맥락에서, 면역치료제로서의 임상적 용도를 위해, B2M의 기능-상실; HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1, 및 HLA-DPB1의 기능-상실; 및 CD47을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하는 변형된 림프구, 여기서는 iNK 세포를 생성한다. 이들 편집물은 편집된 세포, 및/또는 이로부터 유래된 분화된 iNK 세포가 비-자가 숙주의 면역계를 회피할 수 있도록 한다. 추가적인 편집물이 iNK 세포의 임상적 특성을 증강시키기 위해 제조될 수 있다. 이들 iNK 세포는 건강한 공여체로부터의 신체 공여체 세포의 재프로그래밍, 공여체 세포의 만능 상태로의 재프로그래밍 및 요망되는 편집물의 유도에 의해 수득된다. 일단 편집되면, 만능 세포는 NK 세포로 분화되어, 임상 적용을 위한 변형된 iNK 세포 집단을 초래한다.
실시예 9: 임상 적용을 위한 iPS/iNK 세포
치료제로서 iNK 세포의 효과를 증강시키는 실시예 3 내지 8에서 제공된 세포에 대한 추가적인 편집물을 제조한다.
일부 실시형태에서, 이들 편집물은 IL-15R의 변이체, 여기서는 IL-15R과 그 리간드(IL-15, 또는 이의 IL-15-결합 단편)의 융합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물의 녹인을 포함하며, 이는 iNK 세포에서 구성적으로 활성이 있는 IL-15 경로를 초래한다.
일부 실시형태에서, 이들 편집물은 NK-세포 특이적 프로모터, 예를 들어, CD45 프로모터의 제어 하에 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물의 녹인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 이들 편집물은 CD32B(FCGR2)의 기능-상실을 추가로 포함한다.
실시예 10: CISH 및/또는 TGFBR2의 기능 상실을 나타내는 유전자 편집된 NK 세포가 종양 세포에 반응하여 개선된 효과기 기능을 실증함
CISH 및 TGFBR2 유전자의 녹아웃을 통해 NK 세포 기능을 증강시키기 위해 CRISPR-Cpf1 유전자 편집을 사용하여 차세대 동종이형 NK 세포 치료법을 개발하였다.
NK 세포를 20 ng/㎖ IL-15 중 CD3- PBMC 배양으로부터 증식시켰다. 유전자 편집을 상이한 NK 세포 증식 단계(8일차 내지 21일차)에 수행하였다. CISH 및 TGFBR2의 편집을 위해, 어느 하나의 표적에 대한 가이드를 2:1비로 Cpf1 뉴클레아제와 복합체화하여 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하였다. 세포를 두 표적 모두로 편집한 경우, 각각의 표적에 대한 RNP 복합체화를 별도로 수행한 후 전기천공 전에 1:1 비로 혼합하였다.
전기천공을 위해, NK 세포를 80x106 세포/㎖의 밀도로 HyClone 완충액 중에 현탁하였다. 90 마이크로리터의 NK 세포를 10 마이크로리터의 적절한 RNP와 혼합하였다. 이어서 세포 및 RNP 혼합물을 전기천공을 위해 MaxCyte OC-100 또는 OC-400 카세트로 옮겼다. 전기천공 직후, NK 세포를 37℃에서 10분 동안 100 마이크로리터의 배양 배지 중에 회수한 후, 편집 후 회수 및 기능 분석을 위해 24-웰 Grex 플레이트로 옮겼다.
하기 가이드 RNA 서열을 CISH 및 TGFBR2의 편집을 위해 사용하였다: 두 가이드 모두 RNA, 표적화 도메인의 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU 5'의 AsCpf1 스캐폴드, 및 스캐폴드 서열의 5' 말단에서 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT의 25-머 DNA 신장으로 구성되는 표적화 도메인으로 생성하였다.
[표 12]
Figure pct00052
도 1a 및 도 1b에 실증된 바와 같이, TGFBR2 및 CISH의 강력한 단일 및 이중-유전자 편집을 NK 세포에서 달성하였다. CRISPR-Cpf1을 사용하는 NK 세포에서의 TGFBR2 및 CISH의 단일 및 동시 표적화 둘 모두는 NK 세포의 80% 초과에서 두 표적 모두에 인델을 생성하였고, 편집된 NK 세포의 90% 초과가 편집 후 72시간째에 생활성이었다.
효과기 세포의 유효성을 3D 종양 구형체 검정법에 의해 시험관내 평가하였다.
구형체를 형성하기 위해, 5,000개의 NucLight Red 표지된 PC-3 또는 SK-OV-3 종양 세포를 초저부착 96웰 플레이트의 단일 웰에 플레이트접종하고, 10분 동안 1,000 rpm에서 원심분리하고, 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 96시간째에, 효과기 세포(상이한 RNP로 처리된 일차 인간 NK 세포)를 10 ng/㎖의 TGF-베타를 포함하거나 포함하지 않고 여러 효과기 대 표적 세포 비로 구형체에 첨가하였다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 나타낸 데이터를 효과기 첨가 시의 적색 물체 세기에 대해 정규화한다. 구형체 곡선의 정규화는 정규화되지 않은 데이터에서 관찰된 것과 동일한 유효성 패턴을 유지한다(도 2a 및 도 2b).
또한, CISH KO NK 세포는 편집되지 않은 대조군에 비해, 각각 평균 23% 및 12%만큼(두 경우 모두 p<0.0001) SK-OV-3 난소(도 3a, 도 3b 및 도 5a) 및 PC-3 전립샘 종양 구형체(도 4a, 도 4b 및 도 5b)의 성장을 감소시켰다. 그러나, CISH KO NK 세포의 활성은 외인성 TGF-β의 첨가에 의해 둔화되었다.
상기 관찰을 고려했을 때, CISH KO를 포함하는 TGF-β 수용체 유전자, TGFBR2의 녹아웃을 생성하였다. TGFBR2의 단일 녹아웃은 NK 세포를 TGFβ 저해에 저항성으로 만들었다(p<0.0001). 중요하게는, 4개 고유 공여체 및 7회 독립 실험에 걸쳐, TGFBR2/CISH 이중 녹아웃(DKO) NK 세포는 외인성 TGF-β의 보충을 포함하고(도 3a 및 도 3b, 및 도 4a 내지 도 4b) 및 외인성 TGF-β의 보충을 포함하지 않고(도 5a 및 도 5b), 두 종양 유형 모두에 대해 더 우수한 효과기 기능을 실증하였고 SK-OV-3 및 PC-3 종양 구형체 성장을 60% 초과만큼 약화시켰다. 이들 효과기 기능은 대조군 NK 세포 또는 TGFBR2 및 CISH 단일 녹아웃 NK 세포에 비해 통계적으로 더 컸다(모든 경우에서 p<0.0001). 또한, TFBR2/DISH DKO NK 세포는 ELISA에 의해 평가된 바와 같이 두 경우 모두에서 p<0.01로 더 높은 농도의 TNF-α(도 6a) 및 IFN-γ(도 6b)를 생산하였다.
이중 KO NK 세포는 대조군 NK 세포에 비해 유의미하게 더 높은 수준의 활성화 마커 CD25 및 CD69를 발현하였다(도 6c).
편집된 NK 세포의 항-종양 활성을 생체내 모델에서 측정하였다. NSG 마우스는 루시퍼라제로 표지된 500,000개의 SKOV3 종양 세포의 복강내 주사를 제공받았다. 종양 임플란트 후 7일째에, 천만 개의 편집된(CISH/TGFBR2 이중-녹아웃) 또는 편집되지 않은(대조군) NK 세포를 종양-보유 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 부담을 루시페린의 IP 투여 및 IVIS 조영으로 매주 모니터링하였다. 2원 ANOVA 분석을 34일차에 수행하여 대조군 및 DKO NK 세포군 간 통계적 유의성을 결정하였다(****, P<0.0001)(도 6d).
이들 결과는 CRISPR-Cpf1을 이용한 동시 2개의 고유 표적에서의 일차 인간 NK 세포의 효율적 편집을 실증한다. 더불어, 단일 녹아웃 또는 편집되지 않은 NK 세포 대비 시험관내 및 생체내 CISH/TGFBR2 DKO 일차 인간 NK 세포의 증가된 효과기 기능은 CISH/TGFBR2 DKO의 증강되고 상승적인 효과를 시사한다.
실시예 11: TIGIT, NKG2A 또는 ADORA2A의 기능 상실을 나타내는 유전자 편집된 NK 세포가 종양 세포에 반응하여 개선된 효과기 기능을 실증함
TIGIT, NKG2A, 또는 ADORA2A 유전자의 녹아웃을 통해 NK 세포 기능을 증강시키기 위해 CRISPR-Cpf1 유전자 편집을 사용하여 차세대 동종이형 NK 세포 치료법을 개발하였다.
NK 세포를 실시예 10에 전술된 바와 같이 증식시켰다. 간략하게, NK 세포를 IL15 중에서 14일 동안 생체외 증식시킨 후, 각각의 표적화 RNP 복합체로 편집하였다. 유전자 편집을 상이한 NK 세포 증식 단계(8일차 내지 21일차)에 수행하였다. TIGIT, NKG2A, 또는 ADORA2A의 편집을 위해, 대응하는 표적에 대한 가이드를 2:1 비로 Cpf1 뉴클레아제와 복합체화하여 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하였다. 세포를 두 표적 모두로 편집한 경우, 각각의 표적에 대한 RNP 복합체화를 별도로 수행한 후 전기천공 전에 1:1 비로 혼합하였다. NK 세포를 실시예 10에서 전술된 바와 같이 전기천공하였다.
하기 가이드 RNA 서열을 TIGIT, NKG2A, 또는 ADORA2A의 편집을 위해 사용하였다:
[표 13]
Figure pct00053
도 7a 내지 도 7c에서 실증된 바와 같이, TIGIT, NKG2A, 및 ADORA2A의 강력한 단일 유전자 편집을 NK 세포에서 달성하였다.
효과기 세포(상이한 RNP로 처리된 일차 인간 NK 세포)의 유효성을 시험관내 평가하여 3D 종양 구형체 검정법에 의해 TIGIT 단일 KO(도 8a 및 도 8b), NKG2A 단일 KO(도 9a 및 도 9b) 및 ADORA2A 단일 KO(도 10a 및 도 10b)의 기능을 결정하였다.
구형체를 형성하기 위해, 5,000개의 NucLight Red 표지된 PC-3 또는 SK-OV-3 종양 세포를 초저부착 96웰 플레이트의 단일 웰에 플레이트접종하고, 10분 동안 1,000 rpm에서 원심분리하고, 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 96시간째에, 효과기 세포(상이한 RNP로 처리된 일차 인간 NK 세포)를 10 ng/㎖의 TGF-베타를 포함하거나 포함하지 않고 여러 효과기 대 표적 세포 비로 구형체에 첨가하였다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 나타낸 데이터를 효과기 첨가 시의 적색 물체 세기에 대해 정규화한다.
2개의 고유 공여체 및 2회 독립 실험에 걸쳐, TIGIT 단일 KO(도 8a 및 도 8b), NKG2A 단일 KO(도 9a 및 도 9b) 및 ADORA2A 단일 KO(도 10a 및 도 10b) NK 세포는 더 우수한 효과기 기능을 실증하였고 SK-OV-3 및 PC-3 종양 구형체 성장을 약화시켰다. 이들 데이터는 CRISPR-Cpf1을 이용하는 3개의 독립적 고유 표적에서의 일차 인간 NK 세포의 효율적 편집이 편집되지 않은 NK 세포에 비해 시험관내 TIGIT 단일 KO, NKG2A 단일 KO 및 ADORA2A 단일 KO 일차 인간 NK 세포의 증가된 효과기 기능을 초래함을 실증한다.
실시예 12: CISH, TGFBR2 및 TIGIT의 기능 상실을 나타내는 유전자 편집된 NK 세포가 종양 세포에 반응하여 개선된 효과기 기능을 실증함
CISH, TGFBR2 및 TIGIT 유전자의 녹아웃을 통해 NK 세포 기능을 증강시키기 위해 CRISPR-Cpf1 유전자 편집을 사용하여 차세대 동종이형 NK 세포 치료법을 개발하였다.
NK 세포를 실시예 10에 전술된 바와 같이 증식시켰다. 간략하게, NK 세포를 IL15 중에서 14일 동안 생체외 증식시킨 후, 각각의 표적화 RNP 복합체로 편집하였다. 유전자 편집을 상이한 NK 세포 증식 단계(8일차 내지 21일차)에 수행하였다. CISH, TGFBR2 및 TIGIT의 편집을 위해, 표적에 대한 가이드를 Cpf1 뉴클레아제와 복합체화하여 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하고, 각각의 표적에 대한 RNP 복합체화를 별도로 수행한 후 전기천공 전에 1:1 비로 혼합하였다. NK 세포를 실시예 10에서 전술된 바와 같이 전기천공하였다.
CISH, TGFBR2 및 TIGIT의 편집을 위해 사용된 가이드 RNA 서열을 아래의 표 14에 나타낸다:
[표 14]
Figure pct00054
도 11에서 실증된 바와 같이, TGFBR2, CISH 및 TIGIT의 강력한 삼중-유전자 편집을 NK 세포에서 달성하였다.
효과기 세포의 유효성을 3D 종양 구형체 검정법에 의해 시험관내 평가하였다.
구형체를 형성하기 위해, 5,000개의 NucLight Red 표지된 PC-3 또는 SK-OV-3 종양 세포를 초저부착 96웰 플레이트의 단일 웰에 플레이트접종하고, 10분 동안 1,000 rpm에서 원심분리하고, 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 96시간째에, 효과기 세포(상이한 RNP로 처리된 일차 인간 NK 세포)를 10 ng/㎖의 TGF-베타를 포함하거나 포함하지 않고 여러 효과기 대 표적 세포 비로 구형체에 첨가하였다. 적색 물체 세기를 Incucyte 조영 시스템 상에서 6일 동안 2시간마다 측정하였다. 나타낸 데이터를 효과기 첨가 시의 적색 물체 세기에 대해 정규화한다. 구형체 곡선의 정규화는 정규화되지 않은 데이터에서 관찰된 것과 동일한 유효성 패턴을 유지한다.
TGFBR2/CISH/TIGIT 삼중 녹아웃(TKO) NK 세포는 더 우수한 효과기 기능을 실증하였고 SK-OV-3 및 PC-3 종양 구형체 성장을 약화시켰다(도 12a 및 도 12b). 이들 효과기 기능은 대조군 NK 세포보다 통계적으로 더 컸다. 이들 결과는 CRISPR-Cpf1을 이용한 동시 3개의 고유 표적에서의 일차 인간 NK 세포의 효율적 편집을 실증한다. 종합하면, 시험관내 그리고 편집되지 않은 세포 대비 CISH/TGFBR2/TIGIT TKO 일차 인간 NK 세포의 증가된 효과기 기능은 CISH/TGFBR2/TIGIT TKO의 증강된 효과를 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> EDITAS MEDICINE, INC. <120> MODIFIED NATURAL KILLER (NK) CELLS FOR IMMUNOTHERAPY <130> 126454-02320 <140> PCT/US2020/018443 <141> 2020-02-14 <150> 62/943,649 <151> 2019-12-04 <150> 62/841,684 <151> 2019-05-01 <150> 62/841,066 <151> 2019-04-30 <150> 62/806,457 <151> 2019-02-15 <160> 1168 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 aagaccuuuu 10 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 auguguuuuu gucaaaagac cuuuu 25 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 aggccagcuu gccgguuuuu uagucgugcu gcuucaugug uuuuugucaa aagaccuuuu 60 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 94 ggagcagcag gaccagcttc 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 95 cattacaaat ggccagaagc 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 96 ggccatttgt aatgctgact 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 97 gccatttgta atgctgactt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 98 ccatttgtaa tgctgacttg 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 99 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 105 gccactcgat ccttgaagga 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 106 ttcaaggatc gagtggcccc 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 tggggccact cgatccttga 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 108 gatcgagtgg ccccaggtcc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 109 agtggcccca ggtcccggcc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 110 gtggccccag gtcccggcct 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 gaggcccagg ccgggacctg 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 112 tgaggcccag gccgggacct 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 gtgaggccca ggccgggacc 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 tggagggtga ggcccaggcc 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 115 ctggagggtg aggcccaggc 20 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 137 gattccattg cttggagcca 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 138 tggctccaag caatggaatc 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 139 gcggccatgg ctccaagcaa 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 140 tggagccatg gccgcgacgc 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 141 agccatggcc gcgacgctgg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 142 gaccaccagc 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 175 gggctctgtg gagagcagcg 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 176 ctgtggagag cagcggggag 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 177 attgaagtag tcatgcagct 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 178 tgtcctgagt tacagaagcc 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 179 gtcctgagtt acagaagcct 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 180 tacccaggct tctgtaactc 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 181 tgaagaagct gcagttaccc 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 182 tgcagcttct tcacagagac 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 183 gttgtttcta ttgtgcctgt 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 184 cgttgtttct attgtgcctg 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 185 ccgttgtttc tattgtgcct 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 186 ccacggcaca agtgacccag 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 187 agttgacctg ggtcacttgt 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 188 aagtcagcat tacaaatggc 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 189 catccttcaa ggatcgagtg 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 190 atccttcaag gatcgagtgg 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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<400> 196 tgtatcgttc acggtcagcg 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 197 ctgtatcgtt cacggtcagc 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 198 atcagggtag gtgtgataga 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 199 agtgtacgtc ccatcagggt 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 200 ggaagattct cccagtgtac 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 201 tggaggtcct agaaagctca 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 207 cagaatggat tctgagggct 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 208 acagaatgga ttctgagggc 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 209 ttctgtggaa ggtgacctca 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 210 gctgattttc tcctgaggtc 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 211 tcctgtccag ctgattttct 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 212 ttcctcctgt 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<221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 218 ggcagaagct gcacctgctg 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 219 cagagcccag caggtgcagc 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 220 gctgctctcc acagagccca 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 221 cgctgctctc cacagagccc 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 222 atgtcctgag ttacagaagc 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 223 gagcacaccc actgcgatgt 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 224 gatggccagg agactgaaga 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 225 ctgctcaccg gagcgggatg 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 226 gtctgtggcc atgcccatca 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 227 tcaccggagc gggatgcgga 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 228 gtggcaggca gcgcagaacc 20 <210> 229 <211> 20 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239 gggttctgcg ctgcctgcca 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 240 ggacgaagca ggcaatgaag 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 241 gtgctgatgg tgatggcaaa 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 242 agcgcagaac ccggtgctga 20 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 243 gagctccatc ttcagtctcc 20 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 244 tgctgatggt gatggcaaag 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 245 ggcggcggcc gacatcgcag 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 246 aatgaagagg cagccgtggc 20 <210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 247 gggcaatgtg ctggtgtgct 20 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 248 catgcccatc atgggctcct 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 249 aatgtagcgg tcaatggcga 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 250 agtagttggt gacgttctgc 20 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 251 agcggtcaat ggcgatggcc 20 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 252 cgcatcccgc tccggtgagc 20 <210> 253 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 253 gcatcccgct ccggtgagca 20 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 254 tgggcaatgt gctggtgtgc 20 <210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 255 caactacttt gtggtgtcac 20 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 agctccaccg tgatgtacac c 21 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 gtagcggtca atggcgatgg c 21 <210> 295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 cggtgctgat ggtgatggca a 21 <210> 296 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 ccctgctcac cggagcggga t 21 <210> 297 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 gtgacgttct gcaggttgct g 21 <210> 298 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 298 gctccaccgt 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oligonucleotide" <400> 464 tggtgagtgg agggagtgcc c 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 465 gagggagtgc ccaagagtcc c 21 <210> 466 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 466 agggagtgcc caagagtccc a 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 467 gtctgggagg cccgtgttcc c 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 468 catggctaag gagctccacg t 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 469 gagctcctta gccatgagct c 21 <210> 470 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 534 tggcctagat gaccccctgg 20 <210> 535 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 535 tcctgggcca gggggtcatc 20 <210> 536 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 536 ctggcccagg atggagcagg 20 <210> 537 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 537 tggcccagga tggagcagga 20 <210> 538 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 538 cgcgagttcc gccagacctt 20 <210> 539 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 539 ccctggggct ggtgagtgga 20 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oligonucleotide" <400> 577 ctatgaggag tatgcctctt 20 <210> 578 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 578 aagaggcata ctcctcatag 20 <210> 579 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 579 tatgaggagt atgcctcttg 20 <210> 580 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 580 gattgatgtc tgagaagatg 20 <210> 581 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 581 ctcctcagcc gtcaggaact 20 <210> 582 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 582 gttcctgacg gctgaggagc 20 <210> 583 <211> 20 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 604 tgcgtctgga ccctactctg 20 <210> 605 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 605 cagacagagt agggtccaga 20 <210> 606 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 606 gccagcacga tcccaccgca 20 <210> 607 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 607 aaggaaaaaa aaaagcctgg 20 <210> 608 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 608 acaccagcaa tcctgacttg 20 <210> 609 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 609 actagcaaca agtcaggatt 20 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 631 gccgcgtcag gtactcctgt 20 <210> 632 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 632 gacgcggcat gtcatcagct 20 <210> 633 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 633 gcttctgctg ccggttaacg 20 <210> 634 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 634 gtggatgacc tggctaacag 20 <210> 635 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 635 gtgatcacac tccatgtggg 20 <210> 636 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 636 gcccattgag 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oligonucleotide" <400> 647 ccaccgcacg ttcagaagtc 20 <210> 648 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 648 tcacccgact tctgaacgtg 20 <210> 649 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 649 cccaccgcac gttcagaagt 20 <210> 650 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 650 cgagcagcgg ggtctgccat 20 <210> 651 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 651 acgagcagcg gggtctgcca 20 <210> 652 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 652 agcggggtct gccatgggtc 20 <210> 653 <211> 20 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 674 ttctccaaag tgcattatga 20 <210> 675 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 675 catcttccag aataaagtca 20 <210> 676 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 676 cacatgaaga aagtctcacc 20 <210> 677 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 677 ttccagaata aagtcatggt 20 <210> 678 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 678 ttttccttca taatgcactt 20 <210> 679 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 679 cacagttgtg gaaacttgac 20 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 717 agcagaacac ttcagagcag t 21 <210> 718 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 718 ccggcaagac gcggaagctc a 21 <210> 719 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 719 gatgtcagag cggtcatctt c 21 <210> 720 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 720 tcattgcact catcagagct a 21 <210> 721 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 721 cttccagaat aaagtcatgg t 21 <210> 722 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 722 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 851 gcgtggcctg gacaagcagt 20 <210> 852 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 852 gacaagcagt tggagtccag 20 <210> 853 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 853 gttggagtcc agacggaagc 20 <210> 854 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 854 atgcgtacat tggtggggcc 20 <210> 855 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 855 tggccccacc aatgtacgca 20 <210> 856 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 856 gctacctgtt cacgctgtca 20 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Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr 500 505 510 His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro 515 520 525 Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser 530 535 540 Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr 545 550 555 560 Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser 565 570 575 Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val 580 585 590 Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg 595 600 605 Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe 610 615 620 Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro 625 630 635 640 Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His 645 650 655 Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile 660 665 670 Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys 675 680 685 Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg 690 695 700 Glu Ala Leu Cys Lys Trp 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Lys Asn His Glu Ser Arg 1115 1120 1125 Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys 1130 1135 1140 Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser 1145 1150 1155 Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe 1175 1180 1185 Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe 1190 1195 1200 Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala 1205 1210 1215 Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile 1220 1225 1230 Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr 1235 1240 1245 Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn 1250 1255 1260 Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu 1265 1270 1275 Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro 1280 1285 1290 Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly 1295 1300 1305 Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu 1310 1315 1320 Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu 1325 1330 1335 Leu Arg Asn Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Leu Ala Ala Ala 1340 1345 1350 Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1150 <211> 1307 <212> PRT <213> Acidaminococcus sp. <400> 1150 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe 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Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn 1295 1300 1305 <210> 1151 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1151 uagauguucu caucuuuaau 20 <210> 1152 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1152 atgtgttttt gtcaaaagac ctttt 25 <210> 1153 <211> 20 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oligonucleotide" <400> 1168 atgtgttttt gtcaaaagac cttttuaauu ucuacucuug uagauugcag agaaaggugg 60 cucua 65

Claims (88)

  1. 변형된 림프구로서,
    (a) 내인성 CD3, CD4, 및/또는 CD8을 발현하지 않고;
    (b) (i) CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45;
    (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 클러스터 16(CD16));
    (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iv) CD69;
    (v) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하며, 추가로
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16)의 비-자연 생성 변이체;
    (iii) 인터류킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체;
    (v) 인터류킨 12(IL-12);
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하고/하거나
    2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1);
    (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
    (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
    (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B);
    (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    중 적어도 하나의 기능 상실을 나타내는 변형된 림프구.
  2. 제1항에 있어서, 림프구가
    (i) TGFβR2, CISH, TIGIT, ADORA2A, 또는 NKG2A;
    (ii) TGFβR2 및 CISH, TGFβR2 및 TIGIT, TGFβR2 및 ADORA2A, TGFβR2 및 NKG2A, CISH 및 TIGIT, CISH 및 ADORA2A, CISH 및 NKG2A, TIGIT 및 ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A, 또는 ADORA2A 및 NKG2A; 또는
    (iii) TGFβR2, CISH 및 TIGIT; TGFβR2, CISH 및 ADORA2A; TGFβR2, CISH 및 NKG2A; TGFβR2, TIGIT 및 ADORA2A; TGFβR2, TIGIT 및 NKG2A; TGFβR2, ADORA2A 및 NKG2A; CISH, TIGIT 및 ADORA2A; CISH, TIGIT 및 NKG2A; CISH, ADORA2A 및 NKG2A; 또는 TIGIT, ADORA2A 및 NKG2A
    의 기능 상실을 나타내는 변형된 림프구.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 림프구가 재배열된 내인성 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 포함하는 변형된 림프구.
  4. 제3항에 있어서, 재배열된 TCR이 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함하는 변형된 림프구.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 자연 세포독성 수용체가 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b인 변형된 림프구.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15R 변이체가 구성적으로 활성이 있는 IL-15R 변이체이고/이거나 IL12-R 변이체가 구성적으로 활성이 있는 IL12-R 변이체인 변형된 림프구.
  7. 제6항에 있어서, 구성적으로 활성이 있는 IL-15R 변이체가 IL-15R 및 IL-15R 작용제(IL-15RA) 간 융합물이고/이거나 구성적으로 활성이 있는 IL-12R 변이체가 IL-12R 및 IL-12R 작용제(IL-12RA) 간 융합물인 변형된 림프구.
  8. 제7항에 있어서, IL-15R 작용제가 IL-15, 또는 이의 IL-15R-결합 변이체이고/이거나 IL-12R 작용제가 IL-12, 또는 이의 IL-12R-결합 변이체인 변형된 림프구.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TGFβR2의 상실이 TGFβ 수용체 II의 우성-음성 변이체(DN-TGFβR2)의 외인성 발현과 연관되는 변형된 림프구.
  10. 제1항에 있어서, CAR이 메조텔린, EGFR, HER2, MICA/B, BCMA, CD19, CD22, CD20, CD33, CD123, 안드로겐 수용체, PSMA, PSCA, Muc1, HPV 바이러스 펩타이드(즉 E7), EBV 바이러스 펩타이드, CD70, WT1, CEA, EGFRvIII, IL13Rα2, 및 GD2, CA125, CD7, EpCAM, Muc16, 또는 CD30에 결합할 수 있는 변형된 림프구.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래되는 변형된 림프구.
  12. 제11항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 조혈 줄기 세포(HSC)인 변형된 림프구.
  13. 제11항에 있어서, 만능 줄기 세포가 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)인 변형된 림프구.
  14. 제11항에 있어서, 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ESC)인 변형된 림프구.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 림프구에 (1)(i) 내지 (1)(xi) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나 이상의 외인성 핵산 구축물; 및/또는 (2)(i) 내지 (2)(xi) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경을 포함하는 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래되는 변형된 림프구.
  16. 제15항에 있어서, 림프구가 림프구에 (2)(i) 내지 (2)(xi) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경을 포함하는 만능 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래되는 변형된 림프구.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 림프구에 하나 이상의 (2)(i) 내지 (2)(xi)의 기능-상실을 가져오는 적어도 하나의 게놈 변경이 외인성 핵산 구축물의 삽입을 포함하는 변형된 림프구.
  18. 제17항에 있어서, 외인성 핵산 구축물이 (1)(i) 내지 (1)(ix) 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 변형된 림프구.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 (2)에 열거된 유전자/단백질 증 2개 이상의 기능-상실을 나타내는 변형된 림프구.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 (2)의 유전자를 보유하거나 단백질을 인코딩하는 게놈 유전자좌 내로의 외인성 뉴클레오타이드 구축물의 인델 또는 삽입을 포함하는 변형된 림프구.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 (2)의 유전자를 보유하거나 단백질을 인코딩하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 내로의 외인성 뉴클레오타이드 구축물의 인델 또는 삽입을 포함하는 변형된 림프구.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 RNA-가이드 뉴클레아제로 게놈 유전자좌를 편집함으로써 수득되는 변형된 림프구.
  23. 제22항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제가 CRISPR/Cas 뉴클레아제인 변형된 림프구.
  24. 제22항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제가 SpCas9, SaCas9, (KKH) SaCas9, AsCpf1(AsCas12a), LbCpf1, (LbCas12a), CasX, CasY, Cas12h1, Cas12i1, Cas12c1, Cas12c2, eSpCas9, Cas9-HF1, HypaCas9, dCas9-Fokl, Sniper-Cas9, xCas9, AaCas12b, evoCas9, SpCas9-NG, VRQR, VRER, NmeCas9, CjCas9, BhCas12b, 및 BhCas12b V4로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 림프구.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌를 편집함으로써 수득되는 변형된 림프구.
  26. 제25항에 있어서, (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 중 적어도 2개가 상이한 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 편집된 변형된 림프구.
  27. 제25항에 있어서, (2)의 임의의 단백질을 인코딩하는 유전자를 보유하는 2개 이상의 게놈 유전자좌 중 적어도 하나가 Cas9에 의해 편집되었고, 유전자좌 중 적어도 하나가 Cpf1에 의해 편집된 변형된 림프구.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 CD56, CD49, 및 CD45를 발현하는 변형된 림프구.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구가 자연 살해(NK) 세포인 변형된 림프구.
  30. 변형된 세포로서,
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16)의 비-자연 생성 변이체;
    (iii) 인터류킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체;
    (v) 인터류킨 12(IL-12);
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하고/하거나;
    (2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1);
    (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
    (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
    (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B);
    (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    중 적어도 하나의 기능 상실을 나타내는 변형된 세포.
  31. 제30항에 있어서,
    (i) TGFβR2, CISH, TIGIT, ADORA2A, 또는 NKG2A;
    (ii) TGFβR2 및 CISH, TGFβR2 및 TIGIT, TGFβR2 및 ADORA2A, TGFβR2 및 NKG2A, CISH 및 TIGIT, CISH 및 ADORA2A, CISH 및 NKG2A, TIGIT 및 ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A, 또는 ADORA2A 및 NKG2A; 또는
    (iii) TGFβR2, CISH 및 TIGIT; TGFβR2, CISH 및 ADORA2A; TGFβR2, CISH 및 NKG2A; TGFβR2, TIGIT 및 ADORA2A; TGFβR2, TIGIT 및 NKG2A; TGFβR2, ADORA2A 및 NKG2A; CISH, TIGIT 및 ADORA2A; CISH, TIGIT 및 NKG2A; CISH, ADORA2A 및 NKG2A; 또는 TIGIT, ADORA2A 및 NKG2A
    의 기능 상실을 나타내는 변형된 세포.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 면역 세포인 변형된 세포.
  33. 제32항에 있어서, 면역 세포가 림프구인 변형된 세포.
  34. 제33항에 있어서, 림프구가 NK 세포인 변형된 세포.
  35. 제30항에 있어서, 세포가 만능 줄기 세포, 또는 이로부터 유래된 분화된 딸 세포인 변형된 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 내인성 T-세포 공동-수용체를 발현하지 않는 변형된 세포.
  37. 제33항에 있어서, 림프구가 T 세포인 변형된 세포.
  38. 제30항에 있어서, 세포가 재배열된 내인성 TCR 유전자좌를 포함하며, 재배열된 TCR이 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함하는 변형된 세포.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45;
    (ii) FcγRIII(CD16);
    (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iv) CD69;
    (v) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하는 변형된 세포.
  40. 제39항에 있어서, 자연 세포독성 수용체가 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b인 변형된 세포.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 적어도 하나의 NK 세포 바이오마커를 발현하는 변형된 세포.
  42. 제41항에 있어서, NK 세포 바이오마커가 CD56, CD49, 및/또는 CD45인 변형된 세포.
  43. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 변형된 림프구, 또는 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항의 변형된 세포를 포함하는 세포 집단.
  44. 제43항의 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물.
  45. 단리된 림프구 집단으로서, 집단이 적어도 1x103, 적어도 1x104, 적어도 1x105, 적어도 2x105, 적어도 3x105, 적어도 4x105, 적어도 5x105, 적어도 1x106, 적어도 2x106, 적어도 3x106, 적어도 4x106, 적어도 5x106, 적어도 1x107, 적어도 1x107, 적어도 2x107, 적어도 3x107, 적어도 4x107, 적어도 5x107, 적어도 1x108, 적어도 2x108, 적어도 3x108, 적어도 4x108, 적어도 5x108, 적어도 1x109, 적어도 1x109, 적어도 2x109, 적어도 3x109, 적어도 4x109, 적어도 5x109, 적어도 1x1010, 적어도 2x1010, 적어도 3x1010, 적어도 4x1010, 적어도 5x1010, 적어도 1x1011, 또는 적어도 1x1012 세포를 포함하며, 집단에서 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 적어도 99.99%, 적어도 99.999%, 또는 실제로 100%의 림프구가
    (a) 재배열된 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 포함하며;
    (b) 내인성 CD3을 발현하지 않고;
    (c) 내인성 CD56(NCAM), CD49, 및/또는 CD45를 발현하고;
    (d) (i) FcγRIII(CD16);
    (ii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iii) CD69;
    (iv) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하고;
    변형된 림프구가 추가로
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, CD16)의 비-자연 생성 변이체;
    (iii) 인터류킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R), 또는 이의 변이체;
    (v) 인터류킨 12(IL-12);
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R), 또는 이의 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 외인성 핵산 발현 구축물을 포함하고/하거나;
    (2) (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1);
    (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
    (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
    (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B);
    (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    중 적어도 하나의 기능 상실을 나타내는 단리된 림프구 집단.
  46. 제45항에 있어서, 변형된 림프구가
    (i) TGFβR2, CISH, TIGIT, ADORA2A, 또는 NKG2A;
    (ii) TGFβR2 및 CISH, TGFβR2 및 TIGIT, TGFβR2 및 ADORA2A, TGFβR2 및 NKG2A, CISH 및 TIGIT, CISH 및 ADORA2A, CISH 및 NKG2A, TIGIT 및 ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A, 또는 ADORA2A 및 NKG2A; 또는
    (iii) TGFβR2, CISH 및 TIGIT; TGFβR2, CISH 및 ADORA2A; TGFβR2, CISH 및 NKG2A; TGFβR2, TIGIT 및 ADORA2A; TGFβR2, TIGIT 및 NKG2A; TGFβR2, ADORA2A 및 NKG2A; CISH, TIGIT 및 ADORA2A; CISH, TIGIT 및 NKG2A; CISH, ADORA2A 및 NKG2A; 또는 TIGIT, ADORA2A 및 NKG2A
    의 기능 상실을 나타내는 단리된 림프구 집단.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 재배열된 TCR 유전자좌가 TCRα VJ 및/또는 TCRβ V(D)J 절편 재배열 및 전체 V-도메인 엑손을 포함하는 단리된 림프구 집단.
  48. 제47항에 있어서, 재배열된 내인성 TCR 유전자좌가 2개 이하의 재배열된 대립유전자로 구성되는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  49. 제45항에 있어서, 자연 세포독성 수용체가 NKp30, NKp44, NKp46, 및/또는 CD158b인 단리된 시험관내 림프구 집단.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 집단이 외인성 핵산 구축물로부터의 재프로그래밍 인자를 발현하는 1% 초과, 0.1% 초과, 0.001% 초과, 0.0001% 초과, 0.00001% 초과, 0.000001% 초과, 0.0000001% 초과, 0.00000001% 초과, 0.000000001% 초과, 0.0000000001% 초과, 또는 0.00000000001% 초과 세포를 포함하지 않는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  51. 제50항에 있어서, 집단이 외인성 핵산 구축물로부터의 재프로그래밍 인자를 발현하는 세포를 포함하지 않는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 재프로그래밍 인자가 Oct-4 및/또는 Sox-2인 단리된 시험관내 림프구 집단.
  53. 제45항에 있어서, 집단이 재프로그래밍 인자를 인코딩하는 에피솜 발현 구축물을 보유하는 세포를 포함하지 않는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단 내 각각의 세포가 (1) 및 (2)의 동일한 조합을 포함하는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 염색체 전위를 보유하는 0.001% 미만, 0.002% 미만, 0.003% 미만, 0.004% 미만, 0.005% 미만, 0.006% 미만, 0.007% 미만, 0.008% 미만, 0.009% 미만, 0.01% 미만, 0.02% 미만, 0.03% 미만, 0.04% 미만, 0.05% 미만, 0.06% 미만, 0.07% 미만, 0.08% 미만, 0.09% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 또는 10% 미만의 세포를 포함하는 단리된 시험관내 림프구 집단.
  56. 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 림프구, 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항의 변형된 세포, 제41항의 세포 집단, 제44항의 약제학적 조성물, 또는 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항의 단리된 시험관내 림프구 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 대상체가 증식성 질병을 갖거나 이로 진단받은 방법.
  58. 제57항에 있어서, 증식성 질병이 암인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 위암, 신세포 암종(RCC), 또는 비-소세포 폐암(NSCLC), 고형 종양, 방광암, 간세포 암종, 전립샘암, 난소암/자궁암, 췌장암, 중피종, 흑색종, 교모세포종, HPV-연관 및/또는 HPV-양성 암, 예컨대 자궁경부암 및 HPV+ 두부경부암, 구강암, 인두암, 갑상샘암, 담낭암, 연조직 육종, 및 ALL, CLL, NHL, DLBCL, AML, CML, 다발 골수종(MM)과 같은 혈액암인 방법.
  60. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 림프구, 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항의 변형된 세포, 제43항의 세포 집단, 또는 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항의 단리된 시험관내 림프구 집단을 생성하는 방법으로서,
    (a) 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 수득하는 단계;
    (b) (1)의 적어도 하나의 외인성 핵산 발현 구축물의 발현을 포함하고/하거나 (2)의 적어도 하나의 유전자의 기능 상실을 포함하도록 iPSC, 또는 이의 분화되지 않은 또는 분화된 딸 세포를 변형하는 단계,
    (c) iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 단계
    를 포함하며, 조혈 계통 세포가 iPSC에 포함된 편집된 유전적 유전자좌를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 분화를 유도하는 단계가
    (i) iPSC를 BMP 경로 활성화제, 및 선택적으로 bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시켜 중배엽 세포를 수득하는 단계; 및
    (ii) 중배엽 세포를 BMP 경로 활성화제, bFGF, 및 WNT 경로 활성화제를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 수득하는 단계로서, 확정적 혈액생성 내피(HE) 잠재력을 갖는 중배엽 세포가 조혈 계통 세포를 제공할 수 있는, 단계;
    를 포함하며, 중배엽 세포 및 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포가, 배아체를 형성하는 단계 없이 단계 (i) 및 (ii)에서 수득되고;
    조혈 계통 세포가 확정적 혈액생성 내피 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSC), 조혈 다능성 전구 세포(MPP), 프리-T 세포 전구 세포, 프리-NK 세포 전구 세포, T 세포 전구 세포, NK 세포 전구 세포, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 B 세포를 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, iPSC의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하는 단계가 확정적 HE 잠재력을 갖는 중배엽 세포를 bFGF 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 확정적 HE 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 확정적 HE 세포를 BMP 활성화제, 및 선택적으로 ROCK 저해제, 및 TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L 및 IL11로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 조성물과 접촉시켜 조혈 다능성 전구 세포(MPP)를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로 BMP 활성화제, ROCK 저해제, TPO, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-T 세포 전구체, T 세포 전구체, 및/또는 T 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 확정적 HE 세포를 SCF, Flt3L, TPO, IL7 및 IL15로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로 BMP 활성화제, ROCK 저해제, VEGF 및 bFGF 중 하나 이상을 포함하는 조성물과 접촉시켜 프리-NK 세포 전구체, NK 세포 전구체, 및/또는 NK 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 전에, 만능 줄기 세포를 MEK 저해제, GSK3 저해제, 및 ROCK 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 세포를 접종하고 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  67. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 계통 세포에서 재배열된 T-세포 수용체(TCR) 유전자좌를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 관심 항원에 결합하는 재배열된 TCR 유전자좌에 의해 인코딩되는 TCR에 기반하여 재배열된 TCR 유전자좌를 포함하는 조혈 계통 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 관심 항원이 종양 항원인 방법.
  70. 공여체 세포를 만능 상태로 재프로그래밍하는 단계;
    공여체 세포 게놈 내 표적 유전자좌를 편집하는 단계; 및
    재프로그래밍된 공여체 세포를 림프구로 분화시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 편집하는 단계가 공여체 세포를 만능 상태로 재프로그래밍하는 단계 전에 또는 동안에 수행되는 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 공여체 세포가 섬유아세포, 말초혈 세포, 림프구, 또는 T 세포인 방법.
  73. 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포를 림프구로 분화시키는 단계를 포함하며, 유전적으로 변형된 만능 줄기 세포가
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열;
    (ii) FcγRIII(CD16)의 비-자연 생성 변이체를 인코딩하는 핵산 서열;
    (iii) 인터류킨 15(IL-15)를 인코딩하는 핵산 서열;
    (iv) 인터류킨 15 수용체(IL-15R) 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열;
    (v) 인터류킨 12(IL12)를 인코딩하는 핵산 서열;
    (vi) 인터류킨-12 수용체(IL-12R) 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 서열;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G)를 인코딩하는 핵산 서열;
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E)를 인코딩하는 핵산 서열;
    (ix) 백혈구 표면 항원 분화 클러스터 CD47(CD47)을 인코딩하는 핵산 서열;
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    을 포함하는 외인성 핵산 발현 구축물; 및
    (2) 하기 유전적 유전자좌:
    (i) 전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFβR2);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279);
    (vi) 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH);
    (vii) 클래스 II, 주 조직 적합성 복합체, 트랜스활성화제(CIITA);
    (viii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (ix) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자, 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (x) 분화 클러스터 32B(CD32B, FCGR2B);
    (xi) T 세포 수용체 알파 불변체(TRAC);
    또는 이들 중 2개 이상의 임의의 조합
    중 하나 이상에 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입
    을 포함하며, 인델 또는 삽입이 각각의 유전적 유전자좌 또는 유전자좌들에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 외인성 핵산의 인델, 또는 삽입이 하기 유전적 유전자좌:
    (i) TGFβR2, CISH, TIGIT, ADORA2A, 또는 NKG2A;
    (ii) TGFβR2 및 CISH, TGFβR2 및 TIGIT, TGFβR2 및 ADORA2A, TGFβR2 및 NKG2A, CISH 및 TIGIT, CISH 및 ADORA2A, CISH 및 NKG2A, TIGIT 및 ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A, 또는 ADORA2A 및 NKG2A; 또는
    (iii) TGFβR2, CISH 및 TIGIT; TGFβR2, CISH 및 ADORA2A; TGFβR2, CISH 및 NKG2A; TGFβR2, TIGIT 및 ADORA2A; TGFβR2, TIGIT 및 NKG2A; TGFβR2, ADORA2A 및 NKG2A; CISH, TIGIT 및 ADORA2A; CISH, TIGIT 및 NKG2A; CISH, ADORA2A 및 NKG2A; 또는 TIGIT, ADORA2A 및 NKG2A
    에 있으며, 인델 또는 삽입이 각각의 유전적 유전자좌 또는 유전자좌들에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 기능-상실을 초래하는 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, (2)의 외인성 핵산이 (1)의 외인성 핵산인 방법.
  76. 제73항 또는 제75항에 있어서, 만능 줄기 세포가 iPS 세포인 방법.
  77. 제73항 또는 제75항에 있어서, 분화시키는 단계가 만능 줄기 세포를 분화 배지 또는 일련의 분화 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  78. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 알파 사슬 유전자가 HLA-DQA1, HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DMA, HLA-DQA2, 및 HLA-DOA로부터 선택되는 변형된 림프구.
  79. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직 적합성 항원 베타 사슬 유전자가 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB3, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, 및 HLA-DRB5로부터 선택되는 변형된 림프구.
  80. 제1항 내지 제29항, 및 제78항 및 제79항 중 어느 한 항, 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항, 제43항, 제44항, 제45항 내지 55항 중 어느 한 항, 또는 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 발현 구축물이 이종성 프로모터의 제어 하에 (1)에 열거된 인코딩 핵산 서열을 포함하는 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 약제학적 조성물, 단리된 시험관내 림프구 집단, 또는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 이종성 프로모터가 NK-세포 특이적 프로모터인 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 약제학적 조성물, 단리된 시험관내 림프구 집단, 또는 방법.
  82. 제80항에 있어서, NK-세포 특이적 프로모터가 NK 세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 공지된 유전자의 프로모터, 또는 이의 변이체인 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 약제학적 조성물, 단리된 시험관내 림프구 집단, 또는 방법.
  83. 제80항에 있어서, NK-세포 특이적 프로모터가 CD56(NCAM), CD49, 또는 CD45 프로모터, 또는 이의 변이체인 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 약제학적 조성물, 단리된 시험관내 림프구 집단, 또는 방법.
  84. 제80항에 있어서, NK-세포 특이적 프로모터가 FcγIII 프로모터, NKG2D 프로모터, CD69 프로모터, 또는 자연 세포독성 수용체 프로모터, 또는 이의 변이체인 변형된 림프구, 변형된 세포, 세포 집단, 약제학적 조성물, 단리된 시험관내 림프구 집단, 또는 방법.
  85. 제1항 내지 제29항, 제78항, 제79항, 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항의 변형된 림프구, 변형된 세포, 또는 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 대상체가 증식성 질병을 갖거나, 이로 진단받은 방법.
  87. 제86항에 있어서, 증식성 질병이 암인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 위암, 신세포 암종(RCC), 또는 비-소세포 폐암(NSCLC), 고형 종양, 방광암, 간세포 암종, 전립샘암, 난소암/자궁암, 췌장암, 중피종, 흑색종, 교모세포종, HPV-연관 및/또는 HPV-양성 암, 예컨대 자궁경부암 및 HPV+ 두부경부암, 구강암, 인두암, 갑상샘암, 담낭암, 연조직 육종, 및 ALL, CLL, NHL, DLBCL, AML, CML, 다발 골수종(MM)과 같은 혈액암인 방법.
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