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KR20210127714A - 항체-약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

항체-약물 접합체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210127714A
KR20210127714A KR1020217028498A KR20217028498A KR20210127714A KR 20210127714 A KR20210127714 A KR 20210127714A KR 1020217028498 A KR1020217028498 A KR 1020217028498A KR 20217028498 A KR20217028498 A KR 20217028498A KR 20210127714 A KR20210127714 A KR 20210127714A
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KR
South Korea
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ser
antibody
compound
val
thr
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217028498A
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English (en)
Inventor
정진원
김주희
박영돈
송대해
염동훈
엄재현
홍영은
이보라
Original Assignee
에이비엘바이오 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에이비엘바이오 주식회사 filed Critical 에이비엘바이오 주식회사
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Abstract

본 발명은 갈락토오스 트리거(trigger) 모이어티와 CBI (cyclopropabenzindole)를 포함하는 신규 화합물, 및 이를 이용하여 제조된 항체-약물 접합체에 관한 것이다.

Description

항체-약물 접합체 및 이의 용도
본 발명은 갈락토오스 트리거(trigger) 모이어티와 CBI (cyclopropabenzindole)를 포함하는 신규 화합물, 및 이를 이용하여 제조된 항체-약물 접합체에 관한 것이다.
최근 다양한 질환에 대하여 항체를 이용한 진단 또는 치료 방법이 연구되고 있다. 특히, 항체의 표적 특이성 때문에 항체를 이용한 다양한 치료 방법이 개발되고 있으며, 항체를 포함하는 다양한 형태의 의약, 예를 들어 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)등이 개발되고 있다. 이에, 항체 또는 항체-약물 결합체에 대하여 생체 내 안정성을 증가시키고, 치료 효과를 극대화하는 방법이 계속적으로 연구되고 있다.
이 중 ADC는 일반적으로 천연 항체에 비해서 생체 내 안정성이 낮은 단점이 있으나, 천연 항체가 가진 단점인 낮은 치료 효과를 약물과의 결합을 통하여 개선하고자 개발되었다. 표적 특이적 항체에 싸이토톡신 등 특정 약효를 가지는 약물이 다양하게 결합한 형태로 개발되고 있으며, 암세포 특이적 항체에 약물을 결합시켜 암세포 사멸을 유도할 수 있는 항체-약물 결합체가 상용화된 바 있다.
약물 중 DNA 마이너 그루브 알킬화제 (DNA minor groove alkylating agent)를 페이로드로 포함하는 ADC에 대한 임상이 진행되고 있다. 이러한 약물의 예시로, PBD (pyrrolobenzodiazepine) 다이머, CBI (cyclopropabenzindol) 기반 듀오카마이신 유도체가 포함된다. 특히, CBI의 경우 다수의 암에 대한 세포독성이 나타나는 것으로 알려져 있으며, CBI 다이머 또한 매우 높은 정도의 세포독성이 나타나는 것으로 보고된 바 있다 (Tietze et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2010, 49, 7336-7339).
타겟 암세포에 아직 전달되기 전에 ADC에서 링커가 우발적 절단되어, 약물이 조기 방출이 진행되어 전신 독성 위험이 있을 수 있다. 약물이 강력한 세포독성을 나타내는 경우 위험성은 커질 수 있다. 이를 방지하고자, 약물을 유도체화하여 리소좀 내부에서 절단되는 유도체를 사용하면, 유도체가 트리거 (프로드럭화 기능기)로 작용함으로써, 활성인 세포독성 약물이 방출되기까지 링커 이외에도 트리거도 절단되어야 하므로, 위험성을 감소시킬 수 있다.
CBI에 트리거로 카바메이트기, 포스페이트기가 부착될 수 있음이 고려되어 왔다. 카바메이트기를 트리거로 사용하는 경우 리소좀 및/또는 세포질 내에서 카르복시에스테라제에 의해 카바메이트기가 절단될 수 있다. 포스페이트기를 트리거로 사용하는 경우 리소좀 및/또는 세포질 내에서 포스파타제에 의해 포스페이트기가 절단될 수 있다. 그러나, 위와 같은 종래의 트리거 역시 안전성 문제는 여전히 제기되고 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 종래의 트리거에 비해 더욱 타겟 특이적인 독성을 나타내어 향상된 안전성을 가지는 동시에 효과적으로 약물의 활성을 나타낼 수 있는 트리거 모이어티를 개발하기 위하여 노력한 결과, 갈락토오스를 트리거로 포함하는 프로드럭 약물을 ADC에 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 트리거 모이어티가 결합된 CBI 다이머 화합물인 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하는 데 있다.
[화학식 I]
Figure pct00001
[화학식 II]
Figure pct00002
본 발명의 목적은 트리거 모이어티가 결합된 CBI 다이머 화합물인 화학식 (II)로 표시되는 화합물과 항체가 결합된, 화학식 (III)로 표시되는 항체-약물 접합체를 제공하는 데 있다.
[화학식 III]
Figure pct00003
본 발명의 목적은 상기 항체-약물 접합체를 포함하는 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 (I)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
Figure pct00004
상기 화학식에서, R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이다.
본 발명은 또한, 다음의 화학식 (II)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다:
Figure pct00005
상기 화학식에서, R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
W는 스페이서이고;
L1은 링커이다.
본 발명은 또한, 다음의 화학식 (III)으로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
Figure pct00006
상기 화학식에서,
R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
W는 스페이서이고;
L2는 링커이며;
Ab는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
본 발명은 또한, 상기 접합체를 포함하는 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
도 1은 프로드럭 CBI 다이머가 활성화 상태로 변환되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 다양한 종양 세포주에서 베타-갈락토시다제의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 프로드럭 CBI 다이머의 유리 약물에 대한 효능을 확인한 결과를 나타낸것이다.
도 4는 SE-HPLC에 의해 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 SE-HPLC에 의해 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 순도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 LC/MS에 의해 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 DAR을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 LC/MS에 의해 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 DAR을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 H929 세포주에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vitro Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Mino 및 Jeko-1 세포주 각각에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vitro Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 NCI-N87 및 HCC1954 세포주 각각에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vitro Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 OVCAR-3 세포주에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vitro Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 Jeko-1 model에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vivo Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 Multiple Myeloma Model Xenograft에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vivo Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 AML Model Xenograft에서 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 In vivo Cytotoxicity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 ADC를 투여한 동물에서 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 ADC를 투여한 동물에서 혈중 백혈구 수치의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 혈액 중 생화학적 파라미터인 ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase) 및 혈중 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN)에 대한 분석을 통해 ADC의 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 랫트 단회 투여 독성시험에서 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 혈액학적 검사에 따른 백혈구 수치 변화 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 SD 랫트에 단회 투여한 후 체중의 변화와 혈액학적, 혈액생화학적 변화를 관찰하여 독성 발현의 여부와 회복을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 다음의 화학식 (I)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물에 관한 것이다.
Figure pct00007
상기 화학식에서,
R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이다.
본 발명은 일 관점에서, 다음의 화학식 (II)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물에 관한 것이다.
Figure pct00008
상기 화학식에서, R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
W는 스페이서이고;
L1은 링커이다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음의 화학식 (III)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다:
Figure pct00009
상기 화학식에서,
R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
R2는 Cl 또는 Br이고;
R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
W는 스페이서이고;
L2는 링커이며;
Ab는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
상기 화학식 (I), (II) 및 (II)의 화합물은 종래 알려진 바 없는 신규 화합물인 동시에, 화학식 (I)의 화합물은 항체-약물 복합체 및 링커-약물 복합체의 제조를 위한 약물+테더 (tether), 화학식 (II)의 화합물은 항체-약물 접합체의 제조를 위한 링커-약물 복합체, 그리고 화학식 (III)의 화합물은 항체-약물 접합체 또는 이의 프로드럭으로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 화학식 (I), (II) 또는 (III)에서 R1은 프로드럭의 트리거를 나타내고, 도 1에서와 같이 트리거는 세포 내에서 효소를 통해 제거되어 세포독성 약물인 CBI 다이머를 활성화할 수 있다. 트리거 R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이다.
본 명세서에서 프로드럭은 트리거 R1에 의해 비활성인 CBI 다이머가 생체내 특정 생리학적 조건에서 효소 산화(enzymatic oxidation), 환원(reduction) 및/또는 가수분해 등에 의해 활성을 나타내는 약물, 예를 들어 세포독성 특성을 나타내는 CBI 다이머로 변환할 수 있는 화합물을 의미할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 트리거로 포스페이트기를 포함하는 경우 세포독성 효능은 우수하나, 심각한 신장 독성이 유발될 수 있고, 이에 따라 불가역적 신장 장애를 동반할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이론에 구애받지 않으나, 트리거로 포스페이트기를 포함하는 ADC는 혈청에서 안정하지 않은 것으로 판단된다.
그러나, 본 발명에 따르면 R1에 갈락토오스의 아이소머 형태인 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스를 트리거로 포함함으로써, 목적하는 타겟 특이적 세포독성을 유지하면서도 원치 않는 생체 내 독성에 대한 문제를 해결할 수 있음을 확인하였다.
갈락토오스를 트리거로 사용하는 경우, 이를 활성화할 수 있는 효소가 타겟 세포, 예를 들어 증식성 질환을 나타내는 세포, 구체적으로 암 세포에서 높게 발현될 수 있다.
하나의 구현예에서, R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고, 이 때 효소는 갈락토시다제, 구체적으로 베타-갈락토시다제일 수 있다. 베타-갈락토시다제는 리소좀 효소 (lysosomal enzyme)로, 대부분의 암세포에서 높은 수준의 베타-갈락토시다제가 발현되어 종양 선별 활성화 효소로 판별될 수 있음이 확인되었다 (도 2).
하나의 구현예에서, 상기 화학식 (II) 또는 (III) 중 다음의 모이어티는 CBI 다이머 각각을 연결하여, 약리학적 효과를 증진시킬 수 있으며, 화학식 (II)에서의 스페이서 W와 링커 L1 및 화학식 (III)에서의 스페이서 W와 링커 L2 및 약물을 안정적으로 결합시키기 위한 테더 (tether)를 나타낸다.
Figure pct00010
상기 테더 중 R3는 단일 결합, -O- 또는 -NH-이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 접합체는 다음의 화학식으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
상기 화학식 (II) 및 화학식 (III) 중 링커 L이 스페이서 W에 연결되며, 스페이서는 타겟에 약물을 전달하기 위해 항체가 결합되는 경우 항체와 약물 사이의 충분한 거리를 유지할 수 있도록 한다. 경우에 따라서, 용해도 개선을 위한 친수성 모이어티를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서는, 상기 스페이서를 포함하여 "링커"라고 지칭할 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 스페이서 W는 -R4-A-R5-, -R4-A-, -(CH2CH2R6)x-, -(CH2)r(R7(CH2)p)q-, -((CH2)pR7)q-, -(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-, -((CH2)pR7)q(CH2)r-, - R8((CH2)pR7)q- 또는 -(CH2)r(R7(CH2)p)q R8CH2-이고,
여기서 R4 및 R5는 각각 독립적으로 -(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q이고, A는 직접 결합 또는 펩티드 결합이고, V는 단일 결합, O 또는 S이고,
R6은 -O-, C1-C8 알킬렌, -NR9- 또는 -C(O)NR2-이고,
R7 및 R8은 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -NR10-, -C(O)NR11-, -NR12C(O)- 또는 C3-C20 헤테로아릴이며,
R9 내지 R12는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C20 아릴 또는 C1-C6 알킬C3-C20 헤테로아릴이고,
x는 1 내지 5의 정수이고, r은 0 내지 10의 정수이고, p는 0 내지 10의 정수이고, q는 0 내지 20의 정수이고,
선택적으로, 상기 W 내의 1 내지 10 개의 수소는 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 화학식 (II) 또는 상기 화학식 (III) 중 W는 다음을 포함할 수 있다:
(1) -R4-A-R5- 또는 -R4-A-, 여기서 R4 및 R5는 각각 독립적으로 -(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q이고, A는 직접 결합 또는 펩티드 결합이고, V는 단일 결합, O 또는 S이다.
x는 1 내지 5의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
r은 0 내지 10의 정수, 구체적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이며,
p는 0 내지 10의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 또는 구체적으로 0 내지 7의 정수, 또는 0 내지 5의 정수이고,
q는 0 내지 20의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 구체적으로 0 내지 10의 정수, 0 내지 7의 정수 또는 0 내지 5의 정수이다.
(2) -(CH2CH2R6)x-로 표시되는 화합물을 포함하거나, -((CH2)pR7)q(CH2)r-로 표시되는 화합물을 포함하거나, -(CH2)r(R7(CH2)p)qR8CH2-로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
이 때, R6은 -O-, C1-C8 알킬렌, -NR9- 또는 -C(O)NR13-이고,
R7 및 R8은 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -NR10-, -C(O)NR11-, -NR12C(O)- 또는 C3-C20, 구체적으로 C3-C15, 더욱 구체적으로 C3-C12 헤테로아릴이며,
R9 내지 R13는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, (C1-C6 알킬)C6-C20 구체적으로 C3-C15, 더욱 구체적으로 C3-C12 아릴 또는 (C1-C6 알킬)C3-C20 구체적으로 C3-C15, 더욱 구체적으로 C3-C12 헤테로아릴이다.
x는 1 내지 5의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
r은 0 내지 10의 정수, 구체적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 또는 구체적으로 0 내지 7의 정수 또는 0 내지 5의 정수이며,
p는 0 내지 10의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 또는 구체적으로 0 내지 7의 정수 또는 0 내지 5의 정수이고,
q는 0 내지 20의 정수, 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 구체적으로 0 내지 10의 정수, 0 내지 7의 정수 또는 0 내지 5의 정수이다.
상기 화학식 (II) 중 링커 L1 또는 화학식 (III) 중 L2는 항체와 약물을 안정적으로 연결시키고, 체내 순환시 타겟 세포까지 도달 후 항체-약물 접합체가 세포 내로 들어가 항체-약물간 해리현상에 의해 약물이 잘 떨어지면서 타겟 암세포에 약효를 나타내도록 하는 역할을 한다.
상기 화학식 (II) 중 링커 L1은 하이드록시, 알데히드, ONH2, NH2, 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 1 개 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하는 4 내지 7-원 또는 5 내지 7-원 헤테로아릴로서, 상기 헤테로아릴은 하이드록시, 알데히드, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 치환될 수 있다.
상기 화학식 (III) 중 L2는 -CH2NH-, -ON=C(CH3)-, -ON=, 또는, N, O 및 S로부터 선택되는 1 개 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하는 4 내지 7-원 또는 5 내지 7-원 헤테로사이클로서, 상기 헤테로사이클은 하이드록시, 알데히드, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 치환될 수 있다.
구체적으로, 링커 L1 또는 L2는 NH2, -OH, -ONH2　(히드록실아민), -NH2 알데히드 (포르밀), -CO2H, -SH, 2-포밀피리딘, 설폰아미드, (헤테로)사이클로옥틴, 아지드 (-N3),　또는 말레이미드기를 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 화학식 (II) 중 링커 L1 또는 화학식 (III) 중 L2는 다음의 화학식 (IV)으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다;
Figure pct00013
a는 0 또는 1이고,
R13은 C1-C24 알킬, C3-C24 시클로알킬, C3-C24 아릴, C3-C24 헤테로아릴, C3-C24 알킬아릴, C3-C24 알킬헤테로아릴, C3-C24 아릴알킬 및 C3-C24 헤테로아릴알킬로부터 선택되며, 상기 헤테로아릴은 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하고, 여기서 R14는 수소 또는 C1-C4 알킬기이다.
구체적으로, 상기 화학식 (II) 중 링커 L1는 아래의 화학식 (I-a) 또는 (I-b)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00014
여기서 Q1은 시클로옥티닐 또는 헤테로시클로옥티닐이고, 상기 시클로옥티닐 또는 헤테로시클로옥티닐은 임의로 C3-C12 시클로알킬, C3-C12 아릴 및 C3-C12 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 환과 융합되고, 임의로 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환되고,
R13은 C1-C24 알킬, C3-C24 시클로알킬, C3-C24 아릴, C3-C24 헤테로아릴, C3-C24 알킬아릴, C3-C24 알킬헤테로아릴, C3-C24 아릴알킬 및 C3-C24 헤테로아릴알킬로부터 선택되며, 상기 헤테로아릴은 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하고, 여기서 R14는 수소 또는 C1-C4 알킬기이고,
Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4는 스페이서 모이에티로서, 각각 독립적으로 단일 결합, 또는 직선형 또는 분지형 C1-C200 알킬렌, C2-C200 알케닐렌, C2-C200 알키닐렌, C3-C200 시클로알킬렌, C5-C200 시클로알케닐렌, C8-C200 시클로알키닐렌, C7-C200 알킬아릴렌, C7-C200 아릴알킬렌, C8-C200 아릴알케닐렌 및 C9-C200 아릴알키닐렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 시클로알케닐렌, 시클로알키닐렌, 알킬아릴렌, 아릴알킬렌, 아릴알케닐렌 및 아릴알키닐렌은 임의로 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되거나 이를 포함하고,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 O, C(O) 및 N(R13)로부터 선택되고,
a는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
b는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
c는 0 또는 1이고,
d는 0 또는 1이고,
e는 0 또는 1이고,
f는 0 내지 150의 정수이고,
g는 0 또는 1이고,
i는 0 또는 1이다. 예를 들어, 상기 Q1은 하기 화학식들로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00015
여기서, U는 O 또는 NR15이고, 여기서 R15는 수소, 직선 또는 분지형 C1-C12 알킬, C4-C12 아릴 또는 C4-C12 헤테로아릴이며, 더욱 구체적으로 R15는 수소 또는 C1-C4 알킬이다.
구체적으로, 상기 화학식 (III) 중 링커 L2는 아래의 화학식 (II-a) 또는 (II-b)의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00016
여기서 Q2은 트리아졸과 융합된 시클로옥테닐 또는 트리아졸과 융합된 헤테로시클로옥테닐이고, 상기 시클로옥테닐 또는 헤테로시클로옥테닐은 임의로 C3-C12 시클로알킬, C3-C12 아릴 및 C3-C12 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 환과 추가로 융합되고, 임의로 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환되고, 상기 Q2은 트리아졸에 포함된 질소 원자를 통해 Ab와 연결되고,
Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4는 스페이서 모이어티로서, 각각 독립적으로 단일 결합, 또는 직선형 또는 분지형 C1-C200 알킬렌, C2-C200 알케닐렌, C2-C200 알키닐렌, C3-C200 시클로알킬렌, C5-C200 시클로알케닐렌, C8-C200 시클로알키닐렌, C7-C200 알킬아릴렌, C7-C200 아릴알킬렌, C8-C200 아릴알케닐렌 및 C9-C200 아릴알키닐렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 시클로알케닐렌, 시클로알키닐렌, 알킬아릴렌, 아릴알킬렌, 아릴알케닐렌 및 아릴알키닐렌은 임의로 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되거나 이를 포함하고,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 O, C(O) 및 N(R13)로부터 선택되고,
a는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
b는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
c는 0 또는 1이고,
d는 0 또는 1이고,
e는 0 또는 1이고,
f는 0 내지 150의 정수이고,
g는 0 또는 1이고,
i는 0 또는 1이다.
예를 들어, Q2은 트리아졸과 융합된 시클로옥테닐이고, 상기 시클로옥테닐은 C3-C6 시클로알킬 및/또는 C3-C6 아릴과 추가로 융합된다.
예를 들어, 스페이서 모이어티인 Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4는 각각 독립적으로 단일 결합, 또는 직선형 또는 분지형 C1-C20 알킬렌, C2-C20 알케닐렌, C2-C20 알키닐렌, C3-C20 시클로알킬렌, C5-C20 시클로알케닐렌, C8-C20 시클로알키닐렌, C7-C20 알킬아릴렌, C7-C20 아릴알킬렌, C8-C20 아릴알케닐렌 및 C9-C20 아릴알키닐렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 시클로알케닐렌, 시클로알키닐렌, 알킬아릴렌, 아릴알킬렌, 아릴알케닐렌 및 아릴알키닐렌은 임의로 O, S 및 NR14로부터 선택되는 1 개 내지 5 개의 헤테로원자에 의해 치환되거나 이를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "알킬"은 지방족 또는 지환족, 포화 또는 불포화(불포화, 완전 불포화) 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분으로서, 포화 알킬은 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 등, 포화 직쇄형 알킬은 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸(아밀), n-헥실, n-헵틸 등, 포화 분지쇄형 알킬은 예를 들어 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "알케닐렌"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 이중 결합을 갖는, 임의의 길이를 가지는 탄소원자의 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 의미하며, 알케닐 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향을 가지는 라티칼을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "사이클로알킬"은 고리(cyclic) 탄화수소 화합물의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 사이클로알킬기의 예로 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 사이클로헵탄, 메틸사이클로프로판, 디메틸사이클로프로판, 메틸사이클로부탄, 디메틸사이클로부탄, 메틸사이클로펜탄, 디메틸사이클로펜탄 또는 메틸사이클로헥산과 같은 포화 단일고리 탄화수소 화합물;
사이클로프로펜, 사이클로부텐, 사이클로펜텐, 사이클로헥센, 메틸사이클로프로펜, 디메틸사이클로프로펜, 메틸사이클로부텐, 디메틸사이클로부텐, 메틸사이클로펜텐, 디메틸사이클로펜텐, 또는 메틸사이클로헥센과 같은 불포화 단일고리 탄화수소 화합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다.
본 명세서에서 접두사(예를 들어 C1-12, C3-8 등)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예를 들어 본 명세서에서 사용된 용어 "C3-6헤테로사이클릴"은 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴기에 관한 것이다.
단일고리 헤테로사이클릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다:
N1: 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피롤린, 2H- 또는 3H-피롤, 피페리딘, 디하이드로피리딘, 테트라하이드로피리딘, 아제핀;
N2: 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 이미다졸린, 피라졸린, 피페라진;
O1: 옥시란, 옥세탄, 옥솔란, 옥솔, 옥산, 디하이드로피란, 피란, 옥세핀;
O2: 디옥솔란, 디옥산 및 디옥세판;
O3: 트리옥산;
N1O1: 테트라하이드로옥사졸, 디하이드로옥사졸, 테트라하이드로이속사졸, 디하이드로이속사졸, 모르폴린, 테트라하이드로옥사진, 디하이드로옥사진, 옥사진
S1: 티이란, 티에탄, 티올란, 티안, 티에판;
N1S1: 티아졸린, 티아졸리딘, 티오모르폴린;
N2O1: 옥사디아진;
O1S1: 옥사티올, 옥사티안; 및
N1O1S1: 옥사티아진.
본 명세서에서, "아릴"은 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분을 지칭할 수 있다. C6-C20 아릴은 6 내지 20개의 고리 원자를 갖는 것으로서, 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 모이어티를 의미하고, 접두사(C6-C20)는 탄소 원자 또는 헤테로 원자인지 여부와 상관없이, 즉 모두 탄소 원자를 포함하거나, 하나 이상의 임의 헤테로 원자를 포함할 수 있으며, 고리원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로아릴"은 1 이상의 헤테로 원자를 포함하는 아릴로서, 예를 들어 피리딘, 피리미딘, 벤조티오펜, 푸릴, 디옥살라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 구체적으로 벤조푸란, 이소벤조푸란, 인돌, 이소인돌, 인돌리진, 인돌린, 이소인돌린, 퓨린(아데닌 또는 구아닌), 벤즈이미다졸, 인다졸, 벤즈옥사졸, 벤즈이속사졸, 벤조디옥솔, 벤조푸란, 벤조트리아졸, 벤조티오푸란, 벤조티아졸, 벤조티아디아졸로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C9, 크로멘, 이소크로멘, 크로만, 이소크로만, 벤조디옥산, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴놀리진, 벤족사진, 벤조디아진, 피리도피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 프테리딘으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C10, 벤조디아제핀으로부터 유도된 2개의 융합고리를 갖는 C11, 카르바졸, 디벤조푸란, 디벤조티오펜, 카르볼린, 페리미딘, 피리도인돌로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C13, 아크리딘, 크산텐, 티오크산텐, 옥산트렌, 페녹사티인, 페나진, 페녹사진, 페노티아진, 티안트렌, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진으로부터 유도된 3개의 융합고리를 갖는 C14를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "알콕시"는 -OR[여기서, R은 알킬기]을 의미하며, 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "알킬렌"은 이중결합을 포함하는 탄화수소 화합물로, 탄소수 1 내지 20, 탄소수 1 내지 16, 탄소수 1 내지 12, 탄소수 1 내지 8 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬렌기를 의미할 수 있다. 상기 알킬렌기는 직쇄형, 분지형 또는 고리형 알킬렌기일 수 있으며, 임의적으로 하나 이상의 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용되는 염"으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 사용할 수 있고, 상기 유리 산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있다.
상기 유기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이로 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
예컨대, 화합물이 음이온이거나 또는 음이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -COOH는 -COO-일 수 있음), 적절한 양이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예는 알칼리 금속 이온, 예컨대 Na+ 및 K+, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+ 및 다른 양이온, 예컨대 Al3+을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대 NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 하기로부터 유도된 것들이다: 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐 아니라, 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4+이다.
화합물이 양이온이거나 또는 양이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -NH2는 -NH3 +일 수 있음), 적절한 음이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예는 하기 무기 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산 등을 예로 들 수 있다.
적절한 유기 음이온의 예는 하기 유기산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다: 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캠퍼설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루쳅톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시말레산, 히드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산 등을 예로 들 수 있다. 적절한 중합체 유기 음이온의 예는 하기 중합체 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 예로 들 수 있다.
본 명세서에서 "용매화물(solvate)"은 본 발명에 따른 화합물과 용매 분자(solvent molecules) 사이의 분자 복합체(molecular complex)를 말하며, 용매화물의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 에틸 아세테이트, 아세트산, 에탄올아민 또는 이의 혼합용매와 결합한 본 발명에 따른 화합물을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
선택적으로, 아미노산 또는 펩타이드 예를 들어, 디펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, Val-Cit, Phe-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Glu, Val-Asp, Val-Ser 또는 Val-Gly의 디펩타이드를 포함할 수 있다. Val-Cit 디펩타이드 링커가 바람직하다. 단일 아미노산이 포함되는 경우, 예를 들어 Cit, Glu, Lys 또는 Ser를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 또는 펩타이드를 포함하는 링커는 카텝신 B에 의해 절단 가능하다.
상기 화학식 (II)의 화합물은 구체적으로, 다음의 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물은, 항체와 결합하여 항체-약물 접합체를 형성하기 위한 링커 부분을 가지고 있는, 링커-약물 복합체일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 링커는 스페이서를 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커는, 약물과의 결합을 위해 말레이미드, 알데하이드, 아미노옥실, 2-PCA 또는 시클로옥틴기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커가 말레이미드기를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 생성을 위해 항체에 도입된 시스테인 아미노산을 통해 링커가 항체와 연결될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 아미노산은 가공되어 약물 접합에 이용가능하나, 항체의 폴딩을 교란시키지 않고, 항원 결합 및 효과기 기능을 변형시키지 않는 위치에서 시스테인으로 치환된 항체인 THIOMABTM 항체를 통해 결합될 수 있다. 가공된 시스테인 티올기를 통해 세포독성 약물에 접합될 수 있으므로, 균일한 화학양론 (예를 들면, 단일 가공 시스테인을 가지는 항체에서 항체 당 최대 약물 2)을 포함하는 THIOMABTM 항체-약물 접합체 (TDC)를 수득할 수 있다.
THIOMABTM 항체 외에도, 시스테인 아미노산을 포함하는 항체라면 아래와 같은 마이클 반응 (Michael reaction)을 통해 말레이미드 링커를 가지는 화학식 (II)의 화합물과 결합하여 항체-약물 결합체를 생성할 수 있다.
Figure pct00022
예를 들어, 항체의 경쇄-Fab, 중쇄-Fab 또는 중쇄-Fc 내의 특정한 아미노산 위치에서와 같이 약물 부착을 위해 상이한 위치에 가공된 시스테인을 포함할 수 있다.
시스테인 치환은 예를 들어, 카밧 넘버링에 따라 중쇄 중 Y33C, G162C, V184C, I195C, S420C, Y432C, Q434C, R19C, E46C, T57C, Y59C, A60C, M100cC, W103C, G162C, I195C, V258C, S420C, H425C, 및 N430C로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 카밧 넘버링에 따라 경쇄 중 Y55C, G64C, T85C, T180C, N430C, T31C, S52C, G64C, R66C, A193C 및 N430C로 구성된 군으로부터 선택되거나, 경우에 따라서 LC-I106C, LC-R108C, LC-R142C, 및 LC-K149C로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커가 알데하이드기를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 생성을 위해 항체 단백질의 N-말단 또는 리신 아미노산의 NH2 와 링커 내의 알데하이드기를 아래와 같이 환원적 알킬화 (Reductive alkylation) 시킴으로써 링커가 항체와 연결될 수 있다.
Figure pct00023
예를 들어, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커가 아미노옥실기를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 생성을 위해 항체 아미노산 내 케톤기와 링커 내의 아미노옥실기를 아래와 같이 옥심 라이게이션 (Oxime ligation) 시킴으로써 링커가 항체와 연결될 수 있다.
Figure pct00024
예를 들어, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커가 2-PCA (2-Pyridinecarboxaldehyde)를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 생성을 위해 항체 아미노산 내 NH2와 링커 내의 2-PCA를 아래와 같이 N-말단 이미다졸리디논 형성 (N-terminal imidazolidinone formation) 반응을 시킴으로써 링커가 항체와 연결될 수 있다.
Figure pct00025
예를 들어, 본 발명에 따른 화학식 (II)의 화합물이 가지는 링커가 시클로옥틴기를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 항체-약물 접합체의 생성을 위해 아지드기 (-N3)를 가지도록 변형된 항체 내 아지드기와 링커 내의 시클로옥틴기를 아래와 같이 클릭 반응 (click-reaction) 시킴으로써 링커가 항체와 연결될 수 있다.
Figure pct00026
상기 기술한 링커의 종류 및 이를 항체와 접합하여 항체-약물 접합체를 형성하는 구체적 반응 공정은 이미 당업계에 공지된 것으로서 통상의 기술자가 과도한 노력 없이 용이하게 수행할 수 있다. 상기 링커들 외에도 당업계에 알려지고 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있는 다양한 링커들이 본 발명의 항체-약물 결합체의 제조를 위해 사용될 수 있으며, 그러한 링커와 결합된 항체-약물 결합체의 구조 역시 통상의 기술자에 의해 쉽게 예측될 수 있다.
본 명세서에서 항체는 타겟 세포 예를 들어, 암 세포에 의해 고유하게 발현되거나 과발현되는 항원을 인식하며, 고도의 특이성으로 암 세포에 약물 모이어티를 전달하기 위한 표적 작용제로서 기능할 수 있다. 항원에 항체가 결합하게 되면, 항원-접합체가 복합체를 형성하고 내재화되어 궁극적으로 리소좀 내부로 들어가며, 약물 모이어티와 항체 사이의 링커가 절단되면서 약물 모이어티가 방출되어 세포독성 효과가 발휘된다.
상기 항체는 예를 들어, 다음의 항원에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다:
(1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 승인 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 승인 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6회의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 승인 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 승인 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵세포 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 승인 번호 NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 운반체 족 34 (인산나트륨), 구성원 2, 제II형 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b, 진뱅크 승인 번호 NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 유사 제1형), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 승인 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 승인 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 승인 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 승인 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련단백질 1, 전립선의 6회의 막횡단 상피 항원 2, 6회의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 승인 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 구성원 4, 진뱅크 승인 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장인자, 진뱅크 승인 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 승인 번호 M26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-관련 베타), B29, 진뱅크 승인 번호 NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 승인 번호 NM_030764);
(17) HER2 (진뱅크 승인 번호 M11730)
(18) EGFR, HER3 및 HER4로부터 선택된 ErbB 수용체
(19) NCA (진뱅크 승인 번호 M18728);
(20) MDP (진뱅크 승인 번호 BC017023);
(21) IL20Rα (진뱅크 승인 번호 AF184971);
(22) 브레비칸 (진뱅크 승인 번호 AF229053);
(23) EphB2R (진뱅크 승인 번호 NM_004442);
(24) ASLG659 (진뱅크 승인 번호 AX092328);
(25) PSCA (진뱅크 승인 번호 AJ297436);
(26) GEDA (진뱅크 승인 번호 AY260763);
(27) BAFF-R (B 세포 활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, NP_443177.1);
(28) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, NP-001762.1);
(29) CD79a (Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 IgM 분자와 표면에서 복합체를 형성하는 B 세포 특이적 단백질인 CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-관련 알파는 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달함, 진뱅크 승인 번호 NP_001774.1);
(30) CXCR5 (CXCL13 케모킨에 의해 활성화된 G 단백질 커플링된 수용체인 버킷 림프종 수용체 1은 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하고 HIV-2 감염에 참여하며, AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 발병과 관련이 있다고 여겨짐, 진뱅크 승인 번호 NP_001707.1);
(31) HLA-DOB (펩티드에 결합하여 CD4+ T 림프구에 제시하는, MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛, 진뱅크 승인 번호 NP_002111.1);
(32) P2X5 (세포외 ATP에 의해 게이트되는 이온 채널인, 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관여할 수 있으며, 이의 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리에 기여할 수 있음, 진뱅크 승인 번호 NP_002552.2);
(33) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 승인 번호 NP_001773.1);
(34) LY64 (루이신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제I형 막 단백질인, 림프구 항원 64 (RP105)는 B 세포 활성화 및 세포자멸을 조절하며, 이것의 기능 상실은 전신성 홍반성 루푸스 환자의 질병 활성 증가와 관련이 있음, 진뱅크 승인 번호 NP_005573.1);
(35) FcRH1 (C2형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 추정적 수용체인 Fc 수용체 유사 단백질 1은 B 림프구 분화에 관여할 수 있음, 진뱅크 승인 번호 NP_443170.1)
(36) IRTA2 (B 세포 발생 및 림프종발생에 작용할 수 있는 추정적 면역수용체인 이뮤노글로불린 거대족 수용체 전좌 관련 2, 전좌에 의한 상기 유전자 탈조절은 몇몇 B 세포 악성종양에서 일어남, 진뱅크 승인 번호 NP_112571.1); 및
(37) TENB2 (성장 인자의 EGF/헤레굴린 족 및 폴리스타틴과 관련이 있는 추정적 막횡단 프로테오글리칸, 진뱅크 승인 번호 AF179274)
(38) MAGE-C1/CT7 (고환암 과발현 단백질)
(39) androgen receptor, PTEN, human kallikrein-related peptidase 3 (전립선암에서 과발현되는 단백질)
(40) CD20
(41) CD30
(42) CD33
(43) CD52
(44) EpCam
(45) CEA
(46) gpA33
(47) Mucins
(48) TAG-72
(49) Carbonic anhydrase IX
(50) PSMA
(51) folate receptor (FOLR gene에 의해서 발현되는 단백질 패밀리. Folic acid와 높은 결합력을 가지고 있으며, 5-methyltetrahydrofolate를 세포 내로 운반한다)
(52) gangliosides (GD2, GD3, GM2)
(53) 당수화물 Lewis-Y
(54) VEGF
(55) VEGFR
(56) aVb3
(57) a5b1
(58) ERB3
(59) c-MET
(60) EphA3
(61) TRAIL-R1, TRAIL-R2
(62) RANKL
(63) FAP,
(64) Tenascin,
(65) ROR1,
(66) BCMA, 또는
(67) CLL1.
상기 항체는 예를 들어, 항-BCMA 항체, 항-ROR1 항체, 항-Her2 항체, 항-NaPi2b 항체 및 항-CLL1항체로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적 실시예에서, 항-BCMA 항체 및 항-ROR1 항체로는 다음의 항체를 ADC 제작에 사용하였다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
항-Her2 항체로는 공지의 트라스트주맙 (Trastuzumab)의 서열을, 항-NaPi2b 항체로는 공지의 10H1 항체의 서열 (10H1 VL: 서열번호 17, 10H1 VH: 서열번호 18)을, 그리고 항-CLL1항체로는 공지의 6E7(N54A) 항체 (6E7(N54A) VL: 서열번호 18, 6E7(N54A) VH: 서열번호 19)의 서열을 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 상기 항체에는 항원에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편 또는 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 “인간 항체”는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역” (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
경우에 따라서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
“작동적으로 연결”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 증식성 질환 예를 들어 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 항체-약물 접합체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 증식성 질환 예를 들어 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체-약물 접합체를 증식성 질환 예를 들어 종양 또는 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체-약물 접합체의 증식성 질환 예를 들어 종양 또는 암에 대한 예방 또는 치료 용도일 수 있다.
상기 종양 또는 암과 관련하여, 치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 신장암, 췌장암, 난소암, 림프종, 결장암, 중피종, 위암, 폐암, 전립선암, 선암종, 간암 또는 유방암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 종양 또는 암에는 불응 또는 재발암을 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물의 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 ㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예: 약물의 합성
다음의 제조예에서 공통적으로 1H NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 MHz로 기록되었다.
LCMS는 ESI (+) 이온화 모드에서 작동하는 Shimadzu LCMS 2011 (Column: Shim-pack XR-ODS (3.0*30 mm, 2.2 m))의 사극 질량 분석기로 측정하였다. 유량 : 0.8 mL / min, 취득 시간 : 3 분 또는 1.5 분 파장 : UV220, 오븐 온도 : 50 oC.
Prep-HPLC는 다음 조건에서 수행되었다: 컬럼 : Fuji C18 (300x25), YMC (250x20). 파장 : 220 nm; 이동상 : CH3CN (0.05 % NH3·H2O 또는 0.225 % FA); B 물 (0.1% NH3·H2O 또는 0.225% FA); 유속 : 30 mL / min; 주입량 : 3 mL; 실행 시간 : 20 분. 평형 : 3 분
제조예 1: PD001의 합성
Figure pct00030
1) 화합물 1의 제조
Figure pct00031
MeOH (7 mL) 및 EtOAc (7 mL) 중에 화합물 1A (700 mg, 1.65 mmol) 및 10 % 건조 Pd / C (140 mg)의 혼합물을 진공하에서 탈기하고, H2로 수회 퍼징하였다. 혼합물을 H2 (balloon, 15 psi)에서 20℃로 4 시간 동안 교반 하였다. TLC는 더 큰 극성을 가진 하나의 새로운 스팟이 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 셀라이트로 여과하고 여과액을 농축하고 건조하여, 백색 고체로 화합물 1 (549 mg, 수율 99.6 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.56 (9H, s), 3.43 (1H, t, J = 10.4 Hz), 3.85-4.01 (2H, m), 4.07-4.16 (1H, m), 4.19-4.30 (1H, m), 6.24 (1H, brs), 7.34 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.50 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.59-7.80 (2H, m), 8.17 (1H, d, J = 8.0 Hz).
2) 화합물 5-2의 제조
Figure pct00032
20℃에서 무수 DCM (10 mL) 중 화합물 1 (300 mg, 0.899 mmol)의 교반 용액에 4A MS (2 g)를 추가하였다. 다음으로, 혼합물을 20℃에서 30분간 교반하였다. 화합물 5-1 (576 mg, 1.17 mmol)을 첨가한 후, 혼합물을 -10℃로 냉각하고 DCM (5 mL) 중 BF3.Et2O (64 mg, 0.45 mmol)를 적가하였다. 다음으로, 혼합물을 -10℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 0 ℃에서 2 시간 동안 가열하였다. TLC는 미량의 출발물질이 여전히 잔존함을 보여주었고, 큰 극성을 가진 신규 주요 위치가 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 필터링하여 제거하고, 여과액을 sat. aq. NaHCO3 (20 mL)으로 ??칭하였다. 유기층이 분리되었다. 나머지 수상을 DCM (15 mL * 2)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 다음 건조시켰다. 잔류물을 배치 2와 혼합하고, PE: EtOAc / 5 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하였다.
20℃에서 DCM (10 mL) 중 화합물 1 (249 mg, 0.746 mmol) 교반 용액에 4A MS (1.5 g)을 추가하였다. 다음으로, 혼합물을 20 ℃에서 30 분간 교반하였다. 화합물 5-1 (478 mg, 0.970 mmol)을 첨가한 후, 혼합물을 -10 ℃로 냉각하고 DCM (5 mL) 중 BF3.Et2O (53 mg, 0.373 mmol)을 적가하였다. 다음으로, 혼합물을 -10℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 0℃로 2 시간 유지하였다. TLC는 미량의 출발물질이 여전히 잔존함을 보여주었고, 큰 극성을 가진 하나의 신규한 주요 위치가 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 필터를 통해 제거하고 여과액을 sat. aq. NaHCO3 (20 mL)으로 ??칭하였다. 유기층이 분리되었다. 나머지 수상을 DCM (15 mL * 2)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 다음 건조시켰다. 잔류물을 배치 1과 혼합하고, PE : EtOAc / 5 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 백색 고체로 화합물 5-2 (1.19 g, crude)을 얻었다. 백색 고체로 화합물 1의 출발 물질 35mg을 회수하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.61 (9H, s, overlap water signal), 2.02 (3H, s), 2.06 (3H, s, overlap EtOAc signal), 2.11 (3H, s), 2.24 (3H, s), 3.45 (1H, t, J = 10.8 Hz), 3.91-4.05 (2H, m), 4.10-4.19 (1H, m, overlap EtOAc signal), 4.20-4.43 (4H, m), 5.20 (1H, dd, J = 10.4, 3.6 Hz), 5.37 (1H, d, J = 8.0 Hz), 5.53 (1H, d, J = 3.2 Hz), 5.72 (1H, dd, J = 10.4, 7.6 Hz), 7.34-7.40 (1H, m), 7.49-7.57 (1H, m), 7.66 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.68 (1H, brs), 8.13 (1H, d, J = 8.0 Hz).
3) 화합물 5-3의 제조
Figure pct00033
무수 DCM (15mL) 중의 화합물 5-2 (1.19 g, crude)의 교반 용액에 0℃에서 BF3.Et2O (890 mg, 6.27 mmol)을 적하하였다. 이후, 혼합물을 20℃로 따뜻하게 하고, 2 시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 잘 진행된 것으로 나타났다. 혼합물을 sat. aq. NaHCO3 (15 mL)으로 ??칭하였다. 유기층이 분리되었다. 나머지 수상을 DCM (15 mL * 2)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축 및 건조시켰다. 잔류물을 PE : EtOAc / 2 : 1 ~ 1 : 1을 사용하는 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 백색 고체로 de-Boc 중간체 (782 mg, 84% yield of two steps)를 얻었다. 28mg의 화합물 5-2를 회수하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.06 (3H, s), 2.07 (3H, s, overlap EtOAc signal), 2.11 (3H, s), 2.24 (3H, s), 3.52 (1H, t, J = 10.8 Hz), 3.77-3.87 (2H, m), 3.88-3.94 (1H, m), 3.96-4.05 (1H, m), 4.12-4.25 (3H, m, overlap EtOAc signal), 4.31 (1H, dd, J = 10.8, 6.8 Hz), 5.11-5.20 (2H, m), 5.52 (1H, dd, J = 3.2, 0.8 Hz), 5.70 (1H, dd, J = 10.4, 8.0 Hz), 6.66 (1H, s), 7.20-7.20 (1H, m, overlap CDCl3 signal), 7.45-7.52 (1H, m), 7.60 (1H, dd, J = 8.4, 1.2 Hz), 8.00 (1H, d, J = 8.0 Hz).
20℃에서 무수 DMF (6 mL) 중 de-Boc 중간체 (643 mg, 1.14 mmol)와 화합물 1-7 (190 mg, 0.380 mmol)의 혼합물에 EDCI (219 mg, 1.14 mmol)을 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 20℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 여전히 잔존하고, 원하는 생성물이 관찰되었음을 보여주었다. 용매를 감압하에서 제거하였다. 혼합물을 물 (15 mL)로 ??칭하고 EtOAc (15 mL * 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4를 흘려 농축 및 건조시켰다. 잔류물을 PE : EtOAc / 2 : 1 ~ 1 : 2를 이용한 실리카겔 컬럼 용출액로 정제하여 황색 고체인 화합물 5-3 (448 mg, 수율 : 74 %)을 얻었다. 또한, 163 mg의 de-Boc 중간체를 회수하였다 (LCMS : 순도 75 %).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.01-2.20 (18H, m, overlap EtOAc signal), 2.23 (6H, s), 3.43-3.57 (2H, m), 3.69-3.82 (2H, m), 3.95-4.05 (2H, m), 4.06-4.10 (1H, m, overlap EtOAc signal), 4.19-4.65 (15H, m), 5.12-5.27 (2H, m), 5.32-5.44 (2H, m, overlap CH2Cl2 signal), 5.50-5.62 (2H, m), 5.70-5.82 (2H, m), 6.92-7.13 (2H, m), 7.19-7.39 (7H, m, overlap CDCl3 signal), 7.40-7.50 (2H, m), 7.51-7.64 (4H, m), 7.65-7.76 (5H, m), 7.84 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.13-8.27 (3H, m), 8.47 (2H, d, J = 18.4 Hz).
4) 화합물 5-4의 제조
Figure pct00034
무수 DCM (4 mL) 중 화합물 5-3 (250 mg, 0.157 mmol) 및 피페리딘 (134 mg, 1.57 mmol) 용액을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 잘 진행됨을 보여주었다. 용매를 감압하에서 제거하였다. 불순물을 DCM : MeOH / 50 : 1~25 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 5-4 (176 mg, 수율 82 %)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.01-2.24 (24H, m), 3.35-3.59 (4H, m), 3.99-4.62 (16H, m), 5.20-5.30 (2H, m), 5.37-5.47 (2H, m), 5.56 (2H, d, J = 1.2 Hz), 5.75 (2H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.94 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.10-7.20 (2H, m), 7.26-7.34 (1H, m, overlap CDCl3 signal), 7.36-7.74 (7H, m), 7.80 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.05-8.20 (3H, m), 8.44 (2H, d, J = 7.6 Hz).
5) 화합물 5-5의 제조
Figure pct00035
MeOH (2 mL) 및 DCM (2 mL) 중 화합물 5-4 (100 mg, 0.073 mmol) 용액에 MeOH (0.5 mL) 중 NaOMe (8.0 mg, 0.15 mmol)을 0℃에서 적가하였다. 다음으로, 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 크루드 LCMS는 원하는 생성물 MS가 관찰됨을 보여주었다. 혼합물을 AcOH (9.0 mg, 0.15 mmol)로 ??칭하였다. 다음으로, 혼합물을 25℃에서 농축 및 건조하여 황색 고체로 크루드 화합물 5-5 (79mg)을 얻었다. 다음으로, 79 mg의 크루드 화합물 5-5을 다음 단계에 직접 사용하였다.
6) PD001의 제조
Figure pct00036
DMF (2mL) 중 화합물 5-5 (79mg, crude), 화합물 1-3 (24mg, 0.076mmol) 및 DIEA (20mg, 0.15mmol)의 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 크루드 LCMS는 원하는 생성물 MS가 관찰됨을 보여주었다. 용매를 prep-HPLC (0.05% NH3.H2O)에 의해 정제하였다. MeCN의 대부분은 감압하에서 제거되었다. 나머지 수상을 동결건조하여 황색 고체로 순수 PD001 (20 mg, 2 단계의 수율 : 22 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.15-1.27 (2H, m), 1.42-1.60 (4H, m), 2.13 (2H, t, J = 7.6 Hz), 3.48-3.74 (10H, m), 3.75-3.88 (4H, m), 3.89-4.08 (4H, m), 4.24-4.40 (4H, m), 4.48-4.74 (8H, m), 4.92-5.05 (4H, m), 5.38 (2H, d, J = 5.6 Hz), 6.96 (2H, s), 7.29-7.45 (4H, m), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.52-7.63 (2H, m), 7.66 (1H, s), 7.90 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.86-8.01 (4H, m), 8.20-8.25 (1H, m), 8.33 (2H, dd, J = 8.4, 4.8 Hz), 8.38-8.48 (2H, m).
7) 화합물 1-2의 제조
Figure pct00037
AcOH (5mL) 중 6-아미노헥산산 (6-aminohexanoic acid: 500mg, 3.81mmol) 용액에 퓨란-2,5-디온 (374mg, 3.81mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2하에 25℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 다음으로, 혼합물을 N2하에 110℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 다른 위치가 관찰된 것을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공하에서 농축하였다. 잔류물에 물 (10 mL)를 첨가하고 얻어진 용액을 EtOAc (20 mL * 3)로 추출하였으며, 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4,로 건조, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 1 : 1 ~ 1 : 2를 이용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로 화합물 1-2 (525mg, 수율 : 65 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.11-1.29 (2H, m), 1.40-1.57 (4H, m), 2.18 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.36-3.41 (2H, m, overlap with water signal), 6.93-7.07 (2H, s), 12.00 (1H, brs).
8) 화합물 1-3의 제조
Figure pct00038
DCM (5 mL) 중 화합물 1-2 (525 mg, 2.49 mmol), 1- 히드록시피롤리딘-2,5-디온 (300 mg, 2.61 mmol) 및 DIC (336 mg, 2.66 mmol) 용액을 25°C, 16 시간 동안 N2 하에서 교반하였다. TLC는 다른 위치가 관찰된 것을 보여주었다. 반응물에 물(10 mL)을 첨가하고 얻어진 용액을 EtOAc (15 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 2 : 1 ~ 1 : 1 ~ 1 : 2)를 이용한 실리카겔 크로마토그래피 용출액에 의해 정제하여 백색 고체로 불순 화합물 1-3 (643mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.32-1.45 (2H, m), 1.61-1.65 (2H, m), 1.73-1.81 (2H, m), 2.59 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.82 (4H, s), 3.52 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.68 (2H, m).
9) 화합물 1-5의 제조
Figure pct00039
DMF (10 mL) 중 5- 브로모-2-요오드- 페놀 (1.0 g, 3.35 mmol), tert-부틸 아크릴레이트 (1.50 g, 11.7 mmol), Pd (OAc)2 (15 mg, 0.67 mmol), 트리-o-톨릴포스핀화합물 (79 mg, 0.26 mmol) 및 Et3N (1.02 g, 10.0 mmol) 용액을 N2 하에서 110℃ 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 원하는 생성물이 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 60 mL의 물에 ??칭하여 얻어진 용액을 EtOAc (40 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 24 : 1 ~ 20 : 1 ~ 6 : 1을 이용한 Combi Flash 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 1-5 (963mg, 수율 : 83 %)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.48 (18H, s), 6.41 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.56 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.07 (1H, s), 7.19 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.45 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.63 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.75 (1H, d, J = 16.4 Hz), 10.42 (1H, brs).
10) 화합물 1-6의 제조
Figure pct00040
THF (20mL) 중 화합물 1-5 (2.00g, 5.77mmol) 및 화합물 1-5A (2.45g, 8.66mmol) 용액을 N2하에서 0 ℃ 30분간 교반하였다. 투명 용액이 백색 에멀젼이 되면 Ph3P (2.57 g, 9.81 mmol)을 0℃ 혼합물에 추가하고, N2하에서 10 분간 교반하였다. 다음은 DIAD (1.75 g, 8.66 mmol)를 혼합물 0 ℃에 적가하였다 (백색 에멀젼은 오렌지색의 투명 용액이 된다). 이후, 얻어진 용액을 N2하에서 1 시간, 25 ℃로 따뜻하게 하였다. TLC는 원하는 생성물이 관찰되었음을 보여주었다. 1N aq. HCl (60mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 얻어진 용액을 EtOAc로 추출하였다 (50mL * 3). 혼합된 유기층을 염수 (80mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르에서 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 7 : 1을 이용한 Combi Flash 용출액에 의해 정제하여 무색 오일의 불순 화합물 1-6 (3.67 g)을 제조하였다.
11) 화합물 1-7의 제조
Figure pct00041
DCM (80 mL) 중 화합물 1-6 (3.67 g, 불순)의 용액에 TFA (19.3 g, 169 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃ 16 시간 동안 교반하였다. 모니터링 없음. 반응 혼합물을 진공하에서 농축하였다. 잔류물을 tert-부틸 메틸 에테르 (60mL)로 분쇄한 후 여과하였다. 필터 케이크를 tert-부틸 메틸 에테르 (20 mL * 3)로 세척하였다. 필터 케이크를 진공하에서 건조시켜 백색 고체로 화합물 1-7 (2.12 g, 2 단계의 수율 : 74 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.43-3.46 (2H, m), 4.13-4.27 (3H, m), 4.31-4.43 (2H, m), 6.59 (1H, d, J = 16.2 Hz), 6.69 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.29-7.35 (3H, m), 7.36-7.48 (3H, m), 7.55-7.65 (2H, m), 7.66-7.77 (3H, m), 7.80-7.92 (3H, m), 12.40 (2H, brs).
제조예 2. PD005의 합성
Figure pct00042
1) 화합물 5-5의 제조
Figure pct00043
MeOH (1 mL) 및 DCM (1 mL) 중 화합물 5-4 (50 mg, 0.036 mmol) 용액에 0℃ MeOH 0.1 mL) 중 NaOMe (4.0 mg, 0.073 mmol) 용액을 적가하였다. 다음으로, 혼합물을 0℃에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.828 유지 시간에서 93 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 1031; MS Found: 1034 [M+3H]+). 혼합물을 AcOH (4.6 mg)로 ??칭하였다. 이후, 혼합물을 25℃에서 농축하여 건조한 다음 황색 고체로 크루드 화합물 5-5 (41mg)을 얻었다. 41mg의 크루드 화합물 5-5를 다음 단계에 직접 사용하였다.
2) PD005의 제조
Figure pct00044
DMF (1 mL) 중 화합물 5-5 (41 mg, crude), 화합물 5-6 (11 mg, crude) 및 DIPEA (10 mg, 0.079 mmol) 혼합물을 15°C에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.845 유지 시간에서 89 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 1143; MS Found : 1149 [M + 6H +). 반응 혼합물을 prep-HPLC (0.225 % FA)에 의해 정제하였다. MeCN의 대부분은 감압하에서 제거되었다. 나머지 수상을 동결 건조하고 황색 고체로 크루드 PD005 (11 mg)을 얻었다. 또한, H NMR은 미량의 알데히드 신호 양성자가 관찰된 것을 보여주었다.
3) 화합물 5-5A의 제조
Figure pct00045
DCM (2 mL) 중 화합물 5-6b (8.4 mg, 0.064 mmol) 용액에 HOBt (9.5 mg, 0.070 mmol), EDCI (13 mg, 0.070 mmol) 및 DIEA (9.1 mg, 0.070 mmol)을 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 15℃에서 10 분간 교반하였다. 화합물 5-4 (80mg, 0.058mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 제조된 혼합물을 15℃에서 2 시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 하나의 신규 위치가 형성되었다. 혼합물을 물(10 mL)로 ??칭하고 DCM (6 mL * 3)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축하여 건조하였다. 잔류물을 EtOAc를 이용한 실리카겔 컬럼 용출액로 정제하여 황색 고체로 화합물 5-5A (81mg, 수율 : 94 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.58-1.75 (4H, m), 1.95-2.05 (12H, m), 2.06-2.16 (12H, m), 2.24-2.31 (2H, m), 2.40-2.49 (2H, m), 3.42-3.55 (3H, m), 3.69-3.79 (2H, m), 3.92-4.05 (2H, m), 4.10-4.38 (9H, m, overlap EtOAc signal), 4.42-4.64 (4H, m), 5.12-5.26 (2H, m), 5.30-5.42 (2H, m), 5.50-5.60 (2H, m), 5.67-5.77 (2H, m), 6.91-7.06 (2H, m), 7.13-7.22 (2H, m, overlap CDCl3 signal), 7.35-7.48 (3H, m), 7.50-7.60 (2H, m), 7.65-7.76 (3H, m), 7.77-7.84 (1H, m), 8.09-8.19 (2H, m), 8.20-8.30 (1H, m), 8.37-8.50 (2H, m), 9.71 (1H, s).
4) PD005의 제조
Figure pct00046
MeOH (0.5 mL) 및 DCM (0.5 mL) 중 화합물 5-5A (25 mg, 0.017 mmol)의 교반 용액에 0℃ MeOH 0.1 mL) 중 NaOMe (1.8 mg, 0.034 mmol)을 적가하였다. 이후, 혼합물을 0℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 크루드LC-MS는 생성물의 순도가 0.834 유지 시간에서 98 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 1143; MS Found : 1144 [M+H]+). 다음으로, 혼합물을 물 (5 mL)로 ??칭하고 15℃감압하에서 용매를 제거하였다. 제조된 노란색 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 케이크를 물 (10 mL)로 희석하고, 동결건조하여 황색 고체로 크루드 PD005 (11 mg)을 얻었다. 약 6 mg의 크루드를 H NMR 체크에 사용하였고, 크루드 5 mg을 공급하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.19-1.60 (4H, m), 2.05-2.22 (2H, m), 2.35-2.45 (2H, m, overlap DMSO signal), 3.45-4.76 (30H, m), 4.90-5.05 (4H, m), 5.35-5.53 (2H, m), 7.18-8.05 (13H, m), 8.15-8.50 (4H, m,), 9.61 (0.5H, m).
MeOH (1 mL) 및 DCM (1 mL) 중 화합물 5-5A (56 mg, 0.038 mmol)의 교반 용액에 0 ℃ MeOH 0.2 mL) 중 NaOMe (4.1 mg, 0.076 mmol)을 적가하였다. 다음으로, 혼합물을 0℃ 에서 2 시간 동안 교반하였다. 크루드 LCMS는 원하는 생성물 M가 관찰됨을 보여주었다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.857 유지 시간에서 98 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 1143; MS Found : 1169 [M+Na]+).
다음으로, 혼합물을 물 (10 mL)로 ??칭하고 용매를 15°C 감압하에서 제거하였다. 제조된 노란색 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 케이크를 물 (10 mL)로 희석하고, 동결건조하여 황색 고체로 크루드 PD005 (27 mg)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.19-1.60 (4H, m), 2.05-2.21 (2H, m), 2.35-2.45 (2H, m, overlap DMSO signal), 3.45-4.76 (30H, m), 4.90-5.05 (4H, m), 5.35-5.51 (2H, m), 7.21-8.01 (13H, m), 8.15-8.50 (4H, m,), 9.61 (0.4H, m).
5) 화합물 5-6b 제조
Figure pct00047
에틸 6-옥소헥사노에이트 (546 mg, 3.45 mmol), TsOH (15 mg, 0.08 mmol) 및 H2O (1.2 mL) 용액을 N2하에서 90°C로 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 다른 위치가 관찰된 것을 보여주었다. 반응 혼합물을 물 (10 mL)에 ??칭하였고, 얻어진 용액을 EtOAc (15 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 1 : 1 내지 2 : 3을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 무색 오일로 화합물 5-6b (383 mg, 수율 : 85 %)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.49-1.53 (4H, m), 2.22 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.44 (2H, t, J = 7.2 Hz), 9.66 (1H, s), 12.01 (1H, brs).
6) 화합물 5-6의 제조
Figure pct00048
DCM (4 mL) 중 화합물 5-6b (383 mg, 2.94 mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드 (356 mg, 3.09 mmol) 용액에 N2하에서 DIC (397 mg, 3.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃ 에서 3시간 동안 교반하였다. TLC는 극성이 더 낮은 다른 위치가 관찰됨을 보여주었다. 반응 혼합물을 여과하고 여과액을 물 (10 mL)로 ??칭하고 유기층을 분리하였다. 이후 수상을 DCM (10 mL * 3)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트/3 : 2 내지 2 : 3)을 이용한 실리카겔 컬럼 용리액로 정제하여 백색 고체로 불순 화합물 5-6 (204 mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.76-1.78 (4H, m), 2.49-2.51 (2H, m), 2.64 (2H, t, J = 6.8 Hz), 2.84 (4H, s), 9.77 (1H, s).
제조예 3. PD006의 합성
Figure pct00049
Figure pct00050
1) 화합물 6-4의 제조
Figure pct00051
화합물 6-3 (349 mg, 0.635 mmol)와 화합물 6-2 (220 mg, 0.635 mmol) 및 DMF (3 mL) 중 K2CO3 (105 mg, 0.762 mmol) 혼합물을 60 °C로 가열하고 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 1.088 유지 시간에 59 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 723.4; MS Found : 746.3 [M+Na]+). 용매를 높은 정도로 감압하여 제거하였다. 혼합물을 물 (20 mL)로 ??칭하고 EtOAc (15 mL * 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물 (20 mL * 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 농축한 다음 건조시켜, 갈색 오일로 화합물 6-4를 얻었다 (0.45 g, 수율 98 %).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.51-1.56 (18H, m), 3.39 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.61-3.68 (24H, m), 3.69-3.72 (2H, m), 3.92 (2H, t, J = 4.8 Hz), 4.21 (2H, t, J = 4.8 Hz), 6.37 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.50 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.02 (1H, s), 7.10 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.47-7.55 (2H, m), 7.86 (1H, d, J = 16.0 Hz).
화합물 6-2의 합성 과정은 앞서 기재된 PD001에 대한 실시예에서와 동일하다.
2) 화합물 6-5의 제조
Figure pct00052
THF (4 mL) 중 화합물 6-4 (450 mg, 0.622 mmol) 용액에 10℃에서 PPh3 (196 mg, 0.746 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 1 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후 H2O (1 mL)를 혼합물에 추가하였고, 얻어진 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.967 유지 시간에서 21 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 697.4; MS Found : 698.4 [M+H]+). 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 EtOAc에 이어서 DCM : MeOH / 5 : 1을 사용하고, 이후 MeOH: NH3.H2O/100:1 용출액으로 정제하였고, 갈색 오일로 화합물 6-5 (285mg, 수율 66 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.52-1.64 (18H, m, overlap water signal), 2.88 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.63 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.62-3.75 (22H, m), 3.76-3.80 (2H, m), 3.94 (2H, t, J = 5.2 Hz), 4.24 (2H, t, J = 5.2 Hz), 6.39 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.52 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.04 (1H, s), 7.12 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.49-7.57 (2H, m), 7.89 (1H, d, J = 16.4 Hz).
2개의 활성 양성자는 관찰되지 않았다.
3) 화합물 6-11의 제조
Figure pct00053
THF (1 mL) 및 H2O (1 mL) 중 화합물 6-5 (235 mg, 0.337 mmol) 용액에 10 °C Fmoc-Cl (96 mg, 0.37 mmol) 및 NaHCO3 (31 mg, 0.37 mmol)을 추가하였다. 이후 혼합물을 10℃에서 2시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 1.155 유지 시간에서 84 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 919.5; MS Found : 942.5 [M+Na]+). 혼합물을 물 (5 mL)로 ??칭하고 EtOAc (5 mL * 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 다음 건조하여 무색 오일로 크루드 화합물 6-11 (325 mg)을 얻었으며, FmocCl이 포함되어 있었다.
4) 화합물 6-12의 제조
Figure pct00054
TFA (2 mL) 중 화합물 6-11 (325 mg, crude) 및 DCM (3 mL)의 혼합물을 10°C에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 0.890 유지 시간에서 생성물의 순도가 87 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 807.4; MS Found : 830.3 [M+Na]+). 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 EtOAc (5mL)로 분쇄하여 백색 고체로 화합물 6-12 (191mg, 2 단계의 수율 : 70 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 3.10-3.17 (2H, m), 3.30-3.43 (2H, m, overlap water signal), 3.45-3.58 (24H, m), 3.59-3.64 (2H, m), 3.78-3.84 (2H, m), 4.18-4.32 (5H, m), 4.42 (2H, d, J = 7.2 Hz), 5.46 (1H, brs), 6.65 (2H, dd, J = 16.0, 14.4 Hz), 7.27-7.36 (4H, m), 7.38-7.46 (3H, m), 7.57 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.66-7.74 (3H, m), 7.81 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 12.4 (2H, brs).
5) 화합물 6-13의 제조
Figure pct00055
DMF (2 mL) 중 화합물 6-12 (90 mg, 0.11 mmol), 화합물 6-9 (188 mg, 0.334 mmol) 및 EDCI (64 mg, 0.33 mmol)의 혼합물을 10 °C에서 16 시간 동안 교반 하였다. TLC는 원하는 생성물이 관찰되었음을 보여주었다. 높은 정도의 감압하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 2 : 1~EtOAc : MeOH / 50 : 1을 이용한 Combi 플래시 용출액으로 정제하여 황색 고체로 화합물 13 (96 mg, 수율 45 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.04-2.09 (12H, m, overlap EtOAc signal), 2.16 (6H, d, J = 10.4 Hz), 2.24 (6H, s), 3.35-3.43 (2H, m), 3.47-3.84 (30H, m), 3.98-4.09 (4H, m), 4.11-4.62 (15H, m, overlap EtOAc signal), 5.17-5.27 (2H, m), 5.34-5.43 (2H, m), 5.46-5.62 (3H, m), 5.69-5.80 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 14.8 Hz), 7.17 (1H, s), 7.25-7.36 (4H, m, overlap CDCl3 signal), 7.37-7.50 (4H, m), 7.53-7.66 (5H, m), 7.69-7.80 (4H, m), 7.83 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.00 (1H, d, J = 15.2 Hz, overlap DMF signal), 8.17 (2H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz), 8.46 (2H, d, J = 12.0 Hz).
화합물 6-9에 대한 제조공정은 앞서 기재된 PD001에 대한 실시예에서와 동일하다.
6) 화합물 6-14의 제조
Figure pct00056
DCM (1 mL) 중 피페리딘 (86 mg, 1.0 mmol, 0.1 mL) 및 화합물 6-13 (96 mg, 0.051 mmol) 용액을 10°C에서 3 시간 동안 교반하였다. TLC는 출발물질이 완전히 소모되었고, 하나의 신규 주요 위치가 형성되었음을 보여주었다. 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 DCM : MeOH / 100 : 1~9 : 1의 Combi flash 용출액으로 정제하여 황색 고체로 화합물 6-14 (75 mg, 수율 : 78 %)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.03-2.09 (12H, m, overlap EtOAc signal), 2.17 (6H, d, J = 10.4 Hz), 2.24 (6H, s), 3.11-3.18 (2H, m), 3.48-3.87 (30H, m), 3.97-4.70 (18H, m, overlap EtOAc signal), 5.16-5.26 (2H, m), 5.36-5.46 (2H, m), 5.51-5.63 (2H, m), 5.68-5.79 (2H, m), 7.13 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.24-7.37 (3H, m, overlap CDCl3 signal), 7.40-7.49 (2H, m), 7.53-7.65 (3H, m), 7.73 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.83 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.02 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.16 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.46 (2H, d, J = 8.4 Hz).
7) 화합물 6-15 제조
Figure pct00057
MeOH (2 mL) 및 DCM (1 mL) 중 화합물 6-14 (87 mg, 0.052 mmol) 용액에 10 °C에서 K2CO3 (14 mg, 0.10 mmol)을 첨가하였다. 이후, 혼합물을 10℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.836 유지 시간에서 90 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 1339.5; MS Found: 1340.9 [M+H]+). TLC는 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 혼합물을 AcOH (10 mg)로 ??칭하였다. 혼합물을 농축하여 건조한 다음 황색 고체로 크루드 화합물 6-15 (74 mg)을 얻었으며, 크루드를 다음 단계에 직접 사용했다.
8) PD006 제조
Figure pct00058
DMF (1mL) 중 화합물 6-15 (74mg, crude), 화합물 6-6 (16mg, 0.061mmol) 및 DIEA (8.6mg, 0.066mmol)의 혼합물을 10℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.842 유지 시간에서 94%임을 보여 주었다 (MS Calcd : 1490.5; MS Found : 1493.5 [M+2H]+). 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 prep-HPLC (0.225 % FA)에 의해 정제하였다. 남은 수용액을 동결건조하여 PD006 (8 mg)을 얻고, 7 mg의 불순물을 얻었다. 불순 PD006을 prep-HPLC (0.225 % FA)로 추가 정제하였다. 남은 수용액을 동결 건조하여 황색 고체로 PD006 (4 mg)을 얻었다. 총 12 mg의 PD006를 얻었고, 두 단계의 수율은 16 %이었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 2.24-2.37 (2H, m, overlap DMSO signal), 3.08-3.21 (2H, m), 3.24-4.10 (46H, m, overlap water signal), 4.26-4.77 (12H, m), 4.88-5.02 (4H, m), 5.34-5.47 (2H, m), 6.99 (1.1H, s), 7.30-7.64 (8H, m), 7.74 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.83-7.94 (4H, m), 7.98-8.04 (1H, m), 8.29-8.46 (4H, m).
9) 화합물 6-3B 제조
Figure pct00059
0 °C에서 DCM (300 mL) 중 테트라에틸렌 글리콜 (30.0 g, 154 mmol), Et3N (11.7 g, 116 mmol) 및 DMAP (944 mg, 7.72 mmol)의 혼합물에 TsCl (14.7 g, 77.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 2 개의 새로운 위치가 관찰되었고, 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 ??칭하고 유기층을 분리하였다. 이후, 남은 혼합액을 DCM (100 mL * 4)에서 추출하였다. 혼합한 유기층을 염수 (400 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc에 이어서 DCM : MeOH / 20 : 1을 이용하여, 실리카겔 컬럼 용출액로 정제하여, 무색 오일 화합물 6-3B (9.33g) 및 무색 오일 화합물 6-3B (7.16g)를 얻었다. 이후 DCM : MeOH / 50 : 1 ~ 20 : 1을 사용하여 Combi Flash 용출액에 의해 불순 오일 7.16 g을 정제함으로써 무색 오일 화합물 6-3B (4.89 g)를 얻었다. 따라서, 총 14.2 g의 화합물 6-3B를 얻었으며, 수율은 26 %이었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.45 (3H, s), 2.48-2.62 (1H, brs), 3.58-3.71 (14H, m), 4.17 (2H, t, J = 4.8 Hz), 7.34 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.80 (2H, dd, J = 6.4 Hz, 1.6 Hz).
조건 2:
Figure pct00060
DCM (300 mL) 중 테트라에틸렌 글리콜 (10.0 g, 51.5 mmol) 용액에 TsCl (9.82 g, 51.5 mmol), KI (855 mg, 5.15 mmol) 및 Ag2O (14.3 g, 61.8 mmol)의 혼합물을 15°C에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었고, 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 1 : 1 MeOH를 이용한 Combi Flash 용출액에 의해 정제하여 무색 오일로 화합물 6-3B (11.8 g, 수율 : 66 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.32-2.44 (1H, brs), 2.45 (3H, s), 3.60-3.71 (14H, m), 4.17 (2H, t, J = 4.4 Hz), 7.33 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.80 (2H, d, J = 8.0 Hz).
10) 화합물 6-3C의 제조
Figure pct00061
DMF (20 mL) 중 화합물 6-3B (1.66 g, 4.76 mmol) 용액에 NaN3 (465 mg, 7.15 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃ 에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 낮은 극성의 다른 위치가 관찰되었고, 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 물 (50 mL)로 퀘칭하고, 얻어진 용액을 EtOAc (50 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 DCM : MeOH / 40 : 1 ~ 30 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액로 정제하여 담황색 오일 불순 화합물 6-3C (800 mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.46-2.72 (1H, brs), 3.34-3.45 (2H, m), 3.59-3.64 (2H, m), 3.66-3.71 (10H, m), 3.71-3.75 (2H, m).
11) 화합물 6-3D 제조
Figure pct00062
DCM (16 mL) 중 화합물 6-3C (800 mg, impure) 용액에 Et3N (517 mg, 5.11 mmol) 및 TsCl (974 mg, 5.11 mmol)을 0°C에서 첨가한 후, 16 시간 동안 15 °C로 따뜻하게 하였다. TLC는 극성이 낮은 다른 위치가 관찰됨을 보여주었다. 혼합물을 물 (20 mL)로 ??칭하고 유기층을 분리하였다. 이후 남은 혼합액을 DCM (15 mL * 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 2 : 1 ~ 1 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 잔류물을 정제하여 무색 오일로 화합물 6-3D (1.01g, 2 공정의 수율 : 57 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.47 (3H, s), 3.35-3.46 (2H, m), 3.62-3.72 (12H, m), 4.18 (2H, t, J = 4.8 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.82 (2H, d, J = 8.4 Hz).
12) 화합물 6-3E 제조
Figure pct00063
0℃ THF (33mL) 중 NaH (780mg, 19.5mmol 미네랄오일 중 60 % 순도)의 현탁액에 THF (3mL) 중의 화합물 6-3A (3.41g, 17.6mmol)를 N2 하에서 적가하였다. 반응물을 10 ℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 이어서, THF (3mL) 중 화합물 6-3D (3.28g 불순)을 나트륨 알코올레이트의 환류 용액에 적하하였다. 다음으로, 혼합물을 16 시간 동안 환류하였다 (70℃). TLC는 새로운 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, THF를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 물 (30 mL)로 ??칭하고, 얻어진 용액을 혼합용매 (DCM : MeOH / 10 : 1) (50 mL * 5)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하여 크루드 화합물 6-3E (3.47g, crude)를 얻어 다음 단계에 직접 사용하였다.
13) 화합물 6-3의 제조
Figure pct00064
DCM (30 mL) 중 화합물 6-3E (3.03 g, crude) 용액에 Et3N (1.12 g, 11.1 mmol)을 첨가하고 TsCl (2.12 g, 11.1 mmol)을 0℃에서 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 10℃로 따뜻하게 하고, 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 다른 새로운 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 물(40 mL)로 ??칭하고 유기층을 분리하였다. 이후, 나머지 수상을 DCM (30 mL * 5)으로 추출하였다. 이어서, 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 3 : 1 EtOAc를 사용하여 실리카겔 컬럼 용출액으로 정제하여 불순 화합물 6-3 (1.82g)을 얻었다. 불순한 고체를 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 2 : 1에 이어서 EtOAc를 이용하여 Combi Flash 용출액에 의해 정제하여 황색 오일로 화합물 6-3 (1.26g, 2 공정의 수율 : 26 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.47 (3H, s), 3.40-3.53 (2H, m), 3.54-3.83 (28H, m), 4.14-4.24 (2H, m), 7.36 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.81 (2H, d, J = 8.0 Hz).
14) 화합물 6-6의 제조
Figure pct00065
DCM (10 mL) 중 3-말레이미드프로피온산 (1.00 g, 5.91 mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드 (714 mg, 6.21 mmol) 용액에 EDCI (1.21 g, 6.33 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 N2 하에서 15 °C로 16 시간 교반하였다. TLC는 더 작은 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 물 (15 mL)로 반응을 ??칭시키고 유기층을 분리하였다. 이후, 잔존 수상을 DCM (20 mL * 3)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 석유 에테르 : 에틸 아세테이트 / 1 : 2를 이용하여 실리카겔 컬럼 용출액으로 정제하여 백색 고체로 화합물 6-6 (1.18g, 수율 : 75 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.84 (4H, s), 3.04 (2H, t, J = 14.0 Hz), 3.95 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.76 (2H, s).
제조예 4: PD008의 합성
Figure pct00066
1) 화합물 8-1의 제조
Figure pct00067
DCM (1 mL) 중 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6-옥소헥사노에이트 (16 mg, 0.072 mmol), DIPEA (15 mg, 0.12 mmonl) 및 화합물 6-14 (100 mg, 0.0596 mmol)을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 하나의 극성이 더 낮은 새로운 위치가 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 물 (8 mL)로 ??칭하고 DCM (8 mL * 3)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축하여 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc : MeOH / 10 : 1을 이용하는 prep-TLC 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 8-1 (59mg, 수율 : 55 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.55-1.76 (4H, m, overlap water signal), 2.03-2.10 (12H, m), 2.13-2.27 (14H, m), 2.45-2.50 (2H, m), 3.42-3.48 (2H, m), 3.49-3.85 (30H, m), 3.99-4.63 (16H, m), 5.22 (2H, dd, J = 10.4, 3.2 Hz), 5.40 (2H, dd, J = 7.2, 2.0 Hz), 5.57 (2H, d, J = 2.8 Hz), 5.70-5.79 (2H, m), 6.41 (1H, brs), 6.98 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.18 (1H, s), 7.26-7.36 (2H, m, overlap CDCl3 signal), 7.41-7.48 (2H, m), 7.54-7.65 (3H, m), 7.70-7.78 (2H, m), 7.84 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.01 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.14-8.20 (2H, m), 8.46 (2H, d, J = 11.6 Hz), 9.77 (1H, t, J = 1.6 Hz).
화합물 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6-옥소헥사노에이트 (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-oxohexanoate 및 화합물 6-14의 합성은 PD006의 제조예에서와 동일하다.
2) 화합물 PD008의 제조
Figure pct00068
MeOH (1 mL) 및 DCM (0.5 mL) 중 화합물 8-1 (59 mg, 0.033 mmol) 및 K2CO3 (9.1 mg, 0.065 mmol)의 혼합물을 15°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 유지 시간 0.796에서 99.9 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 1451.5; MS Found : 1455.1 [M+3H]+). 혼합물을 AcOH (4 mg)로 ??칭하였다. 얻어진 혼합물을 prep-HPLC (0.225 % FA)에 의해 정제하였다. MeCN 대부분은 감압하에서 제거되었다. 남은 혼합액을 동결건조하여 황색 고체로 PD008 (16 mg, 수율 : 33 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.36-1.56 (4H, m), 1.95-2.12 (2H, m), 2.33-2.44 (2H, m, overlap DMSO-d6 signal), 3.08-3.22 (2H, m, overlap water signal), 3.24-4.11 (44H, m, overlap water signal), 4.24-4.74 (12H, m), 4.86-5.04 (4H, m), 5.24-5.57 (2H, m), 7.27-7.64 (8H, m), 7.68-7.94 (6H, m), 8.28-8.49 (4H, m), 9.64 (0.6H, s).
제조예 5: PD009의 합성
Figure pct00069
1) 화합물 2의 제조
Figure pct00070
2,5- 디브로모벤젠 (5.00 g, 17.8 mmol) 및 tert-부틸 아크릴레이트 (6.84 g, 53.4 mmol)의 Et3N (50 mL) 용액에 트리스-o-트릴포스판 (433 mg, 1.42 mmol)와 디아세톡시팔라듐을 N2하에서 추가하였다 (80 mg, 0.36 mmol). 혼합물을 100℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 화합물 1이 완전히 소모되지 않았 음을 보여주었다. 다음으로, tert-부틸 아크릴레이트 (4.00g), 트리스-o-트릴포스판 (224mg) 및 디아세톡시팔라듐 (80mg)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 이후, 혼합물을 100℃에서 20 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 잔류물에 EtOAc (50 mL)를 첨가한 다음, 여과하고 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 50 : 1을 이용한 Combi flash 용출액으로 정제하여 황색 고체로 화합물 2 (5.72 g, 수율 : 85 %)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.54 (18H, s), 6.34 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.48 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.56 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.65 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.72 (2H, dd, J = 8.0 Hz, 1.6 Hz), 7.98 (1H, d, J = 16.0 Hz), 8.12 (1H, d, J = 1.6 Hz).
2) 화합물 3의 제조
Figure pct00071
얼음 욕조에서 냉각한 아세톤 (70 mL) 중 화합물 2 (6.98 g, 18.6 mmol) 용액에 Zn (9.73 g, 149 mmol)을 가한 후, H2O (35 mL) 중 NH4Cl (3.98 g, 74.4 mmol) 용액을 더했다. 혼합물을 5℃에서 4 시간 동안 교반하였고, TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었으며, 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 반응 혼합물에 EtOAc (50 mL*4)를 첨가하고, 상단의 투명한 용액을 수집했다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 16 : 1을 이용한 Combi Flash 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 3 (5.22 g, 수율 : 81 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.54 (18H, s, overlap water signal), 3.99 (2H, brs), 6.26-6.38 (2H, m), 6.81 (1H, s), 6.93 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.37 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.46 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.68 (1H, d, J = 16.0 Hz).
3) 화합물 6의 제조
Figure pct00072
DMA (6 mL) 중 화합물 3 (300 mg, 0.484 mmol), TsOH (8 mg, 0.05 mmol), 화합물 9-5 (251 mg, 0.726 mmol) 및 EDCI (464 mg, 2.42 mmol)의 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. DMA는 진공에서 제거되었다. 잔류 용액을 물 (10 mL)에 ??칭하고, 얻어진 용액을 EtOAc : MeOH = 3 : 1 (30 mL * 6)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축 하였다. 잔류물을 EtOAc에서 EtOAc : MeOH / 10 : 1을 사용하는 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 황색 오일로 화합물 6 (319mg, 수율 : 69 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.52 (18H, s), 2.71 (2H, t, J = 5.6 Hz), 3.44-3.67 (26H, m), 3.71-3.75 (2H, m), 3.82-3.89 (2H, m), 4.16-4.24 (1H, m), 4.38-4.40 (2H, m), 5.45 (1H, brs), 6.33-6.45 (2H, m), 7.26-7.32 (3H, m, overlap CDCl3 signal), 7.39 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.51-7.61 (4H, m), 7.69-7.76 (3H, m), 8.00 (1H, s), 8.76 (1H, brs).
4) 화합물 7의 제조
Figure pct00073
DCM (3mL) 중 화합물 6 (319mg, 0.337 mmol) 용액에 TFA (1.09g, 9.52 mmol)를 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.801 유지 시간에서 순도 95%임을 보여주었다 (MS Calcd.: 834.3; MS Found: 835.0 [M+H]+). 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (10 mL)로 분쇄하여 여과하였다. 필터 케이크를 EtOAc (5mL)로 세척하여 백색 고체로 화합물 7 (244mg, 수율 : 86 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.51-2.68 (2H, m, overlap DMSO-d6 signal), 3.09-3.17 (2H, m), 3.44-3.58 (26H, m, overlap water signal), 3.62-3.79 (2H, m), 4.16-4.21 (1H, m), 4.22-4.42 (2H, m), 6.48-6.61 (2H, m), 7.28-7.34 (3H, m), 7.36-7.49 (2H, m), 7.54-7.58 (2H, m), 7.66-7.72 (4H, m), 7.84-7.90 (3H, m), 9.88 (1H, brs), 12.48 (2H, brs).
5) 화합물 8의 제조
Figure pct00074
DMF (4mL) 중의 화합물 7 (244mg, 0.292mmol) 및 화합물 6-9 (494mg, 0.877mmol)의 용액에 10℃에서 EDCI (168mg, 0.877mmol)을 추가하였다. 다음으로, 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. DMF를 진공에서 제거하고 잔류물을 물 (10 mL)로 ??칭하였다. 얻어진 용액을 EtOAc : MeOH = 20 : 1 (15mL * 6)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1~0 : 1~EtOAc : MeOH / 20 : 1을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액으로 정제하여 황색 고체로 화합물 8 (469mg, 수율 : 83 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.97-2.04 (12H, m, overlap water signal), 2.11-2.14 (6H, m), 2.15-2.23 (6H, m), 2.71-2.82 (2H, m), 3.39-3.62 (26H, m), 3.67-3.73 (2H, m), 3.75-3.83 (2H, m), 3.92-4.06 (4H, m), 4.11-4.57 (15H, m) (overlap EtOAc signal), 5.22 (2H, d, J = 7.6 Hz), 5.35-5.40 (2H, m), 5.50-5.56 (3H, m), 5.74 (2H, t, J = 8.0 Hz), 6.95-7.03 (2H, m), 7.27-7.36 (2H, m, overlap CDCl3 signal), 7.37-7.46 (5H, m), 7.54-7.61 (4H, m), 7.71-7.76 (5H, m), 7.84 (1H, d, J = 15.6 Hz), 7.98-8.04 (1H, m), 8.17 (3H, d, J = 8.0 Hz), 8.43 (2H, d, J = 8.0 Hz) , 8.95 (1H, brs).
화합물 6-9의 합성은 PD005의 제조예에서와 동일하다.
6) 화합물 9의 제조
Figure pct00075
DCM (3 mL) 중 화합물 8 (197 mg, 0.102 mmol) 용액에 피페리딘 (0.3 mL)을 10℃에서 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 잔류물을 물 (10 mL)로 ??칭하였다. 얻어진 용액을 DCM (15 mL * 4)에서 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc에 이어서 DCM : MeOH / 50 : 1 내지 10 : 1의 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 9 (96mg, 수율 : 55 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.03-2.10 (12H, m, overlap water signal), 2.11-2.18 (6H, m), 2.19-2.28 (6H, m), 2.95-3.06 (2H, m), 3.16-3.16 (2H, m), 3.48-3.76 (28H, m), 3.76-3.82 (2H, m), 3.84-3.90 (2H, m), 3.91-4.06 (4H, m), 4.13-4.39 (8H, m), 4.46-4.63 (4H, m), 5.23 (2H, d, J = 10.8 Hz), 5.40 (2H, d, J = 8.0 Hz), 5.52-5.61 (2H, m), 5.68-5.80 (2H, m), 6.98 (2H, t, J = 15.6 Hz), 7.38-7.49 (3H, m), 7.56 (2H, t, J = 7.2 Hz), 7.67-7.89 (4H, m), 7.83 (2H, d, J = 15.2 Hz), 7.93-8.04 (2H, m), 8.12-8.20 (2H, m), 8.34-8.51 (2H, m), 10.04 (1H, brs).
7) 화합물 10의 제조
Figure pct00076
DCM (1mL) 및 MeOH (2mL) 중 화합물 9 (120mg, 0.0704mmol) 용액에 K2CO3 (19 mg, 0.14 mmol)을 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 30 분간 교반하였다. 크루드 LC-MS는 새로운 피크가 관찰되었고, 화합물 9가 완전하게 소비되었음을 보여주었다 (MS Calcd.: 1702.5) (화합물 10의 MS는 1500을 넘어 MS를 볼 수 없다). 반응 혼합물에 CH3COOH (19 mg)를 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 5 분간 교반하고, 진공에서 농축하여 황색 고체로 화합물 10 (92mg, 크루드)를 얻었다.
8) PD009의 제조
Figure pct00077
DMF (1 mL) 중 화합물 10 (92 mg, 크루드) 및 DIEA (14 mg, 0.11 mmol) 용액에 10°에서 화합물 6-6 (28 mg, 0.11 mmol)을 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 새로운 피크가 관찰되고, 화합물 10이 완전하게 소비되었음을 보여주었다 (MS Calcd.: 1366.5) (PD009의 MS는 1500을 넘어 MS를 볼 수 없다) . 얻어진 혼합물을 prep-HPLC (0.225 % FA)에 의해 정제하였다. MeCN의 대부분은 감압하에서 제거되었다. 남은 혼합액을 동결 건조하여 황색 고체로PD009 (40 mg, 2 단계의 수율 : 37 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.32 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.64-2.74 (2H, m) 3.09-3.18 (2H, m), 3.46-3.71 (33H, m, overlap water signal), 3.73-4.12 (12H, m), 4.23-4.70 (11H, m) 4.91-5.00 (4H, m), 5.34-5.44 (2H, m), 6.99 (1.4H, s), 7.27 (2H, d, J = 15.2 Hz), 7.43 (2H, t, J = 8.0 Hz), 7.57 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.66-7.81 (2H, m), 7.84-7.91 (4H, m), 7.98-8.10 (2H, m), 8.32-8.41 (4H, m), 10.00 (1H, brs).
화합물 6-6의 합성은 PD006의 제조예에서와 동일하다.
9) 화합물 9-2'의 제조
Figure pct00078
배치 1
0℃ THF (20mL) 중 NaH (536mg, 13.4mmol 미네랄 오일 중 60 %)의 현탁액에 THF (5mL) 중의 트리에틸렌 글리콜 (2.41g, 16.1mmol)을 N2하에서 적하하였다. 반응물을 5℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 다음으로, THF (5mL) 중 화합물 6-3D (2.00g, 5.36mmol)을 나트륨 알코올레이트 환류 용액에 적하하였다. 다음으로, 혼합물을 N2하에서 16 시간 동안 환류 (70°C)하였다. TLC는 다른 새로운 위치가 관찰되고 화합물 6-3D이 완전히 소모되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 배치 2와 혼합하였다.
배치 2
0℃ THF (20mL) 중 NaH (536mg, 13.4mmol 미네랄 오일 중 60 %)의 현탁액에 THF (5mL) 중 트리에틸렌 글리콜 (2.41g, 16.1mmol)을 N2하에서 적하하였다. 반응물을 5℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 다음으로, THF (5mL) 중 화합물 6-3D (2.00g, 5.36mmol)을 나트륨 알코올레이트 환류 용액에 적하하였다. 다음으로, 혼합물을 N2 하에서 16 시간 동안 환류 (70 °C)하였다. TLC는 다른 새로운 위치가 관찰되었고, 화합물 6-3D 완전히 소모되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 배치 1과 함께 물 (50 mL)로 ??칭하였다. 유기층을 분리한 후 남은 혼합액을 DCM : MeOH = 10 : 1 (50 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 DCM : MeOH / 100 : 1 ~ 50 : 1의 실리카겔 컬럼 용출액으로 정제하여 분홍색 오일의 화합물 9-2 '(3.03g, 2 배치 수율 : 80 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.41 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.62-3.76 (26H, m).
화합물 6-3D의 합성은 PD006의 제조예에서와 동일하다.
10) 화합물 9-3의 제조
Figure pct00079
0°C THF (5 mL) 중 화합물 9-2 '(328 mg, 0.933 mmol)의 용액에 NaH (4.0 mg, 0.093 mmol, 미네랄 오일 중 60 %)를 추가하였고, 혼합물을 0°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 다음으로, tert-부틸 아크릴레이트 (239mg, 1.87mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 5℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 극성이 낮은 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 미량의 화합물 9-2 '가 여전히 남아 있었다. 물 (10 mL)로 반응을 ??칭시키고 얻어진 용액을 DCM : MeOH = 10 : 1 (15 mL * 4)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1 ~ 1 : 4를 이용한 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 무색 오일로 화합물 9-3 (322mg, 수율 : 72 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (9H, s), 2.50 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.39 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.62-3.72 (28H, m).
11) 화합물 9-3' 제조
Figure pct00080
THF (10mL) 중 화합물 9-3 (1.49g, 3.11 mmol)의 용액에 N2하에서 PPh3 (896mg, 3.42 mmol)를 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 1 시간 동안 교반한 후, H2O (5 mL)을 혼합물에 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 N2하에 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.742 유지 시간에서 3 % 순도임을 보여주었다 (MS Calcd.: 453.2; MS Found: 454.2 [M+H]+). 진공 하에서 THF를 제거하였다. 나머지 용액을 물 (10 mL)로 ??칭하고, 얻어진 용액을 EtOAc : PE = 3 : 1 (30 mL * 2)로 추출하였다. 남은 수층을 진공에서 농축하여 무색 오일로 화합물 9-3’ (1.52 g, crude) (수분 포함)을 제조하였다.
12) 화합물 9-4’ 제조
Figure pct00081
THF (10 mL) 및 H2O (10 mL) 중 화합물 9-3 '(1.52 g) (크루드, 수분 포함) 용액에 Fmoc-Cl (897 mg, 3.47 mmol) 및 NaHCO3 (291 mg, 3.47 mmol)을 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반한 결과, TLC는 극성이 더 낮은 다른 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 진공하에서 THF를 제거하고 남은 용액을 물(20 mL)로 ??칭하였다. 얻어진 용액을 EtOAc로 추출하였다 (40mL * 5). 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1~0 : 1을 사용하여 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제하여 무색 오일로 화합물 9-4 '(1.25g, 2 공정의 수율 : 59 %)을 얻었다 .
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (9H, s), 2.51 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.39-3.43 (2H, m), 3.62-3.73 (28H, m), 4.22-4.26 (1H, m), 4.42 (2H, d, J =7.2 Hz), 5.45 (1H, brs), 7.31-7.35 (2H, m), 7.38-7.47 (2H, m), 7.62 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.78 (2H, d, J = 7.2 Hz).
13) 화합물 9-5의 제조
Figure pct00082
DCM (12 mL) 중 화합물 9-4 '(1.25 g, 1.85 mmol) 용액에 TFA (5.95 g, 52.2 mmol)를 추가하였다. 혼합물을 10℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.816 유지 시간에서 순도 95 %임을 보여 주었다 (MS Calcd.: 619.3; MS Found: 642.0 [M+Na]+). 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 무색 오일로 화합물 9-5 (1.17g, 수율 : 100 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.43 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.13 (2H, dd, J = 11.6 Hz, 5.6 Hz), 3.40 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.48-3.49 (24H, m), 3.59 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.19-4.23 (1H, m), 4.29 (2H, d, J =6.4 Hz), 7.29-7.39 (3H, m), 7.42 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.69 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.2 Hz). 1개의 활성 양성자도 관찰되지 않았다.
제조예 6. PD010의 합성
Figure pct00083
1) 화합물 10의 제조
Figure pct00084
DCM (2 mL) 중 화합물 9 (120 mg, 0.0704 mmol), (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6- 옥소헥사노에이트 (24 mg, 0.11 mmol) 및 DIEA (18 mg, 0.14 mmol)의 혼합물을 10℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC는 극성이 더 낮은 하나의 주요 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 prep-TLC (EtOAc : MeOH / 20 : 1에서 용리액)로 정제하여 황색 고체로 화합물 10 (72 mg, 수율 : 56 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.57-1.76 (4H, m), 2.01-2.10 (12H, m), 2.11-2.30 (14H, m), 2.41-2.50 (2H, m), 2.77-2.88 (2H, m), 3.36-3.76 (28H, m), 3.78-3.86 (2H, m), 3.90-4.07 (4H, m), 4.12-4.39 (8H, m), 4.45-4.63 (4H, m), 5.23 (2H, d, J = 10.0 Hz), 5.35-5.45 (2H, m), 5.56 (2H, s), 5.74 (2H, d, J = 9.2 Hz), 6.42 (1H, brs), 6.93-7.07 (2H, m), 7.40-7.50 (3H, m), 7.52-7.63 (2H, m), 7.69-7.78 (3H, m), 7.85 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.02 (1H, d, J = 14.8 Hz), 8.13-8.21 (3H, m), 8.43 (2H, d, J = 7.2 Hz), 9.10 (1H, brs), 9.75 (1H, s).
(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6- 옥소헥사노에이트 화합물의 합성은 PD006의 제조예에서와 동일하다. 화합물 9의 합성은 PD009의 제조예에서와 동일하다.
2) PD010의 제조
Figure pct00085
DCM (1 mL) 및 MeOH (2 mL) 중 화합물 10 (72 mg, 0.040 mmol) 및 K2CO3 (11 mg, 0.079 mmol)의 혼합물을 10°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드LC-MS는 0.831 유지 시간에서 생성물의 순도가 91 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 1478.5; MS Found: 1481.1 [M+3H]+). 반응 혼합물을 AcOH (12 mg)로 ??칭하였다. 얻어진 혼합물을 prep-HPLC (0.225 % FA)에 의해 정제하였다. MeCN의 대부분은 감압하에서 제거되었다. 남은 혼합액을 동결 건조하여 황색 고체로PD010 (24 mg, 수율 : 41 %)을 얻었다. 이 배치 (24 mg)를 es8455-193-p1 (2 mg)의 배치와 혼합하였다. 그 후, 총 26 mg의 PD010를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.30-.154 (4H, m), 1.95-2.10 (2H, m), 2.63-2.78 (2H, m, overlap DMSO signal), 3.08-3.24 (2H, m, overlap water signal), 3.25-4.11 (46H, m), 4.26-4.42 (2H, m), 4.45-4.77 (8H, m), 4.81-5.10 (4H, m), 5.29-5.54 (2H, brs), 7.18-7.33 (2H, m), 7.36-7.49 (2H, m), 7.51-7.62 (2H, m), 7.64-7.96 (7H, m), 8.04-8.14 (1H, m), 8.26-8.47 (4H, m), 9.64 (1H, s), 10.00 (1H, s).
제조예 7: PD011의 합성
Figure pct00086
1) 화합물 11-2의 제조
Figure pct00087
DMF (6 mL) 중 화합물 11-1 (1.30 g, 1.94 mmol), 화합물 3 (672 mg, 1.94 mmol) 및 K2CO3 (322 mg, 2.33 mmol)의 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반 하였다. TLC는 화합물 11-1의 출발 물질이 여전히 남아 있음을 보여주었다. 새로운 위치가 관찰되었다. 혼합물을 물 (50 mL)로 ??칭하고 DCM (20 mL * 3)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물 (50 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 농축하여 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc : PE / 1 : 1 EtOAc를 가진 Comib flash 용출액로 정제하여, 무색 오일로 크루드 화합물 11-2 (710mg, DMF 함유)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.55 (18H, d, J = 4.0 Hz), 3.56-3.73 (22H, m), 3.75-3.80 (2H, m), 3.86-3.90 (2H, m), 3.92-3.96 (2H, m), 4.21-4.26 (2H, m), 4.37-4.42 (2H, m), 6.30 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.52 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.04 (1H, s), 7.12 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.48-7.57 (2H, m), 7.75-7.79 (2H, m), 7.84-7.91 (3H, m).
화합물 11-1의 합성은 PD001의 실시예에서와 동일하다.
2) 화합물 11-3의 제조
Figure pct00088
MeOH (7 M, 10 mL) 중 NH3과 화합물 11-2 (738 mg, 크루드) 용액을 15℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 백색 침전물이 형성된 후, 백색 침전물을 필터링하였다. 여과액을 농축한 다음 건조하여 무색 오일로 화합물 11-3 (582 mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 1.48 (18H, d, J = 4.4 Hz), 3.46-3.54 (22H, m), 3.55-3.66 (6H, m), 3.79-3.85 (2H, m), 4.24-4.29 (2H, m), 4.37-4.42 (2H, m), 5.98 (2H, brs), 6.60-6.71 (2H, m), 7.28 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.45 (1H, s), 7.53 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.73 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.81 (1H, d, J = 18.4 Hz).
3) 화합물 11-4의 제조
Figure pct00089
H2O (5 mL) 및 THF (5 mL) 중 화합물 11-3 (580 mg, 0.812 mmol), Fmoc-Cl (231 mg, 0.894 mmol) 및 NaHCO3 (75 mg, 0.89 mmol)의 혼합물을 15 oC에서 2 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 1.003 유지 시간에서 43 %의 순도임을 보여 었다 (MS Calcd : 935.5; MS Found : 958.5 [M+Na]+) . 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (6mL * 4). 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 다음 건조시켰다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1 내지 EtOAc, 이후 EtOAc : MeOH / 10 : 1을 사용하여 실리카겔 컬럼 용출액에 의해 정제함으로써, 무색 오일로 화합물 11-4 (558mg, 수율 : 73 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.55 (18H, d, J = 4.8 Hz), 3.61-3.79 (26H, m), 3.90-3.96 (2H, m), 4.01-4.06 (2H, m), 4.19-4.30 (3H, m), 4.50 (2H, d, J = 6.8 Hz), 6.38 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.52 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.03 (1H, s), 7.12 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.31-7.36 (2H, m), 7.42 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.48-7.57 (2H, m), 7.62 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.78 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.88 (1H, d, J = 16.0 Hz), 8.27 (1H, brs).
4) 화합물 11-5의 제조
Figure pct00090
DCM (5 mL) 중 화합물 11-4 (558 mg, 0.596 mmol) 및 TFA (3.08 g, 27.0 mmol, 2 mL) 용액을 15°C에서 16 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.827 유지 시간에서 85% 순도임을 보여주었다 (MS Calcd.: 823.3; MS Found: 846.3 [M+Na]+). 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1 (10mL)로 분쇄하여 백색 고체로 화합물 11-5 (433mg, 수율 : 88 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 3.41-3.87 (30H, m, overlap water signal), 4.21-4.32 (3H, m), 4.40 (2H, d, J = 6.8 Hz), 6.59-6.72 (2H, m), 7.26-7.37 (3H, m), 7.38-7.47 (3H, m), 7.58 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.65-7.75 (3H, m), 7.80 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 10.46 (1H, brs), 12.43 (2H, brs).
5) 화합물 11-6의 제조
Figure pct00091
DMF (3 mL) 중 화합물 11-5 (240 mg, 0.291 mmol)와 화합물 6-9 (493 mg, 크루드)의 혼합물에 15℃ EDCI 168 mg, 0.874 mmol)를 추가하였다. 다음으로, 혼합물을 15℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 노란색을 가지는 주요 위치 하나가 관찰되었음을 보여주었다. 대부분의 DMF는 감압하에서 제거되었다. 잔류물을 EtOAc에 이어서 EtOAc : MeOH / 25 : 1을 사용하는 실리카겔 컬럼 용리액로 정제하여 황색 고체로 생성물 (541mg)을 얻었다. 크루드 약 165 mg을 다음 단계 (de-Fmoc reaction)에 사용했지만, 긍정적 인 결과를 얻을 수 없었다. 이후, 나머지 (375 mg)를 EtOAc (40 mL)에 용해하고 물 (40 mL * 3)로 세척하였다. 유기층을 분리하고 Na2SO4로 건조한 다음, 농축하여 건조함으로써 순수한 화합물 11-6 (340mg)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.00-2.11 (12H, m, overlap EtOAc signal), 2.17 (6H, d, J = 11.2 Hz), 2.24 (6H, s), 3.45-3.84 (28H, m), 3.97-4.40 (19H, m, overlap EtOAc signal), 4.42-4.63 (5H, m), 5.18-5.26 (2H, m), 5.36-5.44 (2H, m), 5.52-5.60 (2H, m), 5.70-5.80 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.17 (1H, s), 7.25-7.37 (4H, m, overlap CDCl3 signal), 7.38-7.49 (4H, m), 7.53-7.64 (5H, m), 7.69-7.79 (4H, m), 7.83 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.00 (1H, d, J = 15.6 Hz), 8.14-8.20 (2H, m), 8.34 (1H, brs), 8.46 (1H, d, J = 11.6 Hz).
6) 화합물 11-7의 제조
Figure pct00092
THF (2 mL) 중 화합물 11-6 (280 mg, 0.146 mmol) 및 피페리딘 (172 mg, 2.03 mmol, 0.2 mL) 용액을 15°C에서 1 시간 동안 교반하였다. TLC는 하나의 새로운 위치가 관찰되었음을 보여주었다. 출발물질은 완전히 소모되었다. 용매를 감압 하에서 제거하였다. 잔류물을 EtOAc : MeOH / 10 : 1을 이용하는 prep-TLC 용출액에 의해 정제하여 황색 고체로 화합물 11-7 (116mg, 수율 : 47 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.06 (12H, d, J = 4.4 Hz), 2.17 (6H, d, J = 10.4 Hz), 2.24 (6H, s), 3.47-3.85 (30H, m), 3.97-4.63 (18H, m), 5.17-5.27 (2H, m), 5.35-5.44 (2H, m), 5.52-5.62 (2H, m), 5.70-5.80 (2H, m), 6.98 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.18 (1H, s), 7.26-7.37 (2H, m, overlap CDCl3 signal), 7.40-7.49 (2H, m), 7.52-7.65 (3H, m), 7.73 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.84 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.00 (1H, d, J = 15.2 Hz), 8.13-8.21 (2H, m), 8.45 (2H, d, J = 11.6 Hz).
7) PD011의 제조
Figure pct00093
MeOH (1 mL) 및 THF (1 mL) 중 화합물 11-7 (116 mg, 0.068 mmol) 및 K2CO3 (19 mg, 0.146 mmol) 혼합물을 15°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 유지 시간 0.772에서 86 %임을 보여주었다 (MS Calcd : 1355.5; MS Found : 1357.2 [M+2]+). 혼합물을 AcOH (50 mg)로 ??칭하였다. 혼합물을 prep-HPLC (0.225 % FA)로 정제하였다. MeCN의 대부분을 감압하에서 제거하고, 남은 수용액을 동결 건조하여 황색 고체로 PD011 (45 mg, 수율 : 48 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 3.18-4.10 (48H, m, overlap water signal), 4.27-4.72 (12H, m), 4.87-5.02 (2H, m), 5.39 (2H, brs), 7.30-7.64 (8H, m), 7.74 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.81-7.97 (4H, m), 8.28-8.49 (4H, m).
8) 화합물 2의 제조
Figure pct00094
DCM (50 mL) 중 옥타에틸렌 글리콜 (5.00 g, 13.5 mmol) 및 Et3N (1.37 g, 13.5 mmol) 용액에 15℃에서 TosCl (2.57 g, 13.5 mmo)을 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 15℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질이 소모되고 2 개의 새로운 위치가 형성되었음을 보여주었다. 혼합물을 물 (50 mL)로 ??칭하고 유기층을 분리하였다. 나머지 수상을 DCM (30 mL * 2)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고 농축한 다음 건조하였다. 잔류물을 EtOAc에 이어서 EtOAc : MeOH / 9 : 1을 사용한 Combi flash 용출액으로 정제하여 무색 오일로 화합물 2 (3.59g, 수율 : 51 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.59-3.76 (30H, m), 4.18 (2H, t, J = 4.8 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.82 (2H, d, J = 8.4 Hz).
9) 화합물 3의 제조
Figure pct00095
THF (30 mL) 중 화합물 2 (3.58 g, 6.82 mmol) 용액에 2- 히드록시이소인돌린-1,3-디온 (1.11 g, 6.82 mmol) 및 PPh3 (2.33 g, 8.87 mmol)를 0°C로 N2하에서 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 0℃에서 30 분간 교반하였다. 이후 DIAD (1.66 g, 8.19 mmol)을 혼합물에 0℃에서 추가하였다. 얻어진 혼합물을 N2하에서 15℃에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 새로운 위치가 관찰 되었음을 나타내고, 그 후 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1 EtOAc를 사용하여 Comib 플래시 용출액으로 정제하여 화합물 3 (3.91g, 수율 : 86 %)을 무색 오일로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.47 (3H, s), 3.56-3.73 (26H, m), 3.86-3.91 (2H, m), 4.16-4.20 (2H, m), 4.37-4.42 (2H, m), 7.36 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.75-7.88 (6H, m).
제조예 8: PD012의 합성
Figure pct00096
1) 화합물 12-1의 제조
Figure pct00097
DMF (2 mL) 중 화합물 6-14 (107 mg, 0.0638 mmol) 및 화합물 12-1a (25 mg, 원유) 용액에 DIEA (13 mg, 0.10 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에서 15℃로 16 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 낮은 극성의 다른 노란색 위치가 관찰되었음을 보여주었다. DMF는 진공에서 제거되었다. 잔류물을 물 (10 mL)에 ??칭하였다. 얻어진 용액을 DCM (15 mL * 4)에서 추출하였다. 혼합된 유기층을 물 (50 mL)로 세척하고 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc : MeOH / 10 : 1을 이용하는 prep-TLC 용출액으로 정제하여 황색 고체로 화합물 12-1 (81mg, 원유)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.94-2.08 (12H, m), 2.09-2.24 (12H, m), 3.50-3.84 (32H, m), 3.98-4.37 (13H, m), 4.43-4.62 (4H, m), 5.20 (2H, d, J = 10.0 Hz), 5.38 (2H, d, J = 7.2 Hz), 5.50-5.57 (2H, m), 5.72 (2H, t, J = 8.8 Hz), 6.96 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.15 (1H, s), 7.27-7.35 (2H, m, overlap CDCl3 signal), 7.39-7.47 (2H, m), 7.51-7.62 (4H, m), 7.71 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.81 (1H, d, J = 15.2 Hz), 7.94-8.09 (2H, m), 8.11-8.20 (2H, m), 8.36-8.48 (3H, m), 10.07 (1H, s).
화합물 6-14의 합성은 PD006의 실시예에서와 동일하다.
2) PD012의 제조
Figure pct00098
DCM (0.2 mL) 및 MeOH (0.4 mL) 중 화합물 12-1 (81 mg, 크루드)의 용액에 K2CO3 (12 mg, 0.090 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.787 유지 시간에서 순도 99 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 1474.2; MS Found: 1496.2 [M+Na]+). 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 pre-HPLC (0.225% FA)에 의해 정제하였다. MeCN의 대부분은 감압 하에서 제거되었다. 남은 혼합액을 동결 건조하여 황색 고체로PD012 (31 mg, 2 단계의 수율 : 33 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.44-3.68 (28H, m), 3.71-4.16 (15H, m), 4.26-4.82 (15H, m), 4.88-5.07 (4H, m ), 5.39 (2H, brs), 7.25-7.64 (8H, m), 7.57 (1H, d, J = 5.2 Hz), 7.81-8.02 (4H, m), 8.07 (1H, d, J = 7.6 Hz), 8.17-8.36 (4H, m), 8.37-8.46 (2H, m), 8.81 (1H, brs), 10.02 (1H, s).
3) 화합물 1의 제조
Figure pct00099
0℃ MeOH (25mL) 중 SOCl2 (8.83g, 74.2mmol) 용액에 2,6-피리딘디카르복실 산 (2.00g, 12.0mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 70 ℃에서 3 시간 동안 교반 하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 유지 시간 0.752에서 순도 99 %임을 보여주었다 (MS Calcd.: 195.1; MS Found: 195.9 [M+H]+). 반응 혼합물을 sat. aq. NaHCO3 (30 mL)로 ??칭하였고, 얻어진 용액을 EtOAc(30 mL*6)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하여 백색 고체로 화합물 1 (2.33g, 수율: 99 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.03 (6H, s), 8.03 (1H, t, J = 8.0 Hz), 8.32 (2H, d, J = 7.2 Hz).
4) 화합물 2의 제조
Figure pct00100
MeOH (35 mL) 중 화합물 1 (2.33 g, 11.9 mmol) 교반 용액에 NaBH4 (1.71 g, 45.1 mmol)을 0℃에서 조금씩 첨가하였고, 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.297 유지 시간에서 97 % 순도임을 보여주었다 (MS Calcd.: 167.1; MS Found: 167.7 [M+H]+). 반응 혼합물을 sat. aq. NaHCO3 (200 mL)로 ??칭하였고, 얻어진 용액을 DCM (100 mL*6)으로 추출하였다. 혼합된 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 진공에서 농축하였다. 잔류물을 PE : EtOAc / 1 : 1 내지 EtOAc을 이용하는 실리카겔 컬럼 용출액로 정제하여 백색 고체로 화합물 2 (832 mg, 수율 : 42 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.45 (1H, brs), 4.02 (3H, s), 4.88 (2H, d, J = 4.8 Hz), 7.55 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.87 (1H, t, J = 7.6 Hz), 8.06 (1H, d, J = 7.2 Hz).
5) 화합물 3의 제조
Figure pct00101
1,2-디클로로에탄 (25 mL) 중 화합물 2 (832 mg, 4.98 mmol) 용액에 MnO2 (4.33 g, 50.0 mmol)을 15℃에서 첨가하고 혼합물을 90℃에서 2 시간 가열하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 0.386 유지 시간에서 98 %의 순도임을 보여주었다 (MS Calcd.: 165.1; MS Found: 165.7 [M+H]+). 혼합물을 셀 라이트로 여과하고 여과액을 증발시켜 백색 고체로 화합물 3 (606 mg, 수율 : 73 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.10 (3H, s), 8.08 (1H, t, J = 7.6 Hz), 8.18 (1H, d, J = 6.8 Hz), 8.38 (1H, d, J = 7.6 Hz), 10.22 (1H, s).
6) 화합물 4의 제조
Figure pct00102
THF (6 mL) 및 H2O (6 mL) 중 화합물 3 (606 mg, 3.67 mmol) 용액에 0 ℃에서 LiOH (132 mg, 5.50 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. TLC는 더 큰 극성의 다른 새로운 위치가 관찰되었고, 출발 물질이 완전히 소모되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하고 남은 용액을 pH = 4의 1N aq. HCl 로 ??칭하였다. 얻어진 용액을 EtOAc : THF = 10 : 1 (20mL * 8)로 추출하고, 백색 고체로 불순 생성물 (466mg)을 얻었다. 불순 생성물을 TBME : PE = 1 : 1 (10mL)로 분쇄하여 여과하고 여과 케이크를 진공 건조하여 백색 고체로 화합물 4 (444mg, 원유)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (1H, dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz), 8.20 (1H, t, J = 7.6 Hz), 8.29 (1H, dd, J = 7.6 Hz, 1.2 Hz), 10.03 (1H, s). (Note: There is a active proton was not observed)
7) 화합물 12-1a의 제조
Figure pct00103
DMF (1.5 mL) 중 화합물 4 (100 mg, 크루드) 및 N-하이드록시숙신이미드 (80 mg, 0.695 mmol) 용액에 15°C N2하에서 EDCI (136 mg, 0.708 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 15°C에서 4시간 교반하였다. 크루드 LC-MS는 생성물의 순도가 1.289 유지 시간에서 96% 순도임을 보여주었다 (MS Calcd.: 248.1; MS Found: 248.9 [M+H]+). DMF를 진공하에서 제거하고 잔류물을 PE : EtOAc / 2 : 3을 이용한 실리카겔 컬럼 용출액으로 정제하여 백색 고체로 화합물 12-1a (51mg 불순)을 얻었다.
제조예 9: PD013의 합성
시나픽스(Synaffix)의 미국 등록특허 제9,636,421호에 기재된 방법에 따라 링커를 제작하였다. 제작된 링커는 제조예 8의 방법과 동일한 방법으로 링커-약물 복합체를 제작하였다.
Figure pct00104
실시예 1. 정상세포 대비 종양세포주에서의 베타-갈락토시다제 과발현
종양세포주에서 베타-갈락토시다제 발현은 웨스턴 블랏팅을 통해 확인하였다. 15종의 세포주들을(각 1x107 개) PBS로 세척한 후 원심분리하여 cell pellet을 얻었다. Cell 내에 들어있는 단백질은 M-PER® mammalian protein extract reagent(Thermo, 78501)로 세포를 용해시킨 다음 추출하였다. Cell pellet에 M-PER® mammalian protein extract reagent 200ul를 넣고 파이펫팅한 후 10분간 반응시켰다. 반응액을 원심분리하고 상등액을 취하였다. 상등액내에 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce, 23225)를 사용하여 농도를 측정하였다. 각 세포주들의 단백질 추출물 10ug을 SDS-PAGE 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 iBlot transfer system을 이용하여 PVDF membrane (Invitrogen, IB401002)에 단백질을 이동시켰다. Membrane은 4% BSA(PBS)로 상온에서 2시간 blocking 시킨 후 Anti-beta-galactosidase antibody(1/10000, abcam, ab128993)를 처리하고 4℃에서 15시간 반응시켰다. 1X PBST(1XPBS + 0.05% Tween20)로 3번 세척 후 Anti-Rabbit IgG HRP(1/3000, pierce, 65-6120)를 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 1X PBST로 3번 세척 후 ECL solution(GE healthcare, RPN2232)을 처리한 후 단백질을 검출하였다. 베타-갈락토시다제의 발현을 확인한 membrane을 β-actin의 발현을 확인하기 위해 stripping하였다. Stripping 한 membrane은 4% BSA(PBS)로 상온에서 2시간 blocking 시킨 후 anti-actin antibody(1/1000, Santacruz, SC-47778)를 4℃에서 15시간 반응시켰다. 1X PBST(1XPBS + 0.05% Tween20)로 3번 세척 후 anti-mouse IgG HRP(1/10000, Pierce, 31432)를 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 1X PBST로 3번 세척 후 ECL solution을 처리한 후 단백질을 검출하였다.
웨스턴 블랏팅 결과로 15종의 종양 세포주에서 베타-갈락토시다제가 발현하는 것을 확인하였다. 또한, TCGA(The Cancer Genome Atlas) 자료 분석시 mRNA level에서 정상조직 대비 종양조직에서 베타-갈락토시다제의 발현이 높은 경향을 보였다 (도 2). 도 2는 베타-갈락토시다제 유전자인 GLB1의 종양조직 및 정상조직 내 mRNA 발현 비율을 나타낸 것으로서, 베타-갈락토시아제가 정상조직에 비해 종양조직 내에서 높게 발현한다는 사실을 보여준다. 특히 자궁암의 경우 종양조직에서의 GLB1 발현이 2 배 이상 높았으며 유방암 조직도 GLB1을 68% 이상 과발현하였다. 이로부터, 종양 세포에서 발현이 높은 베타-갈락토시다제를 종양 선별 활성화 효소로 사용가능함을 확인하였다.
실시예 2. 링커-약물 복합체 단독 효능 평가
베타-갈락토시다제를 포함하도록 제조된 링커-약물 복합체 자체의 세포독성을 평가하였다. 구체적으로, DMSO에 녹인 링커-약물 복합체들을 각각 세포배양용 배지에 200 nM에서 30 pM까지 3 배 연속 희석하여 시료를 준비하고, 이를 다양한 암세포주들에 처리하여 최종적으로 세포들을 100 nM에서 15 pM 농도의 링커-약물 복합체에 노출시켰다. 이후 6 일간 세포를 배양한 후 세포의 생존 정도를 CCK-8 세포 계수 키트를 사용하여 관찰하고 세포독성을 평가하였다. 평가 결과를 표 2에 요약하였으며 대표적인 반응곡선을 도 3에 표시하였다. 표 2 및 도 3에서 확인되는 바와 같이, PD003은 대부분의 세포에서 세포독성을 보이지 않았으며 그 결과 IC50를 설정할 수 없었다. 반면 PD001은 여러 세포에서 세포 독성을 보였으며 그 IC50 값이 표 2에 기재되어 있다.
이러한 실험 결과로부터, 암세포 내에 베타-갈락토오스를 분해하는 베타-갈락토시다제가 적절하게 존재하고, 따라서 PD001이 다양한 암세포 내의 베타-갈락토시다제에 의해서 활성화되어 세포독성을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다. PD003이 활성화를 보이지 않았다는 사실은 베타-글루코오스 모이어티는 베타-글루코시다제의 기질이 될 수 없음을 간접적으로 보여주는 것이다. 또한, 아래 실시예들로부터 PD001은 ADC 형태로 제조한 경우 단독 물질에 비해 더욱 높은 세포독성을 보여주는데, 이는 ADC 형태가 약물의 전달과 활성화에 훨씬 더 효율적이라는 사실을 뒷받침하는 것이다.
Figure pct00105
실시예 3. 항체와 약물을 결합시킨 항체-약물 접합체 (ADC)의 제조
항체와 약물을 결합한 ADC 제조를 위해, 기존 항체 경쇄의 라이신(Lysine: K) 149번 (Kabat 넘버링에 따름. 이하 동일)을 시스테인(Cystein: C)으로 돌연변이화 시키고, 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT)와 같은 환원제를 반응시켜 항체 경쇄 K153C에 티올기를 생성한 후 (K153C T), 생성된 티올기와 약물의 이황화 결합을 통해 항체와 약물을 접합하였다. 구체적으로, 한외여과/투석여과(Ultrafilteration/Diafiltration: UF/DF)를 통해 항체를 5mg/ml 이상으로 준비하고 1M 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris-HCl), pH8.8, 500mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)를 첨가하여, 최종 항체의 농도가 5mg/ml, 75mM Tris-HCl, 2mM EDTA 가 되도록 하였다. 준비된 항체에 100mM 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT)를 항체: DTT 몰비가 1:20 이 되도록 가하고, 25℃에서 16.5시간 반응시켜 항체 경쇄의 시스테인 149번에 이황화 결합(disulfide bond)을 통해 연결된 Free-시스테인(Cystein)을 떼어냈다. 이과정을 Decapping이라 하며, 이후 Decapping 된 항체만 분리하기 위해 양이온 크로마토 그래피 (Cation exchange chromatography: CEX) 정제 방법을 사용하였다. 반응물은 SPHP-A 버퍼 [10mM 석신산(succinate), pH5.0]로 평형화한 hitrap SPHP컬럼(GE Healthcare)에 SPHP-B 버퍼 [50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris-HCl), pH7.5, 0.5M 염화나트륨(Sodium chloride)]으로 용출하였다. Decapping 된 항체를 다시 결합하기 위해 1M 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris-HCl, pH7.5)를 사용하여 산화(Oxidation) 시킬 항체를 75mM Tris-HCl (pH7.5)로 준비하고, 산화형 비타민 C인 디하이드로아스코르빈산(dehydroascorbic acid, DHAA)를 항체: DHAA 비를 1:20 첨가하여 25℃에서 빛을 차단하여 2시간 동안 Reoxidation 시켰다. 그 뒤 Reoxidation된 항체만 분리하기 위해 양이온 크로마토 그래피 (Cation exchange chromatography: CEX) 정제 방법을 사용하여, SPHP-C 버퍼 [10mM 석신산(succinate) pH 5.0, 0.5 M 염화나트륨(Sodium chloride)]로 용출하였다. 정제된 항체는 한외여과/투석여과(Ultrafilteration/Diafiltration: UF/DF)를 통해 5mg/ml 이상으로 농축하였다. 그 이후 항체-약물 결합체를 만들기 위해 1M 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris-HCl), pH8.0)로 반응시킬 항체를 최종 농도 5mg/ml, 100mM 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 (Tris-HC), pH8.0)로 준비하고, 항체: 약물 몰비가 1:10 이 되도록 가하여 25℃에서 16.5시간 동안 반응시켰다. 이후 항체-약물 결합체만 분리하기 위해 양이온 크로마토 그래피 (Cation exchange chromatography: CEX) 정제 방법을 사용하여, SPHP-C 버퍼 [10mM 석신산(succinate) pH 5.0, 0.5 M 염화나트륨(Sodium chloride)]로 용출하였다. 그 이후 DAR2 인 항체-약물 결합체만 분리하기 위해 소수성 상호반응 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography:HIC)를 이용하였다. 이를 위해 Hitrap Butyl HP 컬럼 (GE Healthcare)을 HIC-A 버퍼 [50mM 인산칼륨(Potassium phosphate), pH7.0, 1.0 M 황산 암모늄(Ammonium sulfate)]로 평형화하고, HIC-B 버퍼 [50mM 인산칼륨(Potassium phosphate), pH7.0, 30% 아이소프로필 알코올(2-Propanol)] 로 용출하였다. 이후 아이소프로필 알코올(2-Propanol)을 제거하기 위해 한외여과/투석여과(Ultrafilteration/Diafiltration: UF/DF)를 통해 항체를 HA 버퍼 [20mM 히스티딘(Histidine), pH5.5, 240mM 수크로스(sucrose)]로 교환하여 최종 항체-약물 결합체를 제조하였다.
본 발명에 따른 ADC, 그리고 대조군으로서 D-글루코오스 β-피라노스 또는 글루크로나이드를 트리거로 사용한 ADC 및 상이한 약물과 연결시킨 ADC들의 명칭 및 구체적 구성은 표 3에 나타나 있다. 각 항체의 VH 및 VL 서열은 표 1에 기재된 바와 같다.
Figure pct00106
실시예 4. ADC의 특성 확인
4-1. 제조된 ADC의 순도 확인
제조된 ADC의 순도는 크기 배제-고성능 액체크로마토그래피(SE-HPLC)로 측정하였다. Agilent 1200 시리즈 HPLC 기기에서 Tosoh TSKgel G3000SWxl 컬럼(Tosoh bioscience)을 사용하여, 각 시료가 용출되는 위치와 곡선하면적(area under the curve: AUC)을 비교하여 D20106 및 D20109의 순도를 결정하였다. ADC의 주요 피크의 순도는 97% 이상이었고, 전체 공정 수율(항체 기준)은 20% 이상임을 확인하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다.
4-2. 제조된 ADC의 약물-항체 비율 확인
ADC의 약물-항체의 비율(drug-to-antibody ratio: DAR)은 액체 크로마토그래피-질량분석(LC/MS) 방법으로 결정하였다. 1 ㎎/㎖의 ADC(PBS 중) 항체 100 ㎍ 당 1 유닛의 PNGaseF(NEB)를 가하고 37℃에서 15 시간 동안 인큐베이션하여 N-글리칸을 제거하였다. Waters UPLC I-class 장비와 Waters Synapt G2-S로 구성된 LC/MS 장비에 Acquity UPLC BEH200 SEC 1.7 ㎛(4.6*150 mm) 컬럼을 장착한 후 30%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) 포름산, 및 0.05% 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid: TFA)의 이동상으로 평형화시켰다. 여기에 N-글리칸이 제거된 시료 5 ㎍을 로딩하여 LC/MS를 수행하였다. LC/MS 결과로 얻은 분자량 분포로부터 각 화학종의 상대함량을 가중평균하여 DAR를 결정하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다. 도 6 및 도 7에 따르면 D20106 및 D20109의 DAR은 2 정도를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 PD006 및 PD009가 기대하였던 DAR 수를 나타내면서 항체와 결합하였음을 확인하였다.
4-3. 제조된 ADC의 시험관 내 (in vitro) 타겟 특이적 세포독성 확인
(1) 다발성 골수종 세포주에서의 시험관 내 세포독성
BCMA를 발현하는 다발성 골수종 세포주인 MM NCI-H929 (Multiple myeloma NCI-H929) 세포주를 이용하여 항-BCMA 항체를 포함하는 ADC인 D20103 (B58 PD001), D20106 (B58 PD006) 및 D20109 (B58 PD009)의 시험관 내 세포독성을 확인하였다. 구체적으로, RPMI(ATCC), 10% FBS(Gibco), 0.05 mM 베타-머캅토에탄올, 및 Antibiotic-Antimycotic(Gibco)를 함유한 배지에서 배양한 H929 세포주(ATCC, CRL-9068TM)를 20,000개씩 96 웰의 각 웰에 50 ㎕ 부피로 분주한 후 같은 배양 배지에 희석한 ADC를 50 ㎕씩 분주하였다. ADC의 농도는 연속희석을 통해서 200 nM에서 5 pM였다. 그 후 세포를 37℃, 5% CO2에서 약 6일간 배양하였다. 배양이 종료된 후 10 ㎕의 WST-8(Dojindo)을 각 웰에 가하고 추가 배양하였다. SpectraMax 플레이트 리더를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도와 ADC 농도간 반응곡선은 4PL 커브 피팅을 수행하여 50% 세포 사멸 농도인 IC50 값(nM)을 산출하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. D20103, D20106 및 D20109 모두 우수한 약물효능(potency)을 보였으며, 특히 PD009를 포함하는 D20109는 효능이 가장 우수하였다. PD009는 접합공정 후 여과하여 양을 비교하였을 때 PD006보다 그 양이 많았으며, 동일 조건에서 DAR이 높은 ADC가 더 많이 제조되었다. 이와 관련하여 아래 표 4는 접합공정 중 반응 후 양이온 교환 수지 정제 결과를 보여준다. 이러한 PD009의 공정상의 특징은 상대적으로 높은 용해도에 기인하며 따라서 PD009가 보다 공정 친화적인 것으로 분석된다.
Figure pct00107
(2) 맨틀세포 림프종 세포주에서의 시험관 내 세포독성
ROR1을 발현하는 인간 맨틀세포 림프종(Mantle Cell Lymphoma) 세포주인 Mino 및 Jeko-1를 이용하여 항-ROR1 항체를 포함하는 ADC인 D20204 (C2E3-PD001)의 시험관 내 세포독성을 확인하였다. 대조군으로는 (i) 동일한 항-ROR1 항체인 C2E3을 포함하나 트리거로서 D-갈락토오스 β-피라노스가 아닌 D-글루코오스 β-피라노스를 포함하는 PD003를 약물로 포함하는 C2E3-PD003, 그리고 (ii) 동일한 항-ROR1 항체인 C2E3 및 종래 약물 MMAE를 포함하는 C2E3-CAAX-MMAE를 사용하였다. 구체적으로, RPMI(ATCC), 20% FBS(jeko-1)(Gibco) 또는 15% FBS(mino), Antibiotic-Antimycotic(Gibco)를 함유한 배지에서 배양한 Jeko-1 세포주(ATCC, CRL-3006TM), Mino 세포주(ATCC, CRL-3000TM)를 20,000개씩 96 웰의 각 웰에 50 ㎕ 부피로 분주한 후 세포독성 확인 실험을 하였다. 이후 실험방법은 항-BCMA ADC와 동일하였다.
그 결과를 표 5 및 도 9에 나타내었다. Mino 세포주에서는 대조군인 C2E3-CAAX-MMAE 보다 D20204가 세포독성이 높았고, 트리거로서 글루코오스를 포함하는 C2E3-PD003은 세포독성을 보이지 않았다. Jeko-1에서는 D20204이 C2E3-CAAX-MMAE 보다 다소 낮은 세포독성을 나타내었고, PD003은 전혀 세포독성을 보이지 않았다. 이로부터, 트리거로서 갈락토오스를 가지는 본 발명의 ADC가 트리거로서 글루코오스를 가지는 ADC에 비해 현저히 뛰어난 타겟 특이적 세포독성을 나타냄을 확인하였다.
Figure pct00108
(3) 위암세포주 및 유방암세포주에서의 시험관 내 세포독성
Her2를 발현하는 위암세포주 (NCI-N87) 및 유방암세포주 (HCC1954)를 이용하여 항- Her2 항체를 포함하는 ADC인 D20001 (T-PD001)의 시험관 내 세포독성을 확인하였다. 대조군으로는 동일한 약물인 PD001에 항-BCMA 항체가 연결된 D20103 (B58-PD001)를 사용하였다. 구체적으로, RPMI(ATCC), 10% FBS(Gibco), Antibiotic-Antimycotic(Gibco)를 함유한 배지에서 배양한 NCI-N87 세포주(ATCC, CRL-5822TM)와 HCC1954 세포주 (ATCC, CRL-2338TM)를 10,000개 또는 5000개씩 96 웰의 각 웰에 50 ㎕ 부피로 분주한 후 타겟 특이적 세포독성 확인 실험을 하였다. 이후 실험방법은 항-BCMA ADC와 동일하였다.
그 결과를 표 6 및 도 10에 나타내었다. Her2를 발현하는 NCI-N87, HCC1954 세포주는 D20001에 의한 세포독성을 보인 반면, 항-BCMA ADC인 D20103에 의한 세포독성은 보이지 않았다. 이로부터, 본 발명에 따른 ADC는 ADC에 포함된 항체의 종류에 따른 타겟 특이적 세포독성을 가짐을 확인하였다.
Figure pct00109
(4) 난소암 세포주에서의 시험관 내 세포독성
NaPi2b를 발현하는 난소암 세포주 (OVCAR-3)를 이용하여 항-NaPi2b 항체를 포함하는 ADC인 D20002 (10H1-PD001)의 시험관 내 세포독성을 확인하였다. 대조군으로는 동일한 약물인 PD001에 항-BCMA 항체가 연결된 D20103 (B58-PD001)를 사용하였다. 구체적으로, RPMI(ATCC), 20% FBS(Gibco), Antibiotic-Antimycotic(Gibco)를 함유한 배지에서 배양한 OVCAR-3 세포주(ATCC, HTB-161TM)를 5000개씩 96 웰의 각 웰에 50 ㎕ 부피로 분주한 후 in vitro 세포독성 확인 실험을 하였다. 이후 실험방법은 항-BCMA ADC와 동일하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 따르면 D20002를 포함하는 ADC는 1.53nM의 IC50을 나타냄을 확인하였다. Non-binder/Binder의 비율이 100 이상으로, 고형암 세포주 중 가장 반응성이 우수하였다. 반면 항-BCMA ADC인 D20103에 의한 세포독성은 보이지 않았다. 이로부터, 본 발명에 따른 ADC는 ADC에 포함된 항체의 종류에 따른 타겟 특이적 세포독성을 가짐을 확인하였다.
(5) 종합
D-갈락토오스 β-피라노스를 트리거로서 포함하는 약물을 포함하도록 제조된 본 발명의 ADC의 시험관 내 세포독성을 다양한 대조군 ADC와 비교하여 본 결과, 본 발명에 따른 ADC 대부분은 다양한 세포주에서 1 nM 이하의 IC50을 나타난 바, 우수한 약물로서의 가능성을 시험관 내 시험에서 확인할 수 있었다 (표 7).
Figure pct00110
4-4. 생체 내 (in vivo) 타겟 특이적 세포독성 확인
ADC의 생체 내 타겟 특이적 세포독성을 확인하기 위하여, 다양한 암세포주의 이종이식 마우스 모델에서의 종양 억제 효능을 시험하였다. 구체적으로, 0.5 또는 1 x 107개의 암세포를 마트리겔 (Matrigel)과 혼합한 후, 6 내지 8주령의 암컷 Fox chase SCID 마우스 (CB17/Icr-Prkdc scid /IcrIcoCrl) 또는 누드 마우스의 옆구리에 피하주사하였다. 마우스들은 평균 종양 크기가 150 내지 200 mm3에 달했을 때 순차적으로 각 실험군으로 배치되었다. ADC 및 대조군들은 각 그룹들에서 꼬리 정맥을 통해 투여되었으며, 음성 대조군으로는 PBS (vehicle)가 사용되었다. 종양의 크기는 버니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 장축 및 단축을 측정하여 결정되었으며, 종양의 부피는 다음의 식을 이용해 계산되었다:
종양 부피 (mm3) = (0.5) x (장축) x (단축)2
(1) 인간 맨틀세포 림프종 세포 이종이식 마우스 모델에서의 세포독성
ROR1을 발현하는 인간 맨틀세포 림프종(Mantle Cell Lymphoma) 세포주인 Jeko-1를 이용한 이종이식 마우스 모델에서 D20204 (C2E3-PD001)의 생체 내 세포독성을 확인하였다. 대조군으로는 C2E3 항체, 및 약물로서 MMAF를 포함하는 C2E3-mc-MMAF를 사용하였으며, 4 mg/kg, ADC 단일용량, 매주 3회 투여의 조건으로 수행하였다.
그 결과를 도 12에 나타내었다. D20204는 시험관 내 시험에서는 IC50이 10nM을 초과하였으나 (도 9), 생체 내 시험에서는 MMAF가 접합된 ADC보다도 현저히 우수한 효과를 나타내었다.
(2) 인간 다발성 골수종 세포 이종이식 마우스 모델에서의 세포독성
BCMA를 발현하는 다발성 골수종 세포주인 NCI-H929를 이용한 이종이식 마우스 모델에서 D20106 (B58-PD006) 및 D20109 (B58-PD009)의 생체 내 세포독성을 확인하였다. 구체적으로는 6-7주령의 Fox chase SCID 마우스를 사용하였고 1x107개의 NCl-H929 세포를 마트리겔과 혼합하여 마우스 옆구리 부분 피하에 이식하였으며, 종양의 크기가 평균 180~200 mm3인 시점에 약물을 투여하였다. D20106, D20109 두 물질은 각각 세 가지 용량 (2.5 mpk, 1.25 mpk, 0.625 mpk)으로 단회 투여하였고 종양의 크기를 주 2회 측정하며 3 주간 관찰하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, D20106 및 D20109는 모두 다발성 골수종 세포 이종이식 모델에서 우수한 세포독성을 나타내었다. 구체적으로, D20106 및 D20109는 NCI-H929 종양의 성장을 효과적으로 억제하였으며 D20106이 낮은 농도 (0.625 mpk)로 투여된 군을 제외한 나머지 모든 처치군에서 종양의 소실이 관찰되었다.
(3) 급성 골수성 백혈병 세포 이종이식 마우스 모델에서의 세포독성
CLL-1을 발현하는 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid lymphoma, AML) 세포주인 EOL-1 및 HL-60을 이용한 이종이식 마우스 모델에서 D20502 (6E7-PD009)의 생체 내 세포독성을 확인하였다. 구체적으로는 6-7주령의 Fox chase SCID 마우스를 사용하였고 5x106개의 EOL-1 혹은 HL-60 세포를 마트리겔과 혼합하여 마우스 옆구리 부분 피하에 이식하였으며, 종양의 크기가 평균 180~200 mm3인 시점에 약물을 투여하였다. D20502는 2 mpk 단일 용량으로 단회 투여하였고 종양의 크기를 주 2회 측정하며 3 주간 관찰하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 2 mpk 투여 용량에서 D20502는 두 AML 이종이식 모델 모두에서 종양의 성장을 효과적으로 억제하였으며, 투여 후 2주가 되는 시점에서는 모든 종양이 소실된 것이 관찰되었다.
4-5. 최대 허용 용량 결정을 위한 단회 투여 설치류 독성시험 1
PD001 또는 PD006을 포함하는 ADC의 독성을 평가하고 최대 허용 용량을 결정하기 위해 단회 투여 설치류 독성시험을 수행하였다. 구체적으로, 7 내지 8 주령의 암컷 SD 랫트를 아래 표 8과 같이 순서대로 그룹핑하여, 그룹 전체에서 유사한 평균 체중을 가지도록 하였다. 5 내지 45 mpk ADC 용량을 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 혈액학적 분석 및 혈청 생화학적 분석을 위해 3 일째, 18 일째 및 35 일째에 혈액 샘플을 채취하였다. 나머지 동물은 모두 34 일째에 희생하여, 주요 장기에 대한 조직병리학적 분석을 실시하였다. 대조군인 Group 1에는 부형제인 20mM 히스티딘 pH 6.0 7% 트레할로오스를 투여하였다.
Figure pct00111
(1) 체중 변화
모든 동물에 대하여 Day 1(투여 전), 2, 4, 8, 15, 19, 22, 25, 28, 31, 34 및 Day 35에 소동물용 체중계를 이용하여 체중을 측정하였다. 사망 및 빈사동물은 발견 즉시 해당 동물의 체중을 측정한 후, 부검을 실시하였다.
체중 변화에 대한 확인 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 45 mpk 용량을 투여한 Group 4 및 Group 7을 제외하고는 체중 감소를 보이지 않았다. 최대용량을 투여한 Group 4 및 Group 7은 실험종료일 이전에 모든 개체가 사망하였다.
(2) 혈액학적 분석
혈액학적 검사를 통해 ADC의 독성을 평가하였다. 투여 후 Day 3 (1 차 채혈), Day 18 (2 차 채혈) 및 Day 35 (3 차 채혈)에 정맥 채혈을 실시하였으며, 동물은 채혈 전에 하룻밤 동안 절식 (물은 제공)하였다. 혈액 약 0.5 mL를 항응고제인 EDTA-2K가 들어있는 CBC 보틀에 주입한 후 자동혈액분석기를 이용하여 혈중 백혈구 수치의 변화를 도 16에 나타내었다. 분석 결과, 고용량으로 투여한 Group 4 및 Group 7을 제외하고는 주목할 만한 독성은 관찰되지 않았다. 투여물질에 의한 독성으로 인해 백혈구 수치가 일시적으로 감소하였으나 시간에 지남에 따라 회복되는 양상이 관찰되었다.
(3) 혈청 생화학적 분석
혈액 중 생화학적 파라미터인 ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase) 및 혈중 요소 질소 (blood urea nitrogen, BUN)에 대한 분석을 통해 ADC의 독성을 확인하였다. 투여 후 Day 3 (1 차 채혈), Day 18 (2 차 채혈) 및 Day 35 (3 차 채혈)에 정맥 채혈을 실시하였으며, 혈액 약 1 mL를 응고활성제 (clot activator)가 들어 있는 5 mL 진공채혈관에 주입하였고 15-20 분간 실온에 방치하여 응고시킨 후 10 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈액생화학분석기를 이용하여 검사하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 분석 결과, 같이, 45 mpk 용량을 투여한 Group 4 및 Group 7을 제외하고는 주목할 만한 독성은 관찰되지 않았다
(4) 병리학적 분석 결과
표 9는 부검시 관찰한 장기별 증상이다. 가슴샘의 위축이 G2, G3, G4, G7 등 ADC 투여군에서 관찰되었으나 이는 백혈구의 감소에 의한 현상으로, 시험물질에 의한 직접적인 영향은 아니라고 판단되었다. 그 외 빈사동물의 비장이나 위, 림프절에서 소견이 관찰되었으나 조직병리적 변화를 동반하지 않았거나 자연발생적 변화였으므로 ADC의 독성에 의한 증상은 아닌 것으로 판단되었다.
표 10은 조직병리 결과이다. 신장의 세뇨관에서 거대핵세포형성이 관찰되었으며 용량-반응 상관성이 있어 시험물질에 의한 것으로 판단되었다. 특히 해당 현상은 D20103에서만 관찰되고 D20106에서는 관찰되지 않았으므로, 링커에 사용한 PEG 그룹이 신장독성을 줄이는데 관여했다고 추정되었다.
Figure pct00112
Figure pct00113
4-6. 최대 허용 용량 결정을 위한 단회 투여 설치류 독성시험 2
PD006 또는 PD009을 포함하는 ADC의 독성을 평가하고 최대 허용 용량을 결정하기 위해, 아래 표 11과 같은 실험군을 설정하여 랫트 단회 투여 독성시험을 수행하였다.
Figure pct00114
투여, 사육, 체중 측정의 시험방법은 위 4-5에서 전술한 바와 같다. 투여 3 일차, 14 일차 및 35 일차에 채혈하여 혈액 자동분석기를 이용하여 혈액학적 검사를 수행하였으며, 시험종료시 안락사 시키고 부검, 병리검사를 수행하였다. 대조군인 Group 1에는 부형제인 20mM 히스티딘 pH 6.0 7% 트레할로오스를 투여하였다.
시험동물의 체중 변화는 도 18에 나타나 있다. 모든 실험군에서 투여 후 2 주간 체중이 감소하는 급성 독성 반응이 관찰되었으나, 최고 용량 투여군인 G4 및 G7을 제외하고는 회복하는 양상을 보였다. G4, G7은 투여후 3주 이후에 서서히 회복하는 양상을 보였다. 36 일차에 보이는 전군의 체중감소는 희생전 절식으로 인한 변화이다.
또한, 혈액학적 검사에 따른 백혈구 수치 변화 측정 결과가 도 19에 나타나 있다. 체중 변화에서 보았던 것과 유사한 양상이 관찰되었으며 최고 용량 투여군을 제외한 나머지 군에서는 투여 14일차에 백혈구가 감소하는 독성이 관찰되고 시험 종료일인 투여 35일차에 회복하는 양상을 보였다. 그러나 최고용량 투여군인 G4, G7 군에서는 백혈구 숫자가 회복되는 양상이 관찰되지 않았다.
따라서 체중과 백혈구수 두 가지 지표에 근거하여, PD006를 포함하는 D20106의 최대 허용용량 (maximum tolerated dose, MTD)은 20 mpk, 그리고 PD009를 포함하는 D20109의 최대허용용량은 10 mpk로 설정하였다.
4-7. 유사 물질과 비교하기 위한 단회 투여 설치류 독성시험
트리거로서 β-갈락토오스를 포함하는 페이로드가 유사한 구조를 가지는 다른 트리거를 포함하는 페이로드에 비해 독성 측면에서 더 우수하다는 사실을 증명하기 위해, 아래와 같은 구조를 가지는 β-글루크로나이드(glucuronide) 및 CBI 기반의 페이로드인 GT70을 합성하여 이를 기반으로 ADC를 제작하고 독성을 비교하였다. GT70을 링커-약물로서 사용하여 B58항체에 접합하였다는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 ADC를 제조하고 D20111이라 명명하였다.
Figure pct00115
D20109 및 D20111을 각각 SD 랫트에 단회 투여한 후 28 일간 관찰하였으며 체중의 변화와 혈액학적, 혈액생화학적 변화를 관찰하여 독성 발현의 여부와 회복을 관찰하였다. 단회 독성 시험의 세부방법은 실시예 4-5에 기재된 바와 같으며 실험군의 구성은 아래 표 12와 같다.
Figure pct00116
실험 결과는 도 20에 나타나 있다. 모든 독성학지표에서 용량 의존적인 반응을 보였으며 고용량 투여군 (Group 3 및 Group 5)에서 저용량 투여군 (Group 2 및 Group 4) 보다 높은 독성반응이 관찰되었다. 체중 변화를 관찰하였을 때 동일 용량 수준에서 D20109 투여군은 D20111 투여군에 비해 체중 감소 폭이 적었으며 실험 종료일 체중도 더 많이 회복되었다 (도 20). 혈액학적 지표중 하나인 혈중 백혈구 갯수로 독성을 비교하였을 때에도 D20109 투여군은 D20111 투여군에 비해 백혈구 감소 폭이 작고 회복되는 양상을 보였다 (도 20). 특히 수컷에 대한 적혈구 갯수를 평가하면 D20111 고용량 투여군은 실험 종료시까지 회복되지 못하는 양상을 보였다 (도 20). 이로부터, β-갈락토오스는 ADC의 트리거로서 사용되었을 때, 유사 구조를 가지는 다른 물질에 비해 현저히 우수한 안정성을 가진다는 사실을 확인하였다.
본 발명에 따른 갈락토오스 트리거를 포함하는 페이로드가 결합된 ADC는 암 또는 종양 세포에서 많이 발현되는 베타-갈락토시다제에 의해 갈락토오스가 제거됨으로써 비로소 세포독성을 나타내는 타겟 특이적 특성을 가지므로, 약물의 조기 방출 및 이에 따른 전신 독성 위험을 현저히 낮출 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 갈락토오스 트리거를 포함하는 ADC는 유사한 다른 구조를 가지는 트리거, 예를 들어 글루코오스 또는 글루크로나이드를 트리거로 가지는 ADC에 비해서도 우수한 약물 효능, 그리고 체내에서의 낮은 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명에 따라 갈락토오스 트리거를 적용한 페이로드를 사용하여 종래의 프로드럭과 비교하여 독성이 적고 체내에서 안정성이 높으며 효능이 우수하고 치료 윈도우 (treatment window)가 넓은 ADC를 제조할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 20 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6E7(N54A) VH <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Glu Arg Gly Ala Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450

Claims (13)

  1. 다음의 화학식 (I)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00117

    상기 화학식에서,
    R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
    R2는 Cl 또는 Br이고;
    R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이다.
  2. 다음의 화학식 (II)로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00118

    상기 화학식에서,
    R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
    R2는 Cl 또는 Br이고;
    R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
    W는 스페이서이고;
    L1은 링커이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 W는
    -R4-A-R5-, -R4-A- -(CH2CH2R6)x-, -(CH2)r(R7(CH2)p)q-, -((CH2)pR7)q-, -(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-, -((CH2)pR7)q(CH2)r-, -R8((CH2)pR7)q- 또는 -(CH2)r(R7(CH2)p)q R8CH2-이고,
    여기서 R4 및 R5는 각각 독립적으로 -(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q이고, A는 직접 결합 또는 펩티드 결합이고, V는 단일 결합, O 또는 S이고,
    R6은 -O-, C1-C8 알킬렌, -NR9- 또는 -C(O)NR13-이고,
    R7 및 R8은 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -NR10-, -C(O)NR11-, -NR12C(O)- 또는 C3-C20 헤테로아릴이며,
    R9 내지 R13는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C20 아릴 또는 C1-C6 알킬C3-C20 헤테로아릴이고,
    x는 1 내지 5의 정수이고, r은 0 내지 10의 정수이고, p는 0 내지 10의 정수이고, q는 0 내지 20의 정수이고,
    상기 W 내의 1 내지 10 개의 수소는 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환될 수 있는, 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 L1은
    하이드록시, 알데히드, ONH2, NH2, 또는, N, O 및 S로부터 선택되는 1 개 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하는 4 내지 7-원 헤테로아릴로서, 상기 헤테로아릴은 하이드록시, 알데히드, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 치환될 수 있거나, 또는
    아래의 화학식 (I-a) 또는 (I-b)의 구조를 가지며:
    Figure pct00119

    여기서 Q1은 시클로옥티닐 또는 헤테로시클로옥티닐이고, 상기 시클로옥티닐 또는 헤테로시클로옥티닐은 임의로 C3-C12 시클로알킬, C3-C12 아릴 및 C3-C12 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 환과 융합되고, 임의로 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환되고,
    R13은 C1-C24 알킬, C3-C24 시클로알킬, C3-C24 아릴, C3-C24 헤테로아릴, C3-C24 알킬아릴, C3-C24 알킬헤테로아릴, C3-C24 아릴알킬 및 C3-C24 헤테로아릴알킬로부터 선택되며, 상기 헤테로아릴은 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자를 포함하고, 여기서 R14는 수소 또는 C1-C4 알킬기이고,
    Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4는 스페이서 모이어티로서, 각각 독립적으로 단일 결합, 또는 직선형 또는 분지형 C1-C200 알킬렌, C2-C200 알케닐렌, C2-C200 알키닐렌, C3-C200 시클로알킬렌, C5-C200 시클로알케닐렌, C8-C200 시클로알키닐렌, C7-C200 알킬아릴렌, C7-C200 아릴알킬렌, C8-C200 아릴알케닐렌 및 C9-C200 아릴알키닐렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 시클로알케닐렌, 시클로알키닐렌, 알킬아릴렌, 아릴알킬렌, 아릴알케닐렌 및 아릴알키닐렌은 임의로 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되거나 이를 포함하고,
    Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 O, C(O) 및 N(R13)로부터 선택되고,
    a는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
    b는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
    c는 0 또는 1이고,
    d는 0 또는 1이고,
    e는 0 또는 1이고,
    f는 0 내지 150의 정수이고,
    g는 0 또는 1이고,
    i는 0 또는 1인, 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  5. 제2항에 있어서, 다음의 화학식으로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00120
  6. 제2항에 있어서, 다음의 화학식으로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123

    Figure pct00124

    Figure pct00125
  7. 다음의 화학식 (III)으로 표시되는 화합물, 이의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체-약물 접합체:
    Figure pct00126

    상기 화학식에서,
    R1은 D-갈락토오스 β-피라노스 또는 D-갈락토오스 α-피라노스이고;
    R2는 Cl 또는 Br이고;
    R3은 단일 결합, -O- 또는 -NH-이고;
    W는 스페이서이고;
    L2는 링커이며;
    Ab는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 W는
    -R4-A-R5-, -R4-A-, -(CH2CH2R6)x-, -(CH2)r(R7(CH2)p)q-, -((CH2)pR7)q-, -(CH2)r(R7(CH2)p)qR8-, -((CH2)pR7)q(CH2)r-, - R8((CH2)p R7)q- 또는 -(CH2)r(R7(CH2)p)q R8CH2-이고,
    여기서 R4 및 R5는 각각 독립적으로 -(CH2)r(V(CH2)x)p(CH2)q이고, A는 직접 결합 또는 펩티드 결합이고, V는 단일 결합, O 또는 S이고,
    R6은 -O-, C1-C8 알킬렌, -NR9- 또는 -C(O)NR13-이고,
    R7 및 R8은 각각 독립적으로 단일결합, -O-, -NR10-, -C(O)NR11-, -NR12C(O)- 또는 C3-C20 헤테로아릴이며,
    R9 내지 R13는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬C6-C20 아릴 또는 C1-C6 알킬C3-C20 헤테로아릴이고,
    x는 1 내지 5의 정수이고, r은 0 내지 10의 정수이고, p는 0 내지 10의 정수이고, q는 0 내지 20의 정수이고,
    상기 W 내의 1 내지 10 개의 수소는 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환될 수 있는, 항체-약물 접합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 L2는
    -CH2NH-, -ON=C(CH3)-, -ON=, -CH=, CH=N-, 또는, N, O 및 S로부터 선택되는 1 개 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하는 4 내지 7-원 헤테로사이클로서, 상기 헤테로사이클은 하이드록시, 알데히드, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5 개의 치환기로 치환될 수 있거나; 또는
    아래의 화학식 (II-a) 또는 (II-b)의 구조를 가지며:
    Figure pct00127

    여기서 Q2은 트리아졸과 융합된 시클로옥테닐 또는 트리아졸과 융합된 헤테로시클로옥테닐이고, 상기 시클로옥테닐 또는 헤테로시클로옥테닐은 임의로 C3-C12 시클로알킬, C3-C12 아릴 및 C3-C12 헤테로아릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 환과 추가로 융합되고, 임의로 하이드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 아미노, ONH2 또는 옥소로 치환되고, 상기 Q2은 트리아졸에 포함된 질소 원자를 통해 Ab와 연결되고,
    Sp1, Sp2, Sp3 및 Sp4는 스페이서 모이어티로서, 각각 독립적으로 단일 결합, 또는 직선형 또는 분지형 C1-C200 알킬렌, C2-C200 알케닐렌, C2-C200 알키닐렌, C3-C200 시클로알킬렌, C5-C200 시클로알케닐렌, C8-C200 시클로알키닐렌, C7-C200 알킬아릴렌, C7-C200 아릴알킬렌, C8-C200 아릴알케닐렌 및 C9-C200 아릴알키닐렌으로부터 선택되고, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 시클로알케닐렌, 시클로알키닐렌, 알킬아릴렌, 아릴알킬렌, 아릴알케닐렌 및 아릴알키닐렌은 임의로 O, S 및 NR14로부터 선택되는 헤테로원자에 의해 치환되거나 이를 포함하고,
    Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 O, C(O) 및 N(R13)로부터 선택되고,
    a는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
    b는 각각 독립적으로 0 또는 1이고,
    c는 0 또는 1이고,
    d는 0 또는 1이고,
    e는 0 또는 1이고,
    f는 0 내지 150의 정수이고,
    g는 0 또는 1이고,
    i는 0 또는 1인, 항체-약물 접합체.
  10. 제7항에 있어서, 다음의 화학식으로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
    Figure pct00128
  11. 제7항에 있어서, 상기 링커가 항체에 도입된 시스테인, 리신, 아지드기, 케톤기 또는 항체 단백질의 N-말단을 통해 항체와 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제7항에 있어서, 상기 항체는 항-BCMA 항체, 항-ROR1 항체, 항-Her2 항체, 항-NaPi2b 항체 및 항-CLL1항체로 구성된 군에서 선택되는 접합체.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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